CN102241739A - 肽的生产和纯化方法 - Google Patents

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Abstract

用于合成和纯化Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly八肽(SEQ ID NO 1)的方法。

Description

肽的生产和纯化方法
本申请是专利申请CN.200880125208.9“肽的生产和纯化方法”的分案申请，该母案申请是2008年11月21日提交的PCT申请PCT/EP2008/066037进入中国国家阶段的申请。
技术领域
本发明涉及一种用于制备某一种八肽的方法并且特别涉及包括纯化步骤的这样一种方法。
背景技术
密闭带毒素(“zot”)，(一种由霍乱弧菌生产的肠毒素)，通过可逆地影响紧密连接的结构增加渗透性的事实第一次描述于PCT/WO 9637196(马里兰大学(美国))中。它的序列与一种它的真核的人的类似物(zonulin)在它们推测的结合域(GXXXVGXG)中的比较发现了一种8氨基酸共享的基序，这由DI PIERRO，et al.Zonula Occludens Toxin Structure-Function Analysis.J.biol.chem.2001，vol.276，no.22，p.19160-19165描述。
具有以下序列的八肽(存在于zonulin中)：Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 1)已被Fasano在PCT/WO 0007609(马里兰大学(美国))中和被WANG，et al.Human Zonulin，a Potential Modulatorof Intestinal Tight Junctions.Journal of Cell Science.2000，vol.113，p.4435-4440描述为连接到密闭带毒素受体的zonulin的一种肽拮抗剂。Fasano披露了它在肠胃炎连同与血脑屏障的破坏相关的疾病的治疗方法中的应用。Fasano等人还在US7,026,294B(马里兰大学(美国))中描述了其在延缓疾病发作的方法中的用途。
这种八肽在治疗各种疾病的领域中看起来非常有希望，各种疾病包括细胞间通讯混乱，包括导致自身免疫性疾病(例如乳糜泻和1型糖尿病)的发展和肠紊乱，组织炎症，恶性转化和转移。上述参考没有描述用于合成该八肽的任何方法。本发明现在可以得到一种用于它的制备的方法。
申请人在此描述了一种用于合成该八肽Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 1)的方法，该方法可以高产率并且高品质纯度水平有效地生产所述八肽，同时在生产率和所要求的制造设备上具有优点。
发明内容
合成Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 1)
本发明涉及一种用于合成一种Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly八肽(SEQ ID NO 1)的方法，该方法包括至少一个在溶液中进行的肽偶联步骤。
根据本发明的方法允许使用一种汇集合成策略，使用有限数量的步骤，并且避免逐个的保护/脱保护反应。
出人意料地发现根据本发明的该方法允许以工业规模提供所述八肽而基本上不产生副产物或没有外消旋作用。而且，根据本发明的方法有可能形成的副产物通过特定的纯化方法从最终的八肽中迅速地可分离。此外，本发明允许合成含有L-和D-氨基酸构型的肽。而且，已经发现根据本发明的方法的中间体和产物可以通过固/液分离技术例如沉淀或结晶容易地进行分离和纯化。根据本发明的方法如果希望的话甚至可以基本上避免任何耗时的纯化步骤例如色谱法。这在合成八肽的框架中是罕见的和料想不到的。
具体实施方式
在一个第一具体方面中，根据本发明的方法包括使具有下式的一种肽：
Val-Gln-Pro-Gly-Y(SEQ ID NO 2)；
其中C-端氨基酸被一种羧酸保护基团Y保护；
与一个亮氨酸或一个C-端亮氨酸肽进行偶联，该亮氨酸或C-端亮氨酸肽优选选自式：
X-Gly-Gly-Val-Leu(SEQ ID NO 3)、X-Gly-Val-Leu和X-Val-Leu；并且其中所述亮氨酸或C-端亮氨酸肽可任选地被一种羧酸活化试剂活化。
该羧酸保护基团Y优选选自烷基酯类，芳基酯类，芳烷基酯类和甲硅烷基基团。Y更优选选自烷基酯类和甲硅烷基基团。用Val-Gln-Pro-Gly肽的烷基酯类且特别是用叔丁基酯得到优异的结果。
另一方面，该氨基保护基团X优选选自烯丙氧羰基基团，叔丁氧基羰基(BOC)，苄氧基羰基(Z)，9-芴甲氧羰基(Fmoc)，4-硝基苯磺酰基(Nosyl)，2-硝基苯次磺酰基(Nps)和其任选地取代的衍生物。用叔丁氧基羰基(BOC)基团得到了优异的结果。
为了本发明的目的，术语“肽”指一种聚合物其中单体是通过酰胺键共价连接在一起的氨基酸。肽具有两个或通常更多的氨基酸单体长度。另外，所有肽序列通过化学式表示，它从左至右的方向是氨基端到羧基末端的常规的方向。
为了本发明的目的，术语“氨基酸”旨在表示任何含有至少一个NR1R2基团，优选地是NH2基团，和至少一种羧基基团的化合物。本发明的氨基酸可以是天然存在的或合成的。天然的氨基酸，除了甘氨酸外，含有手性碳原子。除非另外特别地说明，含有具有L-构型的天然氨基酸的化合物是优选的。本申请从始至终氨基酸残基简写如下：甘氨酸是Gly或G；缬氨酸是Val或V；亮氨酸是Leu或L；谷氨酰胺是Gln或Q；脯氨酸是Pro或P；焦谷氨酸(或吡咯烷酮羧酸)是Glp。
为了本发明的目的，术语肽的“C-端”是用游离的羧基基团(-COOH)结束的氨基酸链的末端。另一方面，术语“N-端”指用具有游离的氨基基团(-NH2)的氨基酸结束的肽的末端。
为了本发明的目的，术语“偶联”指一种氨基酸的羧基基团或一种第一肽的C末端与另一氨基酸的氨基基团或一种第二肽的N末端之间的反应。换言之，在偶联过程中，两个肽中间体片段，或一种肽中间体片段和一种反应的氨基酸，总体上在适当的溶剂中并且通常在促进该偶联反应的效率和质量的另外的试剂存在下进行偶联。该肽中间体片段反应性地进行安排从而一个片段的N端偶联到另一个片段的C端，反之亦然。
在另一个具体方面，根据本发明的方法包括使具有式X-Gly-Gly-Val-Leu(SEQ ID NO 3)的肽与具有式Val-Gln-Pro-Gly-Y(SEQ ID NO2)的肽进行偶联。
在本发明中，保护基团是任意种类的基团，它在处理和合成过程可以阻止它所连接的原子或部分例如氧或氮参与不希望的反应。保护基团包括侧链保护基团和C-或N-端保护基团。保护基团也可以阻止羧酸，硫醇和类似物的反应或键连。
术语“氨基保护基团X”指可以用于本发明中代替氨基基团的酸性质子以减少其亲核性的保护基团。如以下描述，适当时在有可能随后加入下一种氨基酸之前在脱保护反应中可以除去该氨基保护基团X。
氨基保护基团X优选地是具有空间阻碍的。术语“空间阻碍”具体地旨在表示一种含有至少3个碳原子，特别地是至少4个碳原子，包括至少一个仲、叔或季碳原子的取代基。该空间阻碍基团通常含有最多100个，优选地最多50个碳原子。
在此由X所表示的适当的氨基保护基团的非限制性例子，它可以在根据本发明的方法中使用，可以特别提到由取代或未取代的酰基类型的基团，例如甲酰基、丙烯酰基(Acr)、苯甲酰基(Bz)、乙酰基(Ac)、三氟乙酰基、芳烷基氧基羰基类型的取代或未取代基团、例如苄氧基羰基(Z)、对-氯苄基氧基羰基、对-溴苄基氧基羰基、对-硝基苄基氧基羰基、对-甲氧基苄氧基羰基、二苯甲氧基羰基、2-(对-联苯基)异丙氧基羰基、2-(3，5-二甲氧基苯基)异丙氧基羰基、对-苯基偶氮基苄氧基羰基、三苯基膦酰基乙基氧基羰基或9-芴甲氧羰基基团(Fmoc)、烷氧基羰基类型的取代或未取代的基团、例如叔丁氧羰基(BOC)、叔戊氧基羰基、二异丙基甲氧基羰基、异丙氧基羰基、乙氧基羰基、烯丙氧羰基、2-甲基磺酰基乙氧基羰基或2，2，2-三氯乙氧基羰基基团、环烷氧基羰基类型的基团、例如环戊氧基羰基、环己氧基羰基、金刚烷基氧基羰基或异冰片基氧基羰基的基团、和含有一个杂原子的基团、例如苯磺酰基、对甲苯磺酰基、均三甲苯磺酰基、甲氧基三甲基苯磺酰基、2-硝基苯磺酰基、2-硝基苯次磺酰基、4-硝基苯磺酰基或4-硝基苯次磺酰基基团。在这些基团X中，优选含有羰基，次磺酰基或磺酰基基团的那些。氨基保护基团X优选选自烯丙氧羰基基团，叔丁氧基羰基(BOC)、苄氧基羰基(Z)、9-芴甲氧羰基(Fmoc)、4-硝基苯磺酰基(Nosyl)、2-硝基苯次磺酰基(Nps)以及取代的衍生物。更优选地，该氨基保护基团X是叔丁氧羰基(BOC)。
氨基保护基团X可以通过不同方法引入例如通过与适当的酰基卤例如苄氧羰基氯化物或酸的酸酐例如乙酸的酸酐反应。另一方面，可以例如通过酸解，氢解，用稀释的氢氧化铵处理，用钠处理，用氨基钠处理，用肼处理，或酶水解来除去氨基保护基团X。
术语“羧酸保护基团Y”指可以用于本发明中代替一种羧酸的酸性质子的保护基团。优选的基团选自任选地取代的烷基、芳基、芳烷基和优选地甲硅烷基基团。三烷基甲硅烷基基团是还要更特别优选的。这样的基团的例子包括甲氧基甲基、甲基硫代甲基、2，2，2-三氯乙基、2-卤乙基、2-(三甲基硅烷基)乙基、叔丁基、芳基、烷基、芳烷基、烯丙基、苄基、三苯甲基(trityl)、二苯甲基、对-硝基苄基、对-甲氧苄基、以及三烷基甲硅烷基基团例如三甲基硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、异丙基-二甲基甲硅烷基。三甲基硅烷基基团是更特别优选的。在根据本发明的方法中，Val-Gln-Pro-Gly肽更优选地用选自全硅烷化的衍生物和烷基酯的基团进行保护。用MSA(N-甲基-N-三甲基甲硅烷基乙酰胺)得到了良好的结果。例如按照在专利申请EP 184243 B(SOLVAY)中描述的方法可以进行氨基酸或肽的全硅烷化作用。通过使用Val-Gln-Pro-Gly-Y肽(其中Y是叔丁基酯基团)也得到优异的结果。
可以通过不同方法包括酯化和硅烷化作用来引入羧酸保护基团Y。另一方面，羧酸保护基团Y的除去可以例如通过水解、皂化、酸解、氢解或酶水解完成。
应当理解中间体肽例如具有适当氨基酸序列通过根据本发明的方法待偶联的比八肽更短的肽如果希望可以用肽合成的固相方法制备。在这样一种方法中，C端氨基酸的羧酸保护基团通常连接到一种树脂上。
本发明的另一个具体方面，如上所述的方法因而可以在一种羧酸活化剂存在下实现。
为了本发明的目的，术语“羧酸活化剂”，也称作“偶联剂”是一种试剂，它用一个适宜的离去基团取代羧酸的羟基基团，该离去基团对亲核置换敏感，从而允许氨基酸或肽的游离的羧基基团与另一氨基酸或肽的游离的氨基基团偶联以在反应物之间形成一个酰胺键。
本发明中有用的的羧酸活化剂和活化基团的例子包括碳二亚胺、羰基二咪唑、碳酰卤、特别是酰卤或卤甲酸盐、叠氮化物、磷鎓盐和脲鎓盐或胍盐、合成或混合的酸酐或活化的酯。这样的羧酸活化剂可以在偶联步骤之前使用以便分离活化的肽衍生物或在引入游离的氨基肽衍生物之前原位使用。
这样的羧酸活化剂的非限制性的具体例子包括碳二亚胺试剂例如N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI还称作“WSC”)、碳二咪唑试剂例如1，1′-羰基二咪唑(CDI)、二异丙基碳二亚胺(DIPCDI)、二异丙基碳二亚胺(DIC)或它们的衍生物、磷鎓盐例如(苯并三唑-1-基氧)三-(二甲氨基)磷鎓(BOP)、苯并三唑-1-基-氧三吡咯烷基六氟磷酸鏻(PyBOP)、(7-氮杂苯并三唑-1-基氧)三吡咯烷基六氟磷酸鏻(PyAOP)、溴-三-吡咯烷基六氟磷酸鏻(PyBroP)、氯-三-吡咯烷基六氟磷酸鏻(PyCloP)或它们的衍生物；脲鎓盐或胍盐例如邻-苯并三唑-N，N，N’，N’-四甲基-脲鎓-六氟磷酸盐(HBTU)、邻-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU)、2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-双(四亚甲基)脲鎓六氟磷酸盐(HAPyU)或它们的衍生物；酰卤例如氯甲酸异丁酯(iBCF)、新戊酰氯(PivCl)、叔丁基氯甲酸酯(TBCF)、氯甲酸乙酯(ECF)或它们的衍生物；酯化剂例如五氟苯酚(PfP)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)或它们的衍生物；叠氮化试剂例如叠氮化磷酸二苯酯(DPPA)或它们的衍生物。预先活化的氨基酸或处于N-羧基酸酐形式，并且特别地尿烷-N-羧基酸酐(UNCA’s)也是羧酸活化剂的良好的例子。
该羧酸活化剂优选选自：碳二亚胺、羰基二咪唑、酰卤、磷鎓盐和脲鎓盐或胍盐并且更优选选自：氯甲酸异丁酯和新戊酰氯。碳酰卤，更优选地酰卤，特别是如前述的酰氯偶联剂是优选的。叔酰卤是更特别地优选的。除其他之外，叔酰卤的例子是1-金刚酰氯、2，2-二甲基丁酰氯和新戊酰氯新戊酰氯更特别地优选作为羧酸活化剂。
出人意料地发现特别是通过仔细选择羧酸活化剂有可能基本上完全避免外消旋作用，特别是有可能当如本文前述偶联Leu或Leu-C端片段时避免任意一个Leu基团的外消旋作用。而且偶联条件已被确定其在下文中随后描述，它特别地允许希望的八肽的高的整体高产率和产量同时保持优异的光学纯度。
当使用另外的试剂时通常得到好的结果，它减少了副反应和/或增加了反应效率。例如，磷鎓和脲鎓盐在叔碱例如二异丙基乙胺(DIPEA)和三乙胺(TEA)存在下可以将受保护的氨基酸转化成活化的形式(例如BOP、PyBOP、HBTU、和TBTU都生成HOBt酯)。帮助阻止外消旋作用的其他试剂包括：碳二亚胺(例如DCC或WSCDI)和一种另外辅助的亲核试剂(例如，1-羟基-苯并三唑(HOBt)、3，4-二氢-3-羟基-4-氧-1，2，3-苯并三嗪(HOOBT)、1-羟基-氮杂苯并三唑(HOA)、或HOSu)或它们的衍生物。可以使用的另一种试剂是TBTU。还使用了用氯甲酸异丁酯与或不与一种另外的辅助亲核试剂混合酸酐的方法，如叠氮化物方法一样，因为得到低的外消旋作用。这些类型的化合物也可以增加碳二亚胺介导的偶联的速率，并且阻止了Asn和Gln残基的脱水。
当使用这样的羧酸活化剂时，通常在一种碱作为另外的试剂存在下进行该偶联反应。在本发明的另一个具体方面，偶联反应因而在一种碱存在下进行。该碱优选选自：叔和杂芳香族的胺例如N-甲基吗啉(NMM)、吡啶、三乙胺(TEA)、二异丙基乙胺(DIPEA)或它们的混合物。更优选地，它选自N-甲基吗啉和二异丙基乙胺。
在本发明的另一个具体方面，如上述的肽的偶联在一种极性有机溶剂中进行。在一个特别优选的实施方案中，该极性有机溶剂允许特别有效地控制生成的肽键的外消旋，该肽和/或肽片段的溶解度，和偶联反应速率。该极性有机溶剂优选选自：酰胺类型溶剂例如N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲亚砜(DMSO)、乙酸乙酯(AcOEt)、二氯甲烷(DCM)、亚甲基氯、吡啶、氯仿、乙腈、二甲氧基乙烷、二噁烷、四氢呋喃(THF)或它们的混合物。更优选地，它选自N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。最优选地，该极性有机溶剂是N，N-二甲基乙酰胺(DMA)。
在本发明中，偶联反应通常在温度大于或等于-45℃下进行。通常在温度大于或等于-25℃下进行反应。优选地，该温度大于或等于-20℃。在根据本发明的方法中，反应通常在温度低于或等于+45℃下进行。通常在温度低于或等于+5℃下进行反应。优选地，该温度低于或等于0℃。
在本发明的另一个具体方面，该溶液(通常在其中进行偶联的溶液)在偶联步骤后可以用水相适当处理以提供偶联产物在该水相中的一种溶液，并且然后将该偶联产物从该水相中萃取到一种有机溶剂中。在这种情况下，水相的pH值优选地控制到大于或等于1。更优选地，它大于或等于1.5。然而更优选地，它大于或等于2。另一方面，该水相的pH值优选地控制到小于或等于9。在一些实施方案中，该pH值优选地控制到小于或等于5。更优选地，在该实施方案中，它小于或等于3.5。然而，更优选地，它小于或等于3。水相的pH值约2.5得到了优异的结果。
已经发现有可能在根据本发明的方法中通过在如上考虑的pH下进行洗涤操作以除去酸性或碱性杂质同时保持偶联产物的高产物质量，特别是涉及敏感基团例如Gln部分或对于进一步的偶联步骤任选地要求的保护基团例如Boc或tBu基团。
在本发明的又另一个具体方面，特别是用于生产，特别是受保护的X-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Y八肽(SEQ ID NO 1)的溶液(通常在其中进行偶联的溶液)可以直接倒入一种水性溶剂中以沉淀所希望的产物。在另一实施方案中，可将一种水性溶剂加入该溶液中特别是受保护的X-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Y八肽(SEQ ID NO 1)的溶液中以结晶所希望的产物。这样的水溶液可以是例如水，盐水，或其他水性无机盐溶液。该水的pH值优选地大于或等于1.5，更优选地大于或等于2。另一方面，该水相的pH值优选地控制到小于或等于10。更优选地，它小于或等于9。然而更优选地小于或等于8。上述盐水溶液中待使用的适当的盐包括碱金属或碱土金属的氯化物，特别是氯化钠，碱金属或碱土金属硫酸盐，特别是硫酸钾，碱或碱土金属的碳酸氢盐，特别是碳酸氢钠。优选的水相含有去离子水。
在一个最优选的实施方案中，Boc-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-OtBu八肽(SEQ ID NO 1)优选地通过依照根据本发明的方法的优选的方面的偶联得到，优选地作为一种含有一种酰胺类型溶剂的溶液，更优选地在DMA中，并且将一种水相优选地含有或包括水，例如去离子水，特别地具有控制质量的GMP质量的水，pH约7，加入到该受保护肽的溶液中，并且其中通常水相具有从20℃到70℃的温度，优选地从40℃到50℃。
在本文前面描述的另一个优选的实施方案中所有其他优选条件与最优选的实施方案中一样，将Boc-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-OtBu八肽(SEQID NO 1)的有机溶液加入水相。
已经发现该最优选的实施方案允许特别高的纯度并且易于分离的受保护的肽，它能以高产量地作为纯化的固体进行分离。
通常，偶联步骤后反应产物含有一种或多种保护基团。这样的偶联产物的例子是具有式X-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Y的一种肽衍生物，其中X和Y如上定义。如果希望，该保护基团可以，例如以一种选择性的方法除去。因而，有可能仅除去某些保护基团，保持其他的在随后的反应过程中不变。
在根据本发明的方法的一个优选的方面，具有式X-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Y的肽衍生物进一步脱保护氨基保护基团X以及酸保护基团Y以提供游离的Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly八肽(SEQ IDNO 1)。
在本发明的一个特别优选的方面，提供一种脱保护方法，包括在具有式X-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Y(SEQ ID NO 1)的肽衍生物中脱保护至少一个氨基保护基团X，其中Y是一种任选的羧基官能团的保护基团。优选地，Y是一种游离的羧基基团或一种酸不稳定的羧基保护基团，例如一种叔丁酯。在这个实施方案中，X优选地是一种酸不稳定的保护基团，特别是一种Boc基团。通过使用有机酸或无机酸可以进行脱保护。有机酸可以例如选自：三氟乙酸(TFA)、三氟甲基磺酸、甲酸、对甲苯磺酸和甲磺酸。优选地用一种无机酸特别是HCl，优选地溶于一种有机溶剂中进行脱保护。通过提供一种氨基保护的肽的含有羧酸优选地冰醋酸的溶剂的溶液并且加入一种无机酸溶液，优选地HCl的极性有机溶剂溶液得到好的结果。在一个第一实施方案中，通过将有机溶剂加入该肽在另一种溶剂中的溶液中例如来自偶联步骤的处理(work-up)溶液来提供氨基保护的肽的溶液。在优选的一个第二实施方案中，氨基保护的肽在第一个步骤中进行沉淀或结晶，过滤并且任选地洗涤并且在一种第二步骤中溶于溶剂例如溶于冰醋酸中。醚，特别是二噁烷也可以用作极性有机溶剂或共溶剂。该脱保护步骤通常在温度从0℃到约45℃下进行，优选地从30℃到低于约45℃，最优选地约30℃。总的来说，脱保护步骤的反应介质基本上无水，含有相对于反应介质总重量低于2％重量的水。优选地该含量等于或小于1％wt，特别是等于或小于0.5％wt。
在一个最优选的实施方案中，将优选地通过如上述结晶得到的Boc-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-OtBu八肽(SEQ ID NO 1)溶于含有或优选地包括冰醋酸的一种溶剂中。加入HCl在冰醋酸中的溶液并且在本文前述的温度下进行脱保护。在这个最优选的实施方案中，通常使用3到12个当量的HCl/分子受保护的肽，优选地5-10，更优选地使用6-8当量的HCl/分子受保护的肽。使用约7当量的HCl/分子受保护的肽是更特别优选的。在这个最优选的实施方案中，脱保护反应的反应介质优选地如上述基本上无水。
已经发现特别是本文中前述的最优选的实施方案允许有效的脱保护同时避免潜在的Gln部分脱酰胺并且提供一种固体脱保护肽的盐，它可以从脱保护步骤的反应介质中容易地回收。
在根据本发明的方法中，至少一种肽偶联步骤在溶液中进行。优选地，至少2个，例如2、3或4和更优选地至少5个肽偶联步骤例如5、6或7个偶联步骤在溶液中进行。然而，更优选地，所有的偶联步骤在溶液中进行。在根据本发明的方法中是有用的具体的溶液相偶联步骤在此后的方案中的合成是显而易见的。
一种第一合成方法在以下的方案1中详述：
Figure BSA00000478797800111
根据方案1的方法的一个具体的实施方案与方案2一致
Figure BSA00000478797800112
当方案1或2的片段3-4，6-7，6-8和5-8在它们的全硅烷化形式下时得到良好的结果。在另一个优选的实施方案中，方案1中的8-Gly保护为羧酸酯，特别是一种叔丁酯。
进一步的合成方法在以下的方案3中详述：
Figure BSA00000478797800121
其中X和Y总体上如以上定义。
当方案2中的8-Gly保护为羧酸酯，特别是保护为叔丁酯时得到良好的结果。
根据本发明的方法中，溶液相偶联步骤中的压力总体上选择为维持该溶液为液态。大气压(约101.3kPa)和超大气压是非常适宜的。
反应产物可以通过纯化方法例如萃取，结晶，冰冻干燥，喷雾干燥，沉淀或色谱法(例如薄层色谱或柱)进行分离和纯化。通过沉淀或结晶分离和纯化是优选的。在一个实施方案中，至少一个中间体肽或最终产物通过沉淀或结晶分离和纯化。在根据本发明方法的一个特别优选的实施方案中，如果希望的话所有的中间体和最终产物通过沉淀或结晶进行分离和纯化。中间体和最终产物可以例如通过色谱参数(纯度控制)，旋光度和可能的分光光度计数据来确定特征。
合成X-Val-Gln-Pro-Gly-Y肽(SEQ ID NO 2)
通过不同合成方法可以得到X-Val-Gln-Pro-Gly肽(SEQ ID NO 2)。用以下两种方法得到优异的结果，即1+3和2+2方法。
在本发明又另一个具体方面，上述方法可以包括通过X-Val与Gln-Pro-Gly肽进行偶联(1+3方法)来制造X-Val-Gln-Pro-Gly肽(SEQ ID NO 2)，其中如上述X是一种氨基保护基团。
这样的四肽(SEQ ID NO 2)的制造优选地包括使X-Val的羧酸官能团活化，例如处于X-Val的活化的酯的形式，优选地用N-羟基丁二酰亚胺.具体地，X可以是苄氧基羰基(Z)。
在本发明的又另一个具体方面，上述方法可以包括通过X-Val-Gln与Pro-Gly肽进行偶联(2+2方法)来制造X-Val-Gln-Pro-Gly肽(SEQ ID NO 2)，其中如上述X是一种氨基保护基团。
X-Val-Gln二肽优选地用N-羟基丁二酰亚胺通过活化X-Val的羧酸官能团，例如以X-Val的活化的酯的形式，优选地得到。具体地，X可以是苄氧基羰基(Z)。另一方面，通过X-Pro和Gly-Y之间的反应优选地得到X-Pro-Gly-Y，其中X优选地是一种苄氧基羰基(Z)基团并且Y优选地是一种叔丁基酯。这样的反应在如上述标准的活化条件下，可以特别是通过使用碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺试剂进行。
得到的X-Pro-Gly-Y肽可以通过酸解、氢解、用稀释的氢氧化铵处理、用钠处理、用氨基钠处理、用肼处理、或酶水解来脱保护它的X基团。优选地它通过氢解除去。
X-Val-Gln和Pro-Gly-Y之间的偶联还可以在不同的条件下进行。碳酰卤化物，更特别地酰卤，特别是如上述的酰氯偶联试剂是优选的。酰卤，特别是如上述酰氯偶联试剂是优选的。叔酰卤是更特别优选的。除其他之外，叔酰卤的例子是是1-金刚酰基氯，2，2-二甲基丁酰基氯以及新戊酰氯。当使用新戊酰氯时得到优异的结果。氯甲酸异丁酯也是一种非常适宜的偶联剂。
出人意料地发现特别是有可能通过仔细选择羧酸活化剂并且特别是用叔酰卤基本上完全避免了外消旋作用，特别是当如本文前述偶联X-Val-Gln或Pro-Gly-Y片段时任意一个Gln基团的外消旋作用。更具体地说，有可能基本上避免在Gln和Pro部分的侧链上不希望的副反应。而且偶联条件已确定它在以下描述，它提供了特别是希望的四肽的高的总体高产率和产量，同时保持优异的光学纯度。
上述偶联通常在温度大于或等于-30℃下进行。通常，在温度大于或等于-10℃下进行反应。优选地，该温度大于或等于-5℃。该反应通常在温度低于或等于+45℃下进行。通常，在温度低于或等于+30℃下进行该反应。优选地，该温度低于或等于+25℃。
优选地在溶液中进行上述偶联。在这种情况下，压力选择为保持该溶液为液态。大气压(约101.3kPa)和超大气压是非常适宜的。当根据本发明的偶联在溶液中进行时，所述溶液可以适当地含有乙腈(CH3CN)和/或水性介质。
在另一实施方案中，该偶联在一种有机溶剂中进行，该有机溶剂优选选自烷基酯溶剂例如乙酸乙酯(AcOEt)、氯化的溶剂例如二氯甲烷(DCM)、和酰胺类型的溶剂例如N，N-二甲基乙酰胺(DMA)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。在该实施方案中，特别是当使用一种酰胺类型的溶剂时，有可能在任选的分离，特别是过滤任选的存在的固体例如加氢催化剂后使用该四肽溶液，无需分离如上述在进一步的偶联步骤中特别是按照方案2或3的偶联步骤中的四肽。
偶联步骤后然后可以适当地用水相处理反应介质从而提供一种在水相中偶联产物的溶液并且然后将X-Val-Gln-Pro-Gly-Y肽(SEQ ID NO 2)从水相中萃取到有机溶剂中。
可以通过沉淀和/或结晶回收该中间体片段和X-Val-Gln-Pro-Gly-Y肽(SEQ ID NO 2)。在一些情况下，X-Val-Gln-Pro-Gly-Y肽(SEQ ID NO2)通常以在一种第一溶剂中的溶液提供并且然后通过加入一种第二溶剂进行沉淀，在该第二溶剂中该肽比在该第一溶剂中的溶解度更低。在其他情况下，X-Val-Gln-Pro-Gly-Y肽(SEQ ID NO2)通常以在一种第一溶剂中的溶液提供并且然后通过加入一种第二溶剂进行结晶，在该第二溶剂中该肽比在该第一溶剂中的溶解度更低。
第一种溶剂有利地选自以下的组，其组成为：乙酸乙酯、四氢呋喃、二氯甲烷、二噁烷、甲醇、正丁醇、异丁醇、2-丁醇、2-丙醇、二异丙醚、二乙醚、甲基叔丁基醚、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、和它们的混合物。用二氯甲烷/异丁醇混合物得到了良好的结果。
第二溶剂有利地含有至少一个溶剂，该溶剂选自水、二异丙醚、乙腈、二乙醚、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、乙酸异丙脂、丙酮、四氢呋喃、二氯甲烷或二噁烷。用二异丙醚得到了良好好的结果。
合成Val-Gln-Pro-Gly四肽(SEQ ID NO 2)
在本发明的又另一个具体方面，上述方法可以包括制备Val-Gln-Pro-Gly四肽(SEQ ID NO 2)，其中如上述制备X-Val-Gln-Pro-Gly-Y肽进一步包括N-端氨基保护基团X的脱保护。具体地，X可以是苄氧基羰基(Z)。
这样的氨基保护基团X可以通过酸解，氢解，用稀释的氢氧化铵处理，用钠处理，用氨基钠处理，用肼处理，或酶水解除去。优选地通过氢解除去它。
合成X-Gln-Pro-Gly-Y三肽
在本发明的又另一个具体方面，上述方法此外包括通过用氨开环X-Glp-Pro-Gly-Y三肽来制造X-Gln-Pro-Gly-Y三肽，其中X是一种氨基保护基团。
合成Gly-Gly-Val-Leu四肽(SEQ ID NO 3)
在本发明的又另一个具体方面，上述方法此外包括通过Val-Leu二肽与X-Gly-Gly或X-Gly进行偶联来制造Gly-Gly-Val-Leu四肽(SEQ ID NO 3)。
总的来说，该偶联在一种羧酸活化剂存在下进行。在一个实施方案中，碳二亚胺，酰卤，磷鎓盐和脲鎓盐或胍盐通常优选作为羧酸活化剂。碳酰卤，更特别地酰卤，特别是如上述的酰氯偶联剂是优选的。叔酰卤是更特别地优选的。除其他之外，叔酰卤的例子是1-金刚酰氯、2，2-二甲基丁酰氯和新戊酰氯。更优选地，该联剂选自氯甲酸异丁酯和新戊酰氯。
在另一个实施方案中，该偶联优选地用X-Gly-Gly的一种活化的酯的形式，优选地用N-羟基丁二酰亚胺进行。
当酰卤用作羧酸活化剂时，通常在一种碱作为另外的试剂存在下进行该偶联。它优选选自N-甲基吗啉(NMM)、吡啶、二异丙基乙胺(DIPEA)或三乙胺(TEA)。更优选地它是N-甲基吗啉(NMM)。
Val-Leu二肽与X-Gly-Gly或X-Gly的偶联优选地在溶液中进行。在这种情况下，压力选择为使该溶液维持在液态。大气压(约101.3kPa)和超大气压是非常适宜的。该溶液通常含有一种极性有机溶剂。优选地，该极性有机溶剂选自N，N-二甲基乙酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲亚砜、乙酸乙酯、二氯甲烷或它们的混合物。更优选地，该溶液含有N，N-二甲基乙酰胺或乙酸乙酯。
甘氨酸氨基酸或二肽Gly-Gly通常由一种氨基保护基团X保护。该氨基保护基团X优选选自叔丁氧羰基，苄氧基羰基、9-芴甲氧羰基、2-硝基苯磺酰基、2-硝基苯次磺酸基、和取代的衍生物。更优选地，该氨基保护基团X是叔丁氧羰基(BOC)。
该Val-Leu二肽通常由一种羧酸保护基团Y保护。
优选的羧酸保护基团Y是烷基、芳基和甲硅烷化的衍生物。在一个特别优选的变体中，该Val-Leu肽衍生物是一种全硅烷化的衍生物。Val-Leu二肽的全硅烷化可以例如根据以申请人的名字在专利申请书EP-A-184243中描述的方法进行。该全硅烷化优选地用MSA进行。
Val-Leu二肽与X-Gly-Gly或X-Gly的偶联通常在温度大于或等于-45℃下进行。通常，在温度大于或等于-25℃下进行反应。优选地，该温度大于或等于-20℃。在根据本发明的方法中，该偶联通常在温度低于或等于+45℃下进行。通常，在温度低于或等于+5℃下进行该反应。优选地，该温度低于或等于0℃
如上述得到的四肽可以进一步脱保护氨基保护基团X和酸保护基团Y以提供游离的Gly-Gly-Val-Leu四肽(SEQ ID NO 3)。
然后可以通过纯化方法例如萃取、结晶、冰冻干燥、喷雾干燥、沉淀或色谱法(例如薄层色谱或柱)来分离和纯化反应产物。
本发明的上述偶联步骤可以在全硅烷化条件下进行。换言之，在根据本发明方法中使用的氨基酸或肽可以在它们的全硅烷化的形式下进行保护。它们优选地在它们的全硅烷化形式下进行保护。
本发明的另一方面涉及具有式Glp-Pro-Gly的一种肽或具有式X-Glp-Pro-Gly的受保护的肽(其中X是一种氨基保护基团)，或具有式X-Glp-Pro-Gly-Y的受保护的肽(其中X是一种氨基保护基团并且Y是一种羧基保护基团)的三肽，涉及具有式Gln-Pro-Gly的三肽或具有式X-Gln-Pro-Gly(其中X是一种氨基保护基团)的受保护的肽的三肽，涉及具有式Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 2)的四肽或具有式X-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 2)的受保护的肽(其中X是一种氨基保护基团并且特别地当X是苄氧基羰基时)的四肽，涉及具有式Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 4)的五肽，涉及具有式Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 5)的六肽，并且涉及具有式Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 6)的七肽，它们可以以原样或在它们的受保护形式下得到，作为在根据本发明的方法中的中间体。
此外，本发明还涉及具有式Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 7)的十二肽，涉及具有式Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 8)的十六肽并且涉及具有式CH3C(＝O)-NH-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 1)的一种修饰的肽，它们在根据本发明的方法中可以得到。
本发明还涉及使用以下肽作为肽合成中的中间体：
具有式Glp-Pro-Gly的三肽；
具有式Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 2)的四肽；
具有式Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 4)的五肽；
具有式Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 5)的六肽；
具有式Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 6)的七肽，
以原样或在它们的受保护形式下。
纯化
在肽合成中的一个主要问题是关于该肽的分离和纯化，它通常是最终肽产物的产量减少的原因。
结果，本发明还涉及以原样的或在它的受保护形式下纯化上述的肽。根据本发明的纯化特别地允许符合关于有机杂质相关的纯化的规格，例如像有机溶剂，例如乙腈并且是可以工业化的。
根据本发明的纯化方法可以有效地并且低成本地生产所述纯化的八肽。
因而本发明的一个目的还是提供一种用于纯化Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly肽(SEQ ID NO 1)或具有式Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 2)或X-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 2)(其中X是一种氨基保护基团)的肽，Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 4)、Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ IDNO 5)、Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 6)、Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 7)、Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO8)、和CH3C(＝O)-NH-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 1)中任意一种肽(以原样或在受保护的一种形式下)的方法，其中该肽溶于第一种溶剂中并且然后沉淀或结晶。沉淀通过将该肽在第一溶剂中的溶液加入一种第二溶剂进行，在该第二溶剂中该肽比在第一溶剂中的溶解度更小。结晶通过将该肽在一种第一溶剂中的溶液加入一种第二溶剂进行，在该第二溶剂中该肽比在第一种溶剂中的溶解度更小。
该肽可以通过加入一种第一溶剂进行溶解或可以在作为第一溶剂的处理之后直接得到。在后一种情况下，该溶液在加入第二溶剂之前可以在真空下浓缩。
第一和第二溶剂的性质取决于该肽的性质，取决于它的等电点值并且取决于它的受保护或未受保护形式。该肽在第一溶剂中比在第二溶剂中应该溶解度更高。
一方面，当该肽未受保护时，第一溶剂优选地是一种水性介质并且第二溶剂优选地含有至少一种极性有机溶剂。该水性介质的pH在一些情况下可以优选地进行控制。另一方面，在受保护的肽的情况下，该第一溶剂优选地含有至少一种极性有机溶剂而该第二溶剂优选地是一种水性介质。
该有机溶剂优选选自：异丙醚(IPE)、乙腈(CH3CN)、甲基叔丁基醚(MTBE)、乙酸乙酯(AcOEt)、乙酸异丙酯(AcOiPr)、丙酮、四氢呋喃(THF)、二氯甲烷(DCM)、二噁烷、甲醇、叔丁醇、异丙醇、乙醇、乙酸、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)以及它们的类似物或混合物。用异丙基醚和/或乙腈得到了良好的结果。
在一个具体方面，极性有机溶剂优选选自乙腈(CH3CN)、乙酸乙酯(AcOEt)、乙酸异丙酯(AcOiPr)、丙酮、四氢呋喃(THF)、二氯甲烷(DCM)、二噁烷、甲醇、叔丁醇、异丙醇、乙醇、乙酸、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)以及它们的类似物或混合物。
下表给出了对于不同片段的第一和第二溶剂的优选的组合
表1
表2-可替代的溶剂组合
Figure BSA00000478797800192
可以有利的是通过盐的形成(例如盐酸盐，乙酸盐，二环己基铵，环己铵或三氟乙酸盐的形成)或通过两性离子的形成来分离并纯化所希望的肽产物。
该肽还可以从一种溶液例如通过喷雾干燥，过滤或倾注进行分离并且在任选地进行进一步处理步骤例如与其他成分结合，冷冻干燥，喷雾干燥，包装和/或储藏之前进行干燥。
根据一种适宜的方法，该肽通过过滤收集该肽并且任选地，特别是为了降低可能的盐含量进行洗涤，并且然后进行干燥。
本发明的另一个具体方面是涉及一种用于纯化Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly肽(SEQ ID NO 1)、或具有式Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 2)或X-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 2)，(其中X是一种氨基保护基团)的肽、Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 4)、Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 5)、Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 6)、Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 7)、Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO8)、和CH3C(＝O)-NH-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 1)中任意一种肽(以原样或受在保护形式下)的方法，该方法包括将前述序列的任意一个粗肽进行色谱操作。
在本发明中，色谱法优选选自：中压液相色谱法(MPLC)和高压液相色谱法(HPLC)。
在这个方面，该色谱操作可以在一个任选的该肽的沉淀或结晶之前或之后进行。
该色谱操作可以在例如连续床色谱柱子上(整体柱)进行。在那种情况下，可以使用正常相固定相，例如硅石或氧化铝。在那种情况下，通常使用非极性流动相。优选地使用反相固定相例如疏水修饰的无机支撑物，典型地用有机疏水化合物接枝的硅石。在那种情况下，通常使用极性流动相例如含有一种有机共溶剂，特别是一种极性有机共溶剂例如甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈或二噁烷的水性流动相。还可以使用中等极性例如具有键连的二醇、丙基氰基或氨基基团的硅石，特别是与温和的极性流动相例如缓冲水溶液/有机流动相一起。
该色谱操作可以是一种中压液相色谱(MPLC)。在这样一种色谱操作中，洗脱液可以含有水，乙腈(CH3CN)，醇例如甲醇、乙醇、丙醇以及类似物。优选地，它含有水(H2O)和/或乙腈(CH3CN)。该洗脱液还可以含有一定量的盐以将它的pH值维持在某一个范围(缓冲溶液)。当使用乙酸铵水溶液作为洗脱液时得到了良好的结果。
本发明的另一个具体方面是涉及一种Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly肽(SEQ ID NO 1)或具有式Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 2)或X-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 2)的肽(其中X是一种氨基保护基团)、Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQID NO 4)、Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 5)、Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 6)、Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO7)、Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ IDNO 8)、和CH3C(＝O)-NH-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 1)中任意一种肽(以原样或在一种受保护形式下)在含有水和一种极性有机溶剂的一种溶剂混合物中的溶液。
根据本发明上述的溶液优选地含有乙腈和醇例如甲醇，乙醇，丙醇和类似物。这样的溶液可以用于一种纯化操作中。
本发明的另一个优选的方面是关于提供具有不同乙酸盐含量的含有乙酸盐的Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly八肽(SEQ ID NO 1)。已发现了依赖于所使用的分离方法在最终的肽中可能实现不同摩尔含量的乙酸盐，这可以为它们的稳定性提供某些优点。
在第一个实施方案中，通过冷冻干燥从肽的水溶液中分离含有乙酸盐的肽。冷冻干燥旨在表示干燥一种所希望的物质的方法，通过冰冻含有所述物质的水性介质并且通过将它暴露在水蒸气的低的分压下使冰直接升华成蒸汽实现。在这种情况下，含有乙酸盐的肽通常具有乙酸盐的浓度为至少或等于60mol％/摩尔肽。
在更优选的一种第二个实施方案中，含有乙酸盐的肽通过浓缩该液体介质(例如通过蒸发)从液体介质进行沉淀。在这种情况下，该含有乙酸盐的肽通常具有乙酸盐的浓度为从30mol％到60mol％优选地约50mol％，对比肽的摩尔。例如通过从如前述脱保护步骤得到的粗产物，通过色谱法，特别是MPLC，可以得到适宜的起始溶液。例如，特别是通过用HCl脱保护得到的粗产物可以经受特别是如上所述的色谱操作。包括含有乙酸盐的肽和一种极性有机溶剂，特别是乙腈的溶液(该溶液从色谱操作得到)可以例如通过蒸发，优选地在减压下，优选地在20℃到50℃的温度下进行浓缩。随着溶液浓缩，含有乙酸盐的肽开始沉淀并且可以通过过滤回收。沉淀效率可以例如通过将该浓缩溶液典型地冷却到温度低于10℃下来增强。
在最优选的一个第三实施方案中，该含有乙酸盐的肽通过用乙酸根离子来交换Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly八肽(SEQ ID NO 1)的盐酸盐的氯反离子而从液体介质中结晶。在这种情况下，该含有乙酸盐的肽通常具有乙酸盐的浓度为从大于0到小于50摩尔％/摩尔肽，优选地20摩尔％/摩尔肽到30摩尔％/摩尔肽。一个特别有利的方面，有可能通过向得到的液体介质中加入一种乙酸根离子来结晶该含有乙酸盐的肽，该液体介质通过将从如上述的脱保护步骤中在水中的Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly八肽(SEQ ID NO 1)的盐酸盐进行溶解而得到。适宜的乙酸盐来源包括乙酸盐例如乙酸钠，乙酸钾，或乙酸铵。乙酸铵给出了良好的结果。优选地，结晶过程中pH控制在2.5到7.5的范围内。pH从3.5到6.5是更特别优选的。pH约4.5给出了良好的结果。在这个实施方案中，作为游离肽测定的Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly八肽(SEQ ID NO 1)的盐酸盐的起始浓度通常为相对于含有所述盐酸盐和乙酸根离子源的液体介质总重量的从2％wt到20％wt，并且如果必要的话pH调节剂，例如一种碱例如铵，优选地都溶于水中。优选地，该起始浓度是按重量计从10％到15％。结晶过程中的温度通常是从5℃到35℃，优选地从20℃到30℃。
在一个第四实施方案中，有可能通过调节Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly八肽(SEQ ID NO 1)盐酸盐水溶液的pH到该肽的等电点，该等电点是约6.0到7.0，更具体地约6.5，通过从液体介质中结晶来制备一种无乙酸盐的肽，优选地处于两性离子的形式。当该游离肽是希望的时，优选的是避免补充的反离子例如乙酸根的存在。
本发明还涉及所述含有乙酸盐的肽。出人意料地已经发现当乙酸盐含量减少时并且也因为它的制造方法该肽的稳定性增强了。如上述通过结晶或沉淀得到含有乙酸盐的肽比冷冻干燥的肽更稳定。
本发明还涉及通过指出的方法制造所述含有乙酸盐的肽。
引入到Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly八肽(SEQ ID NO 1)的盐交换步骤中的盐酸盐通过HPLC优选地具有至少98.5％的纯度。
实例
以下实例旨在说明本发明而非限制其范围。
在这些实例中并且贯穿本说明书使用的缩写定义以下：
AcOH是乙酸、AcOEt是乙酸乙酯、AcOiPr是乙酸异丙酯、Boc是叔丁氧基羰基、n-BuOH是正丁醇、Cbz是苄氧基羰基、DCC是-1，3二环己基碳二亚胺、DCM是二氯甲烷、DIC是1.3-二异丙基碳二亚胺、DIPEA是N，N-二异丙基乙胺、DMAPA是3-二甲基氨基丙基胺、DMF是N，N-二甲基甲酰胺、DMA是N，N-二甲基乙酰胺、Fmoc是芴甲氧羰基、HBTU是N，N，N′，N′-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)脲鎓-六氟磷酸盐)、HOBT是1-羟基苯并三唑、HOOBT是3，4-二氢-3-羟基-4-氧-1，2，3-苯并三嗪、HPW是高纯水、IBCF是氯甲酸异丁酯、PivCl是新戊酰氯、i-BuOH是异丁醇、IPE是二异丙醚、MeCN是乙腈、MeOH是甲醇、NMM是N-甲基吗啉、NMP是1-甲基-2-吡咯烷酮、THF是四氢呋喃、MSA是N-甲基-N-三甲基甲硅烷基乙酰胺、Tos是甲苯磺酰基、MTBE是甲基-叔丁基醚。
实例1至11：以下方案4表示Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQID NO 1)八肽的一种第一常规的合成方法，它将在以下实例中详细描述。
Figure BSA00000478797800241
实例1：合成H-Val-Leu-OH
亮氨酸(1.2当量)在纯MSA中在最高温度50℃下进行甲硅烷化直至完全溶解并且然后用AcOEt稀释。将该亮氨酸溶液在搅拌下在35℃下转移到一种Z-Val-OSu溶液中。反应用水淬灭，有机相用AcOEt稀释并且用KHSO4和NaCl洗涤。溶剂在真空下除去并且用MeOH代替。然后向该甲醇溶液中加入水随后加入钯催化剂。Z基团的脱保护在30℃下通过引入气态氢进行。一旦反应完成，将催化剂过滤并且用甲醇和水50/50的混合物洗涤。蒸发溶剂并且用异丙醇稀释该混合物以沉淀该二肽。然后通过过滤回收该二肽，在室温下用异丙醇洗涤并且然后干燥。分离该二肽，其中产率为85％。
实例2：合成H-Val-Leu-OH
亮氨酸(1.2当量)在纯MSA中在最多50℃下进行甲硅烷化直到完全溶解并且然后用AcOEt稀释。将亮氨酸溶液在搅拌下在35℃下转移到一种Z-Val-OSu溶液中。未反应的ZValOSu用DMAPA(0.05当量)中和并且反应用水淬灭，用AcOEt稀释并且有机相用KHSO4和NaCl洗涤。溶剂在真空下除去并且用iPrOH代替直至在挥发物中AcOEt含量≤5％重量。然后向该肽溶液中加入水然后加入钯催化剂。Z基团的脱保护在约35℃下通过引入气态氢进行。一旦反应完成，将催化剂过滤并且用水洗涤。收集滤液，用异丙醇稀释并且冷却到±5℃以沉淀该二肽，该二肽然后通过过滤回收，在室温下用异丙醇和MeCN洗涤并且然后干燥。分离该二肽，其中产率为85％。
实例3：合成Boc-Gly-Gly-Val-Leu-OH(SEQ ID NO 3)
一方面，向MSA(2.72当量)的AcOEt溶液中加入H-Val-Leu-OH(1当量)。在25℃下搅拌该浆料直至得到溶液。然后该溶液冷却到-15℃。另一方面，Boc-Gly-Gly-OH(1.05当量，商购)与NMM(1.0当量)，AcOEt和DMF一起加入。搅拌该浆料直至完全溶解并且然后冷却到-25℃。向Boc-Gly-Gly-OH溶液中加入IBCF(1.0当量)以活化该羧基官能团。然后加入该甲硅烷化的Val-Leu并且将其保持以搅拌至少30分钟。反应混合物在通过加入水淬灭之前调节到25℃。然后该混合物用AcOEt稀释并且在搅拌下用KHSO4溶液洗涤。除去水相并且用NaCl的溶液再次洗涤该有机相。该有机相最后浓缩并且该四肽在至少8h的温和搅拌下在5℃结晶。一旦用冷AcOEt在5℃下洗涤时，该固体通过过滤回收。真空干燥后，回收了85％的Boc-Gly-Gly-Val-Leu-OH(SEQ ID NO 3)。
实例4：合成Z-Glp-Pro-OH
Z-Glp-OH.DCHA(商购，1当量)在AcOEt中稀释并且通过加入KHSO4的水溶液进行中和。收集该有机相并且用另一个体积的AcOEt萃取水相。结合的有机相然后用水洗涤并且用MeCN代替该溶剂(AcOEt)。Suc-OH(1.05当量)溶于ZGlpOH溶液中，然后将它冷却到-5℃。溶于MeCN中的DCC(1.1当量)缓慢加入该溶液中，保持反应温度低于5℃下。允许反应经过至少4小时升温到25℃。用AcOH(0.05当量)中和过量的DCC并且在过滤沉淀DCU之前将该悬浮液冷却到10℃，该沉淀然后用MeCN洗涤。得到的溶液升温到25℃。向MeCN的溶液中加入H-Pro-OH(2.0当量)和(1.9当量)的MSA。将该悬浮液加热到45℃并且继续搅拌直至得到澄清的溶液。然后将该溶液冷却到25℃。向该Z-Glp-OSu溶液中加入甲硅烷化的脯氨酸溶液并且在25℃下保持以搅拌至少3h。用水稀释该偶联溶液并且在最高温度65℃下在真空中蒸发MeCN。剩余的浆料然后用水稀释并且在5℃下将该沉淀保持以搅拌至少10h。将固体过滤，用水洗涤。真空干燥后，回收了80％的Z-Glp-Pro-OH。
实例5：合成Z-Glp-Pro-Gly-OH
在肽偶联之前制备两种溶液。将溶液A：H-Gly-OH(1.2当量)在最高60℃温度下溶于MSA(3.0当量)中。将该悬浮液冷却到25℃，用DCM稀释并且在冷却到-15℃之前搅拌至少8小时。在溶液B中，Z-Glp-Pro-OH的羧基官能团用DCM和NMM(1.05当量)溶解。将该溶液冷却到-15℃。该羧酸用IBCF(1.05当量)进行活化并且然后向该浆料中加入甲硅烷化的溶液A。将该浆料保持以搅拌至少0.5h并且升温到25℃。该混合物用水淬灭并且在搅拌沉淀的肽下加入KHSO4溶液。将固体过滤并且用水洗涤。真空干燥后，回收了80％的Z-Glp-Pro-Gly-OH。
实例6：合成H-Gln-Pro-Gly-OH
将Z-Glp-Pro-Gly-OH(1当量)在搅拌下在25℃下溶于DMA中，并且加入NH4OH 25％(6当量)，其方式为使温度不升高到超过30℃。将该混合物在25℃下搅拌至少4h。该溶液在真空下浓缩直到pH≤3。该浓缩液用NaCl水溶液稀释并且用KHSO4溶液调节pH到2.5。得到的水溶液用IPE洗涤两次并且然后在25℃下用n-BuOH萃取3次。将有机层合并并且用水洗涤。得到的有机溶液减压下进行浓缩。浓缩的溶液在20℃下用乙醇和水稀释并且向该肽溶液中加入Pd/C(0.02当量)。该溶液在20℃下搅拌随后减压下(0.3bar)引入氢。该溶液搅拌至少2小时并且用HPLC检测反应的完成。将该溶液过滤以除去催化剂并且用脱矿质水洗涤一次后，将溶液的pH用NaHCO3水溶液调节到6.0≤pH≤6.5。然后通过加入乙醇沉淀该游离的三肽。将溶液在25℃下保持以老化3小时。将固体过滤并且用乙醇洗涤。真空干燥后，回收了60％的H-Gln-Pro-Gly-OH。
实例7：合成H-Val-Gln-Pro-Gly-OH(SEQ ID NO 2)
向含有DIPEA(2.00当量)的H2O中加入H-Gln-Pro-Gly-OH(1当量)该浆料在25℃下搅拌直至观察到澄清的溶液并且然后冷却到0℃。将Z-Val-OSu(1.1当量)在25℃下溶于MeCN中直至得到澄清的溶液并且然后冷却到0℃。向H-Gln-Pro-Gly-OH(SEQ ID NO 2)的溶液中加入Z-Val-OSu溶液，其方式为使温度不升高到超过5℃。然后将该混合物搅拌至少2h。该肽溶液进行浓缩并且然后用KHSO4溶液稀释并且搅拌几分钟。该水溶液用IPE和AcOEt的混合物洗涤2次。除去该有机相并且水相用20％i-BuOH的DCM溶液萃取2次。收集有机相并且在减压下浓缩直至挥发物中水含量≤1％重量。然后受保护的四肽的溶液在25℃下在IPE中沉淀。Z-Val-Gln-Pro-Gly-OH(SEQ ID NO 2)通过过滤收集，用IPE洗涤并且真空干燥直至肽中IPE含量≤5％重量。将该受保护片段在30℃下溶于甲醇中并且向该肽溶液中加入Pd/C(0.02当量)。该溶液在20℃下搅拌随后减压下(0.3bar)引入氢。搅拌3小时后过滤该溶液以除去催化剂，该催化剂用甲醇洗涤。蒸发后，该游离的四肽然后通过在10℃下将该溶液转移到MeCN中沉淀。滤出该固体并且用MeCN洗涤。真空干燥后，回收了60％的H-Val-Gln-Pro-Gly-OH(SEQ ID NO 2)。
实例8：合成AcOH.H-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-OH(SEQ ID NO 1)
H-Val-Gln-Pro-Gly-OH(SEQ ID NO 2)(1.0当量)通过在温度≤40℃将它加入含有MSA(3.2当量)的DMA溶液进行甲硅烷化直至观察到澄清的溶液。然后将该溶液冷却到-15℃。将Boc-Gly-Gly-Val-Leu-OH(1.05当量(SEQ ID NO3))与Dipea(1.05当量)溶于DMA中直至得到澄清的溶液。将该溶液冷却到-15℃。向Boc-Gly-Gly-Val-Leu-OH(SEQ ID NO 3)的溶液中加入吡啶(1.0当量)和PivCl(1.0当量)以活化该酸官能团。然后尽可能快地将该甲硅烷化的H-Val-Gln-Pro-Gly-OH(SEQ ID NO 2)溶液转移到该活化的四肽的溶液中。将该反应介质搅拌至少0.5h并且将其保持以升温到-5℃。该反应混合物通过加入5％KHSO4在-5℃下进行中和并且然后在减压下浓缩。该溶液依次用水和i-BuOH稀释。pH通过控制加入5％KHSO4水溶液调节到2.5，并且然后引入DCM以萃取该八肽。除去水溶液并且用NaCl的溶液再次洗涤该有机相。该有机相然后在减压下进行浓缩并且溶剂用冰AcOH代替直至挥发物中水含量≤2％重量并且i-BuOH含量≤2％重量。为了避免可能的问题例如脱保护的混合物地凝胶化作用，受保护的八肽(SEQ ID NO 1)通过在25℃下将该肽溶液转移到IPE和MeCN的混合物中通过沉淀进行分离。Boc-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-OH通过过滤回收，用IPE洗涤并且干燥直至IPE含量≤5％重量。为了进行该脱保护步骤，然后将该八肽在室温下溶于AcOH中。
为了除去Boc基团，向该肽溶液中加入HCl 4M的二噁烷(约3.5当量)溶液并且该混合物在最高温度45℃下搅拌至少2h。最终的肽通过在25℃下在IPE和MeCN的混合物中沉淀回收。将固体过滤，用IPE并且用MeCN洗涤。在40℃下真空干燥后，回收了80％的HCl.H-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-OH(SEQ ID NO 1)。将该肽在25℃下溶于0.05M乙酸铵缓冲溶液中，用25％NH3溶液调节到4.5≤pH≤5.0，并且然后用MeCN稀释。将这个溶液如实例7中所述进行过滤和纯化。
实例9：纯化AcOH.H-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-OH(SEQ ID NO 1)
色谱在Amberchrom CG161m上用流动相：A＝“水相”：0.05M NH4OAc(pH～7.5)和B＝“有机相”：0.05NH4OAc的50/50HPW/MeCN溶液中进行。固定相首先用10％的溶液B调节，然后将实例7中得到的粗产物注入固定相并且用10％的溶液B洗涤。然后加入洗脱液(22％B)并且然后用100％的溶液B洗涤固定相。收集通过纯化得到的合并的纯的部分并且用水(HPW)稀释2倍。同样的固定相用于纯化步骤并且制备了两个新的流动相：A＝1000/0/6HPW/MeCN/AcOH(v/v)和B＝700/300/6HPW/MeCN/AcOH(v/v)。将合并的馏分装入柱上，该柱子之前用流动相A平衡。该柱子然后再次用4倍柱体积的流动相A洗涤并且然后该肽用流动相B洗脱。
实例10：冰冻干燥AcOH.H-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-OH (SEQ ID NO 1)
将实例9中得到的肽溶液在真空下浓缩并且在GORETM的冰冻干燥盘中冻干。将该肽溶液置于一种冰冻干燥器(GT4Edwards/Kniese)中冻干。将冰冻干燥盘冷却到-40℃3h，然后在真空下(0,22mbar)将温度升到20℃持续17h。完成大部分干燥后，将温度保持在20℃持续4h，其中真空调节为0.02mbar。得到了AcOH.H-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-OH(SEQ ID NO 1)的白色粉末。
实例11：沉淀AcOH.H-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-OH(SEQ ID NO 1)
将实例9中得到的肽溶液在真空下浓缩并且沉淀通过过滤收集并且真空干燥。得到了AcOH.H-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-OH  (SEQ ID NO 1)的白色粉末。
实例12-13：在描述部分中在方案3中描述了一种第二合成方法并且 在随后的方案5中给出了它的一个具体实施方案。该方法通过此后的实例描述
实例12：合成Z-Val-Gln-OH
H-Gln-OH(2当量)和NaHCO3(2当量)在搅拌下在最高温度45℃下溶于水中，并且然后冷却到约5℃。将ZValOSu(1当量)溶于MeCN中并且加入该水溶液中，其方式为使温度不升高到超过10℃。在升温到室温保持至少2小时之前该混合物在±5℃下搅拌至少1h。该肽溶液在真空下浓缩，用水稀释并且用AcOEt洗涤2次。然后水相用i-BuOH稀释并且用KHSO4溶液将pH调节到2.5。然后加入DCM以将该肽萃取到有机相中，该有机相用5％重量的NaCl溶液并且最后用水洗涤。收集有机相并且将其在减压下浓缩直至挥发物中水含量≤1％重量。该浓缩物用热的乙酸异丙脂稀释并且在温和搅拌下保持以冷却到25℃以结晶该肽。固体通过过滤回收，在25℃下再次用AcOiPr洗涤并且在真空下干燥直至肽中AcOiPr含量≤5％重量。真空干燥后，回收了不少于70％的Z-Val-Gln-OH。
实例13：合成H-Val-Gln-Pro-Gly-OH(SEQ ID NO 2)
H-Pro-Gly-OH(1.15当量)在水中与Dipea(1.05当量)相混合直至完全溶解，然后加入DMA。将该溶液冷却到-10℃。将Z-Val-Gln-OH溶于DMA中并且得到的溶液冷却到-15℃。加入Dipea(1.05当量)以中和羧基官能团，并且然后加入吡啶(1.05当量)和PivCl以活化该酸官能团。将该Pro-Gly溶液尽可能快地转移到活化的二肽中并且搅拌该浆料至少0.5小时并且将其保持以升温到室温。该反应混合物通过加入水进行中和，用5％的NaHCO3水溶液稀释并且用AcOEt洗涤3次。然后用5％的KHSO4将pH调节到2.5并且该肽用20％i-BuOH的DCM溶液萃取三次。收集有机相并且将其在减压下浓缩直至挥发物中水含量≤1％重量。然后将受保护的四肽的溶液在25℃下在IPE中沉淀。Z-Val-Gln-Pro-Gly-OH(SEQ ID NO 2)通过过滤收集，用IPE洗涤并且真空干燥直至肽中IPE含量≤5％重量。受保护的片段在进行脱保护步骤之前在iPrOH和AcOEt的混合物中再结晶。在30℃下将Z-Val-Gln-Pro-Gly-OH(SEQ ID NO 2)溶于甲醇中并且向该肽溶液中加入Pd/C(0.02当量)。在30℃下搅拌该溶液随后减压下(0.3bar)引入氢。该溶液搅拌至少3小时并且通过HPLC检测反应的完成。过滤该溶液以除去催化剂并且用甲醇洗涤。蒸发后，游离的四肽然后通过在10℃下将该溶液转移到MeCN中进行沉淀。该溶液在10℃下保持以老化至少30分钟。将固体过滤并且用MeCN洗涤。真空干燥后，回收了不少于60％的H-Val-Gln-Pro-Gly-OH(SEQ ID NO 2)。该产物如上实例8中所述可以进行偶联以产生H-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-OH(SEQ ID NO 1)。
实例14-19：在描述部分中在方案3中描述了一种第三合成方法并且 在随后的方案6中给出了它的另一个具体实施方案。该方法通过此后的实例描述
Figure BSA00000478797800311
实例14：合成Boc-Gly-Gly-Osu
将Boc-Gly-Gly-OH和Suc-OH(1.1当量)溶于iPrOH中并且将DIC(二异丙基碳二亚胺)(1.1当量)在约25℃下缓慢加入该溶液中。在该悬浮液冷却到5℃之前该反应在25℃下搅拌至少4h。活化的二肽在5℃下通过过滤回收并且用冷iPrOH洗涤。干燥后分离Boc-Gly-Gly-Osu，其中产率是85％。
[0144]实例15：通过Boc-Gly-Gly-OSu合成Boc-Gly-Gly-Val-Leu-OH(SEQ ID NO 3)
一方面，向MSA(2.7当量)的AcOEt溶液中加入H-Val-Leu-OH(1.05当量)。该浆料在25℃下搅拌直至得到溶液。另一方面，将Boc-Gly-Gly-OSu(1当量)部分地溶于AcOEt和DMA的混合物中。然后在搅拌下在25℃下将该二肽溶液转移到Boc-Gly-Gly-OSu溶液中。当偶联完成时(通过HPLC检测)，未反应的OSu酯用DMAPA(0.05当量)进行中和。然后反应通过加入水淬灭，用AcOEt稀释并且在搅拌下用KHSO4溶液洗涤。除去水相并且该有机层再次用NaCl的溶液并且最终用水洗涤。有机相最终在真空下浓缩直至挥发物中水含量≤1％重量并且该溶液用热异丙醚稀释并且在温和的搅拌下保持以冷却到25℃以结晶该肽。通过过滤回收固体，在25℃下用IPE再次洗涤。真空干燥后，回收80％的Boc-Gly-Gly-Val-Leu-OH(SEQ ID NO 3)。
实例16
遵照实例15中同样的步骤除了使用MTBE替代IPE用于稀释和洗涤。回收了同样产率的Boc-Gly-Gly-Val-Leu-OH(SEQ ID NO 3)，但是MTBE比IPE更便宜并且更安全。
实例17：合成H-Val-Gln-Pro-Gly-OtBu (SEQ ID NO 2)
在25℃下将Z-Pro-Gly-OtBu溶于AcOEt中并且向该肽溶液中加入Pd/C(0.02当量)。在25℃下搅拌该溶液随后减压下(0.3bar)引入氢。反应通过HPLC被认为是完成后，将溶液过滤以除去催化剂，该催化剂用AcOEt洗涤。将H-Pro-Gly-OtBu(1.05当量)的溶液冷却到-15℃。将Z-Val-Gln-OH溶于DMA和AcOEt的混合物中并且将得到的溶液冷却到-15℃。加入Dipea(1.05当量)以中和羧基官能团，并且然后加入吡啶(1.05当量)和PivCl以活化该酸官能团。将该H-Pro-Gly-OtBu溶液尽可能快地转移到活化的二肽中并且搅拌该浆料至少0.5小时并且将其保持以升温到室温。反应混合物通过加入水进行中和，用AcOEt稀释并且有机相用5％KHSO4水溶液，用5％NaHCO3水溶液，用5％NaCl水溶液并且最后用水洗涤。收集有机相并且在减压下浓缩直至挥发物中水含量≤1％重量。该浓缩物用热的异丙醚稀释并且在温和搅拌下保持以冷却到25℃以结晶该肽。固体通过过滤回收，再次用热IPE洗涤并且在真空下干燥直至肽中IPE含量≤5％重量。在室温下将Z-Val-Gln-Pro-Gly-OtBu(SEQ ID NO 2)溶于甲醇中并且向该肽溶液中加入Pd/C(0.02当量)。在25℃下搅拌该溶液随后减压下(0.3bar)引入氢。该溶液搅拌至少2小时并且通过HPLC检测反应的完成。将该溶液过滤以除去催化剂并且用乙醇洗涤。蒸发后，然后游离的四肽通过在-10℃下将该溶液转移到MTBE中沉淀。该溶液在-10℃下保持以老化至少30分钟。将固体过滤并且用MTBE洗涤。真空干燥后，回收了不少于80％的H-Val-Gln-Pro-Gly-OtBu(SEQ ID NO 2)。
实例18：合成HCl.H-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-OH(SEQ ID NO 1)
在25℃下将Z-Val-Gln-Pro-Gly-OtBu溶于DMA中并且向该肽溶液中加入Pd/C(0.02当量)。在25℃下搅拌该溶液随后减压下(0.3bar)引入氢。反应通过HPLC被认为是完成后，将溶液过滤以除去催化剂，该催化剂用DMA洗涤。将Boc-Gly-Gly-Val-Leu-OH(1.05当量)(SEQ ID NO 3)溶于DMA中并且将产生的溶液冷却到-15℃。加入Dipea(1.05当量)以中和羧基官能团，并且然后加入吡啶(1当量)和PivCl以活化该酸官能团。将冷却到-15℃的H-Val-Gln-Pro-Gly-OtBu(SEQ ID NO 2)(1.0当量)的DMA溶液尽可能快地转移到活化的四肽中并且搅拌浆料至少0.5小时并且将其保持以升温到约-5℃。反应混合物用水淬灭并且然后通过加入热水进行稀释以沉淀该肽。该浆料在室温下保持以进行搅拌并且将固体过滤，用KHSO4水溶液，用NaHCO3水溶液并且最终用水洗涤。在减压下干燥该固体直至水含量≤3％重量。为了除去Boc基团，将受保护的八肽(SEQ ID NO 1)溶于AcOH中并且加入HCl 1M的AcOH(7当量)溶液。在约30℃下搅拌该混合物约5hr。最终的肽在25℃下通过在MeCN和IPE的混合物中进行沉淀来回收。将固体过滤，用IPE并且最终用MeCN洗涤数次。在40℃下真空干燥后，回收了80％的HCl.H-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-OH(SEQ ID NO 1)。
实例19：合成H-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-OH(SEQ ID NO 1)
将Boc-Gly-Gly-Val-Leu-OH(1.0当量)(SEQ ID NO 3)H-Val-Gln-Pro-Gly-OtBu(SEQ ID NO 2)(1.0当量)和Hobt(1.1当量)在室温下溶于DMA中直至得到澄清的溶液。将该溶液冷却到约-5℃并且向该溶液中加入EDC(1.1当量)以引发偶联。将混合物在-5℃下搅拌直至完成偶联(通过HPLC跟踪反应进程)。通过加入水稀释反应混合物，这使肽沉淀。将固体过滤，用KHSO4水溶液，用NaHCO3水溶液并且最终用水洗涤。固体在减压下干燥。为了除去Boc基团，将受保护的八肽(SEQ ID NO 1)溶于AcOH中并且加入HCl 4M的二噁烷(12当量)溶液。在25℃下将该混合物搅拌约2h。最终的肽在25℃下通过在IPE中沉淀回收。将固体过滤，用IPE并且最终用MeCN洗涤数次。在40℃下真空干燥后，回收了80％的HCl.H-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-OH(SEQ ID NO 1)。该肽在25℃下溶于0.05M乙酸铵缓冲溶液中，用25％NH3溶液调节到4.5≤pH≤5.0，并且然后用MeCN稀释。将该溶液如实例9中所述进行过滤和纯化。
实例20：合成HCl.H-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-OH(SEQ ID NO 1)
在25℃下将Z-Val-Gln-Pro-Gly-OtBu溶于DMA中并且向该肽溶液中加入Pd/C(0.02当量)。在25℃下搅拌该溶液随后减压下(0.3bar)引入氢。反应通过HPLC被认为是完成后，过滤溶液以除去催化剂，该催化剂用DMA洗涤。将Boc-Gly-Gly-Val-Leu-OH(1.05当量)(SEQ ID NO 3)溶于DMA中并且将产生的溶液冷却到-15℃。加入Dipea(1.05当量)以中和羧基官能团，并且然后加入吡啶(1当量)和PivCl以活化该酸官能团。将冷却到-15℃的H-Val-Gln-Pro-Gly-OtBu(SEQ ID NO 2)(1.0当量)的DMA溶液尽可能快地转移到活化的四肽中并且搅拌浆料至少0.5小时并且将其保持以升温到约-5℃。反应混合物用水淬灭并且然后通过加入热去离子水稀释以沉淀该肽。该浆料在室温下保持以进行搅拌并且将固体过滤，用KHSO4水溶液，用NaHCO3水溶液并且最终用水洗涤。在减压下干燥该固体直至水含量≤3％重量。为了除去Boc基团，将受保护的八肽(SEQ ID NO 1)溶于AcOH中并且加入HCl 1M的AcOH(7当量)溶液。将该混合物在约30℃下搅拌约5小时(直至通过HPLC跟踪的反应完成)。最终的肽通过向脱保护的混合物加入MeCN随后加入IPE通过结晶回收。将固体过滤，用IPE并且最终用MeCN洗涤数次。在40℃下真空干燥后，回收了80％的HCl.H-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-OH(SEQ ID NO 1)。
实例21：结晶AcOH.H-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-OH(SEQ ID NO 1)
在25℃下将HCl.H-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-OH(SEQ ID NO 1)溶于水中并且向该水溶液中加入乙酸胺(±1.25当量)，然后用NH3水溶液将pH调节到±4.5，以结晶该肽。在25℃下搅拌数小时后，将固体过滤并且在真空下干燥直至水含量≤5.0％重量。真空干燥后，回收了不少于80％的AcOH.H-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-OH(SEQ ID NO 1)。
序列表自由正文(Free Text)
Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 1)
Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 2)
Gly-Gly-Val-Leu(SEQ ID NO 3)
Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 4)
Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 5)
Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 6)
Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 7)
Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 8)
Figure ISA00000478797900011

Claims (7)

1.肽Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 1)的结晶盐，其中所述肽的所述盐选自盐酸盐或乙酸盐。
2.根据权利要求1的所述结晶盐，其中所述肽的所述盐是乙酸盐。
3.根据权利要求2的所述结晶盐，其中所述乙酸盐以小于50摩尔％/摩尔肽的浓度存在。
4.根据权利要求2的所述结晶盐，其中所述乙酸盐以20摩尔％/摩尔肽至30摩尔％/摩尔肽的浓度存在。
5.根据权利要求1的所述结晶盐，其中所述肽的所述盐是盐酸盐。
6.根据权利要求5的所述结晶盐，其中所述肽的所述盐酸盐具有通过HPLC测定的至少98.5％的纯度。
7.肽Gly-Gly-Val-Leu-Val-Gln-Pro-Gly(SEQ ID NO 1)的分离的盐酸盐，其具有通过HPLC测定的至少98.5％的纯度。
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