MXPA02006998A - Proceso para sintesis de solucion rapida de peptidos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un proceso para la sintesis en solucion acuosa rapida de un peptido, el proceso comprende los ciclos repetitivos de las etapas (a)-(d): (a) una etapa de acoplamiento, por el uso de un exceso de un componente carboxilico activado para acilar un componente amino, (b) una etapa de apagado en la cual se usa un agente de depuracion para remover las funciones carboxilicas activadas residuales, en donde el agente de depuracion tambien puede usarse para la desproteccion del peptido en crecimiento, (c) una o mas extracciones acuosas y opcionalmente, (d) una etapa de desproteccion separada, seguida por una o mas extracciones acuosas, caracterizado porque el proceso comprende al menos una etapa (b), referida como etapa (b??), en la cual una amina que comprende un anion libre o un anion latente se usa como un agente de depuracion de las funciones carboxilicas activadas residuales. Durante el proceso de esta invencion, el peptido en crecimiento no necesita aislarse hasta que se obtiene la secuencia de peptido final. Este proceso altamente eficiente es util para la produccion de oligo y polipeptidos de alta pureza.

Description

PROCESO PARA SÍNTESIS DE SOLUCIÓN RÁPIDA DE PÉPTIDOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención de refiere a un proceso nuevo y versátil para la síntesis de solución rápida de péptidos, en donde el crecimiento del péptido no necesita aislarse antes de que se contemple el ensamble de la secuencia deseada.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los péptidos se sintetizan ya sea en un soporte sólido o en solución. En ambos enfoques, las etapas de acoplamiento y desprotección se alternan repetitivamente y pueden separarse por purificaciones intermitentes. En el enfoque de fase sólida, una secuencia se ensambla completamente mientras se enlaza a un soporte sólido antes de que se desdoble eventualmente del soporte. La remoción de los reactivos en exceso y subproductos, toma lugar por filtración. La síntesis de fase sólida claramente tiene ventajas: es más o menos aplicable de manera general y fácil de automatizar. Sin embargo, también tiene algunas desventajas serias. Por ejemplo, las reacciones son controladas por la difusión y usualmente son lo bastante lentas bajo las condiciones heterogéneas aplicadas: con objeto de evitar las secuencias de eliminación, son necesarios excesos relativamente grandes de reactivos. Además, todas las cadenas laterales de reactivos del péptido en crecimiento deberán protegerse: ya que no tienen lugar las purificaciones intermitentes, las reacciones laterales debido a la presencia de cadenas laterales protegidas pueden llevar a impurezas en el producto final. El enfoque de fase sólida se dificulta para escalar y es costoso en términos de reactivos y materiales.

El enfoque de fase de solución clásica, por otro lado, es más fácil de escalar y es menos caro en términos de reactivos y materiales. Los aminoácidos completamente protegidos usualmente no se necesitan, ya que los subproductos que resultan de las reacciones laterales de cadenas laterales desprotegidas, puede removerse por purificación intermitente. Sin embargo, el enfoque de fase de solución requiere protocolos específicos de secuencia, y la producción de una secuencia completa consume mucho tiempo. Debido a las desventajas de estos enfoques, es necesario un proceso que combine las ventajas de ambos de estos métodos clásicos, en particular para síntesis de péptídos a gran escala. Un nuevo proceso debería ser rápido, fácil de escalar y generalmente aplicable. En la síntesis de fase de solución, se usa preferiblemente un ligero exceso de un componente carboxílico activado, que se usa preferiblemente en cada etapa de acoplamiento para asegurar el acoplamiento cuantitativo a un componente amino; de esta manera la aparición de secuencias de retiro del producto final puede evitarse. Usualmente se asume que el componente carboxílico activado restante se destruye y se remueve durante la preparación acuosa intermitente. La inserción de secuencias de péptido, sin embargo, frecuentemente se encuentra como impureza del péptido final, debido a la remoción incompleta del componente carboxílico residual (activado) después de una etapa de acoplamiento, que posteriormente se acopla después de la desprotección. Con objeto de evitar que ocurran estas reacciones laterales, puede introducirse una etapa de depuración directamente después de la etapa de acoplamiento para depurar (inactivar) las funciones carboxílicas del residuo activado. Se aplican usualmente aminas como agentes de depuración. El uso de poliaminas como agentes de depuración lleva a compuestos depurados que pueden extraerse activamente en una fase acuosa, preferiblemente ácida, dependiendo de su polaridad (por ejemplo, Kisfaludy, L. et al. (1974) Tetrahedron Lett, 19, 1785-1786]. Esta extracción se realiza usualmente antes de la etapa de desprotección para evitar la pérdida del péptido en crecimiento en la fase acuosa. Sin embargo, este procedimiento en numerosos casos se ha encontrado que resulta en una purificación intermitente incompleta, debido a la capacidad hidrofóbica del compuesto agente de depuración: la capacidad hidrofóbica intrínseca de la parte de amino acilo del componente carboxílico se aumenta por el grupo protector amino todavía presente. De esta manera una extracción acuosa no es completamente efectiva. Recientemente, Carpino, L.A. et al. [(1999) J. Org. Chem. 64, 4324-4338] reporta una mejora del método de depuración. Además del uso de una poliamina como un agente de depuración, el grupo protector amino 1 ,1-dioxobenzo[b]tiofen-2-ilmetoxicarbonilo (Bsmoc) se aplica en el proceso. La función del Bsmoc tiene una muy alta inestabilidad hacia la base. Como resultado de la misma, las funciones carboxílicas activadas restantes se depuran y las funciones Bsmoc se remueven en una de las mismas etapas usando una poliamina. El uso de la función Bsmoc se ha descrito como una mejora significante para la producción de (oligo)péptidos usando técnicas de fase en solución continua rápida, permitiendo el ensamble de un péptido en series sencillas de etapas dentro de un periodo de tiempo relativamente corto.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se ha encontrado ahora un nuevo proceso para la síntesis en solución continua rápida de péptidos, en donde se usa un agente de depuración que permite una elección arbitraria esencial del grupo protector amino (el grupo protector en la terminación N del componente carboxílico activado). En contraste al proceso de Carpino, la desprotección de la función de terminal N no necesariamente toma lugar bajo las mismas condiciones de reacción como el depurado del exceso de las funciones carboxiiicas activadas. Por lo tanto, el proceso de esta invención es mucho más aplicable generalmente que el proceso de Carpino. El nuevo proceso de conformidad con esta invención es un proceso para una síntesis en solución rápida de un péptido de un solvente orgánico o una mezcla de solventes orgánicos, que comprende ciclos repetitivos de las etapas (a)-(d): (a) una etapa de acoplamiento, que usa un exceso de un componente carboxílico activado para acilar un componente amino, (b) una etapa de apagado en la cual se usa un agente de depuración para remover las funciones carboxiiicas activadas residuales, en donde el agente de depuración también puede usarse para la desprotección del péptido en crecimiento (esto es, el péptido que se está formando), (c) una o más extracciones acuosas y opcionalmente , (d) una etapa de desprotección separada, posiblemente por una o más extracciones acuosas, caracterizada porque el proceso comprende al menos una etapa (b), referida como etapa (b'), en la cual una amina que comprende un anión libre o un anión latente, se usa como un agente de depuración de las funciones carboxílicas activadas residuales. Durante el proceso de esta invención, el péptido en crecimiento no necesita aislarse hasta que se ha obtenido la secuencia de péptido final (esto es, el producto final del proceso de esta invención). Por lo tanto el proceso consume significativamente menos tiempo que el proceso de fase de solución clásica y facilita su escalamiento. El proceso de esta invención permite una remoción altamente efectiva del componente carboxílico activado residual sin encontrarse los problemas de capacidad hidrofóbica de los otros procesos del arte previo, en los cuales se usan poliaminas como agentes de depuración. Se obtienen así, péptidos de alta pureza. Preferiblemente, en la etapa (a) del proceso de esta invención, las cantidades molares de los reactivos usados están en orden descendente: componente carboxílico, aditivo de acoplamiento > reactivo de acoplamiento > componente amino. Además, se prefiere un proceso en donde en la etapa (a) se usa un componente carboxílico previamente activado. En otra modalidad preferida, en la etapa (b1) se usa una amina que comprende un anión latente como el agente de depuración. Preferiblemente, el anión latente es una amina depuradora que porta un grupo protector temporal que puede removerse selectivamente en presencia de cualquier grupo protector permanente enlazado al péptido de crecimiento. En una modalidad particularmente preferida, el grupo protector del anión latente en la amina de depuración, exhibe una inestabilidad similar a la del grupo protector temporal presente en la terminación N del péptido en crecimiento. Esto permite la desprotección del agente de depuración produciendo el anión, y la desprotección de la terminal N del péptido en crecimiento para que tenga lugar en una etapa de proceso sencilla. El proceso de la invención es especialmente preferido en donde los grupos protectores temporales, presentes en la terminación N del péptido en crecimiento, y opcionalmente presentes en el depurador, son grupos hidrogenólicamente removibles, puesto que los grupos protectores permanentes son grupos protectores acidolíticamente removibles. Preferiblemente, los grupos protectores temporales son del tipo bencilo, por ejemplo, bencilo (sustituido) y grupos benciloxicarbonilo. Un agente de depuración preferido es una amina primaria que comprende un anión libre o un anión latente, y en particular un derivado de aminoácidos protegido en la terminal C. Además del carboxilato, la amina de depuración puede comprender otras funciones aniónicas tales como, pero no limitándose a, sulfonato, sulfato, fosfonato, fosfato, o fenolato. Un aminoácido altamente preferido para usarse como un agente de depuración es la ß-alanina o un derivado del mismo (por ejemplo, un éster o un derivado de éster de sililo). ??? agente de depuración más preferido es el bencil ß-alaninato o una sal del mismo. Un tiol que comprende un anión libre o latente, también puede usarse como un agente de depuración en lugar de una amina que comprende un anión libre o latente, de conformidad con el proceso de esta invención. El agente de depuración se usa preferiblemente en un exceso molar de 2 a 6 veces con respecto al componente activo residual que necesita depurarse. El uso de un agente de depuración de conformidad con la presente invención, lleva a compuestos depuradores hidrofílicos que pueden extraerse activamente en una fase acuosa básica después de la etapa de desprotección: durante la desprotección (si es aplicable), la capacidad hidrofílica, se aumenta por la presencia tanto de la función amino libre como de la función carboxílica libre en las especies depuradas. De esta manera, el proceso de esta invención resulta en una purificación intermitente muy efectiva debido a la posibilidad de extraer activamente un compuesto agente de depuración hidrofílico. Además, un exceso posiblemente presente del componente carboxílico que no se activa y cuyo grupo protector temporal también se remueve durante la desprotección, se extrae de la mezcla de reacción al mismo tiempo. De conformidad con el proceso de esta invención, al menos un ciclo, pero posiblemente más ciclos del proceso comprenden una etapa (b') en donde un anión libre o un anión latente se usa como un agente de depuración de las funciones carboxílicas activadas residuales. Sin embargo, de conformidad con una modalidad adicional de esta invención, el proceso puede comprender también uno o más ciclos en donde en la etapa (b), se usa como el agente de depuración una poliamina, tal como la 3-dimetilamino-1-propilamina,. Otro proceso preferido de esta invención comprende uno o más ciclos en donde en la etapa (b) la desprotección no ocurre (de esta manera las circunstancias se eligen de tal manera que el agente de depuración solamente se usa para apagar, por ejemplo, por el uso del grupo protector Z y una amina que comprende un anión latente como depurador) y la etapa (c) posterior comprende extracciones básicas secuenciales, acidas y básicas, que se realizan preferiblemente en presencia de cloruro de sodio o nitrato de potasio.

Este proceso comprende una etapa posterior que comprende la desprotección y extracciones neutrales y básicas secuenciales; estas extracciones se realizan preferiblemente en presencia de cloruro de sodio o nitrato de potasio.

Otro proceso preferido de esta invención comprende uno o más ciclos en donde en la etapa (b) ocurren tanto el apagado como la desprotección (por ejemplo, por el uso del grupo protector Bsmoc y una poliamina como un depurador) y la etapa posterior (c) comprende extracciones básicas y neutrales secuenciales, que se realizan preferiblemente en presencia de cloruro de sodio o nitrato de potasio. También se prefiere un proceso en donde en el último ciclo en la etapa (a) los grupos protectores del componente carboxílico exhiben una inestabilidad similar a la de los grupos protectores permanentes del componente amino, y en la etapa (b) el agente de depuración es poliamina. El proceso de conformidad con esta invención, puede realizarse en varios solventes orgánicos que se usan comúnmente para la producción de péptidos. Un solvente orgánico altamente preferido es el acetato de etilo. También se prefieren mezclas de acetato de etilo y otros solvente orgánicos, tales como diclorometano, 1-metil-2-pirrolidinona, ?,?-dimetilformamida o tetrahidrofurano. El proceso de esta invención puede realizarse a temperaturas bien conocidas en el arte para tales etapas en la síntesis de péptidos de fase de solución clásica. Sin embargo, el proceso se realiza preferiblemente dentro de un rango de temperatura de 0 hasta 50°C, y en particular a temperatura ambiente.

El proceso de esta invención es muy apropiado para la síntesis en combinación de colecciones de péptidos que usan el método de división y mezclas. Los acoplamientos se realizan de manera separada aunque las mezclas de acoplamiento individuales se combinan para extracciones y desprotecciones. El proceso de esta invención es muy apropiado para la automatización, ya que se usan protocolos estándar. El nuevo proceso de esta invención es un proceso altamente eficiente, que puede usarse convenientemente en la producción de oligo y polipéptidos de alta pureza. Un proceso apropiado de conformidad con la presente invención es el acoplamiento de un exceso de un componente carboxílico a un componente amino, en donde la función carboxílica se activa previamente o se activa ¡n situ, con el uso de un reactivo de acoplamiento y si se desea, un aditivo. Después de la etapa de acoplamiento, las funciones carboxílicas activadas restantes se depuran al agregar el agente de depuración a la mezcla de reacción y mezclar, usualmente seguido por extracción acuosa. Posteriormente o durante la depuración, se remueven los grupos protectores temporales por el uso de métodos apropiados conocidos en el arte, usualmente seguido de la remoción del componente del compuesto agente de depuración por extracción acuosa. Al mismo tiempo, se extraen de la mezcla de reacción, un exceso posiblemente presente del componente carboxílico que no se activa y cuyo grupo protector temporal también se remueve durante la desprotección, así como otros reactivos solubles en agua y subproductos. A continuación, puede continuar otro ciclo de etapas de acoplamiento, apagado, desprotección y extracción, dependiendo de la longitud del péptido deseado.

El término componente amino, se refiere a un molécula que comprende una función amino libre. En particular, el componente amino puede ser cualquier amina, aminoácidos u oligopéptidos que soportan una función amino y cuyos otros grupos funcionales se protegen de tal manera que no interfieren con la reacción de acoplamiento deseada. La función de la terminal C del aminoácido o aminopéptido apropiado puede protegerse como una amida sustituida o no sustituida o como un éster; los ejemplos del último incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, t-butilo, bencilo, fenacilo, 3-(3-metil)pentil (Mpe), 2-(2-fenil)propil (Pp), 2-clorotritil (Clt), difenil(4-piridil)metil (PyBzh), diciclopropilmetil (Dcpm), 9-fluorenilmetilo (Fm), difenil(4-piridil)metil (PyBzh), diciclopropilmetil (Dcpm), 9-fluorenilmetil (Fm), alil (All), 2-(trimetilsilil)etil (Tmse), 4-{N-[1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexilideno)-3-metilbutil]-amino}bencil (Dmab), y ésteres de desdoblamiento enzimático [Roeske, R.W. (1981) en: "The Peptides', vol. 3 (Gross, E. y Meienhofer, J., eds) Academic Press, New York, pp. 101-136; por Mpe: Karlstrom, A, y Undén, A. (1996) Tetrahedron Lett. 37, 4343-4246; para Pp: Yue, C. et al. (1993) Tetrahedron Lett. 34, 323-326; para Clt: Athanassopoulos, P. et al. (1995) Tetrahedron Lett. 36, 5645-5648; por PyBzh: Mergler, M et al. (2001 ) P154, 2nd International Peptide Symposium & 17th American Peptide Symposium; para Dcpm: Carpino, L.A. et-al. (1995) J. Org. Chem. 60, 7718-7719; para Fm: A1-Obeidi, F. et al. (1990) Int. J. Peptide Protein Res. 35, 215-218; para All: Kunz, H. et al. (1985) Int. J. Peptide Protein Res. 26, 493-497; para Tmse: Sieber, P. (1977) Helv. Chim. Acta 60,27 1-2716; para Dmab: Chan, W.C. et al. (1995) J. Chem. Soc. Chem. Commun., 2209-2210]. Las funciones del tipo t-butilo o funciones de inestabilidad similar se prefieren para la protección permanente de los otros grupos funcionales en el componente amino; esto incluye, pero no se limita a, t.butilo (lBu) para la protección de las cadenas laterales Asp, Glu, Ser, Thr, y Tyr, t-butoxicarbonilo (Boc) para la protección de las cadenas laterales Lys y Trp, tritilo (Trt) para la protección de las cadenas laterales 2,2,5,7,8-pentametilcromano-6-sulfonilo (Pmc) o 2,2,4,6,7-pentametíldihidrobenzofurano-5-sulfonil (Pbf) para la protección de la cadena lateral Arg [Barany, G. y Merrifield, R.B. (1980) en: "The Peptides", vol. 2 (Gross, E. y Meienhofer, J., eds.) Academic Press, New York, pp. 1-284; para Trp(Boc): Franzén, H. et al. (1984) J. Chem. Soc, Chem. Commun., 1699-1700; para Asn(Trt) y Gln(Trt): Sieber, P. y Riniker, B. (1991 ) Tetrahedron Lett. 32, 739-742; para His(Trt): Sieber, P. y Riniker, B. (1987) Tetrahedron Lett. 28, 6031-6034; para Pmc: Ramage, R. y Green, J. (1987) Tetrahedron Lett. 28, 2287-2290; para Pbf: Carpino. L.A. et al. (1993) Tetrahedron Lett.34, 7829-7832]. El término componente carboxílico se refiere a una molécula que comprende una función carboxílica libre. En particular, el componente carboxílico puede ser cualquier ácido carboxílico, aminoácidos u oligopéptido que porte una función carboxílica, libre, y cuyos otros grupos funcionales se protejan de tal manera que no interfieran con la reacción de acoplamiento deseada. En una modalidad preferida, el grupo amino del aminoácido u oligopéptido aplicado se protege temporalmente por una función bencloxicarbonilo (Z); otros ejemplos incluyen, pero no se limitan a, las funciones Boc, Trt, Fluoren-9-ilmetoxicarbonilo (Fmoc), 2-(metilsulfonil)etoxicarbonilo (Msc), aliloxicarbonilo (Alloc), funciones del tipo arilsulfoniio, tales como orto-nitrobencnsulfonilo (o-NBS) y funciones de desdoblamiento enzimáico [Geiger, R. y Kónig, W. (1981) en: "The Peptides", vol. 3 (Gross, E. y Meienhofer, J., eds) Academic Press, New York, pp. 1-99; por Alloc: Kunz, H. y Unverzagt, C. (1984) Angew. 96, 426-427; para arilsulfonilo: Fukuyama, T. et al. (1997) Tetrahedron Lett. 38, 5731-5834]. Las funciones del tipo t-butilo o funciones de inestabilidad similar, se prefieren para la protección permanente de los otros grupos funcionales en el componente carboxilico, como se describe arriba por el componente amino. El componente carboxilico puede preactivarse previamente como un éster activo, preferiblemente una -N-hidroxisuccinimida, benzotriazol-1-ilo, pentafluorofenilo o éster de 4-nitrofenilo, un haluro, un N-carboxianhídrido o un anhídrido simétrico. Alternativamente, el componente carboxilico puede activarse in situ como una mezcla de anhídrido, o por el uso de un reactivo de acoplamiento, tal como carbodiimida, preferiblemente ?,?'-diciclohexilcarbodiimida (DCC) o clorohidrato de 1-(3'-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDC), o una sal de uronio o fosfonio en presencia posible de un aditivo de acoplamiento, preferiblemente N-hidroxisuccinimida (HONSu), 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), 3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidro-1 ,2,3-benzotriazina (HOOBt), 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt) o 6-cloro-1-hidroxibenzotriazol (CI-HOBt) y si se requiere, en presencia de una amina terciaria ["The Peptides', vol. 1 (1979) (Gross, E. y Meienhofer, J., eds.) Academic Press, New York; Li, P. y Xu, J.-C. (2000) Chin.J. Chem. 18,456-466]. El grupo protector temporal puede removerse de conformidad con métodos conocidos en el arte (vide supra). La función Z puede removerse por hidrogenólisis usando procedimientos (estándar) que aplican, por ejemplo, gas de hidrógeno o formiato como un donador de hidrógeno. Durante este proceso, se remueven todos los grupos protectores del grupo bencilo y los grupos protectores del tipo T-butilo o funciones de inestabilidad similar se mantienen. El último puede removerse por acidólisis de conformidad con los métodos conocidos en el arte. Una persona habilidosa en el arte, entenderá lo que significa con el término de extracción acuosa rápida. Sin embargo, las extracciones acuosas básicas se realizan preferiblemente con el uso de soluciones acuosas de carbonato ácido de sodio o carbonato de sodio, si se desea en presencia de cloruro de sodio o nitrato de potasio. El término extracción acuosa activa, se refiere a una extracción en la cual un componente amino se extrae bajo condiciones acidas en la forma protonada (amonio) o un componente carboxílico se extrae bajo condiciones básicas en la forma desprotonada (carboxilato). La invención se ilustra además por los siguientes ejemplos, que no se interpretan como una limitación de esta invención.

EJEMPLO 1 Boc-Gly-Phe-Asp^BuJ-Serí'BuJ-Oteu Primer ciclo: a una solución agitada de 4.34g de H-ser^BuJ-O'Bu en una mezcla de acetato de etilo y diclorometano a 20°C, se le agregó 3.24g de 1-hidroxibenzotriazol, 7.76g de Z-Asp(OlBu)-OH, 4.20g del clorohidrato 1 -(3'-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida y 2.42ml de 4-metilmorfolina. Después de agitar la solución resultante hasta completar la reacción, se agregaron 1.21 mi de 4-metilmorfolina y 3.51 g de sal de bencil ß-alaninato p-toluensulfonato.

La mezcla se agitó durante otros 30 minutos y se extrajo con 5% Na2CO3/10% NaCI, 5%KHS04/ 0% NaCI y 5%Na2C03 / 10% NaCI. La capa orgánica que contiene el dipéptido Z-AspíO'BuJ-Ser BuJ-O'Bu protegido, se sometió a hidrogenólisis catalítica en presencia de paladio en carbón mineral. Una vez completada la reacción, se agregó 5% Na2C03 / 10% NaCI y la suspensión resultante se filtró. El residuo se lavó con una mezcla de acetato de etilo y diclorometano, y los filtrados orgánicos combinados se extrajeron con 5% Na2C03/ 10% NaCI y 30% NaCI. Segundo ciclo: A la capa orgánica que contiene el dipéptido H-AspíOteuJ-Ser-í'BuJ-O'Bu a 20°C, se le agregaron 3.24 g de 1-hidroxibenzotriazol, 7.18 g de Z-Phe-OH, 4.20 g de clorohidrato de 1-(3'-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida y 2.42 mi de 4-metilmorfolina. Después de agitar la solución resultante hasta que se completó la reacción, se agregaron 1.21 mi de 4-metilmorfolina y 3.51 g de sal de bencil ß-alaninato de p-toluensulfonato. La mezcla se agitó por otros 30 minutos y se extrajo con 5% Na2C03/ 10% NaCI, 5% KHSCu/ 10% NaCI y 5% Na2C03/ 10% NaCI. La capa orgánica que contiene el tripéptido Z-Phe-Asp-(OtBu)-Ser-('BuJ-O'Bu protegido, se sometió a hidrogenólisis catalítica en presencia de paladio en carbón mineral. Una vez completada la reacción, se agregó, 5% Na2C03/ 10% NaCI y la suspensión resultante se filtró. El residuo se lavó con una mezcla de acetato de etilo y diclorometano, y los filtrados orgánicos combinados se extrajeron con 5% Na2C03/ 10% NaCI y 30% NaCI. Tercer ciclo: A la capa orgánica que contiene el tripéptido H-Phe-AspíO'BuJ-SerCBuJ-O'Bu a 20°C, se le agregaron 3.24 g de 1-hidroxibenzotriazol, 4.21 g de Boc-Gly-OH, 4.20 g de clorohidrato de 1 -(3'- dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida y 2.42 mi de 4-metllmorfolina. Después de agitar la solución resultante hasta que se completó la reacción, se agregaron 1.25 mi de 3-dimetilamino-1-propilamina. La mezcla se agitó por otros 30 minutos y se extrajo con 5% Na2C03/ 10% NaCI, 5% KHS04/ 10% NaCI, 5% Na2C03/ 10% NaCI, 30% NaCI y agua. La capa orgánica se evaporó hasta secarse, y el residuo se trituró con metil tert-butil éter y se secó para dar el tetrapéptido protegido deseado en un rendimiento del 95% con base en el material de partida El proceso se completó dentro de 6 horas. Pureza: 98.1 % CLAR de fase inversa (24 hasta 68% de acetonitrilo en ácido trifluoroacético al 0.1 % en 29 minutos a, 220 nm, 2.0 ml/min, 5 mieras, columna Ci8). Identidad: m/z 425.4 [?-???-3???+?]+, 469.4 [?+4???+?]\ 525.4 [?-3*??+?]+, 581 .4 [?-2*??+?]+, 637.4 [M- Hf, 693.4 [?+?]+, por electroatomizado EM; 1H RMN (CDCI3) 5 1.16 (s, 9H), 1 .44 (m, 27H), 2.59 (dd, 1 H), 2.79 (dd, 1 H), 3.09 (m, 2H), 3.51 (dd, 1 H), 3.69-3.86 (m, 1 H), 4.47 (m, 1 H), 4.67-4.78 (m, 2H), 5.20 (bs, 1 H), 6.68 (d, 1 H), 7.12-7.34 (m, 7H).

EJEMPLO 2 H-His-Trp-Ser^BuJ-Tryí'BuJ-D-Leu-Leu-OrníBocJ-Pro-O'Bu Primer ciclo: A una solución agitada de 300 g de H-Pro-O'Bu.HCI en acetato de etilo a 20°C, se le agregó 1014 g de 1 -hidroxibenzotriazol, 2756 g de Z-Om(Boc)-OH, 1378 g de clorohidrato de 1-(3'-dimetilaminopropil)-3- etilcarbodiimida y 1495 mi de 4-metilmorfolina. Después de agitar la solución resultante hasta que se completó la reacción, se agregaron 377 mi de 4- metilmorfolina y 1 105 g de sal de bencil ß-alaninato p-toluensulfonato. La mezcla se agitó durante otros 30 minutos y se extrajo con 5% Na2C03/ 10% NaCI, 5% KHSCV 10% NaCI y 5% Na2C03/ 10% NaCI. La capa orgánica que contiene el dipéptido Z-OrníBocJ-Pro-O'Bu protegido se sometió a hidrogenólisis catalítica en presencia de paladio en carbón mineral. Una vez completada la reacción, se agregó 5% Na2C03/ 15% NaCI y la suspensión resultante se filtró. El residuo se lavó con acetato de etilo y los filtrados orgánicos combinados se extrajeron con 5% Na2C03/ 15% NaCI y 30% NaCI. Las capas acuosas separadas se volvieron a extraer con acetato de etilo. Segundo ciclo. A las capas orgánicas combinadas que contienen el dipéptido H-OrnfBocJ-Pro-O'Bu a 20°C, se les agrego 1014 g de 1 -hidroxibenzotriazol, 1993 g de Z-Leu-OH, 1320 g de clorohidrato de 1 -(3'-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida y 754 mi de 4-metilmorfolina. Después de agitar la solución resultante hasta que se completó la reacción, se le agregó 377 mi de -4-metilmorfolina y 1 105 g de sal de bencil ß-alaninato p-toluensulfonato. La mezcla se agitó durante otros 30 minutos y se extrajo con 5% Na2C03/ 10% NaCI, 5% KHSCV 10% NaCI y 5% Na2C03/ 10% NaCI. La capa orgánica que contiene el tripéptido Z-Leu-OmíBocJ-Pro-O'Bu se sometió a hidrogenólisis catalítica en presencia de paladio en carbón mineral. Una vez completada la reacción se agregó 5% Na2C03/ 1 5% NaCI y la suspensión resultante se filtró. El residuo se lavó con acetato de etilo, y los filtrados orgánicos combinados se extrajeron con 5% Na2CC>3/ 10% NaCI y 30% NaCI. Tercer ciclo: A la capa orgánica que contiene el tripéptido H-Leu-?G?(???)-?G?-0'??? a 20°C, se le agregó 1014 g de -hidroxibenzotriazol, 1993 g de Z-D-Leu-OH, 1320 g de clorohidrato de 1-(3'-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodümida y 754 mi de 4-metilmorfolina. Después de agitar la solución resultante hasta que se completó la reacción se le agregaron 377 mi de 4-metilmorfolina y 1 105 g de sal de bencilo ß-alaninato p-toluensulfonato. La mezcla se agitó durante otros 30 minutos y se extrajo con 5% Na2C03, 5% KHS04, y 5% Na2C03. La capa orgánica que contiene el tripéptido Z-D-Leu-Leu-Orn(Boc)-Por-O'Bu protegido, se sometió a hidrogenólisis catalítica en presencia de paladio en carbón mineral. Una vez completada la reacción, se agregó 5% Na2C03 y la suspensión resultante se filtró. El residuo se lavó con acetato de etilo, y los filtrados orgánicos combinados se extrajeron con 5% Na2C03 y 10% NaCI. Cuarto hasta Séptimo ciclo: Estos ciclos se realizaron siguiendo el procedimiento del tercer ciclo, reemplazando los 1993 g de Z-D-Leu-OH por Z-Tyr('Bu)-OH (liberado a partir de 4497 g de la correspondiente sal de diciclohexilamonio), 2218 g de Z-Ser(4Bu)-OH, 2538 g de Z-Trp-OH y 2172 g de Z-His-OH, respectivamente. Sin embargo, del quinto ciclo en adelante, las cantidades de 4-metilmorfolina y sal de bencil ß-alaninato p-toluensulfonato, durante la etapa de depuración, se colocaron al doble. En el quinto ciclo, las extracciones después de la depuración se realizaron a 35°C. en el séptimo ciclo, el acoplamiento se realizó a 3°C, se reemplazaron los 1014 g de 1-hidroxibenzotriazol por 2561 g de 6-cloro-1-hidroxibenzotriazol y una porción suplementaria de 132 g de clorohidrato de 1-(3'-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida se agregó después de 1 hora de acoplamiento. También en el séptimo ciclo, las extracciones después de la hidrogenólisis se realizaron a 35°C. Al final del séptimo ciclo la capa orgánica se evaporó hasta secar para dar el nonapéptido protegido deseado en un rendimiento del 73% con base en el material de partida H-Pro-OlBu. HCI (esto es, un promedio de 98% por etapa química). Pureza: 90.6 % por CLAR de fase inversa (acetonitrilo al 24 hasta 68% en ácido trifluoroacético al 0.1 % en 29 minutos a 220 nm, 2.0 ml/min, 5 mieras, columna C 8). Identidad: m/z 543.6 [m-Boc-2lBu + 2H]2+, 571 .6 [M-Boc-'Bu + 2H]2+, 599.6 [M-Boc+2H]2+, 649.8 [M+2H]2+, 1298.0 [M+H]+ por electroatomizado EM. Conclusiones: Los péptidos protegidos se producen sin el aislado intermitente de los intermediarios. La pureza e identificación del producto obtenido del primer ejemplo, muestra que el exceso de componentes carboxílicos (activados) se han removido completamente en todas etapas del proceso, y no se han formado secuencias de inserción usando el proceso de esta invención. La síntesis del segundo ejemplo, por otra parte, demuestra que la síntesis de conformidad con el proceso de esta invención es fácilmente escalable. Los productos de ambos ejemplos se obtienen en alto rendimiento y alta pureza dentro de un periodo de tiempo relativamente corto.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Un proceso para una síntesis de solución rápida de un péptido en un solvente orgánico o una mezcla de solventes orgánicos, el proceso comprende sitios repetitivos de las etapas (a)-(d): (a) una etapa de acoplamiento, por el uso de un exceso de un componente carboxílico activado para acilar un componente amino, (b) una etapa de apagado en la cual se usa un agente de depuración para remover las funciones carboxílicas activadas residuales, en donde el agente de depuración también pude usarse para la desprotección del péptido en crecimiento, (c) una o más extracciones acuosas y opcionalmente, (d) una etapa de desprotección separada, seguida por una o más extracciones acuosas, caracterizado porque el proceso comprende al menos una etapa (b), referida como etapa (b'), en la cual una amina que comprende un anión libre o un anión latente se usa como un agente de depuración de las funciones carboxílicas activadas residuales. 2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque en la etapa (a), las cantidades molares de los reactivos usados están en orden descendente: componente carboxílico, aditivo de acoplamiento > reactivo de acoplamiento > componente amino. 3. El proceso de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque en la etapa (a) se usa un componente carboxílico previamente activado. 4. El proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque en la etapa (b') se usa una amina que comprende un anión latente como el depurador. 5. El proceso de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el anión latente es una amina depuradora que porta un grupo protector temporal que puede removerse selectivamente en presencia de cualesquiera de los grupos protectores permanentes enlazados al péptido en crecimiento. 6. El proceso de conformidad con las reivindicaciones 4 ó 5, caracterizado porque el anión latente en la amina de depuración, porta un grupo protector temporal que exhibe una inestabilidad similar a la del grupo protector temporal presente en la terminación N del péptido en crecimiento. 7. El proceso de conformidad con las reivindicaciones 5 ó 6, caracterizado porque los grupos protectores temporales son grupos hidrogenólicamente removibles en tanto que los grupos protectores permanentes son grupos acidol ¡ticamente removibles. 8. El proceso de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque los grupos protectores temporales son del tipo bencilo. 9. El proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 4-8, caracterizado porque el agente de depuración es una amina primaria que comprende un anión libre o un anión latente. 10. El proceso de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la amina primaria es un derivado de aminoácidos protegido en la terminal C. 1 1. El proceso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el aminoácido es ß-alanina o un derivado del mismo. 12. El proceso de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizado porque el agente de depuración es bencil ß-alaninato o una sal del mismo. 3. El proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque el tiol comprende un anión libre o latente y se usa como un agente de depuración en lugar de una amina que comprende un anión libre o latente. 14. El proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1- 3, caracterizado porque el proceso comprende uno o más ciclos en donde en la etapa (b) se usa una poliamina como el depurador. 15. El proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-14, caracterizado porque comprende uno o más ciclos en donde en la etapa (b) la desprotección no ocurre, y en la etapa (c) posterior comprende extracciones básicas secuenciales, acidas y básicas. 16. El proceso de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque las extracciones se realizan en presencia de cloruro de sodio o nitrato de potasio. 17. El proceso de conformidad con las reivindicaciones 15 ó 16, caracterizado porque comprende una etapa posterior (d) que comprende la desprotección y extracciones básicas secuenciales y neutrales. 18. El proceso de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque las extracciones se realizan en presencia de cloruro de sodio o nitrato de potasio. 19. El proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 -14, caracterizado porque comprende uno o más ciclos en donde en la etapa (b) tanto la desprotección como el apagado ocurren, y en la etapa (c) posterior comprende la extracciones básicas secuenciales y neutrales. 20. El proceso de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque las extracciones se realizan en presencia de cloruro de sodio o nitrato de potasio. 21. El proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-20, caracterizado porque en el último ciclo en la etapa (a) los grupos de protección del componente carboxílico exhiben una inestabilidad similar a la de los grupos protectores permanentes del péptido en crecimiento, y en la etapa (b) el agente de depuración es poliamina. 22. El proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-21 , caracterizado porque el solvente orgánico o mezcla de solventes orgánicos, es acetato de etilo o una mezcla de acetato de etilo y diclorometano, una mezcla de acetato de etilo y 1-metil-2-pirrolidona, una mezcla de acetato de etilo y ?,?-dimetilformamida o una mezcla de acetato de etilo y tetrahidrofurano. 23. El proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 -22, caracterizado porque el proceso se realiza dentro de un rango de temperatura de 0 hasta 50°C. 24. El proceso de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el proceso se realiza a temperatura ambiente. 25. Un método para la síntesis combinatoria de colecciones de péptidos, por el uso del método de división y mezcla, caracterizado porque se aplica el proceso de cualesquiera de las reivindicaciones 1-24. 26. Un método para la síntesis automatizada de solución de péptidos, caracterizado porque se aplica el proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-25. 27. Un péptido o una mezcla del péptido, preparada de conformidad con un proceso que comprende el proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1-26.