WO2017092689A1 - Method for preparation of rada-16 - Google Patents

Abstract

The invention discloses a method for the preparation of RADA-16, which is a 16-mers peptide with the sequence Ac- (Arg-Ala-Asp-Ala) ₄-NH₂, by liquid phase peptide synthesis.

Description

Method for Preparation of RADA-16

The invention discloses a method for the preparation of RADA-16, which is a 16-mers peptide with the sequence Ac- (Arg-Ala-Asp-Ala) ₄-NH₂, by liquid phase peptide synthesis.

BACKGROUND OF THE INVENTION

In the following text, the following abbreviations and meaning are use, if not otherwise stated.

AA        amino acid or amino acid residue, depending on context；

Ac        acetyl；

ACN       acetonitrile

All       allyl, the protected form of a COOH residue is the allyl ester；

Alloc     allyloxycarbonyl

Boc       tert-butoxycarbonyl

brine     a solution of sodium chloride in water

coupling  the peptide coupling reaction between two amino acids, between an amino acid and

          a peptide, or between two peptides；

cv        column volume；

DCC       Dicyclohexylcarbodiimide；

DCM       dichloromethane；

DIC       Diisopropylcarbodiimide；

DCU       Dicyclohexylurea

DIPE      diisopropylether

DIPEA     diisopropylethylamine

DMF       dimethylformamide；

EDC. HCl 3- (dimethylamino) propyl-1-ethylcarbodiimide hydrochloride

Fmoc      9-fluorenylmethoxycarbonyl protecting group；

HOAt      1-hydroxy-7-azabenzotriazole

HOBt      1-hydroxybenzotriazole, it is used as monohydrate；

LPPS      liquid phase peptide synthesis；

Me-THF    2-methyltetrahydrofurane；

NMP       N-methyl-2-pyrrolidon；

Pbf       2, 2, 4, 6, 7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl protecting group；

PyBOP     1H-benzotriazol-1-yl-oxytris (pyrrolidino) phosphoniumhexafluorophosphate；

RADA-16   the peptide Ac-RADARADARADARADA-NH₂

RT        room or ambient temperature；

SPPS      Solid Phase Peptide Synthesis；

TFA       trifluoroacetid acid；

THF       tetrahydrofuran.

RADA-16 is a synthetic amphiphilic peptide designed to self-assemble in a controlled wayinto fibrils and higher ordered structures depending on pH, such as hydrogels with extremely high water contents. Potential applications have been found for such biocompatible materials in medicine, biotechnology, nanotechnology, and biology. Examples include three-dimensional cell culture, tissue repairing and engineering, cosmetic industry, drug release and drug delivery, biological surface engineering, separation matrices, and membrane protein stabilization. Moreover, self-complementary peptides represent a useful model system to investigate the in vitro formation of amyloid fibrils involved in several neurodegenerative diseases.

Paolo Arosio et al. in Biophysical Journal 2012, 102, 1617-1626 discloses investigations on its behaviour.

So far SPPS was known for RADA-16. RADA-16 shows low yields in SPPS. Paradis-Bas, M., et al., Eur. J. Org. Chem., 2013, 26, 5871-5878, discloses that SPPS results in a rather poor final purity of the crude product, and that impurities are formed that cannot be easily removed. SPPS has the disadvantage that higher volumes are cost intensive. Arg usually is protected with Pbf in SPPS Fmoc chemistry. Cleavage of Pfb results usually in byproducts such as derived from incomplete cleavage and competitive reactions resulting in derivatives of SO₃. Furthermore it was observed that quite long times are needed for coupling completion in SPPS of 3 to 4 hours. Especially the coupling of Fmoc-Arg (Pbf) in position 1 was very difficult and took very long time.

To use NO₂ protection of Arg in SPPS is in principle possible, but not in connection with Bzl protection of Asp in SPPS Fmoc chemistry, since it would lead to high level formation of aspartimide and related impurities. Therefore the Asp would be protected with tBu in connection with NO₂ on Arg. But then two deprotection steps are necessary if Arg is protected with NO₂, catalytic cleavage of NO₂ and acidic cleavage of tBu.

Furthermore in SPPS there is a relatively high amount of racemization of Ala when a tetramer such as Fmoc-RADA-OH it is coupled onto Arg of another tetramer NH₂-RADA-resin.

Paradis-Bas, M., et al., Eur. J. Org. Chem., 2013, 26, 5871-5878, discloses in Scheme 1 a method for preparation of RADA-16, wherein a Fragment F1 Fmoc-Arg (Pbf) -Ala-Asp (tBu) -Ala-OH is coupled three times onto a resin bound Fragment H-Arg (Pbf) -Ala-Asp (tBu) -Ala-NH-Rink Chemmatrix (CM) Resin, this method is called "solid-phase fragment condensation" . In this method the Fragment F1 is prepared by SPPS, threefold molar excess of the amino acids 2 to 4 (Asp (tBu) , Ala and Arg (Pbf) is required.

For the preparation of Peptide Resin II ( [RADA] ₂-CM resin) , which is the first of the three on resin fragment couplings, 3 equiv of Fragment F1 are required.

For the preparation of Peptide Resin III ( [RADA] ₃-CM resin) , which is the second of the three on resin fragment couplings, three couplings of Fragment F1, each with 1.5 equiv, that is a total of 4.5 equiv, of Fragment F1 were required to obtain a negative ninhydrin test.

For the preparation of Ac- (RADA) ₄-NH₂, which is the third of the three on resin fragment couplings,two couplings of Fragment F1, each with 1.5 equiv, that is a total of 3.0 equiv, of Fragment F1 were required to obtain a negative ninhydrin test.

In Scheme 2, a fragment condensation of two octameric Fragments F2 and F3 in solution is disclosed, these Fragment F2 and F3 are prepared by SPPS. Again, a threefold molar excess of each Fmoc-amino acid 2 to 8, that is subsequently coupled after the first amino acid Ala onto the growing peptide chain, is used.

A crude purity of 58％is reported for the fragment condensation method after global deprotection.

Wang, J., "Study on Synthesis of peptide RADA using in molecularself-assembly" , Chinese Master's Theses Full-text Database (Engineering Science and Technology I) , no. 02, 15 February 2007 (15. 02. 2007) , in the abstract and in page 18, line 11 to page 25, line 4, discloses the tetramer Boc-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-OBzl. This tetramer would not be suitable to be the building unit of RADA-16 due to the Bzl protection of the COOH of the C-terminal Ala.

There was a need for a method for preparation of RADA-16 with high yields, with low impurities or byproducts, which is applicable for large volume preparation, and which does not require a large excess of substrates or building blocks with respect to each other.

Unexpectedly a method for preparation based on pure LPPS was found that meets these needs: Tetrapeptides of the sequence RADA, which have been prepared by LPPS； are coupled to octapeptides of the sequences (RADA) 2, which are coupled to provide the desired RADA-16. This LPPS method allows for this fragmentation strategy which leadsto lower racemization level of Ala compared to on-resin fragment coupling as disclosed by Paradis-Bas.

Also in LPPS still some racemization is observed:

When using Arg in its protected form Arg (NO₂) , two isomers were observed in the course of coupling reaction of the two octapeptides, also after global deprotection two isomers were observed. The LC-MS (liquid chromatography–mass spectrometry) spectrum showed that both of these two pairs of peaks had similar molecular weight. Such impurities usually represent isomers from racemization. After global deprotection, two corresponding isomers were still present in the LC-MS spectrum. Such isomers from racemization are difficult to separate, if separation is possible at all.

Unexpectedly the racemization level of Ala in this method is below 1％in the final RADA-16, when Arg is used in unprotected form instead of protected Arg (NO₂) .

Furthermore the LPPS strategy of instant invention uses Allyl for the protection of the C-terminal COOH residue of the main tetramer fragment, thereby this main tetramer fragment, which is prepared with this Allyl protection group, can be used for both conversions, that is for conversion of the C-terminal COOH residue to the amide residue and for the conversion to the unprotected C-terminal COOH, which is needed for the fragment coupling. This represents an efficient and rational strategy of preparing only this one main tetramer fragment which then can be used to be derivatized to the tetramer fragment substrate for building the octameric fragment as outline herein.

The invention represents a new preparation method based on pure LPPS. This was necessary to enable a preparation on large scale of tons, whereas in the known SPPS strategies lower conversion is observed and more substrates, material and intermediates are required. In the coupling reaction in LPPS stoichiometric or near stoichiometric amounts of building blocks can be used.

A crude purity after global deprotection of 58％, when using Arg in its protected form Arg (NO₂) , was obtained, which is higher than the purity reported by Paradis-Bas of 41％and 46％respectively for the on-resin fragment coupling strategy, and which is similar to the purity reported by Paradis-Bas for the fragment condensation of the two octameric Fragments  F2 and F3 in solution. Even a purity of 46％, when using Arg in its unprotected form, was obtained.

SUMMARY OF THE INVENTION

Subject of the invention is a method for the preparation of the peptide (RADA) ₄；

wherein in liquid phase octamer peptides with the sequence (RADA) ₂ are coupled to provide the peptide (RADA) ₄；

the octamer peptides are prepared in liquid phase by coupling of tetramer peptides having the sequence RADA；

the tetramer peptides having the sequence RADA are prepared in liquid phase.

DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

The octamer peptide is a fragment FRAG2.

FRAG2 and (RADA) ₄ are prepared in liquid phase, that is by LPPS.

The tetramer peptide having the sequence RADA is a fragment FRAG1.

FRAG1 is prepared in liquid phase, that is by LPPS.

Preferably, any coupling is done in liquid phase, that is by LPPS. This means that no solid phase coupling, that is no SPPS is used in any coupling.

Preferably, FRAG1 is prepared by stepwise coupling of the individual amino acids；

more preferably, the stepwise coupling starts with the coupling of D with the C-terminal A providing DA, then the second A is coupled with the DA to provide ADA, finally the N-terminal R is coupled with the ADA to provide RADA.

Within the meaning of this invention and of this description, whenever an amino acid or an amino acid residue in a peptide is denoted with its one letter code, then any side chain of an amino acid or of an amino acid residue in a peptide, any alpha amino residue of an amino acid , any COOH residue of an amino acid, any N-terminal NH₂ residue of a peptide and any C-terminal COOH residue of a peptide can be protected or unprotected, unless explicitly stated otherwise.

Within the meaning of this invention and of this description, the term fragment means a peptide that is derived from the fragmentation of (RADA) ₄.

Preferably, any Asp is used as its side chain protected form Asp (OBzl) .

Preferably, any Arg is used only with an unprotected side chain or any Arg is used only as its side chain protected form Arg (NO₂) ；

therefore more preferably, either (Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala) ₄ is provided by the method or (Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala) ₄ is provided by the method of instant invention.

Even more preferavbly, any Arg is used only with an unprotected side chain, and therefore (Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala) ₄ is provided by the method of instant invention.

Preferably, the coupling of the tetramer peptides to provide (RADA) ₂is done at a temperature below 5℃, preferably below 3℃.

Preferably, in case that Arg is used only with an unprotected side chain, then the coupling of the octamer peptides to provide (RADA) ₄ is done at a temperature below 5℃, preferably below 3℃.

More preferably, the coupling of the octamer peptides to provide (RADA) ₄ is done at a temperature below 5℃, preferably below 3℃.

Preferably, any protection of an N-terminal alpha amino residue during any coupling is done with Boc or with Ac.

Preferably, any protection of a C-terminal COOH residue during any coupling is done in the form of allyl ester All or in form of the amide C (O) NH₂.

Preferably, the peptide (RADA) ₄ is provided in form of a peptide PEP-AC-NH2；

PEP-AC-NH2 is Ac- (RADA) ₄-NH₂；

that is with its N-terminal alpha amino residue protected with Ac, and with its C-terminal COOH in form of an amide C (O) NH₂.

Preferably, the method comprises a step STEPB；

in STEPB the PEP-AC-NH2 is prepared by coupling of a fragment FRAG2-AC-OH with a fragment FRAG2-H-NH2；

FRAG2-AC-OH is Ac- (RADA) ₂-OH；

FRAG2-H-NH2 is H- (RADA) ₂-NH₂.

FRAG2-AC-OH and FRAG2-H-NH2 are embodiments of FRAG2.

Preferably, the method comprises a step STEPA1；

in STEPA1 the FRAG2-H-NH2 is prepared；

STEPA1 comprises a coupling of a fragment FRAGA1-Boc-OH with a fragment FRAGA1-H-NH2with a subsequent cleavage of the N-terminal Boc residue；

FRAGA1-Boc-OH is Boc-RADA-OH

FRAGA1-H-NH2 is H-RADA-NH₂.

Preferably, the method comprises a step STEPA2；

in STEPA2 the FRAG2-AC-OH is prepared；

STEPA2 comprises a coupling of a fragment FRAGA2-Ac-OH with a fragment FRAGA2-H-OAll, and comprises a subsequent cleavage of the C-terminal All residue；

FRAGA2-Ac-OH is Ac-RADA-OH

FRAGA2-H-OAll is H-RADA-OAll.

FRAGA1-Boc-OH, FRAGA1-H-NH2, FRAGA2-Ac-OH and FRAGA2-H-OAll are embodiments of FRAG1.

Preferably, for the preparation of FRAG1, that is for the preparation of the tetramer peptides having the sequence RADA, the three amino acids R, A and D are used as Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OBzl) -OH, and Boc-Arg (NO₂) -OH； or are used as Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OBzl) -OH, and Boc-Arg-OH.

Preferably, Boc-Arg-OH is used in form of Boc-Arg-OH. HCl. H₂O.

Another preferred embodiment of FRAG1, which is used as intermediate in the method of instant invention, is Boc-RADA-OAll； especially in the form of Boc-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll or of Boc-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll.

Preferably, cleavage of any side chain protecting group is done after the coupling of the octamer peptides, that is after STEPB.

Preferably, any NO₂ protecting group of Arg and the Bzl protecting group of Asp is cleaved by catalytic hydrogenation. Catalytichydrogenation may be accomplished by elemental hydrogen or by use of a suitable hydrogen donor like formic acid, ammonium formate, 1, 3-cyclohexadiene, 1, 4-cyclohexadieneor borane adducts such as tert-BuNH₂. BH₃. Suitable hydrogenation catalysts are for example noble metal-based hydrogenation catalysts, in particular the metals known as platinum metals, i.e. rhodium, ruthenium, palladium, osmium, iridium and platinum. Expediently, the hydrogenation catalyst is on a support such as charcoal.

Especially, this cleavage of NO₂ and Bzl protecting groups is done simultaneously.

Especially, this cleavage of NO₂ and Bzl is done with the catalyst Pd/C.

Especially, this cleavage of NO₂ and Bzl is done in TFA, formic acid or mixtures thereof as solvent, more especially in TFA.

Preferably, this cleavage of NO₂ and Bzlis done at atmospheric pressure or super atmospheric pressure. Typical pressures are from 1 to100 bar, preferably, from 1 to 70 bar, more preferably from 1 to 10 bar.

Preferably, the reaction temperature of this cleavage of NO₂ and Bzl is from -20 to 70℃； more preferably from 0 and 60℃, even more preferably from 10 to 40℃.

Preferably, the reaction time of this cleavage of NO₂ and Bzl is from 1 to 6 h, more preferably from 1 to 5 h.

Preferably, All is used as C-terminal protecting group of any Ala, that needs protection of its COOH residue, and of any C-terminal Ala of any FRAG1 or FRAG2.

Preferably, All is connected to the COOH residue, that needs protection, by a reaction REACALL between this COOH residue and an allyl donor, the allyl donor is preferably 3-bromopropene.

Preferably, the molar amount of the allyl donor is from 1 to 2 times of the molar amount of the COOH residue.

Preferably, REACALL is done in the presence of a base, preferably in the presence of K₂CO₃.

Preferably, the molar amount of the base is from 1 to 2 times of the molar amount of the COOH residue.

Preferably, REACALL is done in a solvent, preferably in DMF.

Preferably, REACALL is done at atmospheric pressure.

Preferably, the reaction temperature of REACALL is from -20 to 70℃； more preferably from -15 and 60℃.

Preferably, the reaction time of REACALL is from 1 to 48 h.

Preferably, any cleavage of All is done with a reaction CLEAVALL using the catalyst Pd (PPh₃) ₄.

Preferably, the molar amount of the Pd (PPh₃) ₄ is from 0.01 to 0.05 times of the molar amount of the All residue.

CLEAVALL can be done in the presence of an additive ADDALL, ADDALL is selected from the group consisting of morpholine, 1, 3-dimethylbarbituric acid, pyrrolidine, triphenylphosphine, dimedone, and mixtures thereof.

Preferably, the molar amount of ADDALL is from 2 to 7 times of the molar amount of the All residue.

Preferably, CLEAVALL can be done in any inert solvent which candissolve the reactants. Preferred solvents for CLEAVALL are dimethyl sulfoxide (DMSO) , dioxane, tetrahydrofurans such as tetrahydrofurane (THF) or methyltetrahydrofurane (Methyl-THF) , 1-methyl-2-pyrrolidone (NMP) , N, N-Dimethylformamide (DMF) , N, N-Dimethylacetamide (DMA) , dichloromethane (DCM) , ethylacetate, acetonitrile or any mixture thereof.

More preferably, CLEAVALL is done in DMF, acetonitrile or dioxane.

Preferably, CLEAVALL is done at atmospheric pressure.

Preferably, the reaction temperature of CLEAVALL is from -20 to 70℃； more preferably from -15 and 60℃.

Preferably, the reaction time of CLEAVALL is from 1 to 48 h.

Preferably, the progress of REACALL and CLEAVALL is monitored by HPLC and thereby the necessary reaction time is determined.

Preferably, Boc is used as N-terminal protecting group.

Any cleavage of the N-terminal Boc residue is done with a reaction CLEAVBOC, CLEAVBOC can be done using reaction conditions known in the art of peptide synthesis. Preferably, cleavage is accomplished by acid, preferably by trifluoroacetic acid or HCl, which may be used neat in case of TFA, or as a mixture with an inert solvent, like toluene or dioxane, or a mixture thereof, or as gas in case of HCl.

Typically, CLEAVBOC is done out in a solvent which can be any solvent, which does not interfere with the reactants, like chlorinated hydrocarbons such as dichloromethane or  dichloroethane； aromatic hydrocarbons such as toluene； ethers such as THF or dioxane； or any mixture thereof.

Preferably, CLEAVBOC is done in toluene or dioxane.

Preferably, CLEAVBOC is done at atmospheric pressure.

Preferably, the reaction temperature of CLEAVBOC is from -20 to 70℃； more preferably from -15 and 60℃.

Preferably, the reaction time of CLEAVBOC is from 0.5 to 12 h.

Preferably, the progress of CLEAVBOC is monitored by HPLC and thereby the necessary reaction time is determined.

Preferably, any coupling, be it the stepwise coupling of the individual amino acids to provide FRAG1, or be it the coupling of the tetramer peptides to provide the octamer peptides, or be it the coupling of the octamer peptides； can be carried out using reaction conditions known in the art of peptide synthesis.

Preferably, in situ coupling reagents used for the coupling are for example phoshonium or uronium coupling reagents, like benzotriazol-1-yloxy-tris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate (BOP) , benzotriazol-1-yloxy-tris (pyrrolidino ) phosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) , O- (benzotriazol-1-yl) -1, 1, 3, 3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) , O- (6-chlorobenzotriazol-1-yl) -1, 1, 3, 3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU) , O- (6-chlorobenzotriazol-1-yl) -1, 1, 3, 3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TCTU) , O- (7-azabenzotriazol-1-yl) -1, 1, 3, 3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) , O- (7-azabenzotriazol-1-yl) -1, 1, 3, 3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TATU) , O- (benzotriazol-1-yl) -1, 1, 3, 3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU) , O- [cyano (ethoxycarbonyl) methylenamino] -1, 1, 3, 3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TOTU) and (1-cyano-2-ethoxy-2-oxoethylidenaminooxy) dimethylamino-morpholino-carbenium hexafluorophosphate (COMU) ；

or carbodiimide coupling reagents, like diisopropylcarbodiimide (DIC) , dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and water-soluble carbodiimides (WSCDI) like 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) , optionally as salt like as hydrochloride salt.

Other coupling techniques use pre-formed active esters, such asN-hydroxysuccinimide (HOSu) and p-nitrophenol (HONp) esters, pre-formedsymmetrical anhydrides, non-symmetrical  anhydrides such as N-carboxyanhydrides (NCAs) and acid halides, such as acyl fluorides or acyl chlorides.

Preferred coupling reagents are carbodiimide coupling reagents and phoshonium coupling reagents, most preferred coupling reagents are selected from group consisting of PyBOP, DCC, DIC and EDC；

more preferably, coupling reagents arePyBOP, DCC or EDC.

EDC is preferably used as a salt, more preferably as EDC. HCl.

Preferably, the molar amount of coupling reagent is from 1 to 10 times, more preferably from 1 to 5 times, of the molar amount of the substrate, such as the AA or the fragment respectively, that is to be coupled.

Any coupling can be done in the presence of a base, preferably a tertiary amine base, which both deprotonates the COOH residue of the carboxylic component and neutralizes any counterion of the NH₂ residue of the amino component in the coupling, and thus facilitates the coupling reaction.

Suitable bases are for example trialkylamines, like N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) or triethylamine (TEA) ；

N, N-dialkylanilines, like N, N-diethylaniline；

2, 4, 6-trialkylpyridines, like 2, 4, 6-trimethylpyridine； and

N-alkylmorpholines, like N-methylmorpholine.

Preferably, coupling is done in the presence of DIPEA as a base.

Preferably, the molar amount of base is from 1 to 3 times of the molar amount of the substrate, such as the AA or the fragment respectively, that is to be coupled.

Any coupling can be done in the presence of an auxiliary nucleophile as additive due to their positive effect in suppressing undesiredside reactions. Any known auxiliary nucleophile may be used.

Examples of suitableauxiliary nucleophiles are 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) , N-hydroxysuccinimide (HOSu) , N-hydroxy-3, 4-dihydro-4-oxo-1, 2, 3-benzotriazine (HOOBt) and 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt) .

Preferably, HOBt or HOAt are used as auxiliary nucleophile.

Preferably, the molar amount of auxiliary nucleophile is from 0.5 to 3 times of the molar amount of the AA or the fragment respectively, that is to be coupled.

Especially, any coupling is done using DCC/HOBt, EDC/HOBt, PyBOP/HOBt or EDC/HOAt.

Preferably, any coupling can be done in any inert solvent which candissolve the reactants. Preferred solvents for the coupling are water-misciblesolvents like dimethyl sulfoxide (DMSO) , dioxane, tetrahydrofurans such as tetrahydrofurane (THF) or methyltetrahydrofurane (Methyl-THF) , 1-methyl-2-pyrrolidone (NMP) , N, N-Dimethylformamide (DMF) , N, N-Dimethylacetamide (DMA) , orany mixture thereof； and non water-miscible solvents like dichloromethane (DCM) , ethylacetate or any mixture thereof； and any suitable mixture between water-miscible andnon water- miscible solvents, including mixtures with water.

More preferably, coupling is done in a solvent selected from the group consisting of dichloromethane, Me-THF, DMF, NMP, and mixtures thereof.

Preferably, the coupling is done at atmospheric pressure.

Preferably, the reaction temperature of the coupling is from -20 to 70℃； more preferably from -15 and 40℃, even more preferably from -15 to 30℃.

Preferably, the reaction time of the coupling is from 1 to 48 h.

Preferably, the progress of the coupling is monitored by HPLC and thereby the necessary reaction time is determined.

Any amidation of the C-terminal COOH residue or of the COOH residue of an amino acid, is, in the sense of the invention, also a coupling, it is a coupling between the C-terminal COOH residue and an ammonium donor. Therefore all the embodiments described for coupling apply also for the amidation.

Preferably, the ammonium donoris NH₃, or a salt thereof, such as chloride, acetate, or trifluoroacetate salt.

Preferably, the ammonium donor is NH₄Cl or NH₄OAc.

Preferably, the molar amount of ammonium donor is from 3 to 7 times of the molar amount of the COOH residue that is to be amidated.

Preferably, amidation is done using EDC/HOBt, or EDC/HOAt.

Preferably, Ac on an N-terminal NH₂ residue or on an alpha amino residue of an amino acid, is introduced by a reaction ACETYLA, wherein the N-terminal NH₂ is reacted with an acetyl donor.

The acetyl donor can be acetic anhydride or acetic acid.

Preferably, the molar amount of acetyl donor is from 1 to 2 times of the molar amount of the amino residue that is to be acetylated.

In case of acetic acid ACETYLA actually is, in the sense of the invention, also a coupling, it is a coupling between an N-terminal NH₂ residue or an alpha amino residue of an amino acid, and the COOH residue of acetic acid. Therefore all the embodiments described for coupling apply also for ACETYLA.

Preferably, ACETYLA is done using EDC/HOBt or EDC/HOAt, more preferably EDC/HOBt.

Preferably, ACETYLA is done in the presence of a base, preferably in the presence of diisopropylethylamine.

Preferably, ACETYLA is done in a solvent, preferably in DMF or ACN.

Preferably, ACETYLA is done at atmospheric pressure.

Preferably, the reaction temperature of ACETYLA is from -20 to 70℃； more preferably from -15 and 60℃, even more preferably from -10 to 40℃.

Preferably, the reaction time of ACETYLA is from 1 to 48 h, more preferably from 1 to 12 h. Preferably, the progress of ACETYLA is monitored by HPLC and thereby the necessary reaction time is determined.

RADA-16, as it is obtained in crude form after cleavage of any side chain protecting groups, can be purified by conventional methods known to the skilled person, for example by HPLC.

Preferably, RADA-16 is obtained as TFA salt after the cleavage of any side chain protecting groups. If the HCl salt or a different salt is desired then a conventional salt exchange method known to the skilled person can be applied.

Preferably, any purification or salt exchange is done using MeOH or EtOH as one of mobile phases.

A preferred route to Ac- [Arg-Ala-Asp-Ala] ₄-NH₂. TFA using Arg in its side chain protected form Arg (NO₂) is shown in formula schemes 1, 2, 3 and 4.

Formula Scheme 1

Formula Scheme 2

Formula Scheme 3

Formula Scheme 4

A preferred route to Ac- [Arg-Ala-Asp-Ala] ₄-NH₂. TFA using Arg with unprotected side chain is shown in formula schemes A, B, C and D.

Formula Scheme A

Formula Scheme B

Formula Scheme C

Formula Scheme D

Examples

Materials

Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OBzl) -OHand Boc-Arg (NO₂) -OH and Boc-Arg-OH. HCl. H₂Owere purchased from GL Biochem.

Pd (PPh₃) ₄ was purchased from Alfa Aesar.

Pd/C was purchased from Johnson Matthey； product Type A109047-5.

Methods

Determination of purity was done by HPLC:

HPLC conditions for all in-process control (IPC) and intermediates

Instrument: Waters 2695 or coordinative VWD HPLC

Column: Nucleosil 100-5 C18, 250mm×4.6mm, 5μm

Mobile phases:

A＝0.1％TFA aqueous solution

B＝0.1％TFA in acetonitrile solution

Wavelength: 215nm

Flow rate: 1.0mL/Min

Temperature: 15-25℃

Detector: Waters 2996

Gradient: from 5％to 85％of B in 20 mins, then keep 5mins.

HPLC conditions for final crude peptide

Instrument: Waters 2695 or coordinative VWD HPLC

Column: Nucleosil 100-5 C18, 250mm×4.6mm, 5μm

Mobile phases:

A＝0.1％TFA aqueous solution

B＝0.1％TFA in acetonitrile solution

Wavelength: 215nm

Flow rate: 1.0mL/Min

Temperature: 15-25℃

Detector: Waters 2996

Gradient: from 5％to 40％of B in 25 mins, then keep 5mins.

Examples 1 to 4 show the synthesis of Ac- [Arg-Ala-Asp-Ala] ₄-NH₂. TFA using NO₂-protected Arg as starting material.

Examples 5 and 6 show the synthesis of Ac- [Arg-Ala-Asp-Ala] ₄-NH₂. TFA using unprotected Arg as starting material.

Example 7 shows purification and exchange of TFA against HCl

Example 1

The fragment Boc-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll was synthesized according to Formula Scheme 1.

1 (1) Synthesis of Boc-Ala-OAll

Boc-Ala-OH+ Br-CH₂-CH＝CH₂ -> Boc-Ala-OAll

K₂CO₃ (0.134 kg, 1.50 eq) is added to mixture of DMF (0.61 kg) and Boc-Ala-OH (1.0 eq, 0.122 kg) at 25 ℃. After 0.5 h stirring at 25 ℃, 3-bromopropene (0.122 kg, 1.56 eq) was charged drop wise while the temperature was maintained at 25±5 ℃. After about 3 hours, the reaction was complete as shown by HPLC monitoring. Then the reaction mixture was filtered. The wet cake was washed twice with ethyl acetate (0.73 kg each time, total 1.46 kg) . The filtrate and washes were combined and mixed with deionizedwater (1.46 kg) and this mixture was extracted three times with ethyl acetate (0.61 kg each time, total 1.83 kg) . All organic phases were combined and washed twice with saturedbrine (0.14 kg each time, total 0.28 kg) . The organic phase was dried with anhydrous MgSO₄ (0.061 kg) for 1 h, then the dried organic phase was filtered and the wet cake was washed twice with ethyl acetate (0.61 kg each time, total 1.22 kg) . The filtrate and washes were combined and concentrated at 40±5 ℃ in vacuum, followed by azeotropic distillations twice with dioxane (0.122 kg each time, total 0.244 kg) in vacuum to afford the product Boc-Ala-OAll as concentrated oil, that was used in the next step.

HPLC purity: 94.3％.

Boc-Ala-OAll is compound of formula (1) .

1 (2) Synthesis of HCl. H-Ala-OAll

Boc-Ala-OAll + HCl gas -> HCl. H-Ala-OAll

The concentrated oil containing Boc-Ala-OAll was diluted with dioxane (620 ml) . To the mixture, HCl gas (186 g) was charged by bubbling while the temperature was maintained at 20±5℃. After 1 hour, the reaction mixture was evaporated in vacuum, and then the residue was dried by azeotropic distillations with dioxane (120 ml) and ethyl acetate (120 ml) successively. HCl. H-Ala-OAll was isolated as an oil and was directly used in the next coupling step with Boc-Asp (OBzl) -OH.

1 (3) Synthesis of Boc-Asp (OBzl) -Ala-OAll

Boc-Asp (OBzl) -OH + HCl. H-Ala-OAll + DCC/HOBt -> Boc-Asp (OBzl) -Ala-OAll

The oil containingHCl. H-Ala-OAll (200 g, 1.00eq) was neutralized with a mixture of diisopropylethylamine (91.7 g, 1.10eq compared to Boc-Ala-OH) in dichloromethane (1000 ml) and with 13wt％brine (600 ml) at 0 ℃. The organic phase was dried with anhydrous MgSO₄ (100 g) . After 1 h, the mixture was filtered and the wet cake was washed twice with dichloromethane (70 ml each time, total 140 ml) . The filtrate and washes were combined. Boc-Asp(OBzl) -OH (175 g, 0.84 eq) and HOBt. H₂O (83 g, 1.00 eq) were successively added. Then a solution of DCC (111 g, 1.00 eq) in dichloromethane (400 ml) was added while the temperature was maintained at –6℃±5℃. The mixture was stirred for 1 h at –6℃±5℃, and then was allowed to warm up to 20℃. After about 1 hour stirring at 20 ℃, the reaction was complete as shown by HPLC monitoring. Then the reaction mixture was filtered. The filtrate was washed twice with 5wt％aqueous NaHCO₃ (600 ml each time, total 1200 ml) , twice with 10wt％aqueous KHSO₄ (600 ml each time, total 1200 ml) , twice with 20wt％brine (600 ml each time, total 1200 ml) successively. Then the organic phase was concentrated in vacuo at jacket temperature 40℃± 5℃ and was dried by azeotropic distillations twice with dioxane (400 ml each time, total 800 ml) to afford an oil, that was used in the next step.

HPLC purity: 92.28％.

1 (4) Synthesis of HCl. H-Asp (OBzl) -Ala-OAll.

Boc-Asp (OBzl) -Ala-OAll + HCl gas -> HCl. H-Asp (OBzl) -Ala-OAll

The oil containing Boc-Asp (OBzl) -Ala-OAll was diluted with dioxane (500 ml) . To the mixture, HCl gas (225 g) was charged by bubbling while the temperature was maintained at 20± 5℃. After 1 hour, the reaction mixture was evaporated in vacuum, and then the residue was dried by azeotropic distillations twice with dioxane (150 ml each time, total 300 ml) . The oily residue was directly used in the next coupling step.

1 (5) Synthesis of Boc-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll.

                                  DCC/HOBt

Boc-Ala + HCl. H-Asp (OBzl) -Ala-OAll -> Boc-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll

The oily residue containing HCl. H-Asp (OBzl) -Ala-OAll (148 g, 1.0 eq) wasneutralized with diisopropylethylamine (59 g, 1.1 eq) in dichloromethane (750 ml) and 13％brine (450 ml) at 0 ℃. The organic phase was dried with anhydrous MgSO₄ (75 g) . After 1 hour, the solid was removed by filtration and wet cake was washed twice with dichloromethane (55 ml each time, 110 ml) . The filtrate and washes were combined. Boc-Ala-OH (78 g, 1 eq) and HOBt. H₂O (63 g, 1.00 eq) were successively charged into H-Asp (OBzl) -Ala-OAll dichloromethane solution. Then a solution of DCC (102 g, 1.20 eq) in dichloromethane (320 ml) was charged slowly while the temperature was maintained at –6℃ ± 5℃. The mixture was stirred for 1 hours at -6℃ ± 5℃, and then allowed to warm up to 20 ℃. After about 8 hours, the coupling was complete as shown by HPLC monitoring. Then the salts and resulting DCU were removed by filtration. The filtrate was washed twice with 5％NaHCO₃ (450 ml each time, total 900 ml) , twice with 10％KHSO₄ (450 ml each time, total 900 ml) , twice with 20％brine (450 ml each time, total 900 ml) successively. Then the organic phase was concentrated in vacuum at jacket temperature 40℃± 5℃ and was dried by azeotropic distillations twice with dioxane (300 ml each time, total 600 ml) to afford an oil which was directly used in the next deprotection step.

HPLC purity: 93.3％.

1 (6) Synthesis of HCl. H-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll

                             HCl gas

Boc-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll -> HCl. H-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll

The oil containing Boc-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll (14 g, 1.00eq) was dissolved with dioxane (100 ml) . To the mixture, HCl gas (21.0 g) was charged by bubbling while temperature was maintained at 20±5℃. After 1 hour, the reaction mixturewas evaporated in vacuo, and then the residue was dried twice by azeotropic distillations with dioxane (14 ml each time, total 28 ml) . The oily product was directly used in the next coupling reaction with Boc-Arg (NO₂) -OH.

1 (7) Synthesis of Boc-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll

Boc-Arg (NO₂) -OH + HCl. H-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll

DCC /HOBt

-> Boc-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll

The oily product containing HCl. H-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll (116 g, 1.00eq) was neutralized with diisopropylethylamine (39.7 ml, 1.10eq) in Me-THF (1080 ml) and 13％brine (300 ml) at 0 ℃. The organic phase was dried with anhydrous MgSO4 (58 g) . After 1 hour, the solid was removed by filtration and wet cake was washed twice with Me-THF (70 ml each time, total 140 ml) . The filtrate and washes were combined. Boc-Arg (NO₂) -OH (86 g, 1 eq) and HOBt. H₂O (41.4 g, 1.00 eq) were successively charged into the H-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll in Me-THF solution. Then a solution of DCC (61 g, 1.10 eq) in DMF (120 ml) and Me-THF (270 ml) were charged slowly while temperature was maintained at –6℃ ± 5℃. The mixture was stirred for 1 hour at –6℃ ± 5℃, and then allowed to warm up to 20 ℃After about 2 hours at 20 ℃, the coupling was complete as shown by HPLC monitoring. The salts and resulting DCU were removed by filtration. The filtrate was washed twice with 5％NaHCO₃ (220 ml each time, total 440 ml) , twice with 10％KHSO₄ aqueous solution (220 ml each time, total 440 ml) , twice with 20％brine (220 ml each time, total 440 ml) successively. Then the organic phase was concentrated in vacuo at jacket temperature 40℃± 5℃ until an oily residue was obtained. Then the oily residue was heated to 50±5℃, diisopropyl ether (200 ml) was charged drop wise in 1 hour, followed by addition of a mixture of diisopropyl ether (200 ml) and Me-THF (330 ml) in 1 hour. After addition of mixed solvents, the suspension was cooled to 35±5℃ in 1 hour. Then the suspension was stirred for 1 hour and was filtered. The wet cake was washed three times with diisopropyl ether (480 ml each time, total 1440 ml) . The wet cake was dried under vacuum. at 35 ±5 ℃

Purity: 92.2％

Global yield: 28％

Example 2

The fragment Boc-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll was used to synthesize TFA. H- [Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala] ₂-NH₂ according to Formula Scheme 2, which is the protected C-terminal end dimer of the target product.

2 (1) Synthesis of Boc-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-OH

                                  Pd (PPh₃) ₄

Boc-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll ->Boc-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-OH

Boc-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll (40 g, 1.00eq) , prepared according to example 1 (7) , was dissolved in DMF (160 ml) and acetonitrile (100 ml) at 20±5℃. Then morpholine (24.7 g, 5.00eq) was charged in one portion. To the mixture, N₂was charged by bubbling to drive off residual oxygen in the mixture. After 0.5 hours, Pd (PPh₃) ₄ (1.3, 0.02eq) was charged. The mixture was stirred under N₂ atmosphere. After about 1 hour, the reaction was complete as shown by HPLC monitoring. The organic mixture was washed three times with 10％ KHSO₄ aqueous solution (80 ml each time, total 240 ml) , twice with 20％brine (80 ml each time, total 160 ml) successively. Then the organic phase was concentrated in vacuo at jacket temperature 40±5℃ and was dried by azeotropic distillations with acetonitrile (100 ml) to afford an oil.

The oil was used in the step (2) and step (2a) respectively.

2 (2) Synthesis of Boc-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-NH₂

Boc-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-OH -> Boc-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-NH₂

The oil containing Boc-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-OH (21.5 g, 1.00 eq) , prepared according to example 2 (1) , was dissolved with DMF (80 ml) and acetonitrile (50 ml) at 20±5℃. Ammonium acetate (12.4 g, 5.00 eq) , HOBt. H₂O (4.9 g, 1.00 eq) and EDC. HCl (8 g, 1.3 eq) were charged successivelyAfter about 24 hours stirring at 20 ℃, the amidation was complete as shown by HPLC monitoring. The reaction mixture was concentrated under vacuum at 55 ±5℃ to afford an oily residue, which was dissolved in Me-THF (250 ml) . This solution was washed twice with 5％NaHCO₃ (45 ml each time, total 90 ml) , twice with 10％KHSO₄ aqueous solution (45 ml each time, total 90 ml) , twice with 20％brine (45 ml each time, total 90 ml) successively. Then the organic phase was concentrated in vacuum at jacket  temperature 40℃± 5℃ to afford an oily residue. DMF (45 ml) was charged to dissolve the residue and the mixture was heated to 50±5℃. A mixture of diisopropyl ether (120 ml) and ethyl acetate (270 ml) was charged while temperature is maintained at 50±5℃. The resulting suspension was cooled to 10±5℃ in 2 hours and stirred for 1 hour and filtered. The wet cake was washed three times with diisopropyl ether (once with 60 ml, twice with 180 ml) . Wet cake was dried under vacuum at 35±5℃.

Purity: 94.7％

Yield: 38％

2 (3) Synthesis of HCl. H-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-NH₂.

Boc-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-NH₂-> HCl. H-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-NH₂

Boc-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-NH₂ (14.3 g, 1eq) , prepared according to example

2 (2) , was mixed with dioxane (150 ml) . To the mixture, HCl gas (21.5 g) was charged by bubbling while the temperature was maintained at 20±5℃. After 1 hour, the supernatant was discarded and the remaining oily residue was evaporated and was dried twice by azeotropic distillations in vacuum with dioxane (15 mleach time, total 30 ml) .

2 (4) Synthesis of Boc- [Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala] ₂-NH₂

Boc-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-OH + HCl. H-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-NH₂

EDC/HOBt

    ->Boc- [Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala] ₂-NH₂

HCl. H-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-NH₂ (2.3 g, 1.00 eq) , prepared according to example 2 (3) , was dissolved with DMF (15 ml) at 20±5℃. Diisopropylethylamine (0.9 ml, 1.4eq) , HOBt. H₂O (0.9 g, 0.9 eq) and Boc-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-OH (2.3 g, 0.9 eq) , prepared according to example 1 (1a) , wereadded successively. Then the mixture was cooled to 0℃, EDC. HCl (1.1 g, 1.5eq) was added. The reaction mixture is allowedto reach room temperature (20 ℃) and was stirred about 20 hours to reach complete coupling. The reaction mixture was concentrated in vacuum at 55±5 ℃ until 7 ml distillate is collected. Then the residue was poured into 2wt％aqueous NaHCO₃ (35 ml) solution at 20±5℃. Then the formed suspension was filtered and the wet cake was washed three times with deionizedwater (5 ml each time, Total 15 ml) . The wet cake is dried in vacuo at 35 ±5℃.

Purity: 83％.

Yield: 71％

2 (5) Synthesis of TFA. H- [Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala] ₂-NH₂

Boc- [Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala] ₂-NH₂

TFA/Toluene

    ->TFA. H- [Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala] ₂-NH₂

Boc- [Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala] ₂-NH₂ (2 g, 1.00eq) , prepared according to example 2 (4) , was mixed with toluene (12 ml) at 20± 5℃. To the mixture, TFA (8 ml) was added drop wise while the temperature was maintained at 20±5℃. After 1 hour, diisopropyl ether (40 ml) was added in 1 h, then the resulting suspension was filtered and the wet cake was washed three times with diisopropyl ether (5 ml each time, total 15 ml) . The wet cake was dried in vacuum at 35±5 ℃.

Purity: 85.7％

Yield: 100 ％

Example 3

The fragment Boc-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll was used to synthesize Ac- (RADA) ₂-OH according to Formula Scheme 3, which is the protected N-terminal end dimer of the target product.

3 (1) Synthesis of HCl. H-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll

Boc-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll -> HCl. H-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll

Boc-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll (10 g, 1eq) , prepared according to example 1 (7) , was mixed with dioxane (100 ml) . To the mixture, HCl gas (15 g) is charged by bubbling while the temperature was maintained at 20±5℃. After 1 hour the reaction was complete. The supernatant was discarded and the remaining oily residue was evaporated and was dried twice by azeotropic distillations in vacuum with dioxane (10 ml each time, total 20 ml) . The oily residue was directly used.

3 (2) Synthesis of Ac-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll

                                   Ac₂O

HCl. H-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll -> Ac-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll

The oily residue (11 g, 1.00 eq) containing HCl. H-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll was dissolved with DMF (55 ml) at 20±5℃ and the solution was cooled to 0±5℃. Diisopropylethylamine (3.2 g, 1.40 eq) and acetic anhydride (4.1 g, 1.40 eq) were charged successively while the temperature was maintained at 0±5℃. After addition of acetic anhydride, the reaction mixture is allowed to warm to 20±5℃. Normally this reaction goes to completion in 3 hour at 20 ℃ as shown by HPLC monitoring. The reaction mixture was directly used in the next step.

3 (3) Synthesis of Ac-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-OH

                                  Pd (PPh₃) ₄

Ac-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll ->Ac-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-OH

Morpholine (6.7 g, 5.00eq) was charged into the reaction mixturecontaining Ac-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll (10 g, 1 eq) at 20±5℃. N₂ is bubble through the solution during 0.5 hour to remove traces of oxygen. Pd (PPh₃) ₄ (0.35 g g, 0.02eq) was added. The reaction mixture was stirred under N₂ atmospherefor about 2 hours. The reaction mixture was concentrated in vacuum at 55±5 ℃ until about 25 ml residue remained. Me-THF (120 ml) was added to dissolve the residue at 20±5℃, and then the solution was washed with 10wt％aqueous KHSO₄ (30 ml) . The aqueous phase was extracted twice with Me-THF (25 ml each time, total 50 ml) . All organic phases were combined and concentrated in vacuum at 40±5 ℃℃ until about 80 ml residue was obtained. Ethyl acetate (60 ml) was charged and the suspension was cooled to 10±5℃ in 1 h. The suspension was filtered. The cake was washed with ethyl acetate twice (40 ml each time, total 80 ml) and diisopropyl ether (40 ml) successively. The wet cake was dried in vacuum at 35±5 ℃.

Purity: 96.1％

Global yield of the 3 steps3 (1) , 3 (2) and 3 (3) : 71％

3 (4) Synthesis of Ac- [Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala] ₂-OAll

Ac-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-OH + HCl. H-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll

EDC/HOBt

    ->

Ac- [Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala] ₂-OAll

The oily residue containing HCl. H-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll (6.3 g, 1.00 eq) , prepared according to example 3 (1) , was dissolved in a mixture of 0.4 M LiCl in DMF (42 ml) at 20±5℃. Diisopropylethylamine (1.5 g, 1.20 eq) , HOBt. H₂O (1.6 g, 1.00 eq) and Ac-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-OH (6 g, 1.00 eq) , prepared according to example 3 (3) , were charged successively. Then the mixture was cooled to 0℃ and EDC. HCl (2.3 g, 1.2eq) was charged. The reaction mixture is let to warm up to 20 ℃ and stirred for about 4 hours up to completion as shown by HPLC monitoring. The reaction mixture was concentrated in vacuum at 55±5 ℃ until 18 ml distillate is collected. Then the residue is poured into aqueous 2％ NaHCO3 (90 ml) at 20±5℃. Then the formed suspension is filtered. The cake is washed twice with water (12 ml each time, Total 24 ml) and twice with ethyl acetate (15 ml each time, Total 30 ml) successively. Wet cake is dried in vacuum at 35±5 ℃.

Purity: 82.1％

Yield: 83％

3 (5) Synthesis of Ac- [Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala] ₂-OH

Ac- [Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala] ₂-OAll -> Ac- [Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala] ₂-OH

Ac- [Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala] ₂-OAll (6.3 g, 1.00eq) , prepared according to example 3 (4) , was dissolved in DMF (80 ml) , followed by addition of 1, 3-dimethyl barbituric acid (2.5 g, 3.00eq) at 20±5℃. N₂ is bubbled through the solution during 0.5 hour to remove the oxygen. Pd (PPh₃) ₄ (0.1 g, 0.02eq) was charged. The reaction mixture was stirred under N₂ atmosphereduring about 2 hours up to completion as shown by HPLC monitoring. The reaction mixture was concentrated in vacuum at 55±5℃ until aresidual volume of about 25 ml. Deionizedwater (100 ml) was charged to induce precipitation. The resulting suspension was filtered. The wet cake was washed with deionized water twice (20 ml each time, total 40 ml) and ethyl acetate three times (25 ml each time, total 75 ml) successively. The wet cake was dried in vacuum at 35±5 ℃.

Purity: 85.2％

Yield: 72％

Example 4

The protected N-and C-terminal end dimerswere connected and deprotected by catalytic hydrogenation according to Formula Scheme 4 to produce Ac- [Arg-Ala-Asp-Ala] ₄-NH₂. TFA.

4 (1) Synthesis of Ac- [Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala] ₄-NH₂

Ac- [Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala] ₂-OH + TFA. H- [Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala] ₂-NH₂

->Ac- [Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala] ₄-NH₂

TFA. H- [Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala] ₂-NH₂ (0.2 g, 1.00 eq) , prepared according to example 2 (5) , was dissolved in NMP (3 ml) at 20±5℃. Diisopropylethylamine (0.065 ml, 2.30 eq) , HOBt. H₂O (0.026 g, 1.00 eq) , Ac- [Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala] ₂-OH (0.188 g, 1.00 eq) , prepared according to example 3 (5) , and PyBOP (0.128 g, 1.50 eq) were charged successively. After about 40 hours stirring at 20 ℃, the reaction was complete as shown by HPLC monitoring. The reaction mixture was concentrated in vacuum at 55±5 ℃ until 0.6 ml distillate was collected. Then the residue was poured into aqueous 2wt％aqueous NaHCO₃ (3 ml) at 20±5℃. The resulting suspension was filtered and the cake was washed twice with deionizedwater (0.4 ml each time, total 0.8 ml) and twice with ethyl acetate (0.4 ml each time, total 0.8 ml) successively. The wet cake wasdried in vacuum at 35±5 ℃.

Purity: 68％

Yield: 78％

4 (2) Synthesis of Ac- [Arg-Ala-Asp-Ala] ₄-NH₂as crude TFA salt

Ac- [Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala] ₄-NH₂-> Ac- [Arg-Ala-Asp-Ala] ₄-NH₂. TFA

Ac- [Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala] ₄-NH₂ (0.5 g, 1.00 eq) , prepared according to example 4 (2) , was dissolved in a flask in TFA (5 ml) at 20±5℃, followed by addition of Pd/C (loading: 5wt％, water content: 53wt％) (0.71 g) . The flask was evacuated, refilled with H₂ three times and then pressurized with 1.1 atm of H₂ at 20±5℃. After about 2 hours stirring, the reaction was complete as shown by HPLC monitoring. Then the reaction mixture was filtered through celite to remove Pd/C particle. TFA (3 ml) was charged to wash the wet celite cake. TFA filtrates were combined and concentrated in vacuum at 45±5 ℃ until a residual volume of about 2 ml. The residue was poured into diisopropyl ether (7 ml) at 20±5℃. The resulting  suspension was filtered. The cake was washed three times of diisopropyl ether (1.5 ml each time, total 4.5 ml) and dried in vacuum at 35±5 ℃.

Purity: 58％

Yield: 62％

Example 5

The fragment Boc-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll (1) is synthesized by stepwise assembly according to Formula Scheme A.

5 (1) Synthesis of Boc-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll

                                          EDC /HOBt

Boc-ArgOH +HCl. Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll -> Boc-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll

A residue containing HCl. H-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll (79.5 g, 1.0 eq) , prepared according to example 1 (6) , was dissolved in DCM (400 ml) . The solution was washed with aqueous 5wt％NaHCO₃ solution. The pH of aqueous phase was adjusted to 7.5 to 7.8. Then the organic phase was separated and concentrated under vacuum at 35℃. DMF (290 ml) was added. The resulting solution was cooled to 0℃. Then HOBt. H₂O (19.9 g, 1.0 eq) and Boc-Arg-OH. HCl. H₂O (50.9 g, 1.1 eq) was charged successively. EDC. HCl (49.5 g, 1.3eq) was added slowly and while maintaining the inner temperature below 3℃. Then the reaction mixture was stirred at 3 ℃ for 2 h. Then the reaction mixture was allowed to warm to 20℃ in 1h. After about 2 hours stirring at 20 ℃, the reaction was complete as confirmed by HPLC monitoring. Then the mixture was concentrated to an oily residue under vacuum at 45±5℃. DCM (360 ml) was charged to dilute the oily residue. The solution was washed with 20wt％brine (870 ml each time, total 2610 ml) for 3 times. The organic phase was concentrated under vacuum at 35℃. Then DIPE (1850 ml) was charged. The mixture was stirred at RTduring at least 2 hours until the mixture became uniform suspension. The mixture was filtered. The cake was washed with DIPE (220 ml) . The cake dried at 40 ℃ overnight.

Crude yield: 92.8％.

Purity: 97.7％

Example 6: Synthesis of Ac- (RADA) ₄-NH₂

The fragment Ac- (Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala) ₂-OH was prepared according to Formula Scheme B.

The fragment TFA. H- (Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala) ₂-NH₂was prepared according to Formula Scheme C.

The fragment Ac- (Arg-Ala-Asp-Ala) ₄-NH₂. TFA was prepared according to Formula Scheme D.

6 (1) Synthesis of TFA. H-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll

Boc-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll ->TFA. H-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll

TFA (150 ml) was cooled to 10℃. Then Boc-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll (25 g) , prepared according to example 5 (1) , was added slowly while maintaining the temperature below 20℃. Then the resulting mixture was stirred at 20±5℃ for 1h. Then DCM (50 ml) was added to quench this reaction. Then the mixture was concentrated under vacuum at 30±5℃. Azeotropic distillation of the residue was done twice with ACN (380 ml) to remove most of residual TFA. DIPE (240 ml) was added to the residue. The mixture was stirred at RT for 30min. Then the upper liquid phase was poured out. DIPE (340 ml) was added to the residue. The mixture was stirred at RT during at least 2 hoursuntil the mixture became uniform suspension. Then the mixture was filtered. The cake was washed with DIPE (68 ml) . The cake was dried at 40 ℃ overnight.

Crude yield: 98.5％.

Purity: 96.5％

6 (2) Synthesis of Ac-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll

TFA. H-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll -> Ac-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll

TFA. H-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll (23.3 g, 1.0 eq) , prepared according to example 6 (1) , was dissolved in ACN (280 ml) . The solution was cooled to 0℃. Then DIPEA (7.4 ml, 1.2 eq) was added while maintaining the temperature below 10℃. Acetic acid (2.53 g, 1.2 eq) was added, followed by addition of HOBt. H₂O (4.7 g, 1.0 eq) . Then EDC. HCl (7.9 g, 1.3 eq) was added while maintaining the temperature below 3℃. thenthe reaction mixture was stirred at 3℃ for 2 h. Then it was allowed to warm to 20 ℃ within 1h. After about 1 hour stirring, the reaction was complete as shown by HPLC monitoring. Then the mixture was concentrated to an oily liquid under vacuum at35±5℃. DCM (230 ml) and DIPE (230 ml) were charged to the residue. The resulting mixture was stirred at RT for 30min. The upper liquid phase was poured out. DCM (230 ml) was added to dilute the residue. The mixture was stirred at  RTduring about 2 hours until the mixture became uniform suspension. The mixture was filtered. The cake was washed with DCM (35 ml) . The cake was dried at 40 ℃ overnight.

Crude yield: 109.7％.

Purity: 98.24％

6 (3) Synthesis of Ac-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OH

Ac-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll -> Ac-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OH

Ac-Arg-Asp (OBzl) -Ala-OAll (25 g, 1.0 eq) , prepared according to example 6 (2) , was dissolved in in DMF (260 ml) . 1, 3-Dimethyl-barbituric acid (19.5 g, 3.0 eq) was added followed by addition of Pd (PPh₃) ₄ (1.4 g, 0.04 eq) . The resulting mixture was degased and backfilled with nitrogen atmosphere for 3 times. As shown by HPLC monitoring, the reaction was complete after about 3 hours stirring at 20 ℃. Then the mixture was concentrated to an oily liquid under vacuum at 45±5℃. DCM (250 ml) and DIPE (250 ml) were added to the residue. The resulting mixture was stirred at RT for 30min. The upper liquid phase was poured out. DCM (150 ml) was added. The mixture was stirred at least 2 hours at RT until the mixture became a uniform suspension. The solution was filtered. The cake was washed with DCM (40 ml) . The cake was dried at 40℃ overnight.

Crude yield: 86.1％.

Purity: 96.77％

6 (4) Synthesis of Ac- (Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala) ₂-OAll

Ac-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OH + TFA. H-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll

-> Ac- (Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala) ₂-OAll

TFA. H-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll (25 g, 1.0 eq) , prepared according to example 6 (1) , was dissolved in DMF (100 ml) . The solution was cooled to 0℃. Then DIPEA (8.1 ml) was added while maintaining the temperature below 10℃. Ac-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OH (23 g, 1.0 eq) , prepared according to example 6 (3) as a solution in DMF (120 ml) was added. Then HOBt. H₂O (4.6 g, 1.0 eq) was added followed by addition of EDC. HCl (8.3 g, 2eq) while maintaining the temperature below 3℃. The mixture was stirred at 0℃ for 2h. Then the mixture was allowed to warm to 20℃ within 1h. After 2 additional hours stirring at 20 ℃, the reaction was complete as shown by HPLC monitoring. Then the mixture was concentrated under vacuum at 45±5℃. DCM (240 ml) and DIPE (270 ml) were added to the residue. The  mixture was stirred at RT for 30 min. Then the upper clear liquid phase was poured out. Another DCM (360 ml) was added to the residue. The mixture was stirred for roughly 2 hours at RT until the mixture became anuniform suspension. The suspension was filtered. The cake was washed with DCM (30 ml) and dried at 40 ℃ overnight.

Crude yield: 77.0％.

Purity: 90.03％

6 (5) Synthesis of Ac- (Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala) ₂-OH

                                     Pd (PPh₃) ₄

Ac- (Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala) ₂-OAll -> Ac- (Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala) ₂-OH

Ac- (Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala) ₂-OAll (28 g, 1eq) , prepared according to example 6 (4) , wasdissolved in DMF (750 ml) . 1, 3-Dimethyl-barbituric acid (11.8 g, 3eq) and Pd (PPh₃) ₄ (0.9 g, 0.03eq) were added successively. Nitrogen was bubbled through the solution in order to remove traces of oxygen. Then the reaction mixture was stirred at room temperature for 3 hours andthe reaction completeness was confirmed by HPLC. The mixture was concentrated under vacuum at 45±5℃. DIPE (500 ml) was added into the residue. The mixture was stirred at room temperature for 30 min. The mixture was filtered. The cake was washed with DIPE (80 ml) and suspended in DCM (400 ml) and stirred at room temperature during 30min. Then the mixture was filtered. The cake was washed with DCM (40 ml) , suspended in ACN (360 ml) and stirred at room temperature for 30min. Then the mixture was filtered. The cake is washed with ACN (50 ml) , filtered and dried at 40 ℃ overnight.

Crude yield: 84.4％.

Purity: 91.91％

6 (6) Synthesis of Boc-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OH

                           Pd (PPh₃) ₄

Boc-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll -> Boc-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OH

To the solution of Boc-Arg-Asp (OBzl) -Ala-OAll (50 g, 1.0 eq) , prepared according to example 5 (1) in dioxane (780 ml) and DMF (210 ml) was added 1, 3-dimethyl-barbituric acid (35.5 g, 3.0 eq) . Then Pd (PPh₃) ₄ (3.5 g, 0.04 eq) was added. The resulting mixture was degased and backfilled with nitrogen atmosphere for 3 times. Then the mixture was stirred at RT for 3 hand the reaction completeness was confirmed by HPLC. Then the mixture was  concentrated to an oily liquid under vacuum at 45±5℃. DCM (500 ml) and DIPE (500 ml) were added to the residue. The resulting mixture was stirred at RT for 30min. The upper liquid phase was poured out. ACN (500 ml) was added. The mixture was stirred at RT for 30min. The liquid phase was poured out. Then ACN (250 ml) was charged. The mixture was stirred at RT for 30 min. The liquid phase was poured out. MeOH (650 ml) was charged. The mixture was stirred to dissolve. The solution was filtered. The filtrate was collected and concentrated under vacuum at 35±5℃. The solid was collected and dried at 40℃ overnight.

Crude yield: 86.1％.

Purity: 97.4％

6 (7) Synthesis of Boc-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-NH₂

Boc-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OH -> Boc-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-NH₂

Boc-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OH (20 g, 1eq) , prepared according to example 6 (6) , was dissolved in a mixture of dioxane (250 ml) and acetonitrile (100 ml) . Then a solution of NH₄Cl (8.6 g, 5 eq) in water (30 ml) was charged. The resulting mixture was cooled to 5℃. HOAt (4.4 g, 1eq) was charged followed by addition of EDC. HCl (37 g, 5eq) . During additions, the temperature was maintained at below 10℃. Then the mixture was stirred at 5℃ for 2h. Then the mixture was allowed to warm to 20℃ within 1h. After 1 additional hour stirring at 20 ℃, HPLC monitoring showed that reaction was complete. Then the mixture was filtered. The cake was washed with MeOH (150 ml) . The filtrates were collected and concentrated under vacuum at 35±5℃. Then 20 wt％brine (240 ml) was charged to the residue. The mixture was extracted with a solution of 10wt％MeOH in DCM (980 ml each time, total 2940 ml) for 3 times. The organic phase was dried over MgSO₄ (120 g) for 3h. Then the mixture was filtered. The filtrate was collected and concentrated under vacuum at 35±5℃. The resulting solid was dried at 40 ℃ overnight.

Crude yield: 121.6％.

Purity: 90.18％

6 (8) Synthesis of TFA. H-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-NH₂

Boc-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-NH₂ -> TFA. H-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-NH₂

TFA (240 ml) was cooled to 10℃ in ice-bath. Then Boc-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-NH₂ (31.5 g) , prepared according to example 6 (7) , was added while the temperature was maintained  below 20℃. Then the resulting mixture was stirred at 20±5℃ for 1h. Then DCM (60 ml) was added. Then the mixture was concentrated under vacuum at 35±5℃. The residue was dissolved in acetonitrile (450 ml) and evaporated to dryness to remove most of residual TFA. This removal of residual TFA was performed a second time. DIPE (300 ml) was charged to the residue. The mixture was stirred at RT for 30min. Then the upper liquid phase was poured out. DCM (225 ml) was charged to the residue. The mixture was stirred at RT until the mixture was an uniform suspension. Then the mixture was filtered. The cake was washed with DCM (45 ml) and dried at 40 ℃ overnight.

Crude yield: 85.5％.

Purity: 89.15％

6 (9) Synthesis of Boc- [Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala] ₂-NH₂

Boc-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OH + TFA. H-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-NH₂

EDC/HOBt

   -> Boc- [Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala] ₂-NH₂

TFA. H-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-NH₂ (17.9 g, 1.0 eq) , prepared according to example 6 (8) , was dissolved in DMF (160 ml) and cooled to 0℃. Then DIPEA (6.2 g, 1.5 eq) was added while maintaining the temperature below 10℃. A solution of Boc-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OH (20.4 g, 1.0 eq) , prepared according to example 6 (6) , in DMF (160 ml) was charged. Then HOBt. H₂O (4.3 g, 1.0 eq) was added followed by addition of EDC. HCl (12.3 g, 2eq) while the temperature was maintained below 3℃. The mixture was stirred at 0℃ for 2h. Then the mixture was allowed to warm to 20℃ within 1h. After about 1 hour stirring at 20 ℃, HPLC monitoring showed a complete reaction. Then the mixture was concentrated under vacuum at 45±5℃. DCM (170 ml) and DIPE (190 ml) were charged to the residue. The mixture was stirred at RT for 30 min. Then the upper liquid phase was poured out. DCM (250 ml) was charged to the solid. The mixture was stirred at RT for 30min. Then the solid was suspended in ACN (170 ml) and stirred at RT until the mixture became anuniform suspension. The mixture was filtered. The cake was washed with ACN (40 ml) , filtered and dried at 40 ℃ overnight.

Crude yield: 71.84％.

Purity: 90％

6 (10) Synthesis of TFA. H- [Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala] ₂-NH₂

                                TFA

Boc- (Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala) ₂-NH₂-> TFA. H- (Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala) ₂-NH₂

TFA (100 ml) was cooled to 10℃. Boc- (Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala) ₂-NH₂ (26 g) , prepared according to example 6 (9) , was added while maintaining the temperature below 20℃. The resulting mixture was stirred at 20±5℃ for 1h. Then DCM (45 ml) was added. Then the mixture was concentrated under vacuum at 3±5℃. The residue was dissolved in ACN (350 ml) and evaporated to dryness for removal of residual TFA. This removal of residual TFA was performed a second time. ACN (270 ml) was charged to the residue and a the mixture was stirred at RT until obtaining an uniform suspension. After filtration, the cake was suspended in ACN (60 ml) , filtered and dried at 40 ℃ overnight.

Crude yield: 100％.

Purity: 90.17％

6 (11) Synthesis of Ac- (Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala) ₄-NH₂

Ac- (Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala) ₂-OH + TFA. H- (Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala) ₂-NH₂

->Ac- (Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala) ₄-NH₂

Ac- (Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala) ₂-OH (20.5 g, 1eq) , prepared according to example 6 (5) , was dissolved in DMF (1700 ml) . TFA. H- (Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala) 2-NH2 (24.1 g, 1eq) , prepared according to example 6 (10) was dissolved in DMA (500 ml) . The two solutions were combined and cooled to 0℃. Then DIPEA (2.7 g, 1.05 eq) and HOAt (2.2 g, 1eq) were added. Then EDC. HCl (6.1 g, 2eq) was added while maintaining the temperature below 3℃. Then the mixture was stirred at 0℃ for 2h. Then the mixture was allowed to warm to 20℃ within 1h. After about 40 hours stirring at 20 ℃, the HPLC monitoring showed a complete reaction. Then the mixture was concentrated under vacuum at 55±5℃. ACN (480 ml) and DIPE (530 ml) were added to the residue. The mixture was stirred at RT for 30 min. Then the upper liquid phase was poured out. ACN (500 ml) was added to the residue. The mixture was stirred at RT until the mixture became anuniform suspension. Then the mixture was filtered and the cake is washed with ACN (50 ml) . The cake was dried at 40 ℃ overnight.

Crude yield: 103.8％.

Purity: 81.35％

6 (12) Synthesis of Ac- (Arg-Ala-Asp-Ala) ₄-NH₂. TFA

Ac- (Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala) ₄-NH₂ -> Ac- (Arg-Ala-Asp-Ala) ₄-NH₂. TFA

Ac- [Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala] ₄-NH₂ (33.7 g, 1.00 eq) , prepared according to example 6 (11) , was dissolved in TFA (900 ml) at 20±5℃, followed by addition of Pd/C (2.5 g, loading: 5％Pd, water content 53％) . The resulting mixture was degassed and backfilled with hydrogen atmosphere for 3 times. Then the reaction mixture was stirred at 1.1 atm of H₂ at 20±5℃ for 4hours. Then the mixture was filtered through celite to remove Pd/C particle. The celite cake was washed with TFA (20 ml) . The TFA filtrates were combined and concentrated under vacuum at 35±5℃ to provide an oil. The residual TFA was removed by azeotropic distillation with DCM (280 ml) , this was done a second time. Then DIPE (300 ml) was charged to the residue. The mixture was stirred at RT for 30min. The liquid phase was poured out. DCM (480 ml) was charged to the solid. The mixture was stirred at RT until the mixture was an uniform suspension. Then the mixture was filtered. The cake was washed with DCM (50 ml) , filtered and dried at 40 ℃ overnight.

Crude yield: 104.3％.

Purity: 46.52％

Example 7

7 (1) Primary Purification

Each Ac- (Arg-Ala-Asp-Ala) ₄-NH₂. TFA, prepared according to example 4 (2) and according to example 6 (12) , were purified:

Stationary phase:                      

10-300 10 micrometer 300

                                        Suzhou Nonamicro Technology Limited

Column:                                 30 x 250 mm

Mobile phase A:                         0.1％TFA in H₂O (v/v) 

Mobile phase B:                         MeOH

Sample:                                 1.1 g /200ml

Flow rate:                              50 ml/min

Pre-Equilibration volume:               2cv2％mobile phase B in mobile phase A

Equilibration volume (after loading) :  1cv 2％mobile phase B in mobile phase A

Gradient:                               2 to 17％B in 15 cv

                                        17 to 50％B in 3cv

Final washing:              1cv 90％B

Result:                     main fraction purity was in each case higher than 80％

7 (2) Salt exchange

The salt exchange from TFA salt to HCl salt was done by chromatography under the following conditions:

Column:                     30 x 250 mm

Stationary phase:          

10-300 10 micrometer 300

Mobile phase A:             0.1％HCl in H₂O (v/v) 

Mobile phase B:             MeOH

Sample :                    120 mg /100ml

Flow rate:                  50 ml/min

Pre-Equilibration volume:   2 cv, 2％mobile phase B in mobile phase A

Gradient:                   2％mobile phase B in mobile phase Ain 15cv

                            50％B in 3cv

Result:                     100 mg powder of Ac- (Arg-Ala-Asp-Ala) ₄-NH₂. HCl after

                            freeze-drying

Also

HP10 column or any conventional hydrophobic stationary phase column such as a C8 to C18 column can be used as stationary phase both in purification or salt exchange.

Claims (19)

1. Method for the preparation of the peptide (RADA) ₄；

   wherein in liquid phase octamer peptides with the sequence (RADA) ₂ are coupled to provide the peptide (RADA) ₄；

   the octamer peptides are prepared in liquid phase by coupling of tetramer peptides having the sequence RADA；

   the tetramer peptides having the sequence RADA are prepared in liquid phase.
2. Method according to claim 1, wherein

   the tetramer peptide having the sequence RADA is prepared by stepwise coupling of the individual amino acids.
3. Method according to claim 1 or 2, wherein

   Asp is used as its side chain protected form Asp (OBzl) .
4. Method according to one or more of claims 1 to 3, wherein

   Arg is used only with an unprotected side chain or Arg is used only as its side chain protected form Arg (NO₂) .
5. Method according to claim 4, wherein

   Arg is used only with an unprotected side chain.
6. Method according to one or more of claims 1 to 5, wherein

   the coupling of the tetramer peptides is done at a temperature below 5℃.
7. Method according to one or more of claims1 to 6, wherein

   the coupling of the octamer peptides is done at a temperature below 5℃.
8. Method according to one or more of claims 1 to 7, wherein

   any protection of an N-terminal alpha amino residue during any coupling is done with Boc or with Ac.
9. Method according to one or more of claims 1 to 8, wherein

   any protection of a C-terminal COOH residue during any coupling is done with All or in form of the amide C (O) NH₂.
10. Method according to claim 9, wherein

    any cleavage of All is done with a reaction CLEAVALL using the catalyst Pd (PPh₃) ₄.
11. Method according to claim 10, wherein

    CLEAVALL is done in the presence of an additive ADDALL, ADDALL is selected from the group consisting of morpholine, 1, 3-dimethylbarbituric acid, and mixtures thereof.
12. Method according to one or more of claims 1 to 11, wherein

    the peptide (RADA) ₄ is provided in form of a peptide PEP-AC-NH2；

    PEP-AC-NH2 is Ac- (RADA) ₄-NH₂.
13. Method according to claim 12, wherein

    the method comprises a step STEPB；

    in STEPB the PEP-AC-NH2 is prepared by coupling of a fragment FRAG2-AC-OH with a fragment FRAG2-H-NH2；

    FRAG2-AC-OH is Ac- (RADA) ₂-OH；

    FRAG2-H-NH2 is H- (RADA) ₂-NH₂.
14. Method according to claim 13, wherein

    the method comprises a step STEPA1；

    in STEPA1 the FRAG2-H-NH2 is prepared；

    STEPA1 comprises a coupling of a fragment FRAGA1-Boc-OH with a fragment FRAGA1-H-NH2 with a subsequent cleavage of the N-terminal Boc residue；

    FRAGA1-Boc-OH is Boc-RADA-OH

    FRAGA1-H-NH2 is H-RADA-NH₂.
15. Method according to claim 13 or 14, wherein

    the method comprises a step STEPA2；

    in STEPA2 the FRAG2-AC-OH is prepared；

    STEPA2 comprises a coupling of a fragment FRAGA2-Ac-OH with a fragment FRAGA2-H-OAll, and comprises a subsequent cleavage of the C-terminal All residue；

    FRAGA2-Ac-OH is Ac-RADA-OH

    FRAGA2-H-OAll is H-RADA-OAll.
16. Method according to one or more of claims 1 to 15, wherein

    for the preparation of the tetramer peptides having the sequence RADA, the three amino acids R, A and D are used as Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OBzl) -OH and Boc-Arg (NO₂) -OH； or are used as Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OBzl) -OH and Boc-Arg-OH.
17. Method according to one or more of claims 3 to 16, wherein

    cleavage of any side chain protecting group is done after the coupling of the octamer peptides.
18. Method according to one or more of claims 4 to 17, wherein

    theNO₂ protecting group of Arg and the Bzl protecting group of Asp is cleaved by catalytic hydrogenation.
19. Method according to one or more of claims 1 to 18, wherein

    Boc-Arg (NO₂) -Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll or Boc-Arg-Ala-Asp (OBzl) -Ala-OAll is used as an intermediate.