ES2864924T3

ES2864924T3 - Método de síntesis peptídica

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Publication number: ES2864924T3
Application number: ES16758925T
Authority: ES
Inventors: Yusuke Kono; Hideaki Suzuki; Susumu Muto
Original assignee: Jitsubo Co Ltd
Current assignee: Jitsubo Co Ltd
Priority date: 2015-03-04
Filing date: 2016-03-02
Publication date: 2021-10-14
Anticipated expiration: 2036-03-02
Also published as: JPWO2016140232A1; WO2016140232A1; EP3266792A4; CN107406480B; DK3266792T3; EP3266792B1; US11098078B2; TW201639867A; EP3266792A1; US20180215782A1; CN107406480A; JP6713983B2

Abstract

Método de síntesis peptídica que comprende las siguientes etapas a a d: a. condensar un aminoácido que tiene un N-terminal protegido con fluorenilmetoxicarbonilo (N-Fmoc protegido) o un péptido N-Fmoc protegido con un aminoácido que tiene un C-terminal protegido con un portador, siendo el portador capaz de cristalizar, como respuesta a un cambio de una composición de un disolvente de disolución (C-portador protegido), un péptido C-portador protegido o una amida de aminoácido C-portador protegida, en presencia de un agente de condensación, para obtener un péptido N-Fmoc-C- portador protegido, b. subsiguientemente adicionar al sistema de reacción resultante de la etapa (a) por lo menos una amina seleccionada del grupo consistente en una alquilamina que tiene de 1 a 14 átomos de carbono, una amina aromática que tiene de 1 a 14 átomos de carbono e hidroxilamina, en donde la alquilamina o la amina aromática es una amina primaria o secundaria, c. después de esto desproteger el N-terminal, y d. cambiar la composición del disolvente que disuelve el péptido C-portador protegido resultante, para cristalizar y separar el péptido C-portador protegido.

Description

DESCRIPCIÓN

Método de síntesis peptídica

Descripción

[Campo técnico]

[0001] La presente invención se refiere a un método novedoso de síntesis peptídica, específicamente, a un método de síntesis de péptidos capaz de llevar a cabo fácilmente una reacción de elongación peptídica precisa.

[Antecedentes de la técnica]

[0002] Convencionalmente, se usan de manera amplia métodos en los que componentes específicos disueltos en un líquido se separan como un sólido, en un proceso químico. El motivo de esto es que la separación y la purificación después de la reacción resultan sencillas solidificando (cristalizando) únicamente componentes específicos. Según este método, por ejemplo, un compuesto necesario o innecesario se solidifica (cristaliza) después de completar cada reacción en una síntesis multietapa secuencial, tal como la síntesis de una quimioteca usada en desarrollos y estudios recientes de preparaciones farmacéuticas, y, como resultado, la sustancia solidificada (cristalizada) se puede separar y purificar fácilmente. De este modo, puede resolverse la complejidad del proceso como problema convencional.

[0003] Se usa también un método en el un componente específico disuelto se disuelve selectivamente en una fase específica (distribución selectiva) en separación en fase líquida, para lograr la separación con respecto a otros componentes. Este método puede contribuir a la rapidez y la simplificación de los procesos, ya que puede separarse un componente específico sin solidificación (cristalización).

[0004] La solidificación (cristalización) de un componente específico disuelto en una solución o la disolución selectiva de un componente específico en una fase líquida específica (distribución selectiva), según se ha descrito anteriormente, se logra cumpliendo ciertas condiciones referentes a la naturaleza química de un compuesto, sus propiedades físicas y el disolvente. No obstante, en muchos casos las condiciones de solidificación (cristalización) y disolución selectiva (distribución selectiva) deben buscarse empíricamente por ensayo y error. En particular en síntesis multietapa secuencial, se requieren un coste y un tiempo significativos para el desarrollo del proceso, ya que es necesario investigar condiciones de etapas respectivas basadas en las naturalezas específicas de los compuestos sintetizados en etapas respectivas.

[0005] Se sugiere, entonces, una molécula portadora que tiene un enlazador, que detecta de manera sensible un cambio de la composición del disolvente provocando así un cambio reversible entre el estado disuelto y el estado insolubilizado (cristalizado) o provoca una disolución selectiva de un componente específico disuelto en una fase específica con una alta concentración (distribución selectiva) en la separación en fase líquida. Se pueden unir varios compuestos a una molécula portadora del tipo mencionado por medio de un enlazador. De este modo, los compuestos unidos pueden experimentar fácilmente una variación de estado desde el estado disuelto al estado insolubilizado (cristalizado) o a la inversa, junto con la molécula portadora. Alternativamente, los compuestos unidos a la molécula portadora se pueden disolver con una alta concentración selectivamente (distribución selectiva) en una fase específica de un líquido separado en varias fases.

[0006] Además, una molécula portadora de este tipo puede repetir de manera reversible el estado disuelto y el estado insolubilizado (cristalizado) aproximadamente en las mismas condiciones incluso si la estructura química del compuesto unido varía por la reacción química secuencial, o puede provocar una disolución selectiva con una alta concentración (distribución selectiva) en una fase específica de un líquido separado en varias fases. Cuando se usa una molécula portadora que provoca un cambio reversible entre el estado disuelto y el estado insolubilizado (cristalizado) o que puede inducir el estado de distribución selectiva según se ha descrito anteriormente, se puede separar selectivamente del estado disuelto uniforme un compuesto en calidad de diana de separación, usando el conocimiento de reacciones generales en fase líquida en química orgánica en su estado actual. Es decir, se puede separar un compuesto específico al tiempo que dejando otros componentes solubles en la solución después de la reacción en fase líquida.

[0007] Como portador capaz de repetir de manera reversible el estado disuelto y el estado insolubilizado, se sugieren varios compuestos. Por ejemplo, los presentes inventores sugieren un compuesto de alcohol bencílico en el cual se introduce un ácido graso de cadena larga (documentos de patente 1 a 4), o se enumeran un compuesto de fluoreno en el cual se introduce un ácido graso de cadena larga (documento de patente 5) un compuesto de difenilmetano en el cual se introduce un ácido graso de cadena larga (documento de patente 6).

[0008] La tecnología de síntesis peptídica incluye un método de síntesis peptídica en fase sólida (método de SPPS) y un método de síntesis peptídica en fase líquida (método de LPPS). En el método de síntesis peptídica en fase sólida, en principio no se puede llevar a cabo una purificación en cada etapa de la reacción de elongación de los aminoácidos. Puesto que el coste de la síntesis es elevado, este método es adecuado para una producción de volúmenes pequeños. En contraposición, el método de síntesis peptídica en fase líquida se usa ampliamente para producción a gran escala, aunque, cuando la longitud de la cadena peptídica aumenta, la reacción de elongación de los péptidos se hace dificultosa, con lo cual la síntesis de un péptido de cadena larga resulta problemática.

[0009] Por este motivo, se sugiere llevar a cabo una síntesis de péptidos usando el portador antes descrito capaz de repetir de manera reversible el estado disuelto y el estado insolubilizado (documentos de patente 1 a 6).

[0010] La síntesis peptídica tiene el problema de la supresión de un residuo de aminoácido que se produce en la reacción de elongación peptídica, y resulta problemática también en el caso de usar el portador antes descrito. Para solucionar la supresión de un residuo de aminoácido, se incrementan los equivalentes del aminoácido y del agente de condensación. No obstante, cuando, como resultado de ello, en la reacción líquida quedan especies activas de aminoácidos excesivas, surge un problema nuevo por el que se produce un doble hit en la desprotección de un N-terminal. Por ello, disminuye el rendimiento del aminoácido deseado. El doble hit indica que un residuo de aminoácido adicional se inserta además en el péptido diana.

[0011] Como medios para solucionar esto, una especie activa de aminoácido se elimina del sistema de reacción mediante lavado antes de la desprotección. Por ejemplo, se sugiere un método que se describe a continuación. Se ha sugerido un método de adición de una amina que tiene un componente de anión tal como p-alanina-OBz como captador (scavenger), para eliminar un éster activo de un aminoácido que queda en el sistema de reacción en un método de síntesis peptídica en fase líquida que usa un grupo benciloxicarbonilo (Cbz ó Z), o un grupo t-butiloxicarbonilo (Boc) como grupo protector (documento de patente 7). En este método, también se elimina simultáneamente un grupo protector de componente de anión de un cuerpo captado en la desprotección de un grupo protector de un N-terminal, dando como resultado que el cuerpo captado se haga soluble en agua. Después de esto, se lleva a cabo una extracción líquido-líquido usando agua-alcalina-disolvente orgánico, y a continuación, se eliminan con agua un agente de condensación y un componente de aminoácido. No obstante, cuando se usa Cbz como grupo protector, el catalizador de desprotección se desactiva si hay presencia de Met ó Cys en la secuencia peptídica, es decir, esto no es aplicable. Además, en este método, no se puede usar fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) como grupo protector, ya que no se puede eliminar el dibenzofulveno.

[0012] Además, se ha sugerido un método de eliminación de un componente de aminoácido por extracción líquidolíquido al tiempo que se hidroliza un éster activo con agua alcalina (por ejemplo, una solución acuosa de carbonato de sodio al 5%), para eliminar un éster activo de un aminoácido que queda en el sistema de reacción en un método de síntesis peptídica en fase líquida que usa Boc como grupo protector (documento de patente 8). No obstante, en este método se produce posiblemente una epimerización bajo unas condiciones de alcalinidad fuerte de pH = 11 ó superior. Adicionalmente, no se puede usar fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) como grupo protector, ya que no se puede eliminar el dibenzofulveno.

[0013] Además en la síntesis peptídica que usa un portador capaz de repetir de manera reversible el estado disuelto y el estado insolubilizado antes descritos, se puede eliminar una especie activa de aminoácido del sistema de reacción mediante lavado antes de la desprotección para solucionar el problema del doble hit debido a una especie activa de aminoácido excesiva. No obstante, una especie activa de aminoácido no se puede eliminar por completo mediante lavado en algunos casos por una operación de cristalización para insolubilizar el portador, y existe el problema de que se requiere el doble de operaciones de lavado después de la reacción de condensación y después de la desprotección, y es necesaria una gran cantidad de disolvente de lavado.

[0014] El documento de patente 9 y los documentos que no son patente 2 y 3 describen métodos de síntesis peptídica que usan condensación en donde tiene lugar una etapa de precipitación entre la etapa de condensación y la etapa de desprotección.

[0015] Además, existe un informe sobre un método en el que Fmoc se desprotege de un N-terminal, a continuación, se deja que coexista ácido tiolcarboxílico y se genera dibenzofulveno, a continuación, se lleva a cabo una extracción líquido-líquido con agua alcalina-disolvente orgánico, y a continuación, se eliminan con agua un agente de condensación, un componente de aminoácido y dibenzofulveno, con lo cual se elimina el éster activo de aminoácido, como método de eliminación de un grupo Fmoc en una síntesis peptídica (documento de patente 8). Además, se da a conocer que un éster activo se puede eliminar con tiol sílice o se puede descomponer con agua alcalina antes de la desprotección del Fmoc y se sugiere que un éster activo de un aminoácido se elimine en forma de un producto soluble en agua.

[0016] Adicionalmente, existe un informe sobre un método en el que se desprotege el Fmoc de un N-terminal, a continuación, se permite que coexista tiol alquílico o tiol en fase sólida y se genera dibenzofulveno, a continuación, se lleva a cabo una condensación, y a continuación, se cristaliza un componente peptídico con un éter y se lleva a cabo una separación sólido-líquido, para extraer un aducto de dibenzofulveno, como método de eliminación de un grupo Fmoc en una síntesis peptídica, aunque no se describe la eliminación de un éster activo de aminoácido (documento que no es patente 1).

[Lista de citas]

[Bibliografía sobre patentes]

[0017]

Referencia Bibliográfica de Patente 1: Publicación de Solicitud de Patente Japonesa Pendiente de Examinar n.° 2 003- 183298

Referencia Bibliográfica de Patente 2: Publicación de Solicitud de Patente Japonesa Pendiente de Examinar n.° 2 004- 059509

Referencia Bibliográfica de Patente 3: WO 2007/034812

Referencia Bibliográfica de Patente 4: WO 2007/122847

Referencia Bibliográfica de Patente 5: WO 2010/104169

Referencia Bibliográfica de Patente 6: WO 2010/113939

Referencia Bibliográfica de Patente 7: Publicación de Solicitud de Patente Japonesa Pendiente de Examinar n.° 2003-55396

Referencia Bibliográfica de Patente 8: WO 2007/099656

Referencia Bibliográfica de Patente 9: EP 2716650 A1

[Bibliografía que no son patentes]

[0018]

Referencia Bibliográfica que no es Patente 1: James E. Sheppeck II et al., Tetrahedron Letters 41 (2000) Referencia Bibliográfica que no es Patente 2: Daisuke Takahashi et al., Organic Letters 14:4514 (2012) Referencia Bibliográfica que no es Patente 3: Daisuke Takahashi et al., Tetrahedron Letters 53:1936 (2012)

[Sumario de la invención]

[Problema técnico]

[0019] La presente invención tiene el objetivo de proporcionar un método de síntesis peptídica que usa un portador capaz de repetir de manera reversible el estado disuelto y el estado insolubilizado, en donde se puede solucionar fácilmente el problema de la existencia de una especie activa de aminoácido en el sistema de reacción en la reacción de desprotección.

[Solución al problema]

[0020] Los presentes inventores han realizado un estudio de manera intensa en relación con el problema antes descrito y, como resultado, han descubierto que se puede evitar el doble hit de un aminoácido en la desprotección desactivando una especie activa de aminoácido por medio de un captador específico antes de la reacción de desprotección, incluso si la especie activa de aminoácido no se elimina del sistema de reacción antes de la desprotección de un N-terminal, lo cual ha derivado en la materialización de la presente invención. La presente invención incluye lo siguiente.

(1) Un método de síntesis peptídica que comprende las siguientes etapas a a d:

a. una etapa de condensación de un aminoácido que tiene un N-terminal protegido con fluorenilmetoxicarbonilo (N-Fmoc protegido) o un péptido N-Fmoc protegido con un aminoácido que tiene un C-terminal protegido con un portador, siendo el portador capaz de cristalizar, como respuesta a un cambio de una composición de un disolvente de disolución (C-portador protegido), un péptido C-portador protegido o una amida de aminoácido C-portador protegida, en presencia de un agente de condensación, para obtener un péptido N-Fmoc-C-portador protegido,

b. una etapa de adición subsiguiente al sistema de reacción resultante de la etapa (a) de por lo menos una amina seleccionada del grupo consistente en una alquilamina que tiene de 1 a 14 átomos de carbono, una amina aromática que tiene de 1 a 14 átomos de carbono e hidroxilamina, en donde la alquilamina o la amina aromática es una amina primaria o secundaria,

c. después de esto una etapa de desprotección del N-terminal, y

d. una etapa de cambio de la composición del disolvente que disuelve el péptido C-portador protegido resultante, para cristalizar y separar el péptido C-portador protegido.

(2) El método de síntesis peptídica según el punto (1) anterior, en donde dicho portador es un compuesto seleccionado del grupo consistente en

un compuesto que tiene la siguiente estructura (a la que se hace referencia como “K” en algunos casos en la presente memoria descriptiva):

[Fórmula Química 1]

en donde R1 y R5 representan un átomo de hidrógeno, y R2, R3 y R4 representan un grupo alcoxilo que tiene de 8 a 30 átomos de carbono, preferentemente un grupo alcoxilo que tiene de 11 a 22 átomos de carbono. En la fórmula, RX es un grupo representado por la siguiente fórmula 2 y que se une al C-terminal de un péptido o un aminoácido,

Fórmula Química 2

en donde R7 representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo bencilo o un grupo bencilo alcoxi-sustituido, y Re representa un átomo de hidrógeno, un grupo fenilo o un grupo fenilo alcoxi-sustituido. La fórmula antes descrita se muestra en el estado antes de unirse al C-terminal de un péptido o un aminoácido;

un compuesto que tiene la siguiente estructura (a la que se hace referencia como “Kb” en algunos casos en la presente memoria descriptiva):

[Fórmula Química 3]

en donde R2, R4 y R5 representan un átomo de hidrógeno, y R1 y R3 representan un grupo alcoxilo que tiene de 12 a 30 átomos de carbono, preferentemente un grupo alcoxilo que tiene de 18 a 22 átomos de carbono. En la fórmula, RY es un grupo representado por la siguiente fórmula 4 y que se une al C-terminal de un péptido o un aminoácido,

[Fórmula Química 4]

H;

C — SH

en donde R7 representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo bencilo o un grupo bencilo alcoxi-sustituido, y Re representa un átomo de hidrógeno, un grupo fenilo o un grupo fenilo alcoxi-sustituido. La fórmula antes descrita se muestra en el estado antes de la unión al C-terminal de un péptido o un aminoácido; y

un compuesto que tiene la siguiente estructura (a la que se hace referencia en algunos casos en la presente memoria descriptiva como “Kc”):

[Fórmula Química 5]

en donde Ri, R3 y R5 representan un átomo de hidrógeno, y R2 y R4 representan un grupo alcoxilo que tiene de 12 a 30 átomos de carbono, preferentemente un grupo alcoxilo que tiene de 18 a 22 átomos de carbono. En la fórmula, RZ es un grupo representado por la siguiente fórmula 6 y que se une al C-terminal de un péptido o un aminoácido,

[Fórmula Química 6]

en donde R7 representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo bencilo o un grupo bencilo alcoxi-sustituido, y Re representa un átomo de hidrógeno, un grupo fenilo o un grupo fenilo alcoxi-sustituido. La fórmula antes descrita se muestra en el estado antes de la unión al C-terminal de un péptido o un aminoácido.

(3) El método de síntesis peptídica según el punto anterior (1), en donde dicho portador es un compuesto seleccionado del grupo consistente en

[Fórmula Química 7]

en donde, X representa un halógeno, Y es un entero de 8 a 12 y Z es un entero de 17 a 29,

[Fórmula Química 8]

en donde X representan cada uno de ellos independientemente un entero de 7 a 21, y

[Fórmula Química 9]

en donde X representan cada uno de ellos independientemente un entero de 11 a 29.

Las fórmulas antes descritas se muestran en el estado antes de la unión al C-terminal de un péptido o un aminoácido.

(4) El método de síntesis peptídica según el punto anterior (1), en donde dicho portador es un compuesto seleccionado del grupo consistente en

[Fórmula Química 10]

(alcohol 3,4,5-trioctadecilbencílico)

[Fórmula Química 11]

(alcohol 2,4-didocosiloxibencílico)

[Fórmula Química 12]

(alcohol 3,5-didocosiloxibencílico)

[Fórmula Química 13]

en donde X es F ó Cl

[Fórmula Química 14]

(alcohol(2-3,4,5-trioctadeciloxibencil)-4-metoxibencílico)

, y

[Fórmula Química 15]

[Bis-(4-docosiloxifenil)-metilamina).

(5) El método de síntesis peptídica según uno cualquiera de los puntos anteriores (1) a (4), en donde dicha amina es una alquilamina que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o hidroxilamina.

(6) El método de síntesis peptídica según uno cualquiera de los puntos anteriores (1) a (5), en donde dicha amina es una alquilamina que tiene 3 ó 4 átomos de carbono.

(7) El método de síntesis peptídica según uno cualquiera de los puntos anteriores (1) a (6), en donde el equivalente de amina en la etapa b está en una cantidad de 1 a 30 veces con respecto al equivalente de aminoácido que queda teóricamente después de la reacción de condensación de la etapa a.

(8) El método de síntesis peptídica según uno cualquiera de los puntos anteriores (1) a (7), en donde los medios de cambio de composición para cambiar la composición del disolvente que disuelve el péptido C-portador protegido resultante se lleva a cabo concentrando el disolvente de la solución, y a continuación, adicionando un disolvente pobre para lograr la solidificación.

(9) El método de síntesis peptídica según el punto anterior (8), en donde dicho disolvente pobre es un disolvente seleccionado del grupo consistente en acetonitrilo, acetonitrilo acuoso, metanol, metanol acuoso y agua.

(10) El método de síntesis peptídica según uno cualquiera de los puntos anteriores (1) a (9), que comprende efectuar la repetición de la etapa a a la etapa d usando el péptido C-portador protegido cristalizado y separado en la etapa d.

(11) El método de síntesis peptídica según uno cualquiera de los puntos anteriores (1) a (10), que comprende, además, la siguiente etapa:

e. una etapa de lavado del cristal del péptido C-portador protegido, cristalizado y separado con un disolvente orgánico.

(12) El método de síntesis peptídica según uno cualquiera de los puntos anteriores (1) a (11), en donde dichas etapas a a c se efectúan en una síntesis de un solo recipiente.

[Efecto ventajoso de la invención]

[0021] El método de síntesis peptídica de la presente invención puede solucionar el problema de la existencia de una especie activa de aminoácido en el sistema de reacción en la reacción de desprotección con unos medios simples y resulta excelente en cuanto a versatilidad. El péptido sintetizado con la presente invención presenta menos problemas de supresión de un aminoácido y de doble hit, con lo cual, según el método de la presente invención, puede sintetizarse un péptido de alta calidad con un rendimiento elevado.

[Descripción de realizaciones]

[0022] En lo sucesivo en la presente se ilustrará y describirá de forma detallada a la presente invención en referencia a las realizaciones ejemplificativas, junto con los métodos y materiales preferidos que se pueden usar para poner en práctica la presente invención.

[0023] A no ser que se especifique lo contrario en el texto, cualquier término técnico y cualquier término científico usados en la presente memoria descriptiva tienen el mismo significado que los entendidos en general por aquellos con conocimientos habituales en la técnica a la pertenece la presente invención.

[0024] A continuación se explicarán términos usados en la presente memoria descriptiva.

1. Aminoácido y péptido N-Fmoc protegidos

[0025] El aminoácido que tiene un N-terminal protegido por fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) (aminoácido N-Fmoc protegido) indica un aminoácido en el que un grupo amino del aminoácido está protegido por Fmoc, mientras que un grupo carbonilo no está protegido y es reactivo.

[0026] El péptido que tiene un N-terminal protegido por fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) (péptido N-Fmoc protegido) indica un péptido en el que un grupo amino N-terminal de la cadena peptídica está protegido por Fmoc, mientras que un grupo carbonilo en el C-terminal no está protegido y es reactivo.

[0027] Cuando el aminoácido N-Fmoc protegido o el péptido N-Fmoc protegido tiene un grupo funcional rico en reactividad, tal como un grupo hidroxilo, un grupo amino, un grupo guanidilo, un grupo carboxilo o un grupo sulfidrilo, puede introducirse un grupo protector general usado en la química de los péptidos en estos grupos funcionales, y, después de completar la reacción, si es necesario se elimina el grupo protector, con lo cual, puede obtenerse el compuesto objetivo.

[0028] El grupo protector para un grupo hidroxilo incluye un grupo tBu, un grupo Trt, un grupo Bz, un grupo acetilo y un grupo sililo, el grupo protector para un grupo amino incluye un grupo Boc, un grupo Fmoc, un grupo Cbz, un grupo Trt, un grupo Mmt, y un grupo ivDde, el grupo protector para un grupo guanidilo incluye un grupo Pbf, un grupo Pmc, y un grupo nitro, el grupo protector para un grupo carboxilo incluye un grupo tBu, un grupo metilo, un grupo etilo, y un grupo Bz, y el grupo protector para un grupo sulfidrilo incluye un grupo Trt, un grupo Acm, un grupo tBu y un grupo S-tBu.

2. Aminoácido, péptido y amida de aminoácido C-portador protegidos.

[0029] El aminoácido que tiene un C-terminal protegido por un portador que se cristaliza de acuerdo con un cambio de una composición de un disolvente de disolución (aminoácido C-portador protegido) indica un aminoácido en el que un grupo carboxilo del aminoácido está protegido por un portador que se describe posteriormente, mientras que un grupo amino no está protegido y es reactivo.

[0030] El péptido que tiene un C-terminal protegido por un portador que se cristaliza de acuerdo con un cambio de una composición de un disolvente de disolución (péptido C-portador protegido) indica un péptido en el que un grupo carboxilo en el C-terminal de la cadena peptídica está protegido por un portador que se describe posteriormente, mientras que un grupo amino en el N-terminal no está protegido y es reactivo.

[0031] La amida de aminoácido que tiene un C-terminal protegido por un portador que se cristaliza de acuerdo con un cambio de una composición de un disolvente de disolución (amida de aminoácido C-portador protegida) indica una amida de aminoácido en la que un grupo carboxilo de la misma está protegido por un portador que se describe posteriormente, mientras que un grupo amino no está protegido y es reactivo.

[0032] Cuando el aminoácido C-portador protegido o el péptido C-portador o la amida de aminoácido C-portador protegida tiene un grupo funcional rico en reactividad, tal como un grupo hidroxilo, un grupo amino, un grupo guanidilo, un grupo carboxilo o un grupo sulfidrilo, en estos grupos funcionales puede introducirse un grupo protector general usado en la química de los péptidos, y, después de completarse la reacción, si es necesario el grupo protector se elimina, con lo cual puede obtener el compuesto objetivo.

[0033] El grupo protector para un grupo hidroxilo incluye un grupo tBu, un grupo Trt, un grupo Bz, un grupo acetilo y un grupo sililo, el grupo protector para un grupo amino incluye un grupo Boc, un grupo Fmoc, un grupo Cbz, un grupo Trt, un grupo Mmt, y un grupo ivDde, el grupo protector para un grupo guanidilo incluye un grupo Pbf, un grupo Pmc, y un grupo nitro, el grupo protector para un grupo carboxilo incluye un grupo tBu, un grupo metilo, un grupo etilo, y un grupo Bz, y el grupo protector para un grupo sulfidrilo incluye un grupo Trt, un grupo Acm, un grupo tBu y un grupo S-tBu.

3. Portador que se cristaliza de acuerdo con el cambio de la composición del disolvente de disolución

[0034] El portador que se cristaliza de acuerdo con un cambio de una composición de un disolvente de disolución indica un portador que presenta un cambio reversible entre el estado disuelto y el estado solidificado (cristalizado) de acuerdo con un cambio de la composición del disolvente que disuelve el portador. Ejemplos específicos del mismo incluyen los siguientes compuestos, y un aminoácido C-portador protegido, un péptido C-portador o una amida de amino-acido C-portador protegida en el que el C-terminal esté protegido por el portador, usado en la presente invención, se puede producir uniendo estos compuestos al C-terminal de un péptido o un aminoácido.

3-1. Portador A

[0035] Un compuesto que tiene la siguiente estructura (a la que se hace referencia, en la presente memoria descriptiva, en algunos casos, como “Ka”):

[Fórmula Química 16]

en donde R1 y R5 representan un átomo de hidrógeno, y R2, R3 y R4 representan un grupo alcoxilo que tiene de 8 a 30 átomos de carbono. En la fórmula, RX es un grupo representado por la siguiente fórmula y que se une al C-terminal de un péptido o un aminoácido,

[Fórmula Química 17]

en donde R7 representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo bencilo o un grupo bencilo alcoxi-sustituido, y R6 representa un átomo de hidrógeno, un grupo fenilo o un grupo fenilo alcoxi-sustituido.

[0036] En la fórmula antes descrita, R2, R3 y R4 tienen un número de átomos de carbono de, más preferentemente, 8 a 22 , aún más preferentemente 12 a 18.

[0037] En la fórmula antes descrita, RX es, más preferentemente, un grupo hidroximetilo, un grupo aminometilo o un grupo mercaptometilo, aún más preferentemente un grupo hidroximetilo.

[0038] El compuesto incluido en la fórmula antes descrita es, preferentemente, alcohol 3,4,5-trioctadecilbencílico, 3,4,5-trioctadecilbencilamina ó 3,4,5-trioctadecilbenciltiol, aún más preferentemente alcohol 3,4,5-trioctadecilbencílico ó 3,4,5-trioctadecilbencilamina, con la mayor preferencia alcohol 3,4,5-trioctadecilbencílico representado por la siguiente fórmula.

[Fórmula Química 18]

[0039] Para la unión del compuesto antes descrito al C-terminal de un péptido o un aminoácido, en la presente invención también pueden usarse métodos utilizados de forma general en la síntesis de péptidos sin limitaciones, y, por ejemplo, la unión se puede llevar a cabo por esterificación usando DIPCI.

3-2. Portador B

[0040] Un compuesto que tiene la siguiente estructura (a la que se hace referencia como “Kb” en algunos casos en la presente memoria descriptiva):

[Fórmula Química 19]

en donde R2, R4 y R5 representan un átomo de hidrógeno, y R1 y R3 representan un grupo alcoxilo que tiene de 12 a 30 átomos de carbono. En la fórmula, RY es un grupo representado por la siguiente fórmula y que se une al C-terminal de un péptido o un aminoácido,

[Fórmula Química 20]

[0041] En la fórmula antes descrita, R1 y R3 más preferentemente tienen un número de átomos de carbono de 18 a 22.

[0042] En la fórmula antes descrita, RX es, más preferentemente, un grupo hidroximetilo, un grupo aminometilo o un grupo mercaptometilo, todavía más preferentemente un grupo hidroximetilo.

[0043] El compuesto incluido en la fórmula antes descrita es, preferentemente, alcohol 2,4-didocosiloxibencílico, 2,4 didocosiloxibencilamina ó 2,4-didocosiloxibenciltiol, más preferentemente alcohol 2,4-didocosiloxibencílico ó 2,4-didocosiloxibencilamina, con la mayor preferencia alcohol 2,4-didocoxiloxibencílico representado por la siguiente fórmula.

[Fórmula Química 21]

[0044] Para la unión del compuesto antes descrito al C-terminal de un péptido o un aminoácido, en la presente invención también pueden usarse métodos utilizados de forma general en la síntesis de péptidos sin limitaciones, y, por ejemplo, la unión se puede llevar a cabo por esterificación usando DIPCI.

3-3. Portador C

[0045] Un compuesto que tiene la siguiente estructura (a la que se hace referencia en algunos casos en la presente memoria descriptiva como “Kc”:

[Fórmula Química 22]

en donde R1, R3 y R5 representan un átomo de hidrógeno, y R2 y R4 representan un grupo alcoxilo que tiene de 12 a 30 átomos de carbono. En la fórmula, RZ es un grupo representado por la siguiente fórmula y que se une al C-terminal de un péptido o un aminoácido,

[Fórmula Química 23]

en donde R7 representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo bencilo o un grupo bencilo alcoxi-sustituido, y Re representa un átomo de hidrógeno, un grupo fenilo o un grupo fenilo alcoxi-sustituido.

[0046] En la fórmula antes descrita, R2 y R4 más preferentemente tienen un número de átomos de carbono de 18 a 22.

[0047] En la fórmula antes descrita, RX es, más preferentemente, un grupo hidroximetilo, un grupo aminometilo o un grupo mercaptometilo, aún más preferentemente un grupo hidroximetilo.

[0048] El compuesto incluido en la fórmula antes descrita es, preferentemente, alcohol 3,5-didocosiloxibencílico, 3,5-didocosiloxibencilamina ó 3,5-didocoxiloxibenciltiol, aún más preferentemente alcohol 3,5-didocosiloxibencílico ó 3,5-didocosiloxibenlamina, con la mayor preferencia alcohol 3,5-didocosiloxibencílico representado por la siguiente fórmula.

[Fórmula Química 24]

[0049] Para la unión del compuesto antes descrito al C-terminal de un péptido o un aminoácido, en la presente invención también pueden usarse métodos utilizados de forma general en la síntesis de péptidos sin limitaciones, y, por ejemplo, la unión se puede llevar a cabo por esterificación usando DIPCI.

3-4. Portador D

[0050] Un compuesto que tiene la siguiente estructura:

[Fórmula Química 25]

en donde X es un halógeno, Y es un entero de 8 a 12 y Z es un entero de 17 a 29.

[0051] En la fórmula antes descrita, X es preferentemente F ó Cl, más preferentemente F.

[0052] Un compuesto representado por la siguiente fórmula es el más preferible.

[Fórmula Química 26]

en donde X es F ó Cl.

[0053] Para la unión del compuesto antes descrito al C-terminal de un péptido o un aminoácido, en la presente invención también pueden usarse métodos utilizados de forma general en la síntesis de péptidos sin limitaciones, y, por ejemplo, la unión se puede llevar a cabo por esterificación usando un catalizador básico.

3-5. Portador E

[0054] Un compuesto que tiene la siguiente estructura:

[Fórmula Química 27]

en donde X representan cada uno de ellos independientemente un entero de 7 a 21.

[0055] El alcohol 2-(3,4,5-trioctadeciloxibencil)-4-metoxibencílico representado por la siguiente fórmula es el más preferible.

Fórmula Química 28]

[0056] Para la unión del compuesto antes descrito al C-terminal de un péptido o un aminoácido, en la presente invención también pueden usarse métodos utilizados de forma general en la síntesis de péptidos sin limitaciones, y, por ejemplo, la unión se puede llevar a cabo por esterificación usando DIPCI.

3-6. Portador F

[0057] Un compuesto que tiene la siguiente estructura:

[Fórmula Química 29]

[0058] La bis-(4-docosiloxifenil)-metilamina representada por la siguiente fórmula es la más preferible.

[Fórmula Química 30]

[0059] Para la unión del compuesto antes descrito al C-terminal de un péptido o un aminoácido, en la presente invención también pueden usarse métodos utilizados de forma general en la síntesis de péptidos sin limitaciones, y, por ejemplo, la unión se puede llevar a cabo por amidación usando DIPCI/HOBt.

4. Método de producción del péptido

[0060] El método de síntesis peptídica de la presente invención se puede usar adecuadamente en un método de producción peptídica que utilice un portador capaz de repetir de manera reversible el estado disuelto y el estado insolubilizado.

[0061] El método de síntesis peptídica de la presente invención comprende las etapas que se definen en las reivindicaciones. Algunas etapas que se enumeran aquí se describen posteriormente de forma más detallada.

(I) Etapa de acoplamiento

una etapa de condensación de un aminoácido o péptido N-Fmoc protegido con un aminoácido o péptido C-portador protegido en presencia de un agente de condensación, para obtener un péptido N-Fmoc-C-portador protegido,

(ii) una etapa de formación de un cuerpo captado de un éster activo de aminoácido, usando una alquilamina primaria o secundaria que tiene de 1 a 14 átomos de carbono o una amina aromática primaria o secundaria que tiene de 1 a 14 átomos de carbono o hidroxilamina (a lo que se hace referencia en lo sucesivo en la presente como captador de amina),

(iii) una etapa de eliminación de un grupo Fmoc del N-terminal de un péptido, para desproteger el N-terminal, (iv) una etapa de cristalización y separación de un portador al que está unido un péptido (péptido C-portador protegido), usando un disolvente pobre,

(v) una etapa de repetición de las etapas (i) a (v) antes descritas las veces necesarias, y

(vi) una etapa de eliminación del portador de un péptido, para efectuar la desprotección final.

Además, después de la etapa antes descrita (iv) también se puede añadir

(vii) una etapa de lavado del péptido C-portador protegido, cristalizado y separado, con un disolvente orgánico, y con esto, la eliminación de impurezas que incluyen el cuerpo captador de un éster activo de aminoácido es más completa.

[0062] A continuación se explicarán las etapas respectivas.

4-1. Etapa de acoplamiento

[0063] En esta etapa, por ejemplo, un aminoácido N-Fmoc protegido se mezcla con un péptido C-portador protegido, un aminoácido C-portador protegido o una amida de aminoácido C-portador protegido, y un agente de condensación (preferentemente, un agente de condensación y un agente de activación) en un disolvente, para obtener un péptido N-Fmoc-C-portador protegido en el que un residuo de aminoácido se alarga. Si se usa un péptido N-Fmoc protegido en lugar del aminoácido N-Fmoc protegido, se obtiene un péptido N-Fmoc-C-portador protegido en el que se alargan residuos de aminoácido en un número de residuos de aminoácido del péptido N-Fmoc protegido.

[0064] El método y el orden de adición de los componentes respectivo no está limitado en particular, y pueden usarse métodos utilizados habitualmente en una etapa de acoplamiento en síntesis peptídica.

[0065] La cantidad usada de un aminoácido N-Fmoc protegido o un péptido N-Fmoc protegido con respecto a un péptido C-portador protegido es habitualmente de 1.03 a 8 equivalentes, preferentemente de 1.01 a 4 equivalentes, más preferentemente de 1.05 a 2 equivalentes, de manera adicional preferentemente de 1.1 a 1.5 equivalentes con respecto al péptido C-portador protegido. Por debajo de este intervalo, tiende a quedar un péptido C-protegido sin reaccionar, y se produce fácilmente una supresión de un aminoácido. En el método de síntesis peptídica de la presente invención, ésteres activos de aminoácido sin reaccionar son captados (capturados) por un captador de amina que se adicionará posteriormente, y se pueden eliminar de manera sencilla usando un disolvente orgánico, después de la desprotección del N-terminal de un péptido N-Fmoc-C-portador protegido. De este modo, incluso si se usa una cantidad mayor de un aminoácido N-Fmoc protegido o péptido N-Fmoc protegido, no se produce el problema de que queden materiales en comparación con métodos convencionales.

[0066] Como agente de condensación, pueden usarse sin limitaciones también en la presente invención agentes de condensación usados de manera general en la síntesis de péptidos, y ejemplos de los mismos incluyen cloruro de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triacin-2-il)-4-metilmorfonio (DMT-MM), hexafluorofosfato de O-(benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HBTU), hexafluorofosfato de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HATU), hexafluorofosfato de O-(6-clorobenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HBTU(6-Cl)), tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (TBTU), tetrafluoroborato de O-(6-clorobenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (TCTU), hexafluorofosfato de (1-ciano-2-etoxi-2-oxoetilidenaminooxi)dimetilamino-morflino-carbenio (COMU), diisopropilcarbodiimida (DIPCI), diciclohexilcarbodiimida (DCC) y clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (WSC), y preferentemente es DMT-MM, HBTU, HA^tU ó COMU. La cantidad usada del agente de condensación es habitualmente de 0.7 a 1.5 equivalentes, preferentemente de 0.85 a 1.0 equivalentes con respecto al aminoácido N-Fmoc protegido.

[0067] En la etapa de acoplamiento, preferentemente se adiciona un agente de activación para provocar la reacción y suprimir reacciones colaterales, tales como la racemización. El agente de activación es un reactivo que convierte un aminoácido en el éster activo o anhídrido de ácido simétrico correspondiente, facilitando así la formación de un enlace peptídico (enlace amida), por coexistencia con un agente de condensación. Como agente de activación pueden usarse agentes de activación utilizados generalmente en la síntesis peptídica sin limitaciones también en la presente invención, y sus ejemplos incluyen HOBt, HOCt, HOAt, HOOBt, HOSu, HOPht, HONb, y pentafluorofenol, y se prefieren HOBt, HOOBt, HOCt, HOAt, HONb y HOSu. La cantidad usada del agente de activación es habitualmente de 0 a 4.0 equivalentes, preferentemente de 1.1 a 1.5 equivalentes con respecto al aminoácido N-Fmoc.

[0068] Como disolvente usado en la etapa de acoplamiento, también en la presente invención pueden usarse sin limitaciones disolventes utilizados de manera general en la síntesis peptídica, y sus ejemplos incluyen DMF, NMP, acetato de etilo, THF, acetonitrilo, cloroformo, cloruro de metileno y disolventes mixtos de los mismos, y se prefieren THF, DMF o mezclas de los mismos. La cantidad usada del disolvente es una cantidad tal que la concentración de disolución del péptido C-portador protegido es habitualmente de 0.3 M a 0.1 mM, preferentemente de 0.2 M a 1 mM.

[0069] Como temperatura de la reacción, también en la presente invención se usan temperaturas utilizadas generalmente en la síntesis peptídica, y, por ejemplo, la temperatura de la reacción está en un intervalo de habitualmente -20 a 40°C, preferentemente 0 a 30°C. El tiempo de reacción (un ciclo) es habitualmente de 0.5 a 30 horas.

4-2. Etapa de formación del cuerpo captado de éster activo de aminoácido mediante captador de amina [0070] El método de producción peptídica que usa la presente invención se caracteriza por que, después de una etapa de acoplamiento de aminoácidos, se adiciona un captador de amina al sistema de la reacción, y son captados (capturados) ésteres activos de aminoácido sin reaccionar.

[0071] El captador de amina que se puede usar en la presente invención incluye alquilaminas primarias o secundarias, aminas aromáticas primarias o secundarias o hidroxilamina. La alquilamina que se puede usar en la presente invención incluye, por ejemplo, alquilaminas que tienen de 1 a 14 átomos de carbono, y son preferibles alquilaminas que tienen de 2 a 10 átomos de carbono, son más preferibles las alquilaminas que tienen de 2 a 8 átomos de carbono, son aún más preferibles las alquilaminas que tienen de 3 a 4 átomos de carbono. La amina aromática que se puede usar en la presente invención incluye, por ejemplo, aminas aromáticas que tienen de 1 a 14 átomos de carbono, y son preferibles las aminas aromáticas que tienen de 6 a 10 átomos de carbono. Los captadores de amina específicos incluyen, por ejemplo, propilamina, metilamina, hexilamina, anilina, toluidina, 2,4,6-trimetilanilina, anisidina, fenetidina e hidroxilamina, y es preferible particularmente la propilamina.

[0072] La cantidad adicionada del captador de amina es, habitualmente, de 1 a 30 equivalentes, preferentemente de 1 a 15 equivalentes, más preferentemente de 2 a 6 equivalentes, aún más preferentemente de 3 a 4 equivalentes con respecto al equivalente del aminoácido restante teóricamente. Cuando la cantidad adicionada del captador de amina es inferior a este intervalo, la captación (captura) de ésteres activos de aminoácido resulta insuficiente, y, en la etapa subsiguiente, no se puede eliminar fácilmente un aminoácido o péptido N-Fmoc protegido, mientras que, cuando la cantidad es superior a este intervalo, la eliminación de captadores de amina sin reaccionar resulta difícil.

4-3. Etapa de desprotección del N-terminal

[0073] En el método de producción peptídica que usa el método de la presente invención, se efectúa la eliminación de un grupo Fmoc de un péptido N-Fmoc-C-portador protegido después de captar (capturar) un éster activo de aminoácido en el sistema de la reacción mediante un captador de amina, para formar un cuerpo captado. Para la eliminación de un grupo Fmoc del N-terminal, también en la presente invención pueden usarse sin limitaciones métodos de eliminación utilizados generalmente en la síntesis peptídica. La eliminación se puede efectuar usando, por ejemplo, DBU y piperidina. Después de este procedimiento, se puede llevar a cabo un lavado en agua con una solución acuosa de cloruro de amonio, una solución acuosa de cloruro de sodio o con ambas soluciones mencionadas.

4-4. Etapa de cristalización y separación del péptido protegido con portador

[0074] En el método de producción peptídica que usa el método de la presente invención, un péptido C-portador protegido del cual se ha eliminado un grupo Fmoc se puede insolubilizar (cristalizar) y separar. La insolubilización se puede llevar a cabo cambiando la composición de una solución que disuelve el péptido C-portador protegido. Las condiciones para la insolubilización (cristalización) se pueden seleccionar apropiadamente en función del tipo del portador a usar y el tipo y la longitud del péptido C-portador protegido sintetizado. Sus ejemplos incluyen medios que se muestran a continuación.

(Medios de cambio de la composición)

[0075] Como medios para cambiar la composición de una solución que se usan preferentemente en el método de la presente invención, se utilizan sin limitaciones particulares medios capaces de cambiar la composición de una solución que disuelve un péptido C-portador protegido. Los medios preferibles para cambiar la composición de una solución incluyen, por ejemplo, medios en los cuales se adiciona un disolvente pobre a una solución que disuelve un péptido C-portador protegido tal como esté o se adiciona un disolvente pobre después de concentrar el disolvente de la solución, para provocar la cristalización. En este caso, medios de concentración para destilar una parte o la totalidad de disolvente. Después de esto, el cristal precipitado se puede separar, por ejemplo, mediante filtración y separación centrífuga. Las impurezas separadas junto con el cristal se pueden retirar completamente del péptido C-portador protegido cristalizado, preferentemente lavando el cristal separado con un disolvente orgánico.

[0076] El disolvente pobre usado en la presente invención significa un disolvente en el que una amida de aminoácido C-protegida es soluble de manera deficiente, es decir, una amida de aminoácido C-protegida no se disuelve fácilmente o no se disuelve. En relación con la frase “amida de aminoácido C-protegida no se disuelve de manera sencilla o no se disuelve”, el disolvente pobre puede ser ventajosamente un disolvente que sea líquido a temperatura normal con el cual la solubilidad de una amida de aminoácido C-protegida sea inferior al 1% en masa a 25°C, y son preferibles el acetonitrilo, cualquier acetonitrilo acuoso proporcionado, metanol, cualquier metanol acuoso proporcionado y agua.

[0077] Tal como se ha descrito anteriormente, si se usa el método de la presente invención, el proceso desde la reacción de condensación (reacción de acoplamiento) a la reacción de desprotección puede llevarse a cabo en síntesis en 1 recipiente.

4-5. Etapa de desprotección final

[0078] Eliminando un portador en el C-terminal de un péptido C-portador protegido que tiene un número deseado de residuos de aminoácido en la etapa de desprotección final, puede obtenerse como objetivo final un péptido.

[0079] El método de eliminación de un portador en el C-terminal no tiene limitaciones en particular, y pueden usarse métodos de desprotección conocidos de por sí.

[0080] Por ejemplo, puede utilizarse un método de desprotección que use TFA, y, más específicamente, es preferible realizar la desprotección con ácido trifluoroacético a entre un 50 y un 100% cuando se usa Ka, con ácido trifluoroacético a entre un 1 y un 100% cuando se usa Kb, con ácido trifluoroacético a entre un 95 y un 100% cuando se usa Kc, con ácido trifluoroacético a entre un 1 y un 100% cuando se usan el portador D y el portador E, y con ácido trifluoroacético a entre un 95 y un 100% cuando se usa el portador F.

[0081] El péptido resultante como objetivo final se puede aislar y purificar de acuerdo con métodos utilizados normalmente en la química de los péptidos. Por ejemplo, la mezcla de la reacción se puede someter a un lavado con extracción, a cristalización o a cromatografía, para aislar y purificar un péptido como objetivo final.

[0082] Aunque el tipo de péptido a producir con el método de síntesis peptídica de la presente invención no está limitado en particular, es preferible que el número de residuos de aminoácido del péptido sea, por ejemplo, de en torno a docenas o inferior. El péptido obtenido con el método de síntesis peptídica de la presente invención se puede usar en diversos campos igual que los péptidos sintéticos y péptidos naturales existentes o desconocidos, y los campos incluyen, por ejemplo, medicinas, alimentación, cosméticos y materiales electrónicos.

[Ejemplos]

[0083] En lo sucesivo se muestra el método de síntesis que utiliza péptidos que presentan secuencias que se muestran a continuación a título de ejemplo, aunque la presente invención no se limita a ellos.

(péptido A) H-Lys(Boc)Ala-Okb

(péptido B) Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-Met-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-IIe-Gly-OH

(péptido C) H-Gln(Trt)-Ser(YMe,MePro)-Gly-Leu-Gly-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Phe-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-OKb (péptido d ) H-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH

(péptido e ) H-Ala-Gln(Trt)-Ser(^MeMePro)-Gly-Leu-Gly-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Phe-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Leu-OKb

(péptido F) Fmoc-Ser(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Phe-Gly-OH

(péptido G) HChH-Ser(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Phe-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Met-Asp(Ot-Bu)-Arg(Pbf)-Ile-Gly-Ala-Gln(Trt)-Ser(YMe MePro)-Gly-Leu-Gly-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Phe-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-OKb

(péptido H) H-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Ser-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH (7Cys-23Cys, enlace SS)

(péptido I) H-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OKb

(péptido J) Fmoc-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-OH

(péptido K) Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-OH

(péptido L) H-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OKb

(péptido M) H-D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH (péptido N) H-Lys(Boc)-Pro-Pro-Ala-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Pro-Arg(Pbf)-OKb

(péptido O) Fmoc-Lys(Boc)Leu-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-OH

(péptido P) Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser(n-Octanoil)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-OH

(péptido Q) Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser(n-Octanoil)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Pro-Pro-Ala-Lys(Boc)-Leu Gln(Trt)-Pro-Arg(Pbf)-OKb

(péptido R) H-Gly-Ser-Ser(n-Octanoil)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gln-Lys-Leu-Gln-Gln-Arg-Lys-Glu-Ser-Lys-Lys-Pro-Pro-Ala-Lys-Leu-Gln-Pro-Arg-OH

[0084] En la presente memoria descriptiva y los ejemplos que se describen a continuación, se usan las siguientes abreviaturas.

AAs: uno o más residuos de aminoácido cualesquiera

AAx: cualquier residuo de aminoácido

Boc: tert-butoxicarbonilo

COMU (hexafluorofosfato de 1-ciano-2-etoxi-2-oxoetilidenaminooxi)dimetilamino-morfolino-carbenio

CPME: ciclopentil metil éter

DBU: 1,8-diazabiciclo[5.4.0]-7-undeceno

DCM: diclorometano

DIPCI: diisopropilcarbodiimida

DMAP: N,N-dimetil-4-aminopiridina

DMF: N,N-dimetilformamida

DMT-MM: cloruro de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfonio EDT: 1,2-etanoditiol

HATU: hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio

HBTU: hexafluorofosfato de O-(benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio

HOAt: 1-hidroxi-7-azabenzotriazol

HOBt: 1-hidroxibbenzotriazol

Ka: 3,4,5-trioctadeciloxibencilo

Kb: 2,4-didocoxiloxibencilo

Kc: 3,5-didocoxiloxibencilo

Me: metilo

Oxima: acetato de ciano(hidroxiimino)etilo

Pbf: 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo

Su: succinimidilo

tBu: tert-butilo

TFA: ácido trifluoroacético

TFE: 2,2,2-trifluoroetanol

THF: tetrahidrofurano

TIS: triisopropilsilano

WSC HCl: clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida

(Método de síntesis general)

[0085] A continuación se muestra métodos de síntesis general usados en los presentes ejemplos.

(1) Método de síntesis general de de-Fmoc (supresión de Fmoc)

[0086]

[Fórmula Química 31]

Piperidina,DBU

Fmoc-AAs-OKb ------------------------- ►- HCI'H-AAs-OKb

THF,DMF

[0087] Se disolvió material de partida, sin procesar, en una mezcla de THF:DMF (9/1) para obtener una concentración de 0.05 M, y se adicionaron piperidina (1.5 equiv) y DBU (1 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se adicionó ácido clorhídrico concentrado hasta que el pH de la mezcla de la reacción llegó a en torno a 6 y el disolvente se destiló a presión reducida. En el residuo se adicionó una mezcla de acetonitrilo:agua = 9:1 y el precipitado depositado se filtró, y se suspendió y lavó con un líquido mixto de acetonitrilo:agua = 9:1, adicionalmente, se efectuó un lavado en suspensión con acetonitrilo, y el sólido resultante se secó a presión reducida, para obtener un cuerpo de-Fmoc.

(2) Método de síntesis general por condensación de aminoácido

[0088]

[Fórmula Química 32]

DMT-MM,DIPEA

HCI-H-AAs-OKb Fmoc-AAxOH ---------------► Fmoc-AAx-AAs-OKb

THF,DMF

[0089] Se disolvieron materiales sin procesar de partida en una mezcla de THF:DMF (9/1) para obtener una concentración de 0.05 M, y se adicionaron Fmoc-AAx-OH (1.3 equiv), DMT-MM (1.13 equiv) y DIPEA (1.2 equiv), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. El disolvente se destiló a presión reducida, en el residuo se adicionó acetonitrilo y el precipitado depositado se filtró, se efectuó dos veces un lavado en suspensión con acetonitrilo, y el sólido resultante se secó a presión reducida, para obtener un condensado de aminoácido.

[0090] A continuación se muestran métodos de desprotección en presencia de un captador de amina característico en el método de la presente invención, usado en los ejemplos de la presente invención. Se muestran ejemplos que usan propilamina como ejemplo del captador de amina.

(3) Método de desprotección por condensación en 1 recipiente con adición de captador de amina

[0091]

[Fórmula Química 33]

1) DMT-MM,DIPEA

2) Captador

3) Piperidina,DBU

H C I-H -A A s -O K b F m o c -A A x -O H ------------------ ► HCI ■—A A x—A A s —OKb T H F ,D M F

[0092] Se disolvieron materiales sin procesar de partida en una mezcla de THF:DMF (9/1) para obtener una concentración de 0.05 M, y se adicionaron Fmoc-AAx-OH (1.3 equiv), DMT-MM (1.13 equiv) y DIPEA (1.13 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Como captador de amina, se adicionó propilamina (1:2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se adicionaron HOBT (1 equiv), piperidina (1,5 equiv) y DBU (8 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se adicionó ácido clorhídrico concentrado hasta que el pH de la mezcla de la reacción llegó a en torno a 6 y el disolvente se destiló a presión reducida. En el residuo se adicionó un líquido mixto de acetonitrilo:agua=1:1 y el precipitado depositado se filtró, y se suspendió y lavó con una mezcla de acetonitrilo:agua=9:1, adicionalmente, se efectuó un lavado en suspensión con acetonitrilo, y el sólido resultante se secó a presión reducida, para obtener un condensado de aminoácido.

(4) Método de desprotección por condensación en 1 solo recipiente y en el que se adiciona captador de amina y se efectúa un lavado con solución acuosa de cloruro de amonio

[0093]

[Fórmula Química 34]

1) DMT-MM,DIPEA

2) Captador

3) Piperidina,DBU

HCI ■ H-AAs-OKb Fmoc-AAx-OH --------------- ► HCI ■ -AAx-AAs-OKb THF.DMF

Se disolvieron materiales sin procesar de partida en un líquido mixto de THF:DMF (9:1) para obtener una concentración de 0.05 M, y se adicionaron Fmoc-AAx-OH (1.3 equiv), DMT-MM (1.13 equiv) y DIPEA (1.13 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Como captador de amina, se adicionó propilamina (1.2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se adicionaron HOBT (1 equiv), piperidina (1.5 equiv) y DBU (8 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se adicionó ácido clorhídrico concentrado hasta que el pH de la mezcla de la reacción llegó a en torno a 6. Se adicionó a la mezcla de la reacción una solución de solución acuosa de cloruro de amonio saturada:agua = 1:2 en una cantidad del doble del disolvente de reacción, y el líquido se lavó y se separó, y se desechó la capa acuosa. Además, se adicionó una solución de solución salina saturada:agua = 1:2 en una cantidad el doble del disolvente de la reacción, y el líquido se lavó y se separó, y se desechó la capa acuosa. Además, se adicionó solución salina saturada en una cantidad del doble del disolvente de la reacción, y el líquido se lavó y se separó, y se desechó la capa acuosa. La capa orgánica resultante se mantuvo a presión reducida y el disolvente se destiló. En el residuo se adicionó una mezcla de acetonitrilo:agua = 1:1 y el precipitado depositado se filtró, y se suspendió y lavó con una mezcla de acetonitrilo:agua = 9:1, adicionalmente, se efectuó un lavado en suspensión con acetonitrilo, y el sólido resultante se secó a presión reducida, para obtener un condensado de aminoácido.

[0094] Seguidamente, se muestra un método de desprotección (corte) de un portador usado en la presente invención con respecto a un péptido.

(5) Método de desprotección general del grupo protector Kb

[0095]

[Fórmula Química 35]

TFA,TFE

Fmoc-AAs-OKb -------------------------- Fmoc-

DCM

[0096] Un material sin procesar se disolvió en DCM para obtener una concentración de 0.01 M, y se adicionó TFE en una cantidad del 1/10 del DCM, adicionalmente, se adicionó TFA en una cantidad del 1/100 del DCM y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. El precipitado se filtró, y el filtrado se ajustó a un pH=9 con DIPEA, y el disolvente se destiló a presión reducida. En el residuo se adicionó agua y el precipitado depositado se filtró, el sólido resultante se disolvió en THF y tolueno, y a continuación, se llevó a cabo una destilación a presión reducida. Se repitió tres veces un lavado en suspensión con la adición de diisopropil éter al sólido resultante, y el sólido resultante se secó a presión reducida, para obtener un cuerpo sin protección de Kb.

[0097] A continuación se muestra la síntesis peptídica que usa el método de la presente invención.

(Ejemplo 1) Síntesis del intermedio (compuesto 2)

Síntesis del compuesto 1

[0098]

[Fórmula Química 36]

DIPCI,DMAP

Fmoc-Ala-OH Kb-OH ---------------► Fmoc-Ala-OKb

CH2CI2

1

[0099] Se disolvió alcohol 2,4-didocosiloxibencílico (expresado como “Kb-OH”) (3.79 g, 5.00 mmol) en DCM (50 ml), y se adicionaron Fmoc-Ala-OH (2,34 g, 7.50 mmol, 1.5 equiv), DIPCI (1169 Ml, 7.50 mmol, 1.5 equiv) y DMAP (31 mg, 0.25 mmol, 0.05 equiv), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se adicionó propilamina (411 Ml, 5.00 mmol, 1.0 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. El precipitado se filtró, y el filtrado se destiló a presión reducida. En el residuo se adicionó MeOH y el precipitado depositado se filtró, se efectuó dos veces un lavado en suspensión con MeOH, se efectuó un lavado en suspensión con acetonitrilo, y el sólido resultante se secó a presión reducida, para obtener un compuesto 1 (5.02 g, 95.5%).

Síntesis del compuesto 2

[0100]

Piperidina,DBU

Fmoc-Ala-OKb --------------------------- HCI'H

THF,DMF

[0101] El compuesto 1 (5.00 g, 4.76 mmol) se disolvió en una mezcla de THF (86 ml) y DMF (10 ml), y se adicionaron piperidina (707 mL, 7.14 mmol, 1.5 equiv) y DBU (712 mL, 4.76 mmol, 1 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se adicionó ácido clorhídrico concentrado hasta que el pH de la mezcla de la reacción llegó a en torno a 6 y el disolvente se destiló a presión reducida. En el residuo se adicionó una mezcla de acetonitrilo:agua=9:1 y el precipitado depositado se filtró, y se suspendió y lavó con una mezcla de acetonitrilo:agua=9:1, adicionalmente, se efectuó un lavado en suspensión con acetonitrilo, y el sólido resultante se secó a presión reducida, para obtener un compuesto 2 (4.05 g, 98.3%).

(Ejemplo Comparativo 1) Síntesis en dos etapas de H-Lys(Boc)Ala-OKb (compuesto 4) Síntesis del Compuesto 3 [0102]

[Fórmula Química 37]

DMT-MM.DIPEA

HCI-H-Ala-OKb Fmoc-Lys(Boc)-OH --------------► Fmoc-Lys(Boc)Ala-OKb

THF,DMF

2 3

[0103] El compuesto 2 (86 mg, 0.1 mmol) obtenido en el Ejemplo 1 se disolvió en una mezcla de THF (2 ml) y DMF (0.2 ml), y se adicionaron Fmoc-Lys(Boc)-OH (61 mg, 0.13 mmol, 1.3 equiv), DMT-MM (32 mg, 0.113 mmol, 1.13 equiv) y DIPEA (21 ^mL, 0.12 mmol, 1.2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. El disolvente se destiló a presión reducida, en el residuo se adicionó acetonitrilo y el precipitado depositado se filtró, se efectuó dos veces un lavado en suspensión en acetonitrilo, y el sólido resultante se secó a presión reducida, para obtener un compuesto 3 (138.5 mg, cuant).

Síntesis del compuesto 4

[0104]

[Fórmula Química 38]

Piperidina,DBU

Fmoc-Lys( HCI-H-Lys(Boc)Ala-OKb

4

[0105] El compuesto 3 (119 mg, 0.093 mmol) se disolvió en una mezcla de THF (2 ml) y DMF (0.2 ml), y se adicionaron piperidina (14 ^L, 0.14 mmol, 1.5 equiv) y DBU (28 ^L, 0.28 mmol, 2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se adicionó ácido clorhídrico concentrado hasta que el pH de la mezcla de la reacción llegó a en torno a 6 y el disolvente se destiló a presión reducida. En el residuo se adicionó una mezcla de acetonitrilo:agua=1:1 y el precipitado depositado se filtro, y se suspendió y lavó con una mezcla de acetonitrilo:agua=9:1, adicionalmente, se efectuó un lavado en suspensión con acetonitrilo, y el sólido resultante se secó a presión reducida, para obtener un compuesto 4 (92.5 mg, 90.7%).

(Ejemplo 2) Síntesis de H-Lys(Boc)Ala-OKb (compuesto 4) con adición de captador de amina -(1)

[0106]

[Fórmula Química 39]

1) DMT-MM,DIPEA

2) Captador

3) Piperidina,DBU

HCI-H-Ala-OKb Fmoc-Lys(Boc)-OH --------------- ► HCI-H-Lys(Boc)Ala-OKb

THF,DMF

2 4

[0107] El compuesto 2 (173 mg, 0.2 mmol) obtenido en el Ejemplo 1 se disolvió en una mezcla de THF (4 ml) y DMF (0.4 ml), y se adicionaron Fmoc-Lys(Boc)-OH (122 mg, 0.26 mmol, 1.3 equiv), DMT-MM (65 mg, 0.226 mmol, 1.13 equiv) y DlPEA (42 ^L, 0.24 mmol, 1.2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Como captador de amina, se adicionó propilamina (19.7 ^L, 0.24 mmol, 1.2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se adicionaron HOBT (30.6 mg, 0.26 mmol, 1 equiv), piperidina (30 ^L, 0.3 mmol, 1.5 equiv) y DBU (239 ^L, 1.6 mmol, 8 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se adicionó ácido clorhídrico concentrado hasta que el pH de la mezcla de la reacción llegó a en torno a 6 y el disolvente se destiló a presión reducida. En el residuo se adicionó una mezcla de acetonitrilo:agua=1:1 y el precipitado depositado se filtró, y se suspendió y lavó con una mezcla de acetonitrilo:agua=9:1, adicionalmente, se efectuó un lavado en suspensión con acetonitrilo, y el sólido resultante se secó a presión reducida, para obtener un compuesto 4 (92.5 mg, 90.7%).

(Ejemplo 3) Síntesis de H-Lys(Boc)Lys(Boc)Ala-OKb (compuesto 5) con adición de captador de amina [Fórmula Química 40]

[0108]

1) DMT-MM,DIPEA

2) Captador

3) Piperidina,DBU

HCI-H-Lys(Boc)Ala-OKb Fmoc-Lys(Boc)-OH ---------------HCI-H-Lys(Boc)Lys

THF,DMF

4 5

[0109] El compuesto 4 (109 mg, 0.1 mmol) obtenido en el Ejemplo 2 se disolvió en una mezcla de THF (2 ml) y DMF (0.2 ml), y se adicionaron Fmoc-Lys(Boc)-OH (61 mg, 0.13 mmol, 1.3 equiv), DMT-MM (32 mg, 0.113 mmol, 1.13 equiv) y DIPEA (21 ^L, 0.12 mmol, 1.2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Como captador de amina, se adicionó propilamina (9.9 ^L, 0.12 mmol, 1.2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se adicionaron piperidina (15 ^L, 0.15 mmol, 1.5 equiv) y DBU (105 ^L, 1.4 mmol, 7 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de esto, se efectuó el mismo procedimiento que en el Ejemplo 2, para obtener un compuesto 5 (115.2 mg, 87.2%).

(Ejemplo 4) Síntesis de H-Lys(Boc)Ala-OKb (compuesto 4) con la adición de captador de amina -(2)

[0110]

[Fórmula Química 41]

1) HBTU,HOBt, DIPEA

2) Captador

3) Piperidina,DBU

HCI-H-Ala-OKb Fmoc-Lys(Boc)-OH -------------- ► HCI ■ H-Lys(Boc)Ala-OKb

THF,DMF

2 4

El compuesto 2 (86 mg, 0.1 mmol) obtenido en el Ejemplo 1 se disolvió en una mezcla de THF (2 ml) y DMF (0.2 ml), y se adicionaron Fmoc-Lys(Boc)-OH (61 mg, 0.13 mmol, 1.3 equiv), HBTU (44 mg, 0.113 mmol, 1.13 equiv), HOBt (18 mg, 0.113 mmol, 1.13 equiv) y DIPEA (87 ^L, 0.5 mmol, 5 equiv), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Como captador de amina, se adicionó propilamina (9.9 ^L, 0.12 mmol, 1.2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se adicionaron piperidina (15 ^L, 0.15 mmol, 1.5 equiv) y DBU (120 ^L, 1.6 mmol, 8 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de esto, se efectuó el mismo procedimiento que en el Ejemplo 2, para obtener un compuesto 4 (109.2 mg, 99.9%).

(Ejemplo 5) Síntesis de H-Lys(Boc)Ala-OKb (compuesto 4) con la adición de captador de amina -(3)

[0111]

[Fórmula Química 42]

1) HATU,HOAt, DIPEA

2) captador

3) Piperidina,DBU

HCI ■ H-Ala-OKb Fmoc-Lys(Boc)-OH ---------------► HCI ■ H-Lys(Boc)Ala-OKb

THF,DMF

2 4

[0112] El compuesto 2 (86 mg, 0.1 mmol) obtenido en el Ejemplo 1 se disolvió en una mezcla de THF (2 ml) y DMF (0.2 ml), y se adicionaron Fmoc-Lys(Boc)-OH (61 mg, 0.13 mmol, 1.3 equiv), HATU (44 mg, 0.113 mmol, 1.13 equiv), HOAt (16 mg, 0.113 mmol, 1.13 equiv) y DIPEA (87 ^L, 0.5 mmol, 5 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Como captador de amina, se adicionó propilamina (9.9 ^L, 0.12 mmol, 1.2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se adicionaron piperidina (15 ^L, 0.15 mmol, 1.5 equiv) y DBU (120 ^L, 1.6 mmol, 8 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de esto, se efectuó el mismo procedimiento que en el Ejemplo 2, para obtener un compuesto 4 (103.5 mg, 94.7%).

(Ejemplo 6) Síntesis de H-Lys(Boc)Ala-OKb (compuesto 4) con la adición de captador de amina -(4)

[0113]

[Fórmula Química 43]

1) COMU,Oxima, DIPEA

2) Captador

3) Piperidina,DBU

HCI -H-Ala-OKb Fmoc-Lys(Boc)-OH ---------------► HCI-H-Lys(Boc)Ala-OKb

THF,DMF

2 4

[0114] El compuesto 2 (86 mg, 0.1 mmol) obtenido en el Ejemplo 1 se disolvió en una mezcla de THF (2 ml) y DMF (0.2 ml), se adicionaron Fmoc-Lys(Boc)-OH (61 mg, 0.13 mmol, 1.3 equiv), COMU (50 mg, 0.113 mmol, 1.13 equiv), Oxima (17 mg, 0.113 mmol, 1.13 equiv) y DIPEA (87 ^jL, 0.5 mmol, 5 equiv), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Como captador de amina, se adicionó propilamina (9.9 ^jL, 0.12 mmol, 1.2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se adicionaron piperidina (15 j L, 0.15 mmol, 1.5 equiv) y DBU (120 ^jL, 1.6 mmol, 8 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de esto, se efectuó el mismo procedimiento que en el Ejemplo 2, para obtener un compuesto 4 (105.7 mg, 96.7%).

(Ejemplo 7) Síntesis de H-Lys(Boc)Ala-OKb (compuesto 4) con la adición de captador de amina -(5)

[0115] El compuesto 2 (86 mg, 0.1 mmol) obtenido en el Ejemplo 1 se disolvió en una mezcla de THF (2 ml) y DMF (0.1 ml), se adicionaron Fmoc-Lys(Boc)-OH (61 mg, 0.13 mmol, 1.3 equiv), DMT-MM (32 mg, 0.113 mmol, 1.13 equiv) y DIPEA (21 j L, 0.12 mmol, 1.2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Como captador de amina, se adicionó propilamina (2.5 j L, 0.03 mmol, 0.3 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se adicionaron HOBT (30.6 mg, 0.26 mmol, 1 equiv), piperidina (30 j L, 0.3 mmol, 1.5 equiv) y DBU (239 j L, 1.6 mmol, 8 equiv), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de esto, se efectuó el mismo procedimiento que en el Ejemplo 2, para obtener un compuesto 4 (105.3 mg, 96.3%).

(Ejemplo 8) Síntesis de H-Lys(Boc)Ala-OKb (compuesto 4) con la adición de captador de amina -(6)

[0116] El compuesto 2 (86 mg, 0.1 mmol) obtenido en el Ejemplo 1 se disolvió en una mezcla de THF (2 ml) y DMF (0.1 ml), se adicionaron Fmoc-Lys(Boc)-OH (61 mg, 0.13 mmol, 1.3 equiv), DMT-MM (32 mg, 0.113 mmol, 1.13 equiv) y DIPEA (21 j L, 0.12 mmol, 1.2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Como captador de amina, se adicionó propilamina (4.9 ^jL, 0.06 mmol, 0.6 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se adicionaron HOBT (30.6 mg, 0.26 mmol, 1 equiv), piperidina (30 j L, 0.3 mmol, 1.5 equiv) y DBU (239 j L, 1.6 mmol, 8 equiv), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de esto, se efectuó el mismo procedimiento que en el Ejemplo 2, para obtener un compuesto 4 (105.6 mg, 96.6%).

(Ejemplo 9) Síntesis de H-Lys(Boc)Ala-OKb (compuesto 4) con la adición de captador de amina -(7)

[0117] El compuesto 2 (86 mg, 0.1 mmol) obtenido en el Ejemplo 1 se disolvió en una mezcla de THF (2 ml) y DMF (0.1 ml), se adicionaron Fmoc-Lys(Boc)-OH (61 mg, 0.13 mmol, 1.3 equiv), DMT-MM (32 mg, 0.113 mmol, 1.13 equiv) y DIPEA (21 j L, 0.12 mmol, 1.2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Como captador de amina, se adicionó propilamina (19.7 j L, 0.24 mmol, 2.4 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se adicionaron HOBT (30.6 mg, 0.26 mmol, 1 equiv), piperidina (30 ^jL, 0.3 mmol, 1.5 equiv) y DBU (239 ^jL, 1.6 mmol, 8 equiv), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de esto, se efectuó el mismo procedimiento que en el Ejemplo 2, para obtener un compuesto 4 (105.6 mg, 96.6%).

(Ejemplo 10) Síntesis de H-Lys(Boc)Ala-OKb (compuesto 4) con la adición de captador de amina -(8)

[0118] El compuesto 2 (86 mg, 0.1 mmol) obtenido en el Ejemplo 1 se disolvió en una mezcla de THF (2 ml) y DMF (0.1 ml), se adicionaron Fmoc-Lys(Boc)-OH (61 mg, 0.13 mmol, 1.3 equiv), DMT-MM (32 mg, 0.113 mmol, 1.13 equiv) y DIPEA (21 ^jL, 0.12 mmol, 1.2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Como captador de amina, se adicionó propilamina (37 ^jL, 0.45 mmol, 4.5 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se adicionaron HOBT (30.6 mg, 0.26 mmol, 1 equiv), piperidina (30 ^jL, 0.3 mmol, 1.5 equiv) y DBU (239 ^jL, 1.6 mmol, 8 equiv), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de esto, se efectuó el mismo procedimiento que en el Ejemplo 2, para obtener un compuesto 4 (105.2 mg, 96.2%).

(Ejemplo 11) Síntesis de H-Lys(Boc)Ala-OKb (compuesto 4) con la adición de captador de amina -(9)

[0119] El compuesto 2 (86 mg, 0.1 mmol) obtenido en el Ejemplo 1 se disolvió en una mezcla de THF (2 ml) y DMF (0.1 ml), se adicionaron Fmoc-Lys(Boc)-OH (61 mg, 0.13 mmol, 1.3 equiv), DMT-MM (32 mg, 0.113 mmol, 1.13 equiv) y DIPEA (21 j L, 0.12 mmol, 1.2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Como captador de amina, se adicionó solución acuosa de metilamina al 50% (10.3 ^jL, 0.12 mmol, 1.2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se adicionaron HOBT (30.6 mg, 0.26 mmol, 1 equiv), piperidina (30 j L, 0.3 mmol, 1.5 equiv) y DBU (239 ^jL, 1.6 mmol, 8 equiv), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de esto, se efectuó el mismo procedimiento que en el Ejemplo 2, para obtener un compuesto 4 (101.6 mg, 93.0%).

(Ejemplo 12) Síntesis de H-Lys(Boc)Ala-OKb (compuesto 4) con la adición de captador de amina -(10)

[0120] El compuesto 2 (86 mg, 0.1 mmol) obtenido en el Ejemplo 1 se disolvió en una mezcla de THF (2 ml) y DMF (0.1 ml), se adicionaron Fmoc-Lys(Boc)-OH (61 mg, 0.13 mmol, 1.3 equiv), DMT-MM (32 mg, 0.113 mmol, 1.13 equiv) y DIPEA (21 ^jL, 0.12 mmol, 1.2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Como captador de amina, se adicionó solución acuosa de hidroxilamina al 50% (7.1 j L, 0.12 mmol, 1.2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se adicionaron HOBT (30.6 mg, 0.26 mmol, 1 equiv), piperidina (30 j L, 0.3 mmol, 1.5 equiv) y DBU (239 ^jL, 1.6 mmol, 8 equiv), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de esto, se efectuó el mismo procedimiento que en el Ejemplo 2, para obtener un compuesto 4 (104.1 mg, 95.2%).

(Ejemplo 13) Síntesis de H-Lys(Boc)Ala-OKb (compuesto 4) con la adición de captador de amina -(11)

[0121] El compuesto 2 (86 mg, 0.1 mmol) obtenido en el Ejemplo 1 se disolvió en una mezcla de THF (2 ml) y DMF (0.1 ml), se adicionaron Fmoc-Lys(Boc)-OH (61 mg, 0.13 mmol, 1.3 equiv), DMT-MM (32 mg, 0.113 mmol, 1.13 equiv) y DIPEA (21 ^jL, 0.12 mmol, 1.2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Como captador de amina, se adicionó hexilamina (15.9 ^jL, 0.12 mmol, 1.2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se adicionaron HOBT (30.6 mg, 0.26 mmol, 1 equiv), piperidina (30 j L, 0.3 mmol, 1.5 equiv) y DBU (239 j L, 1.6 mmol, 8 equiv), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de esto, se efectuó el mismo procedimiento que en el Ejemplo 2, para obtener un compuesto 4 (104.6 mg, 95.7%).

(Ejemplo 14) Síntesis de H-Lys(Boc)Ala-OKb (compuesto 4) con la adición de captador de amina -(12)

[0122] El compuesto 2 (86 mg, 0.1 mmol) obtenido en el Ejemplo 1 se disolvió en una mezcla de THF (2 ml) y DMF (0.1 ml), se adicionaron Fmoc-Lys(Boc)-OH (61 mg, 0.13 mmol, 1.3 equiv), DMT-MM (32 mg, 0.113 mmol, 1.13 equiv) y DIPEA (21 j L, 0.12 mmol, 1.2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Como captador de amina, se adicionó decilamina (15.9 j L, 0.12 mmol, 1.2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se adicionaron HOBT (30.6 mg, 0.26 mmol, 1 equiv), piperidina (30 ^jL, 0.3 mmol, 1.5 equiv) y DBU (239 ^jL, 1.6 mmol, 8 equiv), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de esto, se efectuó el mismo procedimiento que en el Ejemplo 2, para obtener un compuesto 4 (107.5 mg, 98.4%).

(Ejemplo Comparativo 2) Síntesis de H-Lys(Boc)Ala-OKb (compuesto 4) con la adición de captador de amina no incluido en la presente invención -(13)

[0123] El compuesto 2 (86 mg, 0.1 mmol) obtenido en el Ejemplo 1 se disolvió en una mezcla de THF (2 ml) y DMF (0.1 ml), se adicionaron Fmoc-Lys(Boc)-OH (61 mg, 0.13 mmol, 1.3 equiv), DMT-MM (32 mg, 0.113 mmol, 1.13 equiv) y DIPEA (21 ^jL, 0.12 mmol, 1.2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Como captador de amina, se adicionó 2-aminoetanol (7.2 ^jL, 0.12 mmol, 1.2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se adicionaron HOBT (30.6 mg, 0.26 mmol, 1 equiv), piperidina (30 ^jL, 0.3 mmol, 1.5 equiv) y DBU (239 j L, 1.6 mmol, 8 equiv), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de esto, se efectuó el mismo procedimiento que en el Ejemplo 2, para obtener un compuesto 4 (103.6 mg, 94.8%).

(Ejemplo 15) Síntesis de H-Lys(Boc)Ala-OKb (compuesto 4) con la adición de captador de amina -(14)

[0124] El compuesto 2 (86 mg, 0.1 mmol) obtenido en el Ejemplo 1 se disolvió en una mezcla de THF (2 ml) y DMF (0.1 ml), se adicionaron Fmoc-Lys(Boc)-OH (187 mg, 0.4 mmol, 4.0 equiv), DMT-MM (100 mg, 0.36 mmol, 3.6 equiv) y DIPEA (21 ^jL, 0.12 mmol, 1.2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Como captador de amina, se adicionó propilamina (99 ^jL, 1.2 mmol, 12 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se adicionaron HOBT (30.6 mg, 0.26 mmol, 1 equiv), piperidina (30 j L, 0.3 mmol, 1.5 equiv) y DBU (239 j L, 1.6 mmol, 8 equiv), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de esto, se efectuó el mismo procedimiento que en el Ejemplo 2, para obtener un compuesto 4 (104.2 mg, 95.3%).

(Ejemplo 16) Medición de la pureza de H-Ala-OKb (compuesto 2), H-Lys(Boc)Ala-OKb (compuesto 4) and H-Lys(Boc)Lys(Boc)Ala-OKb (compuesto 5) por HPLC

(1) Preparación de las muestras (común)

[0125] Se pesó y disolvió en 0.5 mL de THF cada 1 mg de los compuestos obtenidos en los Ejemplos y los Ejemplos Comparativos antes descritos, y se adicionaron una solución de THF Fmoc-OSu 0.1 M (20 ^jL, 0.02 mmol, aproximadamente 2 equiv) y una solución de THF DIPEA 0.2 M (10 j L, 0.02 mmol, aproximadamente 2 equiv) y las mezclas se agitaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de un secado al aire, las soluciones se suspendieron y se lavaron con acetonitrilo tres veces, y se secaron a presión reducida. En los sólidos resultantes se adicionó 1 ml de THF para HPLC (que no contenía estabilizador) y las soluciones resultantes se filtraron a través de un filtro de membrana de 0.2 jm, y los filtrados resultantes se usaron como muestras para la HPLC y se sometieron a medición del HPLC.

(2) Medición de HPLC

[0126] Se efectuó la medición de HPLC de acuerdo con las siguientes condiciones.

<HPLC de fase reversa>

[0127] Columna: columna C4 de fase reversa

Fase móvil A: THF:CH3CN = mezcla 8:2

Fase móvil B: agua que contiene TFA al 0.1%

Caudal: 0.2 ml/min

Gradiente: A, del 70% al 100% durante 30 minutos

Longitud de onda de detección: 254 nm

<HPLC de fase normal>

[0128] Columna: columna de gel de sílice de fase normal

Fase móvil A: acetato de etilo

Fase móvil B: N-hexano

Caudal: 0.2 ml/min

Gradiente: fase móvil A, del 0% al 100% durante 30 minutos

Longitud de onda de detección: 280 nm

[0129] Los resultados se muestran en la siguiente Tabla 1.

[Tabla 1]

(Ejemplo 17) Síntesis de HCl^H-Ile-Gly-OKb (compuesto 14)

Síntesis del compuesto 6

[0130]

[Fórmula Química 44]

DIPCI,DMAP

Fmoc-Gly-OH Kb-OH

Fmoc-Gly-OKb

6

[0131] Se disolvió alcohol 2,4-didocosiloxibencílico (expresado como “KbOH”) (1.51 g, 2.00 mmol) en DCM (50 ml), y se adicionaron Fmoc-Gly-OH (892 mg, 3.0 mmol, 1.5 equiv), DIPCI (467 pl, 3.0 mmol, 1.5 equiv) y DMAP (12 mg, 0.1 mmol, 0.05 equiv), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. El precipitado se filtró, y el filtrado se destiló a presión reducida. En el residuo se adicionó MeOH y el precipitado depositado se filtró, se efectuó dos veces un lavado en suspensión con MeOH, se efectuó un lavado en suspensión con acetonitrilo, y el sólido resultante se secó a presión reducida, para obtener un compuesto 6 (2.01 g, 97.1%).

Síntesis del compuesto 7

[0132]

[Fórmula Química 45]

Piperidina,DBU

Fmoc-

ly-OKb

[0133] El compuesto resultante 6 (2.01 g, 0.1 mmol) se sometió a una operación de de-Fmoc de acuerdo con un método de síntesis general de de-Fmoc, para obtener un compuesto 7 (1.84 g, cuant).

Síntesis del compuesto 8

[0134]

[Fórmula Química 46]

DMT-MM,DIPEA

HCI-H-Gly-OKb Fmoc-Ile-OH --------------- ► Fmoc-Ile-Gly-OKb THF,DMF

7 8

[0135] El compuesto resultante 7 (1.84 g, 0.1 mmol) se condensó con Fmoc-Ile-OH de acuerdo con un método de condensación general de aminoácido, para obtener un compuesto 8 (1.99 g, 88.9%).

Síntesis del compuesto 9

[0136]

[Fórmula Química 47]

Piperidina,DBU

Fmoc-Il

HCI-H-Ile-G ly-OKb

[0137] El compuesto resultante 8 (662 mg, 0.58 mmol) se sometió a una operación de de-Fmoc de acuerdo con un método de síntesis general de de-Fmoc, para obtener un compuesto 9 (505 mg, 91%).

(Ejemplo Comparativo 3) Síntesis de Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-Met-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Ile-Gly-OKb (compuesto 10) [0138] Se introdujeron los siguientes aminoácidos en el compuesto 9 obtenido en el Ejemplo 17 por repetición de un método de condensación general de aminoácidos y un método de síntesis general de de-Fmoc, para obtener un compuesto 10.

Tercer residuo: Fmoc-Arg(Pbf)-OH

Cuarto residuo: Fmoc-Asp(OtBu)-OH

Quinto residuo: Fmoc-Met-OH

Sexto residuo: Fmoc-Arg(Pbf)-OH

Séptimo residuo: Fmoc-Gly-OH

(Ejemplo Comparativo 4) Síntesis de Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-Met-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Ile-Gly-OH (compuesto 11)

[0139] El compuesto 10 obtenido en el Ejemplo Comparativo 2 se sometió a una operación de de-Kb de acuerdo con un método de desprotección general del grupo protector Kb, para obtener un compuesto 11. El compuesto resultante se sometió a medición de LC-MS, para observar 1643.7 [M+Gly+H+], 1995.2 [M+Arg(Pbf)+H+], 1758.1 [M+Asp(OtBu)+H+] y 1718.0 [M+Met+H+].

(Ejemplo 18) Síntesis de Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-Met-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Ile-Gly-OKb (compuesto 10) mediante el método de desprotección por condensación en 1 recipiente con la adición de captador de amina

[0140] Se introdujeron los siguientes aminoácidos en el compuesto 9 obtenido en el Ejemplo 17 por repetición de un método de desprotección por condensación con la adición de un captador de amina, para obtener un compuesto 10. Introducción de

Tercer residuo: Fmoc-Arg(Pbf)-OH

Cuarto residuo: Fmoc-Asp(OtBu)-OH

Quinto residuo: Fmoc-Met-OH

Sexto residuo: Fmoc-Arg(Pbf)-OH

Séptimo residuo: Fmoc-Gly-OH, que se efectuó de acuerdo con un método general de condensación de aminoácidos.

(Ejemplo 19) Síntesis de Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-Met-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Ile-Gly-OH (compuesto 11)

[0141] El compuesto 10 obtenido en el Ejemplo 18 se sometió a una operación de de-Kb de acuerdo con un método de desprotección general del grupo protector Kb, con el fin de obtener un compuesto 11. El compuesto resultante se sometió a medición de LC-MS, pero no se observaron 1643.7 [M+Gly+H+], 1995.2 [M+Arg(Pbf)+H+], 1758.1 [M+Asp(OtBu)+H+] y 1718.0 [M+Met+H+].

(Ejemplo 20) Síntesis de H-Gly-Leu-Gly-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Phe-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Okb (compuesto 14)

Síntesis del compuesto 12

[0142]

[Fórmula Química 48]

DIPCI.DMAP

Fmoc-Tyr(tBu)-OH Kb-OH -------------- ► Fmoc-Tyr(tBu)-OKb

CFI2CI2 i o

[0143] Se disolvió alcohol 2,4-didocosiloxibencílico (expresado como “Kb-OH”) (3.79 g, 5.00 mmol) en DCM (50 ml), se adicionaron Fmoc-Tyr(tBu)-OH (3.45 g, 7.50 mmol, 1.5 equiv), DIPCI (1169 ^L, 7.50 mmol, 1.5 equiv) y DmAp (31 mg, 0.25 mmol, 0.05 equiv), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se adicionó propilamina (811 ^L, 10.0 mmol, 2.0 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. El precipitado se filtró, y el filtrado se destiló a presión reducida. En el residuo se adicionó MeOH y el precipitado depositado se filtró, se efectuó dos veces un lavado en suspensión con MeOH, se efectuó un lavado en suspensión con acetonitrilo, y el sólido resultante se secó a presión reducida, para obtener un compuesto 12 (6.06 g, cuant).

Síntesis del compuesto 13

[0144]

[Fórmula Química 49]

Piperidina,DBU

-Tyr(tBu)-OKb

13

[0145] El compuesto 12 (6.06 g, 5.00 mmol) se disolvió en una mezcla de THF (86 ml) y DMF (10 ml), se adicionaron piperidina (743 ^L, 7.5 mmol, 1.5 equiv) y DBU (748 ^L, 5.00 mmol, 1 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se adicionó ácido clorhídrico concentrado hasta que el pH de la mezcla de la reacción llegó a en torno a 6. A la mezcla de la reacción se le adicionó una solución de solución salina saturada:agua=2:1 en una cantidad el doble del disolvente de la reacción, y la mezcla se lavó y se separó, a continuación, se desechó la capa acuosa, adicionalmente, la misma se lavó con solución salina saturada en una cantidad del doble del disolvente de la reacción y la mezcla se separó, y a continuación se desechó la capa acuosa. La capa orgánica resultante se mantuvo a presión reducida y el disolvente se destiló. En el residuo se adicionó una mezcla de acetonitrilo:agua=9:1 y se filtró el precipitado depositado, y el mismo se suspendió y lavó con una mezcla de acetonitrilo:agua=9:1, adicionalmente, se efectuó un lavado en suspensión con acetonitrilo, y el sólido resultante se secó a presión reducida, para obtener un compuesto 13 (4.70 g, 92.9%).

(Ejemplo 21) Síntesis de H-Ser(tBu)-Phe-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Okb (compuesto 14)

[0146] Se introdujeron los siguientes aminoácidos en el compuesto 13 mediante repetición de un método de desprotección por condensación en 1 solo recipiente y en el que se adiciona un captador de amina y se efectúa un lavado con una solución acuosa de cloruro de amonio, para obtener un compuesto 14.

Primer residuo: Fmoc-Arg(Pbf)-OH

Segundo residuo: Fmoc-Phe-OH

Tercer residuo: Fmoc-Ser(tBu)-OH

(Ejemplo 22) Síntesis de H-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Phe-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Okb (compuesto 15)

[0147] El compuesto resultante 14 (7.58 g, 4.43 mmol) se disolvió en THF para obtener una concentración de 0.05 M, y se adicionó DIPEA (1.93 ml, 11.1 mmol, 2.5 equiv). Fmoc-Asn(Trt)-OH (3.44 g, 5.76 mmol, 1.3 equiv), COMU (2.28 g, 5.32 mmol, 1.3 equiv) y Oxima (0.76 g, 5.32 mmol, 1.3 equiv) se disolvieron en 8.9 ml de DMF, y se adicionó DIPEA (1.93 ml, 11.1 mmol, 2.5 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 minutos. La mezcla resultante se adicionó a una solución de THF del compuesto 14, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Como captador de amina, se adicionó propilamina (728 pL, 8.86 mmol, 2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se adicionaron piperidina (658 pL, 6.65 mmol, 1.5 equiv) y DBU (4.64 ml, 31.0 mmol, 7 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se adicionó ácido clorhídrico concentrado hasta que el pH de la mezcla de la reacción llegó a en torno a 6. Se adicionó a la mezcla de la reacción una solución de solución acuosa de cloruro de amonio saturada:agua=1:2 en una cantidad del doble del disolvente de la reacción, y la mezcla se lavó y se separó, y se desechó la capa acuosa. Además, se adicionó una solución de solución salina saturada:agua=1:2 en una cantidad del doble del disolvente de la reacción, y la mezcla se lavó y se separó, y se desechó la capa acuosa. Además, se adicionó una solución salina saturada en una cantidad del doble del disolvente de la reacción, y la mezcla se lavó y se separó, y se desechó la capa acuosa. La capa orgánica resultante se mantuvo a presión reducida y el disolvente se destiló. En el residuo se adicionó una mezcla de acetonitrilo:agua=9:1 y el precipitado depositado se filtró, adicionalmente, se efectuó un lavado en suspensión con acetonitrilo, y el sólido resultante se secó a presión reducida, para obtener un compuesto 15 (8.74 g, 95.4%).

(Ejemplo 23) Síntesis de H-Gly-Leu-Gly-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Phe-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Okb (compuesto 16) [0148] Se introdujeron los siguientes aminoácidos en el compuesto resultante 15 mediante repetición de un método de desprotección por condensación en 1 solo recipiente y en el que se adiciona un captador de amina y se efectúa un lavado con una solución acuosa de cloruro de amonio, para obtener un compuesto 16.

Sexto residuo: Fmoc-Cys(Trt)-OH

Séptimo residuo: Fmoc-Gly-OH

Octavo residuo: Fmoc-Leu-OH

Noveno residuo: Fmoc-Gly-OH

(Ejemplo 24) Síntesis de H-Gln(Trt)-Ser(^Me,MePro)-Gly-Leu-Gly-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Phe-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Okb (compuesto 17)

[0149] El compuesto 16 (10.68 g, 4.06 mmol) obtenido en el Ejemplo 23 se disolvió en una mezcla de THF:DMF (9/1) para obtener una concentración de 0.05 M, se adicionaron Fmoc-Gln(Trt)-Ser(^Me,MePro)-OH (3.88 g, 5.28 mmol, 1.3 equiv), DMT-MM (1.30 g, 4.59 mmol, 1.13 equiv) y DIPEA (845 pL, 4.87 mmol, 1.2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Como captador de amina, se adicionó propilamina (665 pL, 8.12 mmol, 2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se adicionaron piperidina (601 pL, 6.09 mmol, 1.5 equiv) y DBU (6.05 ml, 40.6 mmol, 10 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se adicionó ácido clorhídrico concentrado hasta que el pH de la mezcla de la reacción llegó a en torno a 6. A la mezcla de la reacción se le adicionó una solución de solución acuosa de cloruro de amonio saturada:agua=1:2 en una cantidad del doble del disolvente de la reacción, y la mezcla se lavó y se separó, y se desechó la capa acuosa. Además, se adicionó una solución de solución salina saturada:agua=1:2 en una cantidad del doble del disolvente de la reacción, y la mezcla se lavó y se separó, y se desechó la capa acuosa. Además, se adicionó una solución salina saturada en una cantidad del doble del disolvente de la reacción, y el líquido se lavó y se separó, y se desechó la capa acuosa. La capa orgánica resultante se mantuvo a presión reducida y el disolvente se destiló. En el residuo se adicionó agua y el precipitado depositado se filtró, y se suspendió y lavó con n-hexano, y el sólido resultante se secó a presión reducida, para obtener un compuesto 17 (12.85 g, 100.0%). El compuesto resultante 17 se analizó por TLC (n-hexano:acetato de etilo=9:1), pero no se observó presencia de dibenzofulveno.

(Ejemplo 25) Síntesis de H-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH (compuesto 21)

Síntesis del compuesto 18

[0150]

[Fórmula Química 50]

DIPCI,DMAP

Fmoc-Arg(Pbf)-OH Ka-OH

Fmoc-Arg(Pbf)-OKa

18

[0151] Se disolvió alcohol 3,4,5-trioctadeciloxibencílico (expresado como “Ka-OH”) (9.14 g, 10.00 mmol) en DCM (100 ml), se adicionaron Fmoc-Arg(Pbf)-OH (9.73 g, 15.00 mmol, 1.5 equiv), DIPCI (2337 ^jL, 15.00 mmol, 1.5 equiv) y ^dM^aP (61 mg, 0.50 mmol, 0.05 equiv), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se adicionó propilamina (1644 j L, 20.0 mmol, 2.0 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. El precipitado se filtró, y el filtrado se destiló a presión reducida. En el residuo se adicionó MeOH y el precipitado depositado se filtró, se efectuó un lavado en suspensión con MeOH, adicionalmente, se efectuó un lavado en suspensión con acetonitrilo, y el sólido resultante se secó a presión reducida, para obtener un compuesto 18 (15.40 g, 99.7%).

Síntesis del compuesto 19

[0152]

[Fórmula Química 51]

Piperidina,DBU

Fmoc-Arg(Pbf)-OKa --------------HCP H-Arg(

18 THF,DMF 19

[0153] El compuesto 18 (15.40 g, 10.00 mmol) se disolvió en una mezcla de THF (179 ml) y DMF (20 ml), se adicionaron piperidina (1480 ^jL, 14.9 mmol, 1.5 equiv) y DBU (1490 ^jL, 9.96 mmol, 1 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se adicionó ácido clorhídrico concentrado hasta que el pH de la mezcla de la reacción llegó a en torno a 6. A la mezcla de la reacción se le adicionó una solución de solución salina saturada:agua=2:1 en una cantidad del doble del disolvente de la reacción, y la mezcla se lavó y se separó, a continuación, se desechó la capa acuosa, adicionalmente, la misma se lavó con solución salina saturada en una cantidad el doble del disolvente de la reacción y la mezcla se separó, y a continuación, se desechó la capa acuosa. La capa orgánica resultante se mantuvo a presión reducida y el disolvente se destiló. En el residuo se adicionó acetonitrilo y el precipitado depositado se filtró, y se suspendió y lavó con acetonitrilo, y el sólido resultante se secó a presión reducida, para obtener un compuesto 19 (14.39 g, cuant).

Síntesis del compuesto 20 (HCl^H-D-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(Pbf)-OKa)

[0154]

[Fórmula Química 52]

1) Fmoc-AAx-OH,agente condens.,medio auxil. condens.,DIPEA

2) n-Propilamina

3) Piperidina,DBU,HOBt

[0155] El compuesto 19 (13.52 g, 9.95 mmol) se sometió al siguiente método de manera repetida, para obtener un compuesto 20 (24.31 g, 81.6%).

[0156] Se disolvieron materiales de partida sin procesar en una mezcla de THF:DMF (9/1) para obtener una concentración de 0.05 M, se adicionaron Fmoc-AAx-OH (el equivalente se muestra en equivalente de AA en la tabla de las condiciones de la reacción), un agente de condensación mostrado en la siguiente tabla (el equivalente se muestra en equivalente de agente de condensación en la tabla de las condiciones de la reacción), un medio auxiliar de condensación mostrado en la siguiente tabla (el equivalente se muestra en equivalente de medio auxiliar de condensación en la tabla de las condiciones de la reacción) y DIPEA (el equivalente se muestra en equivalente de base en la tabla de las condiciones de la reacción), y se efectuó su reacción de condensación tal como se muestra en la tabla de las condiciones de reacción. Seguidamente, como captador de amina, se adicionó propilamina (el equivalente se muestra en equivalente de captador en la tabla de las condiciones de la reacción) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de esto, se adicionaron HOBt (el equivalente se muestra en equivalente de HOBt en la tabla de las condiciones de la reacción), piperidina (1.5 equiv) y DBU (el equivalente se muestra en equivalente de DBU en la tabla de las condiciones de la reacción) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Seguidamente, se adicionó ácido clorhídrico concentrado hasta que el pH de la mezcla de la reacción llegó a en torno a 6.

[0157] La primera solución de lavado mostrada en la tabla de las condiciones del lavado se adicionó en una cantidad el doble del disolvente de la reacción a la mezcla de la reacción, y la mezcla se lavó y se separó, y la capa acuosa se desechó. En caso necesario, se adicionó la segunda solución de lavado mostrada en la tabla de las condiciones de lavado en una cantidad del doble del disolvente de la reacción, y la mezcla se lavó y se separó, y la capa acuosa se desechó. Además, se adicionó solución salina saturada en una cantidad del doble del disolvente de la reacción, y la mezcla se lavó y se separó, y la capa acuosa se desechó. La capa orgánica resultante se mantuvo a presión reducida y el disolvente se destiló. En el residuo se adicionó un disolvente pobre mostrado en la tabla de las condiciones de lavado y el precipitado depositado se filtró, adicionalmente, se adicionó un disolvente de lavado en suspensión mostrado en la tabla de las condiciones de lavado y se efectuó un lavado en suspensión, y el sólido resultante se secó a presión reducida, para obtener un condensado de aminoácido.

T l 1

Síntesis del compuesto 21

[0158]

[Fórmula Química 53]

HCI ■ H-D-Arg(Pbf)-Arg(

Hyp-Gly-Ser(tBu)-D-T

H-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Ser-

Arg(Pbf)-OKa D-Tic-Oic-Arg-OH

20 21

El compuesto 2 (10.0 g, 3.1 mmol) se disolvió en 155 ml de una mezcla de TFA:TIS:agua=90:2.5:7.5, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de la reacción se filtró a través de Celite. El residuo de filtración se lavó con 30 ml de TFAy se filtró. Los filtrados resultantes se combinaron entre sí, y se colocaron en 1.85 L de isopropil éter frío mientras se sometían a agitación. El sólido resultante se filtró, y el residuo de la filtración adicionalmente se suspendió y se lavó con isopropil éter frío y se filtró, dos veces. El sólido resultante se secó, para obtener un compuesto 21 (5.17 g, Cuant, pureza de HPLC 77.36%). El compuesto resultante se midió por LC-MS, para observar 652.9 [M+2H+]/2.

(Ejemplo 26) Síntesis de H-Ala-Gln(Trt)-Ser(^Me,MePro)-Gly-Leu-Gly-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Phe-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-OKb (compuesto 22)

[0159] Se introdujo Fmoc-Ala-OH en el compuesto 17 obtenido en el Ejemplo 24 mediante un método de desprotección por condensación en 1 solo recipiente y en el que se adiciona un captador de amina y se efectúa un lavado con una solución acuosa de cloruro de amonio, para obtener un compuesto 22 (12.42 g, Cuant).

(Ejemplo 27) Síntesis de Fmoc-Ser(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Phe-Gly-OH (compuesto 26)

Síntesis del compuesto 23 (HCl ■ H-Gly-OKb)

[0160] Se usó Fmoc-Gly-OH de la misma manera que en el Ejemplo 17 sobre Kb-OH (7.57 g, 10.0 mmol), para obtener un compuesto 23 (7.90 g, 93.1%).

Síntesis del compuesto 24 (HCl ■ H-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Phe-Gly-OKb)

[0161]

[Fórmula Química 54]

DIPEA

2)

n-Propilamina

3) Piperidina,DBU

HCI ■ H-AAs-OKb Fmoc-AAx-OH ------------------------------► HCI-H-AAx-AAs-OKb

THF.DMF

Introducción de

Segundo residuo: Fmoc-Phe-OH

Tercer residuo: Fmoc-Cys(Trt)-OH

Cuarto residuo: Fmoc-Ser(tBu)-OH

Quinto residuo: Fmoc-Ser(tBu)-OH

Sexto residuo: Fmoc-Arg(Pbf)-OH

Séptimo residuo: Fmoc-Arg(Pbf)-OH

Octavo residuo: Fmoc-Leu-OH

[0162] Se introdujeron secuencialmente aminoácidos en el compuesto 23 (7.89 g, 9.25 mmol) repitiendo el siguiente método, para obtener un compuesto 24 (20.27 g, 85.5%).

[0163] Materiales de partida sin procesar se procesaron usando un método de desprotección por condensación en 1 solo recipiente y en el que se adiciona un captador de amina y se efectúa un lavado con una solución acuosa de cloruro de amonio (en este caso, se usan Fmoc-aminoácido (1.3 equiv) y DMT-MM (1.13 equiv), se omite el lavado con una solución acuosa de cloruro de amonio), para obtener un condensado de aminoácido.

Síntesis del compuesto 25 (Fmoc-Ser(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Phe-Gly-OKb)

[0164] Se introdujo Fmoc-Ser(tBu)-OH en el compuesto 24 (20.26 g, 7.91 mmol) mediante un método de síntesis general por condensación de aminoácido, para obtener un compuesto 25 (22.56 g, Cuant).

Síntesis del compuesto 26 (Fmoc-Ser(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Phe-Gly-OH)

[0165] Se aplicó un método de desprotección general del grupo protector Kb sobre el compuesto 25 (22.56 g, 7.80 mmol), para obtener un compuesto 26 (22.56 g, Cuant).

(Ejemplo 28) Síntesis de HCl ■ H-Ser(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Phe-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Met-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Ile-Gly-Ala-Gln(Trt)-Ser(^Me,MePro)-Gly-Leu-Gly-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Phe-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-OKb (compuesto 28)

Síntesis del compuesto 27 (HCl ■ H-Gly-Arg(Pbf)-Met-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Ile-Gly-Ala-Gln(Trt)-Ser(^Me,MePro)-Gly-Leu-Gly-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Phe-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-OKb)

[0166]

[Fórmula Química 55]

l)Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-Met-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Ile-Gly-OH,

HATU,HOAt,DIPEA HCl ■ H-Gly-Arg(Pbf)-Met-HCl ■ H-Ala-Gln(T rt)- 2) n-Propilamina Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Ile-Ser(^Me,Me Pro)-Gly- 3) Piperidina,DBU Gly-Ala-Gln(Trt)-

Leu-Gyl-Cys(T rt)-Asn(T rt)-
Ser(^Me,Me Pro)-Gly-

SeKtBu)-Phe-Arg(Pbf)- Leu-Gyl-Cys(T rt)-Asn(T rt)-Tyr(tBu)-OKb THF.DMF SerCtBu)-Phe-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-OKb

22

27

[0167] El compuesto 11 (11.33 g, 5.8 mmol, 1.5 equiv) obtenido en el Ejemplo 19 se disolvió en DMF (38.7 ml), y se adicionó THF (348 ml) para su dilución, y se adicionaron el compuesto 22 (12.42 g, 3.87 mmol, 1.0 equiv) obtenido en el Ejemplo 26, HATU (1.99 g, 5.22 mmol, 1.35 equiv), HOAt (711 mg, 5.22 mmol, 1.35 equiv) y DIPEA (3369 pL, 19.3 mmol, 5.0 equiv), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Como captador de amina, se adicionó propilamina (318 ^L, 3.87 mmol, 1 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Además, se adicionaron piperidina (575 ^L, 5.80 mmol, 1.0 equiv) y DBU (5.79 ml, 38.7 mmol, 10 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se adicionó ácido clorhídrico concentrado hasta que el pH de la mezcla de la reacción llegó a en torno a 6. Se adicionó a la mezcla de la reacción una solución de solución acuosa de cloruro de amonio saturada:agua=1:2 en una cantidad del doble del disolvente de reacción, y la mezcla se lavó y se separó, y la capa acuosa se desechó. Además, se adicionó una solución de solución salina saturada:agua=1:2 en una cantidad del doble del disolvente de la reacción, y la mezcla se lavó y se separó, y la capa acuosa se desechó. Además, se adicionó solución salina saturada en una cantidad del doble del disolvente de la reacción, y el líquido se lavó y se separó, y la capa acuosa se desechó. La capa orgánica resultante se mantuvo a presión reducida y el disolvente se destiló. En el residuo se adicionó una mezcla de acetonitrilo:agua=9:1 y el precipitado depositado se filtró, y se suspendió y lavó con acetonitrilo, y el sólido resultante se secó a presión reducida, para obtener un compuesto 27 (15.29 g, cuant).

Síntesis del compuesto 28 (HCl ■ H-Ser(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Phe-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Met-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Ile-Gly-Ala-Gln(Trt)-Ser(^Me,MePro)-Gly-Leu-Gly-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Phe-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-OKb)

[0168]

[Fórmula Química 56]

1)Fmoc-Ser(tBii)-Leii-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)~

Cys(Trt)-Phe-Gly-OH,

26 HCI-H-SeKtBu)-Leu-Arg(Pbf)-HCl ■ H-Gly-Arg(Pbf)-Met- HATU,HOAt,DIPEA er(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Ile- 2) n-Propilamina Arg(Pbf)-S

3) Piperidina,DBU Cy s(Trt)-P he-G ly-G ly-Arg(Pbf)-

Gly-Ala-Gln(Trt)-
Met-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Ile-

Ser(^Me,Me Pro)-Gly- Gly-Ala-Gln(Trt)-Le u~Gy l~Cy s(T rt)-As n(T rt)- THF,DMF Ser(í/^Me,Me Pro)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Arg(Pbf)- Leu-Gyl-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-OKb Ser(tBu)-Phe-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-OKb

27

28

[0169] Sobre el compuesto 27 (17.63 g, 3.87 mmol), se usó el compuesto 26 (12.47 g, 5.80 mmol, 1.5 equiv) obtenido en el Ejemplo 27 y el mismo se hizo reaccionar de la misma manera que para la síntesis del compuesto 27, con el fin de obtener un compuesto 28 (26.83 g, cuant).

(Ejemplo 29) Síntesis de H-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Ser-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH (7Cys-23Cys, enlace SS) (compuesto 30)

Síntesis del compuesto 29 (H-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Ser-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH)

[0170]

[Fórmula Química 57]

HCl ■ H-Ser(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Phe-Gly-Gly-Arg(Pbf)- H-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Met-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Ile- TFA,TIS,H20,EDT Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Gly-Ala-Gln(Trt)- -------------------------------► Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-GIn-SeKt/'Me.Me Pro)-Gly- Ser-Gly-Leu-Gyl-Cys-Asn-Leu-Gyl-Cys(T rt)-Asn(T rt)- Ser-Phe-Arg-Tyr-OH

Ser(tB u)-Ph e-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-OKb

28 29

[0171] El compuesto 28 (6.93 g, 1.0 mmol) se disolvió en 200 ml de una mezcla de TFA:TIS:agua:EDT=80:5:10:5, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. El líquido de la reacción se filtró a través de Celite, y el residuo de la filtración se lavó con 100 ml de TFA y se filtró. Los filtrados resultantes se combinaron entre sí, y se colocaron en 3.0 L de isopropil éter frío mientras se sometían a agitación. El sólido resultante se filtró, y el residuo de la filtración además se suspendió y se lavó con isopropil éter frío y se filtró, dos veces. El sólido resultante se secó, para obtener un compuesto 29 (3.90 g, Cuant, pureza de HPLC 55.22%).

Síntesis del compuesto 30 (H-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Ser-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ne-Gly-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH (7Cys-23Cys, enlace SS))

[0172]

[Fórmula Química 58]

H-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser

Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met- H-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-A -Ar -Il - l -Al - In- Aire Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-

30

29

[0173] El compuesto 29 (3.90 g, 1.0 mmol) se disolvió en 3.77 L de agua, y la solución se ajustó a un pH7.1 con piridina, y se agitó durante la noche. La mezcla de reacción resultante se liofilizó, para obtener un compuesto 30 (3.47 g, 92.2%, pureza de HPLC 65.07%). El compuesto resultante se midió por LC-MS, para observar 1027.2 [M+3H+]/3.

(Ejemplo 30) Síntesis de H-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OKb (compuesto 33) Síntesis del compuesto 31

[0174]

[Fórmula Química 59]

DIPCI.DMAP

Fmoc-Leu-OH Fmoc-Leu-OKb

3 ]

[0175] Se usó Fmoc-Leu-OH de la misma manera que en el Ejemplo 18 sobre Kb-OH (2.27 g, 3.00 mmol), para obtener un compuesto 31 (3.26 g, 99.6%).

Síntesis del compuesto 32

[0176]

[Fórmula Química 60]

Piperidina,DBU

Fmoc-Leu-OKb ------------- HCI" H-Le

31 THF,DMF 32

Se aplicó un método de síntesis general de de-Fmoc sobre el compuesto 31 (3.26 g, 2.98 mmol), para obtener un compuesto 32 (2.72 g, Cuant).

Síntesis del compuesto 33 (H-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OKb)

[0177]

[Fórmula Química 61]

1) DMT-MM,DIPEA

2) n-Propilamina

3) Piperidina,DBU

HCI-H-AAs-OKb Fmoc-AAx-OH ---------------------------------- ► HCI-H-AAx-AAs-OKb

THF,DMF

Introducción de

Segundo residuo: Fmoc-Tyr(tBu)-OH

Tercer residuo: Fmoc-Glu(OtBu)-OH

Cuarto residuo: Fmoc-Glu(OtBu)-OH

Quinto residuo: Fmoc-Pro-OH

Sexto residuo: Fmoc-Ile-OH

Séptimo residuo: Fmoc-Glu(OtBu)-OH

[0178] Se introdujeron secuencialmente aminoácidos en el compuesto 32 (2.70 g, 2.98 mmol) mediante repetición del siguiente método, para obtener un compuesto 33 (4.40 g, 77.7%).

[0179] Materiales de partida sin procesar se disolvieron en una mezcla de THF:DMF (9/1) para obtener una concentración de 0.05 M, se adicionaron Fmoc-aminoácido (1.3 equiv), DMT-MM (1.2 equiv) y DIPEA (1.2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Como captador de amina, se adicionó propilamina (2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se adicionaron HOBt (1 equiv) (solamente segundo residuo), piperidina (1.5 equiv) y DBU (7 equiv, para solamente el segundo residuo: 8 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se adicionó ácido clorhídrico concentrado hasta que el pH de la mezcla de la reacción llegó a en torno a 6. A la mezcla de la reacción se le adicionó una solución de solución salina saturada:agua=1:2 en una cantidad del doble del disolvente de reacción, y la mezcla se lavó y se separó, y la capa acuosa se desechó. Además, se adicionó solución salina saturada en una cantidad del doble del disolvente de reacción, y la mezcla se lavó y se separó, y se desechó la capa acuosa. La capa orgánica resultante se mantuvo a presión reducida y el disolvente se destiló. En el residuo se adicionó acetonitrilo y el precipitado depositado se filtró, y se suspendió y se lavó con acetonitrilo, y el sólido resultante se secó a presión reducida para obtener un condensado de aminoácido.

(Ejemplo 31) Síntesis de Fmoc-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-OH (compuesto 38) Síntesis del compuesto 34

[0180]

[Fórmula Química 62]

DIPCI,DMAP

Fmoc-Glu(OtBu)-OH Kb-OH ------------Fmoc-Glu(O

CH2GI2 34

[0181] Se usó Fmoc-Glu(OtBu)-OH de la misma manera que en el Ejemplo 18 sobre Kb-OH (3.41 g, 4.50 mmol), para obtener un compuesto 34 (5.05 g, 96.3%).

Síntesis del compuesto 35

[0182]

[Fórmula Química 63]

Piperidina,DBU

Fmoc-Glu(OtBu)-OKb ------------ HCI ■ H-Glu(

34 THF.DMF 35

[0183] Se aplicó un método de síntesis general de de-Fmoc sobre el compuesto 34 (5.04 g, 4.33 mmol), para obtener un compuesto 35 (4.24 g, Cuant).

Síntesis del compuesto 36 (HCl • H-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-OKb)

[0184]

[Fórmula Química 64]

1) Fmoc-AAx-OH,agente condens.,medio auxil. condens.,DIPEA

2) n-Propilamina

3) Piperidina,DBU,HOBt

HCI ■ H-AAs-OKb ---------------------------------► HCI-H-AAx-AAs-OKb

THF.DMF

[0185] El compuesto 35 (4.23 g, 4.33 mmol) se procesó de la misma manera que para la síntesis del compuesto 20, según la tabla de las condiciones de reacción y la tabla de las condiciones del lavado que se muestran a continuación, para obtener un compuesto 36 (7.05 g, 90.8%).

[Tabla 5]

Síntesis del compuesto 37

[0186]

[Fórmula Química 65]

1) Fmoc-Gly-OH,DMT-MM,DIPEA

2) n-Propilamina

HCI ■ H-Gly-Asn(Trt)-Gly- Fmoc-Gly-Gly-Asn(T rt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-OKb ------------------------ Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-OKb

36 THF.DMF 37

[0187] El Compuesto 36 (7.04 g, 3.90 mmol) se disolvió en una mezcla de THF (65 ml) y DMF (7.2 ml), se adicionaron Fmoc-Gly-OH (1.39 g, 4.68 mmol, 1.2 equiv), DMT-MM (1.20 g, 4.32 mmol, 1.11 equiv) y DIPEA (753 ^L, 4.32 mmol, 1.11 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Como captador de amina, se adicionó propilamina (888 ^L, 10.8 mmol, 2.77 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La capa orgánica resultante se mantuvo a presión reducida y el disolvente se destiló. En el residuo se adicionó una solución de acetonitrilo:agua=9:1 y la solución se enfrió, y el precipitado depositado se filtró, y se suspendió y lavó con acetonitrilo, adicionalmente, se efectuó un lavado en suspensión con acetonitrilo, y el sólido resultante se secó a presión reducida, para obtener un compuesto 37 (7.16 g, 90.4%).

Síntesis del compuesto 38 (Fmoc-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-OH)

[0188] Se aplicó un método de desprotección general del grupo protector Kb sobre el compuesto 37 (2.20 g, 1.09 mmol), para obtener un compuesto 38 (1.21 g, 83.0%).

(Ejemplo 32) Síntesis de Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-OH (compuesto 42)

Síntesis del compuesto 39 (HCI • H-Gly-OKb)

[0189] Se usó Fmoc-Gly-OH de la misma manera que en el Ejemplo 17 sobre Kb-OH (3.41 g, 4.5 mmol), para obtener un compuesto 39 (3.58 g, 90.2%).

Síntesis del compuesto 40 (HChH-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-OKb)

[0190]

[Fórmula Química 66]

1) DMT-MM,DIPEA

2) n-Propilamina

3) Piperidina,DBU

HCI-H-AAs-OKb Fmoc-AAx-OH -------------------------------- ► HCI ■ H-AAx-AAs-OKb

THF.DMF

Introducción del

Segundo residuo: Fmoc-Gly-OH

Tercer residuo: Fmoc-Pro-OH

Cuarto residuo: Fmoc-Arg(Pbf)-OH

Quinto residuo: Fmoc-Pro-OH

[0191] Se introdujeron secuencialmente aminoácidos en el compuesto 39 (3.33 g, 3.91 mmol) repitiendo el siguiente método, para obtener un compuesto 40 (5.11 g, 85.7%).

[0192] Materiales de partida sin procesar se disolvieron en un líquido de mezcla de THF:DMF (9/1) para obtener una concentración de 0.05 M, se adicionaron Fmoc-aminoácido (1.3 equiv), DMT-MM (1.2 equiv) y DIPEA (1.2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Como captador de amina, se adicionó propilamina (2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se adicionaron HOBt (1 equiv), piperidina (1.5 equiv) y DBU (7 equiv, solamente para el segundo residuo: 8 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se adicionó ácido clorhídrico concentrado hasta que el pH de la mezcla de la reacción llegó a en torno a 6. A la mezcla de la reacción se le adicionó una solución de solución salina saturada:agua=1:2 en una cantidad del doble del disolvente de reacción, y la mezcla se lavó y se separó, y la capa acuosa se desechó. Además, se adicionó solución salina saturada en una cantidad del doble del disolvente de reacción, y la mezcla se lavó y se separó, y se desechó la capa acuosa. La capa orgánica resultante se mantuvo a presión reducida y el disolvente se destiló. En el residuo se adicionó acetonitrilo y el precipitado depositado se filtró, y se suspendió y se lavó con acetonitrilo, y el sólido resultante se secó a presión reducida para obtener un condensado de aminoácido.

Síntesis del compuesto 41

[0193]

[Fórmula Química 67]

1) Fmoc-D-Phe-OH,DMT-MM,DIPEA

2) n-Propilamina

HCI-H-Pro-Arg(pbf)- ______________ Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-

Pro-Gly-Gly-OKb Pro-Gly-Gly-OKb

THF,DMF 41

[0194] El Compuesto 40 (5.10 g, 3.38 mmol) se disolvió en una mezcla de THF (61 ml) y DMF (6.7 ml), se adicionaron Fmoc-D-Phe-OH (1.70 g, 4.39 mmol, 1.3 equiv), DMT-MM (1.12 g, 4.05 mmol, 1.2 equiv) y DIpEa (705 ^L, 4.05 mmol, 1.2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Como captador de amina, se adicionó propilamina (555 ^L, 6.75 mmol, 2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La capa orgánica resultante se mantuvo a presión reducida y el disolvente se destiló. En el residuo se adicionó una solución de acetonitrilo:agua=9:1 y la solución se enfrió, y el precipitado depositado se filtró, y se suspendió y lavó con acetonitrilo, adicionalmente, se efectuó un lavado en suspensión con acetonitrilo, y el sólido resultante se secó a presión reducida, para obtener un compuesto 41 (5.92 g, 95.2%).

Síntesis del compuesto 42 (Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-OH)

[0195] Se aplicó un método de desprotección general del grupo protector Kb sobre el compuesto 41 (1.84 g, 1.0 mmol), para obtener un compuesto 42 (0.942 g, 85.3%).

(Ejemplo 33) Síntesis de H-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(Ot-Bu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OKb (compuesto 44)

Síntesis del compuesto 43 (HCl • H-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ne-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OKb)

[0196]

[Fórmula Química 68]

l)Fmoc-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-OH.

38

HATU,HOAt,DIPEA

2) n-Propilamina HCI ■ H_Gly~Gly~Asn(Trt)-HCI ■ H-Glu(OtBu)-Ile- 3) piPeridina,DBU Gly-Asp(OtBu)-Phe-

Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-

Glu(0tBu)-Glu(0tBuHle-

Tyr(tBu)-Leu-OKb THFDMF Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OKb

33

43

[0197] El compuesto 38 (573 mg, 0.45 mmol, 1.5 equiv)obtenido en el Ejemplo 31 se usó y se hizo reaccionar sobre el compuesto 33 (568 mg, 0.3 mmol) obtenido en el Ejemplo 30, de la misma manera que para la síntesis del compuesto 27, y se le aplicó un lavado líquido-líquido, y en el residuo concentrado se adicionó una mezcla de acetonitrilo:agua=9:1 y el precipitado depositado se separó por centrifugación, y se suspendió y se lavó con metanol, adicionalmente, se efectuó un lavado en suspensión con acetonitrilo, y el sólido resultante se secó a presión reducida, para obtener un compuesto 43 (725 mg, 82.6%).

Síntesis del compuesto 44 (HCI • H-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(Ot-Bu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OKb)

[0198]

[Fórmula Química 69

[0199] El compuesto 42 (405 mg, 0.33 mmol, 1.5 equiv) obtenido en el Ejemplo 32 se usó y se aplicó sobre el compuesto 43 (715 mg, 0.245 mmol), de la misma manera que para la síntesis del compuesto 32, con el fin de obtener un compuesto 44 (863 mg, 93.2%).

(Ejemplo 34) Síntesis de H-D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ne-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH (compuesto 45)

[0200]

[Fórmula Química 70]

HCI ■ H-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)- H-D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly- Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-

Asn(Trt)- Gly-Asp(OtBu)-Phe-

Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-

Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile- ^{^} Glu-Tyr-Leu-OH

Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OKb

44 45

[0201] El compuesto 44 (300 mg, 0.079 mmol) se disolvió en 8 ml de una mezcla de TFA:TIS:agua=95:2.5:2.5, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La mezcla de la reacción se filtró a través de Celite. El residuo de filtración se lavó con 3 ml de TFA y se filtró. Los filtrados resultantes se combinaron entre sí, y se colocaron en 120 mL de isopropil éter frío mientras se sometían a agitación. El sólido resultante se separó por centrifugación, y el residuo de la filtración además se suspendió y se lavó con isopropil éter frío y se separó por centrifugación, cuatro veces. El sólido resultante se secó, para obtener un compuesto 45 (147.7 mg, 77.4%, pureza de HPLC 74.49%).

(Ejemplo 35) Síntesis de H-Lys(Boc)-Pro-Pro-Ala-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Pro-Arg(Pbf)-OKb (compuesto 50) Síntesis del compuesto 46

[0202]

[Fórmula Química 71]

DIPCI,DMAP

Fmoc-Arg(Pbf)-OH Kb-OH -------------Fmoc-Arg

CH2CI2 46

[0203] Se usó Kb-OH (2.27 g, 3.0 mmol), Fmoc-Arg(Pbf)-OH (2.92 g, 4.5 mmol, 1.5 equiv) de la misma manera que en el Ejemplo 17, para obtener un compuesto 46 (4.20 g, Cuant).

Síntesis del compuesto 47

[0204]

[Fórmula Química 72]

Piperidina,DBU

Fmoc-Arg(Pbf)-OKb HCI-H-Arg(Pbf)-OKb

46 THF,DMF 47

[0205] Se aplicó un método de síntesis general de de-Fmoc sobre el compuesto 46 (4.15 g, 2.99 mmol), para obtener un compuesto 47 (3.51 g, 97.6%).

Síntesis del compuesto 48

[0206]

[Fórmula Química 73]

1) Fmoc-Pro-OH,DMT-MM,DIPEA

2) n-Propilamina

HCI ■ H-Arg(Pbf)_OKb

47 THF,DMF 48

[0207] El Compuesto 47 (3.5 g, 2.91 mmol) se disolvió en una mezcla de THF (52 ml) y DMF (5.8 ml), se adicionaron Fmoc-Pro-OH (1.28 g, 3.78 mmol, 1.3 equiv), DMT-MM (943 mg, 3.41 mmol, 1.17 equiv) y DIPEA (913 pL, 5.24 mmol, 1.8 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Como captador de amina, se adicionó propilamina (479 pL, 5.82 mmol, 2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La mezcla de reacción resultante se mantuvo a presión reducida y el disolvente se destiló. En el residuo se adicionó acetonitrilo y el precipitado depositado se filtró, y se suspendió y lavó con acetonitrilo, y el sólido resultante se secó a presión reducida, para obtener un compuesto 48 (4.24 g, 98.0%).

Síntesis del compuesto 49

[0208]

[Fórmula Química 74]

HOBt,Piperidina,DBU

Fmoc-Pro-Arg(Pbf)-OKb -------------------------------- ► HCI-H-Pro-Arg(Pbf)-OKb

48 THF,DMF 49

[0209] El compuesto 48 (4.23 g, 2.85 mmol) se disolvió en un líquido de mezcla de THF (51 ml) DMF (6 ml), se adicionaron HOBt (388 mg, 2.85 mmol, 1.0 equiv), piperidina (423 ^L, 4.27 mmol, 1.5 equiv) y DBU (852 ^L, 5.69 mmol, 2 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se adicionó ácido clorhídrico concentrado hasta que el pH de la mezcla de la reacción llegó a en torno a 6. A la mezcla de la reacción se le adicionó una solución de solución acuosa de cloruro de amonio saturada:agua=1:2 en una cantidad del doble del disolvente de la reacción, y la mezcla se lavó y se separó, y la capa acuosa se desechó. Además, se adicionó una solución de solución salina saturada:agua=1:2 en una cantidad del doble del disolvente de la reacción, y la mezcla se lavó y se separó, y la capa acuosa se desechó. Además, se adicionó solución salina saturada en una cantidad del doble del disolvente de la reacción, y la mezcla se lavó y se separó, y la capa acuosa se desechó, y el disolvente se destiló a presión reducida. Al residuo se le adicionó acetonitrilo y el precipitado depositado se filtró, adicionalmente, se suspendió y se lavó con acetonitrilo, y el sólido resultante se secó a presión reducida, para obtener un compuesto 49 (3.75 g, Cuant).

Síntesis del compuesto 50 (H-Lys(Boc)-Pro-Pro-Ala-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Pro-Arg(Pbf)-OKb)

[0210]

[Fórmula Química 75]

1) Fmoc-AAx-OH,agente condens.,medio auxil. condens.,DIPEA

2) n-Propilamina

3) Piperidina,DBU,HOBt

HCI-H-AAs-OKb ---------------------------------► HCI ■ H-AAx-AAs-OKb

THF,DMF

[0211] El compuesto 49 (3.69 g, 2.84 mmol) se procesó de la misma manera que para la síntesis del compuesto 20, de acuerdo con las condiciones de reacción y las condiciones de lavado mostradas en las siguientes tablas, con el fin de obtener un compuesto 50 (6.02 g, 79.9%).

(Ejemplo 36) Síntesis de Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-OH (compuesto 55)

Síntesis del compuesto 51

[0212]

[Fórmula Química 76]

DIPCI,DMAP

Fmoc-|_ys(Boc)-OH

------------- Fmoc-Lys

C H 2C I2 5 ]

[0213] Sobre Kb-OH (1.52 g, 2.0 mmol), se usó Fmoc-Lys(Boc)-OH de la misma manera que en el Ejemplo 18, para obtener un compuesto 51 (2.48 g, Cuant).

Síntesis del compuesto 52

[0214]

[Fórmula Química 77]

Piperidina,DBU

Fm oc-Lys(B oc)-O K b

H C I-H -Lys(B oc)-O K b

51 THF.DMF 52

[0215] Se aplicó un método de síntesis general de de-Fmoc sobre el compuesto 51 (2.41 g, 1.99 mmol), para obtener un compuesto 52 (2.01 g, 98.9%).

Síntesis del compuesto 53 (HCI • H-Leu-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-OKb)

[0216]

[Fórmula Química 78]

1) Fmoc-AAx-OH,agente condens.,medio auxil. condens.,DIPEA

2) n-Propilamina

3) Piperidina,DBU,HOBt

HC I-H -A A s-O K b --------------------------------------► HCI ■ H-AAx-AAs-OKb

THF.DMF

[0217] El compuesto 52 (2.01 g, 1.96 mmol) se procesó de la misma manera que para la síntesis del compuesto 20, de acuerdo con la tabla de las condiciones de reacción y la tabla de las condiciones de lavado mostradas a continuación, con el fin de obtener un compuesto 53 (4.38 g, 78.2%).

Síntesis del compuesto 54

[0218]

[Fórmula Química 79]

1) Fmoc-Lys(Boc)-OH,DMT-MM,DIPEA

2) n-Propilamina

HCI-H-Leu-Gln(Trt)-Gln(Trt)- Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)- --------------------------------------- ► Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-OKb THF DMp Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-OKb

53 54

[0219] Se actuó sobre el compuesto 53 (4.36 g, 1.53 mmol) de la misma manera que para el compuesto 48 usando Fmoc-Lys(Boc)-OH (934 mg, 1.99 mmol, 1.3 equiv) y DIPEA (481 ^L, 2.76 mmol, 1.8 equiv), para obtener un compuesto 54 (5.11 g, Cuant).

Síntesis del compuesto 55 (Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-OH)

[0220] Se aplicó un método de desprotección general del grupo protector Kb sobre el compuesto 54 (2.55 g, 0.764 mmol), para obtener un compuesto 55 (2.26 g, Cuant).

(Ejemplo 37) Síntesis de Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser(n-octanoyl)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-OH (compuesto 61)

Síntesis del compuesto 56

[0221]

[Fórmula Química 80]

DIPCI.DMAP

Fmoc-Gln(Trt)-OH Kb-OH Fmoc-Gln(Trt)-OKb

C H 2 C I2 50

[0222] Se usó Fmoc-Gln(Trt)-OH sobre Kb-OH (2.27 g, 3.0 mmol) de la misma manera que en el Ejemplo 18, para obtener un compuesto 56 (4.21 g, Cuant).

Síntesis del compuesto 57

[0223]

[Fórmula Química 81]

Piperidina,DBU

Fmoc-Gln(Trt)-OKb

HCI-H-Gln(Trt)-OKb

56 THF,DMF 57

[0224] Se aplicó un método de síntesis general de de-Fmoc sobre el compuesto 56 (4.04 g, 2.99 mmol), para obtener un compuesto 57 (3.62 g, Cuant).

Síntesis del compuesto 58 (HCI • H-Ser(tBu)-Ser-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(OtBu)-His(Trf)-Gln(Trt)-OKb)

[0225]

[Fórmula Química 82]

1) Fmoc-AAx-OH,agente condens.,medio auxil. condens.,DIPEA

2) n-Propilamina

3) Piperidina,DBU,HOBt

[0226] El compuesto 57 (3.48 g, 2.99 mmol) se procesó de la misma manera que para la síntesis del compuesto 20, de acuerdo con las condiciones de reacción y las condiciones de lavado de las siguientes tablas, con el fin de obtener un compuesto 58 (4.60 g, 72.1%).

Síntesis del compuesto 59

[0227]

[Fórmula Química 83]

1) Boc-Gly-OH,DMT-MM,DIPEA

2) n-Propilamina

Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser-Phe-HCI ■ H-Ser(tBu)-Ser-Phe- ________________________^ Leu-SeKtBu)-Pro-Glu(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(OtBu)- His(Trt)-Gln(Trt)-OKb

His(Trt)-Gln(Trt)-OKb THFDMF

59

58

[0228] Se actuó sobre el compuesto 58 (4.59 g, 1.87 mmol) de la misma manera que para el compuesto 48 usando Boc-Gly-OH (425 mg, 2.43 mmol, 1.3 equiv) y DIPEA (1170 ^jL, 6.72 mmol, 3.6 equiv), para obtener un compuesto 59 (4.55 g, 94.5%).

Síntesis del compuesto 60

[0229]

[Fórmula Química 84]

Ácido n-octanoico,DIPCI,DMAP

Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser-Phe- Boc-Gly-Ser(tBu)-SeKn-octanoyl)-Leu-SeKtBu)-Pro-Glu(OtBu)-

Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-OKb DQM His(Trt)-Glr(Trt)-OKb

59 60

[0230] El compuesto 59 (4.55 g, 1.76 mmol) se disolvió en DCM (35 ml), se adicionaron ácido caprílico (628 mg, 3.96 mmol, 2.25 equiv), WSC^HCl (760 mg, 3.96 mmol, 2.2 g equiv) y DMAP (11 mg, 0.088 mmol, 0.05 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos y a 40°C durante 1 hora. Como captador de amina, se adicionó propilamina (1086 ^jL, 13.2 mmol, 7.5 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. A la mezcla de la reacción se le adicionó una solución de solución acuosa de cloruro de amonio saturada:agua=1:2 en una cantidad del doble del disolvente de la reacción, y la mezcla se lavó y se paró, y la capa acuosa se desechó. Además, se adicionó una solución de solución salina saturada:agua=1:2 en una cantidad del doble del disolvente de la reacción, y la mezcla se lavó y se separó, y la capa acuosa se desechó. Además, se adicionó solución salina saturada en una cantidad del doble del disolvente de reacción, y la mezcla se lavó y se separó, y la capa acuosa se desechó. La capa orgánica resultante se mantuvo a presión reducida y el disolvente se destiló. En el residuo se adicionó acetonitrilo, y el precipitado depositado se filtró, y se suspendió y lavó con acetonitrilo, y el sólido resultante se secó a presión reducida, para obtener un compuesto 60 (4.48 g, 94.1%).

Síntesis del compuesto 61 (Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser(n-Octanoyl)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-OH)

[0231] Se aplicó un método de desprotección general del grupo protector Kb sobre el compuesto 60 (4.47 g, 1.65 mmol), para obtener un compuesto 61 (3.26 g, Cuant).

(Ejemplo 38) Síntesis de Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser(n-Octanoyl)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(Ot-Bu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Pro-Pro-Ala-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Pro-Arg(Pbf)-OKb (compuesto 63)

Síntesis del compuesto 62(HChH-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Glu(Ot-Bu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Pro-Pro-Ala-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Pro-Arg(Pbf)-OKb)

[0232]

[Fórmula Química 85]

1 )F moc-Lys(Boc)-l_eu-Gln(T rt)-Gln(T rt)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-OH,

55

1) DMT-MM,DIPEA

2)

n-Propilamina HCI ■ H-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-HCI ■ H-Lys(Boc)-Pro-Pro- 3) Piperidina,DBU Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ala-l_ys(Boc)-l_eu-Gln(T rt)- Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-P ro-A rg(P bf)- O Kb THF,DMF Pro-Pro-Ala-Lys(Boc)-Leu-Gln(T rt)-Pro-Arg(Pbf)-OKb

50 62

[0233] El compuesto 50 (251 mg, 0.1 mmol) obtenido en el Ejemplo 35 se disolvió en una mezcla de THF (9 ml) y DMF (1.0 ml), se adicionaron el compuesto 61 (443 mg, 0.15 mmol, 1.5 equiv) obtenido en el Ejemplo 36, DMT-M^m(40.0 mg, 0.405 mmol, 1.45 equiv) y DIp Ea (63 gL, 0.36 mmol, 3.6 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Como captador de amina, se adicionó propilamina (25.0 gL, 0.3 mmol, 3 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se adicionaron piperidina (15 pL, 0.45 mmol, 1.5 equiv) y DBU (150 pL, 3.0 mmol, 10 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se adicionó ácido clorhídrico concentrado hasta que el pH de la mezcla de la reacción llegó a en torno a 6. Se adicionó a la mezcla de la reacción una solución de solución salina saturada:agua=1:2 en una cantidad del doble del disolvente de la reacción, y la mezcla se lavó y separó, y se desechó la capa acuosa. Además, se adicionó solución salina saturada en una cantidad del doble del disolvente de reacción, y la mezcla se lavó y separó, y se desechó la capa acuosa. La capa orgánica resultante se mantuvo a presión reducida y el disolvente se destiló. En el residuo se adicionó acetonitrilo frío y al precipitado depositado se filtró, adicionalmente, se suspendió y se lavó con acetonitrilo frío, y el sólido resultante se secó a presión reducida, para obtener un compuesto 62 (485 mg, Cuant).

Síntesis del compuesto 63 (Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser(n-Octanoyl)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(Ot-Bu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Pro-Pro-Ala-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Pro-Arg(Pbf)-OKb)

[0234]

[Fórmula Química 86]

1)Boc-G ly-Ser(tBu)-Ser(n-O ctanoyl)-Phe-Leu-Ser(tB u)-P ro-G lu(O tBu)-H is(Trt)-G ln(Trt)-O H,

61 B - l - r B - r n - n -

n rt - ro- rg -

62 63

[0235] El compuesto 62 (251 mg, 0.1 mmol) se disolvió en un líquido de mezcla de THF (2 ml) y DMF (0.2 ml), se adicionaron el compuesto 61 (295 g, 0.15 mmol, 1.5 equiv) obtenido en el Ejemplo 37, DMT-MM (40.0 mg, 0.405 mmol, 1.45 equiv) y DIPEA (62 ^L, 0.36 mmol, 3.6 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Como captador de amina, se adicionó propilamina (25.0 ^L, 0.3 mmol, 3 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La mezcla de la reacción se mantuvo a presión reducida y el disolvente se destiló. En el residuo se adicionó acetonitrilo frío y el precipitado depositado se filtró, además, se suspendió y se lavó con acetonitrilo frío, y el sólido resultante se secó a presión reducida, para obtener un compuesto 63 (562 mg, 84.4%).

(Ejemplo 39) Síntesis de H-Gly-Ser-Ser(n-Octanoyl)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gln-Lys-Leu-Gln-Gln-Arg-Lys-Glu-Ser-Lys-Lys-Pro-Pro-Ala-Lys-Leu-Gln-Pro-Arg-OH (compuesto 64)

[0236]

[Fórmula Química 87]

[0237] El compuesto 63 (555 mg, 0.083 mmol) obtenido en el Ejemplo 38 se disolvió en 8 ml de una mezcla de TFA:TIS:agua=95:2.5:2.5, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. El líquido de la reacción se filtró a través de Celite. El residuo de filtración se lavó con 3 ml de TFA y se filtró. Los filtrados resultantes se combinaron entre sí, y se concentraron a presión reducida y a temperatura ambiente hasta 4.5 ml. El residuo se colocó en 45 ml de isopropil éter frío mientras se agitaba. El sólido resultante se separó por centrifugación, y el residuo de la filtración además se suspendió y lavó con isopropil éter frío y se separó por centrifugación, dos veces. El sólido resultante se secó, para obtener un compuesto 64 (351 mg, Cuant, pureza de HPLC 68.92%). El compuesto resultante se midió por LC-MS, para observar 1119.3 [M+3H+]/3.

[Aplicabilidad Industrial]

[0238] Cuando se usa el método de síntesis peptídica de la presente invención, se puede evitar el doble hit de un aminoácido en la desprotección desactivando una especie activa de aminoácido con la utilización de un captador específico antes de la desprotección del N-terminal, incluso si la especie activa de aminoácido no se elimina del sistema de reacción. El método de la presente invención puede solucionar el problema de la existencia de una especie activa de aminoácido en el sistema de reacción en la reacción de desprotección, con unos medios sencillos, con lo cual, este método es excelente en cuanto a versatilidad y es útil. Además, un péptido sintetizado con la presente invención presenta menos problemas de supresión de un aminoácido y de doble hit, y de acuerdo con la presente invención, puede sintetizarse un péptido de alta calidad con un alto rendimiento.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método de síntesis peptídica que comprende las siguientes etapas a a d:

a. condensar un aminoácido que tiene un N-terminal protegido con fluorenilmetoxicarbonilo (N-Fmoc protegido) o un péptido N-Fmoc protegido con un aminoácido que tiene un C-terminal protegido con un portador, siendo el portador capaz de cristalizar, como respuesta a un cambio de una composición de un disolvente de disolución (C-portador protegido), un péptido C-portador protegido o una amida de aminoácido C-portador protegida, en presencia de un agente de condensación, para obtener un péptido N-Fmoc-C-portador protegido,

b. subsiguientemente adicionar al sistema de reacción resultante de la etapa (a) por lo menos una amina seleccionada del grupo consistente en una alquilamina que tiene de 1 a 14 átomos de carbono, una amina aromática que tiene de 1 a 14 átomos de carbono e hidroxilamina, en donde la alquilamina o la amina aromática es una amina primaria o secundaria,

c. después de esto desproteger el N-terminal, y

d. cambiar la composición del disolvente que disuelve el péptido C-portador protegido resultante, para cristalizar y separar el péptido C-portador protegido.

2. Método de síntesis peptídica según la reivindicación 1, en donde dicho portador es un compuesto seleccionado del grupo consistente en compuestos que tienen las siguientes estructuras:

[Fórmula Química 1]

en donde R1 y R5 representan un átomo de hidrógeno, R2, R3 y R4 representan un grupo alcoxilo que tiene de 8 a 30 átomos de carbono, y RX es un grupo representado por la siguiente fórmula 2 y que se une al C-terminal de un péptido o un aminoácido,

[Fórmula Química 2]

en donde R7 representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo bencilo o un grupo bencilo alcoxi-sustituido, y R6 representa un átomo de hidrógeno, un grupo fenilo o un grupo fenilo alcoxi-sustituido,

un compuesto que tiene la siguiente estructura:

[Fórmula Química 3]

en donde R2, R4 y R5 representan un átomo de hidrógeno, R1 y R3 representan un grupo alcoxilo que tiene de 12 a 30 átomos de carbono, y RY es un grupo representado por la siguiente fórmula 4 y que se une al C-terminal de un péptido o un aminoácido,

[Fórmula Química 4]

en donde R7 representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo bencilo o un grupo bencilo alcoxi-sustituido, y R6 representa un átomo de hidrógeno, un grupo fenilo o un grupo fenilo alcoxi-sustituido, y

un compuesto que tiene la siguiente estructura:

[Fórmula Química 5]

en donde Ri, R3 y R5 representan un átomo de hidrógeno, R2 y R4 representan un grupo alcoxilo que tiene de 12 a 30 átomos de carbono, y RZ es un grupo representado por la siguiente fórmula 6 y que se une al C-terminal de un péptido o un aminoácido,

[Fórmula Química 6]

— CHO

en donde R7 representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo bencilo o un grupo bencilo alcoxi-sustituido, y R6 representa un átomo de hidrógeno, un grupo fenilo o un grupo fenilo alcoxi-sustituido, en donde las fórmulas anteriores se muestran en el estado antes de la unión al C-terminal de un péptido o un aminoácido.

3. Método de síntesis peptídica según la reivindicación 1, en donde dicho portador es un compuesto seleccionado del grupo consistente en

[Fórmula Química 7]

en donde X representa un halógeno, Y es un entero de 8 a 12 y Z es un entero de 17 a 29,

[Fórmula Química 8]

[Fórmula Química 9]

en donde X representan cada uno de ellos independientemente un entero de 11 a 29,

en donde las fórmulas anteriores se muestran en el estado antes de la unión al C-terminal de un péptido o un aminoácido.

4. Método de síntesis peptídica según la reivindicación 1, en donde dicho portador es un compuesto seleccionado del grupo consistente en

[Fórmula Química 10]

[Fórmula Química 12]

en donde X es F ó Cl

[Fórmula Química 14]

, y

[Fórmula Química 15]

5. Método de síntesis peptídica según una cualquiera de las reivindicaciones 1a 4, en donde dicha amina es una alquilamina que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o hidroxilamina.

6. Método de síntesis peptídica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha amina es una alquilamina que tiene 3 ó 4 átomos de carbono.

7. Método de síntesis peptídica según una cualquiera de las reivindicaciones 1a 6, en donde el equivalente de amina en la etapa b está en una cantidad de 1 a 30 veces con respecto al equivalente de aminoácido que queda teóricamente después de la reacción de condensación de la etapa a.

8. Método de síntesis peptídica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde los medios de cambio de composición para cambiar la composición del disolvente que disuelve el péptido C-portador protegido resultante se lleva a cabo concentrando el disolvente de la solución, y a continuación, adicionando un disolvente pobre para lograr la solidificación.

9. Método de síntesis peptídica según la reivindicación 8, en donde dicho disolvente pobre es un disolvente seleccionado del grupo consistente en acetonitrilo, acetonitrilo acuoso, metanol, metanol acuoso y agua.

10. Método de síntesis peptídica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde en la etapa b la por lo menos una amina se adiciona para captar ésteres activos.

11. Método de síntesis peptídica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende efectuar la repetición de la etapa a a la etapa d usando el péptido C-portador protegido cristalizado y separado en la etapa d.

12. Método de síntesis peptídica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende, además, la siguiente etapa:

e. una etapa de lavado del cristal del péptido C-portador protegido cristalizado y separado con un disolvente orgánico.

13. Método de síntesis peptídica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde dichas etapas a a c se efectúan en una síntesis de un solo recipiente.