BRPI0202783B1 - processo para a síntese rápida de um peptídeo em solução em um solvente orgânico ou em uma mistura de solventes orgânicos, e, métodos para a síntese combinatória de coleções de peptídeo e para a síntese de peptídeo automatizada em solução - Google Patents
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Abstract
"processo para a síntese rápida de um peptídeo em solução em um solvente orgânico ou em uma mistura de solventes orgânicos, métodos para a síntese combinatória de coleções de peptídeo e para a síntese de peptídeo automatizada em solução, e, peptídeo ou uma mistura de peptídeos". a presente invenção refere-se a um processo para a sintese rápida de um peptídeo em solução, o processo compreendendo os ciclos repetitivos das etapas (a)-(d): (a) uma etapa de acoplamento, usando um excesso de componente carboxílico ativado para acilar um componente amino, (b) uma etapa de resfriamento brusco na qual um removedor é usado para remover funções carboxílicas ativadas residuais, na qual o removedor também pode ser usado para a desproteção do peptídeo crescente, (c) uma ou mais extrações aquosas e opcionalmente, (d) uma etapa de desproteção separada, após uma ou mais etapas de extração aquosa, caracterizado pelo fato de que o processo compreende pelo menos uma etapa (b), referida como a etapa (b'), na qual uma amina compreendendo um ânion livre ou um ânion latente é usada como um removedor de funções carboxílicas ativadas residuais. durante o processo desta invenção o peptídeo crescente não precisa ser isolado até ter sido obtida a seqüência de peptídeo final. este processo elevadamente eficiente é útil para a produção de oligo- e polipeptídeos de alta pureza.
Description
“PROCESSO PARA A SÍNTESE RÁPIDA DE UM PEPTÍDEO EM SOLUÇÃO EM UM SOLVENTE ORGÂNICO OU EM UMA MISTURA DE SOLVENTES ORGÂNICOS, E, MÉTODOS PARA A SÍNTESE COMBINATÓRIA DE COLEÇÕES DE PEPTÍDEO E PARA A SÍNTESE DE PEPTÍDEO AUTOMATIZADA EM SOLUÇÃO” A invenção refere-se a um novo e versátil processo para a síntese rápida de peptídeos em solução, no qual o peptídeo crescente não precisa ser isolado antes do término da montagem da seqüência desejada.
Os peptídeos são sintetizados quer em solução quer sobre um suporte sólido. Em ambas as abordagens etapas de acoplamento e de desproteção repetidamente se alternam e podem ser separadas por purificações intermitentes. Na abordagem em fase sólida, uma seqüência é montada completamente enquanto fixada em um suporte sólido antes de ela ser eventualmente clivada do citado suporte. A remoção do excesso de reagentes e subprodutos ocorre por filtração. A síntese em fase sólida claramente possui a vantagens: ela é mais ou menos geralmente aplicável e fácil de automatizar. Contudo, ela também apresenta algumas sérias desvantagens. Por exemplo, as reações são controladas por difusão e são normalmente bastante lentas sob as condições heterogêneas empregadas: com o propósito de evitar seqüências de deleção, são necessárias seqüências relativamente grandes. Em adição, todas as cadeias laterais reativas do peptídeo crescente têm que estar protegidas: visto que não ocorrem purificações intermitentes, as reações secundárias devido à presença de cadeias laterais não protegidas podem acarretar impurezas no produto final. A abordagem em fase sólida é difícil de ter sua escala aumentada e é custosa em termos de reagentes e materiais. A clássica abordagem em fase de solução, por outro lado, é mais fácil de ter sua escala aumentada e é menos cara em termos de reagentes e materiais. Aminoácidos totalmente protegidos não são normalmente necessários, visto que os subprodutos resultantes de reações secundárias das cadeias laterais não protegidas podem ser removido por purificações intermitentes. Contudo, a abordagem em fase de solução requer protocolos específicos para seqüência e a produção de uma seqüência completa é muito demorada.
Por causa das desvantagens destas abordagens há uma necessidade de um processo que combine as vantagens de ambos os métodos clássicos, em particular para a síntese de peptídeos em grande escala. Um novo processo deve ser rápido, fácil de ter sua escala aumentada e geralmente aplicável.
Na síntese em fase de solução, um ligeiro excesso de um componente carboxílico ativado é preferivelmente usado em cada etapa de acoplamento para garantir acoplamento quantitativo em um componente amino; assim a ocorrência de seqüências de deleção no produto final pode ser evitada. Normalmente é assumido que o componente carboxílico ativado residual é destruído e removido durante o processamento aquoso intermitente. Seqüências de peptídeos de inserção, contudo, são freqüentemente encontradas como impurezas do peptídeo final devido à remoção incompleta do componente carboxílico (ativado) residual após uma etapa de acoplamento, que subseqüentemente foi copulado após a desproteção. Com o propósito de evitar a ocorrência das citadas reações secundárias uma etapa de remoção pode ser introduzida diretamente após a etapa de acoplamento para remover as funções carboxílicas ativadas residuais (inativas). Aminas são normalmente aplicadas como removedores. O emprego de poliaminas como removedores leva a compostos removidos que podem ser ativamente extraídos para dentro de uma fase aquosa -preferivelmente ácida - dependendo de sua polaridade [por exemplo Kisfaludy, L. et al. (1974) Tetrahedron Lett. 19, 1785-1786]. Esta extração é normalmente realizada antes da etapa de desproteção para evitar a perda de peptídeo crescente para dentro da fase aquosa. Entretanto, tem sido verificado em numerosos casos que este procedimento resulta em purificação intermitente incompleta devido à hidrofobicidade do composto removido: a hidrofobicidade intrínseca da parte amino acila do componente carboxílico é aumentada pelo grupo amino-protetor ainda presente. A extração aquosa é deste modo não completamente efetiva.
Recentemente, Carpino, L. A. et al. [(1999) J. Org. Chem. 64, 4324-4338] relatou uma melhoria no método de remoção. Em adição ao uso de uma poliamina como removedor, o grupo amino-protetor 1,1-dioxo-benzo[Z>]tiofeno-2-il-metóxi-carbonila (Bsmoc) foi aplicado no processo. A função Bsmoc possui labilidade muito elevada em base. Como um seu resultado, funções carboxílicas ativadas residuais são removidas e as funções Bsmoc são removidas em uma e mesma etapa usando uma poliamina. O uso da função Bsmoc tem sido descrito como uma melhoria significativa da produção de oligopeptídeos empregando rápidas técnicas em fase de solução contínua permitindo a montagem de um peptídeo em uma única série de etapas dentro de um período de tempo relativamente curto.
Agora tem sido verificado um novo processo para síntese de peptídeos em solução, rápida, contínua, um removedor é empregado o qual permite que uma escolha essencialmente arbitrária do grupo amino-protetor (o grupo protetor na terminação N do componente carboxílico ativado). Em contraste ao processo de Carpino, a desproteção da função N-terminal não necessariamente ocorre sob as mesmas condições de reação que as da remoção de excesso de funções carboxílicas ativadas. Portanto, o processo desta invenção é muito mais geralmente aplicável do que o processo de Carpino. O novo processo de acordo com a invenção é um processo para a síntese de um peptídeo em solução, rápida, em um solvente orgânico ou em uma mistura de solventes orgânicos compreendendo os ciclos repetitivos das etapas (a)-(d): (a) uma etapa de acoplamento, usando um excesso de componente carboxílico ativado para acilar um componente amino, (b) uma etapa de resfriamento brusco na qual um removedor é usado para remover funções carboxílicas ativadas residuais, na qual o removedor também pode ser usado para a desproteção do peptídeo crescente (isto é, o peptídeo que está sendo formado), (c) uma ou mais extrações aquosas e opcionalmente (d) uma etapa de desproteção separada, possivelmente após uma ou mais das etapas de extração, caracterizado pelo fato de que o processo compreende pelo menos uma etapa (b), referida como a etapa (b'), na qual uma amina compreendendo um ânion livre ou um ânion latente é usada como um removedor de funções carboxílicas ativadas residuais.
Durante o processo desta invenção o peptídeo crescente não precisa ser isolado até ter sido obtida a seqüência de peptídeo final (isto é o produto final do processo desta invenção). Portanto, o processo é significativamente menos demorado do que os processos clássicos em fase de solução e fáceis de terem sua escala aumentada. O processo desta invenção permite remoção elevadamente eficiente do componente carboxílico ativado residual sem encontrar os problemas de hidrofobicidade dos processos da técnica anterior nos quais poliaminas são empregadas como removedores. Assim são obtidos peptídeos de alta pureza.
Preferivelmente, na etapa (a) do processo desta invenção as quantidades molares de reagentes empregadas estão em ordem decrescente: componente carboxílico, aditivo de acoplamento > reagente de acoplamento > componente amino. Mais preferido é um processo no qual na etapa (a) é empregado um componente carboxílico pré-ativado.
Em outra modalidade, na etapa (V) uma amina compreendendo um ânion latente é utilizada como o removedor. Preferivelmente, o ânion latente na amina removedora possui um grupo protetor temporário que pode ser seletivamente removido na presença de qualquer grupo protetor permanente ligado no peptídeo crescente. Em uma modalidade particularmente preferida o grupo protetor do ânion latente na amina removedora mostra uma labilidade semelhante àquela do grupo protetor temporário presente na terminação N do peptídeo crescente. Isto permite a desproteção do removedor dando o ânion e da desproteção N-terminal do peptídeo crescente em uma única etapa de processo. Especialmente preferido é o processo da invenção no qual os grupos protetores temporários, presentes na terminação N do peptídeo crescente e opcionalmente presentes no removedor, são grupos hidrogenoliticamente removíveis enquanto que os grupos protetores permanentes são grupos protetores acidoliticamente removíveis. Preferivelmente, os citados grupos protetores temporários são do tipo benzila, por exemplo grupos benziloxicarbonila e benzila (substituída). Um removedor preferido é uma amina primária compreendendo um ânion livre ou um ânion latente, e em particular um derivado de aminoácido C-terminalmente protegido. Além de carboxilato, a amina removedora pode compreender outras funções aniônicas tais como - mas não limitadas a - sulfonato, sulfato, fosfonato, fosfato ou fenolato. Um aminoácido elevadamente preferido para uso como um removedor é β-alanina ou um derivado da mesma (por exemplo um éster ou derivado de silil éster). O removedor mais preferido é β-alaninato de benzila ou um sal do mesmo.
Um tiol compreendendo um ânion livre ou latente também pode ser empregado como um removedor no lugar de uma amina compreendendo um ânion livre ou latente de acordo com o processo desta invenção. O removedor é preferivelmente usado em um excesso molar de duas a seis vezes com relação ao componente ativo residual que necessita ser removido. O uso de um removedor de acordo com a presente invenção acarreta compostos removidos hidrofílicos que podem ser ativamente extraídos para dentro de uma fase aquosa básica após a etapa de desproteção: com a desproteção (se aplicável), a hidrofilicidade é aumentada pela presença de ambas uma função amino livre e uma função carboxílica livre nas espécies removidas. Assim, o processo desta invenção resulta em uma purificação intermitente muito efetiva devido à possibilidade de extrair ativamente um composto hidrofílico removido. Em adição, um possível excesso presente de componente carboxílico que não estava ativado e cujo grupo protetor temporário também não fora removido durante a desproteção, é extraído da mistura reacional ao mesmo tempo.
De acordo com o processo desta invenção, pelo menos um ciclo, mas possivelmente mais ciclos do processo compreende(m) uma etapa (b') na qual um ânion livre ou um ânion latente é usado como um removedor de funções carboxílicas ativadas residuais. Contudo, de acordo com um outro aspecto desta invenção, o processo pode também compreender um ou mais ciclos nos quais na etapa (b) uma poliamina, tal como 3-dimetil-amino-l-propil-amina, é usada como o removedor.
Outro processo preferido desta invenção compreende um ou mais ciclos nos quais na etapa (b) a desproteção não ocorrer (assim as circunstâncias são escolhidas de tal modo que o removedor apenas seja usado para resfriamento brusco, por exemplo usando o grupo protetor Z e uma amina compreendendo um ânion latente como um removedor) e a etapa (c) subseqüente compreende extrações seqüenciais básica, ácida e básica, que são preferivelmente realizadas na presença de cloreto de sódio ou nitrato de potássio. Este processo compreende uma etapa (d) subseqüente que compreende a desproteção e as extrações seqüenciais básica e neutra; estas extrações são preferivelmente conduzidas na presença de cloreto de sódio ou nitrato de potássio.
Outro processo preferido desta invenção compreende um ou mais ciclos nos quais na etapa (b) tanto o resfriamento brusco quanto a desproteção ocorrem (por exemplo usando o grupo protetor Bsmoc e uma poliamina como removedor) e a etapa (c) subseqüente compreende extrações seqüenciais básica e neutra, que são preferivelmente realizadas na presença de cloreto de sódio ou nitrato de potássio.
Também é preferido um processo no qual no último ciclo na etapa (a) os grupos protetores do componente carboxílico mostram uma labilidade semelhante àquela dos grupos protetores permanentes do componente amino e na etapa (b) o removedor é uma poliamina. O processo de acordo com a invenção pode ser conduzido em vários solventes orgânicos que são comumente empregados para a produção de peptídeos. Um solvente orgânico elevadamente preferido é acetato de etila. Também são preferidas misturas de acetato de etila e outros solventes orgânicos, tais como diclorometano, l-metil-2-pirrolidinona, N,N-dimetil-formamida ou tetraidrofurano. O processo desta invenção pode ser realizado em temperaturas bem conhecidas na técnica para tais etapas na clássica síntese de peptídeo em fase de solução. Contudo, preferivelmente o processo é realizado dentro de uma faixa de temperatura de 0 a 50°C, e em particular na temperatura ambiente. O processo desta invenção é muito adequado para a síntese combinatória de coleções de peptídeo usando o método de separação e misturação. Os acoplamentos são realizados separadamente enquanto que as misturas de acoplamento individuais são combinadas para extrações e desproteções. O processo desta invenção é muito adequado para automação visto que protocolos padrão são empregados. O novo processo desta invenção é um processo elevadamente eficiente que pode ser convenientemente utilizado na produção de oligo- e polipeptídeos de alta pureza.
Um processo adequado de acordo com a presente invenção é o acoplamento de um excesso de um componente carboxílico em um componente amino, no qual a função carboxílica é pré-ativada ou ativada in situ usando um reagente de acoplamento e, se desejado, um aditivo. Após a etapa de acoplamento, as funções carboxílicas ativadas residuais são removidas pela adição de removedor na mistura reacional e misturação, normalmente seguida por extração aquosa. Subseqüentemente ou durante a remoção, os grupos protetores temporários são removidos empregando métodos adequados conhecidos na técnica, normalmente seguidos pela remoção do composto removido por extração aquosa. Ao mesmo tempo, um excesso possivelmente presente de componente carboxílico que não estava ativado e cujo grupos protetores temporários também foram removido durante a desproteção, bem como subprodutos e outros reagentes solúveis em água são extraídos da mistura reacional. A seguir, outro ciclo de etapas de acoplamento, resfriamento brusco, desproteção e extração pode seguir dependendo do comprimento do peptídeo desejado. O termo componente amino refere-se a uma molécula compreendendo uma função amino livre. Em particular, o componente amino pode ser uma amina, aminoácido ou oligopeptídeo que possui uma função amino livre e cujos outros grupos funcionais estão protegidos em uma tal maneira que eles não interferem com a reação de acoplamento desejada. A função C-terminal do polipeptídeo ou do aminoácido aplicado pode ser desprotegida como uma amida substituída ou não substituída ou como um éster; exemplos do último incluem - mas não se limitam a - metil, etil, t-butil, benzil, fenacil, 3-(3-metil)-pentil (Mpe), 2-(2-fenil)-propil (Pp), 2-cloro-tritil (Clt), difenil-(4-piridil)-metil (PyBzh), diciclo-propil-metil (Dcpm), 9-fluorenil-metil (Fm), alil (All), 2-(trimetil-silil)-etil (Tmse), 4-{N-[l-4,4-dimetil,2,6-dioxo-ciclo-hexilideno)-3-metil-butil]-amino-benzil (Dman) ésteres e ésteres enzimaticamente cliváveis [Roeske, R.W. (1981) em: 'The Peptides', vol. 3 (Gross, E. e Meienhofer, J., eds.) Academic Press, New York, pp. 101-136; para Mpe: Karlstrõm, A. e Undén, A. (1996) Tetrahedron Lett. 37,4343-4246; para Pp: Yue, C. et al. (1993) Tetrahedron Lett. 34, 323-326; para Clt: Athanassopoulos, P. et al. (1995) Tetrahedron Lett. 36, 5645-5648; para PyBzh: Mergler, M. et al. (2001) PI54, 2nd International Peptíde Symposium & 17th American Peptide Symposium; para Dcpm: Carpino, L.A. et al. (1995) J. Org Chem. 60,7718-7719; para Fm: AI-Obeidi, F. et al. (1990) Int. J. Peptide Protein Res. 35, 215-218; para All: Kunz, H. et al. (1985) Int. J. Peptide Protein Res. 26, 493-497; para Tmse: Sieber, P. (1977) Helv. Chim. Acta 60, 2711-2716; para Dmab: Chan, W.C. et al. (1995) J. Chem. Soc., Chem. Commun., 2209-2210]. Funções do tipo t-butila ou funções de labilidade semelhante são preferidas para a proteção permanente de outros grupos funcionais no componente amino; estas incluem - mas não se limitam a - t-butila (*Bu) para a proteção de cadeias laterais de Tyr, Thr, Ser, Glu e Asp, t-butóxi-carbonila (Boc) para a proteção de cadeias laterais de Lys e Trp, tritila (Trt) para a proteção de cadeia laterais de Asn, Gin e His e 2,2,5,7,8-pentametil-cromano-6-sulfonila (Pmc) ou 2,2,4,6,7-pentametil-di-hidro-benzofürano-5-sulfonila (Pbf) para a proteção da cadeia lateral de Arg [Barany, G. e Merrifíeld, R.B. (1980) em: 'The Peptides’, vol. 2 (Gross, E. e Meienhofer, J., eds.) Academic Press, New York, pp. 1-284; para Trp(Boc): Franzen, H. et al. (1984) J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1699-1700; para Asn(Trt) e Gln(Trt): Sieber, P. e Riniker, B. (1991) Tetrahedron Lett. 32, 739-742; para His(Trt): Sieber, P. e Riniker, B. (1987) Tetrahedron Lett. 28,6031-6034; para Pmc: Ramage, R. e Green, J. (1987) Tetrahedron Lett. 28, 2287-2290; para Pbf: Carpino, L.A. et al. (1993) Tetrahedron Lett. 34, 7829-7832]. O termo componente carboxílico refere-se a uma molécula compreendendo uma função carboxílica livre. Em particular, o componente carboxílico pode ser qualquer ácido carboxílico, aminoácido ou oligopeptídeo que possua uma função carboxílica livre e cujos os outros grupos funcionais estão protegidos em uma tal maneira que eles não interferem com a reação de acoplamento desejada. Em uma modalidade preferida, o grupo amino do aminoácido ou oligopeptídeo aplicado está temporariamente protegido por uma função benziloxicarbonila (Z); outros exemplos incluem - mas não se limitam a - as funções Boc, Trt, fluoren-9-il-metóxi-carbonil (Fmoc), 2-(metilsulfonil)-etoxicarbonila (Msc), aliloxicarbonila (Alloc), as funções do tipo arilsulfonila, tal como orto-nitrobenzenosulfonila (o-NBS) e as funções enzimaticamente cliváveis [Geiger, R. e Kõnig, W. (1981) em: 'The Peptides', vol. 3 (Gross, E. e Meienhofer, J., eds.) Academic Press, New York, pp. 1-99; para Alloc: Kunz, H. e Unverzagt, C. (1984) Angew. Chem. 96, 426-427; para arilsulfonila: Fukuyama, T. et al. (1997) Tetrahedron Lett. 38, 5831-5834]. As funções do tipo t-butila ou as funções de labilidade semelhante são preferidas para a proteção permanente dos outros grupos funcionais no componente carboxílico, como descrito acima para o componente amino. O componente carboxílico pode ser pré-ativado como um éster ativo, preferivelmente uma N-hidróxi-succinimida, benzoil-triazol-1-ila, pentafluorofenila ou 4-nitro-fenil-éster, um haleto, um N-carbóxi-anidrido ou um anidrido sintético. Altemativamente, o componente carboxílico pode ser ativado in situ como um anidrido misto ou usando um reagente de acoplamento, tal como carbodiimida, preferivelmente Ν,Ν'-diciclo-hexil-carbodiimida (DCC) ou cloridrato de l-(3'-dimetil-amino-propil)-3-etil-carbodiimida (EDC), um sal de urônio ou de fosfônio na possível presença de um aditivo de acoplamento, preferivelmente N-hidróxi-succinimida (HONSu), 1 -hidróxi-benzotriazol (HOBt), 3-hidróxi-4-oxo-3,4-di-hidro-l,2,3-benzotriazina (HOOBt), 1-hidróxi-7-aza-benzotriazol (HOAt) ou 6-cloro-1-hidróxi-benzotriazol (Cl-HOBt) e se requerido na presença de uma amina terciária ['The Peptid.es', vol. 1 (1979) (Gross, E. e Meienhofer, J., eds.) Academic Press, New York; Li, P. e Xu, J.-C. (2000) Chin. J. Chem. 18, 456-466]. O grupo protetor temporário pode ser removido de acordo com métodos conhecidos na técnica (veja acima). A função Z pode ser removida por hidrogenólise usando procedimentos (padrão) que aplicam, por exemplo gás hidrogênio ou formiato como um doador de hidrogênio. Durante este processo todos os grupos protetores do tipo benzila são removidos e os grupos protetores do tipo t-butila ou funções de labilidade semelhante são mantidos. Os últimos podem ser removidos por acidólise de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Uma pessoa experiente na técnica entenderá o que significa o termo extração aquosa básica. Contudo, as extrações aquosas básicas são preferivelmente realizadas empregando soluções aquosas de hidrogeno carbonato de sódio ou de carbonato de sódio, se desejado na presença de cloreto de sódio ou de nitrato de potássio. O termo extração aquosa ativa refere-se a uma extração na qual quer um componente amino é extraído sob condições ácidas na forma protonada (amônio) quer um componente carboxílico é extraído sob condições básicas na forma desprotonada (carboxilato). A invenção é adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos, que não são para serem interpretados como uma limitação desta invenção. EXEMPLO 1 Boc-Gly-Phe-AspCO^uj-Ser^Buj-O^u 1° Ciclo: Em uma solução agitada de 4,34 g de H-SerfBu)- OlBu em uma mistura de acetato de etila e diclorometano a 20°C, foram adicionados 3,24 g de 1-hidróxi-benzotriazol, 7,76 g de Z-Asp(OlBu)-OH, 4,20 g de cloridrato de l-(3'-dimetil-amino-propil)-3-etil-carbodiimida e 2,42 ml de 4-metil-morfolina. Após agitação da solução resultante até o término da reação, 1,21 ml de 4-metil-morfolina e 3,51 g de sal de p-toluenossulfonato de β-alaninato de benzila foram adicionados. A mistura foi agitada por mais 30 minutos e extraída com 5% Na2CO3/10% NaCl, 5% KHSCyiO% NaCl e 5% Na2CO3/10% NaCl. A camada orgânica contendo o dipeptídeo protegido Z-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu foi submetida à hidrogenólise catalítica na presença de paládio sobre carvão. Com o término da reação, 5% Na2CO3/10% NaCl foi adicionado e a suspensão resultante foi filtrada. O resíduo foi lavado com uma mistura de acetato de etila e diclorometano, e os filtrados orgânicos combinados foram extraídos com 5% Na2CO3/10% NaCl e 30% NaCl. 2° Ciclo: Na camada orgânica contendo o dipeptídeo H-AspCC^Bu^Ser^Bu^C^Bu a 20°C, foram adicionados 3,24 g de 1-hidróxi-benzotriazol, 7,18 g de Z-Phe-OH, 4,20 g de cloridrato de l-(3'-dimetil-amino-propil)-3-etil-carbodiimida e 2,42 ml de 4-metil-morfolina. Após a agitação da solução resultante até o término da reação, 1,21 ml de 4-metil-morfolina e 3,51 g de sal de p-toluenossulfonato de β-alaninato de benzila foram adicionados. A mistura foi agitada por mais 30 minutos e extraída com 5% Na2CO3/10% NaCl, 5% KHS(V10% NaCl e 5% Na2CO3/10% NaCl. A camada orgânica contendo o tripeptídeo protegido Z-Phe-AspCC^Bu^Ser^Bu^C^Bu foi submetida à hidrogenólise catalítica na presença de paládio sobre carvão. Com o término da reação, 5% Na2CO3/10% NaCl foi adicionado e a suspensão resultante foi filtrada. O resíduo foi lavado com uma mistura de acetato de etila e diclorometano, e os filtrados orgânicos combinados foram extraídos com 5% Na2CO3/10% NaCl e 30% NaCl. 3° Ciclo: Na camada orgânica contendo o tripeptídeo H-Phe- Asp(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu a 20°C, foram adicionados 3,24 g de 1-hidróxi-benzotriazol, 4,21 g de Boc-Gly-OH, 4,20 g de cloridrato de l-(3'-dimetil-amino-propil)-3-etil-carbodiimida e 2,42 ml de 4-metil-morfolina. Após a agitação da solução resultante até o término da reação, foram adicionados 1,21 ml de 4-metil-morfolina. A mistura foi agitada por mais 30 minutos e extraída com 5% Na2CO3/10% NaCl, 5%.KHSC>4/10% NaCl e 5% Na2CO3/10% NaCl, 30% NaCl e água. A camada orgânica foi evaporada até a secura e o resíduo triturado com metil-terc-butil-éter e seco para dar o tetrapeptídeo protegido desejado com rendimento de 95% baseado no material inicial H-Ser^Buj-CfBu. O processo foi completado em 6 horas.
Pureza: 98,1% por HPLC de fase reversa (24 a 68% acetonitrila em 0,1% ácido trifluoroacético em 29 minutos a 220 nm, 2,0 ml/min., coluna C]g de 5 micrômetros). Identidade: m/z 425,4 [M-Boc-3lBu+H]+, 469,4 [M-4lBu+H]+, 525,4 [M-3lBu+H]+, 581,4 [M-2lBu+H]+, 637,4 [M-‘Bu+H]+, 693,4 [M+H]+ por eletropulverização MS; Ή RMN (CDC13) δ 1,16 (s, 9H), 1,44 (m, 2H), 2,59 (dd, 1H), 2,79 (dd, 1H), 3,09 (m, 2H), 3,51 (dd, 1H), 3,69-3,86 (m, 3H), 4,47 (m, 1H), 4,67-4,78 (m, 2H), 5,20 (bs, 1H), 6,68 (d, 1H), 7,12-7,34 (m, 7H). EXEMPLO 2 H-His-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Orn(Boc)-Pro-OtBu 1° Ciclo: Em uma solução agitada de 1.300 g de H-Pro-OlBu.HCl em acetato de etila a 20°C, foram adicionados 1.014 g de 1-hidróxi-benzotriazol, 2.756 g de Z-Om(Boc)-OH, 1.378 g de cloridrato de 1-(3'-dimetil-amino-propil)-3-etil-carbodiimida e 1.495 ml de 4-metil-morfolina. Após a agitação da solução resultante até o término da reação, foram adicionados 377 ml de 4-metil-morfolina e 1.105 g de sal de p-toluenossulfonato de β-alaninato de benzila. A mistura foi agitada por mais 30 minutos e extraída com 5% Na2CO3/10% NaCl, 5% KHS(V10% NaCl e 5% Na2CO3/10% NaCl. A camada orgânica contendo o dipeptídeo protegido Z-Οη(Βοΰ)-Ρπ>ΟιΒιι foi submetida à hidrogenólise catalítica na presença de paládio sobre carvão. Com o término da reação, 5% Na2CO3/10% NaCl foi adicionado e a suspensão resultante foi filtrada. O resíduo foi lavado com acetato de etila, e os filtrados orgânicos combinados foram extraídos com 5% Na2CO3/10% NaCl e 30% NaCl. As camadas aquosas separadas foram reextraídas com acetato de etila. 2° Ciclo: Nas camadas orgânicas combinadas contendo o dipeptídeo H-OmCBoc^Pro-CfBu a 20°C, foram adicionados 1.014 g de 1-hidróxi-benzotriazol, 1.993 g de Z-Leu-OH, 1.320 g de cloridrato de l-(3'-dimetil-amino-propil)-3-etil-carbodiimida e 754 ml de 4-metil-morfolina. Após a agitação da solução resultante até o término da reação, 377 ml de 4-metil-morfolina e 1.105 g de sal de p-toluenossulfonato de β-alaninato de benzila foram adicionados. A mistura foi agitada por mais 30 minutos e extraída com 5% Na2CO3/10% NaCl, 5% KHS(V10% NaCl e 5% Na2CO3/10% NaCl. A camada orgânica contendo o tripeptídeo protegido Z-Leu-Om(Boc)-Pro-OlBu foi submetida à hidrogenólise catalítica na presença de paládio sobre carvão. Com o término da reação, 5% Na2CO3/10% NaCl foi adicionado e a suspensão resultante foi filtrada. O resíduo foi lavado com acetato de etila, e os filtrados orgânicos combinados foram extraídos com 5% Na2CO3/10% NaCl e 30% NaCl. 3° Ciclo: Na camada orgânica contendo o tripeptídeo H-Leu-Om(Boc)-Pro-OlBu a 20°C, foram adicionados 1.014 g de 1-hidróxi-benzotriazol, 1.993 g de Z-D-Leu-OH, 1.320 g de cloridrato de l-(3'-dimetil-amino-propil)-3-etil-carbodiimida e 754 ml de 4-metil-morfolina. Após a agitação da solução resultante até o término da reação, foram adicionados 377 ml de 4-metil-morfolina e 1.105 g de p-toluenossulfonato de β-alaninato de benzila. A mistura foi agitada por mais 30 minutos e extraída com 5% Na2C03, 5% KHSO4 e 5% Na2C03. A camada orgânica contendo o tripeptídeo protegido Z-D-Leu-Om(Boc)-Pro-OtBu foi submetida à hidrogenólise catalítica na presença de paládio sobre carvão. Com o término da reação, 5% Na2C03 foi adicionado e a suspensão resultante foi filtrada. O resíduo foi lavado com acetato de etila, e os filtrados orgânicos combinados foram extraídos com 5% Na2C03 e 10% NaCl. 4° a 7° Ciclos: Estes ciclos foram realizados seguindo a procedimento do terceiro ciclo, substituindo 1.993 g de Z-D-Leu-OH por Z-Tyr(lBu)-OH (liberado de 4.497 g do sal de diciclo-hexilamônio correspondente), 2.218 g de Z-Ser(lBu)-OH, 2.538 g de Z-Trp-OH e 2.172 g de Z-His-OH, respectivamente. Contudo, do quinto ciclo em diante foram dobradas as quantidades de 4-metil-morfolina e do sal de p-toluenossulfonato de β-alaninato de benzila durante a etapa de remoção. No quinto ciclo, as extrações após a remoção foram realizadas a 35°C. No sétimo ciclo, o acoplamento foi realizada a 3°C, 1.014 g de 1-hidróxi-benzotriazol foram substituídos por 2.561 g de 6-cloro-l-hidróxi-benzotriazol e uma porção suplementar de 132 g de cloridrato de l-(3'-dimetil-amino-propil)-3-etil-carbodiimida foi adicionada após 1 hora de acoplamento. Também no sétimo ciclo, as extrações depois da hidrogenólise foram conduzidas a 35°C. No final do sétimo ciclo, a camada orgânica foi evaporada até a secura para dar o nonapeptídeo protegido desejado com rendimento de 73% baseado no material inicial H-Pro-O^u.HCl (isto é, em média de 98% por etapa química).
Pureza: 90,6% por HPLC de fase reversa (24 a 68% acetonitrila em 0,1% ácido trifluoroacético em 29 minutos a 220 nm, 2,0 ml/min., coluna C]8 de 5 micrômetros). Identidade: m/z 543,6 [M-Boc-2rBu+2H]2+, 571,6 [Μ-Βοο-*Βυ+2Η]2+, 599,64 [M-Boc+2H]2+, 649,8 [M+2H]2+, 1.298,0 [M+H]+ por eletropulverização MS.
Conclusões: Os peptídeos protegidos foram produzidos sem o isolamento intermitente dos intermediários. A pureza e a identificação do produto obtido do primeiro exemplo demonstram que o excesso de componentes carboxílicos (ativados) têm sido removidos completamente em todos os estágios do processo e seqüências de inserção não têm sido formadas usando o processo desta invenção. A síntese do segundo exemplo, em adição, demonstra que a escala da síntese de acordo com o processo desta invenção é facilmente aumentável. Os produtos de ambos os exemplos são obtidos com alto rendimento e elevada pureza dentro de um período de tempo relativamente curto.
REIVINDICAÇÕES
Claims (25)
1. Processo para a síntese rápida de uni peptídeo em solução em um solvente orgânico ou em uma mistura de solventes orgânicos, caracterizado pelo fato de que compreende os ciclos repetitivos das etapas (a)-(d): (a) uma etapa de acoplamento, usando um excesso de componente carboxílico ativado para acilar um componente amino, (b) uma etapa de resfriamento brusco na qual um rcmovcdor é usado para remover funções carboxílicas ativadas residuais, na qual o removedor também pode ser usado para a desproteção do peptídeo crescente, (c) uma ou mais extrações aquosas e opcionalmente, (d) uma etapa de desproteção separada, possivelmente após uma ou mais extrações aquosas, em que pelo menos uma etapa (b), referida como a etapa (b1), na qual uma amina compreendendo um ânion livre ou um ânion latente c usada como um removedor de funções carboxílicas ativadas residuais.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa (a) as quantidades molares de reagente usadas são em ordem decrescente: componente carboxílico, aditivo de acoplamento > reagente de acoplamento > componente amino.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa (a) é empregado um componente carboxílico pré-ativado.
4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3. caracterizado pelo fato dc que na etapa (b') uma amina compreendendo um ânion latente é utilizada como removedor,
5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o ânion latente na amina removedora possui um grupo protetor temporário que pode ser seletivamente removido na presença de quaisquer grupos protetores permanentes ligados no peptídeo crescente.
6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o ânion latente na amina removedora possui um grupo protetor temporário que mostra uma labilidade semelhante àquela do grupo protetor temporário presente na terminação N do peptídeo crescente.
7. Processo de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que os grupos protetores temporários são grupos hidrogenoliticamente removíveis enquanto que os grupos protetores permanentes são grupos acidoliticamente removíveis.
8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de os grupos protetores temporários são do tipo benzila.
9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a 8, caracterizado pelo fato de que o removedor é uma amina primária compreendendo um ânion livre ou um ânion latente.
10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a amina primária é um derivado de aminoácido C-terminalmente protegido.
11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o aminoácido é β-alanina ou um derivado da mesma.
12. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o removedor é β-alaninato de benzila ou um sal do mesmo.
13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais ciclos nos quais na etapa (b) uma poliamina é usada como o removedor.
14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de compreender um ou mais ciclos no qual, na etapa (b), a desproteção não ocorre e a subsequente etapa (c) compreende extrações seqüenciais básica, ácida e básica.
15. Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que as extrações são conduzidas na presença de cloreto de sódio ou nitrato de potássio.
16. Processo de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de compreender uma etapa (b) subsequente que compreende a desproteção e extrações sequenciais básica e neutra.
17. Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que as extrações são conduzidas na presença de cloreto de sódio ou nitrato de potássio.
18. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de compreender um ou mais ciclos nos quais, na etapa (b), ocorrem tanto o resfriamento brusco quanto a desproteção e a etapa (c) subsequente compreende extrações sequenciais básica e neutra.
19. Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que as extrações são conduzidas na presença de cloreto de sódio ou nitrato de potássio.
20. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que, no último ciclo na etapa (a), os grupos protetores do componente carboxílico mostram uma labilidade semelhante àquela dos grupos protetores permanentes do peptídeo crescente e na etapa (b) o removedor é uma poliamina.
21. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que o solvente orgânico ou a mistura de solventes orgânicos é acetato de etila ou uma mistura de acetato de etila e diclorometano, uma mistura de acetato de etila e l-metil-2-pirrolidona, uma mistura de acetato de etila e Ν,Ν-dimetil-formamida ou uma mistura de acetato de etila e tetraidrofurano.
22. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que é realizado dentro de uma faixa de temperatura de 0 a 50°C.
23. Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o processo é realizado na temperatura ambiente.
24. Método para a síntese combinatória de coleções de peptídeo usando o método de separação e misturação, caracterizado pelo fato de ser aplicado o processo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 23.
25. Método para a síntese de peptídeo automatizada em solução, caracterizado pelo fato de ser aplicado o processo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 24.
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