KR100861031B1 - 펩티드의 급속 용액 합성 방법 - Google Patents

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엔.브이.오가논
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution

Abstract

본 발명은 (a) 과량의 활성화된 카르복실 성분을 사용하여 아미노 성분을 아실화하기 위한 커플링 단계, (b) 스캐빈져를 사용하여 잔류 활성화 카르복실 작용기를 제거하며, 상기 스캐빈져는 성장중인 펩티드의 탈보호에도 사용될 수 있는 것인 퀀칭 단계, (c) 1 이상의 수성 추출 단계, 및 경우에 따라 (d) 별도의 탈보호 단계와, 이어지는 1 이상의 수성 추출 단계의 반복 사이클을 포함하는 펩티드의 급속 용액 합성 방법에 관한 것으로, 이 방법은 유리 음이온 또는 잠재(latent) 음이온을 포함하는 아민 또는 티올이 잔류 활성화 카르복실 작용기의 스캐빈져로서 사용되는, 단계 (b')로 지칭되는 1 이상의 단계 (b)를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명 방법의 수행 도중에는 최종 펩티드 서열이 얻어질 때까지 성장중인 펩티드를 분리할 필요가 없다.
이와 같이 매우 효율적인 방법은 고순도의 올리고펩티드 및 폴리펩티드의 제조에 유용하다.
급속 용액 합성

Description

펩티드의 급속 용액 합성 방법{PROCESS FOR RAPID SOLUTION SYNTHESIS OF PEPTIDES}
본 발명은 목적하는 서열의 조립을 완결하기 전에 성장중인 펩티드를 분리할 필요가 없는 펩티드의 급속 용액 합성을 위한 신규한 다목적 방법에 관한 것이다.
펩티드는 고체 지지체 상에서 또는 용액 중에서 합성된다. 두 방법 모두 커플링 단계와 탈보호 단계를 반복적으로 교대로 실시하며, 그 사이에 간헐적으로 정제를 수행할 수 있다. 고체상 방법에서는 서열을 고체 지지체에 부착시킨 상태로 조립을 완결한 후에 최종적으로 상기 지지체로부터 서열을 절단해 낸다. 과량의 반응물 및 부산물은 여과를 통해 제거한다. 고체상 합성은 분명 이점이 있다. 고체상 합성은 다소 적용 범위가 보편적이며 자동화가 용이하다. 그러나, 몇 가지 심각한 단점도 있다. 예를 들어, 반응은 확산-제어적이며, 적용된 이질 조건 하에서 일반적으로 다소 느린편이다. 결실 서열을 피하기 위해서는 비교적 과량의 반응물이 필요하다. 또한, 성장중인 펩티드의 모든 반응성 측쇄를 보호해야 한다. 간헐적인 정제 단계가 없기 때문에 비보호된 측쇄의 존재로 인한 부반응은 최종 생성물에 불순물을 유발시킬 수 있다. 고체상 방법은 대형화가 어렵고 시약 및 재료의 측면에서 비용이 많이 든다.
반면에, 전통적인 용액상 방법은 대형화가 보다 용이하고 시약과 재료의 비용이 보다 적게 든다. 비보호된 측쇄의 부반응으로 인한 부산물을 간헐적인 정제로 제거할 수 있으므로, 통상 완전히 보호된 아미노산이 필요하지 않다. 그러나, 용액상 방법은 서열 특이적 프로토콜을 필요로 하며 완전한 서열의 제조에는 시간이 많이 소요된다.
상기 방법들의 단점으로 인해 상기의 전통적인 두 가지 방법의 이점을 결합한 방법, 특히 펩티드의 대규모 합성에 적합한 방법이 요구되고 있다. 신규 방법은 빠르고 대형화가 용이하고 적용 범위가 보편적이다.
용액상 합성에서는 아미노 성분에 대한 정량적 커플링을 확실히 하기 위해 각 커플링 단계에 약간 과량의 활성화된 카르복실 성분을 사용하는 것이 바람직하다. 이렇게 하여 최종 생성물 내 결실 서열의 발생을 막을 수 있다. 일반적으로 잔류 활성화 카르복실 성분은 간헐적 수성 후처리 중에 파괴되어 제거되는 것으로 생각된다. 그러나 후속 탈보호 단계와 연계된 커플링 단계 후에 잔류하는 (활성화된) 카르복실 성분이 불완전하게 제거됨으로 인해 삽입 펩티드 서열이 최종 펩티드의 불순물로서 생성되는 경우가 종종 있다. 상기 부반응의 발생을 막기 위해 스캐빈징 단계를 커플링 단계 직후에 도입하여 잔류 활성화 카르복실 작용기를 스캐빈징(불활성화)할 수 있다. 일반적으로 아민을 스캐빈져(scavenger)로 사용한다. 폴리아민을 스캐빈져로서 사용하면 스캐빈징된 화합물이 그들의 극성에 따라 - 바람직하게는 산성-수성 상으로 활성적으로 추출될 수 있도록 한다[참고 문헌: Kisfaludy, L. 등(1974) Tetrahedron Lett. 19, 1785-1786]. 이러한 추출은 통상 탈보호 단계 전에 수행되어 성장중인 펩티드가 수성상으로 유실되는 것을 막는다. 그러나, 많은 경우 이러한 절차는 스캐빈징된 화합물의 소수성으로 인해 간헐적 정제를 불완전하게 하며, 카르복실 성분의 아미노 아실 부분의 고유 소수성은 여전히 존재하는 아미노 보호기에 의해 강화되는 것으로 밝혀졌다. 그러므로 수성 추출은 완전히 효과적인 것은 아니다.
최근, Carpino, L.A. 등의 문헌[(1999) J. Org. Chem. 64, 4324-4338]은 개선된 스캐빈징 방법을 보고하였다. 폴리아민을 스캐빈져로서 사용하는 것 외에도, 아미노 보호기 1,1-디옥소벤조[b]티오펜-2-일메톡시카르보닐(Bsmoc)을 상기 방법에 적용하였다. 상기 Bsmoc 작용기는 염기에 대해 매우 높은 불안정성을 나타낸다. 그 결과, 잔류 활성화 카르복실 작용기는 스캐빈징되고 폴리아민을 이용하여 하나의 동일한 단계에서 Bsmoc 작용기가 제거된다. Bsmoc 작용기의 사용은, 비교적 짧은 시간 내에 일련의 단계에서 펩티드의 조립을 가능하게 하는 급속 연속 용액상 기법을 이용하는 현저히 개선된 (올리고)펩티드의 제조 방법인 것으로 기술되었다.
본 발명자들은 펩티드의 급속 연속 용액 합성을 위한 신규 방법을 발견하였으며, 이 방법에서는 아미노 보호기(활성화된 카르복실 성분의 N-말단에 있는 보호기)의 사실상 임의 선택을 허용하는 스캐빈져를 사용한다. 카르피노(Carpino) 방법과는 대조적으로, N-말단 작용기의 탈보호는 반드시 과량의 활성화된 카르복실 작용기의 스캐빈징에서와 동일한 반응 조건 하에 수행할 필요는 없다. 따라서, 본 발명은 방법은 카르피노 방법보다 훨씬 더 보편적으로 적용이 가능하다.
본 발명에 따른 신규 방법은 (a) 과량의 활성화된 카르복실 성분을 사용하여 아미노 성분을 아실화하기 위한 커플링 단계, (b) 스캐빈져를 사용하여 잔류 활성화 카르복실 작용기를 제거하며, 상기 스캐빈져는 성장중인 펩티드(즉, 형성되고 있는 펩티드)의 탈보호에도 사용될 수 있는 것인 퀀칭 단계, (c) 1 이상의 수성 추출 단계, 및 경우에 따라 (d) 별도의 탈보호 단계와, 가능하게는 이어지는 1 이상의 수성 추출 단계의 반복 사이클을 포함하는, 유기 용매 또는 유기 용매 혼합물 중에서의 펩티드의 급속 용액 합성 방법에 관한 것으로, 이 방법은 유리 음이온 또는 잠재 음이온을 포함하는 아민이 잔류 활성화 카르복실 작용기의 스캐빈져로서 사용되는, 단계 (b')로 지칭되는 1 이상의 단계 (b)를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명 방법의 수행 도중에는 최종 펩티드 서열(즉, 본 발명의 방법의 최종 생성물)이 얻어질 때까지 성장중인 펩티드를 분리할 필요가 없다. 따라서, 본 발명의 방법은 전통적인 용액상 방법보다 시간이 훨씬 적게 소요되고 대형화가 용이하다. 본 발명의 방법은 폴리아민을 스캐빈져로서 사용하는 기타 종래 기술의 방법의 소수성 문제에 직면하지 않고 잔류 활성화 카르복실 성분을 매우 효율적으로 제거할 수 있다. 따라서 고순도의 펩티드가 얻어진다.
본 발명의 방법의 단계 (a)에서, 사용되는 반응물의 몰량은 카르복실 성분, 커플링 첨가제 > 커플링 시약 > 아미노 성분의 순으로 감소되는 것이 바람직하다. 단계 (a)에서, 예비활성화된 카르복실 성분을 사용하는 방법이 보다 바람직하다.
또 다른 바람직한 구체예에서는, 단계 (b')에서 잠재 음이온을 포함하는 아민을 스캐빈져로서 사용한다. 스캐빈징 아민 내 잠재 음이온은 성장중인 펩티드에 부착된 임의의 영구 보호기의 존재 하에 선택적으로 제거할 수 있는 임시 보호기를 보유하는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 구체예에서 스캐빈징 아민 내 잠재 음이온의 보호기는 성장중인 펩티드의 N-말단에 존재하는 임시 보호기와 유사한 불안정성을 나타낸다. 이로 인해 음이온을 생성하는 스캐빈져의 탈보호와 성장중인 펩티드의 N-말단 탈보호가 단일 공정 단계에서 일어나게 된다. 성장중인 펩티드의 N-말단 및 경우에 따라 스캐빈져 내에 존재하는 임시 보호기는 수소분해에 의해 제거 가능한 기인 반면, 영구 보호기는 산분해에 의해 제거 가능한 보호기인 것이 특히 바람직하다. 상기 임시 보호기는 벤질형, 예컨대 (치환된) 벤질 및 벤질옥시카르보닐기인 것이 바람직하다. 바람직한 스캐빈져는 유리 음이온 또는 잠재 음이온을 포함하는 1차 아민, 특히 C-말단이 보호된 아미노산 유도체이다. 스캐빈징 아민은 카르복실레이트 외에도 비제한적인 예로서 설포네이트, 설페이트, 포스포네이트, 포스페이트 또는 페놀레이트 등의 다른 음이온성 작용기를 포함할 수 있다. 스캐빈져로서 사용하기에 매우 바람직한 아미노산은 β-알라닌 또는 이의 유도체(예, 에스테르 또는 실릴 에스테르 유도체)이다. 가장 바람직한 스캐빈져는 벤질 β-알라니네이트 또는 이의 염이다.
또한, 유리 음이온 또는 잠재 음이온을 포함하는 티올을 본 발명의 방법에 따른 유리 음이온 또는 잠재 음이온을 포함하는 아민 대신에 스캐빈져로서 사용할 수 있다.
스캐빈져는 스캐빈징할 필요가 있는 잔류 활성 성분에 대하여 2∼6배 몰 과량으로 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 스캐빈져의 사용은 탈보호 단계 후에 염기성 수성상으로 활성적으로 추출될 수 있는 친수성의 스캐빈징된 화합물을 유도한다. 탈보호시(적용 가능하다면), 스캐빈징된 종 내의 유리 아미노 작용기와 유리 카르복실 작용기양자의 존재로 인해 친수성이 강화된다. 따라서, 본 발명의 방법은 친수성의 스캐빈징된 화합물을 활성적으로 추출할 수 있는 가능성으로 인해 매우 효과적인 간헐적인 정제로 귀결된다. 또한, 활성화되지 않고 또 탈보호 과정 중에 임시 보호기가 제거된, 존재할 수 있는 과량의 카르복실 성분이 반응 생성물로부터 동시에 추출된다.
본 발명의 방법에 따르면 본 발명의 방법의 적어도 1 사이클, 가능하게는 1 이상의 사이클은 유리 음이온 또는 잠재 음이온이 잔류 활성화 카르복실 작용기의 스캐빈져로서 사용되는 단계 (b')를 포함한다. 그러나, 본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 이 방법은 단계 (b)에서 3-디메틸아미노-1-프로필아민과 같은 폴리아민이 스캐빈져로서 사용되는 1 이상의 사이클을 포함할 수도 있다.
본 발명의 바람직한 방법은, 단계 (b)에서는 탈보호가 일어나지 않고(따라서 스캐빈져가, 예컨대 Z 보호기와 스캐빈져로서 잠재 음이온을 포함하는 아민을 사용하는 퀀칭을 위해서만 사용되도록 환경이 선택됨), 후속 단계 (c)는 순차적인 염기성 추출, 산성 추출 및 염기성 추출(염화나트륨 또는 질산칼륨의 존재 하에 수행되는 것이 바람직함)을 포함하는 1 이상의 사이클을 포함한다. 이 방법은 탈보호 및 순차적인 염기성 및 중성 추출을 포함하는 후속 단계 (d)를 포함하며, 상기 추출들은 염화나트륨 또는 질산칼륨의 존재 하에 수행하는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 바람직한 방법은 단계 (b)에서 퀀칭과 탈보호를 둘 다 수행하고(예컨대 Bsmoc 보호기와, 스캐빈져로서 폴리아민을 이용함), 후속 단계 (c)는 순차적인 염기성 및 중성 추출(염화나트륨 또는 질산칼륨의 존재 하에 수행되는 것이 바람직함)을 포함하는 1 이상의 사이클을 포함한다.
마지막 사이클의 단계 (a)에서 카르복실 성분의 보호기는 아미노 성분의 영구 보호기와 유사한 불안정성을 나타내고 단계 (b)에서의 스캐빈져가 폴리아민인 방법 역시 바람직하다.
본 발명에 따른 방법은 펩티드 제조에 통상적으로 사용되는 몇 가지 유기 용매 중에서 수행할 수 있다. 에틸 아세테이트가 매우 바람직한 유기 용매이다. 에틸 아세테이트와 다른 유기 용매(예, 디클로로메탄, 1-메틸-2-피롤리디논, N,N-디메틸포름아미드 또는 테트라히드로푸란)의 혼합물도 바람직하다.
본 발명의 방법은 전통적인 용액상 펩티드 합성에서의 단계를 위해 당업계에 잘 알려진 온도에서 수행할 수 있다. 그러나, 이 방법은 0∼50℃의 온도 범위, 특히 상온에서 수행하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법은 분할-혼합법(split and mix method)을 이용한 펩티드 라이브러리의 조합 합성에 매우 적합하다. 커플링은 별도로 수행하고 개별 커플링 혼합물을 추출 및 탈보호를 위해 조합한다.
본 발명의 방법은 표준 프로토콜이 사용되기 때문에 자동화에 매우 적합하 다. 본 발명의 신규 방법은 고순도의 올리고펩티드 및 폴리펩티드의 제조에 편리하게 사용될 수 있는 매우 효율적인 방법이다.
본 발명에 따른 적절한 방법은 과량의 카르복실 성분을 아미노 성분에 커플링하는 것인데, 이때 카르복실 작용기는 커플링 시약과 필요에 따라 첨가제를 사용하여 계내에서(in situ) 예비활성화시키거나 또는 활성화시킨다. 커플링 단계에 이어, 반응 혼합물에 스캐빈져를 첨가하여 혼합한 후 통상적으로 수성 추출에 의해 잔류 활성화 카르복실 작용기를 스캐빈징한다. 스캐빈징 후에 또는 스캐빈징하는 동안 당업계에 공지된 적절한 방법을 이용하여 임시 보호기를 제거한 다음 스캐빈징된 화합물을 수성 추출에 의해 제거한다. 동시에, 활성화되지 않고 또 탈보호 과정 중에 임시 보호기가 제거된, 존재할 수 있는 과량의 카르복실 성분은 물론, 기타 수용성 반응물 및 부산물을 반응 혼합물로부터 추출한다. 그 후 목적하는 펩티드의 길이에 따라 커플링, 퀀칭, 탈보호 및 추출 단계의 추가 사이클을 수행할 수 있다.
본원에서 사용하는 용어 '아미노 성분'은 유리 아미노 작용기를 포함하는 분자를 의미한다. 구체적으로, 아미노 성분은 유리 아미노 작용기를 보유하고 기타 작용기는 목적하는 커플링 반응을 방해하지 않는 방식으로 보호된 임의의 아민, 아미노산 또는 올리고펩티드일 수 있다. 적용된 아미노산 또는 올리고펩티드의 C-말단 작용기는 치환 또는 비치환 아미드, 또는 에스테르로서 보호될 수 있는데; 상기 에스테르의 예로는 메틸, 에틸, t-부틸, 벤질, 펜아실, 3-(3-메틸)펜틸(Mpe), 2-(2-페닐)프로필(Pp), 2-클로로트리틸(Clt), 디페닐(4-피리딜)메틸(PyBzh), 디시클로프로필메틸(Dcpm), 9-플루오레닐메틸(Fm), 알릴(All), 2-(트리메틸실릴)에틸(Tmse), 4-{N-[1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥실리덴)-3-메틸부틸]-아미노}벤질(Dmab) 에스테르 및 효소에 의해 절단 가능한 에스테르[참고 문헌: Roeske, R.W. in: 'The Peptides', vol. 3(Gross, E. 및 Meienhofer, J., eds.) Academic Press, New York, pp. 101-136 (1981); Mpe에 대해서는 Karlstorm, A. 및 Unden, A., Tetrahedron Lett. 37, 4343-4246 (1996); Pp에 대해서는 Yue, C. 등, Tetrahedron Lett. 34, 323-326 (1993); Clt에 대해서는 Athanassopoulos, P. 등, Tetrahedron Lett. 36, 5645-5648 (1995); PyBzh에 대해서는 Mergler, M. 등, P154, 2차 국제 펩티드 심포지움 및 17차 미국 펩티드 심포지움 (2001); Dcpm에 대해서는 Carpino, L.A. 등, J. Org. Chem. 60, 7718-7719 (1995); Fm에 대해서는 Al-Obeidi, F. 등, Int. J. Peptide Protein Res. 35, 215-218 (1990); All에 대해서는 Kunz, H. 등, Int. J. Peptide Protein Res. 26, 493-497 (1985); Tmse에 대해서는 Sieber, P., Helv. Chim. Acta 60, 2711-2716 (1977); Dmab에 대해서는 Chan, W.C. 등, J. Chem. Soc., Chem. Commun., 2209-2210 (1995)]를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. t-부틸형의 작용기 또는 유사한 불안정성을 나타내는 작용기는 아미노 성분 내 기타 작용기의 영구 보호에 바람직한데; 이의 예로는 Asp, Glu, Ser, Thr 및 Tyr 측쇄의 보호를 위해서는 t-부틸(tBu); Lys 및 Trp 측쇄의 보호를 위해서는 t-부톡시카르보닐(Boc); Asn, Gln 및 His 측쇄의 보호를 위해서는 트리틸(Trt); 및 Arg 측쇄의 보호를 위해서는 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐(Pmc) 또는 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-설포닐(Pbf)[참고 문헌: Barany, G. 및 Merrifield, R.B. in: 'The Peptides', vol. 2 (Gross, E. 및 Meienhofer, J., eds.) Academic Press, New York, pp. 1-284 (1980); Trp(Boc)에 대해서는 Franzen, H. 등, J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1699-1700 (1984); Asn(Trt) 및 Gln(Trt)에 대해서는 Sieber, P. 및 Riniker, B., Tetrahedron Lett. 32, 739-742 (1991); His(Trt)에 대해서는 Sieber, P. 및 Riniker, B. Tetrahedron Lett. 28, 6031-6034 (1987); Pmc에 대해서는 Ramage, R. 및 Green, J., Tetrahedron Lett. 28, 2287-2290 (1987); Pbf에 대해서는 Carpino, L.A. 등, Tetrahedron Lett. 34, 7829-7832 (1993)]을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에서 사용하는 용어 '카르복실 성분'은 유리 카르복실 작용기를 포함하는 분자를 의미한다. 구체적으로, 카르복실 성분은 유리 카르복실 작용기를 보유하고 기타 작용기는 목적하는 커플링 반응을 방해하지 않는 방식으로 보호된 임의의 카르복실산, 아미노산 또는 올리고펩티드일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 적용된 아미노산 또는 올리고펩티드의 아미노기는 벤질옥시카르보닐(Z) 작용기에 의해 임시 보호되며; 다른 예로는 Boc, Trt, 플루오렌-9-일메톡시카르보닐(Fmoc), 2-(메틸설포닐)에톡시카르보닐(Msc), 알릴옥시카르보닐(Alloc) 작용기, 아릴설포닐 형 작용기, 예를 들어 오르토-니트로벤젠설포닐(o-NBS) 및 효소에 의해 절단 가능한 작용기[참고 문헌: Geiger, R. 및 Konig, W. in: 'The Peptides', vol. 3(Gross, E. 및 Meienhofer, J., eds.) Academic Press, New York, pp. 1-99 (1981); Alloc에 대해서는 Kunz, H. 및 Unverzagt, C., Angew. Chem. 96, 426-427 (1984); 아릴설포닐에 대해서는 Fukuyama, T. 등, Tetrahedron Lett. 38, 5831-5834 (1997)]를 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. t-부틸형의 작용기 또는 유사한 불안정성을 나타내는 작용기는 아미노 성분을 대해 상기한 바와 같은 카르복실 성분 내 기타 작용기의 영구 보호를 위해 바람직하다. 상기 카르복실 성분은 활성 에스테르로서, 바람직하게는 N-히드록시숙신이미드, 벤조트리아졸-1-일, 펜타플루오로페닐 또는 4-니트로페닐 에스테르, 할라이드, N-카르복시안하이드라이드 또는 대칭 안하이드라이드로서 예비활성화될 수 있다. 또는, 상기 카르복실 성분은 가능하다면 커플링 첨가제, 바람직하게는 N-히드록시숙신이미드(HONSu), 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt), 3-히드록시-4-옥소-3,4-디히드로-1,2,3-벤조트리아진(HOOBt), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt) 또는 6-클로로-1-히드록시벤조트리아졸(Cl-HOBt) 및 필요에 따라 3차 아민의 존재 하에서, 계내에서, 혼합 안하이드라이드로서 또는 커플링 시약, 예를 들어 카르보디이미드, 바람직하게는 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC) 또는 1-(3'-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드(EDC), 우로늄 또는 포스포늄 염을 이용하여 활성화할 수 있다[참고 문헌: 'The Peptides', vol. 1(Gross, E. 및 Meienhofer, J., eds.) Academic Press, New York (1979); Li, P. 및 Xu, J.-C., Chin. J. Chem. 18, 456-466 (2000)].
임시 보호기는 당업계에 공지된 방법으로 제거할 수 있다(상기 참조). Z 작용기는, 예를 들어 수소 기체 또는 포르미에이트를 수소 공여체로 사용하는 (표준) 기법을 이용하여 수소분해시킴으로써 제거할 수 있다. 이 과정 중, 모든 벤질형 보호기는 제거되며, t-부틸형 보호기 또는 유사한 불안정성을 나타내는 작용기는 유지된다. 후자는 당업계에 공지된 방법에 따라 산분해시킴으로써 제거할 수 있다.
당업자는 본원에서 사용하는 용어 '염기성 수성 추출'의 의미를 이해할 수 있을 것이다. 그러나, 염기성 수성 추출은 탄산수소나트륨 또는 탄산나트륨의 수용액을 이용하여 수행하는 것이 바람직하며, 필요에 따라 염화나트륨 또는 질산칼륨의 존재 하에서 수행할 수도 있다. 본원에서 사용하는 용어 '활성 수성 추출'은 아미노 성분이 산성 조건 하에서 양성자화된 형태(암모늄)로 추출되거나, 카르복실 성분이 염기성 조건 하에서 탈양성자화된 형태(카르복실레이트)로 추출되는 것을 의미한다.
이하, 본 발명은 후술하는 실시예를 통해 추가로 설명한다. 이 실시예가 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1
Boc-Gly-Phe-Asp(O t Bu)-Ser( t Bu)-O t Bu
제1 사이클: 20℃에서 에틸 아세테이트와 디클로로메탄의 혼합물 중 H-Ser(tBu)-OtBu 4.34 g의 교반 용액에 1-히드록시벤조트리아졸 3.24 g, Z-Asp-(OtBu)-OH 7.76 g, 1-(3'-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 4.20 g 및 4-메틸모르폴린 2.42 ㎖를 첨가하였다. 생성된 용액을 반응이 완결될 때까지 교반한 후, 4-메틸모르폴린 1.21 ㎖ 및 벤질 β-알라니네이트 p-톨루엔설포네이트 염 3.51 g을 첨가하였다. 혼합물은 30 분 더 교반하고, 5% Na2CO3/10% NaCl, 5% KHSO4/10% NaCl 및 5% Na2CO3/10% NaCl로 추출하였다.
보호된 디펩티드 Z-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu를 함유하는 유기층은 챠콜 담지 팔라듐 존재 하에서 접촉 수소분해 반응시켰다. 반응이 완결된 후, 5% Na2CO3/10% NaCl을 첨가하고, 생성된 현탁액은 여과하였다. 잔류물은 에틸 아세테이트와 디클로로메탄의 혼합물로 세정하고, 합한 유기 여과물은 5% Na2CO3/10% NaCl 및 30% NaCl로 추출하였다.
제2 사이클: 20℃에서 디펩티드 H-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu를 함유하는 유기층에 1-히드록시벤조트리아졸 3.24 g, Z-Phe-OH 7.18 g, 1-(3'-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 4.20 g 및 4-메틸모르폴린 2.42 ㎖를 첨가하였다. 생성된 용액을 반응이 완결될 때까지 교반한 후, 4-메틸모르폴린 1.21 ㎖ 및 벤질 β-알라니네이트 p-톨루엔설포네이트 염 3.51 g을 첨가하였다. 혼합물은 30 분 더 교반하고, 5% Na2CO3/10% NaCl, 5% KHSO4/10% NaCl 및 5% Na2CO3/10% NaCl로 추출하였다.
보호된 트리펩티드 Z-Phe-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu를 함유하는 유기층은 챠콜 담지 팔라듐 존재 하에서 접촉 수소분해 반응시켰다. 반응이 완결된 후, 5% Na2CO3/10% NaCl을 첨가하고, 생성된 현탁액은 여과하였다. 잔류물은 에틸 아세테이트와 디클로로메탄의 혼합물로 세정하고, 합한 유기 여과물은 5% Na2CO3/10% NaCl 및 30% NaCl로 추출하였다.
제3 사이클: 20℃에서 트리펩티드 H-Phe-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu를 함유하는 유기층에 1-히드록시벤조트리아졸 3.24 g, Boc-Gly-OH 4.21 g, 1-(3'-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 4.20 g 및 4-메틸모르폴린 2.42 ㎖를 첨가하였다. 생성된 용액을 반응이 완결될 때까지 교반한 후, 3-디메틸아미노-1-프로필아민 1.25 ㎖를 첨가하였다. 혼합물은 30 분 더 교반하고, 5% Na2CO3/10% NaCl, 5% KHSO4/10% NaCl, 5% Na2CO3/10% NaCl, 30% NaCl 및 물로 추출하였다. 유기층을 증발 건조시키고 잔류물을 메틸 t-부틸 에테르로 분쇄하고 건조시켜서 출발 물질 H-Ser(tBu)-OtBu를 기준으로 95% 수율로 목적하는 보호된 테트라펩티드를 얻었다. 이 방법은 6 시간 내에 완결되었다.
역상 HPLC(220 nm, 2.0 ㎖/분, 5 마이크론 C18 컬럼에서 29 분 내에 0.1% 트리플루오로아세트산 중 24∼68% 아세토니트릴)로 측정한 순도는 98.1%였다. 실체: m/z 425.4 [M-Boc-3tBu+H]+, 469.4 [M-4tBu+H]+, 525.4 [M-3tBu+H]+, 581.4 [M-2tBu+H]+, 637.4 [M-tBu+H]+, 693.4 [M+H]+ (전기 분무 MS); 1H NMR (CDCl3) δ1.16 (s, 9H), 1.44 (m, 27H), 2.59 (dd, 1H), 2.79 (dd, 1H), 3.09 (m, 2H), 3.51 (dd, 1H), 3.69-3.86 (m, 3H), 4.47 (m, 1H), 4.67-4.78 (m, 2H), 5.20 (bs, 1H), 6.68 (d, 1H), 7.12-7.34 (m, 7H).
실시예 2
H-His-Trp-Ser( t Bu)-Tyr( t Bu)-D-Leu-Leu-Orn(Boc)-Pro-O t Bu
제1 사이클: 20℃에서 에틸 아세테이트 중 H-Pro-OtBu.HCl 1300 g의 교반 용액에 1-히드록시벤조트리아졸 1014 g, Z-Orn(Boc)-OH 2756 g, 1-(3'-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 1378 g 및 4-메틸모르폴린 1495 ㎖를 첨가하였다. 생성된 용액은 반응이 완결될 때까지 교반한 후, 4-메틸모르폴린 377 ㎖ 및 벤질 β-알라니네이트 p-톨루엔설포네이트 염 1105 g을 첨가하였다. 혼합물은 30 분 더 교반하고, 5% Na2CO3/10% NaCl, 5% KHSO4/10% NaCl 및 5% Na2CO3/10% NaCl로 추출하였다.
보호된 디펩티드 Z-Orn(Boc)-Pro-OtBu를 함유하는 유기층은 챠콜 담지 팔라듐 존재 하에서 접촉 수소분해 반응시켰다. 반응이 완결된 후, 5% Na2CO3/15% NaCl을 첨가하고, 생성된 현탁액은 여과하였다. 잔류물은 에틸 아세테이트로 세정하고, 합한 유기 여과물은 5% Na2CO3/15% NaCl 및 30% NaCl로 추출하였다. 분리된 수성층을 에틸 아세테이트로 재추출하였다.
제2 사이클: 20℃에서 디펩티드 H-Orn(Boc)-Pro-OtBu를 함유하는 합한 유기층에 1-히드록시벤조트리아졸 1014 g, Z-Leu-OH 1993 g, 1-(3'-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 1320 g 및 4-메틸모르폴린 754 ㎖를 첨가하였다. 생성된 용액은 반응이 완결될 때까지 교반한 후, 4-메틸모르폴린 377 ㎖ 및 벤질 β-알라니네이트 p-톨루엔설포네이트 염 1105 g을 첨가하였다. 혼합물은 30 분 더 교반하고, 5% Na2CO3/10% NaCl, 5% KHSO4/10% NaCl 및 5% Na2CO3/10% NaCl로 추출하였다.
보호된 트리펩티드 Z-Leu-Orn(Boc)-Pro-OtBu를 함유하는 유기층은 챠콜 담지 팔라듐 존재 하에서 접촉 수소분해 반응시켰다. 반응이 완결된 후, 5% Na2CO3/15% NaCl을 첨가하고, 생성된 현탁액은 여과하였다. 잔류물은 에틸 아세테이트로 세정하고, 합한 유기 여과물은 5% Na2CO3/10% NaCl 및 30% NaCl로 추출하였다.
제3 사이클: 20℃에서 트리펩티드 H-Leu-Orn(Boc)-Pro-OtBu를 함유하는 유기층에 1-히드록시벤조트리아졸 1014 g, Z-D-Leu-OH 1993 g, 1-(3'-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 1320 g 및 4-메틸모르폴린 754 ㎖를 첨가하였다. 생성된 용액은 반응이 완결될 때까지 교반한 후, 4-메틸모르폴린 377 ㎖ 및 벤질 β-알라니네이트 p-톨루엔설포네이트 염 1105 g을 첨가하였다. 혼합물은 30 분 더 교반하고, 5% Na2CO3, 5% KHSO4 및 5% Na2CO3로 추출하였다.
보호된 트리펩티드 Z-D-Leu-Leu-Orn(Boc)-Pro-OtBu를 함유하는 유기층은 챠콜 담지 팔라듐 존재 하에서 접촉 수소분해 반응시켰다. 반응이 완결된 후, 5% Na2CO3를 첨가하고, 생성된 현탁액은 여과하였다. 잔류물은 에틸 아세테이트로 세정하고, 합한 유기 여과물은 5% Na2CO3 및 10% NaCl로 추출하였다.
제4 사이클 내지 제7 사이클: 이들 사이클은 Z-D-Leu-OH 1993 g을, 각각 Z-Tyr(tBu)-OH(해당 디시클로헥실암모늄 염 4497 g으로부터 유리), Z-Ser(tBu)-OH 2218 g, Z-Trp-OH 2538 g 및 Z-His-OH 2172 g으로 대체하여 제3 사이클의 절차에 따라 수행하였다. 그러나, 제5 사이클부터는 스캐빈징 단계 중에 4-메틸모르폴린 및 벤질 β-알라니네이트 p-톨루엔설포네이트 염의 양을 두배로 하였다. 제5 사이클에서는 스캐빈징 후의 추출을 35℃에서 수행하였다. 제7 사이클에서는 커플링을 3℃에서 수행하고 1-히드록시벤조트리아졸 1014 g을 6-클로로-1-히드록시벤조트리아졸 2561 g으로 대체하고, 1 시간 커플링 후 1-(3'-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 추가분 132 g을 첨가하였다. 제7 사이클에서도 수소분해 후 추출은 35℃에서 수행하였다. 제7 사이클 후반부에는 유기층을 증발 건조시켜서 출발 물질 H-Pro-OtBu.HCl을 기준으로 73% 수율(즉, 화학 단계당 평균 98%)로 목적하는 보호된 노나펩티드를 얻었다.
역상 HPLC(220 nm, 2.0 ㎖/분, 5 마이크론 C18 컬럼에서 29 분 내에 0.1% 트리플루오로아세트산 중 24∼68% 아세토니트릴)로 측정한 순도는 90.6%였다. 실체: m/z 543.6 [M-Boc-2tBu+2H]2+, 571.6 [M-Boc-tBu+2H]2+, 599.6 [M-Boc+2H]2+, 649.8 [M+2H]2+, 1298.0 [M+H]+ (전기 분무 MS).
중간물질의 간헐적 분리없이 보호된 펩티드가 제조되었다. 제1 실시예로부터 얻은 생성물의 순도 및 실체로부터, 본 발명의 방법을 이용하여 과량의 (활성화된) 카르복실 성분이 공정의 모든 단계에서 완벽하게 제거되었고, 삽입 서열이 형성되지 않았음이 입증된다. 또한, 제2 실시예로부터의 합성은 본 발명의 방법에 따른 합성이 대형화가 용이하다는 것을 입증한다. 상기 두 실시예로부터 얻은 생성물은 비교적 단시간 내에 고수율과 고순도로 얻어진다.

Claims (27)

  1. (a) 과량의 활성화된 카르복실 성분을 사용하여 아미노 성분을 아실화하기 위한 커플링 단계,
    (b) 스캐빈져를 사용하여 잔류 활성화 카르복실 작용기를 제거하며, 상기 스캐빈져는 성장중인 펩티드의 탈보호에도 사용될 수 있는 것인 퀀칭 단계,
    (c) 1 이상의 수성 추출 단계, 및 경우에 따라
    (d) 별도의 탈보호 단계와, 이어지는 1 이상의 수성 추출 단계
    의 반복 사이클을 포함하는, 유기 용매 또는 유기 용매 혼합물 중에서의 펩티드의 급속 용액 합성 방법으로서, 유리 음이온 또는 잠재 음이온을 포함하는 아민이 잔류 활성화 카르복실 작용기의 스캐빈져로서 사용되는, 단계 (b')로 지칭되는 1 이상의 단계 (b)를 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드의 급속 용액 합성 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (a)에서, 사용되는 반응물의 몰량이 카르복실 성분, 커플링 첨가제 > 커플링 시약 > 아미노 성분의 순으로 감소되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 단계 (a)에서, 예비활성화된 카르복실 성분을 사용하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 (b')에서, 잠재 음이온을 포함하는 아민을 스캐빈져로서 사용하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 스캐빈징 아민 내의 잠재 음이온은 성장중인 펩티드에 부착된 임의의 영구 보호기의 존재 하에 선택적으로 제거할 수 있는 임시 보호기를 보유하는 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 스캐빈징 아민 내의 잠재 음이온은 성장중인 펩티드의 N-말단에 존재하는 임시 보호기와 유사한 불안정성을 나타내는 임시 보호기를 보유하는 것인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 임시 보호기는 수소분해에 의해 제거할 수 있는 기이고, 영구 보호기는 산분해에 의해 제거할 수 있는 기인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 임시 보호기가 벤질형 기인 방법.
  9. 제4항에 있어서, 스캐빈져가 유리 음이온 또는 잠재 음이온을 포함하는 1차 아민인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 1차 아민이 C-말단이 보호된 아미노산 유도체인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 아미노산이 β-알라닌 또는 이의 유도체인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 스캐빈져가 벤질 β-알라니네이트 또는 이의 염인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 유리 음이온 또는 잠재 음이온을 포함하는 아민 대신에, 유리 음이온 또는 잠재 음이온을 포함하는 티올을 스캐빈져로서 사용하는 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 단계 (b)에서 폴리아민을 스캐빈져로서 사용하는 1 이상의 사이클을 포함하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 단계 (b)에서 탈보호가 일어나지 않고 후속 단계 (c)가 순차적인 염기성 추출, 산성 추출 및 염기성 추출을 포함하는 1 이상의 사이클을 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 추출은 염화나트륨 또는 질산칼륨의 존재 하에 수행하는 것인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 탈보호와, 순차적인 염기성 추출 및 중성 추출을 포함하는 후속 단계 (d)를 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 추출은 염화나트륨 또는 질산칼륨의 존재 하에 수행하는 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 단계 (b)에서 퀀칭과 탈보호가 둘 다 일어나며, 후속 단계 (c)가 순차적인 염기성 추출과 중성 추출을 포함하는 1 이상의 사이클을 포함하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 추출은 염화나트륨 또는 질산칼륨의 존재 하에 수행하는 것인 방법.
  21. 제1항에 있어서, 마지막 사이클의 단계 (a)에서 카르복실 성분의 보호기는 성장중인 펩티드의 영구 보호기와 유사한 불안정성을 나타내고, 단계 (b)에서 스캐빈져는 폴리아민인 방법.
  22. 제1항에 있어서, 유기 용매 또는 유기 용매 혼합물은 에틸 아세테이트 또는, 에틸 아세테이트와 디클로로메탄의 혼합물, 에틸 아세테이트와 1-메틸-2-피롤리디논의 혼합물, 에틸 아세테이트와 N,N-디메틸포름아미드의 혼합물 또는 에틸 아세테이트와 테트라히드로푸란의 혼합물인 방법.
  23. 제1항에 있어서, 0∼50℃의 온도 범위에서 수행하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상온에서 수행하는 방법.
  25. 분할-혼합법(split and mix method)을 이용하는 펩티드 라이브러리의 조합 합성 방법으로서, 제1항의 방법이 적용된 방법.
  26. 펩티드의 자동화된 용액 합성 방법으로서, 제1항의 방법이 적용된 방법.
  27. 삭제
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