MXPA01002600A - Metodo de usar zot o zonulina para inhibir la proliferacion linfocito en una manera antigeno-especifico. - Google Patents

Abstract

Metodos para usar Zot o zonulina como un inhibidor de antigeno especifico de la actividad APC y proliferacion linfocito, siendo primeramente util en el campo de inmunoterapia e inmunoregulacion como son descritos. Especificamente, Zot y zonulina inhiben el antigeno que presenta la proliferacion linfocito antigeno-especifico de celula-mediada en una manera dependiente de la dosis. Este efecto esta asociado con la presencia de un receptor de superficie macrodevoradora lo cual enlaza Zot en una manera saturable y especifica. Esta bajo-regulacion de la respuesta inmune esta, al menos en parte, asociada con una disminucion del consumo de antigeno.

Description

MÉTODO DE USAR ZOT O ZONULINA PARA INHIBIR LA PROLIFERACIÓN DE LINFOCITO EN UNA MANERA ANTIGENO-ESPECIFICO El desarrollo de la presente invención fue soportado por la Universidad de Maryland, Baltimore. Ciertos estudios descritos adjunto fueron soportados por el National Institute of Health, subvención NIH No. DK-48373. El gobierno puede tener ciertos derechos.

REFERENCIA CRUZADA PARA SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud es una solicitud presentada bajo 35 U.S.C. § 111 (a) que reclama beneficios conforme al 35 U.S.C. § 119 Ce) (I) de la fecha de presentación de la solicitud provisional No. 60/100,266, presentada el 14 de septiembre de 1988, conforme al 35 U.S.C. § 111 (b).

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a la bajo-regulación del antígeno-específico de una respuesta inmune que usa zot o zonulina. Específicamente, la presente invención proporciona un método para inhibir antígenos que presentan la proliferación de linfocitos de antígeno-específico de célula mediada en una manera dependiente de la dosis por la administración de una cantidad efectiva de zot o zonulina.

ANTECEDENTES DE LA INVECION La unión hermética y la citoesqueletón actina. . a, 4 -. Mj.tmMlt? . tj?. *."-»-—-* La unión hermética (en lo sucesivo "tj") ocluyentes de zonula (en lo sucesivo "ZO") son unos de los distintivos de la efitalia secretora y absortiva (Madara, J. Clin. Invest., 83:1089-1094 (1989); and Madara, Textbook of Secretory Diarrhea Eds. 5 Lebenthal et al, Chapter 11 , pages 125-138 (1990). Como una barrera entre compartimentos apical y vasolateral, ellos regulan selectivamente la difusión pasiva de iones y solutos solubles en agua a través de la vía paracelular ( gumbiner, AM. J. Physiol., 253 (Cell Physiol. 22) :C749-C758 (1997)). Esta barrera mantiene cualquier gradiente generado por la actividad de las vías asociadas con la ruta transcelular (Diamond, 10 Physiologist, 20:10-18 (1977)). Hay una evidencia abundante de los ZO, una vez considerados como estructuras estáticas, están de hecho dinámica y fácilmente adaptados a una variedad de desarrollo de circunstancias fisiológicas y patológicas (Magnuson et al, Dev. Biol., 67:214- 224 (1978); Revel et al, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 40:443-455 (1976); y 15 Schneeberger et al, J. Cell Sci., 32:307-324 (1978); Gilula et al, Dev. Biol., 50:142-168 (1976); Madara et al, J. Membr. Biol., 100:149-164 (1987); Mazariegos et al, J. Cell Biol., 98:1865-1877 (1984); Milks et al, J. Cell Biol., 103:2729-2738 (1986); Nash et al, Lab. Invest., 59:531 -537(1988); y Shasby et al, Am. J. Physiol., 255 (Cell Physiol., 24) :C781- 788(1988)). Los mecanismos regulatorios que refuerzan esta adaptación no están aún 20 completamente entendidos. Sin embargo, es claro que, en la presencia de Ca 2+, la reunión del ZO es el resultado de interacciones celulares que desencadenan una cascada completa de eventos bioquímicos que últimamente conducen a la formación y modulación de una red organizada de elementos ZO, la composición la cual ha sido caracterizada solo parcialmente (Diamond, Physiologist, 20:10-18 (1977)). Un candidato para las hebras 25 de proteína transmembrana, que ocluye, ha sido identificado (Furuse et al, J. Membr. Biol., 87:141-150 (1985)).

Seis proteínas han sido identificadas en una placa submembranosa citoplásmíca subyacente a los contactos de la membrana, pero su función resta por ser establecida (Diamond, supra). Las ZO-1 y ZO-2 existen como un heterodímero (Gumbiner et al, Proc. Nati. Acad. Sci., USA 88:3460-3464 (1991 )), en un complejo de detergente estable con una proteína 130 KD (ZO-3) no caracterizada. La mayoría de los estudios microscópicos inmunoelectrónicos han sido localizadas ZO-1 precisamente en los contactos debajo de la membrana (Stevenson et al, Molec. Cell Briochem., 83:129-145 (1988)). Otras dos proteínas cingulina, (Citi et al, Nature (London), 333:272-275 (1988)) y el antígeno 7H6 (Zhong et al, J. Cell Biol., 120:477-483 (1993)) están localizados además de la membrana y no han sido aún clonadas. El Rab 13, una pequeña proteína de enlace GTP ha sido también recientemente localizada para la región de empalme ( Zahraoui et al, J. Cell Biol., 124;101-115 (1994)). Otras pequeñas proteínas de enlace GTP se conocen para regular el citoesqueletón cortical, es decir, accesorio rho que regula la membrana actina en contactos focales (Ridley et al, Cell, 70:389-399 (1992)), y rae regula el factor inducido de crecimiento de la membrana de agitamiento (Ridley et al, Cell, 70:401-410 (1992)). Basado en la analogía con las funciones conocidas de las proteínas de placa en el mejor empalme de célula caracterizado, los contactos focales (Guan et al, Nature, 358:690-692 (1992)), y empalmes de adherinas (Tsukita et al, J. Cell Biol., 123:1049-1053 (1993)), ha sido hipotetizado que las proteínas de placa tj-asociadas están involucradas en la transducción de señales en ambas direcciones a través de la membrana celular, y en la regulación de los enlaces para el citoesqueletón actina cortical. Para conocer la cantidad de infecciones diversas fisiológicas y patológicas a las cuales el epitelio está sujeto, las ZO deben ser capaces de respuestas rápidas y coordinadas que requiera la presencia de un sistema regulatorio complejo. La caracterización precisa de los mecanismos involucrados en la reunión y regulación de la ZO es un área de investigación corriente y activa.

Hay ahora un cuerpo que evidencia que existen ligamentos tj estructurales y funcionales entre el citoesqueletón actina y los tj complejos de las células absortivas (Gumbiner et al, supra; Madara et al, supra; y Drenchahn et al, J. Cell Biol., 107:1037-1048 (1988)). El citoesqueletón actina está compuesto de una malla de trabajo complicada de microfilamentos cuya geometría precisa está regulada por un núcleo largo de proteínas de enlace actina. Un ejemplo de como el estado de fosforilación de una proteína de enlace actina puede regular el ligando citoesqueletal que liga al plasma de la membrana de la célula y el substrato quinasa C rica en alanina miristohilatada (en io sucesivo "MARCKS"). MARCKS es una proteína específica quinasa C (en lo sucesivo "PKC") substrato que está asociado con la cara citoplásmica del plasma de la membrana (Aderem, Elsevier Sci. Pub. (UK), pages 438-443 (1992)). En su forma no-fosforilatada, los enlaces cruzados MARCKS para la membrana actina. Entonces, de ello es que probablemente la malla de trabajo asociada con la membrana vía MARCKS está relativamente rígida (Hartwig et al, Nature, 356:618-622 (1992)). Las PKC losforilatadas MARCKS activadas las cuales son liberadas de la membrana (Rosen et al. J. Exp. Med., 172:1211- 1215 (1990); y Telen et al, Nature, 351 :320-322 (1991)). La actina ligada a las MARCKS es probablemente separada espacialmente de la membrana y es más plástica. Cuando las MARCKS están desfosforilatadas, ellas regresan a la membrana donde una y otra vez se enlazaron cruzadamente con actina (Hartwig et al, supra; y Thelen et al, supra). Estos datos sugieren que la red F-actina puede ser rearreglada para un proceso de fosforilación PKC dependiente que involucra proteínas de enlace actina (las MARCKS son unas de ellas). II. Zonula que ocluye toxina ("Zot") y Zonulina La mayoría de candidatos construidos de la vacuna Vibrio Cholerae por el borrado del gen ctxA que codifica a la toxina del cólera (CT) son capaces de evocar alta respuesta de anticuerpo pero más de la mitad de las vacunas aún desarrollan una leve ^^^ diarrea (Levine et al, Infecí. Inmun., 56(1): 161 -167 (1988)). Dada la magnitud de la diarrea inducida en la ausencia de CT, fue hipotetizado que V.Cholerae produce otros factores enterotoxigénicos, los cuales están aún presentes en especies de la secuencia borrada ctxA (Levine et al, supra). Como resultado, una segunda toxina, zónula que ocluye toxina (en lo sucesivo Zot) elaborada por V.Cholerae, y la cual contribuye a la diarrea residual, fue descubierta (Fasano et al, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 8:5242-5246 (1991)). El gen zot está localizado inmediatamente y adyacente a los genes ctx. El alto porcentaje de ocurrencia del gen zot con los genes ctx también especies de V.Cholerae (Johnson et al, J. Clin. Microb., 31/3:732-733 (1993); y Karasawa et al, FEBS Microbiology Letter, 106:143-146 (1993)). Sugiere un posible papel cinergístico de zot es la causa de la típica diarrea dehidratadora aguda del cólera. Recientemente, el gen zot ha sido también identificado en otros patógenos entéricos (Tschape, "nd Asian-Pacific Symposium cn Typhoid fever y other Salmoneliosis 47 (Abstr.) (1994)). Se ha encontrado previamente que, cuando se probó sobre la mucosa ileai de conejos, zot incrementa la permeabilidad intestinal por la modulación de la estructura de la unión hermética intracelular (Fasano et al, supra). Se ha encontrado que una consecuencia de modificación de la vía pericelular, la mucosa intestinal se hace más permeable. También fue encontrado que Zot no afecta al transporte activado de pareja Na+- glucosa, no es citotóxica y falla completamente al abolir la resistencia transepitelial (Fasano et al, supra). Más recientemente, se ha encontrado que Zot es capaz de abrir reversiblemente la unión hermética en la mucosa intestinal, y entonces Zot, cuando se coadministra con un agente terapéutico es capaz de afectar la entrega intestinal del agente terapéutico, cuando se emplea en una composición de dosis oral para la entrega de droga intestinal (WO 96/37196, Patente U.S. 5,827,534 y Patente U.S. 5,665,389; cada una de las cuales es incorporada como referencia adjunto en su totalidad). Ha sido también _________ Aa»,- encontrado que Zot es capaz de abrir reversiblemente la unión hermética en la mucosa nasal, y entonces Zot cuando es co-administrado con un agente terapéutico es capaz de mejorar la absorción nasal de un agente terapéutico (WO 98/30211 y Patente U.S. 5,908,825; la cual es incorporada como referencia adjunto en su totalidad). En la patente U.S. 5,864,014 y la patente U.S. 5,912,223; las cuales están incorporadas como referencia adjunto en su totalidad, los receptores Zot de células de CaCo2, del corazón, tejido intestinal y cerebral han sido identificadas e aislados. Los receptores Zot representan el primer paso de la vía pericelular involucrada en la regulación de la permeabilidad epitelial instestinal y nasal. En la patente US. 5,945,510, la cual es incorporada como referencia adjunto en su totalidad, las proteínas de mamíferos que están inmunológicamente y funcion^lmente relacionadas a Zot, y que funcionan como el modulador fisiológico de los empalmes apretado de los mamíferos han sido identificadas y purificadas. Estas proteínas de mamíferos, referidas como "zonulina", son útiles para mejorar la absorción de los agentes terapéuticos a través de la unión hermética de la mucosa intestinal y nasal, también como a través de la unión hermética de barreras de la sangre cerebral. Estás proteínas están además caracterizadas por la capacidad para enlazar a los receptores Zot. En la solicitud de patente pendiente U.S. de número de serie No. 09/127,815 presentada el 3 de agosto de 1998, titulada "Peptide Antagonists of Zonulin y Methods for Use of the same", la cual es incorporada como referencia adjunto en su totalidad, los péptidos antagónicos de la zonulina han sido identificados. Dichos péptidos antagónicos enlazan a los receptores Zot, aún no funcionan para modular fisiológicamente las aberturas de la unión hermética de los mamíferos. El péptido antagónico competitivamente inhibe el enlace de Zot y zonulina a los receptores Zot, de ese modo ...ÍSi_>i?i-<-i¡ r-?." í* inhibe la capacidad de Zot y zonulina para modular fisiológicamente las aberturas de unión hermética de los mamíferos. lll. Antíqeno que presenta células y respuestas inmunes. Para una discusión completa de respuestas inmunes e inmunomodulación, ver el capítulo 10 "Recent Advances in Inmunology", por Sztgein et al, New Generation of Vaccines, páginas 99-125, Eds. Levine et al (1997), la descripción de la cual es incorporada de ese modo por referencia. Uno de los mecanismos primarios de protección contra agentes infecciosos involucra inmunidad específica o adquirida. En contraste a la inmunidad innata, los mecanismos de afectación de la inmunidad adquirida que incluye además de otros, anticuerpos, linfocitos citotóxicos (en lo sucesivo "CTL"), las citoquinas derivadas de linfocito T (tal como iFN-?, IL-4, etc.) se inducen las siguientes exposiciones para antígenos o agentes infecciosos y se incrementa en magnitud con las sucesivas exposiciones a los antígenos específicos. Esta capacidad para "recordar" exposiciones previas a los antígenos y responder rápidamente con respuestas de resultado inmunológico de magnitud incrementada (memoria inmunológica) constituye la fundamentación para la vacunación inmunoprofiláctica contra agentes infecciosos. Los tipos principales de células involucradas en respuestas inmunes específicas son los linfocitos T y B. Los linfocitos B o células B son derivadas de la médula del hueso y son ios precursores de las células de secreción de anticuerpo (células de plasma). Las células B reconocen antígenos (proteínas, carbohidratos o grupos químicos simples) a través de los receptores inmunoglobulina o la célula de la membrana (Fearon et al, Scienc, 272:50-53 (1996); Ziegles-Heitbroack et al, Inmunol. Today, 14:121-152 (1993); y Banchereau et al, Inmunol., 52:125-262 (1992)). Después del desencadenamiento por antígeno se expanden clonalmente y cambian su expresión de anticuerpo isotipo (es decir, IgM a IgG, IgE o IgA) bajo la influencia de las citoquinas derivadas de las células T, &^¡* ^ ¿¡¡¡ £^^¿2^ macrodevoradoras y otros tipos de células. Somáticamente mutadas de alta afinidad a las células B son generadas y seleccionadas por antígeno en y alrededor de los centros germinales que están formados en los nodos línfo, bazo, parches Peyers y más agregados linfáticos desorganizados del sistema linfoide periferial (Banchereau et al, (1996) supra; Clark et al, Ann. Rev. Inmuno., 9:97-127 (1991 ); y Maclennan et al, inmunol. Today. 14:29-34 (1993)). Existen las bases para la memoria de la célula B. Linfocitos T o células T, en contraste a las células B, reconocen péptidos derivados de proteínas antígenos que están presentadas sobre la superficie de células que presentan antígeno (en lo sucesivo "APC") en conjunción con las moléculas clase I y clase II de mayor complejo de histocompatibilidad (MHC). Clones de linfocitos T que expresan receptores de células T (en lo sucesivo "TCR") de apropiada afinidad son desencadenados por antígeno para proliferar y desarrollar dentro de las células de afectación (Fearon, (1996) supra; Sprent et a! Cell, 76:315-322 (1994); y Hendrick et al, Germain, Fundamental Inmunology, 3ra ed., páginas 629-676 (1993)). Después de la eliminación del agente infeccioso los clones de antígeno específico se mantienen como la memoria de aquellas células T, tras la exposición subsecuente al antígeno, proporciona una respuesta sólida, más rápida y algunas veces cualitativamente diferente de la inmune específica. Hay dos poblaciones principales de células T, aquellas que se expresan como moléculas CD4 y aquellas que se expresan como moléculas CD8. Las moléculas CD4 y CD8 son células T de superficie giicoproteínas que sirven como moléculas accesorio importantes (co-receptores) durante la presentación antígeno por el enlace a las moléculas clase II y clase I MHC, respectivamente (Hendrick et al, supra (1993)). Entonces, las moléculas CD4 y CD8 juegan un papel significante en la estabilización de las interacciones de las células T y APC iniciadas por el enlace específico del complejo TCR para los péptidos antigénicos presentados en asociación con las moléculas MHC.

?MM¿ ..^t-É-h-a-*.--] Consecuentemente, las moléculas CD4 y CD8, originalmente usadas primeramente como marcadores para identificar las poblaciones de células T con características funcionales diferentes, juegan un papel mayor en la activación de las células T en la clase II MHC- restringida y clase I MHC-restringida . Las células CD4+ (el ayudante T o Th) están principalmente involucradas en las respuestas inflamatorias y proporcionan ayuda para la producción de anticuerpos por células B mientras que las células CD8+ (citotóxicas T o Tc) componen la mayoría de las CTL involucradas primeramente en la clase I MHC- restringidas que mata las células objetivo infectadas por organismos patogénicos, incluyendo bacterias, virus y parásitos (Sztein et al, J. Inmunol., 155:3987-3993 (1995); Kaufman, Ann. Rev. Inmunol., 11 :129-163 (1993) y Inmunol. Today, 9:168-174 (1988); Townsend et al, Cell, 44:959-968 (1986); Malik et al, Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 88:3300- 3304 (1991); Sedegah et a!, J. Inmunol., 149:966-971 (1992); y Shearer et a!, Inmunol. Today, 17:21-24 (1996)). La activación exitosa del antígeno específico de las células T que resulta en la expansión y diferenciación de la célula T (o proliferación de linfocito) requiere una ppmera señal proporcionada por la interacción de TCR sobre la superficie de las células T con complejos MHC-antígeno sobre APC y una segunda, complementaria, señal proporcionada por factores solubles tal como IL-2, o enlaces de CD28 (una molécula co- estimulatoria) para miembros de la familia B7 (es decir, CD80 (B7-1 ) o CD86 (B7-2) sobre APC (Lenschow, Ann. Rev. Inmunol., 14:233-258 (1996), and Linsley et al, Ann. Rev. Inmuno., 11 : 191-212 (1993)). El estudio de la vía co-estimulatoria CD28/B7 y otras moléculas de adhesión que ayudan a estabilizar las interacciones de la célula-APC T (la cual también parece jugar papeles críticos en el mensajero linfocíto) es una de las áreas claves en las cuales muchos avances significativos han sido hecho en años recientes. La presentación de antígenos a las células T involucra una serie de eventos intracelulares dentro de APC, que incluyen la generación de fragmentos de péptido antigénico, enlace de esos péptidos a moléculas MHC para formar complejos estables péptido-MHC y transporte de esos complejos a la superficie de la célula donde pueden ser reconocidos por TCR en la superficie de las células T se ha acumulado evidencia para la existencia de dos principales vías de presentación y proceso de antígeno ("vías clásicas"). Una de estas vías, la "vía citosólica", es predominantemente usada para la presentación de péptidos producidos endogénicamente en la APC, tal como proteínas virales, antígenos tumorales y auto-péptidos, asociados con moléculas de clase I MHC (Hendrick et al, supra; and Germain, supra (1993)). La presentación del gran número de complejos de auto-péptidos para moléculas clase I MHC resulta de la capacidad de APC para diferenciar entre auto y no-auto. Bajo condiciones normales, la mayoría de células T seleccionadas para reconocer auto-péptidos son eliminadas durante la diferenciación de célula T o son activadas bajo-reguladas, y consecuentemente no pueden ser activadas por complejos auto-péptido-clase I MHC la segunda "vía clásica" de la presentación y proceso de antígeno, "vía endosomal", la cual es usada predominantemente para presentación de antígenos exógenos solubles que se unen a moléculas clase ¡I MHC, involucran la captura de antígeno por APC, cualquiera de los dos enlaces para un receptor específico o por realización en la fase fluida por macropinositosis (Lanzavecchia, Curr. Opin, Inmunol., 8:348-354 (1996)). El desencadenamiento de las células T a través de TCR se ha mostrado con tan pocos como 200-600 complejos péptido-MHC en el caso de nucleoproteínas de influenza (Falk et al, Semin. Inmuno., 5:81-94 (1993)). En la mayoría de las repuestas inmunes, los epítopes antigénicos asociados con moléculas clase I MHC desencadenan la activación de respuestas CD8+ CTL, mientras que los fragmentos antigénicos (epítopes) derivados de los complejos de proteínas solubles para moléculas clase II MHC son reconocidos por células CD4+ Th. Esto determina que son las más importantes contribuciones hechas en los años pasados sobre los mecanismos < ** ¿ t-_bt.t-><__?_jt..». ^ -,__»>.. ._, ,y,»A-biBÍt— i¿A¡-~«a--A <„» involucrados en las etapas prematuras de la activación inmune y son críticos para el desarrollo de vacunas exitosas. Como se mencionó arriba hay dos "vías clásicas" o proceso de antígeno y presentación. La vía de clase I MHC es la más usada comúnmente para el proceso de presentar proteínas celulares en su mayoría, sino todos, los comportamientos celulares, incluyen el citocol, núcleos y mitocóndria ( Falk et al, supra (1993)) para el reconocimiento por CD8+ CTL. La vía de clase II MHC es usada predominantemente para el proceso y presentación de antígenos exógenos, tal como proteínas producidas por bacteria extracelular y otros microorganismos infecciosos que pueden ser presentados para las células CD4+ Th. Ambas moléculas clase I y II MHC enlazan antígenos péptido a través del uso de receptores de superficie o "grietas de enlace". Sin embargo la ruta del proceso antígeno y preparación varía dramáticamente entre los dos. Los antígenos clase I son procesados y preparados por la "vía citosólica''. Específicamente, péptidos sintetizados intracelularmente que son degradados dentro de fragmentos pequeños de proteína los cuales entonces son llevados a través de la membrana del retículo endoplasmático (ER). Dentro del ER, los fragmentos antigénicos enlazan a moléculas clase I MHC que forman un complejo que es transportado entonces al aparato de Golgi y últimamente a la superficie celular donde ellos son reconocidos por TCR, que señalan la expansión y diferenciación antígeno específico CTL, el primer paso de la respuesta inmune. Antígenos clase II, por otro lado, son procesados y preparados por la "vía endosomal". Específicamente, los antígenos naturales son capturados por APC que circula, el enlace antígeno a un receptor no específico o específico. El antígeno es entonces internalizado por la APC por un mecanismo de endocitosis de receptor mediado o pinocitosis. El antígeno internalizado está entonces localizado en un endosoma, una membrana de enlace que ¡nvolucra a la vesícula en el transporte intracelular y degradación del antígeno. Fragmentos de péptido adheridos entonces se enlazan a moléculas clase II MHC para formar un complejo que es transportado -a través del aparato de Golgi dentro del compartimiento endosomal, y para la superficie celular que va a ser reconocida por el TCR. Otra vez la diferenciación y expansión y señalización de la célula Th antígeno específico. 5 La APC juega un papel vital en la generación de una respuesta inmune. Para la presentación de antígenos procesados para CTL en una manera restringida clase I, la APC debe expresar moléculas clase I MHC y tener la capacidad para expresarlas sobre la superficie celular complejos de proteínas producidas endogénicamente para moléculas clase I MHC. Además todas las células virales endogénicamente producidas, 10 parasíticas, o proteínas bacteriales o antígenos tumorales que ganan el acceso al citocol pueden funcionar como APC. Para la presentación de antígenos procesados para células Th en una manera de clase II restringida, la APC debe ser capaz de reconocer y enlazar el antígeno a través de receptores específicos o no específicos para el antígeno particular. La mayoría de células que eficientemente presentan antígenos para los linfocitos son 15 llamadas prcfesionalmente APC que incluyen células dendríticas (DC), macrodevoradoras, linfocitos B, células Langerhans, y, en ciertas instancias células endoteliales humanas (Lanzavecchia, supra (1996)). Las DC que se originan en la médula del hueso son consideradas como las más eficientes APC para la presentación de antígenos solubles. Las DC capturan 20 antígenos sobre la periferia y migran al bazo o nodos linfa, donde son eficientemente activadas las células Th particularmente las células naturales T (Lanzavecchia. supra (1996); Peters et al, Inmunol. Today, 17:273-278 (1996)). Varías características únicas capacitan a DC para funcionar tan efectivamente como presentadores de antígeno. Específicamente, ellas tienen la capacidad para internalizar antígenos solubles por varios 25 mecanismos, que incluyen macropinocitosis constitutiva, internalización de complejos anticuerpo antigeno a través de los enlaces receptores CD32, e internalización de antígenos manosilatados o fucosilatados a través de enlace receptor mañosa. Esto permite a DC muestrear grandes cantidades de fluido en cortos periodos de tiempo, los que se acumulan en un compartimiento lísosomal que contiene moléculas clase II MHC y proteasas. Las DC también constitutivamente expresan un número de moléculas 5 costimulatorias y otras de adhesión que están super reguladas por citoquinas proinf lamatorias tales como IL-1a, IL-1 ß y TNF-a, de ese modo mejorando su capacidad para funcionar como APC para respuestas inmunes Th restringidas a clase II MHC. Macrodevoradoras y otros fagocitos mononucleares son probablemente las más efectivas APC para antígenos derivados de la mayoría de microorganismos 10 patogénicos. Otros como los virus a través de su capacidad para fagocitar partículas largas, tales como bacterias y parásitos bajo condiciones típicas, los microorganismos fagocitados son entonces asesinados en las fagolizozomas y digeridos, que resulta en la generación de fragmentos antigénicos disponibles a enlazar a moléculas ciase II MHC para la preparación de células Th. Otros mecanismos importantes que permiten 15 macrodevoradoras para que sirvan como efectivas APC que incluye su capacidad para internalizar antígenos solubles a través del enlace de complejos antígeno anticuerpo a receptores CD16, CD32 y CD64. Macrodevoradoras, también internalizan proteínas complementarias cubiertas a través de receptores para componentes C3 y otros C y tras la estimulación por factores de crecimiento, por macropinocitosis. Además, las 20 macrodevoradoras expresan receptores para mañosa y son una mayor fuente de citoquinas pro-inflamatorias que incluyen IL-1a, IL-1 ß, IL-6, IL-8, IL-12, TNF-a y TNF-ß que ejercen potente actividad inmunoregulatoria sobre las respuestas de células T (Sztein et al, supra (1997)). Los linfocitos B son muy efectivos APC para antígenos solubles para ¡a 25 presentación a las células Th. Esto está en gran parte basado sobre su capacidad para enlazar e internalizar muy eficientemente antígenos .solubles específicos a través de los complejos receptores células B (BCR), que consiste de la membrana específica inmunoglobina (mlg) y la Iga (CD79a) - Igß (CD79ß) heterodímero (Fakl et al, supra (1993)). Las células Langerhans (LC), derivadas de progenitores de médula dei hueso, están consideradas por ser solamente las células presentes en la epidermis con capacidades APC. Las LC migran fuera de la epidermis vía los linfáticos a ios nodos linfaregionales donde ellos se desarrollan dentro de la DC. Indistintamente, LC expresa CD1 , una molécula MHC no clásica capaz de presentarse a las células T, en una manera restringida, los antígenos no proteínas tales como lípido microbial y antígenos glicolípidos. La invención adjunto se enfoca sobre la bajo regulación del antígeno específico de la respuesta inmune de APC mediada. La invención deriva del descubrimiento de un receptor superficial macrodevoradora al cual se enlaza Zot en una manera saturable y específica. La presente invención describe un método para usar Zot o zonulina como inmunoreguladores antígeno específico y en inmunoterapeútica. Específicamenle, ambos Zot y zonulina inhiben la proliferación de linfocito antígeno específico APC mediado en una manera dosis dependiente sin afectar las respuestas mitógeno inducidas. Esta bajo regulación de la respuesta inmune está al menos una parte asociada con el disminuido consumo del antígeno. Moduladores corrientemente disponibles de respuestas inmunes, tal como ciclosporín y compuestos esteroidales, tienen un efecto generalizado sobre estimulaciones antígeno y mitógeno del sistema inmune (Reed et al, J. Inmunol., 137:150-154 (1986)). La invención descrita adjunto ofrece la ventaja de habilitar la bajo regulación de respuestas inmunes a un antígeno particular sin inducir los efectos negativos laterales, tal como la susceptibilidad incrementada a la infección y la supresión generalizada inmune, típico de los inmunomoduladores de la técnica anterior.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Es un objeto de la invención proporcionar un método para la bajo regulación de la respuesta inmune de un huésped animal para ciertos antígenos, de ese modo facilitar las terapias inmunobasadas. Específicamente, es un objeto de la invención inhibir la capacidad de células que presentan antígeno (APC) a procesos y presentan antígenos a linfocitos, que de ese modo suprimen la proliferación de linfocitos y reacciones del sistema inmune subsecuente en respuesta a los antígenos definidos. Es además otro objeto de la invención proporcionar un tratamiento para un animal afligido con un deceso o desorden relacionado autoinmune o inmune tal como una esclerosis múltiple, artritis reumatoide, diabetes mellitus dependiente de insulina, deceso celiaco, síndrome de Sjogren, eritematosus lupus sistémica, tiroiditis autoinmune, ideopática trombocitopénica púrpura, anemia hemolítica, deceso Grave, deceso Addison, orquitis autoinmune, anemia perniciosa, basculitis, cuagulofatia autoinmune, miastenia gravie, polineuritis, pénfigus, carditis reumática, polimiocitie, derrnatomiocitis. y escleroderma por la administración de una cantidad efectiva de inmunoregulador Zot relacionado. En una modalidad alternativa, el tratamiento de la aflicción animal con un deceso o desorden relacionado autoinmune o inmune puede involucrar la administración de una cantidad efectiva de inmunoregulador Zot relacionado en combinación con un antígeno específico relacionado autoinmune. Es además un objeto de la invención proporcionar un tratamiento de un animal afligido con subsecuente rechazo inmune para tejidos u órganos trasplantados por la administración de una cantidad efectiva de ¡nmunoregulador Zot relacionado. En una modalidad alternativa el tratamiento del animal afligido con subsecuente rechazo inmune a tejidos u órganos trasplantados puede regular la administración de una cantidad efectiva de inmunoregulador Zot relacionado en combinación con un antígeno específico trasplantado.

Es además un objeto de la invención proporcionar un tratamiento para un animal afligido con un deceso o desorden inflamatorio o alérgico tal como asma, psoriasis, dermatitis eczematous, sarcoma Kaposi, esclerosis múltiple, deceso inflamatorio de intestino, desórdenes proliferativos de células de músculos suaves, y condiciones 5 inflamatorias asociadas con infecciones micótica, viral, parasítica, o bacterial por ¡a administración de una cantidad efectiva terapéuticamente de un inmunoregulador Zot relacionado. En una modalidad alternativa el tratamiento de la aflicción del animal con un deceso o desorden alérgico o inflamatorio puede involucrar la administración de una cantidad efectiva de un inmunoregulador Zot relacionado en combinación con un alérgeno 0 o antígeno específico inflamatorio relacionado. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 ilustra curvas de enlace de saturación Zot-FITC para linfocitos y macrodevoradoras. Los datos demuestran que los enlaces Zot preferencialmente para monocitos/macrodevoradoras humanas. 5 La figura 2 ilustra el bloqueo de enlaces Zot-F!TC por ia Zot no etiquetada.

La pre-incubación de PBMC con Zot no etiquetada disminuye e! enlace de Zot-FITC para ambos, monocito/devoradoras y linfocitos T por aproximadamente 33%, que sugiere que el enlace Zot para estas células es receptor-mediado. La pre-incubación de células con MBP purificado no tiene efecto en el bloqueo de enlace Zot-F!TC, que indica que el o bloqueo con Zot no etiquetado es un fenómeno específico. La figura 3 ilustra los efectos de Zot sobre la proliferación de PBMC inducida humana por toxoide tetanus y PHA. Los datos demuestran que Zot marcadamente suprime la proliferación de toxoide tetanus inducido en una manera de dosis dependiente mientras que no afecte sobre la proliferación inducida de PHA. 5 La figura 4 ilustra los efectos de suero anti Zot o supresión Zot inducida de la proliferación de PBMC humano-inducido por toxoide tetanus. La adición de células anti I??t? . .. ,« -! . i Zí,ÍÍÍmi.:ií.i.. ...

Zot la supresión de Zot mediado de la proliferación de la toxina-inducida tetanus es más grande que el 50%. Las figuras 5A-5D ilustran el efecto de comprensión de Zot sobre dextrán-FITC por macrodevoradoras CD14+HLA-DR+ normales humanos. La figura 5A despieza la realización dextrán-FITC en un medio a 0°C (2.9%) y representa la dependencia de temperatura del consumo antígeno. La figura 5B despieza la realización dextrán-FITC en un medio a 37°C (46.0%) y representa un control para el consumo antígeno. La figura 5C despieza la realización dextrán-FITC en BSA a 37°C (39.0%) que representa un control negativo de consumo antígeno. La figura 5D despieza la realización dextrán-FITC en Zot a 37°C (19.3%). Los datos muestran que Zot disminuye el consumo de antígeno. La figura 6 ¡lustra el número de sitios/célula de enlace FITC-Zot en macrodevoradoras humanas y linfocitos. PBMC fue incubado con concentraciones que se incrementan de Zot-FITC y analizado por citometría de flujo. La intensidad del medio fluorecente de cada una de las poblaciones que siguió la incubación con Zot-FITC fue convertida a número de sitios/célula de enlace Zot que usa una curva estándar construida usando el equipo Quantum en 26 MESF. Estos datos muestran que el enlace Zot es un fenómeno saturable, con saturación que alcanza aproximadamente 0.5 pM y que el número promedio de sitios/células de enlace Zot es aproximadamente 10 veces más alto en macrodevoradoras (» 106,000) que en linfocitos (« 9,000). Las figuras 7A-7C ilustran la cinética del enlace Zot a macrodevoradoras humanas y linfocitos. La determinación de la cinética de enlace de Zot a células humanas fue llevada a cabo por citometría de flujo usando conjugados Zot-FITC. El etiquetado PBMC con anti-CD3-SD y anti CD-14-PE mAb fueron mantenidos a 27°C por la duración del experimento (12 minutos) mientras los datos fueron recolectados usando una muestra manual y viable (módulo cinético) adherido al citómetro de flujo. Los niveles de fluorescencia de Baselina FITC fueron recogidos durante 90-150 segundos (indicado por las fechas) y la adquisición de datos fue pausada durante « 10-15 segundos para inyectar Zot-FITC (figuras 7A y 7B). La figura 7C muestra las cinética de enlace de anti-CD14-FITC para monocitos/macrodevoradoras humanas no etiquetadas. Los datos son presentados como exhibidores esométricos de intensidad Zot-FITC (eje y) contra tiempo (eje x) contra número de células (eje z) para células puenteadas sobre CD3 (linfocitos) o CD14 (macrodevoradoras). Los resultados indican que el enlace Zot a macrodevoradoras humanas (figura 7A) y linfocitos (figura 7B) ocurren muy rápidamente alcanzando el equilibrio dentro de los dos minutos que siguen a la adición de Zot-FITC. La figura 8 ilustra el enlace de FITC-Zot a linfocitos B y T humanos. PBMC fue incubada con Zot-FITC y mAb para las moléculas presentes en T (CD3+) y B (CD19+) linfocitos y analizada por citometría de flujo. Un control isotópico FITC-etiquetado mAb (mlg) que corresponden a células puenteadas sobre la región de linfocitos dispersados laterales contra delanteros es también mostrado como un indicador de enlace no específico. Los resultados indican que los enlaces Zot para ambos linfocitos T y B. La figura 9 ilustra la incapacidad de antagonistas Zot para bloquear el enlace Zot-FITC. El PBMC coloreado con CD14-PE y CD3-SD fueron lavadas e incubadas por 15 minutos a 4°C en un solo medio AIM-V o con la adición de un exceso de 100 veces de FZI/o (SEQ ID NO: 7), FZI/1 (SEQ ID NO:8), BSA (control negativo) o exceso de 4 veces de Zot no etiquetado (control positivo). Las células fueron entonces incubadas con Zot-FITC y analizadas por citometría de flujo. Los resultados están expresados como supresión de porcentaje de la intensidad de fluorescencia del medio de las células incubadas con Zot-FITC en la presencia de antagonistas Zot, el Zot no etiquetado o BSA como está relacionado a la intensidad de fluorescencia del medio de las células incubadas en el medio único, (asignado un valor arbitrariamente de 100%). Los resultados muestran que la adición de uno u otro FZI/o o FZI/1 antagonistas Zot no bloquearon significativamente el enlace de Zot-FITC a CD14+ macrodevoradoras -____- ________________ ^¿__ puenteadas. En contraste, la pre-incubación con enlace bloqueado no etiquetado Zot de Zot-FITC por 24-43%. Las figuras 10A - 10B ilustran la supresión Zot de la expresión CD14 sobre macrodevoradoras/monocitos humanas. PBMC fue incubado por 18 horas en la ausencia o presencia de TT sin o con Zot purificado o BSA, teñido con CD14-FITC y analizado por citometría de flujo los resultados muestran como los histogramas de color simple de la fluorescencia CD14 sobre las células inducidas sobre la "región monocito", definidas* las características basadas en la dispersión delantera contra la dispersión lateral de las macrodevoradoras humanas. La adición de Zot causa una marcada supresión de la expresión de CD 14 en la ausencia de TT (figura 10A) o presencia de TT (figura 10B). La figura 11 ¡lustra los efectos de Zot sobre monocitos/macrodevoradoras humanos y la viabilidad de linfocito PBMC fueron incubadas por varios periodos de tiempo en la ausencia o presencia de Zot purificado o BSA. La viabilidad de células fue evaluada usando la prueba de exclusión iodada propidium y citometría de flujo. Los resultados se muestran como el porcentaje viable de células inducidas sobre la "región monocito" o "región linfocito" basada y definida sobre las características de dispersión delantera contra la dispersión lateral de estas poblaciones de células. Los resultados muestran que la adición de la viabilidad Zot que afecta macrodevoradoras a tiempos relativamente inmediatos, mientras los efectos sobre los linfocitos se hicieron aparentes hasta al menos cuatro días en el cultivo. Las figuras 12A - 12C ilustran la inducción de Zot mediada o la producción de citoquina por macrodevoradoras/monocitos humanas. PBMC fue incubada por seis hora por cuatro días en la ausencia o presencia de Zot purificado o BSA. Los superflotantes fueron recogidos a los tiempos indicados y los niveles de citoquina medidos por quimioluminiscencia ELISA. La adición de Zot resultó en la producción de altos niveles de TNF-a (figura 12A) y IL-10 (figura 12C) tan inmediato como seis horas, alcanzando los ^^ ¡^^^^^^^^ s^^ i^a^j^^^^ í^- niveles pico a las 24 horas. Una semana de inducción de !a producción IL-1ß fue también observada (figura 12B). Las figuras 13A-13B ilustran la inducción de Zot mediado de la producción de citoquina por linfocitos humanos. PBMC fue incubada durante tres días sin o con TT en la ausencia o presencia de Zot purificado o BSA y niveles de citoquina en ios superflotantes medidos por quimioluminiscencia ELISA. La adición del Zot resultado en la supresión de la producción IL-2 inducida por la incubación con TT, mientras los niveles no medibles de IL-2 fueron inducidos por Zot en la ausencia de TT (figura 13A). En contraste, la adición de Zot consistentemente indujo la producción de IFN-? en la ausencia de TT, niveles similares a los inducidos por TT, y marcadamente los niveles incrementados de !FN-? inducida por TT (figura 13B). D SCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Estudios previos se han enfocado sobre la capacidad de Zot y zonuiina para modular fisiológicamente ia unión hermética de las aberturas de los mamíferos (ociudencias o zonula) del epitelio de varios tejidos, tal modulación particularmente útil para facilitar la entrega de droga a través de esas membranas. En el curso de este estudio, los receptores para Zot y zonulina fueron identificados e aislados de células CaCo2, tejidos del corazón, intestinal y del cerebro. Además por el descubrimiento de los receptores Zot péptidos antagónicos de zonulina fueron identificados, dichos enlaces de péptidos antagónicos a los receptores Zot, que aún no funcionan para modular fisiológicamente la unión hermética de la abertura de los mamíferos (es decir, que falta la actividad biológica) los péptidos antagónicos competitivamente inhiben el enlace de Zot y zonulina para los receptores Zot, de ese modo inhiben la capacidad de Zot y zonulina para regular la unión hermética. t — Aá-yj. i a_k- at-. - -Í -.&J-.

A la luz de los efectos conocidos de Zot y zonulina en la vía paracelular fue realmente sorpresivo determinar un receptor para Zot sobre macrodevoradoras aisladas completamente diferenciadas de la sangre. Inicialmente fue poco claro por la circulación de células tales como macrodevoradoras que tendrían un receptor para una molécula asociada con modulación de tejido celular. Profundizando en la respuesta para esta pregunta fue descubierto que Zot y zonulina tienen la capacidad para regular fisiológicamente la actividad de macrodevoradoras. Sin embargo sin desear que se enlace con la teoría parece que Zot es el que bloquea los receptores sobre la macrodevoradoraa el enlace a las macrodevoradoras de receptores de superficie en una manera saturable y específica. Por el enlace a macrodevoradoras, Zot altera la capacidad de los macrodevoradoras para procesar y presentar un antígeno a los linfocitos, últimamente la supresión de la proliferación de los linfocitos en respuesta a! antígeno en una dosis dependiente en una manera antígeno-específico. En otras palabras, Zot permite ¡a bajo regulación de antígeno específico de una respuesta inmune. Los resultados descritos abajo en detalle además sugieren que ésta bajo-regulación de la respuesta inmune está a! menos en parte asociada con la disminución en el consumo del antígeno. Ello parece que Zot es una proteína multi-funcional, que controla la respuesta inmune por un mecanismo dual de regulación del consumo y el tráfico de antígenos. La toxina zonula ocludente o "Zot" es producida por V. cholerae. La especie particular de V cholerae de la cual se deriva Zot no es crítica a la presente invención. Ejemplos de tales especies de V. cholerae incluyen la especie 569B, 395 y E7946 (Levine et al, suprea; Johnson et al, supra; y Karasawa et al, supra). Como se usa adjunto, "Zot" se refiere a la proteína madura de 399 aminoácidos, también como mutantes de ellas las cuales retienen la capacidad para regular tj. Por ejemplo, una supresión N-terminal de aminoácidos de 1-8 puede ser hecha sin efectuar la actividad Zot, y proteínas de fusión N-terminal de Zot pueden ser hechas &a^ >« ~^ -£a-a~~-.- .,J - Jtt~~y- ~y,»y».y. y , . y m i-i *ZÍ »ft.__i. *- . ^i«i__.«i.y sin efectuar la actividad Zot. Tales mutantes pueden ser fácilmente preparadas por mutagenesis de sitio dirigido y emitidas por la actividad Zot como es descrito adjunto. Zot se puede obtener y purificar, es decir, por ingeniería genética de especies de E Coli sobre-expuestas al gen Zot (Baudry et al, Infect. Inmun., 60:428-434 (1992)), sola o fusionada a otros genes tales como proteínas de enlace maltosa (ver el ejemplo 1 abajo), glutatión-S-transferasa (ver ejemplo 2 abajo), o 6 poli-histidina (ver ejemplo 2 abajo). Como se usa adjunto el término "zonulina" se refiere a una proteína substancialmente pura biológicamente activa que tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 47 kDa, como es determinado por electroforesis del gel SDS-poüacplamida, y la siguiente secuencia de aminoácidos N-terminal: Asn Asp Gln Pro Pro Pro Ala Gly Val Thr Ala Tyr Asp Tyr Leu Val lie Gln (SEQ ID NO: 1 ), de las siguientes secuencias de aminoácidos N-terminal: Glú Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Xaa Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu (SEQ ID NO: 2) también como mutantes de ellas las cuales retienen la capacidad de enlace de los receptores para Zot y para regular ij. La zonulina es producida por, o se encuentra en, varios tejidos y células de mamíferos, es decir, tejidos o células de conejo o de humano. El tipo particular de tejidos o células de mamífero de las cuales la zonulina se deriva no es crítica para la presente invención. Ejemplos de tales tipos de tejidos de mamífero los incluye el corazón, pulmón, intestino, hígado, cerebro, riñon, y páncreas. La zonulina se puede obtener y purificar, es decir, por la afinidad de purificación cromatográfica que usa anticuerpos anti-ZOT, como se describe en el ejemplo 3 de la patente U.S. 5,945,510, incorporada como referencia adjunto. Como se usa adjunto, el termino "inmunoregulador zot relacionado" o "molécula que regula zot relacionado" se refiere a Zot o zonulina como se define arriba.

Por consiguienle, como se usa adjunto, el término "inhibición" (y "inhibir" y "inhibiendo") se refieren a la bajo regulación de algún aspecto de ía actividad APC que resulta en una reducción substancial de la proliferación de linfocito. Ejemplo de actividades incluyen el consumo antígeno, procesamiento antígeno, y presentación antígeno. El término "inhibición" como se usa adjunto no necesariamente implica una completa supresión de la función o resultado. Algo de, la inhibición parcial es contemplada por el término. Para proporcionar un tratamiento para un huésped animal afligido con un desorden o deceso relacionado autoinmune o inmune tal como una esclerosis múltiple, artritis reumatoide, diabetes mellitus dependiente de insulina, deceso celiaco, síndrome Sjogren, eritematosus lupus sistémico, tiroiditis autoinmune, idiopática trombositopénica púrpura, anemia hemolítica, deceso Grave, deceso de adición, orquitis autoinmune, anemia perniciosa, vasculitis, cuagulopatia autoinmune, miastenia gravis, polineuritis, pemfibus, carditis reumática, polimiositis, dermatomiositis, y escleroderma, un inmuno regulador Zot relacionado es administrado solo o en combinación con un antígeno específico autoinmune relacionado. Ejemplos de antígenos específicos autoinmunes asociados con desórdenes o decesos autoinmunes son proteína básica mieiina y gliadina (antígeno asociado con deceso celiaco). Para proporcionar un tratamiento para un huésped animal afligido con subsecuente rechazo inmune a los tejidos u órganos de trasplante, un inmunoregulador Zot asociado es administrado solo o en combinación con un antígeno específico de trasplante. El trasplante de antígenos se puede obtener ensayando la HLA o el trasplante de tejidos u órganos. Para proporcionar un tratamiento para un huésped animal afligido con un deceso inflamatorio o alérgico o desorden tal como asma, psoriasis, dermatitis eczematosa, zarcoma Kaposi, esclerosis múltiple, deceso inflamatorio del intestino, desórdenes proliferativos de las células de músculos blandos, y condiciones inflamatorias asociadas con infecciones lincóticas, viral, parasítica, o bacterial, un inmunoregulador Zot relacionado es administrado solo o en combinación con un alergénico o antigénico relacionado específico inflamatorio. Ejemplos de antígenos relacionados inflamatorios específicos asociados con decesos alérgicos o inflamatorios o desórdenes que tienen polens y polvos (asociados con asma), las proteínas encontradas en la leche de la vaca o fragmentos de ellas (asociadas con dermatitis eczematosus), proteína a base mieiina (asociada con esclerosis múltiple) y vacuna de antígenos para el virus particular, del parásito o bacteria asociado con la condición inflamatoria. La presente invención permite para la bajo regulación del antígeno específico de la respuesta inmune. Como se discutió arriba, una modalidad de la presente invención involucra ia administración de una cantidad efectiva de un inmunoregulador Zot relacionado (Zot o zonulina) solo o en combinación con un antígeno específico, la respuesta linfocito a dicho antígeno es específicamente suprimida en una manera dosis dependiente. Es claro de los resultados de los detalles ios cuales son presentados adjunto que la presente invención está limitada para aquellos antígenos procesados y presentados oor e> antígeno que presenta células (APC) aquellos que requieren mediación de macrodevoradoraa. La invención se relaciona a todas las APCs que incluyen macrodevoradoras y oíros fagocitos mononucleares, células dendríticas, linfocitos B, células Langerhans y células endoteliales humanas. En una modalidad preferida, la APC es una macrodevoradoraa. La presente invención se puede utilizar en ambos ambientes in vivo o in vitro. Lo crítico es solamente la adminisíración a células animales, dichas células una u otra en un huésped vivo o en un cultivo de célula Las células animales están definidas como nucleadas, no-cloroplásticas que contienen células derivadas de organismos multicelulares en el presente cuya posición taxonómica se encuentra deniro del reino animal, un primer cullivo de células, expande el cullivo o una línea de células transformada. 1gi_ __iÍ__?gfa_ata_J_á? El recipiente huésped animal empleado en la presente invención no es crítico a ello e incluye células preseníes en o una forma derivada de todos los organismos dentro del reino animal. En una modalidad preferida, el animal está deniro de la familia de los mamíferos. El animal preferido y células animales son células de mamífero, tales como humanas, bovinas, ovinas, porcinas, de venado y primates. El animal más preferido o células animales son humanas o células humanas. El modo particular y método de administración no es crítico para la presente invención. Lo crítico es solamente que ambas las Zot relacionadas que inmunoregulan moléculas y el antígeno alcanza a la macrodevoradora intacía. En el 0 conlexío de la présenle invención, las moléculas que inmunoregulan Zot relacionadas pueden ser co-administradas con el antígeno. Alternativamente, a manera de simplicidad, la discusión del modo de administración y preparación farmacéutica de abajo está dirigida a la administración y preparación de antígeno. Sin embargo, es claro que los mismos modos se aplican a la administración de .moléculas que inmunoregulan Zot relacionado. Por consiguiente, aunque la- discusión está limitada a la administración de un antígeno simple, es claro que más de un antígeno puede ser administrado, la respuesta inmune a más de un enlace antígeno subsecuentemente y simultáneamente bajo regulado. La administración exitosa requiere la entrega para un ambiente rico en APC. Las rutas preferidas de administración incluyen aquellas de los sitios objetivo del sistema inmune, tal como la mucosa o los tejidos linfa. De esta manera, las rutas de administración preferidas son intranasal, intraocular, intrainteetina!, e intravaginal. Esto no excluye la administración parenteral, tal como intradermal, intramuscular, subcutánea e intravenosa, pueden ser rutas efectivas de administración de Zot o zonulina, sola o en combinación con los antígenos preferidos. Dependiendo de la ruta particular de administración, la forma de dosis puede ser sólida, semisólida, o preparación líquida. La forma de dosis puede incluir *^ ^ J ?-'---.. -^-. ' --..- -—.-. . y. . ...... -.*j?- .- s *áa**M ..... , z.., a~ . aquellos aditivos, lubricantes,- estabilizadores, neutralizadores, capas o baños, y ecipientes como es estándar en la técnica de formulaciones farmacéuticas. Considerando el modo de administración, el antígeno puede ser administrado como composiciones de dosis oral para pequeña entrega intestinal. Tales composiciones de dosis oral para pequeña entrega intestinal son bien conocidas en la técnica, y generalmente comprenden tabletas o cápsulas gastroresistentes (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Eds. Osol, Mack Publishing Co., Chapter 89 (1980); digenis et al, J. Pharm. Sci., 83:915-921 (1994); Vantini et al, Clínica Terapéutica, 145:445-451 (1993); Yoshitomi et al, Chem. Pharm. Bull., 40:1902-1905 (1992); Thoma et al, Pharmazie, 46:331-336 (1991); Morishita et al, Drug Design and Delivery, 7:309-319 (1991 ); y Lin et al, Pharmaceutical Res., 8:919-924 (1991)); cada uno de las cuales es incorporada como referencia adjunto en su totalidad. Las tabletas son hechas gastroresistentes por ia adición de, es decir, por cualquiera de las dos celulosa acetato ftalato o celulosa acetato tereftalato. Las cápsulas tienen forma de dosis sólida en ías cuales el antígeno está encerrado en ambas en una cascara o contenedor soluble duro o suave de gelatina. La gelatina usada en la fabricación de cápsulas se obtiene de material colagenoso por hidrólisis. Hay dos tipos de gelatina. Tipo A, derivado de pieles de puerco por proceso ácido, y tipo B, obtenido de piel y huesos de animales por el proceso alcalino el uso de cápsulas de gelatinas duras permite una selección que prescribe un antígeno simple o una combinación de ello al nivel de dosis exacto que es el mejor considerado para el sujeto individual. La cápsula de gelatina dura consisten de dos secciones, una que resbala sobre la otra, y entonces rodea completamente el antígeno solo o en combinación con la molécula que inmunoregula. Estas cápsulas son rellenadas por la introducción del antígeno, o cuentas gastroresistentes que contienen el antígeno, dentro del extremo más largo de la cápsula, y entonces resbala sobre el capuchón. Las cápsulas de gelatina dura son hechas en su mayor parte de gelatina, FD&C colorantes, y algunas veces un agente que opaca, tal como el dióxido de titanio. El USP permite a la gelatina para estos propósitos contener 0.15% (W/V) dióxido de azufre para prevenir la descomposición durante la fabricación. En el contexto de la presente invención, las composiciones de dosis oral para una pequeña entrega intestinal también incluyen composiciones líquidas las cuales contiene agentes acuosos que neutralizan y que previenen al antígeno de ser desactivado significativamente por los fluidos gástricos en el estómago, de ese modo permite al antígeno alcanzar el intestino delgado en una forma activa. Ejemplos de tales agentes acuosos neutralizadores los cuales pueden ser empleados en la presente invención incluyen neutralizador bicarbonato (pH 5.5 a 8.7 preferiblemente aproximadamente pH 7.4). Cuando la composición de dosis oral es una composición líquida, es preferible que la composición sea preparada justo antes de ¡a administración tal como para minimizar problemas de estabilidad. En este caso, la composición líquida puede ser preparada por un disolvente liofilizado péptido antagónico en el agente neutralizador acuoso. De manera parecida, otros vehículos de entrega de dosis son contemplados por la presente invención que incluyen pero no limitados a liposomas, caracoles del oído, polímeros solubles en agua y microesferas. La composición de dosis puede además incluir adyuvantes tal como lípido monofosforil A, QS-21, ISCOMs, y citoquinas. El antígeno puede ser administrado como composiciones de dosis intravenosa para la entrega a los elementos cistémicos del sistema inmune. Tales composiciones son bien conocidas en la técnica y las composiciones generalmente comprenden un diluyente fisiológico, es decir, agua destilada, o 0.9% de NaCI (w/v). De ií-á manera parecida, la admjn¡strf .ión puede ser parenteral, intradermal, intramuscular, o subcutánea como se menciona arriba. Las formas de dosis para tal administración podrían claramente incluir la forma farmacéuticamente aceptable, que incluye neutralizadores fisiológicos, diluyentes o lo similar. Como se usa adjunto, una cantidad efectiva de inmunoregulador Zot relacionado tal como Zot o zonulina, se refiere a una cantidad efectiva de la actividad bajo regulada de dicha célula que presenta antígeno, de ese modo es efectiva para bajo regular la proliferación linfocito de célula mediada que presenta antígeno. La cantidad específica de antígeno y molécula inmunoregulador que emplea Zot relacionado no es crítica para la presente invención y variara dependiendo sobre el deceso o condición que está siendo tratada, tal como la edad, peso y sexo del sujeto que está siendo tratado. Generalmente, para lograr tal concentración final en, es decir, los intestinos o sangre, la cantidad de moléculas ¡nmunoreguladores Zot relacionado en una composición de dosis oral simple de la presente invención generalmente estará en aproximadamente 0.1 microgramos a aproximadamente 100 microgramos, preferiblemente aproximadamente 2 microgramos a aproximadamente 60 microgramos, más preferiblemente aproximadamente 20 microgramos a aproximadamente 50 microgramos. De esta manera, la cantidad de antígeno en una composición de dosis oral simple de la presente invención estará generalmente en el intervalo de aproximadamente 0.01 microgramos a aproximadamente 1000 microgramos, más preferiblemente aproximadamente 0.1 microgramos a aproximadamente 100 microgramos. Obviamente, la dosis exacta del antígeno variará con el deceso o desorden que está siendo tratado, los intervalos preferidos que son fácilmente determinables a través de la rutina de experimentación y procedimiento de optimización.

Los siguientes ejemplos son proporcionados solamente para propósitos ilustrativos, y están en una manera que no intenta limitar el alcance de la presente invención. EJEMPLO 1 Enlace de Zot etiquetado-FITC a Linfocitos y Macrodevoradoras. A. Materiales y Métodos- Aislamiento de células (PBMC) mononucleares de sangre periferial humana. Las PBMC fueron aisladas por centrifugación del gradiente de densidad sobre el medio de separación linfocito (LSM, Organon-Teknika, Durha, NC) de voluntarios saludables. Los donadores fueron adultos y dieron una información concensada para los bosquejos de sangre. Las PBMC usadas fueron frescas o fueron licuadas y congeladas en un RPMI que contiene 10% (v/v) FCS y 10%(v/v) DMSO que usa un aparato congelador de proporción lineal controlada (1 °C por minuto, Planner Biomed, Saüsbury, England) para preservar ia viabilidad de ias células y maximizar la recuperación celular.

Las células fueron almacenadas en nitrógeno líquido hasta que se usaron. En algunos experimentos, las células fueron usadas inmediatamente después de ser aisladas. Preparación de ZOT-MBP Purificado. 5,000 ml de la fracción superflotante obtenida después del cultivo de la especie V. cholerae CVD110 (Michalski et al, ínfect. Inmun., G1 :4462-4468 (1993)), la cual ha sido transformada con plasmida pZ14, fue concentrada 1000 veces usando un filtro de flujo laminar con un límite MW de 10 kDa. La construcción de pZ14 la cual contiene el gen Vibrio cholerae Zot, está descrito en detalle en, inter alia, WO 96/37196. Las superflotantes que resultan fueron entonces sometidas a 8.0% (w/v) SDS-PAGE. Las bandas de proteína fueron detectadas por coloreado azul Coomassie de el gel SDS-PAGE. Ninguna banda de proteína que corresponde a Zot fue detectable cuando se comparó con el control superflotante de la especie CVD110 transformada con plasmida pTTQ181 (Amersham, Arlington Heights, IL), y tratada en la misma manera. Por consiguiente, aunque aun el gen Zot colocado atrás del promotor tac resistente y altamente inducible en pZ14, el nivel de proteína en la superflotante pZ14 concentrada mil veces fue no detectable aún por el gel coloreado Coomassie SDS-PAGE. Entonces, para incrementar la cantidad de Zot producido, el gen Zot fue fusionado en el marco con el gen de proteína de enlace maltosa (en lo sucesivo "MBP") para crear una proteína de fusión MBP-ZOT. El vector MBP pMAL-c2 (Biolab) fue usado para expresar y purificar Zot por fusión del gen Zot para el gen malE de E.Coli. Esta construcción usa la resistencia, del promotor tac inductible, y las señales de iniciación de traslación malE para dar un alto nivel de expresión al gen Zot clonado. El vector pMAL-c2 tiene una exacta supresión de la secuencia de señal malE, la cual conduce a la expresión citroplásmisca de la proteína de fusión. La purificación por afinidad cromatográfica para MBP se usó para facilitar e! aislado de la proteína de fusión (Biolab). Más específicamente, el vector pMAL-c2 fue iinealizado con EcoRI (que corta al extremo 3' de el gen malE), relleno con el fragmento Klenow, y digerido con XbaE (que tiene un sitio simple en el polienlazador pMAL-c2). El Zot que codifica orf fue subclonado de la plasmida pBB241 (Baudry et al, Infecí. Inmun., 60:428-424 (1992)). La plasmida pBB241 fue digerida con BssHIl, y llenada con el fragmento Klenow, y digerida con Xbal. Entonces, el fragmento desafilado-Xbal fue subclonado deníro de pMAL-c2 para dar a la plasmida pLC10-c. Eníonces ambos el incerto, y el vecíor íenían exiremos punliagudos y desafilados, la orientación correcta se obtuvo con el extremo 3' de malE fundida con el término 5' del incerto. pLC10-c fue entonces electroporateada dentro de la especie E.Coli DH5a. En pBB241 , es el silio de resíricción BssHIl esíá deniro de Zol orf. Entonces, los aminoácidos 1-8 de Zot faltan en la proteína de fusión MBP-ZOT.

Eslo para purificar la proteína de fusión MBP-ZOT, 10 ml de Luria Bertani ambos contienen 0.2% (w/v) de glucosa y 100µg/ml de ampicilina fue inoculada con una colonia simple que contiene pLC10-c, e incubada toda la noche a 37°C con agitación. El cultivo fue diluido en una proporción 1 :100 en 1.0 ml de el mismo medio fresco, y crecido a 37°C mientras se agita, para aproximadamente 1.0 x 108 células/ml. 0.2 mM de IPTG fueron entonces agregadas para inducir la expresión MBP-ZOT, y el cultivo fue incubado a 37°C por tres horas adicionales. La bacteria fue entonces hecha pildora y resuspendida en 20 ml de hielo frío "columna neutralizadora" que comprende 20 mM Trís-HCL, 0.2 M de NaCI, 1.0 mM EDTA, 10 mM 2-ME, 1.0 mM NaN3. La suspensión balerial fue analizada por el tratamiento de prensa francesa y girada por 30 minutos a 13,000 x g a 4°C. La superflolanle fue recogida, y diluida de 1:5 con un neutralizador de columna y un cargador dentro de la columna 1 x 10 de resina amilosa (Biolab sistema de purificación por fusión -MBP), preequílibrado con una columna neutralizadora. Después de lavar la columna con cinco volúmenes de la columna neuíralizadora, la proleína de fusión MBP-ZOT fue exlraida por la carga de 10 ml de 10 mM de maltosa en la columna neutralizadora. La producción típica de 1.0 ml de cultivo fue de 2-3 miligramos de proíeína. El compañero de fusión MBP de la proíeína de fusión purificada MBP-ZOT fue entonces dividido por el uso de un microgramo de proteasa factor Xa (Biolabs) por 20 microgramos de MBP-ZOT. El factor proíeasa Xa divide justo antes del término amino de Zol. La proteína Zot así obtenida fue corrida sobre un gel SDS-PAGE a 8.0% (w/v), y electroextraido del gel usando una cámara de electroseparación (Schleicher & Schuell, Keene, NH). Cuando se probó usando las cámaras el Zot purificado que resultó como un decrecimiento de dosis dependiente de Rt, con un ED50 de 7.5 x 10~8 M. Conjugación de ZOT-MBP para fluorescencia isocianato (Zot-FITC) La conjugación de ZOT-MBP a FITC fue llevada a cabo siguiendo técnicas estándar. Brevemente, ZOT-MBP fue dializada contra 500 ml de neutralizado que etiqueta fej t FITC que comprende 0.1 M de neutrálizador de bicarbonato (es decir, 0.09 M NaHCO3 + 0.0085 M de Na2CO3), ajustado a un pH 9.0 con NaOH concentrado y almacenado a 4°C, a 4°C por 8 horas para elevar el pH a 9.0. Diez µl de 5.0 mg/ml de FITC en DMSO por cada miligramo de MBP-ZOT fue entonces agregado, seguido por una incubación por toda la noche en PBS a 4°C. El FITC no asegurado fue entonces removido por diálisis en 500 ml de diálisis neutralizadora que comprende PBS (pH 7.4), almacenado a 4°C, a 4°C con dos o tres cambios durante dos días. Esta preparación fue almacenada a 4°C hasta que se usó. Enlace de FITC-ZOT para PBMC Humano v Análisis Citométrico de Flujo PBMC aislado como se describe arriba fue incubado con concentraciones que se incrementan de Zot-FITC por 60 minutos a 37°C en tubos siliconizados (para excluir ei enlace de macrodevoradoras a las paredes del tubo de prueba) ^n la presencia de anticuerpos monoclonales para conjugados CD14 para ficoeritri a (PE) y para CD3 conjugado para ECD (energía de secado acoplada, a un conjugado rojo-texas-PE). El CD14 es un marcador de macrodevoradoras monocitos humanos, mientras que CD3 es un marcador de iinfocitos T. El uso de estos fluorocromos (es decir, FITC, PE y ECD) permitieron el estudio simultáneo de enlace de Zot a macrodevoradoras monocitos y linfocitos T en una mezcla de poblaciones PBMC por citometría de flujo tricolor, Las células entonces fueron lavadas dos veces con PBS (pH 7.2) que contiene 1% (w/v) de BSA y 0.1% (w/v) de NaAzide, y analizado inmediatamente por citometría de flujo usando un sistema clasificador célula-citometro Epics Élite. En estos experimentos, el fluorocromo etiquetado mAbs de los mismos isotipos, pero especificidad irrelevante fue usado como un control. Plaquetas., eritrocitos y restos de células fueron excluidos del análisis para establecer un puente apropiado sobre los parámetros ligeros de dispersión de avance contra el 90%. Los datos fueron recogidos para cada muestra sobre 10,000 células. El análisis de los datos fue llevado a cabo usando el paquete de análisis Epics Élite (Coulter) o el paquete de análisis lista-moda o WinList (Verity Software House, Topsham, ME). B. Resultados Un experimento representativo muestra el análisis citométrico de flujo del enlace Zot-FITC para linfocitos T humanos (CD3+) y monocito macrodevoradoras ( CD14+) como se mueslra en la figura 1. Los resultados muestran que el enlace de Zot-FITC, como es evidenciado por los niveles de intensidad de fluorescencia media, es varias veces más alto en monocitos macrodevoradoras que en linfocitos T. Por consiguiente, la adición de cantidades que incrementan los resultados Zot-FITC en un enlace incrementado que inicia a nivel 0 después de la adición de 40-60 microlitros de Zot-FITC. Estos resultados indican que Zot preferencialmente enlaza a monocito microdevoradora humana. En seguida, el enlace de Zot-FITC para macrodevoradoras monocito humanas y linfocitos en la presencia de Zot no etiquetado fue probado, para determinar si el Zot no etiquetado podría bloquear enlaces. Como se muestra en la figura 2, la preincubación de PBMC por 30 minutos a 37°C con 100 microlitros de Zot no identificado, seguido por la adición de Zot-FITC (10 microlitros) por 30 minutos a 37°C, decreció por « 33% del enlace de Zot-FITC a ambos, monocitos macrodevoradoras y linfocitos T, que sugieren que los enlaces Zot para esas células son receptores mediados. La preincubación de células con 100 microlitros de MBP purificado, seguido por la adición de Zot-FITC (10 microlitros) por 30 minutos a 37°C, no tuvo efecto en el bloqueo de enlace Zot-FITC, que indica que el bloqueo con Zot no etiquetado es un fenómeno específico. EJEMPLO 2 Respuestas proliferativas a mitóqenos y antíqenos por células mononucleares humanas. A. Materiales y Métodos. .t. t--ti . <-!--.,-», . ~ , ut Hiinii- - f * ,?. ¡m,*h?**íM„ "•>»* * *»<* E?I aislamiento de células mononucleares de sangre periferial humana (PBMC) de voluntarios saludables. Las PBMC fueron aisladas por centrifugación del gradiente de densidad sobre un medio de separación linfocito (LSM Organon-Teknika, Durham, NC) de voluntarios saludables. De acuerdo con la revisión institucional de la junta directiva de la Universidad de Maryland, Baltimore, los donadores adultos se les dio información y bajo pleno consentimiento para los esquemas de sangre. Las PBMC usadas fueron renovadas o fueron alicuotadas y congeladas en RPMI que conteniene 10% (v/v) FCS y 10% (v/v) DMSO que usa una proporción lineal controlada de aparatos congeladores (1 °C por minuto, Planner Biomed, Salisbury, England) para preservar la viabilidad de las células y maximizar la recuperación de células. Las células fueron almacenadas en nitrógeno iíquido hasta que se usaron. En algunos experimentos las células fueron usadas inmediatamente después de ser aisladas. Preparación de Zot purificado. El gen Zot fue amplificado oor PCR con polimeraza de abertura profunda (New England Biolabs), que usa plasmida pBB241 (Baudry et al, supra) el ADN como una plantilla. Los primers de adelanto y retroceso fueron: 5'-CGGGATCCCGTATGAGTATCTTT-3' (SEQ ID NO:3); y 5'- CCCAAGCTTGGGTCAAAATATACT-3' (SEQ ID NO:4), respectivamente. Las colas 5' de estos oligonucleótidos contienen un BamHI y un Hindlll sitio de restricción, respectivamente. El aplicón resultante (1.2 kb) fue analizado por 8.0% (w/v) electrofóresis gel agarosa, y purificado de sales y libre de nucleótidos que usan una columna de giro extrema (Pierce). Las dos encimas de restricción arríba anotadas se usaron entonces para digerir el aplicón purificado y el aplicón digerido resultante fue entonces insertado en el vector pQE30 (Quiagen), el cual ha sido previamente digerido con BamHI y Hindlll, como para obtener plasmida pSU113. La pQE30 es un vector de expresión que proporciona un nivel alto de expresión de una proteína recombinante con un código 6 polihistidina (6xHis). El producto de expresión de plásmida pSU113 es de lo anterior una proteína de fusión 6xHis-Zot. La pSU113 fue entonces transformada dentro de una DH5a E. Coli. Para purificar la proteína de fusión 6xHís-Zot, la E.Coli transformada que resulta fue cultivada toda la noche a 37°C en 150 ml de caldo Luria Bertani que contiene 2.0% (w/v) de glucosa, 25 µg/ml de canamicina y 200 µg/ml de ampicilina hasta que el Aeoo fue aproximadamente de 1 :10 . Enseguida, 75 ml de los cultivos de toda la noche se agregaron a 1000 ml de caldo Luria Bertani que contiene 2.0% (w/v) de glucosa, 25 µg/ml de canamisina y 200 µg/ml de ampicilina, incubadas por aproximadamente 3 horas a 37°C, con agitamiento vigoroso hasta que el A^o fue de aproximadamente 0.7-0.9. Entonces, IPTG fue agregado a una concentración final de 2.0 mM, y el cultivo se le permitió continuar por cinco horas a 37°C. Enseguida, las células fueron cosechadas por centrifugación a 4000 x g por 20 minutos, las células resuspendidas en 5.0 ml/g de peso húmedo de neutralizador A que comprende 6.0 M GuHCL, 0.1 M de fosfato de sodio, y 0.01 M Tris-HCl (pH 8.0) y removido por una hora a la temperatura ambiente. Entonces, la mezcla fue centrifugada a 10,000 x g por treinta minutos a 4°C y para el superflotante que resulta fue agregado 4.0-5.0 ml/g de peso húmedo de un 50% de lodo de resina superfluida (QIAGEN), el removido fue llevado a cabo por una hora a temperatura ambiente. La resina resultante fue cargada dentro de una columna a 1.6 por 8.0, la cual fue lavada entonces secuencialmente con neutralizador A, neutralizador B que comprende 8.0 M de urea, 0.1 M de fosfato de sodio, y 0.01 M de Tris-HCl (pH 6.3). Cada lavado fue llevado a cabo hasta que la A^o del flujo terminal fue menor que 0.01. La proteína de fusión 6xHis-Zot fue extraída de la columna usando 20 ml de neutralizador C que contiene 250 mM imidazol. Entonces, las fracciones que contiene la proteína de fusión con la 6xHis-zot fueron verificadas por SDS-PAGE usando el procedimiento descrito por Davis -Ann, N.Y. Acacl. Sci., 121 :404-1964, y el gel coloreado con azul Comassie. Las fracciones que contiene proteína de fusión 6xHis-Zot fueron dialízadas contra 8.0 M de urea, combinada, y entonces diluida 100 veces en PBS. En seguida, 4.0 ml de un 50% de lodo de resina suprefluida fueron agregados, el removido fue llevado a cabo durante 2 horas a la temperatura ambiente, y la resina resultante cargada dentro de una columna de 1.6 x 8.0, la cual fue entonces lavada con 50 ml de PBS La proteína de fusión 6xHis-Zot fue extraída de la columna con 10 ml de PBS conteniendo 250 mM imidazol. El extraído resultante fue dializado contra PBS, y la proteían de fusión 6xHís-Zot fue verificada por SDS-PAGE, como se describe arriba. Preparación y Purificación de Antisuero Anti-Zot de Conejo Para obtener antisuero específico, una proteína quimérica giutathione S-transferasa (GST) - Zot fue expresada y purificada. Más específicamente primers oligonucleotidos fueron usados para ampiificar la Zot orf por una cadena de reacción polimerasa (PCR) que usa plásmida Pbb241 (Baudry et al, supra) como una plantilla ADN. El primer delantero (TCATCACGGC GCGCCAGG, SEQ ID NO:5) corresponden a nucleotidos 15-32 de Zot orf, y el primer inverso (GGAGGTCTAG AATCTGCCCG AT, SEQ ID N0 6) correspondió al extremo 5' de ctxA orf. De lo anterior, los aminoácidos 1-5 de Zot están faltando en la proteína de fusión resultanle. El producto de amplificación fue insertado dentro del políenlazador (sitio Smal) localizado en el extremo del gen GST en pGEX-2T (Farmacia Milwaukee, Wl). La pGEX-2T es un vector de expresión de proteína de fusión que expresa un gen clonado como una proteína de fusión con GST de Schistosoma Japonicum. El gen de fusión está bajo el control del promotor tac. Tras la inducción IPTG, ocurre la desrepresión y la proteína de fusión GST es expresada.

La plásmida recombinante resultante, llamada pLC11 , fue electroprorateada en DH5a E.Coli. Para purificar la proteína de fusión GST-Zot, 10 ml de caldo de Luria Bertani que contienen 100 µg/ml de ampicílina fueron inoculados con una única colonia que contiene pLC11 , e incubada toda la noche a 37°C con sacudimiento. El 5 cultivo fue diluido a la proporción 1 :100 en 1.0 ml del mismo medio fresco y cultivada a 37°C mientras se sacude, para aproximadamente 1.0 x 108 células/ml. 0.2 mM IPTG fueron entonces agregadas para inducir la expresión GST-Zot, y el cultivo fue incubado a 37°C por tres horas adicionales. La bacteria fue entonces hecha pildora, resuspendida en 20 ml de hielo frío PBS (pH 7.4) y analizada por el método de prensa francesa. La ?o proteína de fusión GST-Zot no fue soluble bajo estas condiciones y sedimenta con la fracción de pildora baterial. Por consiguiente la pildora fue resuspendida en un neutralizador analizador Laemli que comprende 0.00625 M Tris-HCL (pH 6.8), 0.2 M 2- ME, 2.0% (w/v) SDS, 0.025% (w/v) bromofenol azul y 10% (v/v) de glicerol, y sujeta a electroforesis sobre un gel PAGE-SDS 8.0% (w/v), y coloreado con azul brillante 15 Coomassie. Una banda de aproximadamente 70 kDa (26 kDa de GST + 44 kDa de Zot), que corresponden a la proteína de fusión fue electroextraída del gel usando una cámara de electroseparación (Schleicher & Schuell, Keene, NH). 10 µg de la proteína extraída resultante (10-20 µg) fue inyectada dentro de un conejo mezclada con un volumen igual de adyuvante completo Freund. Dos dosis de 20 inyección de refuerzo fueron administradas con un adyuvante incompleto Freund cuatro y ocho semanas después. Un mes después el conejo fue sangrado. Para determinar la producción de anticuerpos específicos, 10"10 M de Zot, con las dos proteínas de fusión de adelante MBP-ZOT y GST-ZOT, fue transferida sobre una membrana de nailon e incubada con un antisuero de conejo de dilusión 1 :5000 toda 25 la noche a 4°C con un sacudimiento moderado. El filtro fue entonces lavado 15 minutos «a-áShfe» - - ' - . .-..; .« _ , --Í-— J,:,.. .- _>_J' I llM_Í_É-- 1 ll hj_- . ,. y, ?~-.. , li-fe-ljlj..... , . , -, .-: .¿. por cuatro veces con PBS que contiene 0.05% (v/v) Tween 20 (en lo sucesivo "PBS-T"), e incubado con una dilusión de 1 :30,000 de un conjugado de cabra IgG anticonejo para el rábano de caballo peroxidasa por 2 horas a la temperatura ambiente. El filtro fue lavado otra vez por 15 minutos cuatro veces, PBS que contiene 0.1% (v/v/) Tween, y las bandas inmunoreactivas fueron detectadas usando quimioluminicencia mejorada (Amerxsham). Sobre el inmuno-ocultado, se encontró el antisuero de conejo para reconocer Zot, también como las proteínas de fusión MBS-ZOT y GST-ZOT, pero no el control negativo de MBP. Además, para confirmar la producción de anticuerpos apropiados anti-zot, los experimentos de neutralización fueron conducidos en cámaras de uso. Cuando el superflotante preincubado con pZ14 a 37°C por 60 minutos, el antisuero Zot específico (1 :100 en dilusión), fue posible completamente neutralizar la disminución en Rt inducida por Zot montado sobre el ileón del conejo en cámaras de uso. En seguida, los anticuerpos antizot de afinidad purificada que usan una columna de afinidad MBP-ZOT. Más específicamente, una columna de afinidad MPB-ZOT fue preparado por la inmovilización, toda la noche a la temperatura ambiente, 1.0 mg de MBP-ZOT purificado, se obtuvo como se describe en el ejemplo uno de arriba, para un gel preactivado (Aminolink, Pierce). La columna fue lavada con PBS, y entonces cargada con 2.0 ml de antisuero de conejo ant- Zot. Después una incubación de 90 minutos a temperatura ambiente, la columna fue lavada con 14 ml de PBS, y el anticuerpo específico anti-zot fue extraído de la columna con 4.0 ml de una solución que comprende 50 mM de glicina (pH2.5), 150 mM de NaCI, y 0.1% (v/v) de Tritón X-100. El pH de un mililitro de la fracción extraída fue neutralizado inmediatamente con 1.0 N NaOH. Condiciones de Cultivo y Ensayos de Linfoproliferación Las PBMC (1.5 x 106 células/ml) fueron cultivadas en un mililitro de un medio completo, (cRPMI) que comprende RPMI 1640 que contiene 10% (v/v) de suero de becerro fetal y 50 µg/ml de gentamicina. Las células fueron incubadas a 37°C, 5% de C02 en placas de 96 pozos en la ausencia o presencia de fitohemaglutinina (PHA, un mitógeno no específico, usado a 2.0 µg/ml) o toxoide tetanus (TT; un antígeno específico, usado a 2.0 µg/ml; Connaught, Swift Water, PA) sin o con Zot purificado (usado a 20 ó 60 µg/ml) o suero bovino albúmina (BSA; una proteína de control, usada a 20 ó 60 µg/ml; fracción V, Sigma, St. Louis, MO). En algunos experimentos, un antisuero de conejo anti-Zot o suero normal de conejo fue también agregado a los cultivos al inicio. Las células fueron cultivadas or dos días (para PHA) o seis días (para TT) y 1.0 µCi/ sobre pozo de tiamidina tritiatada que fue agregada. Las placas fueron cosechadas 20 horas después sobre un cosechador de células Wallac (Gaithersburg, MD) e incorporada la tiamidina medida sobre un contador Wallas Trilux Microbeta (Gaithersburg, MD). B. Resultados Un experimento representativo que muestra los efectos de Zot purificada sobre la proliferación de PBMS humana inducida por pH y toxoide tetanus se muestra en la figura 3. Los resultados indican claramente que la incubación con Zot suprimió marcadamente la proliferación de toxoide inducido tetanus (« 85% a 60 de µg/ml), mientras que no tuvo efecto sobre la proliferación PHA-inducido. Además, la supresión de la proliferación de TT-inducido por los que parecían Zot para ser dependientes de la dosis. Niveles significativamente más altos de supresión fueron observados cuando se agregó Zot a 60 µg/ml (8 85%) que cuando fueron usados 20 µg/ml de Zot (« 56% de supresión). La adición de BSA, usada como control de proteína no tuvo efecto sobre ambos linfocitos TT o PHA-inducidos la proliferación demostró la especificidad de la actividad biológica de Zot. Un examen posterior de la especificidad de la supresión Zot inducida de la proliferación TT inducida, las PBMC fueron incubadas en la ausencia o presencia de TT con Zot solamente, Zot más antisuero de conejo anti-Zot (usado a una dilusión de 1 :10) o Zot más suero normal de conejo (usado a una dílusión de 1 :10). Como se puede observar en la figura 4, la adición de un antisuero de conejo anti-Zot invertido es mayor que el 50% de la supresión Zot mediada de la prolieferación de TT-inducida. La adición de suero de conejo normal no tuvo efecto, que confirma la especificidad de los efectos Zot mediados. Similarmente, la adición de BSA no tuvo efecto en este sistema. EJEMPLO 3 Efectos de Zot sobre el consumo de FITC-Dextrán por macrodevoradoras y monocitos humanos. A. Materiales y Métodos El aislamiento de células mononucleares de sangre periferial humana (PBMC) de voluntarios saludables. La PBMC fue aislada por centrifugación del gradiente de densidad sobre un medio de separación linfocito (LSM, Organon-Teknika, Durham, NC) de voluntarios saludables. De acuerdo con la revista institucional de la Junta Directiva de la Universidad de Maryland, Baltimore, los donadores fueron adultos fueron informados y con consentimiento para los esquemas de sangre. Las PBMC usadas fueron frescas o alicuotadas y congeladas en RPMI que contiene 10% (v/v) FCS y 10% (v/v) DMSO que usa una proporción lineal controlada de aparatos congeladores (1°C por minuto, Planner Biomed, Salisbury, England) para preservar la viabilidad de la célula y maximizar la recuperación de la célula. Las células fueron almacenadas en nitrógeno líquido hasta ser usadas. Preparación de 6xHis-Zot purificado. La proteína de fusión 6xHis-Zot fue preparada y purificada por el proceso descrito arriba en el ejemplo dos de arriba. Consumo de antíqeno soluble. ^^^^^^í^^ = ftj' M is. -__ La capacidad para tomar antígeno soluble fue medido usando un isosianato fluorescina dextrán (F?TC)-conjugado (MW 50,700; Sigma). Las PBMC recientemente aisladas (500,0*00 células en 0.5 ml de cRPMI que contiene 10% (v/v) de FCS inactivadas con calor y 50 µg/ml de gentamicina) fueron incubadas en la ausencia o presencia de Zot purificado (40 µg/ml) o BSA (40 µg/ml) por tres horas a 37°C en un volumen final del tubo de 0.5 ml/50ml. Esta incubación fue llevada a cabo bajo agitación en tubos sihconizados para prevenir la adherencia de macrodevoradoras monocitos a las paredes del tubo. Siguiendo esta incubación, FITC-Dextrán (a una concentración final de 300 µg/ml), también como el anti-CD14 aloficocianina (APC)-etiquetada y anti-HLA-DR perdinina proteína clorofil (PerCP)-etiquetada anticuerpos monoclonales fueron agregados a cada uno de ¡os cultivos sin lavar y las células se les permitió incubar por 30 minutos a 37°C o sobre hielo. Entonces el consumo de FITC-De .trán. y antígenos solubles en general, depende sobre la pinocitosis, un fenómeno dependiente de la temperatura, incubaciones a 0°C son llevadas a cabo para establecer los niveles de enlace no específico de FITC-Dextrán a las células. En estos experimentos CDM y HLA-DR (una mayor histocompatibilidad del complejo antígeno clase II cuyo nivel de expresión se incrementa con la activación de la célula) fue usado para identificar macrodevoradoras monocito. Las células fueron entonces lavadas una vez con hielo frío PBS y corridas inmediatamente sobre un sistema surtidor célula-citomedidor de flujo Coulter Epics Élite (Coulter Corp., Miami, FL). El análisis fue llevado a cabo usando el paquete de software WinList (Verity Software House, Topham, ME). El porcentaje de células que fueron incorporadas a FITC-Dextrán se obtuvieron por la resta del porcentaje de células que se incorporaron a FITC-Dextrán a 0°C (hielo) del porcentaje de células FITC-Dextrán que se incorporaron a 37°C.

B. Resultados Un experimento representativo muestra los efectos de Zot sobre el consumo de FITC-Dextrán por un humano normal CD14+ HLA-DR' macrodevoradoras monocito se muestra en la figura 5A-5D. Los resultados muestran que Zot marcadamente suprimida (figura 5D) (« 51-58%) del consumo de FITC-Dextrán por un humano de macrodevoradoras monocito como es comparado con aquel observado en las células incubadas en un medio solo o BSA. Ninguna diferencia significativa fue observada entre el porcentaje de células que se incorporaron a FITC-Dextrán en el medio o en la presencia de BSA. Además, como era esperado, la incubación a 0°C abrogó totalmente el consumo de FITC-Dextrán, confirmando que este fenómeno es dependiente de la temperatura. Ello está bien establecido que el consumo de antígeno por APCs, tal como macrodevoradoras monocito es un evento crítico que conduce a la proliferación y activación de linfocito (Sztein et al, supra (1997)). Los resultados muestran que Zot interfiere con el consumo de FITC-Dextrán y demuestra que los efectos . inmunoregulatorios de Zot sobre la proliferación de TT-inducida son mediados, al menos en parte, por la disminución de la capacidad de las macrodevoradoras monocito para consumir antígeno, conduciendo a la alteración en la presentación y proceso de antígeno. Esto es además soportado por el hecho de que Zot no afecta la proliferación PHA- inducido, un fenómeno que no requiere presentación y proceso de antígeno EJEMPLO 4 Medida del Número de Sitios de Célula de Enlace F TC-Zot en Linfocitos y Macrodevoradoras Monocitos Humanas A. Materiales y Métodos Aislamiento de Células Mononucleares de Sangre Periferail Humana (PBMC) de Voluntarios Saludables.

Las PBMC fueron aisladas por centrifugación del gradiente de densidad sobre un medio de separación linfocito (LSM, Organon-Tecknika, Durham, NC) de voluntarios saludables. De acuerdo con la revista Institucional de la Junta Directiva de la Universidad de Maryland, Baltimore, los donadores fueron adultos e informados del consentimiento para los esquemas de sangre. Las PBMC fueron alicuotadas y congeladas en RPMI que contienen 10% (v/v) FCS y 10% (v/v) DMSO que usa una proporción lineal controlada de aparatos congeladores (1°C por minuto, Planer Biomed, Salisbury, England) para preservar la viabilidad de la célula y maximizar la recuperación de la célula. Las células fueron almacenadas en nitrógeno líquido hasta que se usaron. En algunos experimentos las células fueron usadas inmediatamente después del aislamiento. Preparación de 6xHis-Zot Purificado La preparación de 6xHis~Zot fue como se describió en el ejemplo 2 de arriba. Conjugación de Zot al Isosianato Fluorescina (Zot-F TC) La conjugación de Zot con FITC fue llevada a cabo siguiendo técnicas estándar. Brevemente Zot fue dializada contra 500 ml de neutralizador que etiqueta FITC que comprende 0.05 M de ácido bórico, 0.2 M de NaCI, ajustada a un pH 9.2 con NaOH concentrado, y almacenado a 4°C, toda la noche para quitar los iones libres NH4+ y eleva el pH a 9.2. 20 µl de 5.0 mg/ml de FITC en DMSO para cada uno de los miligramos de Zot fue entonces agregado, seguido por una incubación por dos hora a la temperatura ambiente el FITC no unido fue entonces removido por diálisis en 500 ml de neutralizador de diálisis que comprende 0.1 M Tris-HCL (pH 7.4), 0.1% (w/v) de NaN3, 0.2 M de NaCI, ajustado a un pH para 7.4 con NaOH concentrada, y almacenado a 4°C, a 4°C con dos o tres cambios en dos días. Esta preparación fue almacenada a 4°C hasta ser usada. Enlace de F TC-Zot para Humano PBMC y Análisis Citométrico de Flujo t.? * t -«.a »• ,---*-- La PBMC aislada como se describió arriba fue incubada con concentraciones que se incrementan de Zot-FITC por 30 minutos a 37°C en tubos siliconados (para impedir el enlace de macrodevoradoras a las paredes del tubo de prueba) en la presencia de anticuerpos monoclonales (mAb) para CD conjugada para fícoeritrina (PE) y para CD3 conjugado para ECD (energía acoplada al colorante, un conjugado rojo-texas-PE). El CD14 es usado como un marcador de macrodevoradoras humanas mientras que el CD3 es usado como un marcador para linfocitos T. El uso de estos fluorocromos (es decir, FITC, PE y ECD) nos permite estudiar simultáneamente el enlace de Zot a macrodevoradoras y linfocitos T en una mezcla de poblaciones PBMC por citrometría de flujo tricolor. Siguiendo el teñido, las células fueron lavadas dos veces con PBS (pH 7.2) que contiene 1.0% (w/v) BSA y 0.1 % (w/v) de NaAzide y analizada inmediatamente usando citometría de flujo de un sistema surtidor célula citomedidor de flujo Epics Élite (Beckman-Coulter. Míami, FL). En estos experimentos, las mAbs fluorocromo-etiquetadas del mismo isotipo pero especificidad ¡¡relevante, fueron usadas como controles. Plaquetas, eritrocitos y pedazos de célula fueron excluidos del análisis por establecer un puente apropiado sobre los parámetros de dispersión ligeros hacia adelante contra 90%. Cada una de las muestras recogió datos para aproximadamente 10,000 células. El análisis de datos fue llevado a cabo usando el paquete de análisis Epics Élite (Coulter) o el paquete de análisis lista-moda WinList (Verity Software House, Topeham, ME). Las cantidades (en pM) de Zot-FITC agregado a cada uno de los tubos fue derivado de las concentraciones finales agregadas (en µg/ml) y las conocidas MW de Zot (44,900). Cálculo de Sitios Célula de Enlace Zot La principal intensidad de fluorescencia de cada una de las poblaciones que sigue a la incubación con Zot-FITC fueron convertidas a número de sitios células de enlace Zot usando una curva estándar construida para usar el equipo Quantum 26 MESF (del intervalo de 10,000 a 500,000 MESF) y el software de calibración QuickCal de acuerdo a las recomendaciones del fabricante (Flow Cytometry Standards Corporation, San Juan, Puerto Rico). El estándar de fluorescencia en el equipo Quantum fue calibrado en moléculas de unidades (MESF) de fluorocromos equivalente soluble contra soluciones de colorante fluorescentes purificados. El número de sitios enlace por células (macrodevoradoras o linfocitos) fue derivada de las unidades MESF de Zot-FITC de muestras incubadas (con enlace no específico, es decir, de los controles IgG de FITC-etiquetadas de ratón de MESF, substraídas) ajustadas por la proporción de la fluorescencia/proteína (F/P) de las varias remesas de FITC-Zot usadas. E?. Resultados Un experimento representativo que muestra el análisis de citrometría de flujo del enlace Zot-FITC a los linfocitos T humanos (CD3+) y macrodevoradoras (CD14+) se muestra en la figura 6. Los resultados muestran que el enlace de Zot-FITC de sitios célula como es evidenciado por el número incrementado de enlaces Zot, es varias veces más alto en macrodevoradoras, que en CD3+ linfocitos T. Lo que es más, estos datos muestran que el enlace de Zot es un fenómeno saturable, con la saturación alcanzada a aproximadamente 0.5 pM (» 40g/m!) además, observamos que en las condiciones de bajo saturación, hay aproximadamente 106,000 enlaces Zot sitios/célula y aproximadamente 9,000 enlaces Zot sitios/célula en macrodevoradoras humanas y linfocitos, respectivamente. Para explorar la distribución de sitios de enlace Zot en macrodevoradoras humanas y linfocitos, la metodología descrita arriba fue usada para determinar el número de enlaces Zot sitios/célula en varios voluntarios. Los resultados indicaron que el número promedio de sitios/células de enlaces Zot está en promedio, aproximadamente 10 veces más alto en macrodevoradoras (media = 104,649; intervalo = 56,791-142,840) que en linfocitos (media = 10,684; intervalo = 4,802-18,662). i - í-?*t i - ._-______. r * EJEMPLO 5 Cinéticas de Enlace Zot para Linfocitos y Macrodevoradoras Monocitos Humanas A. Materiales y Métodos El Aislamiento de Células Mononucleares de Sangre Periferial Humana (PBMC) de Voluntarios Saludables. Las PBMC fueron aisladas de voluntarios saludables como se describió arriba en el ejemplo 4. Preparación de 6xHis-Zot Purificado La preparación de 6xHis-Zot fue como se describión en el ejemplo 2 de arriba. Conjugación de Zot a Isotiosianato Fluorescina (Zot-F TC) La conjugación de Zot con FITC fue como se llevó a cabo en el ejemplo 4 de airiba. Cinéticas de Ensayo de Enlace. La determinación de las cinéticas de enlace de Zot a células humanas fue llevada a cabo por citometría de flujo usando un conjugado Zot-FITC y citometría de flujo. Las muestras fueron corridas en tiempo real usando un sistema surtidor de célula citometría de flujo Epics Élite (Beckman-Coulter, Miami, FL). Las PBMC fueron teñidas con anti-CD3 mAb codificado con ECD (energía de colorante acoplada) y anti CD-14 mAb codificado con PE (ficoheritrina). Los controles para el umbral de fluorescencia fueron preparados con una alícuota adicional de cada una de las células en suspensión que substituyen a las irrelevantes mAb de los mismos isotipos, conjugada con los colorantes de fluorescencia correspondientes, para la mAb experimental. Las PBMC etiquetadas con anti-CD3 y anti-CD14 mAbs fueron entonces lavadas y mantenidas en un baño de hielo hasta ser analizadas (dentro de una hora) para minimizar la modulación antígeno. Antes *uáámmik< Am ¿ -^«dbt¿lt-a-,ii del análisis las células fueron liberadas para equilibrarse a 37°c por un espacio de 15-20 minutos en un baño de agua y mantenidas a 37°C usando un controlador de muestra viable (módulo cinético, Citek, Fremont, CA) unido al citómetro de flujo por la duración del experimento (12 minutos) mientras que los datos fueron continuamente recogidos. Los 5 niveles de fluorescencia Baseline FITC fueron recogidos durante 90-150 segundos y la adquisición de datos fue pausada por « 10-15 segundos para inyectar Zot-FITC (a una concentración final de 40 µg/ml). La colección de datos fue resumida inmediatamente después de la adición de Zot-FITC a una proporción de ~ 300-600 células/segundo para un tota! de 12 minutos. Los fluorocromos FITC, PE y ECD fueron excitados usando un ?o láser de argón enfriado por aire (emisión de 488 nm). Los resultados fueron calculados y exhibidos usando los paquetes de análisis WinList and Isocontour (Verity Software House, Topsham, ME). Los datos son presentados como exhibiciones isométricas de la intensidad Zot-FITC (eje y) contra tiempo (eje x) contra número de células (eje z) para las células puenteadas sobre CD3 (linfocitos T) sobre CD14 (macrodevoradoras). 15 B. Resultados Un experimento representativo muestra la cinética del enlace Zot-FITC a linfocitos T humanos (CD3+) y rnacrodevoradoras (CD14+) esto se muestra en las figuras 7A-7C. Los resultados indican que los enlaces Zot a macrodevoradoras humanas (figura 7A) y linfocitos (figura 7B) ocurren muy rápidamente, alcanzando el equilibrio dentro de 20 los dos minutos que siguen a la adición de Zot-FITC. Para comparar el tiempo requerido para Zot y ant?-CD14 mAb para alcanzar el máximo de enlace, experimentos similares fueron llevados a cabo usando células no etiquetadas. En estos experimentos, los niveles de fluorescencia de la línea de fondo FITC fueron recogidos como se describió arriba, la adquisición de datos fue pausada por aproximadamente 10-15 segundos para inyectar 25 FITC-anti-CD14 mAb y la colección de datos se resumió inmediatamente por un total de ^ &a^i^^^^^ 4 12 minutos. Los resultados (figura 7C) indican que los niveles máximos de enlace Zot ocurren en un tiempo menor (« 2 minutos) que aquel requerido por anti-CD14 mAb para alcanzar el equilibrio (« 5 minutos). EJEMPLO 6 Enlace de FITC-Zot a Linfocitos T y B Humanos. A. Materiales y Métodos Aislamiento de Células Mononucleares de Sangre Periferial Humana (PBMC) de Voluntarios Saludables. Las PBMC fueron aisladas de voluntarios saludables como se describió en el ejemplo 4 arriba. Preparación de 6xHis-Zot Purificado. La preparación de 6xHis-Zot fue descrita en el ejemplo 2 de arriba. Conjugación de Zot a isotiocianato (Zot-F TC La conjugación de Zot con FITC fue como se llevó a cabo en el ejemplo 4 de arriba. Enlace de FITC-Zot a PBMC Humano y Análisis Citométrico de Flujo. La PBMC aislada como se describió arriba fue incubada con 40 µg/ml de Zot-F!TC por 30 minutos a 37°C en la presencia de mAb para un conjugado CD14 a PE, el conjugado CD3 para un tricolor y conjugado anti-CD19 (un conjugado PE-Cy5) para ECD (energía de colorante acoplada, un conjugado rojo-texas-PE). El CD14 es un marcador de macrodevoradoras humanas, el CD3 es un marcador de linfocitos T y el CD19 es un marcador para linfocitos B. El uso de estos fluorocromos (es decir, FITC, PE, TC y ECD) nos permitió estudiar simultáneamente el enlace de Zot a macrodevoradoras, los linfocitos T y B en poblaciones mezcla de PBMC por citometría de flujo tetracolor. Siguiendo las células teñidas fueron lavadas dos veces con PBS (pH 7.2) que contienen 1.0% (w/v) BSA y 0.1% (w/v) NaAzide e inmediatamente analizadas por citometría de flujo usando un sistema surtidor de células citomedidor de flujo Epics Élite (Beckman-Coulter, Miami, FL). En estos experimentos, las mAbs fluorocromo estiquetadas de los mismos isotipos pero de especificidad irrelevante fueron usadas como controles. Plaquetas, eritrocitos y restos de células fueron excluidos del análisis para establecer un puente apropiado sobre los parámetros de dispersión ligeros de adelante contra 90% Por cada ejemplo, los datos para alrededor de 10,000 células fueron recolectados. El análisis de datos fue ejecutado usando el paquete de análisis Epics Élite (Coulter) o el paquete de análisis lista-moda de WinList (Verity Software House, Topsham, ME). Los resultados se mostraron como histrogramas de color simple de intensidad de fluorescencia de Zot-FITC en poblaciones puenteadas linfocito T (CD3+) y B (CD19+). B. Resultados Un experimento que muestra el enlace de Zot-F!TC a linfocitos humanos T (CD3+) y B (CD I9+) como se muestra en la figura 8. Los resultados indican que los enlaces Zot similarmente para ambos, linfocitos T y B. En este experimento eí enlace Zot-FITC a macrodevoradoras fue de 5-8 veces más alto que el enlace a los linfocitos T o B. EJEMPLO 7 Incapacidad de Zot Antagónicos para Bloguear Enlace Zot-F TC A. Material v Métodos El aislamiento de células mononucleares periferiales humanas (PBMC) de voluntarios saludables. Las PBMC fueron aisladas de voluntarios saludables como se describió arriba en el ejemplo 4. Preparación de 6xHis-Zot Purificada La preparación de 6xHis-Zot fue como se describió en el ejemplo 2 de arriba. ítÚ*Í.A. M. -,--y y , , y. .

Preparación de FZI/0 v FZ /1 Zot Antagónicos. Los péptidos antagónicos FZI/0 (Gly Gly Val Leu Val Gin Pro Gly) (SEQ ID NO: 7) y FZI/1 (Val Gly Val Leu Gly Arg Pro Gly) (SEQ ID NO:8) fueron químicamente sintetizados y purificados usando técnicas bien conocidas, tal como se describió en High Performance Liquid Chromatography of Peptides and Proteins: Separation Analysis and Conformation, Eds. Mant et al, C.R.C. Press (1991 ), y un sintetizador de péptido, tal como Symphony (Protein Technologies, Inc.). Conjugación de Zot para Isotiocianato Fluorescina (Zot-F TC) La conjugación de Zot con FITC fue como se llevó a cabo en el ejemplo 6 de arriba. Condiciones de Cultivo para Bloqueadores de Enlace FITC-Zot para PBMC Humanos y Análisis Citométrico de Flujo. La PBMC aislada como se describió arriba fue teñida con mAbs para el conjugado CD14 para PE y para el conjugado CD3 para ECD (la energía del colorante acoplada, a un conjugado rojo-texas-PE) las células fueron entonces lavadas e incubadas por 15 minutos a 4°C en 400 µí de un medio AIM-V (GIBCO BRL, un medio definido libre de suero usado rutinariamente por los cultivos de linfocito humano) con 0.2% (w/v) NaAzide (para bloquear el reciclador de internalización) en un solo medio o con la adición de FZI/0 (4.0 mg/ml), FZI/ (4.0 mg/ml), BSA (4.0 mg/ml; control negativo) o un Zot no etiquetado (160 µg/ml; control positivo). El Zot-FITC fue entonces agregado a cada uno de los tubos para alcanzar la concentración final de 40 µg/ml e incubado por 5 minutos (el tiempo requerido para alcanzar el equilibrio), lavado e inmediatamente corrido en un citomedidor de flujo. Entonces, FZI/0, FZI/1 y BSA fueron agregadas con un exceso de 100 veces y Zot no etiquetado a un exceso de 4 veces comparado con la concentración agregada de Zot-FITC. Infortunadamente, las dificultades técnicas en obtener grandes i -, ccü^t..., .* ..*. s. : cantidades de preparaciones de Zot no etiquetado purificado evitaron la evaluación de su capacidad para bloquear enlaces Zot-FITC a más de cuatro veces en exceso. Plaqueta, eritrocitos y restos de células fueron excluidas del análisis para establecer un puente apropiado sobre los parámetros de dispersión ligeros hacia adelante contra el 90%. Para cada muestra recolectamos datos para alrededor de 10,000 células. El análisis de datos fue llevado a cabo usando el paquete de análisis Epics Élite (Coulter) o el paquete de análisis lista-moda WinList (Verity Software House, Topsham, ME). Los resultados se mostraron como porcentaje de supresión de la intensidad de fluorescencia principal de las células incubadas con Zot-FITC en la presencia de Zot antagónicos, el Zot no etiquetado o BSA como es relacionado a la intensidad de fluorescencia del medio de las células incubadas en un sólo medio (arbitrariamente se le asignó un valor de 100%). E3. Resultados Un experimento representativo que muestra los efectos de incubación de PBMC de 3 voluntarios diferentes con Zot antagónicas, Zot no etiquetado o BSA se muestra en la figura 9. La adición de ambos FZI/0 o FZI/1 Zot antagónicos a un exceso de 100 veces no bloqueó significativamente el enlace de Zot-FITC a macrodevoradoras puenteadas CD14+. Similarmente, la adición de un exceso de 100 veces de BSA no afectó el enlace de Zot-FITC. En contraste, la preincubación con un exceso de solamente 4 veces de Zot no etiquetado bloqueó el enlace de Zot-FITC por 24-43%. Estos resultados sugieren que el enlace de Zot a macrodevoradoras humanas involucra un receptor con diferentes sitios de enlace que aquellos de los receptores identificados Zot/zonulina en el cerebro y tejidos intestinales. EJEMPLO 8 Supresión de Zot de la Proliferación Toxoide Tétanus (TT) - nducida es Dependiente de los Factores Presentes en el Suero. A. Material y Métodos El aislamiento de células mononucleares de sangre periferial humana (PBMC. de volunta^ ^saludables. Las PBMC fueron aisladas de voluntarios saludables como se describió en el ejemplo 4 de arriba. Preparación de 6xHis-Zot Purificado. La preparación de 6xHis-Zot fue como se describió en el ejemplo 2 de arriba. Condiciones de Cultivo y Ensayos Linfoproliferación. Las PBMC fueron cultivadas (1.5 x10fi células/ml) en 1.0 ml de ambos medios (a) AIM-V, (b) RPMl 1 ,640 que contiene 10% (v/v) de suero de becerro fetal inactivado por calor y 50 µg/ml de gentamicina o (c) RPMi 1 ,640 que contiene 10% (v/v) de suero humano AB inactivado por calor y 50 µg/ml de gentamicina Las células fueron incubadas a 37°C, 5% de C02 en placas de 96 pozos en la ausencia o presencia del toxoide tétanus (TT; un antígeno específico, usado a 2.0 ug/ml; Wyeth. Manieta, PA) sin o con Zot purificado (60µg/rnl) o suero bovino albúmina (BSA; una proteína de control, 60ug/ml; Fracción V, Sigma, St. Louis, MO). Las células fueron cultivadas por seis días y fue agregado 1.0 Ci/pozo de timidina tptiatada. Las placas fueron cosechadas 20 horas después sobre un cosechador de células Wallac (Gaithersburg, MD) y la timidina incorporada fue medida en un contador microbeta Wallac Trilux (Gaithersburg, MD). B. Resultados Los resultados de tres experimentos independientes mostraron la no inhibición de la proliferación de TT inducidas pudo ser observado cuando las PBMC fueron incubadas en la ausencia de suero, es decir, cuando el medio definido AIM-V fue usado en los cultivos. En efecto el retroceso fue observado en la mayoría de los casos, es decir, la incubación con Zot en la ausencia del suero considerado para incrementar las jm í. repuestas de proliferación incrementadas para TT. En contraste, la incubación con Zot resultó en una marcada supresión de la proliferación de TT-inducida cuando los cultivos fueron ejecutados en la presencia de una u otra FCS o suero AB humano. En efecto, la presencia de suero humano AB parece mediar los niveles más altos (arriba del 90%) de la supresión de la proliferación TT-inducida tanto como se observó en la presencia de FCS. EJEMPLO 9 La Supresión Zot de la Expresión CD14 sobre Macrodevoradoras Monocitos Humanas. A. Material y Métodos. El Aislamiento de Células Mononucleares de Sangre Periferial Humana (PBMC) de Voluntarios Saludables. Las PBMC fueron aisladas de voluntarios saludables como se describió en ei ejemplo 4 arriba. Preparación de 6xHis-Zot Purificado. La preparación de 6xHis-Zot fue como se describió en el ejemplo 2 de arriba. Condiciones de Cultivo de Análisis Citométrico de Flujo. Las PBMC aisladas como se describió arriba fueron incubadas a 37°C, 5% de C02 en placas de 24 pozos por varios periodos de tiempo (4 horas a 7 días) en la ausencia o presencia de toxoide tétanus (TT; un antígeno específico, usado a 2.0 µg/ml; Wyeth, Marietta, PA) sin o con Zot purificado (60 µg/ml) o suero bovino albúmina (BSA; una proteína de control, 60 µg/ml; Fracción V, Sigma, St. Louis, MO). Las células fueron entonces coloreadas con un mAb para conjugado CD para FITC y analizadas por citometría de flujo. Plaquetas, eritrocitos y restos de célula fueron excluidos del análisis por establecer un puente apropiado sobre los parámetros ligeros de dispersión contra 90%. Para cada muestra, los datos para alrededor de 10,000 células fueron recogidos. El análisis de datos fue realizado usando el paquete de análisis Epícs Élite (Coulíer) o el paquete de análisis lista-moda de WinList (Verity Software House, Topsham, ME). Los resultados son mostrados como histogramas de color simple de la fluorescencia CDM sobre las células puenteadas sobre la "región monocito", basada y definida sobre la dispersión hacia adelante contra la dispersión lateral características de macrodevoradoras humanas. B. Resultados Un experimento representativo que muestra los efectos de incubación de PBMC con Zot sobre la expresión de CDM en macrodevoradoras humanas se incluye en las figuras 10A-10B. La adición de Zot causó una marcada supresión de la expresión de CDM en las siguientes 18 horas de incubación. Este efecto fue muy pronunciado para ambos en la ausencia (figura 10A) o presencia (figura 10B) de toxoide tétanus. La adición de BSA no afectó la expresión CDM. Los expepmentos cinéticos mostraron que la supresión Zot inducida de la expresión CDM es observada en aproximadamente la mitad de los experimentos tan prematuro como de 4-6 horas siguientes a la exposición para Zot y aquella para la expresión CDM se mantiene marcadamente suprimida después de 7 días en el cultivo (la última vez del punto evaluado). La CDM es una molécula en la superficie de macrodevoradoras que actúa como un receptor de alta afinidad para proteínas de enlace-LPS-LPS complejas. Entonces, la bajo regulación de la expresión CDM por Zot es reconocida por tener efectos profundos sobre la activación de macrodevoradoras y su capacidad para iniciar efectivamente las respuestas inmunes de células mediadas T. EJEMPLO 10 Efectos de Zot sobre la Viabilidad de Macrodevoradoras Monocitos y Linfocitos Humanas. A. Material y Métodos **-"• ' - - • -ci*JkLm.*a.~m .-«a&g-atffy.

El Aislamiento de Células Mononucleares de Sangre Periferial Humana l'PBMC) de Voluntarios Saludables. Las PBMC fueron aisladas de voluntarios saludables como se describió en el ejemplo 4 de arriba. Preparación de 6xHis-Zot Purificado La preparación de 6xHis-Zot fue como se describió en el ejemplo 2 de arriba. Condiciones de Cultivo y Análisis Citométrico de Flujo. La PBMC aislada como se describió arriba fue incubada a 37°C, 5% de C02 en placas de 24 pozos por varios periodos de tiempo (6 horas a 7 días) en la ausencia o presencia de toxoide tétanus (TT; un antígeno específico, usado a 2.0 µg/ml; Wyeth, Marietta, PA) sin o con Zot purificado (40 µg/ml) o suero bovino albúmina (BSA; una proteína de control, 40 µg/ml, Fracción V, Sigma, St. Louis, MO). Las células fueron entonces teñidas con mAbs dializada para conjugado CDM para FITC y lavada. Para evaluar la viabilidad de célula, propidium iodado (Pl; 50 g/ml; un colorante que es fácilmente incorporado dentro de las células muertas pero excluido de las células viables) fue agregado a la suspensión de célula y las muestras analizadas inmediatamente por citometría de flujo. Plaquetas, eritrocitos y restos de células fueron excluidos del análisis para establecer un puente apropiado sobre los parámetro de dispersión ligera de avance contra 90%. Por cada una de las muestras, datos de alrededor de 10,000 células fueron recogidos. El análisis de datos fue efectuado usando el paquete de análisis Epics Élite (Coulter) o el paquete de análisis lista-moda WinList (Verity Software House, Tomphsam, ME). Los resultados son mostrados como el porcentaje de células viables puenteadas sobre "la región monocito" o "región linfocito", basadas y definidas sobre la dispersión de avance contra las características de dispersión lateral de esas poblaciones de célula. í .ti ? í3. Resultados Un experimento representativo que muestra los efectos de incubación de PBMC con Zot sobre la viabilidad de macrodevoradoras humanas y linfocitos se incluye en la figura 11. La adición de Zot causó decrecimiento moderado en la viabilidad de macrodevoradoras comparadas como controles a una etapa temprana de un día en el cultivo. Esos decrecimientos se hicieron muy pronunciados el día 4 y virtualmente todas las macrodevoradoras murieron después de 7 días en el cultivo. En contraste, ninguna diferencia en la viabilidad del linfocito fue observada a más cultivos incubados con Zot y aquellos incubados con el medio o BSA hasta el día 4. Sin embargo, la viabilidad hnfocito decreció marcadamente las últimas veces en la presencia de Zot. Resultados similares fueron observados cuando TT fue agregada a los cultivos en la ausencia o presencia de Zot. Estos resultados demuestran que Zot afecta la viabilidad acrodevoradora a tiempos relativamente tempranos, mientras que los efectos sobre linfocitos no se hacen aparentes hasta al menos cuatro días en el cultivo. Estas observaciones proveen información adicional referente a los mecanismos que pueden reforzar la supresión Zot-mediada de presentación y procesamiento de antígeno, apuntando a los efectos tempranos sobre macrodevoradoras. EJEMPLO 11 La nducción Zot-mediada de Producción de Citoguina por Linfocitos y Macrodevoradoras Monocitos Humanas A. Material y Métodos El Aislamiento de Células Mononucleares de Sangre Periferia! Humana (PMBC) de Voluntarios Saludables. Las PBMC fueron aisladas de voluntarios saludables como se describió en el ejemplo 4 de arriba. Preparación de 6xHis-Zot Purificado ^ zj^ ksa^?eg^^, La preparación de 6xHis-Zot fue como se describió en el ejemplo 2 de arriba. Condiciones de Cultivo. Las PBMC aisladas como se describió arriba fueron incubadas a 37°C, 5% de CO2 en placas de 24 pozos por varios periodos de tiempo (6 horas a 4 días) en la ausencia o presencia de toxoide tétanus (TT; un antígeno específico, usado a 2.0 µg/ml; Wyeth, Marietta, PA) sin o con Zot purificado (60 µg/ml) o suero bovino albúmina (BSA; una proteína de control, 60 µg/ml; Fracción V, Sigma, St. Louis, MO) para estudios que involucran la producción de TNF-a, IL-1 ß y IL-10, el contenido de los pozos fue recolectado a las 6 horas y en los días 1, 2 y 4 dentro de tubos de 1.5 ml Eppendorf y centrifugado a 4°C por 10 minutos a 2,700 x g en una centrífuga Eppendorf refrigerada para remover células y restos. Las superflotantes fueron transferidas a nuevos tubos Eppendorf y congeladas a -70°C hasta que fueron analizadas. Las superfiotantes para la medición de citoquinas derivadas de linfocito T (es decir, IL-2, lL-4 y IFN-?) siguiendo la estimulación con TT sin o con Zot purificado o BSA fueron recogidas después de 3 días. Mediciones Citoguina por Quimioluminiscencia ELISA. Una quimioluminiscencia estándar de captura ELISA fue usada para detectar la presencia de citoquinas en el cultivo de células superflotantes. Brevemente, 1.0-2.0 µg/ml de anticuerpos citoquina anti-humano fueron cubiertos sobre los 96 pozos negros opacos de las placas ELISA (Corning-Costar, Cambridge, MA) en alguno de los dos PBS (pH 7.4) toda la noche a 4°C. Las placas fueron lavadas con PBS (pH 7.4) que contienen 0.5% (v/v)Tween-20 (Sigma) y bloqueada durante 2 horas con ambos PBS (pH 7.4) que contienen 10% (v/v) de FCS o 4.0% (w/v) de BSA. Después del lavado, 100 µl de células de cultivo superflotantes o recombinantes citoquinas humanas (como estándares) fueron agregadas a los pozos e incubadas por 2 horas a temperatura ambiente. Después ??»?tl?.. í m ',*? , del lavado, las correspondientes anticitoquina mAbs conjugada para biotina fue agregada a los pozos (45 minutos a temperatura ambiente), lavadas e incubadas con abidina peroxidasa por 30 minutos a la temperatura ambiente. La BM quimioluminiscencia reaccionante ELISA (Boehringer Mannheim, Gaithersburg, MD) fue entonces agregada y la quimioluminiscencia detectada sobre una microprobeta 1 ,450 lectora de placa Trilux (Wallac, Gaithersburg, MD). Los anticuerpos anti-IL-1 ß fueron obtenidos de Endogen (Woburn, MA), todos los otros fueron obtenidos de Pharmingen (San Diego, CA). B. Resultados Un experimento representativo que muestra la capacidad de Zot para inducir producción de citoquína por macrodevoradoras humanas se muestra en las figuras 12A-12C. La adición de Zot (en ausencia de TT) la producción inducida de cantidades considerables de TNF-a es tan temprana como a las 6 horas, alcanzando los nivelas pico a ¡as 24 horas (3,400-3,800 pg/ml) y el decrecimiento después de alcanzar los niveles de línea de fondo cercana por 4 días (figura 12A). Los niveles más bajos de TNF a fueron observados en el medio o cultivos BSA (« 1 ,000 - 1 , 100 pg/ml) probablemente el resultado de la activación no específica de macrodevoradoras que sigue a la adherencia al plástico. Una inducción débil de IL-1 ß por Zot ( « 40-60 pg/ml) fue también observada que alcanzó los niveles pico después de dos días y decreció considerablemente por el día 4 (« 20 pg/ml) (figura 12B). Niveles no significantes de IL-1 ß fueron observados en el medio o cultivos BSA. Finalmente, la incubación con Zot resultó en la producción de altos niveles de IL-10 después de 6 horas (« 1 ,000 pg/ml), alcanzando niveles pico por el día 1 (« 1 ,500 pg/ml), y continuando en las mismas concentraciones hacia arriba para el día 4 (figura 12C). Similares a los encontrados y descritos arriba para TNF-a, niveles considerablemente más bajos de IL-10 fueron observados en el medio o cultivos de BSA, probablemente el resultado de la activación no específica de macrodevoradoras que siguió a la adherencia al plástico, la presencia de TT no alteró ninguna de las dos la cinética o la magnitud de las respuestas citoquina observadas que siguieron a la adición de Zot. La inducción de altos niveles de citoquinas pro-inflamatorias potentes que sigue a la exposición a Zot proporciona información adicional que involucra los mecanismos que 5 pueden reforzar la supresión Zot mediada de presentación y proceso de antígeno, otra vez apuntando a un efecto temprano sobre macrodevoradoras. Por ejemplo, la inducción Zot mediada de la producción de IL-10, una citoquina conocida por ser el mayor inhibidor de respuesta tipo Th1 a través de la inhibición de la producción de citoquinas tales como IL-2, es considerado para jugar un papel significante en la supresión de respuestas 10 linfoproliferativas de antígeno inducido observadas cuando Zot es agregado a los cultivos. Un experimento representativo que muestra los efectos de Zot sobre la producción de citoquinas células derivadas T se muestra en las figu. as 13A.13B. Y fue observado que la adición de Zot suprimió la producción de IL-2 inducido por la incubación con TT, mientras BSA no tuvo efecto (figura 13A). Niveles no medibles de lL-2 fueron 35 inducidos por Zot en la ausencia de TT. En contraste, a la adición de Zot consistentemente inducida por la producción de niveles bajo moderados de IFN-? en la ausencia de TT, similares a los niveles inducidos por TT (figura 13B). Además, Zot marcadamente incrementó los niveles de IFN-inducido por TT, mientras que BSA no tuvo efecto (figura 13B). Finalmente, se observó que la adición de Zot no indujo producción de 20 IL-4. Entonces IL-2 es una citoquina que juega un papel crítico en la proliferación linfocito, la supresión de la producción de IL-2 que siguió a la estimulación antigénica es considerada como uno de los mecanismos claves del refuerzo de la supresión Zot mediada de la proliferación inducida de TT. También la importancia, el hecho de que Zot induce la producción IFN-? en la ausencia o presencia de TT, también como la producción 25 de muchas citoquinas pro-inflamatorias, indica que Zot ejerce sus efectos inmunoregulatorios a varios niveles durante el proceso complejo de presentación y procesamiento de antígeno que conduce a la generación de respuestas inmune antígeno específico. Toda las referencias citadas adjunto son incorporadas como referencia en su totalidad. Mientras que la invención ha sido descrita en detalle, y con referencia a modalidades específicas de ellas, y será aparente a alguien con destreza ordinaria en la técnica que varios cambios y modificaciones se pueden hacer a ello sin salir del espíritu y alcance de eso.

IIg^^^^^^^^^^^^^^^ fc?g^t^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^_^_^ ^¿aji^^^^^^^i^^^^^ LISTADO DE SECUENCIAS. <110> FASANO, Alessio Sztein, Marcelo B. LU, Ruiliang TANNER, Michael K. <120> EL MÉTODO DE USAR ZOT O ZONULINA PARA INHIBIR LA PROLIFERACIÓN DE LINFOCITOS EN UNA MANERA ANTIGENO- ESPECIFICO. <130> P7574 <140> 09/1000,000 <141 > 1999-09-09 <150> 60/1100,266 <151 > 1998-09-10 <160> 8 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 18 <212> PRT <213> Humano <400> 1 Asn Asp Gln Pro Pro Pro Ala Gly Val Thr Ala Tyr Asp Tyr Leu Val 1 5 10 15 ile Gln <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Humano <220> <221> INSEGURA <222> (10) <223> X a la posición 10 es un aminoácido. <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Xaa Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 1/3 ser Leu Arg Leu 20 <210>3 <211>23 <212>ADN <213> Construcción Sintética <400> 3 cgggatcccg tatgagtate ttt 23 <210>4 <211>24 <212>ADN <213> Construcción Sintética <400> 4 cccaagcttg ggtcaaaata tact 24 <210>5 <211> 18 <212>ADN <213> Construcción Sintética <400> 5 tcatcacggc gcgccagg 18 <210>6 <211>22 <212>ADN <213> Construcción Sintética <400> 6 ggaggtctag aatctgcccg at 22 <210>7 <211>8 <212> PRT <213> Construcción Sintética <400> 7 Gly Gly Val Leu Val Gln Pro GIY 1 5 2/3 <210>8 <211>8 <212> PRT <213> Construcción Sintética <400> 8 Val Gly Val Leu Gly Arg Pro Gly 1 5 3/3 .^^Aggt^tí^i^^^^^^i^^^

Claims (25)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método de supresión de antígeno que presente proliferación linfocito de célula-mediada en un huésped mamífero preexpuesto a un antígeno particular que comprende el paso de administrar a dicho huésped una cantidad efectiva de un inmunoregulador Zot-relacionado seleccionado del grupo que consiste de Zot o zonulina, dicha cantidad efectiva para bajo-regular la actividad de dicha célula que presenta antígeno.
2. 2. Un método de supresión de antígeno que presenta la proliferación de linfocito de célula-mediada para un antígeno particular en un huésped mamífero que comprende el paso de administrar a dicho huésped una cantidad efectiva de un inmunoregulador Zot-relacionado seleccionado del grupo que consiste de Zot o zonulina en combinación con dicho antígeno particular, dicha cantidad efectiva para bajo-regular la actividad de dicha célula que presenta antígeno.
3. 3. Un método para tratar un huésped mamífero afligido con un deceso o desorden inmuno-relacionado o auto-inmune que comprende el paso de administrar a dicho huésped una cantidad efectiva de un inmuno-regulador Zot-relacionado seleccionado del grupo que consiste de Zot o zonulina, dicha cantidad efectiva para bajo-regular el antígeno que presenta la proliferación linfocito de célula-mediada.
4. 4. Un método para tratar un huésped afligido con un deceso o desorden inmuno-relacionado o auto-inmune que comprende el paso de administrar a dicho huésped una cantidad efectiva de un inmuno-regulador Zot-relacionado seleccionado del grupo que consiste de Zot o zonulina en combinación con un antígeno específico para dicho deceso o desorden, dicha cantidad efectiva para bajo-regular el antígeno que presenta la proliferación linfocito de célula-mediada.
5. 5. Un método para tratar un huésped mamífero que sufre de un subsecuente rechazo inmune para tejidos u órganos de trasplante que comprende el paso 62 de administrar a dicho huésped una cantidad efectiva de un inmuno-regulador Zot-relacionado seleccionado del grupo que consiste de Zot o zonulina, dicha cantidad efectiva para bajo-regular el antígeno que presenta la proliferación linfocito de célula-mediada.
6. 6. Un método de tratamiento para un huésped mamífero que sufre de subsecuente rechazo inmune para tejidos u órganos de trasplante que comprende el paso de administrar a dicho huésped una cantidad efectiva de un inmuno-regulador Zot-relacionado seleccionado del grupo que consiste de Zot o zonulina en combinación con un antígeno de trasplante específico, dicha cantidad efectiva para bajo-regular el antígeno que presenta proliferación linfocito de célula-mediada.
7. 7. Un método de tratamiento para un huésped mamífero afligido con un deceso alérgico o inflamatorio o desórdenes que comprende el paso de administrar un inmuno-regulador efectivo de un Zot-relacionado seleccionado del grupo que consiste de Zot o zonulina, dicha cantidad efectiva para bajo-regular el antígeno que presenta proliferación linfocito de célula-mediada.
8. 8. Un método para el tratamiento de un huésped mamífero afligido con un deceso alérgico o inflamatorio o desórdenes que comprende el paso de administrar un inmuno-regulador efectivo de un Zot-relacionado seleccionado del grupo que consiste de Zot o zonulina en combinación con un antígeno relacionado inflamatorio específico o alergén, dicha cantidad efectiva para bajo-regular el antígeno que presenta proliferación linfocito de célula-mediada.
9. 9. El método de acuerdo a las reivindicaciones 3 ó 4, caracterizado además porque dicho deceso o desorden relacionado inmune o auto-inmune es seleccionado del grupo que consiste de esclerosis múltiple, artritis reumatoide, diabetes mellitus dependiente de insulina, deceso celiaco, síndrome Sjogren, eritomatosus lupus sistémico, tiroiclitis auto-inmune, trombositopénica idiopática púrpura, anemia hemolítica, 63 deceso Grave, deceso de Addison, orquitis auto-inmune, anemia perniciosa, vasculitis cuagulofatia auto-inmune, miastenia gravis, polineuritis, pénfigus, carditis reumática, polimiocitosis, dermatomiocitosis, y, escleroderma.
10. 10. El método de acuerdo a las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado además porque dicho deceso alérgico o inflamatorio o desorden es seleccionado del grupo que consiste de asma, psoriasis, dermatitis eczematous, sarcoma de Kaposi, esclerosis múltiple, deceso inflamatorio del intestino, desórdenes proliferativos de las células de músculos blandos, y condiciones inflamatorias asociadas con infecciones micótica, viral, parasítica, o bacterial.
11. 11. El método de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado además porque dicho huésped mamífero es un humano.
12. 12. El método de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado además porque dicho huésped mamífero es seleccionado del grupo que consiste de húmanos, bovinos, ovinos, porcinos, felinos, búfalos, caninos, cabras, equinos, burros, venado y primates.
13. 13. El método de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado además porque dicho inmunoregulador es administrado en una componente con al menos uno de los grupos que consiste de un portador aceptable farmacéuticamente, adyuvante y vehículo de entrega.
14. 14. El método de acuerdo a las reivindicaciones 2, 4, 6 u 8, caracterizado además porque dicho antígeno es administrado en una componente con al menos uno de los grupos que consiste de un portador aceptable farmacéuticamente, adyuvante y vehículo de entrega.
15. 15. El método de acuerdo a las reivindicaciones 2, 4, 6 u 8, caracterizado además porque dicho antígeno y dicho inmunoregulador son administrados secuencialmente o concomitántemente. 64
16. 16. El método de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado además porque dicho inmunoregulador es administrado a una superficie mucosa.
17. 17. El método de acuerdo a las reivindicaciones 2, 4, 6 u 8, caracterizado además porque dicho antígeno y dicho inmunoregulador son administrados a una superficie mucosa.
18. 18. El método de acuerdo a la reivindicación 16, caracterizado además porque dicha superficie mucosa es seleccionada del epitelio intestinal, los tejidos linfoides, tejidos linfoides bronquial-asociados, tejidos linfoides nasal-asociados, tejidos linfoides genital-asociados, y amígdalas.
19. 19. El método de acuerdo a la reivindicación 17, caracterizado además porque dicha superficie mucosa es seleccionada del epitelio intestinal de los tejidos linfoides, tejidos linfoides bronquial-asociados, tejidos linfoides nasal-asociados, tejidos linfoides ganital-asociados, y amígdalas.
20. 20. El método de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado además porque dicho inmuno regulador es administrado parenteralmente.
21. 21. El método de acuerdo a las reivindicaciones 2, 4, 6 u 8, caracterizado además porque dicho antígeno y dicho inmunoregulador son administrados parenteralmente.
22. 22. El método de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado además porque el modo de administrar dicho inmunoregulador es seleccionado del grupo que consiste de intravenosa, intradermal, intramuscular, y subcutánea.
23. 23. El método de acuerdo a las reivindicaciones 2, 4, 6 u 8, caracterizado además porque el modo de administrar dicho antígeno y dicho inmunoregulador es seleccionado del grupo que consiste de intravenosa, intradermal, intramuscular, y subcutánea. 65
24. 24. Un método de supresión de antígeno que presenta proliferación linfocito de célula-mediada en un cultivo de células preexpuesto a un antígeno particular que comprende el paso de poner en contacto con el cultivo una cantidad de un inmunoregulador Zot-relacionado seleccionado del grupo que consiste de Zot o zonulina, 5 dicha cantidad efectiva para bajo-regular la actividad de dicha célula que presenta antígeno.
25. 25. Un método de supresión de antígeno que presenta la proliferación linfocito de célula-mediada en un cultivo de células en respuesta a un antígeno que comprede el paso de ponerla en contacto con el cultivo con una cantidad efectiva para ?o bajo-regular la actividad de dicha célula que presenta antígeno de un inmunoregulador Zot-relacionado seleccionado del grupo que consiste de Zot o zonulina en combinación con dicho antígeno, dicha cantidad efectiva para bajo regular la actividad de dicha célula que presenta antígeno.