ES2340885T3 - Hidrolisis enzimatica selectiva de esteres terc-butilicos c terminal de peptidos. - Google Patents
Hidrolisis enzimatica selectiva de esteres terc-butilicos c terminal de peptidos. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2340885T3 ES2340885T3 ES07703919T ES07703919T ES2340885T3 ES 2340885 T3 ES2340885 T3 ES 2340885T3 ES 07703919 T ES07703919 T ES 07703919T ES 07703919 T ES07703919 T ES 07703919T ES 2340885 T3 ES2340885 T3 ES 2340885T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- peptide
- protected
- terminal
- synthesis
- hydrolysis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 79
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 title claims abstract description 6
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 68
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 55
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 35
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims abstract description 19
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 16
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical group CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 51
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 24
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 24
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 20
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 16
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 14
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 13
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 13
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 12
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 9
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 claims description 8
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 6
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 claims description 5
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 claims description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 5
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000000266 alpha-aminoacyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 claims description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 4
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 claims description 3
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 claims description 3
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 claims description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 3
- ODIGIKRIUKFKHP-UHFFFAOYSA-N (n-propan-2-yloxycarbonylanilino) acetate Chemical compound CC(C)OC(=O)N(OC(C)=O)C1=CC=CC=C1 ODIGIKRIUKFKHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 2
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 claims 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 claims 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 description 12
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 description 12
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 150000002148 esters Chemical group 0.000 description 11
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 7
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 7
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 7
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- -1 His Chemical compound 0.000 description 5
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N N-Heptane Chemical compound CCCCCCC IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 3
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 3
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000003495 polar organic solvent Substances 0.000 description 2
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- DYWUPCCKOVTCFZ-LBPRGKRZSA-N (2s)-2-amino-3-[1-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonyl]indol-3-yl]propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2N(C(=O)OC(C)(C)C)C=C(C[C@H](N)C(O)=O)C2=C1 DYWUPCCKOVTCFZ-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 108010054792 4-nitrobenzyl esterase Proteins 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100494530 Brassica oleracea var. botrytis CAL-A gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 101710098556 Lipase A Proteins 0.000 description 1
- 101710099648 Lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 102100026001 Lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase Human genes 0.000 description 1
- 241001661345 Moesziomyces antarcticus Species 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-M beta-alaninate Chemical compound NCCC([O-])=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- BXRNXXXXHLBUKK-UHFFFAOYSA-N piperazine-2,5-dione Chemical compound O=C1CNC(=O)CN1 BXRNXXXXHLBUKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000009993 protective function Effects 0.000 description 1
- 230000001012 protector Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
- C07K1/023—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution using racemisation inhibiting agents
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Un proceso para la hidrólisis enzimática selectiva de ésteres terc-butílicos C terminales de sustratos peptídicos en la síntesis de péptidos, que comprende hidrolizar uno o más sustratos peptídicos que comprenden ésteres terc-butílicos C terminales usando la proteasa subtilisina en cualquier forma adecuada.
Description
Hidrólisis enzimática selectiva de ésteres
terc-butílicos C terminal de péptidos.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La invención se refiere a un proceso de
hidrólisis enzimática selectiva de ésteres terc-butílicos C
terminales de sustratos peptídicos en la síntesis de péptidos.
En la síntesis de péptidos la selección
apropiada de grupos protectores es muy importante. En la síntesis
química de péptidos, el alargamiento del péptido en crecimiento
habitualmente ocurre en la dirección N terminal para evitar la
ramecización de los aminoácidos constituyentes. Para permitir el
alargamiento gradual del péptido en crecimiento en dirección N
terminal, el grupo protector de la función amino N terminal es de
una naturaleza temporal. Este grupo se escinde selectivamente del
péptido en cada ciclo de una síntesis peptídica sin afectar a los
grupos protectores semipermanentes en las cadenas laterales
funcionales y el extremo C. Los grupos funcionales en las cadenas
laterales de los aminoácidos constituyentes habitualmente están
protegidos para evitar las reacciones secundarias.
En la síntesis química de péptidos, se puede
seguir un enfoque completamente lineal o un enfoque convergente, es
decir, un enfoque en el que el péptido final se ensambla a partir de
fragmentos peptídicos protegidos. El último enfoque generalmente se
prefiere para péptidos más largos, ya que los rendimientos globales
son intrínsecamente más altos y se pueden preparar fragmentos
paralelamente lo que da como resultado un tiempo de síntesis global
más corto. En una síntesis convergente, todos los fragmentos excepto
el fragmento C terminal se tienen que proteger en su extremo C con
una función protectora que se puede escindir selectivamente. En el
caso de síntesis peptídica en un soporte sólido, esta función
habitualmente se proporciona por un asa en el propio soporte. Sin
embargo, para la síntesis peptídica en una escala industrial se
prefiere la síntesis en fase de solución por enzima de la síntesis
en fase sólida. Particularmente se prefiere una síntesis de acuerdo
con DioRaSSF^{1}®, un método en fase de solución que combina las
ventajas de la fase sólida y el proceso en fase de solución clásico
(documentos EP-A-1.291.356; US
6.864.357; Eggen I. et al., Org. Process Res. Dev. 2005, 9,
98-101; Eggen I. et al., J. Pept. Sci. 2005,
11.633-641).
El éster C terminal en una síntesis convergente
debería ser estable en las condiciones del ensamblaje del péptido y
más particularmente en las condiciones de desprotección del grupo
protector N terminal temporal, que se repite en cada ciclo de una
síntesis peptídica. Por otra parte, el grupo protector N terminal y
los grupos protectores de las cadenas laterales necesitan
permanecer sin afectarse cuando el éster en el extremo C se retira
antes del propio acoplamiento de fragmento. Aunque se conoce una
variedad de ésteres que se pueden usar para la protección del
extremo C de los fragmentos peptídicos y están disponibles varias
opciones para la desprotección química, ninguno de los métodos
disponibles es generalmente aplicable. La mayoría de estos ésteres
son de una naturaleza primaria, por ejemplo, ésteres metílicos, y
por tanto, dan origen a formación de dicetopiperazina en la fase
del dipéptido desprotegido. Adicionalmente, la introducción de la
función éster con frecuencia requiere una activación relativamente
fuerte de la función carboxílica que da como resultado la pérdida
de la integridad enantiomérica del aminoácido esterificado.
Finalmente, la función de éster con frecuencia se desbloquea en
condiciones ácidas o básicas que conducen a modificaciones en el
propio péptido. Basándose en su estabilidad elevada, su facilidad
de introducción y su amplia disponibilidad comercial, se prefiere
el éster terc-butílico si se puede conseguir la desprotección
selectiva en presencia de grupos protectores de cadena lateral. Sin
embargo, la desprotección química generalmente no es aplicable para
este propósito.
Los métodos enzimáticos han ganado interés en la
síntesis peptídica durante el último par de años. Las enzimas con
frecuencia muestran selectividad química, de región y
estereoselectividad elevada. Además, las enzimas habitualmente
funcionan en condiciones muy suaves, a valores de pH neutros y a
temperaturas de 20-50ºC. Por tanto, en tales
condiciones, se pueden evitar las reacciones secundarias catalizadas
por ácido o base.
En la técnica se conoce que algunos grupos
protectores se pueden escindir por enzimas, que se pueden usar en
el desbloqueo de péptidos. En particular se pueden aplicar ésteres,
que se pueden hidrolizar mediante lipasas, esterasas y proteasas.
Las lipasas y esterasas habitualmente se consideran más generalmente
aplicables a química de grupos protectores en síntesis peptídica,
ya que una desventaja de las proteasas es que las mismas también
pueden hidrolizar los enlaces peptídicos (actividad endopeptidasa).
Recientemente, se ha observado que determinadas lipasas y esterasas
que portan el motivo de aminoácido GGG(A)X (donde G
indica glicina y X cualquier aminoácido; en pocas enzimas una
glicina se reemplaza por alanina, A) muestran remoción leve y
selectiva de grupos protectores de éster terc-butílico en
derivados de aminoácidos y compuestos relacionados. Se concluyó que
en particular dos enzimas, BsubpNBE (p-nitrobenzil esterasa
recombinante de Bacillus subtilis producida en E.
coli) y CAL-A (lipasa A de Candida
antarctica (Novozymes)) se pueden usar en química orgánica
sintética para escindir ésteres terc-butílicos a partir de
diversos sustratos (Schmidt M. et al., J. Org. Chem. 2005,
70, 3737-3740). Sin embargo, las actividades de esas
enzimas no se han ensayado en ésteres terc-butílicos C
terminales de péptidos, con la excepción de un dipéptido que no
mostró ninguna actividad. La solubilidad de péptidos protegidos
probablemente comportará un problema en los sistemas de disolvente
que se han aplicado para ensayar las actividades enzimáticas, que
usan en particular tolueno, n-hexano y éter dietílico como
co-disolventes. Sin embargo, en general, los
péptidos protegidos y especialmente los péptidos protegidos largos
requieren disolventes orgánicos polares para disolverse (por
ejemplo, DMF, NMP, diclorometano, metanol o acetonitrilo).
A pesar del hecho de que las proteasas son menos
preferidas, el uso de una proteasa denominada termitasa se dice que
ha dado como resultado la hidrólisis eficaz de ésteres peptídicos
(Schultz M. et al., Synlett. 1992, 1,37-38).
Sin embargo, la termitasa no ha encontrado un uso amplio en la
síntesis peptídica desde el momento en el que se ha indicado esto.
Entre otras razones, esto se puede deber a su disponibilidad
comercial limitada (código de familia EC 3.4.21.66), que impide
gravemente el cambio de escala a una escala industrial. Por tanto,
todavía existe una necesidad de procesos enzimáticos aplicables de
forma general para la remoción de ésteres C terminales, en
particular, ésteres terc-butílicos, en química peptídica,
especialmente para procesos a escala industrial.
Además, como una alternativa a la síntesis
química de péptidos, existe un interés creciente en la síntesis
enzimática de péptidos, en la que las etapas tanto de acoplamiento
como de desprotección pueden estar mediadas por enzimas
específicas. Debido a que las etapas de acoplamiento mediadas por
enzimas no suscitan ramecización a diferencia de la alternativa
química, el alargamiento del péptido en crecimiento en síntesis
enzimática de péptidos puede ocurrir en dirección C terminal. Una
síntesis de este tipo es, en efecto, una síntesis convergente en la
que el fragmento C terminal se reemplaza por un derivado de
aminoácido; por lo tanto, sería igualmente de beneficio a partir de
la disponibilidad de procesos enzimáticos aplicables generalmente
para la remoción de ésteres C terminales, en particular ésteres
terc-butílicos.
Finalmente, la disponibilidad de procesos
aplicables de forma general para la remoción de ésteres C
terminales, en particular ésteres terc-butílicos, sería muy
provechosa en la síntesis peptídica que comprende ciclaciones
peptídicas que implican el extremo C del precursor lineal (es decir,
ciclaciones de cabeza a cola y de cola a cadena lateral). Tales
ciclaciones pueden tener lugar en solución, pero también en un
soporte sólido cuando el precursor lineal está anclado a través de
su extremo N o una cadena lateral.
Ahora se ha encontrado un nuevo proceso para la
hidrólisis enzimática selectiva de ésteres terc-butílicos C
terminales de sustratos peptídicos en la síntesis de péptidos, que
comprende hidrolizar uno o más sustratos peptídicos que comprenden
ésteres terc-butílicos C terminales que usan la proteasa
subtilisina en cualquier forma adecuada.
De forma sorprendente, se ha observado que se
pueden obtener rendimientos altos, hasta cuantitativos, del
producto hidrolizado usando la proteasa subtilisina, mientras la
actividad endopeptidasa está sustancialmente suprimida.
El proceso nuevo de esta invención se puede usar
convenientemente en la producción de péptidos protegidos o no
protegidos. El proceso es en particular favorable en síntesis
convergente de péptidos.
Preferiblemente, el éster terc-butílico C
terminal de los sustratos peptídicos comprende un resto acilo C
terminal que es un resto \alpha-amino acilo de
origen natural o sintético. El resto \alpha-amino
acilo C terminal puede estar protegido o no protegido en la cadena
lateral. Los restos \alpha-amino C terminales
seleccionados entre Ala, Cys protegida, Asp protegida, Glu
protegida, Phe, Gly, His, Lys (protegida), Leu, Met, Asn, Gln
(protegida), Arg (protegida), Ser (protegida), Thr, Val, Trp
(protegida) y Tyr (protegida) son particularmente preferidos, en
los que los paréntesis alrededor de la palabra "protegida"
significan que el resto puede estar presente en forma de cadena
lateral tanto protegida como no protegida. En este caso se usa el
código de tres letras de aminoácidos de acuerdo con la nomenclatura
IUPAC (IUPAC-IUB Commission (1985) J. Biol. Chem.
260, 14-42).
Preferiblemente, los sustratos peptídicos
protegidos o no protegidos usados en el proceso de esta invención
se preparan mediante síntesis en fase de solución. En una
realización adicional preferida, los sustratos peptídicos
protegidos o no protegidos usados en el proceso de esta invención se
preparan de acuerdo con DioRaSSP®. Por tanto, un sustrato peptídico
que comprende un éster terc-butílico C terminal
preferiblemente se prepara de acuerdo con este proceso para
síntesis en solución rápida de un péptido en un disolvente orgánico
o una mezcla de disolventes orgánicos, comprendiendo el proceso los
ciclos repetitivos de las etapas (a)-(d):
- (a)
- una etapa de acoplamiento, que usa un exceso de un componente carboxílico activado para acilar un componente amino,
- (b)
- una etapa de inactivación en la que se usa un eliminador para retirar funciones carboxílicas activadas residuales, en la que el eliminador también se puede usar para la desprotección del péptido en crecimiento,
- (c)
- una o más extracciones acuosas y
opcionalmente, (d) una etapa de desprotección
separada, seguida por una o más extracciones acuosas,
por lo que en al menos un ciclo en la etapa b
del proceso una amina que comprende un anión libre o un anión
latente se usa como un eliminador de funciones carboxílicas
activadas residuales. La amina preferiblemente es bencil
\beta-alaninato o una sal de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
La hidrólisis del proceso de la presente
invención se puede realizar en un tampón acuoso. Sin embargo, con
propósitos de solubilidad y/o para suprimir la actividad
endopeptidasa, la hidrólisis del proceso de la invención
preferiblemente se realiza en una mezcla de un tampón acuoso y uno o
más disolventes orgánicos. Los tampones adecuados se pueden
seleccionar entre tampones que se usan generalmente para
transformaciones que usan enzimas proteolíticas. En particular, el
tampón acuoso es un tampón fosfato, borato o TRIS. Los disolventes
orgánicos polares son preferidos, y en particular el disolvente
orgánico se selecciona entre N,N-dimetilformamida (DMF),
N,N-metil-2-pirrolidona
(NMP), dioxano, N,N-dimetilacetamida (DMA), diclorometano
(DCM), tetrahidrofurano (TF), acetonitrilo y terc-butanol.
Particularmente preferido es DMF. Por consiguiente, el porcentaje
del disolvente orgánico en la mezcla puede variar del 0 al 60%
(v/v), preferiblemente del 30 al 60% (v/v). Es especialmente útil
cuando el porcentaje del disolvente orgánico en la mezcla es de
aproximadamente el 50-60% (v/v).
El pH al que se realiza la reacción se puede
seleccionar entre el intervalo de 6,5-10, en
particular 6,5-8 y preferiblemente el pH es 7.
Las temperaturas de reacción para la hidrólisis
se pueden seleccionar adecuadamente en el intervalo de
20-60ºC. Se prefiere una temperatura de reacción de
40ºC.
La cantidad de enzima se puede seleccionar
adecuadamente en el intervalo del 1 al 50% p de enzima con relación
al sustrato peptídico. En una realización adicional de la invención,
la hidrólisis se realiza gradualmente añadiendo porciones de la
proteasa subtilisina (en cualquier forma adecuada) a la mezcla de
reacción que comprende uno o más sustratos peptídicos que
comprenden ésteres terc-butílicos C terminales.
Los sustratos peptídicos de los cuales se
hidrolizan los ésteres terc-butílicos C terminales en el
proceso de la invención, pueden llevar grupos protectores en otras
partes de su secuencia peptídica.
La hidrólisis se puede realizar con un sustrato
peptídico así como una mezcla del mismo. Se ha establecido que el
rendimiento de la hidrólisis de una mezcla de sustratos peptídicos
que comprende ésteres terc-butílicos C terminales no está
significativamente reducido por la presencia de más de un sustrato
peptídico.
Un proceso adecuado de acuerdo con la presente
invención es el siguiente.
A una solución agitada de un éster
terc-butílico de un péptido en una mezcla de un disolvente
orgánico adecuado (o mezcla de disolventes orgánicos) y un tampón,
se añade subtilisina [por ejemplo: a 0,1 mmol de un éster
terc-butílico de un péptido en una mezcla de 2,5 ml de DMF y
2,5 ml de tampón fosfato de sodio (0,1 M, pH 7,0, 40ºC), se añaden
5 mg de subtilisina]. Cuando la conversión de sustrato ha alcanzado
un nivel deseado, por ejemplo mayor del 95% (determinado por HPLC),
se añade una cantidad de acetato de etilo. Después de la separación
de la fase acuosa, la fase orgánica se extrae dos veces con solución
de cloruro de sodio y se concentra en vacío. El péptido o fragmento
peptídico desprotegido en el extremo C se aísla por precipitación
con un no disolvente como éter dietílico, éter terc-butílico
de metilo o heptano. En caso de una enzima inmovilizada, la enzima
se retira mediante filtración antes del procedimiento de tratamiento
descrito.
La proteasa subtilisina (EC 3.4.21.62) se puede
usar en el proceso de la invención en cualquier forma, por tanto,
la misma se puede usar en forma soluble y/o cristalizada, pero
también en forma inmovilizada u otra forma insoluble, por ejemplo,
en la forma de agregados de enzima reticulados (CLEA) o cristales de
enzima reticulados (CLEC).
El término "sustrato" en este documento se
refiere a una entidad que se convierte en un producto mediante la
proteasa subtilisina en cualquier forma. Este producto puede ser un
producto peptídico final por lo que si estuvieran presentes sólo
los grupos laterales protegidos todavía tendrían que desprotegerse.
Como alternativa, este producto también puede ser un fragmento
peptídico que posteriormente se somete a reacción con otros
fragmentos peptídicos en una síntesis convergente para obtener un
péptido más largo con el número final necesario de aminoácidos.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Un experto en la materia puede identificar
fácilmente sustratos adecuados, por ejemplo, realizando una
hidrólisis de ensayo sencilla de un péptido seleccionado que
comprende una funcionalidad de éster terc-butílico C
terminal en condiciones adecuadas como se ha descrito en este
documento anteriormente y a continuación conversión, por ejemplo,
mediante técnicas de HPLC. Se ha encontrado por hidrólisis de
dipéptidos modelo de la estructura general
Z-Val-X-OBu^{t}
en presencia de Alcalasa CLEA y DMF al 50% v/v (véase el Ejemplo 3
para más detalles) que la reactividad para estos sustratos modelo
que comprenden una funcionalidad de éster terc-butílico C
terminal se puede dividir en cuatro categorías:
Si se indica que la reactividad es
"insensible", también después de la optimización, el péptido
seleccionado no es un sustrato de acuerdo con la invención.
Basándose en la estructura de estos sustratos
peptídicos modelo los resultados se consideran indicativos de la
reactividad del derivado de aminoácido seleccionado X hacia la
proteasa subtilisina en cualquier forma adecuada. Esto se comprueba
mediante el Ejemplo 5 en el que se ha ensayado qué combinaciones de
aminoácidos son susceptibles de actividad endopeptidasa de la
proteasa subtilisina. Más particularmente, los sustratos de
tretapéptido modelo de la estructura general
Z-Val-Val-X-Leu-OBu^{t}
se hidrolizaron en presencia de Alcalasa CLEA y DMF al 50% v/v
(véase el Ejemplo 5 para más detalles). Además, el Ejemplo 5
demuestra que la actividad esterasa en relación con el derivado de
aminoácido X es indicativa de la actividad endopeptidasa en
relación con ese derivado de aminoácido X. Sin embargo, se enfatiza
que en condiciones optimizadas del proceso de la presente invención
la actividad endopeptidasa es significativamente más baja que la
actividad esterasa.
Se ha establecido que el proceso es muy adecuado
para preparar péptidos cortos, tales como dipéptidos, tripéptidos y
tetrapéptidos. Además, basándose en los argumentos mencionados
anteriormente en base a los Ejemplos 3 y 5 un experto también es
capaz de preparar péptidos más largos que comprenden derivados de
aminoácidos que se espera que tengan reactividad mala o mediocre en
cualquier posición del péptido excepto el extremo C. En este
sentido, los derivados de D-aminoácidos se pueden
considerar derivados de aminoácido insensibles y, por tanto se
pueden preparar péptidos también con D-aminoácidos
en cualquier posición excepto el extremo C.
El término "protegido" se refiere a que los
grupos funcionales (dentro del péptido) están protegidos con grupos
protectores adecuados. Un experto en la materia sabrá qué tipo de
protección seleccionar para qué tipo de grupo funcional. Por
ejemplo, las funciones amina presentes en los compuestos se pueden
proteger durante el procedimiento sintético mediante un grupo
N-protector, que se refiere a un grupo usado
comúnmente en la química peptídica para la protección de un grupo
a-amino, como el grupo
ter-c-butiloxicarbonilo (Boc), el grupo
benciloxicarbonilo (Z) o el grupo
9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc). Se proporcionan
visiones de conjunto de grupos protectores amino y métodos para su
remoción en: Geiger R. y Konig W. (1981) en Peptides: Analysis,
Synthesis, Biology, Vol 3, Gross E. y Meienhofer, J., eds, Academic
Press, New York, págs. 1-99, y Peptides: Chemistry
and Biology, Sewald N. y Jakubke H.-D., eds,
Wiley-VCH, Weinheim, 2002, págs.
143-154. Las funciones del tipo
terc-butílico o funciones de inestabilidad similar se
prefieren para la protección de otros grupos funcionales en las
cadenas laterales; éstas incluyen, pero sin limitación,
terc-butilo (But^{t}) para la protección de las
cadenas laterales de Asp, Glu, Ser, Thr y Tyr,
terc-butoxicarbonilo (Boc) para la protección de las cadenas
laterales de Lys y Trp, tritilo (Trt) para la protección de las
cadenas laterales de Asn, Gln y His y
2,2,5,7-8-pentametilcromano-6-sulfonilo
(Pmc) o
2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofurano-5-sulfonilo
(Pbf) para la protección de la cadena lateral de Arg [Barany, G. y
Merrifield, R.B. (1980) en: "The Peptides", vol. 2 (Gross, E.
y Meienhofer, J., eds.) Academic Press, New York, págs.
1-284; para Trp(Boc): Franzen, H. et
al. (1984) J. Chem. Soc, Chem. Commun.,
1699-1700; para Asn(Trt) y Gin (Trt): Sieber,
P. y Riniker, B. (1991) Tetrahedron Lett. 32,
739-742; para His(Trt): Sieber, P. y Riniker,
B. (1987) Tetrahedron Lett. 28, 6031-6034; para
Pmc: Ramage, R. y Green, J. (1987) Tetrahedron Lett. 28,
2287-2290; para Pbf: Carpino, L.A. et al.
(1993) Tetrahedron Lett. 34, 7829-7832].
La invención se ilustra adicionalmente mediante
los siguientes ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
El tetrapéptido del Ejemplo 2 y el tetrapéptido
del Ejemplo 5 donde X=Met se han preparado de acuerdo con DioRaSSP®
(documentos EP-A-1.291.356; US
6.864.357; Org. Process Res. Dev. 2005, 9, 98-101;
Eggen I. et al., J. Pept. Sci. 2005, 11,
633-641), mientras que los dipéptidos, tripéptidos y
el tetrapéptido del Ejemplo 5 donde X=Arg se han producido de
acuerdo con métodos en fase de solución convencionales para síntesis
peptídica. Los otros tetrapéptidos del Ejemplo 5 se preparan de
acuerdo con métodos en fase de solución convencionales aplicando un
protocolo de separación y mezcla. El protocolo de separación y
mezcla se ha aplicado para reducir la cantidad de trabajo de
preparación.
La enzima libre subtilisina A (S. Carlsberg)
usada en el Ejemplo 1 se adquirió en Sigma Aldrich. La enzima libre
subtilisina A usada en los otros Ejemplos se adquirió en Novozymes.
La Alcalasa CLEA se obtuvo en CLEA Technologies B.V., Delft, Países
Bajos.
\vskip1.000000\baselineskip
0,1 mmol de cada uno de los péptidos se disolvió
en una mezcla de temperatura controlada por termostato de 2,5 ml de
DMF y 2,5 ml de tampón fosfato 0,1 M pH 7. Se añadieron 5 mg de
enzima a la solución peptídica. La mezcla de reacción se incubó a
40ºC durante un total de dos horas. Las mezclas de reacción se
analizaron después de 2 horas usando HPLC.
(Algunos resultados seleccionados de buenos
sustratos de subtilisina se muestran)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
0,05 mmol de
Boc-Gly-Phe-Phe-Leu-OBu^{t}
se disolvieron en una mezcla con temperatura controlada por
termostato de 2,5 ml de NMP y 2,5 ml de tampón fosfato 0,1 M pH 8. A
esta solución se añadieron 5 mg de Alcalasa CLEA. La mezcla de
reacción se incubó a 40ºC durante un total de 17 horas. La
conversión de sustrato se determina mediante HPLC. La reacción dio
como resultado después de 17 h un rendimiento >95% de
Boc-Gly-Phe-Phe-Leu-OH.
\vskip1.000000\baselineskip
0,1 mmol de cada uno de los péptidos se
disolvieron en 2,5 ml de DMF. 5 mg de enzima se disolvieron en 2,5
ml de tampón fosfato 0,1 M pH 7 y se añadieron a la solución
peptídica. La mezcla de reacción se incubó a 40ºC durante un total
de seis horas. Las mezclas de reacción se analizaron después de 6
horas usando HPLC y LC/MS.
0,1 mmol de cada uno de los péptidos se
disolvieron en 2,5 ml de DMF. A esta solución se añadieron 5 mg de
enzima junto con 2,5 ml de tampón fosfato 0,1 M pH 7. La mezcla de
reacción se incubó a 40ºC durante un total de seis horas. Las
mezclas de reacción se analizaron después de 6 horas usando HPLC y
LC/MS.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
0,1 mmol de cada uno de los péptidos se
disolvieron en 2,5 ml de DMF. Subtilisina A se disolvió en 2,5 ml
de tampón fosfato 0,1 M pH 7 y se añadió a la solución peptídica. La
mezcla de reacción se incubó a 40ºC. Las mezclas de reacción se
muestrearon en los tiempos de reacción indicados y se analizaron
mediante HPLC. Cuando fueron necesarias, se añadieron porciones
adicionales de enzima en intervalos de 2 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
0,1 mmol de cada uno de los tetrapéptidos (o
mezclas de tetrapéptidos) se disolvieron en 2,5 ml de DMF. A esta
solución se añadieron 5 mg de enzima junto con 2,5 ml de tampón
fosfato 0,1 M pH 7 y se añadieron a la solución anterior. La mezcla
de reacción se incubó a 40ºC. Las mezclas de reacción se analizaron
después de 2 horas y 6 horas mediante HPLC. En el caso de que la
reacción no hubiera alcanzado la finalización se añadieron
porciones adicionales de enzima [5 mg cada una] al final de seis
horas y durante una noche (aproximadamente 24 horas de reacción).
La última alícuota se analizó mediante LC/MS para verificar la
presencia del compuesto deseado y cualquier impureza que fuera
Z-Val-Val-X-OH
y/o H-X-Leu-OH.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución agitada de 606 mg (1 mmol) de
Z-Val-Trp-Leu-OBu^{t}
en 25 ml de DMF, se añadieron 25 mg de Alcalasa CLEA junto con 25
ml de tampón fosfato 0,1 M pH 7. La mezcla se agitó a 40ºC. El
avance de la reacción se supervisó mediante HPLC. Se añadieron
porciones adicionales de enzima (25 mg de Alcalasa CLEA cada una)
después de 24 horas y después de 48 horas. Después de 6 días la
reacción se detuvo. La mezcla de reacción se acidificó a pH 2 y se
evaporó el DMF. El producto se extrajo con acetato de etilo. La capa
orgánica se secó usando sulfato de sodio, se concentró en vacío y
el producto final se precipitó a partir de heptano. No se
identificaron impurezas relacionadas con endopeptidasa durante el
análisis del compuesto final tanto por HPLC como LC/MS.
Producción: 96,2%
Pureza de HPLC: 96,5% a/a (del compuesto final
también contenía 2,5% a/a del material de partida).
Claims (24)
1. Un proceso para la hidrólisis enzimática
selectiva de ésteres terc-butílicos C terminales de sustratos
peptídicos en la síntesis de péptidos, que comprende hidrolizar uno
o más sustratos peptídicos que comprenden ésteres
terc-butílicos C terminales usando la proteasa subtilisina en
cualquier forma adecuada.
2. El proceso de la reivindicación 1, en el que
el sustrato peptídico que comprende el éster terc-butílico C
terminal comprende un resto acilo C terminal que es un resto
\alpha-amino acilo de origen natural o
sintético.
3. El proceso de la reivindicación 2, en el que
el resto \alpha-amino acilo se selecciona entre
Ala, Cys protegida, Asp protegida, Glu protegida, Phe, Gly, His,
Lys (protegida), Leu, Met, Asn, Gln, Arg (protegida), Ser
(protegida), Thr, Val, Trp (protegida) y Tyr (protegida).
4. El proceso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el sustrato peptídico es un di-,
tri- o tetrapéptido.
5. El proceso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el sustrato peptídico se prepara
mediante síntesis en fase de solución.
6. El proceso de la reivindicación 5, en el que
el sustrato peptídico se prepara de acuerdo con un proceso para
síntesis en solución rápida de un péptido en un disolvente orgánico
o una mezcla de disolventes orgánicos, comprendiendo el proceso
ciclos repetitivos de las etapas (a)-(d):
- a)
- una etapa de acoplamiento, que usa un exceso de un componente carboxílico activado para acilar un componente amino,
- b)
- una etapa de inactivación en la que se usa un eliminador para retirar funciones carboxílicas activadas residuales, en la que el eliminador también se puede usar para la desprotección del péptido en crecimiento,
- c)
- una o más extracciones acuosas y
opcionalmente, (d) una etapa de desprotección
separada, seguida por una o más extracciones acuosas,
por lo que en al menos un ciclo en la etapa b
del proceso una amina que comprende un anión libre o un anión
latente se usa como un eliminador de funciones carboxílicas
activadas residuales.
\vskip1.000000\baselineskip
7. El proceso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que la proteasa subtilisina es de la
familia EC 3.4.21.62.
8. El proceso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que la proteasa subtilisina es
subtilisina libre.
9. El proceso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que la proteasa subtilisina es
subtilisina de agregado de enzima reticulado (CLEA).
10. El proceso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que la hidrólisis se realiza en una
mezcla de un tampón acuoso y un disolvente orgánico.
11. El proceso de la reivindicación 10, en el
que el disolvente orgánico es un disolvente polar.
12. El proceso de la reivindicación 11, en el
que el disolvente orgánico se selecciona entre
N,N-dimetilformamida (DMF),
N-metil-2-pirrolidona (NMP),
dioxano, N,N-dimetilacetamida (DMA), diclorometano (DCM),
tetrahidrofurano (THF), acetonitrilo y terc-butanol.
13. El proceso de la reivindicación 12, en el
que el disolvente orgánico es DMF.
14. El proceso de una cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 13, en el que el porcentaje del disolvente
orgánico en la mezcla es del 50-60%.
15. El proceso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, en el que el pH al que se realiza la
reacción se selecciona entre el intervalo de
6,5-10.
16. El proceso de la reivindicación 15, en el
que el pH se selecciona entre intervalo de
6,5-8.
17. El proceso de la reivindicación 16, en el
que el pH es 7.
\newpage
18. El proceso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-17, en el que la temperatura de
reacción para la hidrólisis es 20-60ºC.
19. El proceso de la reivindicación 18, en el
que la temperatura de reacción para la hidrólisis es 40ºC.
20. El proceso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-19, en el que la cantidad de
enzima varía del 1 al 50% p con relación al sustrato peptídico.
21. El proceso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-20, en el que la hidrólisis se
realiza gradualmente añadiendo porciones de la proteasa subtilisina
en la mezcla de reacción que comprende uno o más sustratos
peptídicos que comprenden ésteres terc-butílicos C
terminales.
22. Un proceso para la síntesis convergente de
un péptido a partir de dos o más fragmentos peptídicos en el que al
menos uno de los fragmentos peptídicos se prepara de acuerdo con un
proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.
23. Un proceso para la síntesis enzimática
gradual de un péptido en dirección C terminal de acuerdo con un
proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.
24. Un proceso de síntesis peptídica que
comprende ciclación peptídica que implica el extremo C del precursor
lineal de acuerdo con un proceso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 21.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP06100420 | 2006-01-17 | ||
EP06100420 | 2006-01-17 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2340885T3 true ES2340885T3 (es) | 2010-06-10 |
Family
ID=37025119
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES07703919T Active ES2340885T3 (es) | 2006-01-17 | 2007-01-16 | Hidrolisis enzimatica selectiva de esteres terc-butilicos c terminal de peptidos. |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20090093016A1 (es) |
EP (1) | EP1979370B1 (es) |
AT (1) | ATE461208T1 (es) |
BR (1) | BRPI0706400A2 (es) |
DE (1) | DE602007005349D1 (es) |
DK (1) | DK1979370T3 (es) |
ES (1) | ES2340885T3 (es) |
WO (1) | WO2007082890A1 (es) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20100311130A1 (en) * | 2007-06-19 | 2010-12-09 | Dsm Ip Assets B.V. | Enzymatic ester hydrolysis |
JP2011500010A (ja) * | 2007-10-12 | 2011-01-06 | ディーエスエム アイピー アセッツ ビー.ブイ. | C末端エステル転換による化学酵素的ペプチド合成 |
KR20230158005A (ko) | 2021-03-18 | 2023-11-17 | 씨젠 인크. | 생물학적 활성 화합물의 내재화된 접합체로부터의 선택적 약물 방출 |
Family Cites Families (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3733222A1 (de) * | 1987-10-01 | 1989-04-13 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von optisch reinem homophenylalanin |
ZW6189A1 (en) * | 1988-05-09 | 1990-05-09 | Smithkline Beckman Corp | Anti-aggregatory peptides |
US5665587A (en) * | 1989-06-26 | 1997-09-09 | Novo Nordisk A/S | Modified subtilisins and detergent compositions containing same |
US5204466A (en) * | 1990-02-01 | 1993-04-20 | Emory University | Method and compositions for the synthesis of bch-189 and related compounds |
US5275950A (en) * | 1990-05-11 | 1994-01-04 | Abbott Laboratories | Process for the preparation of a renin inhibiting compound |
US5256814A (en) * | 1990-12-07 | 1993-10-26 | Scios Nova Inc. | Excitatory amino acid antagonists |
ES2051647B1 (es) * | 1992-12-10 | 1995-01-16 | Lipotec Sa | Procedimiento para la preparacion de calcitonina de salmon. |
US6187579B1 (en) * | 1993-10-28 | 2001-02-13 | Carlsberg A/S | Customized proteases |
US5981267A (en) * | 1996-01-24 | 1999-11-09 | The Scripps Research Institute | Enantioselection of amines using homocarbonates with hydrolase |
TW505654B (en) * | 1996-07-30 | 2002-10-11 | Hoffmann La Roche | Synthesis of analogs of PTH and PTHrP |
AU749383B2 (en) * | 1998-07-02 | 2002-06-27 | Genencor International, Inc. | Chemically modified proteins with a carbohydrate moiety |
FR2814744B1 (fr) * | 2000-10-04 | 2002-11-29 | Commissariat Energie Atomique | Cyclopeptides, leur procede de preparation et leur utilisation comme inhibiteur ou activateur de l'angiogenese |
NL1017258C2 (nl) * | 2001-02-01 | 2002-08-02 | Univ Delft Tech | Werkwijze voor het maken van vernette enzymaggregaten. |
US20030032083A1 (en) * | 2001-05-23 | 2003-02-13 | Diversa Corporation | Peptide synthesis method |
IL150601A (en) * | 2001-07-19 | 2010-06-30 | Organon Nv | Process for rapid synthesis of peptides within a solution using the back of an activated carboxyl component and destruction of the residual activated carboxyl component |
TWI243826B (en) * | 2001-07-19 | 2005-11-21 | Akzo Nobel Nv | Process for the preparation of peptides |
US7084247B2 (en) * | 2004-03-11 | 2006-08-01 | Peptimmune, Inc. | Identification of self and non-self antigens implicated in autoimmune diseases |
US8124372B2 (en) * | 2007-06-25 | 2012-02-28 | N.V. Organon | Selective enzymatic amidation of C-terminal esters or acids of peptides |
-
2007
- 2007-01-16 DE DE602007005349T patent/DE602007005349D1/de active Active
- 2007-01-16 US US12/087,849 patent/US20090093016A1/en not_active Abandoned
- 2007-01-16 BR BRPI0706400-4A patent/BRPI0706400A2/pt active IP Right Grant
- 2007-01-16 WO PCT/EP2007/050409 patent/WO2007082890A1/en active Application Filing
- 2007-01-16 EP EP07703919A patent/EP1979370B1/en active Active
- 2007-01-16 ES ES07703919T patent/ES2340885T3/es active Active
- 2007-01-16 DK DK07703919.6T patent/DK1979370T3/da active
- 2007-01-16 AT AT07703919T patent/ATE461208T1/de not_active IP Right Cessation
-
2012
- 2012-05-17 US US13/474,125 patent/US20120231497A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1979370B1 (en) | 2010-03-17 |
BRPI0706400A2 (pt) | 2011-03-29 |
US20090093016A1 (en) | 2009-04-09 |
US20120231497A1 (en) | 2012-09-13 |
ATE461208T1 (de) | 2010-04-15 |
DE602007005349D1 (de) | 2010-04-29 |
WO2007082890A1 (en) | 2007-07-26 |
EP1979370A1 (en) | 2008-10-15 |
DK1979370T3 (da) | 2010-06-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
FI70597B (fi) | Foerfarande foer enzymatisk framstaellning av peptider | |
JP2024010221A (ja) | リラグルチド、セマグルチド及びglp-1の化学酵素合成 | |
US20120107870A1 (en) | Selective enzymatic amidation of c-terminal esters or acids of peptides | |
NO164245B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av peptidet h-arg-x-z-y-tyr-r. | |
ES2340885T3 (es) | Hidrolisis enzimatica selectiva de esteres terc-butilicos c terminal de peptidos. | |
Kullmann | Enzymic synthesis of dynorphin (1-8) | |
US9598714B2 (en) | Side-chain protected oligopeptide fragment condensation using subtilisins in organic solvents | |
EP0149594A2 (en) | Enzymatic coupling of n-formyl amino acids and/or peptide residues | |
Nakamura et al. | Synthesis of peptide thioesters via an N–S acyl shift reaction under mild acidic conditions on an N‐4, 5‐dimethoxy‐2‐mercaptobenzyl auxiliary group | |
Čeřovský et al. | Protease‐catalyzed fragment condensation via substrate mimetic strategy: a useful combination of solid‐phase peptide synthesis with enzymatic methods | |
Albericio et al. | Application of N, N‐dimethylformamide dineopentyl acetal for efficient anchoring of Nα‐9‐fluorenylmethyloxycarbonylamino‐acids as p‐alkoxybenzyl esters in solid‐phase peptide synthesis | |
Nishino et al. | Studies on the Synthesis of Proteinase Inhibitors I. Synthesis and Activity of Nonapeptide Fragments of Soybean Bowman-Birk Inhibitor | |
SAKINA et al. | Enzymatic synthesis of cholecystokinin-octapeptide | |
ES2359121T3 (es) | Proceso para la conversión de ésteres o ácidos peptídicos c-terminales en amidas empleando subtilisina en presencia de sales de amonio. | |
Ohno et al. | Partial enzymic deprotection in the synthesis of a protected octapeptide bearing a free terminal carboxyl group | |
MX2008009145A (es) | Hidrolisis enzimatica selectiva de esteres ter-butilicos c-terminal de peptidos | |
BRPI0706400B1 (pt) | Selective enzymatic hydrolysis of terc-butil c-terminal esters of peptide substrates, for the convergent synthesis of a peptide of two or more peptide fragments, for the enzymatic synthesis of stages of a peptide in the direction of terminal c, e for peptide synthesis | |
Chou et al. | Enzymatic Synthesis of Oligopeptide. Part I. Papain‐Catalyzed Synthesis of Dipeptide, Tripeptide and Tetrapeptide | |
JP2009512427A (ja) | オリゴペプチドアミドからオリゴペプチドアルキルエステルへの酵素転化 | |
Clapés et al. | Enzymatic peptide synthesis in water-poor media | |
JPS62232393A (ja) | ペプチド誘導体の酵素的製造法 | |
Elmore | Peptide synthesis | |
JPS63254994A (ja) | N置換ロイシンエンケフアリンアミドの製造方法 | |
Ken’ichiroh Nakamura et al. | Synthesis of peptide thioesters via an N–S acyl shift reaction under mild acidic conditions on an N-4, 5-dimethoxy-2-mercaptobenzyl auxiliary group | |
JPH06169790A (ja) | 酵素を用いるペプチド合成方法 |