BRPI0202779B1 - processo para a preparação de compostos contendo uma ou mais ligações amida - Google Patents

Abstract

"processo para a preparação de compostos contendo uma ou mais ligações amida, e, composto". a presente invenção refere-se a um processo para a preparação de peptídeos usando um excesso de um componente carboxílico ativado para acilar um componente amino, no qual, após a acilação, uma amina compreendendo um ânion livre ou um anion latente é empregada como um removedor de funções carboxílicas ativadas residuais. este processo é útil para a preparação de oligo- e polipeptídeos e, mais geralmente, na preparação de compostos contendo uma ou mais ligações de amida.

Description

“PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSTOS CONTENDO UMA OU MAIS LIGAÇÕES AMIDA” A invenção refere-se a um novo e versátil processo para a preparação de compostos contendo uma ou mais ligações de amida, em particular peptídeos, especialmente para os processos realizados em solução.

Os peptídeos são sintetizados quer em solução quer sobre um suporte sólido. Em ambas as abordagens etapas de acoplamento e desproteção repetidamente se alternam e podem ser separadas por purificações intermitentes. Um excesso de um componente carboxílico ativado é preferivelmente usada em cada etapa de acoplamento para garantir o acoplamento quantitativa em um componente amino; assim a ocorrência de seqüências de deleção no produto final podem ser evitadas. Na síntese de peptídeo em fase sólida o componente carboxílico residual é normalmente removido por filtração no final de cada etapa de acoplamento. Na síntese em fase de solução é normalmente assumido que o componente carboxílico ativado residual é destruído e removido durante o processamento aquoso intermitente. Seqüências de peptídeos de inserção, contudo, são freqüentemente encontradas na síntese em fase de solução como impurezas do peptídeo final devido à remoção incompleta do componente carboxílico (ativado) residual após uma etapa de acoplamento, que subseqüentemente foi acoplado após a desproteção. Com o propósito de evitar a ocorrência das citadas reações secundárias uma etapa de remoção pode ser introduzida diretamente após a etapa de acoplamento para remover as funções carboxílicas ativadas residuais (inativas). Aminas são normalmente aplicadas como removedores. O emprego de poliaminas como removedores leva a compostos removidos que podem ser ativamente extraídos para dentro de uma fase aquosa - preferivelmente ácida - dependendo de sua polaridade [por exemplo Kisfaludy, L. et al. (1974) Tetrahedron Lett. 19, 1785-1786]. Esta extração é normalmente realizada antes da etapa de desproteção para evitar a perda de peptídeo crescente para dentro da fase aquosa. Entretanto, tem sido verificado em numerosos casos que este procedimento resulta em purificação intermitente incompleta devido à hidrofobicidade do composto removido: a hidrofobicidade intrínseca da parte amino acila do componente carboxílico é aumentada pelo grupo amino-protetor ainda presente. A extração aquosa é deste modo não completamente efetiva.

Recentemente, Carpino, L. A. et ai [(1999) J. Org. Chem. 64, 4324-4338] relatou uma melhoria no método de remoção. Em adição ao uso de uma poliamina como removedor, o grupo amino-protetor 1,1-dioxo-benzo[Z>]tiofeno-2-il-metóxi-carbonila (Bsmoc) foi aplicado no processo. A função Bsmoc possui labilidade muito elevada em base. Como um seu resultado, funções carboxílicas ativadas residuais são removidas e as funções Bsmoc são removidas em uma e mesma etapa usando uma poliamina.

Agora tem sido verificado um novo processo para a preparação de peptídeos, no qual um excesso de um componente carboxílico ativado é empregado para acilar um componente amino, e no qual após a acilação uma amina compreendendo um ânion livre ou um ânion latente (por exemplo ânion formado durante desproteção) é utilizada como um removedor de funções carboxílicas ativadas residuais. Este novo processo permite uma escolha essencialmente arbitrária do grupo protetor na terminação N do componente carboxílico ativado, visto que - em contraste com o processo de Carpino - sua desproteção não necessariamente ocorre sob as mesmas condições de reação que as da remoção de excesso de funções carboxílico ativado. Em adição, o processo desta invenção permite a remoção elevadamente eficiente do componente carboxílico ativado residual sem se deparar com os problemas de hidrofobicidade de outros processos da técnica anterior nos quais poliaminas são usadas como removedores. Preferivelmente, o processo da invenção ocorre em solução. Contudo, o processo também pode ser aplicado na síntese de peptídeo em fase sólida. O processo da invenção também é apropriado para a preparação de outros compostos contendo uma ou mais ligações de amida.

Em uma modalidade preferida, uma amina compreendendo um ânion latente é usada como o removedor. Preferivelmente, o ânion latente na amina removedora possui um grupo protetor temporário que pode ser seletivamente removido na presença de qualquer grupo protetor permanente ligado no peptídeo crescente. Em uma modalidade particularmente preferida o grupo protetor do ânion latente na amina removedora mostra uma labilidade semelhante àquela do grupo protetor temporário presente na terminação N do peptídeo crescente. Isto permite a ocorrência da desproteção do removedor dando o ânion e da desproteção N-terminal do peptídeo crescente em uma única etapa de processo. Especialmente preferido é o processo da invenção no qual os grupos protetores temporários, presentes na terminação N do peptídeo crescente e opcionalmente presentes no removedor, são grupos hidrogenoliticamente removíveis enquanto que os grupos protetores permanentes são grupos protetores acidoliticamente removíveis. Preferivelmente, os citados grupos protetores temporários são do tipo benzila, por exemplo grupos benziloxicarbonila e benzila (substituída). Um removedor preferido é uma amina primária compreendendo um ânion livre ou um ânion latente, e em particular um derivado de aminoácido C-terminalmente protegido. Além de carboxilato, a amina removedora pode empreender outras funções aniônicas tais como - mas não limitadas a -sulfonato, sulfato, fosfonato, fosfato ou fenolato. Um aminoácido elevadamente preferido para uso como um removedor é β-alanina ou um derivado da mesma (por exemplo um éster ou derivado de silil éster). O removedor mais preferido é β-alaninato de benzila ou um sal do mesmo.

Um tiol compreendendo um ânion livre ou latente também pode ser empregado como um removedor no lugar de uma amina compreendendo um ânion livre ou latente de acordo com o processo desta invenção. Ò removedor é preferivelmente usado em um excesso molar de duas a seis vezes com relação ao componente ativo residual que necessita ser removido. O uso de um removedor de acordo com a presente invenção acarreta compostos removidos hidrofílicos que podem ser ativamente extraídos para dentro de uma fase aquosa básica após a etapa de desproteção: com a desproteção (se aplicável), a hidrofilicidade é aumentada pela presença de ambas uma função amino livre e uma função carboxílica livre nas espécies removidas. Assim, o processo desta invenção resulta em uma purificação intermitente muito efetiva devido à possibilidade de extração ativa de um composto hidrofílico removido. Em adição, um possível excesso presente de componente carboxílico que não estava ativado e cujo grupo protetor temporário também não fora removido durante a desproteção, é extraído da mistura reacional ao mesmo tempo. O novo processo desta invenção pode ser convenientemente utilizado na preparação de oligo- e polipeptídeos e, mais geralmente, na preparação de compostos contendo uma ou mais ligações amida.

Um processo adequado de acordo com a presente invenção é o acoplamento de um excesso de um componente carboxílico em um componente amino, no qual a função carboxílica é pré-ativada ou ativada in situ usando um reagente de acoplamento e, se desejado, um aditivo. Após a etapa de acoplamento, as funções carboxílicas ativadas residuais são removidas pela adição de um removedor na mistura reacional. Subseqüentemente, os grupos protetores temporários são removidos empregando métodos adequados conhecidos na técnica, seguidos pela remoção do composto removido pela extração aquosa básica. Ao mesmo tempo, um excesso de componente carboxílico possivelmente presente que não fora ativado e cujo grupo protetor temporário também não fora removido durante a desproteção, é extraído da mistura reacional. O termo componente amino refere-se a uma molécula compreendendo uma função amino livre. Em particular, o componente amino pode ser uma amina, aminoácido ou oligopeptídeo que possui uma função amino livre e cujos outros grupos funcionais estão protegidos em uma tal maneira que eles não interferem com a reação de acoplamento desejada. A função C-terminal do polipeptídeo ou do aminoácido aplicado pode ser desprotegida como uma amida substituída ou não substituída ou como um éster; exemplos do último incluem - mas não se limitam a - metil, etil, t-butil, benzil, fenacil, 3-(3-metil)-pentil (Mpe), 2-(2-fenil)-propil (Pp), 2-cloro-tritil (Clt), difenil-(4-piridil)-metil (PyBzh), diciclo-propil-metil (Dcpm), 9-fluorenil-metil (Fm), alil (All), 2-(trimetil-silil)-etil (Tmse), 4-{N-[l-4,4-dimetil,2,6-dioxo-ciclo-hexilideno)-3-metil-butil]-amino-benzil (Dman) ésteres e ésteres enzimaticamente cliváveis [Roeske, R.W. (1981) em: 'The Peptides', vuí. 3 (Gross, E. e Meienhofer, J., eds.) Academic Press, New York, pp. 101-136; para Mpe: Karlstrõm, A. e Undén, A. (1996) Tetrahedron Lett. 37,4343-4246; para Pp: Yue, C. et al. (1993) Tetrahedron Lett. 34, 323-326; para Clt: Athanassopoulos, P. et al. (1995) Tetrahedron Lett. 36, 5645-5648; para PyBzh: Mergler, M. et al. (2001) P154, 2nd International Peptide Symposium & 17th American Peptide Symposium; para Dcpm: Carpino, L.A. et al. (1995) J. Org Chem. 60,7718-7719; para Fm: AI-Obeidi, F. et al. (1990) Int. J. Peptide Protein Res. 35, 215-218; para All: Kunz, H. et al. (1985) Int. J. Peptide Protein Res. 26, 493-497; para Tmse: Sieber, P. (1977) Helv. Chim. Acta 60, 2711-2716; para Dmab: Chan, W.C. et al. (1995) J. Chern. Soc., Chem. Commun., 2209-2210]. Funções do tipo t-butila ou funções de labilidade semelhante são preferidas para a proteção permanente de outros grupos funcionais no componente amino; estas incluem - mas não se limitam a - t-butila (*Bu) para a proteção de cadeias laterais de Tyr, Thr, Ser, Glu e Asp, t-butoxicarbonila (Boc) para a proteção de cadeias laterais de Lys e Trp, tritila (Trt) para a proteção de cadeia laterais de Asn, Gin e His e 2,2,5,7,8-pentametil-cromano-6-sulfonila (Pmc) ou 2,2,4,6,7-pentametil-di-hidro-benzofurano-5-sulfonila (Pbf) para a proteção da cadeia lateral de Arg [Barany, G. e Merrifield, R.B. (1980) em: 'The Peptides', vol. 2 (Gross, E. e Meienhofer, J., eds.) Academic Press, New York, pp. 1-284; para Trp(Boc): Franzen, H. et al. (1984) J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1699-1700; para Asn(Trt) e Gln(Trt): Sieber, P. e Riniker, B. (1991) Tetrahedron Lett. 32, 739-742; para His(Trt): Sieber, P. e Riniker, B. (1987) Tetrahedron Lett. 28,6031-6034; para Pmc: Ramage, R. e Green, J. (1987) Tetrahedron Lett. 28, 2287-2290; para Pbf: Carpino, L.A. et al. (1993) Tetrahedron Lett. 34, 7829-7832]. O termo componente carboxílico refere-se a uma molécula compreendendo uma função carboxílica livre. Em particular, o componente carboxílico pode ser qualquer ácido carboxílico, aminoácido ou oligopeptídeo que possua uma função carboxílica livre e cujos os outros grupos funcionais estão protegidos em uma tal maneira que eles não interferem com a reação de acoplamento desejada. Em uma modalidade preferida, o grupo amino do aminoácido ou oligopeptídeo aplicado está temporariamente protegido por uma função benziloxicarbonila (Z); outros exemplos incluem - mas não se limitam a - as funções Boc, Trt, fluoren-9-il-metoxicarbonila (Fmoc), 2-(metilsulfonil)-etoxicarbonila (Msc), aliloxicarbonila (Alloc), as funções do tipo arilsulfonila, tal como orto-nitrobenzenosulfonila (o-NBS) e as funções enzimaticamente cliváveis [Geiger, R. e Kõnig, W. (1981) em: 'The Peptides' vol. 3 (Gross, E. e Meienhofer, J., eds.) Academic Press, New York, pp. 1-99; para Alloc: Kunz, H. e Unverzagt, C. (1984) Angew. Chem. 96, 426-427; para arilsulfonila: Fukuyama, T. et al. (1997) Tetrahedron Lett. 38, 5831-5834]. As funções do tipo t-butila ou as funções de labilidade semelhante são preferidas para a proteção permanente dos outros grupos funcionais no componente carboxílico, como descrito acima para o componente amino. O componente carboxílico pode ser pré-ativado como um éster ativo, preferivelmente uma N-hidróxi-succinimida, benzoil-triazol-l-ila, pentafluorofenila ou 4-nitro-fenil-éster, um haleto, um N-carbóxi-anidrido ou um anidrido sintético. Altemativamente, o componente carboxílico pode ser ativado in situ como um anidrido misto ou usando um reagente de acoplamento, tal como carbodiimida, preferivelmente Ν,Ν'-diciclo-hexil-carbodiimida (DCC) ou cloridrato de l-(3'-dimetil-amino-propil)-3-etil-carbodiimida (EDC), um sal de urônio ou de fosfônio na possível presença de um aditivo de acoplamento, preferivelmente N-hidróxi-succinimida (HONSu), 1-hidróxi-benzotriazol (HOBt), 3-hidróxi-4-oxo-3,4-di-hidro-l,2,3-benzotriazina (HOOBt), 1-hidróxi-7-aza-benzotriazol (HOAt) ou 6-cloro-1-hidróxi-benzotriazol (Cl-HOBt) e se requerido na presença de uma amina terciária [The Peptides', vol. 1 (1979) (Gross, E. e Meienhofer, J., eds.) Academic Press, New York; Li, P. e Xu, J.-C. (2000) Chin. J. Chem. 18,456-466]. O grupo protetor temporário pode ser removido de acordo com métodos conhecidos na técnica (veja acima). A função Z pode ser removida por hidrogenólise usando procedimentos (padrão) que aplicam, por exemplo gás hidrogênio ou formiato como um doador de hidrogênio. Durante este processo todos os grupos protetores do tipo benzila são removidos e os grupos protetores do tipo t-butila ou funções de labilidade semelhante são mantidos. Os últimos podem ser removidos por acidólise de acordo com métodos conhecidos na técnica.

Uma pessoa experiente na técnica entenderá o que significa o termo extração aquosa básica. Contudo, as extrações aquosas básicas são preferivelmente realizadas empregando soluções aquosas de hidrogeno carbonato de sódio ou de carbonato de sódio, se desejado na presença de cloreto de sódio ou de nitrato de potássio. O termo extração aquosa ativa refere-se a uma extração na qual quer um componente amino é extraído sob condições ácidas na forma protonada (amônio) quer um componente carboxílico é extraído sob condições básicas na forma desprotonada (carboxilato). A invenção é adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos, que não são para serem interpretados como uma limitação desta invenção. EXEMPLO 1 H-Asp(OtBu)-Phe-OtBu Em uma suspensão de 5,52 g de H-Phe-OlBu.HCl em uma mistura de acetato de etila e diclorometano a 20°C, foram adicionados 7,76 g de Z-Asp(OlBu)-OH, 3,24 g de 1-hidróxi-benzotriazol, 4,20 g de cloreto 1-(3'-dimetil-amino-propil)-3-etil-carbodiimida e 4,62 ml de 4-metil-morfolina. Após agitação da solução resultante até término da reação, 1,21 ml de 4-metil-morfolina e 3,51 g do sal de p-toluenossulfonato de β-alaninato de benzila foram adicionados. A mistura foi agitada por mais 30 minutos e foi extraída com 5% Na2CO3/10% NaCl, 5% KHSO4/10% NaCl e 5% Na2CO3/10% NaCl. A camada orgânica contendo o dipeptídeo Z-Asp(OlBu)-Phe-OlBu protegido foi submetida à hidrogenólise catalítica na presença de paládio sobre carvão. Com o término da reação foi adicionado 5% Na2CO3/10% NaCl e a suspensão resultante foi filtrada. O resíduo foi lavado com uma mistura de acetato de etila e diclorometano, e os filtrados orgânicos combinados foram extraídos com 5% Na2CO3/10% NaCl, 30% NaCl e água. A camada orgânica foi evaporada até a secura para dar o dipeptídeo desejado com rendimento quantitativo. Pureza: 98,4% por HPLC em fase reversa (24 a 68% acetonitrila e 0,1% ácido trifluoroacético em 29 minutos a 220 nm, 2,0 ml/min., coluna Ci8 de 5 micrômetros). Identidade: m/z 393,4 [M+H]+ por eletropulverização MS; !H RMN (CDC13) δ 1,41 (s, 9H), 1,46 (s, 9H), 1,63 (bs, 2H), 2,39 (dd, 1H), 2,79 (dd, 1H), 3,39 (d, 2H), 3,65 (m, 1H), 4,72 (m, 1H), 7,17-7,32 (m, 5H), 7,81 (d, 1H). EXEMPLO 2 K-Leu-Phe-NH-(CH2>7-CH3 Em uma solução agitada de 2,12 ml de n-octilamina em acetato de etila a 20°C, foram adicionados 4,61 g de Z-Phe-OH, 2,08 g de 1-hidróxi-benzotriazol, 2,71 g de cloridrato de l-(3'-dimetil-amino-propil)-3-etil-carbodiimida e 1,55 ml de 4-metil-morfolina. Após agitação da suspensão resultante até término da reação, 0,78 ml de 4-metil-morfolina e 2,26 g do sal de p-toluenossulfonato de β-alaninato de benzila foram adicionados. A mistura foi agitada por mais 30 minutos e foi extraída com 5% Na2CO3/10% NaCl, 5% KHSO4/10% NaCl e 5% Na2CO3/10% NaCl. A camada orgânica contendo Z-Phe-NH-(CH2)7-CH3 foi diluída com 1-metil-2-pirrolidinona e submetida à hidrogenólise catalítica na presença de paládio sobre carvão. Com o término da reação foi adicionado 30% NaCl e a suspensão resultante foi filtrada. O resíduo foi lavado com acetato de etila, e os filtrados combinados foram extraídos com 5% Na2CO3/10% NaCl e 30% NaCl.

Na camada orgânica contendo H-Phe-NH-(CH2)7-CH3 a 20°C, foram adicionados 4,09 g de Z-Leu-OH, 2,08 g de 1-hidróxi-benzotriazol, 2,71 g de cloridrato de l-(3'-dimetil-amino-propil)-3-etil-carbodiimida, 1,55 ml de 4-metil-morfolina e l-metil-2-pirrolidinona. Após agitação da suspensão resultante até o término da reação, 0,78 ml de 4-metil-morfolina e 2,26 g do sal de p-toluenossulfonato de β-alaninato de benzila foram adicionados. A mistura foi agitada por mais 30 minutos e foi extraída com 30% NaCl, 5% Na2CO3/10% NaCl, 5% KHS(V10% NaCl e 5% Na2CO3/10% NaCl. A camada orgânica contendo Z-Leu-NH-(CH2)7-CH3 foi diluída com l-metil-2-pirrolidinona e submetida à hidrogenólise catalítica na presença de paládio sobre carvão. Com o término da reação, foi adicionado 5% Na2CO3/10% NaCl e a suspensão resultante foi filtrada a 45°C. O resíduo foi lavado com acetato de etila, e os filtrados orgânicos combinados foram extraídos com 5% Na2CO3/10% NaCl, 30% NaCl e água. A camada orgânica foi evaporada até a secura para dar o produto desejado com rendimento de 85%.

Pureza: 99,3% por HPLC de fase reversa (24 a 68% acetonitrila em 0,1% ácido trifluoroacético em 29 minutos a 220 nm, 2,0 ml/min., coluna Cis de 5 micrômetros). Identidade: m/z 390,4 [M+H]+, 412,4 [M+Na]+, 388,2 [M-H]', 434,2 [M+HCOO]' por eletropulverização MS; *H RMN (CDC13) δ 0,89 (m, 9H), 1,12-1,39 (m, 14H), 1,50-1,60 (m, 3H), 3,01-3,02 (m, 4H), 3,35 (dd, 1H), 4,53 (dd, 1H), 5,90 (t, 1H), 7,19-7,32 (m, 5H), 7,83 (d, 1H).

Conclusão: \ pureza e a identificação dos produtos acima demonstram que os excessos de componente carboxílico (ativado) têm sido removidos completamente e a inserção de seqüências de peptídeo não tem sido formada usando 0 processo desta invenção.

Claims (11)

1. Processo para a preparação de compostos contendo uma ou mais ligações amida, caracterizado pelo fato de usar um excesso de um componente carboxílico ativado para acilar um componente amino, em que, após a acilação, uma amina compreendendo um ânion latente é usada como um removedor de funções carboxílicas ativadas residuais, o ânion latente na amina removedora possuí um grupo protetor temporário que pode ser seletivamente removido na presença de quaisquer grupos protetores permanentes ligados no peptídeo crescente.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto que contém uma ou mais ligações amida é um peptídeo.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o ânion latente na amina removedora possui um grupo protetor temporário que mostra uma labilidade semelhante àquela do grupo protetor temporário presente na terminação N do peptídeo crescente.

4. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que os grupos protetores temporários são grupos hidrogenoliticamente removíveis enquanto que os grupos protetores permanentes são grupos acidoliticamente removíveis,

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que os grupos protetores temporários são do tipo benzila.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o removedor é uma amina primária,

7. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a amina primária é um derivado de aminoácido C-terminalmente protegido.

8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o aminoácido é β-alanina ou um derivado da mesma.

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o removedor é β-alaninato de benzila ou um sal do mesmo.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que um tiol compreendendo um ânion latente é usado como um removedor no lugar de uma amina compreendendo um ânion latente.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o processo é realizado em solução.