CN1398876A - 快速溶液合成肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及快速溶液合成肽的方法，该方法包括步骤(a)－(b)的重复循环：(a)偶联步骤，使用过量的活化羧基成分酰化氨基成分，(b)淬灭步骤，在该步骤中使用清除剂除去残余的活化羧基官能团，其中该清除剂还可以用于使生长中的肽去保护，(c)一或多个水抽提和任选地，(d)独立的去保护步骤，之后进行一或多次水抽提，其特征在于该方法包括至少一个步骤(b)，称作步骤(b’)，在该步骤中包含自由阴离子或潜阴离子的胺或硫醇用作残余活化羧基官能团的清除剂。在本发明方法中，在获得最终肽序列之前，无需分离生长中的肽。此高效方法对于制备高纯度的寡肽和多肽是有用的。

Description

快速溶液合成肽的方法
技术领域
本发明涉及快速溶液合成肽的多用途新方法，其中在完成对期望序列的组装之前无需分离生长中的肽。
背景技术
肽是在固体支持物上或溶液中合成的。在这两种方法中，偶联和去保护步骤重复地交替，并可以被间歇纯化分开。在固相方法中，序列在最终从所述支持物上切割下来之前完全组装并附着在固体支持物上。通过过滤除去过量试剂和副产物。固相合成明显地具有以下优点：或多或少是通用的并易于自动化。然而，该方法也有严重的缺陷。例如，反应受到扩散控制，并且在应用的非均相条件下反应常十分缓慢；为了避免缺失序列，需要相对大过量的试剂。此外，必须对生长中的肽的所有反应性侧链进行保护：由于不进行间歇的纯化，所以由于存在未保护侧链而造成的副反应可以导致终产物不纯。固相方法难于扩大规模，而且就试剂和材料而言其成本较高。
另一方面，经典的溶液相方法更易于扩大规模，并且就试剂和材料而言较便宜。因为可以通过间歇纯化除去由于未保护侧链的副反应导致的副产物，所以通常无需对氨基酸进行全部保护。然而，溶液相方法需要序列特异的方案，并且完全序列的产生极为费时。
由于这些方法的缺陷，因此需要一种结合了这两种经典方法的优点，尤其是用于肽的大规模合成的方法。新的方法应当快速、易于扩大规模并且通用。
在溶液相合成中，优选在每个偶联步骤中使用稍过量的活化羧基成分，以保证与氨基成分定量偶联；由此，可以避免终产物中出现缺失序列。通常认为，在间歇水操作过程中残余的活化羧基成分被破坏和除去。然而，通常会遇到作为终产物的杂质的插入肽序列，原因是偶联步骤后不能完全去除残余(活化)羧基成分，这些成分在去保护后又随之发生偶联。为了避免所述副反应的发生，可以直接在偶联步骤后引入清除步骤以清除(失活)残余的活化羧基官能团。胺通常被用作清除剂。使用多胺作为清除剂导致被清除的化合物可以根据它们的极性被有效地抽提至-优选酸性的-水相中[例如Kisfaludy，L.等(1974)Tetrahedron Lett.19，1785-1786]。该抽提通常在去保护步骤前进行，以避免生长中的肽流失到水相中。然而，已发现该程序在许多情况下由于被清除化合物的疏水性(羧基成分的氨酰基部分固有的疏水性被仍存在的氨基保护基团加强)导致间歇的纯化不彻底。因此，水相抽提并不十分有效。
近来，Carpino，LA.等[(1999)J.Org.Chem.64，4324-4338]报道了对此清除方法的改进。除了使用多胺作为清除剂外，还在该方法中使用氨基保护基团1，1-双氧代苯并[b]噻吩-2-基甲氧基羰基(Bsmoc)。Bsmoc官能团对碱有极高的不稳定性。其结果是，使用多胺在一个相同步骤中清除残余的活化羧基官能团和除去Bsmoc官能团。Bsmoc官能团的使用被描述为使用快速连续溶液相技术制备(寡)肽的一个显著进步，这使得可以在单个系列步骤中在相对短的时间内组装肽。
发明内容
现在发现了用于快速连续溶液合成肽的新方法，其中使用允许基本上任意选择氨基保护基团(位于活化的羧基成分N端的保护基团)的清除剂。与Carpino方法不同，不必在清除过量活化羧基官能团的相同条件下进行N端官能团的去保护。因此，本发明方法比Carpino方法具有大得多的通用性。
根据本发明的新方法是在有机溶剂或有机溶剂混合物中快速溶液合成肽的方法，包括步骤(a)-(b)的重复循环：
(a)偶联步骤，使用过量的活化羧基成分酰化氨基成分，
(b)淬灭步骤，在该步骤中使用清除剂除去残余的活化羧基官能团，其中该清除剂还可以用于使生长中的肽(即正在形成的肽)去保护，
(c)一或多个水抽提(aqueous extraction)，和任选地，(d)独立的去保护步骤，可能地，之后进行一或多次水抽提，其特征在于该方法包括至少一个步骤(b)，称作步骤(b’)，在该步骤中使用包含自由阴离子或潜阴离子的胺作为残余活化羧基官能团的清除剂。
在本发明方法中，在获得最终的肽序列(即本发明方法的终产物)前，无需分离生长中的肽。因此，该方法比经典的溶液相方法耗费的时间显著少并易于扩大规模。本发明方法使得可以高效除去残余的活化羧基成分，而且不会遇到使用多胺作为清除剂的其它现有技术方法的疏水问题。因此，获得高纯度的肽。
优选地，本发明方法步骤(a)中，所用试剂的摩尔量按递减顺序排列：羧基成分、偶联添加物＞偶联试剂＞氨基成分。而且优选其中步骤(a)使用预先活化的羧基成分的方法。
在另一优选实施方案中，步骤(b’)中使用包含潜阴离子的胺作为清除剂。优选地，清除性胺中的潜阴离子带有暂时性保护基团，该基团可以在与生长中的肽连接的任何持久保护基团存在时选择性地去除。在一个尤其优选的实施方案中，清除性胺中潜阴离子的保护基团表现出与生长中的肽N端存在的暂时性保护基团相似的不稳定性。这就允许在一个工艺步骤中使清除剂去保护产生阴离子并使生长中的肽的N端去保护。尤其优选以下本发明方法，其中存在于生长中的肽N端的和任选地存在于清除剂中的暂时性保护基团是可氢解去除的基团，而持久保护基团是可酸解去除的保护基团。优选地，所述暂时性保护基团是苄基类的，例如(取代的)苄基和苄氧基羰基基团。优选的清除剂是包含自由阴离子或潜阴离子的伯胺，尤其是C端被保护的氨基酸的衍生物。除了羧酸根外，清除性胺可以包含其它阴离子官能团，例如-但不限于-磺酸根、硫酸根、膦酸根、磷酸根、或酚盐阴离子。极为优选用作清除剂的氨基酸是β-丙氨酸或其衍生物(例如酯或甲硅烷基酯衍生物)。最优选的清除剂是β-丙氨酸苄基酯或其盐。
根据本发明方法，包含自由阴离子或潜阴离子的硫醇也可以用作清除剂替代含有自由阴离子或潜阴离子的胺。
该清除剂优选以相对于需要清除的残余活性成分2至6倍摩尔的过量使用。
根据本发明清除剂的使用导致亲水性的被清除化合物的产生，这些化合物可以在去保护步骤后有效地被抽提至碱性水相中：在去保护(如果适用的话)后，被清除物中自由氨基官能团和自由羧基官能团的同时存在增强了亲水性。因此，由于可以有效地抽提亲水的被清除化合物，本发明方法导致极为有效的间歇纯化。此外，同时可以从反应混合物中抽提出未被活化的、去保护过程中其暂时性保护基团也被去除了的、可能存在的过量羧基成分。
根据本发明方法，该方法的至少一个循环，但也可能更多个循环，包含步骤(b’)，在该步骤中使用自由阴离子或潜阴离子作为残余的活化羧基官能团的清除剂。然而，根据本发明的其它实施方案，该方法还包括一或多个循环，其中步骤(b)中使用多胺例如3-二甲基氨基-1-丙胺作为清除剂。
本发明另一优选方法包含一或多个循环，其中步骤(b)中不发生去保护(由此对情况进行选择以便仅使用清除剂进行淬灭，例如使用Z保护基团和包含潜阴离子的胺作为清除剂)，而且随后的步骤(c)包括顺序的碱性、酸性和碱性抽提，这些抽提优选在氯化钠或硝酸钾存在时进行。该方法包含随后的步骤(d)，该步骤包括去保护和顺序的碱性和中性抽提；这些抽提优选在氯化钠或硝酸钾存在时进行。
本发明另一优选方法包含一或多个循环，其中步骤(b)中发生淬灭和去保护两者(例如使用Bsmoc保护基团和多胺作为清除剂)，而且随后步骤(c)包括顺序的碱性和中性抽提，这些抽提优选在氯化钠或硝酸钾存在时进行。
而且优选以下方法，其中在最后一个循环，步骤(a)中的羧基成分保护基团表现出与氨基成分的持久保护基团相似的不稳定性，并且步骤(b)中的清除剂是多胺。
根据本发明的方法可以在几种常用于肽制备的有机溶剂中进行。极为优选的有机溶剂是乙酸乙酯。而且优选乙酸乙酯和其它有机溶剂如二氯甲烷、1-甲基-2-吡咯烷酮(pyrrolidinone)、N，N-二甲基甲酰胺或四氢呋喃的混合物。
本发明方法可以在本领域熟知的用于经典溶液相肽合成的这些步骤中的温度下进行。然而，优选该方法在0-50℃的温度范围内进行，尤其是在环境温度下进行。
部分方法非常适于使用分开和混合方法(split and mix method)组合合成(combinatorial synthesis)肽文库。单独进行偶联，而将单个的偶联混合物合并用于抽提和去保护。
因为使用了标准方法，本发明方法极为适于自动化。
本发明的新方法是一种极为有效的方法，可以方便地用于制备高纯度的寡肽和多肽。
根据本发明的适当方法是使过量羧基成分与氨基成分偶联，其中羧基官能团是预先活化的或是使用偶联试剂以及(如果期望的话)添加剂在原位活化的。偶联步骤后，通过在反应混合物中加入清除剂清除残余的活化羧基官能团，之后通常进行水抽提。随后或在清除过程中，使用本领域已知的适当方法去除暂时性保护基团，之后通常通过水抽提除去被清除的化合物。同时，未活化的、其暂时性保护基团在去保护过程中也被除去了的、可能存在的过量羧基成分、以及其它水溶性试剂和副产物也从反应混合物中被抽提出去。接着，之后可以根据期望肽的长度进行另一循环的偶联、淬灭、去保护和抽提步骤。
术语氨基成分是指含有自由氨基官能团的分子。具体地，该氨基成分可以是带有自由氨基官能团的、而且其它官能团以一定方式被保护以致它们不会干扰期望的偶联反应的任何胺、氨基酸或寡肽。所用氨基酸或寡肽的C端官能团可以被保护以取代的或未取代的酰胺或以酯的形式存在；后者的例子包括-但不限于-甲基、乙基、叔丁基、苄基、苯甲酰甲基、3-(3-甲基)戊基(Mpe)、2-(2-苯基)丙基(Pp)、2-氯三苯甲基(Clt)、二苯基(4-吡啶基)甲基(PyBzh)、二环丙基甲基(Dcpm)、9-芴基甲基(Fm)、烯丙基(All)、2-(三甲基甲硅烷基)乙基(Tmse)、4-{N-[1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己基)-3-甲基丁基]-氨基}苄基(Dmab)酯和酶促可切割的酯[Roeske，R.W.[1981]，《肽》(The Peptides’)，第3卷(Gross，E.和Meienhofer，J.编)Academic Press，New York，第101-136页；对于Mpe：Karlstrom，A.和Unden，A.(1996)TetrahedronLett.37，4343-4262；对于Pp：Yue，C.等(1993)Tetrahedron Lett.34，323-326；对于Clt：Athanassopoulos，P.等(1995)Tetrahedron Lett.36，5645-5648；对于PyBzh：Mergler，M.等(2001)P154，第2届国际肽研讨会和第17届美国肽讨论会；对于Dcpm：Carpino，L.A.等(1995)J.Org.chem.60，7718-7719；对于Fm：Al-Obeidi，F.等(1990)Int.J.Peptide Protein Res.35，215-218；对于All：Kunz，H.等(1985)Int.J.Peptide Protein Res.26，493-497；对于Tmse：Sieber，P.(1997)Helv.Chim.Acta60，2711-2716；对于Dmab：Chan，W.C.等(1995)J.Chem.Soc.，Chem.Commun.，2209-2210]。对于氨基成分中其它官能团的持久保护，优选叔丁基类官能团或具有类似不稳定性的官能团；这些包括-但不限于-叔丁基(tBu)用于保护Asp、Glu、Ser、Thr和Tyr侧链；叔丁氧基羰基(Boc)用于保护Lys和Trp侧链；三苯甲基(Trt)用于保护Asn、Gln和His侧链；和2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(Pmc)或2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)用于保护Arg侧链[Barany，G.和Merrifield，R.B.(1980)，《肽》第2卷(Gross，E.和Meienhofer，J.编)Academic Press，New York，第1-284页；对于Trp(Boc)：Franzen，H.等(1984)J.Chem.Soc.Chem.Commun.，1699-1700；对于Asn(Trt)和Gln(Trt)：Sieber，P.和Riniker，B.(1991)Tetrahedron Lett.32，739-742；对于His(Trt)：Sieber，P.和Riniker，B.(1987)Tetrahedron Lett.28，6031-6034；对于Pmc：Ramage，R.和Green，J.(1987)Tetrahedron Lett.28，2287-2290；对于Pbf：Carpino，L.A.等(1993)Tetrahedron Lett.34，7829-7832]。
术语羧基成分是指包含自由羧基官能团的分子。具体地，该羧基成分可以是带有自由羧基端官能团、且其它官能团以一定方式被保护以致它们不干扰期望的偶联反应的任何羧酸、氨基酸或寡肽。在一个优选实施方案中，所用氨基酸或寡肽的氨基基团被苄氧基羰基(Z)官能团暂时性保护；其它例子包括-但不限于-Boc、Trt、芴-9-基甲氧基羰基(Fmoc)、2-(甲基磺酰基)乙氧基羰基(Msc)、烯丙基氧基羰基(Alloc)官能团、芳基磺酰基类如邻硝基苯磺酰基(o-NBS)官能团、和酶促可切割的官能团[Geiger，R.和Konig，W.(1981)《肽》第3卷(Gross，E.和Meienhofer，J.编)Academic Press，New York，第1-99页；对于Alloc：Kunz，H.和Unverzagt，C.(1984)Angew.Chem.96，426-427；对于芳基磺酰基：Fukuyama，T.等(1997)Tetrahedron Lett.38，5831-5834]。与上述用于氨基成分的相同，对于羧基成分中其它功能基团的持久保护，优选叔丁基类的官能团或具有类似不稳定性的官能团。可以预先将羧基成分活化为活性酯、优选N-羟基琥珀酰亚胺、苯并三唑-1-基、五氟苯基或4-硝基苯基酯、卤化物、N-羧基酐(N-carboxyanhydride)，或活化为对称的酐。或者，可以将羧基成分原位活化为混合酐，或者可以使用偶联试剂如碳二亚胺、优选N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)或1-(3’-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸(EDC)、脲鎓(uronium)或磷鎓盐，在可能存在偶联添加剂，优选N-羟基琥珀酰亚胺(HONSu)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、3-羟基-4-氧代-3，4-二氢-1，2，3-苯并三嗪(HOOBt)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)或6-氯-1-羟基苯并三唑(Cl-HOBt)的情况下以及如果需要的话在存在叔胺的情况下原位活化该羧基成分[《肽》，第1卷(1979)(Gross，E.和Meienhofer，J.编)Academic Press，New York；Li，P.和Xu，J.-C.(2000)Chin.J.Chem.18，456-466]。
可以根据本领域已知方法(参阅上文)，除去暂时性保护基团。可以使用应用如氢气或甲酸盐(formiate)作为氢供体的(标准)方法通过氢解作用除去Z官能团。在该方法中，除去所有苄基类保护基团，并保持叔丁基类保护基团或具有类似不稳定性的保护基团。后者可以根据本领域已知方法通过酸解除去。
本领域技术人员将明了术语碱性水抽提的意义。然而，碱性水抽提优选使用碳酸氢钠或碳酸钠的水溶液，如果期望的话在氯化钠或硝酸钾存在下进行。术语有效水抽提是指以下抽提，其中在酸性条件下以质子化形式(铵)抽提氨基成分，或在碱性条件下以脱质子化形式(羧酸盐)抽提羧基成分。
本发明通过以下实施例作进一步举例说明，这些实施例不应解释为对本发明的限制。
实施例1Boc-Gly-Phe-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu
第1个循环：20℃下向4.34g H-Ser(tBu)-OtBu在乙酸乙酯和二氯甲烷混合物中的搅拌溶液中，加入3.24g 1-羟基苯并三唑、7.76gZ-Asp(OtBu)-OH、4.20g 1-(3’-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸化物和2.42ml 4-甲基吗啉。搅拌所获溶液直至反应完成，之后加入1.21ml 4-甲基吗啉和3.51g β-丙氨酸苄基酯对甲苯磺酸盐。再搅拌混合物30分钟并用5％Na2CO3/10％NaCl，5％KHSO4/10％NaCl和5％Na2CO3/10％NaCl抽提。
在存在活性炭上的钯时，对含有被保护的二肽Z-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu的有机层进行催化氢解。反应完成后，加入5％ Na2CO3/10％ NaCl并过滤所获悬浮液。用乙酸乙酯和二氯甲烷的混合物洗涤该残余物，并用5％Na2CO3/10％ NaCl和30％ NaCl抽提此合并的有机过滤物。
第2个循环：20℃下向含有二肽H-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu的有机层，加入3.24g1-羟基苯并三唑、7.18gZ-Phe-OH、4.20g 1-(3’-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸化物和2.42ml 4-甲基吗啉。搅拌所获溶液直至反应完成，之后加入1.21ml 4-甲基吗啉和3.51g β-丙氨酸苄基酯对甲苯磺酸盐。再搅拌混合物30分钟并用5％ Na2CO3/10％ NaCl，5％ KHSO4/10％NaCl和5％Na2CO3/10％NaCl抽提。
在存在活性炭上的钯时，对含有被保护的三肽Z-Phe-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu的有机层进行催化氢解。反应完成后，加入5％ Na2CO3/10％ NaCl并过滤所获悬浮液。用乙酸乙酯和二氯甲烷的混合物洗涤该残余物，并用5％ Na2CO3/10％ NaCl和30％ NaCl抽提此合并的有机过滤物。
第3循环：20℃下向含有三肽H-Phe-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu的有机层，加入3.24g 1-羟基苯并三唑、4.21g Boc-Gly-OH、4.20g1-(3’-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸化物和2.42ml 4-甲基吗啉。搅拌所获溶液直至反应完成，之后加入1.25ml 3-二甲基氨基-]-丙胺。再搅拌混合物30分钟并用5％ Na2CO3/10％ NaCl、5％ KHSO4/10％NaCl、5％Na2CO3/10％NaCl、30％ NaCl和水抽提。蒸干有机层并用甲基叔丁基醚研制残余物，并干燥产生期望的被保护四肽，基于起始物质H-Ser(tBu)-OtBu有95％产率。该方法在6小时内完成。
纯度：通过反向HPLC(0.1％三氟乙酸中24-68％乙腈，220nm下29分钟、2.0ml/min、5微米C18柱)检测为98.1％。鉴定：
m/z425.4[M-Boc-3tBu+H]+，469.4[M-4tBu+H]+，525.4[M-3tBu+H]+，581.4[M-2tBu+H]+，637.4[M-tBu+H]+，693.4[M+H]+，电喷射MS；1H NMR(CDCl3)δ1.16(s，9H)，1.44(m，27H)，2.59(dd，1H)，2.79(dd，1H)，3.09(m，2H)，3.51(dd，1H)，3.69-3.86(m，3H)，4.47(m，1H)，4.67-4.78(m，2H)，5.20(bs，1H)，6.68(d，1H)，7.12-7.34(m.7H).
实施例2H-His-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Orn(Boc)-Pro-OtBu
第1个循环：20℃下向1300gH-Pro-OtBu.HCl在乙酸乙酯中的搅拌溶液内，加入1014g 1-羟基苯并三唑、2756g Z-Orn(Boc)-OH、1378g1-(3’-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸化物和1495ml 4-甲基吗啉。搅拌所获溶液直至反应完成，之后加入377ml 4-甲基吗啉和1105gβ-丙氨酸苄基酯对甲苯磺酸盐。再搅拌混合物30分钟并用5％ Na2CO3/10％ NaCl，5％ KHSO4/10％NaCl和5％Na2CO3/10％NaCl抽提。
在存在活性炭上的钯时，对含有被保护的二肽Z-Orn(Boc)-Pro-OtBu的有机层进行催化氢解。反应完成后，加入5％ Na2CO3/10％ NaCl并过滤所获悬浮液。用乙酸乙酯洗涤残余物，并用5％Na2CO3/10％NaCl和30％NaCl抽提此合并的有机过滤物。用乙酸乙酯重新抽提此分离的水相层。
第2个循环：20℃下向含有二肽H-Orn(Boc)-Pro-OtBu的合并有机层，加入1014g 1-羟基苯并三唑、1993g Z-Leu-OH、1320g 1-(3’-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸化物和754ml 4-甲基吗啉。搅拌所获溶液直至反应完成，之后加入377ml 4-甲基吗啉和1105g β-丙氨酸苄基酯对甲苯磺酸盐。再搅拌混合物30分钟并用5％ Na2CO3/10％ NaCl，5％KHSO4/10％NaCl和5％Na2CO3/10％NaCl抽提。
在存在活性炭上的钯时，对含有被保护的三肽Z-Leu-Orn(Boc)-Pro-OtBu的有机层进行催化氢解。反应完成后，加入5％Na2CO3/15％ NaCl并过滤所获悬浮液。用乙酸乙酯洗涤该残余物，并用5％Na2CO3/10％ NaCl和30％ NaCl抽提此合并的有机过滤物。
第3循环：20℃下向含有三肽H-Leu-Orn(Boc)-Pro-OtBu的有机层，加入1014g 1-羟基苯并三唑、1993gZ-D-Leu-OH、1320g 1-(3’-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸化物和754ml 4-甲基吗啉。搅拌所获溶液直至反应完成，之后加入377ml 4-甲基吗啉和1105g β-丙氨酸苄基酯对甲苯磺酸盐。再搅拌混合物30分钟并用5％ Na2CO3、5％ KHSO4和5％Na2CO3抽提。
在存在活性炭上的钯时，对含有被保护的四肽Z-D-Leu-Leu-Orn(Boc)-Pro-OtBu的有机层进行催化氢解。反应完成后，加入5％ Na2CO3并过滤所获悬浮液。用乙酸乙酯洗涤该残余物，并用5％Na2CO3和10％ NaCl抽提此合并的有机过滤物。
第4个循环至第7个循环：在第3个循环过程后进行这些循环，分别用Z-Try(tBu)-OH(从4497g相应的二环己基铵盐释放出来的)、2218gZ-Ser(tBu)-OH、2538g Z-Trp-OH和2172g Z-His-OH替代1993gZ-D-Leu-OH。然而，从第5个循环向前，清除步骤中4-甲基吗啉和β-丙氨酸苄基酯对甲苯磺酸盐的量加倍。在第5个循环，清除后35℃进行抽提。在第7个循环，偶联在3℃进行，用2561g 6-氯-1-羟基苯并三唑代替1014g 1-羟基苯并三唑，并在1小时偶联后加入补充部分的132g1-(3’-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸化物。而且，在第7个循环，氢解后在35℃进行抽提。第7个循环末，蒸干有机层产生期望的被保护九肽，基于起始物质H-Pro-OtBu.HCl有73％产率(即，每个化学步骤平均98％)。
纯度：通过反向HPLC(0.1％三氟乙酸中24-68％乙腈，220nm下29分钟、2.0ml/min、5微米C18柱)测得为90.6％。鉴定：
m/z543.6[M-Boc-2tBu+2H]2+，571.6[M-Boc-tBu+2H]2+，599.6[M-Boc+2H]2+，649.8[M+2H]2+，1298.0[M+H]+，采用电喷射MS.
结论：不经间歇分离中间体，产生了该被保护的肽。第一个实施例的所获产物的纯度和鉴定证明，在该方法的所有步骤中均完全地除去了过量的(活化)羧基成分，而且使用本发明方法未形成插入序列。而且，第二个实施例的合成证明，根据本发明方法的合成可以容易地扩大规模。这两个实施例中均在相对短时间内获得了高产率高纯度的产物。

Claims (27)

1.在有机溶剂或有机溶剂混合物中快速溶液合成肽的方法，该方法包括步骤(a)-(b)的重复循环：
(a)偶联步骤，使用过量的活化羧基成分酰化氨基成分，
(b)淬灭步骤，在该步骤中使用清除剂除去残余的活化羧基官能团，其中该清除剂还可以用于使生长中的肽去保护，
(c)一或多个水抽提，和
任选地，(d)独立的去保护步骤，之后进行一或多次水抽提，
其特征在于
该方法包括至少一个步骤(b)，称作步骤(b’)，在该步骤中使用包含自由阴离子或潜阴离子的胺作为残余活化羧基官能团的清除剂。
2.权利要求1的方法，其中步骤(a)中所用试剂的摩尔量按以下递减顺序排列：
羧基成分、偶联添加剂＞偶联试剂＞氨基成分。
3.权利要求1的方法，其中步骤(a)中使用预先活化的羧基成分。
4.权利要求1至3之任一项的方法，其中步骤(b’)中使用包含潜阴离子的胺作为所述清除剂。
5.权利要求4的方法，其中该清除性胺中的潜阴离子带有在与生长中的肽连接的任何持久保护基团存在时能被选择性地去除的暂时性保护基团。
6.权利要求4或5的方法，其中清除性胺中的潜阴离子带有暂时性保护基团，该暂时性保护基团表现出与生长中的肽N端存在的暂时性保护基团类似的不稳定性。
7.权利要求5或6的方法，其中暂时性保护基团是可氢解去除的基团，而持久保护基团是可酸解去除的基团。
8.权利要求7的方法，其中暂时性保护基团是苄基类的。
9.权利要求4-8之任一项的方法，其中清除剂是包含自由阴离子或潜阴离子的伯胺。
10.权利要求9的方法，其中伯胺是C端被保护的氨基酸的衍生物。
11.权利要求10的方法，其中氨基酸是β-丙氨酸或其衍生物。
12.权利要求11的方法，其中清除剂是β-丙氨酸苄基酯或其盐。
13.权利要求1-8之任一项的方法，其中使用包含自由阴离子或潜阴离子的硫醇代替包含自由阴离子或潜阴离子的胺作为清除剂。
14.权利要求1-13之任一项的方法，其中该方法包含一或多个循环，在所述循环中步骤(b)中使用多胺作为清除剂。
15.权利要求1-14之任一项的方法，包含一或多个循环，在该循环中步骤(b)中不发生去保护，而且随后的步骤(c)包含顺序的碱性、酸性和碱性抽提。
16.权利要求15的方法，其中在存在氯化钠或硝酸钾时进行抽提。
17.权利要求15或16的方法，包括随后的步骤(d)，该步骤包含去保护和顺序的碱性和中性抽提。
18.权利要求17的方法，其中在存在氯化钠或硝酸钾时进行抽提。
19.权利要求1-14之任一项的方法，包含一或多个循环，在该循环中步骤(b)中发生淬灭和去保护两者，而且随后的步骤(c)包含顺序的碱性和中性抽提。
20.权利要求19的方法，其中在存在氯化钠或硝酸钾时进行抽提。
21.权利要求1-20之任一项的方法，其中在最后一个循环，步骤(a)中的羧基成分保护基团表现出与生长中的肽的持久保护基团相似的不稳定性，而且步骤(b)中清除剂是多胺。
22.权利要求1-21之任一项的方法，其中有机溶剂或有机溶剂混合物是乙酸乙酯或乙酸乙酯和二氯甲烷的混合物、乙酸乙酯和1-甲基-2-吡咯烷酮的混合物、乙酸乙酯和N，N-二甲基甲酰胺的混合物或乙酸乙酯和四氢呋喃的混合物。
23.权利要求1-22之任一项的方法，其中该方法在0至50℃的温度范围内进行。
24.权利要求23的方法，其中该方法在环境温度下进行。
25.使用分开和混合方法组合合成肽文库的方法，其中应用权利要求1-24之任一项的方法。
26.自动化溶液合成肽的方法，其中应用权利要求1-25之任一项的方法。
27.根据包含权利要求1-26之任一项的方法的方法制备的肽或肽混合物。
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