JP2014517023A - ペプチドの抽出方法および液相ペプチド合成におけるその使用 - Google Patents
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Abstract
該反応混合物が、ペプチドと、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミドおよびN−メチル−2−ピロリドンからなる群から選択される極性非プロトン性溶媒とを含むこと;ならびに
該方法が、
a)該反応混合物にトルエンである成分a1)と水である成分a2)とを加えて、有機層および水層からなる二相系を得ることを含む工程、および
b)ペプチドを含む有機層と水層を分離することを含む工程
を含むこと
を特徴とする方法に関する。
本発明の特に好ましい実施形態においては、n−ヘプタン、2−メチルテトラヒドロフラン、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、アセトニトリルおよびテトラヒドロフランからなる群から選択される有機溶媒1とトルエンとの組み合わせを本発明の抽出方法に使用する。この抽出工程は、液相におけるペプチド調製方法に好ましく使用される。
Description
ACN アセトニトリル
Boc tert−ブトキシカルボニル
Bsmoc 1,1−ジオキソベンゾ[b]チオフェン−2−イルメチルオキシカルボニル
Bzl ベンジル
Cbz ベンジルオキシカルボニル
DCC N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
DCM ジクロロメタン
DEA ジエチルアミン
DIPE ジイソプロピルエーテル
DIPEA N,N−ジイソプロピルエチルアミン
DMA N,N−ジメチルアセトアミド
DMF N,N−ジメチルホルムアミド
EDC 1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド
eq 当量
EtOAc 酢酸エチル
Fmoc フルオレニル−9−メトキシカルボニル
h 時間
HOBt 1−ヒドロキシベンゾトリアゾール
HOBt・H2O 1−ヒドロキシベンゾトリアゾール1水和物
HPLS 高速液体クロマトグラフィー
LPPS 液相ペプチド合成
MeTHF 2−メチルテトラヒドロフラン
min 分
MS 質量分析
NMP N−メチル−2−ピロリドン
OMe メトキシ
OtBu tert−ブトキシ
PG 保護基
PyBOP ベンゾトリアゾール−1−イルオキシ−トリス(ピロリジノ)−ホスホニウムヘキサフルオロホスファート
SPPS 固相ペプチド合成
TAEA トリス(2−アミノエチル)アミン
TBTU O−(ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート
tBu tert−ブチル
TEA トリエチルアミン
TFA トリフルオロ酢酸
THF テトラヒドロフラン
TLC 薄層クロマトグラフィー
TOTU O−[シアノ(エトキシカルボニル)メチレンアミノ]−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート
Trt トリチル
UV 紫外線
WO2005/081711は、薬物−リンカー−リガンド結合体、薬物−リンカー化合物、およびがん、自己免疫疾患または感染症を治療するためのこれらの使用方法に関する。この特許文献では、酢酸エチル、ジクロロメタンおよびtBuOH/CHCl3混合物を使用した、ペプチドベースの薬剤の調製方法およびペプチドの抽出方法などが開示されている。
該反応混合物が、ペプチドと、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミドおよびN−メチル−2−ピロリドンからなる群から選択される極性非プロトン性溶媒とを含むこと;
該方法が、
a)該反応混合物にトルエンである成分a1)と水である成分a2)とを加えて、有機層および水層からなる二相系を得ることを含む工程、および
b)ペプチドを含む有機層と水層を分離することを含む工程
を含むこと;ならびに
工程a)で得られる該二相系の体積組成比が、
極性非プロトン性溶媒:トルエン=1:20〜1:2、および
極性非プロトン性溶媒:水=1:20〜1:2であること
を特徴とする方法に関する。
該反応混合物が、ペプチドと、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミドおよびN−メチル−2−ピロリドンからなる群から選択される極性非プロトン性溶媒とを含むこと;
該方法が、
a)トルエンである成分a1)と、水である成分a2)と、n−ヘプタン、2−メチルテトラヒドロフラン、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、アセトニトリルおよびテトラヒドロフランからなる群から選択される有機溶媒1である成分a3)とを加えて、有機層および水層からなる二相系を得ることを含む工程、および
b)ペプチドを含む有機層と水層を分離することを含む工程
を含むこと;ならびに
工程a)で得られる該二相系の体積組成比が、
極性非プロトン性溶媒:トルエン=1:20〜1:2、
極性非プロトン性溶媒:有機溶媒1=1:5〜30:1、
極性非プロトン性溶媒:水=1:20〜1:2、および
トルエン:有機溶媒1=50:1〜1:1であること
を特徴とする方法に関する。
極性非プロトン性溶媒:トルエン=1:6〜1:3、
極性非プロトン性溶媒:有機溶媒1=1:1〜4:1、
極性非プロトン性溶媒:水=1:5〜1:3、および
トルエン:有機溶媒1=10:1〜2:1である。
本発明は、ペプチドカップリング反応により得られる反応混合物からペプチドを抽出する方法であって、
該反応混合物が、ペプチドと極性非プロトン性溶媒とを含むこと;ならびに
該方法が、
a)該反応混合物にトルエンである成分a1)と水である成分a2)とを加えて、有機層および水層からなる二相系を得ることを含む工程、および
b)ペプチドを含む有機層と水層を分離することを含む工程
を含むこと
を特徴とする方法に関する。
該反応混合物が、ペプチドと、DMF、DMAおよびNMPからなる群から選択される極性非プロトン性溶媒とを含むこと;ならびに
該方法が、
a)トルエンである成分a1)と、水である成分a2)と、n−ヘプタン、2−メチルテトラヒドロフラン、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、アセトニトリルおよびテトラヒドロフランからなる群から選択される有機溶媒1である成分a3)とを加えて、有機層および水層からなる二相系を得ることを含む工程、および
b)ペプチドを含む有機層と水層を分離することを含む工程
を含むこと
を特徴とする方法に関する。
本発明の別の態様は、液相におけるペプチドの調製方法であって、
aa)カップリング試薬および必要に応じて第三級塩基の存在下において、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミドおよびN−メチル−2−ピロリドンからなる群から選択される極性非プロトン性溶媒中でペプチドカップリング反応を行う工程;
bb)得られたペプチドを上記の方法によって抽出する工程;ならびに
cc)工程bb)において得られた有機層の少なくとも一部を蒸発させる工程
を含む方法に関する。
アミノ酸もしくはペプチドの側鎖官能基の保護、またはアミノ酸もしくはペプチドのN末端アミノ基またはC末端カルボン酸基の保護のために本発明において使用される保護基(PG)は、以下の4つの異なる群に分類される。
1.塩基性の切断条件下で切断可能なPG(以下「塩基型PG」と呼ぶ)
2.強酸性の切断条件下で切断可能であるが、弱酸性の切断条件下では切断不可能なPG(以下「強力型PG」と呼ぶ)
3.弱酸性の切断条件下で切断可能なPG(以下「弱力型PG」と呼ぶ)
4.還元性の切断条件下で切断可能なPG(以下「還元型PG」と呼ぶ)
5.鹸化性の切断条件下で切断可能なPG(以下「鹸化型PG」と呼ぶ)
A)HPLC分析
HPLC法Aにおける検出はUVフォトダイオードアレイ検出器を用いて行った。
工程1 試料調製:
移動相A:0.1体積%TFAを含む水
移動相B:0.085体積%TFAを含むACN
工程2 クロマトグラフィーの条件:
MIH-009-2TG11法
カラム: Purospher Star RP18 55×4mm
オーブン温度: 40℃
流速: 2.0mL/分
検出器波長: 215nm
グラジエント時間: 15分
グラジエント組成: 2〜78%B(5分)→78〜98%B(10分)
工程3 クロマトグラフィーによるプロファイル分析:
単離された生成物の組成はクロマトグラフィーにおける全てのピークの面積を測定することにより決定した。決定された予測生成物の純度は該生成物に対応するピーク面積(%)に一致する。
ガスクロマトグラフ: 水素炎イオン化検出器およびオートインジェクターシステムを備え、データ収集ソフトウェアと接続したGC
分析用GCカラム: 溶融シリカカラム
長さ50m;内径0.53mm;固定相:CP SIL 8CB DF=5.0μm
試薬: メタノール(分析等級)
試験溶液および対照溶液
10mLのメスフラスコに試料400μLを正確に入れ、メタノールを標線まで加えた。
キャリアガス: ヘリウム 30kPa
オーブン温度: 35℃(14分)→(5℃/分)→55℃(3分)→(5℃/分)→110℃(5分)→(10℃/分)→225℃(5分)
インジェクター温度: 225℃
検出器温度: 260℃
注入量: 1μL
注入方法: スプリット
スプリット流量: 85mL/分
比率: 24
沈殿したペプチドを含む混合物を、孔径20μmのフィルターを備えた直径2.7cmの濾過カラムに移した。20℃、圧力50mbarの条件で濾過を行った。流速およびケーキの高さを測定し、濾過係数Kを次式により求めた。
K=母液量(mL)×ケーキの高さ(cm)/フィルターの面積(cm2)/圧力(bar)/濾過時間(分)
トルエン/THF混合溶媒(本発明)の抽出性をMeTHF/THF混合溶媒およびEtOAc/THF混合溶媒(比較例)の抽出性と比較した。実験は150g/LのNaClを含む水溶液を用いて行った。この実施例の系にペプチドは含まれていなかった。
体積比は以下のとおりであった。
NMP:EtOAc:THF:NaCl溶液=1:3:3:3
NMP:MeTHF:THF:NaCl溶液=1:3:3:3
NMP:トルエン:THF:NaCl溶液=1:3:3:3
水層中のNMP分率をGCによって測定した。実験結果を表1に要約する。
実施例2.1 Boc-Tyr(Bzl)-Leu-OBzlのLPPS
Boc-Tyr(Bzl)-OH(4.7g、12.7mmol)およびH-Leu-OBzl・Tos(5.0g、12.7mmol)を20℃でDMF(25mL)中に溶解した。反応混合物を-8℃に冷却し、次いでHOBt・H2O(2.0g、13.1mmol、1.0当量)およびEDC・HCl(2.8g、14.6mmol)を加えた。HPLCにより反応の完了が確認されるまで反応温度を-5〜-10℃の範囲に維持した。反応の進行は、反応混合物から得た試料5μLを酢酸:水(9:1)で50倍に希釈し、上記のMIH-009-2TG11法に従って分析することによりモニタリングした。
実施例2.1に従って調製した混合物にトルエン(90mL)を加え、以下のものにより反応混合物から順次抽出を行った。
1)20g/L NaClを含む水溶液(90mL)
2)150g/L NaClおよび50g/L NaHCO3を含む水溶液(90mL)
3)20g/L NaClおよび50g/L NaHCO3を含む水溶液(90mL)
4)20g/L NaClおよび50g/L NaHCO3を含む水溶液(90mL)
5)150g/L NaClを含む水溶液(90mL)
Boc-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-OH(3.5g)、H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu-OBzl(5.0g)およびHOBt(0.88g)をDMF(20mL)中に溶解した。EDC・HCl(1.2g)およびTEA(1.5mL)を加えて-6〜0℃で攪拌しながら一晩かけてカップリング反応を行った。HPLC(MIH-009-2TG11法)により反応の完了を確認した。
得られた材料中の微量のDMFはBoc保護基の除去を著しく抑制した。したがって、DCMを用いて抽出した材料におけるBocの切断の進行は、EtOAcを用いて抽出した材料の場合と比較して顕著に遅かった。
Boc-Ser(OBzl)-OH(1.62g、5.5mmol)を20℃でDMF(25mL)中に溶解し、粗生成物であるH-Phe-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr-Leu(OBzl)に加えた。HOBt・H2O(0.89g、5.8mmol)およびEDC・HCl(1.2g、6.3mmol)を加え、反応混合物を5℃に冷却した。反応の完了がHPLCにより確認されるまで反応混合物をこの温度で維持した。反応の進行は、反応混合物から得た試料5μLを酢酸:水(9:1)で50倍に希釈し、上記のMIH-009-2TG11法に従って分析することによりモニタリングした。
Boc-Ser(Bzl)-Phe-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu(OBzl) 5gを含む反応混合物25mLを、100g/L NaClを含む水溶液(75mL)およびMeTHF(75mL)と混合した。十分に混合し相分離(約4分間)させた後、下層の水層を除去した。さらに、100g/L NaClを含む水溶液(3×75mL)を用いて上層の有機層からの抽出を3回行った。次いで有機層を単離し、残量が10mLになるまで30℃、60mbarで部分的に蒸発させた。0℃においてDIPE(250mL)を攪拌しながら、部分的に蒸発させた有機層を滴下することによってペプチドを沈殿させた。得られた混合物を、孔径20μmのフィルターを備えた直径2.7cmの濾過カラムに移した。50mbarの圧力下で濾過を行った。沈殿母液の全量(260mL)を濾過するのに3分45秒を要した。濾過後のケーキの高さは3.5cmであり、これより濾過係数(K)=848が得られた。固形物を回収し減圧下で乾燥した。ペプチド4.5gを固形物として単離した。
ペプチドの濾過を行う前にDMF(2.5mL)を沈殿混合物に加えたこと以外は上記a)と同様に抽出および沈殿操作を行った。固形沈殿は直ちにゴム状固形物を形成し、濾過を行うことはできなかった。
0℃においてDIPE(250mL)を攪拌しながら、Boc-Ser(Bzl)-Phe-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu(OBzl) 5gを含む実施例4において得られた反応混合物25mLを滴下し、沈殿物を生じさせた。粘着性を有するゴム状固形物としてペプチド沈殿物が得られた。二層分離後、上清をポンプで吸引して第2バッチ用のDIPE(250mL)と交換した。得られた混合物を1時間攪拌して、粘着性を有するゴム状固形物の凝集を解砕させた。二層分離後、上清を第3バッチ用のDIPE(250mL)と再度交換した。混合物を再度1時間攪拌し、次いで濾過カラムに移した。しかしながら、固形物の大部分は沈殿容器に付着したまま粘着性ゴム状固形物の形態を保ち、移動させることは不可能であった。母液の濾過には2分30秒を要し、ケーキの高さは1.75cmであった。これより濾過係数(K)=636が得られた。回収した固形物を減圧下で乾燥させた。
0℃において水(250mL)を攪拌しながら、Boc-Ser(Bzl)-Phe-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu(OBzl) 5gを含む実施例4において得られた反応混合物25mLを滴下し、沈殿物を生じさせた。非常に薄い沈殿物の層が得られ、次いでこれを濾過カラムに移した。濾過速度は非常に遅く(<3mL/h)、濾過の最初の段階において多量の沈殿物がフィルターを通過し、約65分後には明らかなフィルターの閉塞が見られた。さらに、透明な沈殿上清は得られなかった。したがって、得られた沈殿物を回収することは不可能であった。
DMFの存在下でペプチドBoc-Ser(Bzl)-Phe-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu(OBzl)を沈殿させると(実施例b)〜d))、ゴム状固形物が形成された。この固形物は取り扱いが困難であった。実施例a)では、微量に含まれていたDMFを抽出により実質的に除去した後、ペプチドBoc-Ser(Bzl)-Phe-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu(OBzl)を沈殿させた。得られた生成物は良好な収率で単離することができ、容易に濾過することができた。
Claims (16)
- ペプチドカップリング反応により得られる反応混合物からペプチドを抽出する方法であって、
該反応混合物が、ペプチドと、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミドおよびN−メチル−2−ピロリドンからなる群から選択される極性非プロトン性溶媒とを含むこと;
該方法が、
a)該反応混合物にトルエンである成分a1)と水である成分a2)とを加えて、有機層および水層からなる二相系を得ることを含む工程、および
b)ペプチドを含む有機層と水層を分離することを含む工程
を含むこと;ならびに
工程a)で得られる該二相系の体積組成比が、
極性非プロトン性溶媒:トルエン=1:20〜1:2、および
極性非プロトン性溶媒:水=1:20〜1:2であること
を特徴とする方法。 - 工程a)において、n−ヘプタン、2−メチルテトラヒドロフラン、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、アセトニトリルおよびテトラヒドロフランからなる群から選択される有機溶媒1である成分a3)を前記反応混合物にさらに加えて、有機層および水層からなる二相系を得ること;ならびに
工程a)で得られる該二相系の体積組成比が、
極性非プロトン性溶媒:トルエン=1:20〜1:2、
極性非プロトン性溶媒:有機溶媒1=1:5〜30:1、および
極性非プロトン性溶媒:水=1:20〜1:2であること
を特徴とする請求項1に記載の方法。 - 工程a)で得られる前記二相系の体積組成比が、
極性非プロトン性溶媒:トルエン=1:6〜1:3、
極性非プロトン性溶媒:有機溶媒1=1:1〜4:1、および
極性非プロトン性溶媒:水=1:5〜1:3であること
を特徴とする請求項2に記載の方法。 - 前記極性非プロトン性溶媒が、N,N−ジメチルホルムアミドおよびN−メチル−2−ピロリドンからなる群から選択されることを特徴とする請求項1〜3の1項以上に記載の方法。
- 前記有機溶媒1が、アセトニトリルおよびテトラヒドロフランからなる群から選択されることを特徴とする請求項2〜4の1項以上に記載の方法。
- 前記成分a2)が、塩化ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、硫酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウムおよびリン酸水素ナトリウムからなる群から選択される少なくとも1種の無機塩類を含むことを特徴とする請求項1〜5の1項以上に記載の方法。
- 前記成分a2)のpHが5〜8であることを特徴とする請求項1〜6の1項以上に記載の方法。
- 工程b)の前に、工程a)で得られた前記二相系の濾過を行うことを特徴とする請求項1〜7の1項以上に記載の方法。
- 工程a)および工程b)を20℃〜30℃で行うことを特徴とする請求項1〜8の1項以上に記載の方法。
- 液相におけるペプチドの調製方法であって、
aa)カップリング試薬の存在下において、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミドおよびN−メチル−2−ピロリドンからなる群から選択される極性非プロトン性溶媒中でペプチドカップリング反応を行う工程;
bb)得られたペプチドを、請求項1〜10の1項以上に記載の方法によって抽出する工程;ならびに
cc)工程bb)において得られた有機層の少なくとも一部を蒸発させる工程
を含む方法。 - 前記カップリング試薬が、O−1H−ベンゾトリアゾールのウロニウム塩、O−1H−ベンゾトリアゾールのホスホニウム塩およびカルボジイミドカップリング試薬からなる群から選択されることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 工程aa)の前記ペプチドカップリング反応を、N,N−ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミンおよびN−メチルモルホリンからなる群から選択される第三級塩基の存在下で行うことを特徴とする請求項10または11に記載の方法。
- dd)工程cc)で得られた前記有機層と、アセトニトリル、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテルおよびn−ヘプタンからなる群から選択される有機溶媒2とを混合する工程;
ee)前記ペプチドの少なくとも大部分を沈殿させる工程;ならびに
ff)沈殿させたペプチドを濾別する工程
をさらに含む請求項10〜12の1項以上に記載の方法。 - 前記ペプチドのN末端保護基がtert−ブチルオキシカルボニル保護基である場合、工程cc)で得られた前記有機層をトリフルオロ酢酸で処理することによって、tert−ブチルオキシカルボニル保護基を除去することを特徴とする請求項10〜12の1項以上に記載の方法。
- 前記ペプチドのN末端保護基がフルオレニル−9−メトキシカルボニル保護基である場合、工程aa)の前記ペプチドカップリング反応により得られた反応混合物をピペリジンで処理することによって、フルオレニル−9−メトキシカルボニル保護基を除去することを特徴とする請求項10〜12の1項以上に記載の方法。
- 前記ペプチドのC末端カルボン酸基が、2−クロロフェニルジフェニルメチルエステルまたはN−メチル−9H−キサンテン−9−アミドで保護されていることを特徴とする請求項10〜15の1項以上に記載の方法。
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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