ES2248485T3

ES2248485T3 - Procedimiento para la sintesis rapida de peptidos en solucion.

Info

Publication number: ES2248485T3
Application number: ES02077830T
Authority: ES
Inventors: Ivo Franci Eggen; Paulus Bernardus Wilhelmus Ten Kortenaar; Cornelis Albert Gruson Haasnoot
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Akzo Nobel NV
Priority date: 2001-07-19
Filing date: 2002-07-15
Publication date: 2006-03-16
Anticipated expiration: 2022-07-15
Also published as: HRP20020609A2; BR0202783A; EP1291356A3; ZA200205409B; CA2390358A1; HK1050904A1; NO20023446L; PT1291356E; TWI247012B; PL205559B1; DK1291356T3; JP4142907B2; US20040082760A1; NO20023446D0; IL150601A0; DE60205693D1; HUP0202369A2; EP1291356A2; EP1291356B1; AR034869A1

Abstract

Un procedimiento para la síntesis rápida en disolución de un péptido en un disolvente orgánico o una mezcla de disolventes orgánicos, el procedimiento comprende ciclos repetitivos de las etapas (a)-(d): (a) una etapa de copulación usando un exceso de un componente carboxílico activado para acilar un componente amino, (b) una etapa de inactivación en la que se usa un agente de eliminación para retirar las funciones carboxílicas activadas residuales, en la que el agente de eliminación también se puede usar para la desprotección del péptido en crecimiento, (c) uno o más extracciones acuosas y opcionalmente (d) una etapa de desprotección separada, seguida de una o más extracciones acuosas, caracterizadas por que el procedimiento comprende al menos una etapa (b), denominada (b¿), en la que se usa una amina que comprende un anión libre o un anión latente como un agente de eliminación de las funciones carboxílicas activadas residuales.

Description

Procedimiento para la síntesis rápida de péptidos en disolución.

La invención se refiere a un procedimiento nuevo y versátil para la síntesis rápida de péptidos en disolución, en la que el péptido en crecimiento no necesita aislarse antes de que se complete el montaje de la secuencia deseada.

Los péptidos se sintetizan sobre un soporte sólido o en disolución. En ambos métodos, las etapas de copulación y desprotección se alternan repetidamente y pueden estar separadas por purificaciones intermitentes. En el método en fase sólida, mientras está sujeta a un soporte sólido una secuencia se ensambla completamente antes de que se corte de dicho soporte. La eliminación del exceso de reactivos y subproductos se realiza por filtración. La síntesis en fase sólida tiene claramente ventajas: es más o menos aplicable de forma general y fácil de automatizar. Sin embargo, también tiene algunos serios inconvenientes. Por ejemplo, las reacciones están controladas por difusión y normalmente son algo lentas en las condiciones heterogéneas que se aplican: con el fin de evitar las secuencias de eliminación se necesitan relativamente grandes excesos de reactivos. Además, se deben proteger todas las cadenas laterales reactivas del péptido en crecimiento: debido a que no se realizan purificaciones intermitentes, las reacciones secundarias debidas a la presencia de cadenas laterales sin proteger puede conducir a impurezas en el producto final. El método en fase sólida es difícil de escalar y es costoso en términos de reactivos y materiales.

Por otra parte, el método clásico en fase disolución es fácil de escalar y es menos costoso en términos de reactivos y materiales. Normalmente no se necesitan aminoácidos totalmente protegidos, ya que se pueden eliminar los subproductos resultantes de las reacciones secundarias de las cadena laterales sin proteger mediante purificaciones intermitentes. Sin embargo, el método en fase disolución requiere protocolos de secuencia específicos y la producción de una secuencia completa consume mucho tiempo.

Debido a los inconvenientes de estos métodos, existe la necesidad de un procedimiento que combine las ventajas de estos dos métodos clásicos, particularmente para la síntesis a gran escala de péptidos. Un procedimiento nuevo debería ser rápido, fácil de escalar y aplicable de forma general.

En la síntesis en fase disolución, se usa preferiblemente un ligero exceso de un componente carboxílico activado en cada etapa de copulación para asegurar la copulación cuantitativa a un componente amino; así se puede evitar la incidencia de las secuencias de eliminación en el producto final. Normalmente se asume que el componente carboxílico activado residual se destruye y se elimina durante la etapa acuosa intermitente. Sin embargo, a menudo se encuentran secuencias de péptidos de inserción como impurezas del péptido final debido a la eliminación incompleta del componente carboxílico (activado) residual después de una etapa de copulación, el cual posteriormente se ha copulado después de la desprotección. Con el fin de evitar la aparición de dichas reacciones secundarias, se puede introducir una etapa de eliminación directamente después de la etapa de copulación, para eliminar (inactivar) los grupos funcionales carboxílicos activados residuales. Normalmente se aplican aminas como agentes de eliminación (en inglés "scavengers"). El uso de poliaminas como agentes de eliminación produce compuestos de eliminación que se pueden extraer activamente en una fase acuosa -preferiblemente ácida- dependiendo de su polaridad [por ejemplo, Kisfaludy, L. et al. (1974) Tetrahedron Lett. 19, 1785-1786]. Normalmente esta extracción se lleva a cabo antes de la etapa de desprotección para evitar la pérdida del péptido en crecimiento en la fase acuosa. Sin embargo, se ha encontrado que en numerosos casos este procedimiento ha dado lugar a purificación intermitente incompleta debido al carácter hidrófobo del compuesto de eliminación: el carácter hidrófobo intrínseco de la parte amino-acil del componente carboxílico se potencia por el, todavía presente, grupo amino-protector. De ese modo, la extracción en fase acuosa no es completamente efectiva.

Recientemente, Carpino, L.A. et al. [(1999) J. Org. Chem. 64, 4324-4338] describió una mejora del método de eliminación. Además del uso de una poliamida como un agente de eliminación, se aplicó en el procedimiento el grupo amino-protector 1,1-dioxobenzo[b]tiofeno-2-ilmetoxicarbonilo (Bsmoc). La función Bsmoc tiene una muy alta labilidad hacia las bases. Como resultado de ello, las funciones carboxílicas activadas residuales se retiran y las funciones Bsmoc se eliminan en una misma y única etapa usando una poliamina. Se ha descrito el uso de la función Bsmoc como una mejora significativa para la producción de (oligo)péptidos usando técnicas rápidas en fase disolución en continuo que permiten el montaje de un péptido en una serie simple de etapas en un periodo de tiempo relativamente corto.

El documento WO 00/71.569 describe el uso de resinas de intercambio iónico como agentes de eliminación en la síntesis en disolución de péptidos.

Ahora se ha encontrado un nuevo procedimiento para la síntesis rápida de péptidos en disolución y en continuo, en el que se usa un agente de eliminación que permite una elección esencialmente arbitraria del grupo amino-protector (el grupo que protege el N-terminal del componente carboxílico activado). A diferencia del procedimiento de Carpino, la desprotección de la función N-terminal no tiene lugar necesariamente en las mismas condiciones de reacción que la eliminación del exceso de funciones carboxílicas activadas. Por lo tanto, el procedimiento de la invención es aplicable de manera mucho más general que el procedimiento de Carpino.

El nuevo procedimiento según esta invención es un procedimiento para la síntesis rápida en disolución de un péptido en un disolvente orgánico o en una mezcla de disolventes orgánicos que comprende ciclos repetitivos de las etapas (a)-(d):

(a): una etapa de copulación usando un exceso de un componente carboxílico activado para acilar un componente amino,

(b): una etapa de inactivación en la que se usa un agente de eliminación para retirar las funciones carboxílicas activadas residuales, en la que el agente de eliminación también se puede usar para la desprotección de los péptidos en crecimiento (es decir, el péptido que se está formando),

(c): uno o más extracciones acuosas y

: opcionalmente, (d) una etapa de desprotección separada, posiblemente seguida de una o más extracciones acuosas,

caracterizadas por que el procedimiento comprende al menos una etapa (b), denominada etapa (b'), en la que se usa una amina que comprende un anión libre o un anión latente como un agente de eliminación de las funciones carboxílicas activadas residuales.

Durante el procedimiento de esta invención, el péptido en crecimiento no necesita aislarse hasta que se ha obtenido la secuencia peptídica final (es decir, el producto final del procedimiento de la invención). Por lo tanto, el procedimiento consume significativamente menos tiempo que el procedimiento clásico en fase disolución y es fácil de escalar. El procedimiento de esta invención permite la eliminación altamente eficiente del componente carboxílico activado residual sin tropezar con los problemas de carácter hidrófobo de otros procedimientos de la técnica anterior en los que se usaban poliaminas como agentes de eliminación. De ese modo, se obtienen péptidos de alta pureza.

Preferiblemente, en la etapa (a) del procedimiento de esta invención las cantidades molares de los reactivos que se usan son, en orden decreciente: componente carboxílico, aditivo de copulación > reactivo de copulación > componente amino. Más preferido es un procedimiento en el que en la etapa (a) se usa un componente carboxílico pre-activado.

En otra realización preferida, en la etapa (b') se usa una amina que comprende un anión latente como agente de eliminación. Preferiblemente, el anión latente en la amina de eliminación soporta un grupo protector temporal que se puede retirar selectivamente en presencia de cualquier grupo protector permanente fijado al péptido en crecimiento. En una realización particularmente preferida, el grupo protector el anión latente en la amina de eliminación exhibe una labilidad parecida a la del grupo protector temporal presente en el N-terminal del péptido en crecimiento. Esto permite que la desprotección del agente de eliminación que genera el anión y la desprotección del N-terminal del péptido en crecimiento tengan lugar en una única etapa del procedimiento. Es especialmente preferido el procedimiento de la invención en el que los grupos protectores temporales, presentes en el N-terminal del péptido en crecimiento y opcionalmente presentes en el agente de eliminación, sean grupos que se puedan retirar por hidrogenólisis mientras que los grupos protectores permanentes sean grupos protectores que se puedan retirar por acidólisis. Preferiblemente, dichos grupos protectores temporales son del tipo bencil, por ejemplo, grupos bencil y benciloxicarbonil (sustituidos). Un agente de eliminación preferido es una amina primaria que comprende un anión libre o un anión latente, y en particular un derivado de aminoácido protegido en el C-terminal. Además del carboxilato, la amina de eliminación puede comprender otras funciones aniónicas tales como -pero sin limitarse a- sulfonato, sulfato, fosfonato, fosfato o fenolato. Un aminoácido altamente preferido para usar como un agente de eliminación es \beta-alanina o uno de sus derivados (por ejemplo, un derivado éster o silil éster). El agente de eliminación más preferido es \beta-alaninato de bencilo o una de sus sales.

También se puede usar como un agente de eliminación un tiol que comprenda un anión libre o uno latente en lugar de una amina que comprenda un anión libre o uno latente según el procedimiento de esta invención.

El agente de eliminación se usa preferiblemente en un exceso dos a seis veces molar con respecto al componente activo residual que necesita ser eliminado.

El uso de un agente de eliminación según la presente invención produce compuestos de eliminación hidrófilos que se pueden extraer activamente en una fase acuosa básica después de la etapa de desprotección: después de la desprotección (si es aplicable), se potencia el carácter hidrófilo por la presencia tanto de una función amino libre como de una función carboxílica libre en las especies eliminadas. De ese modo, el procedimiento de esta invención da lugar a una purificación intermitente muy efectiva debido a la posibilidad de extraer activamente un compuesto eliminado hidrófilo. Además, se extrae de la mezcla de reacción al mismo tiempo un posible exceso presente de componente carboxílico que no se ha activado y cuyo grupo protector temporal también se ha eliminado durante la desprotección.

Según el procedimiento de esta invención, se usa al menos un ciclo, pero posiblemente más ciclos del procedimiento, que comprende(n) una etapa (b') en la que se usa un anión libre o un anión latente como un agente de eliminación de las funciones carboxílicas activadas residuales. Sin embargo, según una realización adicional de esta invención, el procedimiento puede también comprender uno o más ciclos en los que en la etapa (b) se usa como agente de eliminación una poliamina, tal como 3-dimetilamino-1-propilamina.

Otro procedimiento preferido de esta invención comprende uno o más ciclos en los que en la etapa (b) no tiene lugar la desprotección (de ese modo se eligen circunstancias tales que el agente de eliminación sólo se usa para inactivar, por ejemplo, usando el grupo protector Z y una amina que comprende un anión latente como un agente de eliminación) y la etapa posterior (c) que comprende extracciones secuenciales básica, ácida y básica, que se realizan preferiblemente en presencia de cloruro sódico o nitrato potásico. Este procedimiento comprende una etapa posterior (d) que comprende desprotección y extracciones secuenciales básica y neutra; estas extracciones preferiblemente se realizan en presencia de cloruro sódico o nitrato potásico.

Otro procedimiento preferido de esta invención comprende uno o más ciclos en los que en la etapa (b) tienen lugar tanto la inactivación como la desprotección (por ejemplo, usando el grupo protector Bsmoc y una poliamina como un agente de eliminación) y la etapa posterior (c) comprende extracciones secuenciales básica y neutra, que se realizan preferiblemente en presencia de cloruro sódico o nitrato potásico.

También es preferido un procedimiento en el que en el último ciclo en la etapa (a) los grupos protectores del componente carboxílico exhiben una labilidad parecida a la de los grupos protectores permanentes del componente amino, y en la etapa (b) el agente de eliminación es una poliamina.

El procedimiento según esta invención se puede realizar en varios disolventes orgánicos que se usan habitualmente para la producción de péptidos. Un disolvente orgánico altamente preferido es acetato de etilo. También se prefieren mezclas de acetato de etilo y otros disolventes orgánicos, tales como diclorometano, 1-metil-2-pirrolidona, N,N-dimetilformamida o tetrahidrofurano.

El procedimiento de esta invención se puede realizar a temperaturas bien conocidas en la técnica para tales etapas en la síntesis clásica de péptidos en fase disolución. Sin embargo, el procedimiento preferiblemente se realiza en un intervalo de temperatura de 0 a 50ºC, y en particular a temperatura ambiente.

El procedimiento de esta invención es muy adecuado para la síntesis combinatoria de bibliotecas de péptidos usando el método de corte y mezcla. Las copulaciones se realizan separadamente mientras que las mezclas de acoplamiento individuales se combinan para las extracciones y desprotecciones.

El procedimiento de esta invención es muy adecuado para la automatización ya que se usan protocolos estándar.

El nuevo procedimiento de esta invención es un procedimiento altamente eficiente que se puede usar convenientemente en la producción de oligo y polipéptidos de alta pureza.

Un procedimiento adecuado según la presente invención es la copulación de un exceso de un componente carboxílico con un componente amino, en el que la función carboxílica se pre-activa o activa in situ usando un reactivo de copulación y, si se desea, un aditivo. A continuación de la etapa de copulación, las funciones carboxílicas activadas residuales se eliminan añadiendo el agente de eliminación a la mezcla de reacción y mezclándolo, seguido normalmente por extracción acuosa. Posteriormente, o durante la eliminación, se retiran los grupos protectores temporales usando métodos conocidos en la técnica, normalmente seguido por la retirada del compuesto de eliminación por extracción acuosa. Al mismo tiempo, se extraen de la mezcla de reacción un posible exceso de componente carboxílico presente que no se activó y cuyo grupo protector temporal también se eliminó durante la desprotección, así como otros reactivos y subproductos solubles en agua. A continuación, puede seguir otro ciclo de etapas de copulación, inactivación, desprotección y extracción dependiendo de la longitud del péptido deseado.

El término componente amino se refiere a una molécula que comprende una función amino libre. En particular, el componente amino puede ser cualquier amina, aminoácido u oligopéptido que soporta una función amino libre y cuyos otros grupos funcionales se protegen de una manera tal que no interfieren con la reacción de copulación deseada. La función C-terminal del aminoácido u oligopéptido aplicado se puede proteger como una amida sustituida o no sustituida o como un éster; ejemplos de esto último incluyen -pero no se limitan a- ésteres de metilo, etilo, t-butilo, bencilo, fenacilo, 3-(3-metil)pentilo (Mpe), 2-(2-fenil)propilo (Pp), 2-clorotritilo (Clt), difenil(4-piridil)metilo (PyBzh), diciclopropilmetilo (Dcpm), 9-fluorenilmetilo (Fm), allilo (All), 2-(trimetilsilil)etilo (Tmse), 4-{N-[1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexiliden)-3-metilbutil]-amino}bencilo (Dmab) y ésteres que se pueden escindir enzimáticamente [Roeske, R.W. (1981) en: "The Peptides", vol. 3 (Gross, E. y Meienhofer, J., eds.) Academic Press, New York, páginas 101-136; para Mpe: Karlström, A. y Undén, A. (1996) Tetrahedron Lett. 37, 4343-4246; para Pp: Yue, C. et al. (1993) Tetrahedron Lett. 34, 323-326; para Clt: Athanassopoulos, P. et al. (1995) Tetrahedron Lett. 36, 5645-5648; para PyBzh: Mergler, M. et al. (2001) P154, 2^{nd} International Peptide Symposium & 17^{th} American Peptide Symposium; para Dcpm: Carpino, L.A. et al. (1995) J. Org. Chem. 60, 7718-7719; para Fm: Al-Obeidi, F. et al. (1990) Int. J. Peptide Protein Res. 35, 215-218; para All: Kunz, H. et al. (1985) Int. J. Peptide Protein Res. 26, 493-497; para Tmse: Sieber, P. (1977) Helv. Chim. Acta 60, 2711-2716; para Dmab: Chan, W.C. et al. (1995) J. Chem. Soc., Chem. Commun., 2209-2210]. Se prefieren funciones del tipo t-butilo o funciones de labilidad parecida para la protección permanente de otros grupos funcionales en el componente amino; estos incluyen -pero sin limitarse a- t-butilo (^{t}Bu) para la protección de las cadenas laterales de Asp, Glu, Ser, Thr y Tyr, t-butoxicarbonilo (Boc) para la protección de las cadenas laterales de Lys y Trp, tritilo (Trt) para la protección de las cadenas laterales de Asn, Gln y His y 2,2,5,7,8-pentametilcromano-6-sulfonilo (Pmc) o 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofurano-5-sulfonilo (Pbf) para la protección de la cadena lateral de Arg [Barany, G. y Merrifield, R.B. (1980) en: "The Peptides", vol. 2 (Gross, E. y Meienhofer, J., eds.) Academic Press, New York, páginas 1-284; para Trp(Boc): Franzén, H. et al. (1984) J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1699-1700; para Asn(Trt) y Gln(Trt): Sieber, P. y Riniker, B. (1991) Tetrahedron Lett. 32, 739-742; para His(Trt): Sieber, P. y Riniker, B. (1987) Tetrahedron Lett. 28, 6031-6034; para Pmc: Ramage, R. y Green, J. (1987) Tetrahedron Lett. 28, 2287-2290; para Pbf: Carpino, L.A. et al. (1993) Tetrahedron Lett. 34, 7829-7832].

El término componente carboxílico se refiere a una molécula que comprende una función carboxílica libre. En particular, el componente carboxílico puede ser cualquier ácido carboxílico, aminoácido u oligopéptido que soporte una función carboxílica libre y cuyos otros grupos funcionales estén protegidos de una manera tal que no interfieran con la reacción de copulación deseada. En una realización preferida, el grupo amino del aminoácido u oligopéptido aplicado se protege temporalmente con una función benciloxicarbonilo (Z); otros ejemplos incluyen -pero no se limitan a- las funciones Boc, Trt, fluoren-9-ilmetoxicarbonilo (Fmoc), 2-(metilsulfonil)etoxicarbonilo (Msc), aliloxicarbonilo (Alloc), funciones del tipo arilsulfonilo, tal como orto-nitrobencensulfonilo (o-NBS) y funciones que se pueden escindir enzimáticamente [Geiger, R. y König, W. (1981) en: "The Peptides", vol. 3 (Gross, E. y Meienhofer, J., eds.) Academic Press, New York, páginas. 1-99; para Alloc: Kunz, H. y Unverzagt, C. (1984) Angew. Chem. 96, 426-427; para arilsulfonilo: Fukuyama, T. et al. (1997) Tetrahedron Lett. 38, 5831-5834]. Se prefieren las funciones del tipo t-butilo o funciones de labilidad parecida para la protección permanente de otros grupos funcionales en el componente carboxílico, como se describió anteriormente para el componente amino. El componente carboxílico puede ser preactivado como un éster activo, preferiblemente un éster de N-hidroxisuccinimida, benzotriazol-1-il, pentafluorofenilo o nitrofenilo, un haluro, un N-carboxianhídrido o como un anhídrido simétrico. Alternativamente, el componente carboxílico puede activarse in situ como un anhídrido mezclado o usando un reactivo de copulación, tal como una carbodiimida, preferiblemente N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC) o hidrocloruro de 1-(3'-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDC), un uronio o una sal de fosfonio en la posible presencia de un aditivo de copulación, preferiblemente N-hidroxisuccinimida (HONSu), 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), 3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidro-1,2,3-benzotriazina (HOOBt), 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt) o 6-cloro-1-hidroxibenzotriazol (Cl-HOBt) y si se requiere, en presencia de una amina terciaria ["The Peptides", vol. 1 (1979) (Gross, E. y Meienhofer, J., eds.) Academic Press, New York; Li, P. and Xu, J.-C. (2000) Chin. J. Chem. 18, 456-466].

El grupo protector temporal se puede eliminar según los métodos conocidos en la técnica (vide supra). Se puede eliminar la función Z por hidrogenólisis usando procedimientos (estándar) que aplican, por ejemplo, gas hidrógeno o formiato como un donante de hidrógeno. Durante este proceso se eliminan todos los grupos protectores del tipo bencilo y se mantienen todos los grupos protectores del tipo t-butilo o funciones de labilidad parecida. El último se puede eliminar por acidólisis según los métodos conocidos en la técnica.

Una persona experta en la técnica entenderá qué significa el término extracción acuosa básica. Sin embargo, las extracciones acuosas básicas se realizan preferiblemente usando disolución acuosa de hidrogenocarbonato sódico o carbonato sódico, si se desea en presencia de cloruro sódico o nitrato potásico. El término extracción acuosa activa se refiere a una extracción en la que un componente amino se extrae en condiciones ácidas en la forma protonada (amonio) o un componente carboxílico se extrae en condiciones básicas en la forma desprotonada (carboxilato).

La invención se ilustra adicionalmente con los siguientes ejemplos, que no se han de interpretar como una limitación de esta invención.

Ejemplo 1 Boc-Gly-Phe-Asp(O^{t}Bu)-Ser(^{t}Bu)-O^{t}Bu

1^{er} Ciclo: A una disolución en agitación de 4,34 g de H-Ser(^{t}Bu)-O^{t}Bu en una mezcla de acetato de etilo y diclorometano a 20ºC se añadieron 3,24 g de 1-hidroxibenzotriazol, 7,76 g de Z-Asp(O^{t}Bu)-OH, 4,20 g de hidrocloruro de 1-(3'-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida y 2,42 ml de 4-metilmorfolina. Después de agitar la disolución resultante hasta que se completó la reacción, se añadieron 1,21 ml de 4-metilmorfolina y 3,51 g de sal de \beta-alaninato p-toluensulfonato de bencilo. La mezcla se agitó durante otros 30 minutos y se extrajo con 5% Na_{2}CO_{3}/10% NaCl, 5% KHSO_{4}/10% NaCl y 5% Na_{2}CO_{3}/10% NaCl.

La capa orgánica que contenía el dipéptido protegido Z-Asp(O^{t}Bu)-Ser(^{t}Bu)-O^{t}Bu se sometió a hidrogenólisis catalítica en presencia de paladio en carbón activo. Después de completarse la reacción, se añadió 5% Na_{2}CO_{3}/10% NaCl y se filtró la suspensión resultante. El residuo se lavó con una mezcla de acetato de etilo y diclorometano, y los filtrados orgánicos combinados se extrajeron con 5% Na_{2}CO_{3}/10% NaCl y 30% NaCl.

2º Ciclo: A la capa orgánica que contenía el dipéptido H-Asp(O^{t}Bu)-Ser(^{t}Bu)-O^{t}Bu a 20ºC se le añadieron 3,24 g de 1-hidroxibenzotriazol, 7,18 g de Z-Phe-OH, 4,20 g de hidrocloruro de 1-(3'-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida y 2,42 ml de 4-metilmorfolina. Después de agitar la disolución resultante hasta que se completó la reacción, se añadieron 1,21 ml de 4-metilmorfolina y 3,51 g de sal de \beta-alaninato p-toluensulfonato de bencilo. La mezcla se agitó durante otros 30 minutos y se extrajo con 5% Na_{2}CO_{3}/10% NaCl, 5% KHSO_{4}/10% NaCl y 5% Na_{2}CO_{3}/10% NaCl.

La capa orgánica que contenía el tripéptido protegido Z-Phe-Asp(O^{t}Bu)-Ser(^{t}Bu)-O^{t}Bu se sometió a hidrogenólisis catalítica en presencia de paladio en carbón activo. Después de completarse la reacción, se añadió 5% Na_{2}CO_{3}/10% NaCl y se filtró la suspensión resultante. El residuo se lavó con una mezcla de acetato de etilo y diclorometano, y los filtrados orgánicos combinados se extrajeron con 5% Na_{2}CO_{3}/10% NaCl y 30% NaCl.

3er Ciclo: A la capa orgánica que contenía el tripéptido H-Phe-Asp(O^{t}Bu)-Ser(^{t}Bu)-O^{t}Bu a 20ºC se le añadieron 3,24 g de 1-hidroxibenzotriazol, 4,21 g de Boc-Gly-OH, 4,20 g de hidrocloruro de 1-(3'-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida y 2,42 ml de 4-metilmorfolina. Después de agitar la disolución resultante hasta que se completó la reacción, se añadieron 1,25 ml de 3-dimetilamino-1-propilamina. La mezcla se agitó durante otros 30 minutos y se extrajo con 5% Na_{2}CO_{3}/10% NaCl, 5% KHSO_{4}/10% NaCl, 5% Na_{2}CO_{3}/10% NaCl, 30% NaCl y agua. La capa orgánica se evaporó a sequedad y el residuo se trituró con metil tert-butil éter y se seco para dar el tetrapéptido protegido deseado con rendimiento de 95% sobre la base del material de partida H-Ser(^{t}Bu)-O^{t}Bu. El procedimiento se completó en 6 horas.

Pureza: 98,1% por HPLC en fase reversa (24 a 68% de acetonitrilo en ácido trifluoracético al 0,1% en 29 minutos a 220 nm, 2,0 ml/min, columna C_{18} de 5 micrómetros). Identidad: m/z 425,4 [M-Boc-3^{t}Bu+H]^{+}, 469,4 [M-4^{t}Bu+H]^{+},
525,4 [M-3^{t}Bu+H]^{+}, 581,4 [M-2^{t}Bu+H]^{+}, 637,4 [M-^{t}Bu+H]^{+}, 693,4 [M+H]^{+} por MS con electro pulverización; ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 1,16 (s, 9H), 1,44 (m, 27H), 2,59 (dd, 1H), 2,79 (dd, 1H), 3,09 (m, 2H), 3,51 (dd, 1H), 3,69-3,86 (m, 3H), 4,47 (m, 1H), 4,67-4,78 (m, 2H), 5,20 (bs, 1H), 6,68 (d, 1H), 7,12-7,34 (m, 7H).

Ejemplo 2 H-His-Trp-Ser(^{t}Bu)-Tyr(^{t}Bu)-D-Leu-Leu-Orn(Boc)-Pro-O^{t}Bu

1er Ciclo: A una disolución en agitación de 1300 g de H-Pro-O^{t}Bu.HCl en acetato de etilo a 20ºC, se añadieron 1014 g de 1-hidroxibenzotriazol, 2756 g de Z-Orn(Boc)-OH, 1378 g de hidrocloruro de 1-(3'-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida y 1495 ml de 4-metilmorfolina. Después de agitar la disolución resultante hasta que se completó la reacción, se añadieron 377 ml de 4-metilmorfolina y 1105 g de sal de \beta-alaninato p-toluensulfonato de bencilo. La mezcla se agitó durante otros 30 minutos y se extrajo con 5% Na_{2}CO_{3}/10% NaCl, 5% KHSO_{4}/10% NaCl y 5% Na_{2}CO_{3}/10% NaCl.

La capa orgánica que contenía el dipéptido protegido Z-Orn(Boc)-Pro-O^{t}Bu se sometió a hidrogenólisis catalítica en presencia de paladio en carbón activo. Después de completarse la reacción, se añadió 5% Na_{2}CO_{3}/15% NaCl y la suspensión resultante se filtró. El residuo se lavó con acetato de etilo y los filtrados orgánicos combinados se extrajeron con 5% Na_{2}CO_{3}/15% NaCl y 30% NaCl. Las capas acuosas separadas se re-extrajeron con acetato de etilo.

2º Ciclo: A las capas orgánicas combinadas que contenían el dipéptido H-Orn(Boc)-Pro-O^{t}Bu a 20ºC, se añadieron 1014 g de 1-hidroxibenzotriazol, 1993 g de Z-Leu-OH, 1320 g de hidrocloruro de 1-(3'-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida y 754 ml de 4-metilmorfolina. Después de agitar la disolución resultante hasta que se completó la reacción, se añadieron 377 ml de 4-metilmorfolina y 1105 g de sal de \beta-alaninato p-toluensulfonato de bencilo. La mezcla se agitó durante otros 30 minutos y se extrajo con 5% Na_{2}CO_{3}/10% NaCl, 5% KHSO_{4}/10% NaCl y 5% Na_{2}CO_{3}/10% NaCl.

La capa orgánica que contenía el dipéptido protegido Z-Leu-Orn(Boc)-Pro-O^{t}Bu se sometió a hidrogenólisis catalítica en presencia de paladio en carbón activo. Después de completarse la reacción, se añadió 5% Na_{2}CO_{3}/15% NaCl y la suspensión resultante se filtró. El residuo se lavó con acetato de etilo y los filtrados orgánicos combinados se extrajeron con 5% Na_{2}CO_{3}/10% NaCl y 30% NaCl.

3^{er} Ciclo: A la capa orgánica que contenía el tripéptido H-Leu-Orn(Boc)-Pro-O^{t}Bu a 20ºC, se añadieron 1014 g de 1-hidroxibenzotriazol, 1993 g de Z-D-Leu-OH, 1320 g de hidrocloruro de 1-(3'-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida y 754 ml de 4-metilmorfolina. Después de agitar la disolución resultante hasta que se completó la reacción, se añadieron 377 ml de 4-metilmorfolina y 1105 g de sal de \beta-alaninato p-toluensulfonato de bencilo. La mezcla se agitó durante otros 30 minutos y se extrajo con 5% Na_{2}CO_{3}, 5% KHSO_{4} y 5% Na_{2}CO_{3}.

La capa orgánica que contenía el tripéptido protegido Z-D-Leu-Leu-Orn(Boc)-Pro-O^{t}Bu se sometió a hidrogenólisis catalítica en presencia de paladio en carbón activo. Después de completarse la reacción, se añadió 5% Na_{2}CO_{3} y la suspensión resultante se filtró. El residuo se lavó con acetato de etilo y los filtrados orgánicos combinados se extrajeron con 5% Na_{2}CO_{3} y 10% NaCl.

4º a 7º Ciclo: Estos ciclos se llevaron a cabo siguiendo el procedimiento del tercer ciclo, sustituyendo 1993 g de Z-D-Leu-OH por Z-Tyr(^{t}Bu)-OH (liberado a partir de 4497 g de la correspondiente sal de diciclohexilamonio), 2218 g de Z-Ser(^{t}Bu)-OH, 2538 g de Z-Trp-OH y 2172 g de Z-His-OH, respectivamente. Sin embargo, del quinto ciclo en adelante se doblaron las cantidades de 4-metilmorfolina y sal de \beta-alaninato p-toluensulfonato de bencilo durante la etapa de eliminación. En el quinto ciclo, las extracciones que siguieron a la eliminación se llevaron a cabo a 35ºC. En el séptimo ciclo, la copulación se llevó a cabo a 3ºC, se sustituyeron 1014 g de 1-hidroxibenzotriazol por 2561 g de 6-cloro-1-hidroxibenzotriazol y se añadió una porción suplementaria de 132 g de hidrocloruro de 1-(3'-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida después de 1 hora de copulación. También en el séptimo ciclo, las extracciones que siguieron a la hidrogenólisis se llevaron a cabo a 35ºC. Al final del séptimo ciclo, la capa orgánica se evaporó a sequedad para dar el nonapéptido protegido deseado con rendimiento del 73% sobre la base del material de partida H-Pro-O^{t}Bu.HCl (es decir, como promedio 98% por cada etapa química).

Pureza: 90,6% por HPLC en fase reversa (24 a 68% de acetonitrilo en ácido trifluoracético al 0,1% en 29 minutos a 220 nm, 2,0 ml/min, columna C_{18} de 5 micrómetros). Identidad: m/z 543,6 [M-Boc-2^{t}Bu+2H]^{2+}, 571,6 [M-Boc-^{t}Bu+2H]^{2+}, 599,6 [M-Boc+2H]^{2+}, 649,8 [M+2H]^{2+}, 1298,0 [M+H]^{+} por MS con electro pulverización.

Conclusiones: Se produjeron los péptidos protegidos sin aislamiento intermitente de los intermedios. La pureza e identificación del producto obtenido a partir del primer ejemplo demuestra que el exceso de componentes carboxílicos (activados) se ha eliminado completamente en todas las etapas de los procedimientos y que no se han formado secuencias de inserción usando el procedimiento de esta invención. La síntesis del segundo ejemplo demuestra además que la síntesis según el procedimiento de esta invención es fácilmente escalable. Los productos de ambos ejemplos se obtienen con alto rendimiento y alta pureza en un periodo de tiempo relativamente corto.

Claims

1. Un procedimiento para la síntesis rápida en disolución de un péptido en un disolvente orgánico o una mezcla de disolventes orgánicos, el procedimiento comprende ciclos repetitivos de las etapas (a)-(d):

(b): una etapa de inactivación en la que se usa un agente de eliminación para retirar las funciones carboxílicas activadas residuales, en la que el agente de eliminación también se puede usar para la desprotección del péptido en crecimiento,

(c): uno o más extracciones acuosas y

: opcionalmente (d) una etapa de desprotección separada, seguida de una o más extracciones acuosas,

caracterizadas por que

el procedimiento comprende al menos una etapa (b), denominada (b'), en la que se usa una amina que comprende un anión libre o un anión latente como un agente de eliminación de las funciones carboxílicas activadas residuales.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que en la etapa (a) las cantidades molares de los reactivos usados son en orden decreciente:

componente carboxílico, aditivo de copulación > reactivo de copulación > componente amino.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que en la etapa (a) se usa un componente carboxílico pre-activado.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que en la etapa (b') se usa una amina que comprende un anión latente como agente de eliminación.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el anión latente en la amina de eliminación soporta un grupo protector temporal que puede retirarse selectivamente en presencia de cualquiera de los grupos protectores permanente fijados al péptido en crecimiento.

6. El procedimiento de las reivindicaciones 4 ó 5, en el que el anión latente en la amina de eliminación soporta un grupo protector temporal que exhibe una labilidad parecida a la del grupo protector temporal presente en el N-terminal del péptido en crecimiento.

7. El procedimiento de las reivindicaciones 5 ó 6, en el que los grupos protectores temporales son grupos que se pueden eliminar por hidrogenólisis mientras que los grupos protectores permanentes son grupos que se pueden eliminar por acidólisis.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que los grupos protectores temporales son del tipo bencilo.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 4-8, en el que el agente de eliminación es una amina primaria que comprende un anión libre o un anión latente.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que la amina primaria es un derivado de aminoácido protegido en el C-terminal.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el aminoácido es \beta-alanina o uno de sus derivados.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el agente de eliminación es \beta-alaninato de bencilo o una de sus sales.

13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que se usa un tiol que comprende un anión libre o uno latente como un agente de eliminación en lugar de una amina que comprende un anión libre o uno latente.

14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que el procedimiento comprende uno o más ciclos en los que en la etapa (b) se usa una poliamina como agente de eliminación.

15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, que comprende uno o más ciclos en los que en la etapa (b) no tiene lugar la desprotección y la etapa (c) posterior comprende extracciones secuenciales básica, ácida y básica.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que las extracciones se llevan a cabo en presencia de cloruro sódico o nitrato potásico.

17. El procedimiento de la reivindicación 15 ó 16, que comprende una etapa posterior (d) que comprende la desprotección y las extracciones secuenciales básica y neutra.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que las extracciones se llevan a cabo en presencia de cloruro sódico o nitrato potásico.

19. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, que comprende uno o más ciclos en los que en la etapa (b) tienen lugar tanto la inactivación como la desprotección y la etapa posterior (c) comprende extracciones secuenciales básica y neutra.

20. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que las extracciones se llevan a cabo en presencia de cloruro sódico o nitrato potásico.

21. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-20, en el que en el último ciclo de la etapa (a) los grupos protectores del componente carboxílico exhiben una labilidad parecida a la de los grupos protectores permanentes del péptido en crecimiento y en la etapa (b) el agente de eliminación es una poliamina.

22. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-21, en el que el disolvente orgánico o mezcla de disolventes orgánicos es acetato de etilo o una mezcla de acetato de etilo y diclorometano, una mezcla de acetato de etilo y 1-metil-2-pirrolidona, una mezcla de acetato de etilo y N,N-dimetilformamida o una mezcla de acetato de etilo y tetrahidrofurano.

23. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-22, en el que el procedimiento se lleva a cabo en un intervalo de temperaturas de 0 a 50ºC.

24. El procedimiento de la reivindicación 23, en el que el procedimiento se lleva a cabo a temperatura ambiente.

25. Un método para la síntesis combinatoria de bibliotecas de péptidos usando el método de corte y mezcla, en el que se aplica el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-24.

26. Un método para la síntesis de péptidos automatizada en disolución, en el que se aplica el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-25.