DE69925496T2

DE69925496T2 - In-vitro verfahren zur verwendung von zot oder zonulin zur inhibierung der lymphozyten proliferation in einer antigen-spezifischen weise

Info

Publication number: DE69925496T2
Application number: DE69925496T
Authority: DE
Inventors: Alessio Fasano; B. Marcelo SZTEIN; Ruiliang Lu; K. Michael TANNER
Original assignee: University of Maryland at Baltimore
Current assignee: University of Maryland at Baltimore
Priority date: 1998-09-14
Filing date: 1999-09-09
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2019-09-10
Also published as: EP1113813A1; DE69925496D1; WO2000015252A1; AU754142B2; HUP0103965A2; AU6019099A; CN1317975A; MXPA01002600A; HUP0103965A3; EP1113813A4; IL141563A0; KR20010075114A; ZA200102071B; RU2214271C2; CA2342771A1; NO20011253D0; JP2002524531A; CN1228084C; ES2239480T3; NO20011253L

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Antigen-spezifische Herunterregulierung einer Immunantwort unter Verwendung von Zot oder Zonulin. Die vorliegende Erfindung stellt insbesondere ein Verfahren zur Inhibierung einer durch Antigen-präsentierende Zellen vermittelten Antigen-spezifischen Lymphozytenproliferation in dosisabhängiger Weise durch Verabreichung einer wirksamen Menge Zot oder Zonolin bereit.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
I. Tight Junctions und das Actin-Zytoskelett
Die Tight Junctions (nachfolgend "TJ") oder Zonula occludens (nachfolgend „ZO") sind eines der Kennzeichen absorptiver und sekretorischer Epithelien (Madara, J. Clin. Invest., 83:1089-1094 (1989); und Madara, Textbook of Secretory Diarrhea, Hrsg. Lebenthal et al., Kapitel 11, Seiten 125-138 (1990)). Als Barriere zwischen apikalen und basolateralen Kompartimenten regulieren sie selektiv die passive Diffusion von Ionen und wasserlöslichen gelösten Stoffen über den parazellulären Weg (Gumbiner, Am. J. Physiol., 253 (Cell Physiol. 22):C749-C758 (1987)). Diese Barriere hält jeden Gradienten aufrecht, der durch die Aktivität von Wegen erzeugt wurde, die in Zusammenhang mit der transzellulären Route stehen (Diamond, Physiologist, 20:10-18 (1977)).
Es gibt vielfältige Beweise dafür, dass die ZO, die einst als statische Strukturen angesehen wurde, in Wirklichkeit dynamisch ist und sich leicht an eine Vielzahl entwicklungsbedingter Gegebenheiten (Magnuson et al, Dev. Biol., 67:214-224 (1978); Revel et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 40:443-455 (1976); und Schneeberger et al., J. Cell Sci., 32:307-324 (1978)), physiologischer Gegebenheiten (Gilula et al., Dev. Biol., 50:142-168 (1976); Madara et al., J. Membr. Biol., 100:149-164 (1987); Mazariegos et al., J. Cell Biol., 98:1865-1877 (1984); und Sardet et al., J. Cell Biol., 80:96-117 (1979)), und pathologischer Gegebenheiten (Milks et al., J. Cell Biol., 103:2729-2738 (1986); Nash et al., Lab. Invest., 59:531-537 (1988); und Shasby et al., Am. J. Physiol., 255 (Cell Physiol, 24:C781-C788 (1988)) anpasst. Die regulatorischen Mechanismen, die dieser Anpassung zugrunde liegen, werden noch nicht vollständig verstanden. Es ist jedoch klar, dass in Gegenwart von Ca²⁺ der Zusammenbau der ZO das Ergebnis zellulärer Wechselwirkungen ist, die eine komplexe Kaskade biochemischer Ereignisse auslösen, welche schließlich zur Bildung und Modulierung eines organisierten Netzwerkes von ZO-Elementen führen, dessen Zusammensetzung bisher nur teilweise charakterisiert wurde (Diamond, Physiologist, 20:10-18 (1977)). Ein Kandidat für die Transmembran-Proteinstränge, Occludin, wurde identifiziert (Furuse et al., J. Membr. Biol., 87:141-150 (1985)).
In einem zytoplasmatischen, unter der Membran liegenden Plaque, der unter den Membrankontakten liegt, wurden sechs Proteine identifiziert, deren Funktion aber noch ermittelt werden muss (Diamond, supra). ZO-1 und ZO-2 liegen als Heterodimer (Gumbiner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:3460-3464 (1991)) in einem Detergenz-stabilen Komplex mit einem nicht charakterisierten 130 kD-Protein (ZO-3) vor. Die meisten Immunelektronenmikroskopie-Studien lokalisierten ZO-1 genau unterhalb der Membrankontakte (Stevenson et al., Molec. Cell Biochem., 83:129-145 (1988)). Zwei weitere Proteine, Cingulin (Citi et al., Nature (London), 333:272-275 (1988)) und das 7H6-Antigen (Zhong et al., J. Cell Biol., 120:477-483 (1993)) sind weiter entfernt von der Membran lokalisiert und wurden noch nicht kloniert. Rab 13, ein kleines GTP-bindendes Protein wurde kürzlich ebenfalls an der Junction-Region lokalisiert (Zahraoui et al., J. Cell Biol., 124:101-115 (1994)). Es ist bekannt, dass weitere kleine GTP-bindende Proteine das corticale Zytoskelett regulieren, d.h. rho reguliert die Actin-Membran-Anheftung in fokalen Kontakten (Ridley et al., Cell, 70:389-399 (1992)) und rac reguliert die Wachstumsfaktor-induzierte Membranauffaltung (Ridley et al., Cell, 70:401-410 (1992)). Auf der Grundlage der Analogie mit den bekannten Funktionen von Plaque-Proteinen in den besser charakterisierten Zell-Junctions, fokalen Kontakten (Guan et al., Nature, 358:690-692 (1992) und Adhärenz-Junctions (Tsukita et al., J. Cell Biol., 123:1049-1053 (1992)) wurde die Hypothese aufgestellt, dass TJ-assoziierte Plaque-Proteine an der Signaltransduktion in beiden Richtungen über die Zellmembran und an der Regulierung von Verbindungen mit dem cortikalen Actin-Zytoskelett beteiligt sind.
Um den vielen unterschiedlichen physiologischen und pathologischen Anforderungen gerecht zu werden, denen Epithelien ausgesetzt sind, muss die ZO zu schnellen und koordinierten Antworten befähigt sein, die das Vorhandensein eines komplexen regulatorischen Systems erfordern. Die genaue Charakterisierung der Mechanismen, die am Zusammenbau und der Regulation der ZO beteiligt sind, ist gegenwärtig ein Gebiet aktiver Forschung.
Es gibt nun eine Vielzahl von Beweisen, dass strukturelle und funktionale TJ-Verknüpfungen zwischen dem Actin-Zytoskelett und dem TJ-Komplex absorptiver Zellen existieren (Gumbiner et al., supra; Madara et al., supra und Drenchahn et al., J. Cell Biol., 107:1037-1048 (1988)). Das Actin-Zytoskelett besteht aus einem komplizierten Netzwerk von Mikrofilamenten, deren genaue Geometrie von einem großen Kader Actin-bindender Proteine reguliert wird. Ein Beispiel dafür, wie der Phosphorylierungszustand eines Actinbindenden Proteins die Zytoskelett-Verknüpfung mit der Zell-Plasmamembran regulieren könnte, ist das myristoylierte Alanin-reiche C-Kinase-Substrat (nachfolgend „MARCKS"). MARCKS ist ein spezifisches Substrat für Proteinkinase C (nachfolgend „PKC"), das mit der zytoplasmatischen Seite der Plasmamembran assoziiert ist (Aderem, Elsevier Sci. Pub.
(UK), Seiten 438-443 (1992)). In seiner nicht-phosphorylierten Form ist MARCKS mit dem Actin der Membran vernetzt. Es ist somit wahrscheinlich, dass das Actin-Netzwerk, das mit der Membran über MARCKS assoziiert ist, relativ rigide ist (Harwig et al., Nature, 356:618-622 (1992)). Aktivierte PKC phosphoryliert MARCKS, das von der Membran freigesetzt wird (Rosen et al., J. Exp. Med., 182:1211-1215 (1990) und Thelen et al., Nature, 351:320-322 (1991)). Das mit MARCKS verknüpfte Actin wird wahrscheinlich von der Membran räumlich getrennt und plastischer. Wenn MARCKS dephosphoryliert wird, kehrt es zur Membran zurück, wo es erneut mit Actin vernetzt wird (Hartwig et al., supra und Thelen et al., supra). Diese Daten legen nahe, dass das F-Actin-Netzwerk über einen PKC-abhängigen Phosphorylierungsprozess umarrangiert werden kann, der Actin-bindende Proteine umfasst (wobei MARCKS eines davon ist).
II. Zonula occludens-Toxin („Zot") und Zonulin
Die meisten Vibrio cholerae-Vakzinkandidaten, die durch Deletion des ctxA-Gens konstruiert wurden, welches das Cholera-Toxin (CT) kodiert, vermögen starke Antikörperantworten auszulösen, aber mehr als die Hälfte der geimpften Personen entwickelt noch schwachen Durchfall (Levine et al., Infect. Immun., 56(1):161-167 (1988)). Angesichts der Stärke des bei Fehlen von CT ausgelösten Durchfalls wurde die Hypothese aufgestellt, dass V. cholerae weitere enterotoxigene Faktoren produziert, die noch in den Stämmen vorhanden sind, bei denen die ctxA-Sequenz deletiert ist (Levine et I., supra). Als Ergebnis davon wurde ein zweites Toxin, Zonula occludens-Toxin (nachfolgend „Zot") entdeckt, das von V. cholerae produziert wird und zu dem verbleibenden Durchfall beiträgt (Fasano et al., Proc. Nat., Acad. Sci., USA, 8:5242-5246 (1991)). Das zot-Gen ist unmittelbar benachbart zu den ctx-Genen lokalisiert. Die hohe prozentuale Übereinstimmung des zot-Gens mit den ctx-Genen innerhalb von V. cholerae-Stämmen (Johnson et al., J. Clin. Microb., 3113:732-733 (1993) und Karasawa et al., FEBS Microbiology Letters, 106:143-146 (1993)) legt eine mögliche synergistische Rolle von Zot bei der Verursachung des akuten, dehydratisierenden Durchfalls nahe, der für Cholera typisch ist. Vor kurzem wurde das Zot-Gen auch in weiteren Pathogenen des Darms identifiziert (Tschape, 2nd Asian-Pacific Symposium on Typhoid fever and other Salmonellosis, 47 (Zusammenfassung) (1994)).
Kürzlich wurde beschrieben, dass Zot die intestinale Permeabilität durch Modulierung der Struktur interzellulärer Tight Junctions erhöht, wenn es auf der Mukosa des Ileums eines Kaninchens getestet wird (Fasano et al., supra). Es wurde festgestellt, dass als Folge der Modifizierung des perizellulären Wegs die intestinale Mukosa durchlässiger wird. Weiterhin wurde festgestellt, dass Zot den Na⁺-Glucose-gekoppelten aktiven Transport nicht beeinflusst, nicht zytotoxisch ist und den transepithelialen Widerstand nicht vollständig aufhebt (Fasano et al., supra).
In neuerer Zeit wurde festgestellt, dass Zot Tight Junctions in der intestinalen Mukosa reversibel zu öffnen vermag und somit bei Verabreichung zusammen mit einem therapeutischen Agens den intestinalen Transport des therapeutischen Agens bewirken kann, wenn es in einer oralen Dosierungszusammensetzung für intestinalen Wirkstofftransport verwendet wird (WO 96/37196, US-Patent 5,827,534 und US-Patent 5,665,389).
Es wurde ebenfalls festgestellt, dass Zot Tight Junctions in der nasalen Mukosa reversibel zu öffnen vermag und somit die nasale Absorption eines therapeutischen Agens zu erhöhen vermag, wenn es zusammen mit einem therapeutischen Agens verabreicht wird (WO 98/30211 und US-Patent 5,908,825).
In den US-Patenten 5,864,014 und 5,912,323 wurden Zot-Rezeptoren von CaCo2-Zellen, Herz-, Darm- und Hirngeweben identifiziert und isoliert. Die Zot-Rezeptoren stellen den ersten Schritt des perizellulären Wegs dar, der an der Regulation der epithelialen intestinalen und nasalen Permeabilität beteiligt ist.
Im US-Patent 5,945,510 wurden Säugetierproteine identifiziert und aufgereinigt, die immunologisch und funktional mit Zot verwandt sind und als der physiologische Modulator von Tight Junctions der Säugetiere fungieren. Diese Säugetierproteine, die als „Zonulin" bezeichnet werden, sind für die Erhöhung der Absorption therapeutischer Agenzien über Tight Junctions intestinaler und nasaler Mukosa ebenso wie über Tight Junctions der Blut-Hirn-Schranke brauchbar. Diese Proteine sind weiterhin durch ihre Fähigkeit charakterisiert, an die Zot-Rezeptoren zu binden.
In der anhängigen US-Patentanmeldung mit der laufenden Nummer 09/127,815, die am 3. August 1998 eingereicht wurde und den Titel „Peptide Antagonists of Zonulin and Methods for Use of the Same" trägt, wurden Peptid-Antagonisten von Zonulin identifiziert. Die Peptid-Antagonisten binden an den Zot-Rezeptor, wirken jedoch nicht in der Weise, dass sie die Öffnungen der Tight Junctions der Säugetiere physiologisch modulieren. Die Peptid-Antagonisten inhibieren kompetitiv die Bindung von Zot und Zonulin an den Zot-Rezeptor, wodurch die Fähigkeit von Zot und Zonulin inhibiert wird, das Öffnen von Tight Junctions in Säugetieren physiologisch zu modulieren.
III. Antigen-präsentierende Zellen und Immunantworten
Für eine vollständige Diskussion von Immunantworten und Immunmodulation wird auf Kapitel 10 „Recent advances in Immunology" von Sztein et al., New Generation of Vaccines, Seiten 99-125, Hrsg. Levine et al., (1997) verwiesen.
Einer der Hauptmechanismen des Schutzes gegen infektiöse Agentien umfasst die spezifische oder erworbene Immunität. Im Gegensatz zur angeborenen Immunität werden die Effektormechanismen der erworbenen Immunität, die unter anderem Antikörper, zytotoxische Lymphozyten (nachfolgend „CTL"), aus T-Lymphozyten stammende Zytokine (beispielsweise IFN-γ, IL-4, usw.) umfassen, durch Kontakt mit Antigenen oder infektiösen Agentien induziert und nehmen mit nachfolgenden Kontakten mit den spezifischen Antigenen an Stärke zu. Diese Fähigkeit, sich an vorausgegangene Kontakte mit Antigenen zu „erinnern" und schnell mit immunologischen Effektor-Antworten erhöhter Stärke zu reagieren (immunologisches Gedächtnis) stellt die Grundlage für immunoprophylaktische Impfungen gegen infektiöse Agentien dar. Die Haupt-Zelltypen, die an spezifischen Immunantworten beteiligt sind, sind T- und B-Lymphozyten.
B-Lymphozyten oder B-Zellen stammen aus dem Knochenmark und sind die Vorläufer Antikörper-sekretierender Zellen (Plasmazellen). B-Zellen erkennen Antigene (Proteine, Kohlenhydrate oder einfache chemische Gruppen) über Immunoglobulin-Rezeptoren auf der Zellmembran (Fearon et al., Science, 272:50-53 (1996), Ziegler-Heitbroack et al., Immunol. Today, 14:121-152 (1993) und Banchereau et al., Adv. Immunol, 52:125-262 (1992)). Ausgelöst durch Antigen kommt es zu deren klonaler Expansion und Umschaltung ihrer Expression des Antikörper-Isotyps (z.B. von IgM auf IgG, IgE oder IgA) unter dem Einfluss von Zytokinen, die von T-Zellen, Makrophagen oder anderen Zelltypen stammen. Somatisch mutierte, hochaffine B-Zellen werden erzeugt und durch Antigen in den und um die Keimzentren herum selektiert, die in den Lymphknoten, der Milz, den Peyers' Patches und weniger organisierten Iymphatischen Aggregaten des peripheren Lymphsystems gebildet werden ((Banchereau et al., (1996) supra, Clark et al., Ann. Rev. Immunol., 9:97-127 (1991) und MacLennan et al., Immunol. Today, 14:29-34 (1993)). Sie stellen die Grundlage für das B-Zell-Gedächtnis dar.
Im Gegensatz zu B-Zellen erkennen T-Lymphozyten oder T-Zellen Peptide, die von Protein-Antigenen stammen, die auf der Oberfläche Antigen-präsentierender Zellen (nachfolgend „APC") in Verbindung mit Molekülen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) der Klasse I oder der Klasse II präsentiert werden. Antigen löst die Proliferation und Entwicklung in Effektorzellen von Klonen von T-Lymphozyten aus, die T-Zell-Rezeptoren (nachfolgend „TCR") geeigneter Affinität exprimieren (Fearon, (1996) supra; Sprent et al., Cell, 76:315-322 (1994) und Hendrick et al., Germain, Fundamental Immunology, 3. Aufl., Seiten 629-676 (1993)). Nach Eliminierung des infektiösen Agens bestehen die Antigenspezifischen Klone als Gedächtnis-T-Zellen weiter, die bei nachfolgenden Kontakten mit Antigen eine stärkere, schnellere und manchmal qualitativ unterschiedliche spezifische Immunantwort bewirken.
Es gibt zwei Hauptpopulationen von T-Zellen, diejenigen, die CD4-Moleküle exprimieren, und diejenigen, die CD8-Moleküle exprimieren. CD4- und CD8-Moleküle sind T-Zell-Oberflächenglycoproteine, die als wichtige akzessorische Moleküle (Co-Rezeptoren) während der Antigenpräsentation fungieren, indem sie an MHC-Moleküle der Klasse II bzw. Klasse I binden (Hendrick et al. supra (1993)). CD4- und CD8-Moleküle spielen somit eine wichtige Rolle bei der Stabilisierung der Wechselwirkungen von T-Zellen und APC, die durch die spezifische Bindung des TCR-Komplexes an antigene Peptide initiiert werden, welche in Verbindung mit MHC-Molekülen präsentiert werden. CD4- und CD8-Moleküle, die ursprünglich vorwiegend als Macker zur Identifizierung von T-Zell-Populationen mit unterschiedlichen funktionellen Eigenschaften verwendet wurden, spielen folglich eine wesentliche Rolle bei der Klasse II-MHC-restringierten und der Klasse I-MHC-restringierten T-Zell-Aktivierung. CD4⁺-Zellen (T-Helfer oder Th-Zellen) spielen hautsächlich bei inflammatorischen Reaktionen eine Rolle und unterstützen die Antikörperproduktion durch B-Zellen, während CD⁺8-Zellen (T-cytotoxische oder Tc-Zellen) den Hauptteil der CTL darstellen, die vorwiegend an durch Klasse I-MHC-restringierter Abtötung von Zielzellen beteiligt sind, welche mit pathogenen Organismen, einschließlich Bakterien, Viren und Parasiten, infiziert sind (Sztein et al., J. Immunol., 155:3987-3993 (1995); Kaufman, Ann. Rev. Immunol., 11:129-163 (1993) und Immunol. Today, 9:168-174 (1988); Townsend et al., Cell, 44:959-968 (1986); Malik et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:3300-3304 (1991); Sedegah et al., J. Immunol, 149:966-971 (1992) und Shearer et al., Immunol. Today 17:21-24 (1996)).
Eine erfolgreiche Antigen-spezifische Aktivierung von T-Zellen, die zu einer T-Zell-Expansion und -Differenzierung (oder Lymphozyten-Proliferation) führt, benötigt ein erstes Signal, das durch die Wechselwirkung von TCR auf der Oberfläche von T-Zellen mit MHC-Antigen-Komplexen auf APC bereitgestellt wird, und ein zweites, komplementäres Signal, das durch lösliche Faktoren, beispielsweise IL-2, oder die Bindung von CD28 (ein costimulatorisches Molekül) an Angehörige der B7-Familie (z.B. CD80 (B7-1) oder CD86 (B7-2)) auf APC bereitgestellt wird (Lenschow, Ann. Rev. Immunol., 14:233-258 (1996) und Linsley et al., Ann. Rev. Immunol., 11:191-212 (1993)). Die Untersuchung des costimulatorischen Wegs über CD28/B7 und weiterer Adhäsionsmoleküle, die zur Stabilisierung von T-Zell/APC-Wechselwirkungen beitragen (und scheinbar auch eine wesentliche Rolle beim Homing von Lymphozyten spielen), ist einer der Schlüsselbereiche, in denen in den vergangenen Jahren wesentliche Fortschritte erzielt wurden.
Die Präsentation von Antigenen gegenüber T-Zellen umfasst eine Reihe intrazellulärer Ereignisse innerhalb der APC, einschließlich der Erzeugung antigener Peptidfragmente, der Bindung dieser Peptide an MHC-Moleküle unter Bildung stabiler Peptid-MHC-Komplexe und des Transports dieser Komplexe zur Zelloberfläche, wo sie vom TCR an der Oberfläche von T-Zellen erkannt werden können. Es haben sich Beweise für die Existenz zweier Hauptwege der Antigenprozessierung und Antigen-Präsentation angesammelt („klassische Wege"). Einer dieser Wege, der „zytosolische Weg", wird überwiegend für die Präsentation von Peptiden benutzt, die endogen in den APC produziert werden, beispielsweise virale Proteine, Tumorantigene und Selbst-Peptide, die mit MHC- Molekülen der Klasse I assoziiert sind (Hendrick et al., supra und Germain, supra (1993)). Die Präsentation einer großen Anzahl von Selbst-Peptiden, die mit MHC-Molekülen der Klasse I komplexiert sind, beruht auf der Unfähigkeit von APC, zwischen Selbst und Nicht-Selbst zu differenzieren. Unter normalen Bedingungen werden die meisten T-Zellen, die auf Erkennung von Selbst-Peptiden selektiert sind, während der Differenzierung der T-Zellen eliminiert oder aktiv herunterreguliert, und können folglich durch Selbst-Peptid-Klasse I-MHC-Komplexe nicht aktiviert werden. Der zweite „klassische Weg" der Antigen-Prozessierung und -Präsentation, der „endosomale Weg", der vorwiegend für die Präsentation löslicher, exogener Antigene verwendet wird, die an MHC-Moleküle der Klasse II gebunden sind, umfasst den Einfang von Antigen durch APC, entweder durch Bindung an einen spezifischen Rezeptor oder durch Aufnahme in die flüssige Phase durch Makropinocytose (Lanzavecchia, Curr Opin. Immunol, 8:348-354 (1996)). Für Influenza-Nukleoproteine wurde eine Auslösung von T-Zellen durch den TCR mit wenigen, bis hinunter zu 200-600 Peptid/MHC-Komplexen gezeigt (Falk et al., Semin. Immunol, 5:81-94 (1993)). Bei den meisten Immunantworten lösen antigene Epitope, die mit MHC-Molekülen der Klasse I assoziiert sind, die Aktivierung von CD8⁺-CTL-Antworten aus, während antigene Fragmente (Epitope), die von löslichen Proteinen stammen und mit MHC-Molekülen der Klasse II komplexiert sind, von CD4⁺-Th-Zellen erkannt werden. Diese Erkenntnisse gehören zu den wichtigsten Beiträgen, die im Lauf der vergangenen wenigen Jahre hinsichtlich der Mechanismen geleistet wurden, die an den frühen Stadien der Immunaktivierung beteiligt sind, und sind wesentlich für die Entwicklung erfolgreicher Vakzine.
Wie oben erwähnt, gibt es zwei „klassische" Wege der Antigen-Prozessierung und -Präsentation. Der Klasse I-MHC-Weg ist der am häufigsten benutzte Weg für die Prozessierung zellulärer, in den meisten, wenn nicht allen zellulären Kompartimenten, einschließlich des Zytosols, des Kerns und der Mitochondrien vorliegenden Proteine (Falk et al., supra (1993)) für die Erkennung durch CD8⁺-CTL. Der Klasse II-MHC-Weg wird vorwiegend für die Prozessierung und Präsentation exogener Antigene benutzt, beispielsweise durch extrazelluläre Bakterien und andere infektiöse Mikroorganismen erzeugte Proteine, die CD4⁺-Th-Zellen präsentiert werden können. Sowohl Klasse I- als auch Klasse II-MHC-Moleküle binden Peptidantigene über Oberflächen-„Rezeptoren" oder „Bindungsspalten". Der Weg der Antigen-Prozessierung und Vorbereitung ist jedoch zwischen den beiden Wegen auf dramatische Weise unterschiedlich. Klasse I-Antigene werden über den „zytosolischen Weg" prozessiert und vorbereitet. Genauer gesagt werden intrazellulär synthetisierte Peptide zu kleinen Proteinfragmente abgebaut, die dann über die Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) transportiert werden. Im ER binden die antigenen Fragmente an Klasse I-MHC-Moleküle unter Bildung eines Komplexes, der dann zum Golgi-Apparat und schließlich an die Zelloberfläche transportiert wird, wo die antigenen Fragmente vom TCR erkannt werden, und Signale für die Antigen-spezifische Expansion und Differenzierung von CTL liefern, den ersten Schritt einer Immunantwort. Klasse II-Antigene werden dagegen über den „endosomalen Weg" prozessiert und vorbereitet. Genauer gesagt werden native Antigene durch zirkulierende APC eingefangen, wobei das Antigen an einen spezifischen oder nicht-spezifischen Rezeptor bindet. Das Antigen wird dann durch die APC über einen Mechanismus Rezeptor-vermittelter Endocytose oder Pinocytose internalisiert. Das internalisierte Antigen befindet sich dann in einem Endosom, einem membrangebundenen Vesikel, das am intrazellulären Transport und dem Abbau des Antigens beteiligt ist. Gespaltene Peptidfragmente binden dann an MHC-Moleküle der Klasse II unter Bildung eines Komplexes, der durch den Golgi-Apparat in das endosomale Kompartiment und an die Zelloberfläche transportiert wird, wo er von TCR erkannt wird, wodurch erneut ein Signal für die Antigen-spezifische Th-Zellexpansion und -differenzierung geliefert wird.
APC spielen eine wesentliche Rolle bei der Erzeugung einer Immunantwort. Für die Präsentation prozessierter Antigene gegenüber CTL in einer Klasse I-restringierten Weise muss die APC MHC-Moleküle der Klasse I exprimieren und in der Lage sein, auf der Zelloberfläche endogen erzeugte Proteine komplexiert an Klasse I-MHC-Moleküle zu exprimieren. Fast alle Zellen, die endogen virale, parasitische oder bakterielle Proteine oder Tumorantigene herstellen, die Zugang zum Zytosol erlangen, können als APC fungieren. Für die Präsentation prozessierter Antigene gegenüber Th-Zellen auf Klasse II-restringierte Weise muss die APC fähig sein, das Antigen über für das bestimmte Antigen spezifische oder nicht-spezifische Rezeptoren zu erkennen und zu binden. Zellen, die Antigene Th-Lymphozyten am effektivsten präsentieren, sogenannte professionelle APC, umfassen dendritische Zellen (DC), Makrophagen, B-Lymphozyten, Langerhans-Zellen und unter bestimmten Umständen menschliche endotheliale Zellen (Lanzavecchia, supra (1996)).
DC, die im Knochenmark entstehen, werden für die effektivsten Zellen für die Präsentation löslicher Antigene gehalten. DC fangen Antigene in der Peripherie ein und wandern zur Milz oder zu Lymphknoten, wo sie die Th-Zellen, insbesondere naive T-Zellen, effektiv aktivieren (Lanzavecchia, supra (1996) und Peters et al., Immunol. Today, 17:273-278 (1996)). Mehrere einzigartige Eigenschaften ermöglichen es den DC, so effektiv als Antigen-präsentierende Zellen zu fungieren. Sie haben insbesondere die Fähigkeit zur Internalisierung löslicher Antigene über mehrere Mechanismen, einschließlich konstitutiver Makropinocytose, der Internalisierung von Antigen-Antikörper-Komplexen über CD32-Rezeptorbindung, und der Internalisierung mannosylierter oder fucosylierter Antigene über Mannose-Rezeptor-Bindung. Dies ermöglicht es den DC, große Flüssigkeitsmengen in kurzen Zeiträumen zu durchmustern, wobei diese in einem lysosomalen Kompartiment angereichert werden, das Klasse-II-MHC-Moleküle und Proteasen enthält. DC exprimieren auch konstitutiv eine Reihe co-stimulatorischer und anderer Adhäsionsmoleküle, die durch proinflammatorische Zytokine, wie beispielsweise IL-1α, IL-1β und TNF-α, hochreguliert werden, wodurch deren Fähigkeit erhöht wird, als APC für Klasse II-MHC-restringierte Th-Immunantworten zu fungieren.
Aufgrund ihrer Fähigkeit, große Teilchen wie beispielsweise Bakterien und Parasiten zu phagozytieren, sind Makrophagen und andere mononukleäre Phagozyten vermutlich die effektivsten APC für Antigene, die von den meisten nicht-viralen pathogenen Mikroorganismen stammen. Unter typischen Bedingungen werden die phagozytierten Mikroorganismen dann in den Phagolysosomen abgetötet und verdaut, was zur Erzeugung antigener Fragmente führt, die für die Bindung an MHC-Moleküle der Klasse II zur Präsentation gegenüber Th-Zellen zur Verfügung stehen. Weitere wichtige Mechanismen, die es den Makrophagen ermöglichen, als effektive APC zu fungieren, umfassen deren Fähigkeit zur Internalisierung löslicher Antigene durch Bindung von Antigen-Antikörper-Komplexen an CD16-, CD32- und CD64-Rezeptoren. Makrophagen internalisieren auch Komplement-beschichtete Proteine über Rezeptoren für C3 und andere C'-Komponenten und nach Stimulierung durch Wachstumsfaktoren durch Makropinocytose. Darüber hinaus exprimieren Makrophagen Rezeptoren für Mannose und stellen eine Hauptquelle für proinflammatorische Zytokine einschließlich 1L-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, TNF-α und TNF-β dar, die starke immunregulatorische Aktivitäten auf T-Zell-Antworten ausüben (Sztein et al., supra (1997)).
B-Lymphozyten sind sehr effektive APC für die Präsentation löslicher Antigene gegenüber Th-Zellen. Dies beruht weitgehend auf deren Fähigkeit zur sehr effizienten Bindung und Internalisierung spezifischer löslicher Antigene über den B-Zell-Rezeptorkomplex (BCR), der aus dem spezifischen Membran-Immunoglobin (mIg) und dem Igα (CD79α)-Igβ (CD79β)-Heterodimer besteht (Falk et al., supra (1993)).
Von Knochenmarksvorläufern stammende Langerhans-Zellen (LC) werden als die einzigen in der Epidermis vorliegenden Zellen mit APC-Fähigkeiten angesehen. LC wandern aus der Epidermis über das Lymphsystem in die regionalen Lymphknoten, wo sie sich zu DC entwickeln. Interessanterweise exprimieren LC CD1, ein nicht-klassisches MHC-Molekül, das in einer restringierten Weise Nicht-Protein-Antigene wie beispielsweise mikrobielle Lipide und Glykolipid-Antigene T-Zellen zu präsentieren vermag.
Die vorliegende Erfindung konzentriert sich auf die Antigen-spezifische Herunterregulierung APC-vermittelter Immunantworten. Die Erfindung beruht auf der Entdeckung eines Oberflächenrezeptors von Makrophagen, an den Zot auf spezifische und der Sättigung unterliegende Weise bindet. Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Verwendung von Zot oder Zonulin als Antigen-spezifische Immunregulatoren und in der Immuntherapie. Genauer gesagt inhibieren sowohl Zot als auch Zonulin die APC-vermittelte Antigen-spezifische Lymphozytenproliferation in einer dosisabhängigen Weise, ohne die Mitogen-induzierten Antworten zu beeinflussen. Diese Herunterregulierung der Immunantwort ist wenigstens teilweise mit einer verringerten Aufnahme von Antigen verbunden.
Gegenwärtig verfügbare Modulatoren von Immunantworten, wie beispielsweise Cyclosporin und Steroidverbindungen, üben einen allgemeinen Effekt auf die Antigen- und Mitogenstimulierungen des Immunsystems aus (Reed et al., J. Immunol., 137:150-154 (1986)). Die hier offenbarte Erfindung eröffnet den Vorteil, dass die Herunterregulierung von Immunantworten gegen ein bestimmtes Antigen ermöglicht wird, ohne negative Nebeneffekte zu induzieren, beispielsweise eine erhöhte Anfälligkeit für Infektionen oder eine allgemeine Immunsuppression, die für Immunmodulatoren nach dem Stand der Technik typisch sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, in vitro die Fähigkeit Antigen-präsentierender Zellen (APC) zur Prozessierung und Präsentation von Antigenen gegenüber Lymphozyten zu inhibieren, wodurch die Proliferation der Lymphozyten unterdrückt wird.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 stellt die Zot-FITC-Sättigungsbindungskurven für Lymphozyten und Makrophagen dar. Die Daten zeigen, dass Zot vorzugsweise an menschliche Monozyten/Makrophagen bindet.
2 stellt die Blockierung der Zot-FITC-Bindung durch nicht-markiertes Zot dar. Eine Präinkubation von PBMC mit nicht-markiertem Zot verringert die Bindung von Zot-FITC sowohl an Monozyten/Makrophagen als auch an T-Lymphozyten um etwa 33 %, was nahe legt, dass die Zot-Bindung an diese Zellen rezeptorvermittelt erfolgt. Die Präinkubation von Zellen mit aufgereinigtem MBP beeinflusst die Blockierung der Zot-FITC-Bindung nicht, was zeigt, dass die Blockierung mit nicht-markiertem Zot ein spezifisches Phänomen ist.
3 zeigt die Effekte von Zot auf die durch PHA und Tetanus-Toxoid induzierte Proliferation menschlicher PBMC. Die Daten zeigen, dass Zot die durch Tetanus-Toxoid induzierte Proliferation in dosisabhängiger Weise deutlich unterdrückt, während es keinen Effekt auf die durch pH induzierte Proliferation hat.
4 zeigt die Effekte von anti-Zot-Antiserum auf die Zot-induzierte Unterdrückung der durch Tetanus-Toxoid induzierten Proliferation menschlicher PBMC. Eine Zugabe von anti-Zot kehrt die durch Zot vermittelte Unterdrückung Tetanus-Toxin-induzierter Proliferation zu mehr als 50 % um.
Die 5A-5D zeigen den Effekt von Zot auf die Aufnahme von FITC-Dextran durch normale menschliche CD14⁺HLA-DR⁺-Makrophagen. 5A zeigt die Aufnahme von FITC-Dextran in Medien bei 0 °C (2,9 %) und stellt die Temperaturabhängigkeit der Antigen-Aufnahme dar. 5B zeigt die Aufnahme von FITC-Dextran in Medium bei 37 °C (46,0 %) und stellt eine Kontrolle für die Antigenaufnahme dar. 5C zeigt die Aufnahme von FITC-Dextran in BSA bei 37 °C (39,0 %) und stellt eine Negativkontrolle der Antigenaufnahme dar. 5D zeigt die Aufnahme von FITC-Dextran in Zot bei 37 °C (19,3 %). Die Daten zeigen, dass Zot die Aufnahme von Antigen verringert.
6 stellt die Zahl der Bindungsstellen/Zelle für FITC-Zot bei menschlichen Makrophagen und Lymphozyten dar. PBMC wurden mit steigenden Konzentrationen von Zot-FITC inkubiert und über Durchflusszytometrie analysiert. Die durchschnittliche Fluoreszenzintensität jeder Population nach Inkubation mit Zot-FITC wurde unter Verwendung einer mit dem Quantum 26 MESF-Kit erstellten Standardkurve in die Zahl von Zot-Bindungsstellen/Zelle umgewandelt. Diese Daten zeigen, dass die Bindung von Zot ein Phänomen ist, das der Sättigung unterliegt, wobei Sättigung bei etwa bei 0,5 pM erreicht wird, und dass die durchschnittliche Zahl von Zot-Bindungsstellen/Zelle in Makrophagen (∼ 106.000) etwa 10-fach höher ist als in Lymphozyten (∼ 9.000).
Die 7A-7C zeigen die Kinetik der Bindung von Zot an menschliche Makrophagen und Lymphozyten. Die Bestimmung der Kinetik der Bindung von Zot an menschliche Zellen erfolgte über Durchflusszytometrie unter Verwendung von Zot-FITC-Konjugaten. Mit anti-CD3-ECD- und anti-CD14-PE-mAb markierte PBMC wurden für die Dauer des Experiments (12 min) bei 37 °C gehalten, während die Daten über ein Gerät für lebensfähige Proben (Kinetik-Modul) erfasst wurden, das an das Durchflusszytometer angeschlossen war. Basiswerte für die FITC-Fluoreszenz wurden 90-150 Sekunden erfasst (durch die Pfeile gekennzeichnet) und die Datenerfassung dann ∼10-15 s unterbrochen, um Zot-FITC zu injizieren (7A und 7B). 7C zeigt die Kinetik der Bindung von anti-CD14-FITC an nicht-markierte menschliche Monozyten/Makrophagen. Die Daten sind als isometrische Darstellungen der Zot-FITC-Intensität (y-Achse) gegen die Zeit (x-Achse) und gegen die Zellzahl (z-Achse) für Zellen gezeigt, die im Fenster von CD3 (Lymphozyten) oder CD14 (Makrophagen) lagen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Bindung von Zot an menschliche Makrophagen (7A) und Lymphozyten (7B) sehr schnell erfolgt, wobei ein Gleichgewicht innerhalb von 2 min nach Zugabe von Zot-FITC erreicht wird.
8 zeigt die Bindung von FITC-Zot an menschliche T- und B-Lymphozyten. PBMC wurden inkubiert mit Zot-FITC und mAb gegen Moleküle, die in T (CD3⁺)- und B (CD19⁺)-Lymphozyten vorliegen, und über Durchflusszytometrie analysiert. Ein isotopischer FITC-markierter Kontroll-mAb (mIg) entsprechend Zellen im Fenster der Lymphozyten gemäß Vorwärts-gegen-Seitwärtsstreuung ist als Indikator nicht-spezifischer Bindung ebenfalls gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass Zot sowohl an T- als auch an B-Lymphozyten bindet.
9 zeigt, dass Zot-Antagonisten nicht in der Lage sind, die Bindung von Zot-FITC zu blockieren. Mit CD14-PE und CD3-ECD markierte PBMC wurden gewaschen und 15 min bei 4 °C in AIM-V-Medium ohne Zusatz oder unter Zugabe eines 100-fachen Überschusses von FZI/0 (SEQ ID NO:7), FZI/1 (SEQ ID NO:8), BSA (Negativkontrolle) oder eines 4-fachen Überschusses von nicht-markiertem Zot (Positivkontrolle) inkubiert. Die Zellen wurden dann mit Zot-FITC inkubiert und über Durchflusszytometrie analysiert. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als %-Unterdrückung der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität von Zellen, die mit Zot-FITC in Gegenwart von Zot-Antagonisten, nicht-markiertem Zot oder BSA inkubiert wurden, bezogen auf die durchschnittliche Fluoreszenzintensität von Zellen, die nur in Medium inkubiert wurden (der willkürlich ein Wert von 100 % zugeordnet wurde). Die Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe entweder von FZI/0- oder FZI/1-Zot-Antagonisten die Bindung von Zot-FITC an Makrophagen im Fenster von CD14⁺ nicht signifikant blockierte. Im Gegensatz dazu blockierte die Präinkubation mit nicht-markiertem Zot die Bindung von Zot-FITC um 24-43 %.
Die 10B-10B stellen die Zot-bedingte Unterdrückung der Expression von CD14 auf menschlichen Monozyten/Makrophagen dar. PBMC wurden 18 h bei Fehlen oder in Gegenwart von TT ohne oder mit aufgereinigtem Zot oder BSA inkubiert, mit CD14-FITC markiert und über Durchflusszytometrie analysiert. Die Ergebnisse sind als Einzelfarben-Histogramme der CD14-Fluoreszenz auf Zellen gezeigt, die auf der Grundlage der Vorwärtsstreuung-gegen-Seitwärtsstreuung-Eigenschaften menschlicher Makrophagen dem Fenster der „Monozyten-Region" entsprechen. Die Zugabe von Zot bewirkte eine deutliche Unterdrückung der Expression von CD14 bei Fehlen von TT (10A) oder in Gegenwart von TT (10B).
11 zeigt die Effekte von Zot auf die Lebensfähigkeit menschlicher Monozyten/Makrophagen und Lymphozyten. PBMC wurden für unterschiedliche Zeiträume bei Fehlen oder in Gegenwart von aufgereinigtem Zot oder BSA inkubiert. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch den Propidiumiodid-Ausschlusstest und Durchflusszytometrie bestimmt. Die Ergebnisse sind dargestellt als % lebensfähige Zellen im Fenster der „Monozytenregion" oder „Lymphozytenregion", die auf der Grundlage der Vorwärtsstreuung-gegen-Seitwärtsstreuung-Eigenschaften dieser Zellpopulationen definiert sind. Die Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe von Zot die Lebensfähigkeit von Makrophagen zu relativ frühen Zeitpunkten beeinflusst, während Effekte auf Lymphozyten nicht vor einer Kultivierungsdauer von wenigstens 4 Tagen zutage traten.
Die 12A-12C zeigen die durch Zot vermittelte Induktion von Zytokin-Produktion durch menschliche Monozyten/Makrophagen. PBMC wurden 6 h bis 4 Tage bei Fehlen oder in Gegenwart von aufgereinigtem Zot oder BSA inkubiert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Überstände gesammelt und die Zytokin-Konzentrationen über Chemilumineszenz-ELISA gemessen. Bereits zu frühen Zeitpunkten wie 6 Stunden führte die Zugabe von Zot zur Produktion hoher Konzentrationen von TNFα (12A) und IL-10 (12C), wobei Spitzenwerte bei 24 h erreicht wurden. Eine schwache Induktion der Produktion von IL-1β wurde ebenfalls beobachtet (12B).
Die 13A-13B zeigen die durch Zot vermittelte Induktion von Zytokin-Produktion durch menschliche Lymphozyten. PBMC wurden drei Tage ohne oder mit TT bei Fehlen oder in Gegenwart von aufgereinigtem Zot oder BSA inkubiert und die Zytokin-Konzentrationen in den Überständen über Chemilumineszenz-ELISA gemessen. Die Zugabe von Zot führte zur Unterdrückung der durch Inkubation mit TT induzierten Produktion von IL-2, während bei Fehlen von TT keine messbaren Konzentrationen von IL-2 durch Zot induziert wurden (13A). Im Gegensatz dazu induzierte die Zugabe von Zot in beständiger Weise die Produktion von IFN-γ bei Fehlen von TT in ähnlichen Konzentrationen, wie sie durch TT induziert wurden, und steigerte deutlich die Konzentration von IFN-γ, die durch TT induziert wurden. (13B).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Frühere Untersuchungen konzentrierten sich auf die Fähigkeit von Zot und Zonulin, die Öffnung der Tight Junctions (oder Zonula occludens) von Epithelien verschiedener Gewebe von Säugetieren physiologisch zu modulieren, wobei eine solche Modulation insbesondere brauchbar ist, um einen Wirkstofftransport über diese Membranen hinweg zu erleichtern. Im Laufe dieser Untersuchung wurden Rezeptoren für Zot und Zonulin identifiziert und aus CaCo2-Zellen, Herz-, Darm- und Hirngewebe isoliert. Zusätzlich zur Entdeckung von Zot-Rezeptoren wurden Peptid-Antagonisten von Zonulin identifiziert, wobei diese Peptid-Antagonisten an den Zot-Rezeptor binden und dennoch nicht in der Weise wirken, dass sie die Öffnung von Tight Junctions bei Säugetieren physiologisch modulieren (d.h. ihnen fehlt eine biologische Aktivität). Die Peptid-Antagonisten inhibieren kompetitiv die Bindung von Zot und Zonulin an den Zot-Rezeptor, wobei die Fähigkeit von Zot und Zonulin zur Regulierung der Tight Junctions inhibiert wird.
Angesichts des bekannten Effekts von Zot und Zonulin auf den parazellulären Weg war es in der Tat überraschend, einen Rezeptor für Zot auf vollständig ausdifferenzierten, aus Blut isolierten Makrophagen zu finden. Anfänglich war es unklar, warum zirkulierende Zellen wie Makrophagen einen Rezeptor für ein Molekül haben sollten, das mit der Gewebezellmodulation in Zusammenhang steht. Beim Suchen einer Antwort auf diese Frage wurde entdeckt, dass Zot und Zonulin auch die Fähigkeit haben, die Aktivität von Makrophagen physiologisch zu regulieren. Obwohl keine Festlegung auf eine Theorie beabsichtigt ist, scheint es, dass Zot den Rezeptor auf dem Makrophagen blockiert, wobei der Oberflächenrezeptor auf dem Makrophagen auf spezifische und einer Sättigung unterliegenden Weise gebunden wird. Durch Bindung an Makrophagen verändert Zot die Fähigkeit der Makrophagen, ein Antigen zu prozessieren und gegenüber Lymphozyten zu präsentieren, wodurch letztlich die Proliferation von Lymphozyten als Reaktion auf das Antigen in einer dosisabhängigen und Antigen-spezifischen Weise unterdrückt wird. Mit anderen Worten, Zot ermöglicht eine Antigen-spezifische Herunterregulierung einer Immunantwort. Die Ergebnisse, die nachfolgend detailliert beschrieben werden, legen den Schluss nahe, dass diese Herunterregulierung der Immunantwort wenigstens zum Teil mit der verringerten Aufnahme von Antigen in Zusammenhang steht. Es scheint, dass Zot ein multifunktionales Protein ist, das die Immunantwort über einen dualen Mechanismus der Regulierung der Aufnahme und des Transports von Antigenen kontrolliert.
Zonula occludens-Toxin oder „Zot" wird von V. cholerae produziert. Der jeweilige V. cholera-Stamm, aus dem Zot stammt, ist für die vorliegende Erfindung nicht wesentlich. Beispiele solcher V. cholerae-Stämme umfassen die Stämme 569B, 395 und E7964 (Levine et al. supra, Johnson et al., supra und Karasawa et al, supra).
„Zot" bedeutet hier das reife Protein mit 399 Aminosäuren ebenso wie Mutanten davon, welche die Fähigkeit zur Regulierung von TJ beibehalten. Beispielsweise kann eine N-terminale Deletion der Aminosäuren 1-8 vorgenommen werden, ohne die Zot-Aktivität zu beeinflussen und N-terminale Fusionsproteine von Zot können erzeugt werden, ohne die Zot-Aktivität zu beeinflussen. Wie hier beschrieben, können solche Mutanten einfach durch ortsspezifische Mutagenese erzeugt und auf Zot-Aktivität gescreent werden.
Zot kann beispielsweise von genetisch modifizierten E. coli-Stämmen erhalten und aufgereinigt werden, die das zot-Gen überexprimieren (Baudry et al., Infect. Immun. 60:428-434 (1992)), wobei dieses alleine vorliegt oder mit anderen Genen fusioniert ist, beispielsweise dem Maltose-Bindungsprotein (siehe Beispiel 1 unten), Glutathion-S-Transferase (siehe Beispiel 2 unten) oder 6-Polyhistidin (siehe Beispiel 2 unten).
Der Begriff „Zonulin" bedeutet hier ein im Wesentlichen reines, biologisch aktives Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 47 kDa gemäß SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und der folgenden N-terminalen Aminosäuresequenz: Asn Asp Gln Pro Pro Pro Ala Gly Val Thr Ala Tyr Asp Tyr Leu Val Ile Gln (SEQ ID NO:1) oder der folgenden N-terminalen Aminosäuresequenz: Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Xaa Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu (SEQ ID NO:2), ebenso wie Mutanten davon, welche die Fähigkeit zur Bindung an den Rezeptor für Zot und die Fähigkeit zur Regulation von TJ beibehalten.
Zonulin wird in verschiedenen Zellen und Geweben von Säugetieren produziert oder in diesen gefunden, z.B. Zellen/Geweben des Kaninchens oder des Menschen. Die spezifische Zell-/Gewebeart von Säugetieren, aus der Zonulin stammt, ist für die vorliegende Erfindung nicht wesentlich. Beispiele solcher Gewebetypen von Säugetieren umfassen Herz, Lunge, Darm, Leber, Hirn, Niere und Bauchspeicheldrüse.
Zonulin kann erhalten und aufgereinigt werden, z.B. über Affinitätsreinigungs-Chromatographie unter Verwendung von anti-ZOT-Antikörpern, wie in Beispiel 3 des US-Patents 5,945,510 beschrieben.
Die Begriffe „Zot-verwandter Immunregulator" oder „Zot-verwandtes immunregulierendes Molekül" beziehen sich auf Zot oder Zonulin wie oben definiert. Weiterhin bedeutet der Begriff „Inhibierung" (und „inhibiert" und „inhibierend") hier die Herunterregulierung irgendeines Aspekts der Aktivität von APC, der zu einer wesentlichen Verringerung der Lymphozytenproliferation führt. Beispiele für Aktivitäten umfassen Antigenaufnahme, Antigenprozessierung und Antigenpräsentation. Der Begriff „Inhibierung" bedeutet hier nicht notwendigerweise eine vollständige Unterdrückung der Funktion oder des Ergebnisses. Eine teilweise Inhibierung ist ebenfalls von dem Begriff umfasst.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Antigen-spezifische Herunterregulierung der Immunantwort in vitro. Wie oben erläutert, umfasst eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Zot-verwandten Immunregulators (Zot oder Zonulin) alleine oder in Kombination mit einem spezifischen Antigen, wobei die Antwort der Lymphozyten auf das Antigen in dosisabhängiger Weise spezifisch unterdrückt wird. Aus den Ergebnissen, deren Details hier vorgestellt werden, wird deutlich, dass die vorliegende Erfindung auf solche Antigene gerichtet ist, die von Antigenpräsentierenden Zellen (APC) prozessiert und präsentiert werden, wobei eine Vermittlung durch Makrophagen erforderlich ist. Die Erfindung betrifft alle APCs einschließlich Makrophagen und anderer mononukleärer Phagozyten, dendritischer Zellen, B-Lymphozyten, Langerhans-Zellen und menschlicher endothelialer Zellen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die APC ein Makrophage.
Die vorliegende Erfindung kann in in vitro-Umgebungen verwendet werden. Der einzige wesentliche Punkt ist die Verabreichung an tierische Zellen in einer Zellkultur. Tierische Zellen sind definiert als kernhaltige, Chloroplasten-freie Zellen, die multizellulären Organismen, deren taxonomische Stellung innerhalb des Reichs der Animalia liegt, einer primären Zellkultur, einer Explantat-Kultur oder einer transformierten Zelllinie entstammen oder darin vorliegen.
Der genaue Modus und das genaue Verfahren der Verabreichung sind für die Erfindung nicht wesentlich. Der einzige wesentliche Punkt besteht darin, dass sowohl das Zot-verwandte immunregulierende Molekül als auch das Antigen den Makrophagen intakt erreichen. Bei der vorliegenden Erfindung kann das Zot-verwandte, immunregulierende Molekül zusammen mit dem Antigen verabreicht werden. Alternativ können die beiden nacheinander verabreicht werden. Obwohl sich die Diskussion auf die Verabreichung eines einzelnen Antigens beschränkt, ist es weiterhin offensichtlich, dass mehr als ein Antigen verabreicht werden kann, wobei die Immunantworten auf mehr als ein Antigen nachfolgend gleichzeitig herunterreguliert werden.
Eine wirksame Menge eines Zot-verwandten Immunregulators, beispielsweise Zot oder Zonulin bedeutet hier eine Menge, welche die Aktivität der Antigen-präsentierenden Zelle wirksam herunterreguliert, wodurch die durch Antigen-präsentierende Zellen vermittelte Lymphozytenproliferation wirksam herunterreguliert wird.
Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung und sollen den Umfang der vorliegenden Erfindung in keiner Weise beschränken.
BEISPIEL 1
Bindung von FITC-markiertem Zot an Lymphozyten und Makrophagen
A. MATERIALIEN UND METHODEN
Isolierung menschlicher mononukleärer Zellen des peripheren Blutes (PBMC) gesunder Freiwilliger
PBMC wurden von gesunden Freiwilligen durch Dichtegradientenzentrifugation über Lymphozyten-Abtrennungsmedium (LSM, Organon-Teknika, Durham, NC) isoliert. Die Spender waren Erwachsene und erteilten informierte Zustimmung zur Blutabnahme. Die verwendeten PBMC waren frisch oder wurden in Aliquots unterteilt und in RPMI eingefroren, das 10 % (v/v) FCS und 10 % (v/v) DMSO enthielt, wobei eine Einfriervorrichtung mit kontrollierter linearer Geschwindigkeit (1 °C pro min, Planner Biomed, Salisbury, England) verwendet wurde, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten und die Wiedergewinnungsrate der Zellen zu maximieren. Die Zellen wurden bis zur Verwendung in flüssigem Stickstoff gelagert. In einigen Experimenten wurden die Zellen unmittelbar nach der Isolierung verwendet.
Herstellung von aufgereinigtem ZOT-MBP
Nach Kultivierung des V. cholerae-Stammes CVD110 (Michalski et al., Infect. Immun., G1:4462-4468 (1993)), der mit dem Plasmid pZ14 transformiert worden war, wurden 5000 ml der erhaltenen Überstand-Fraktion 1000-fach über einen Laminarflussfilter mit einer Molekulargewichtsausschlussgrenze von 10 kDa aufkonzentriert. Die Konstruktion von pZ14, der das zot-Gen von Vibrio cholerae enthält, ist inter alia detailliert in der WO 96/37196 beschrieben. Der erhaltene Überstand wurde dann einer Gelelektrophorese mit einem 8,0 % (g/v) SDS PAGE unterzogen. Proteinbanden wurden durch Färbung des SDS-PAGE-Gels mit Coomassie-Blau nachgewiesen. Bei Vergleich mit einem Kontrollüberstand des mit dem Plasmid pTTQ181 (Amersham, Arlington Heights, IL) transformierten Stammes CVD110 und Behandlung auf dieselbe Weise war keine Proteinbande nachweisbar, die Zot entspricht. Obwohl das zot-Gen hinter dem hochinduzierbaren und starken tac-Promotor in pZ14 angeordnet war, war somit die Konzentration des Proteins in dem 1000-fach aufkonzentrierten pZ14-Überstand über das Coomassie-gefärbte SDS-PAGE-Gel immer noch nicht nachweisbar.
Zur Erhöhung der hergestellten Menge von Zot wurde das zot-Gen somit im Leserahmen mit dem Maltose-Bindungsprotein (nachfolgend „MBP")-Gen fusioniert, um ein MBP-Zot-Fusionsprotein zu erzeugen.
Der MBP-Vektor pMAL-c2 (Biolab) wurde zur Expression und Aufreinigung von Zot durch Fusion des zot-Gens mit dem malE-Gen von E. coli verwendet. Dieses Konstrukt verwendet den starken, induzierbaren tac-Promotor, und die Translationsinitiierungssignale von malE für eine starke Expression des klonierten zot-Gens. Der Vektor pMAL-c2 weist eine genaue Deletion der malE-Signalsequenz auf, die zu zytoplasmatischer Expression des Fusionsproteins führt. Für eineleichtere Isolierung des Fusionsproteins wurde eine Affinitätschromatographie-Aufreinigung für MBP verwendet (Biolab).
Genauer gesagt linearisierte man den Vektor pMAL-c2 mit EcoRI (welches am 3'-Ende des malE-Gens schneidet), füllte mit Klenow-Fragment auf, und verdaute mit XbaI (für das eine einzige Schnittstelle in dem pMAL-c2-Polylinker vorliegt). Der orf, welcher für ZOT kodiert, wurde aus dem Plasmid pBB241 subkloniert (Baudry et al., Infect. Immun., 60:428-434 (1992)). Man verdaute das Plasmid pBB241 mit BssHII, füllte mit Klenow-Fragment auf und verdaute mit XbaI. Dann subklonierte man das XbaI-Fragment mit stumpfen Enden in pMAL-c2, wodurch man das Plasmid pLC10-c erhielt. Da sowohl das Insert als auch der Vektor stumpfe und klebrige Enden aufwiesen, erhielt man die korrekte Orientierung mit dem 3'-Ende von malE, das mit dem 5'-Terminus des Inserts fusioniert war. pLC10-c wurde dann durch Elektroporation in den E.coli-Stamm DH5a überfragen. In pBB241 liegt die BssHII-Restriktionsstelle innerhalb des orf von zot. Die Aminosäuren 1-8 von ZOT fehlen somit in dem MBP-ZOT-Fusionsprotein.
Zur Aufreinigung des MBP-ZOT-Fusionsproteins beimpfte man 10 ml Luria Bertani-Nährlösung, die 0,2 % (g/v) Glucose und 100 μm/ml Ampicillin enthielten, mit einer einzelnen, pLC10-c enthaltenden Kolonie und inkubierte unter Schütteln über Nacht bei 37 °C. Man verdünnte die Kultur 1:100 in 1,0 ml des gleichen frischen Mediums und kultivierte unter Schütteln bei 37 °C, bis eine Zelldichte von etwa 1,0 × 10⁸ Zellen/ml erreicht wurde. Zur Induzierung der Expression von MBP-Zot gab man dann 0,2 mM IPTG zu und inkubierte die Kultur weitere 3 h bei 37 °C. Danach pelletierte man die Bakterien und resuspendierte sie in 20 ml eiskaltem „Säulenpuffer", der 20 mM Tris-HCl, 0,2 M NaCl, 1,0 mM EDTA, 10 mM 2-ME und 1,0 mM NaN₃ enthielt. Man lysierte die Bakteriensuspension durch Behandlung in einer „French Press" und zentrifugierte 30 min mit 13.000 × g bei 4 °C. Man sammelte den Überstand, verdünnte 1:5 mit Säulenpuffer und belud damit eine 1 × 10 Säule eines Amyloseharzes (Biolabs, MBP-Fusion Purification System), das zuvor mit Säulenpuffer äquilibriert worden war. Nach Waschen der Säule mit 5 Volumina Säulenpuffer eluierte man das MBP-ZOT-Fusionsprotein durch Auftragen von 10 ml 10 mM Maltose in Säulenpuffer. Die typische Ausbeute aus 1,0 ml Kulturlösung betrug 2-3 mg Protein.
Man spaltete dann den MBP-Fusionspartner des aufgereinigten MBP-Zot-Fusionsproteins unter Verwendung von 1,0 μg Faktor Xa Protease (Biolabs) pro 20 μm MBP-Zot ab. Faktor Xa Protease spaltet unmittelbar vor dem Amino-Terminus von Zot. Man trennte das auf diese Weise erhaltene Zot-Protein auf einem 8,0 % (g/v) SDS-PAGE-Gel auf und gewann es unter Verwendung einer Elektroseparationskammer (Schleicher & Schuell, Keene, NH) durch Elektroelution aus dem Gel.
Beim Austesten in Ussing-Kammern induzierte das erhaltene, aufgereinigte Zot eine dosisabhängige Abnahme von Rt, wobei der ED₅₀ 7,5 × 10^–8 M betrug.
Koniugation von ZOT-MBP mit Fluoresceinisothiocyanat (ZOT-FITC)
Die Konjugation von Zot-MBP mit FITC erfolgte über Standardverfahren. Kurz zusammengefasst dialysierte man ZOT-MBP 8 h bei 4 °C zur Anhebung des pH auf 9,0 gegen 500 ml FITC-Markierungspuffer, der 0,1 M Bicarbonatpuffer (z.B. 0,09 M NaHCO₃ + 0,0085 M Na₂CO₃), enthielt, mit konzentriertem NaOH auf pH 9,0 eingestellt und bei 4 °C aufbewahrt worden war. Danach gab man für jedes Milligramm MBP-ZOT 10 μl 5,0 mg/ml FITC in DMSO zu und inkubierte anschließend über Nacht bei 4 °C in PBS. Nicht-gebundenes FITC entfernte man dann durch Dialyse in 500 ml Dialysepuffer bei 4 °C mit zwei- oder dreimaligem Auswechseln im Verlauf von 2 Tagen, wobei der Dialysepuffer PBS enthielt (pH 7,4) und bei 4 °C aufbewahrt wurde. Diese Präparation wurde bis zum Gebrauch bei 4 °C aufbewahrt.
Bindung von FITC-ZOT an menschliche PBMC und Analyse über Durchflusszytometrie
Wie oben beschrieben isolierte PBMC inkubierte man 60 min bei 37 °C mit zunehmenden Konzentrationen Zot-FITC in silikonisierten Röhrchen (um die Bindung von Makrophagen an die Wände der Teströhrchen zu verhindern) in Gegenwart monoklonaler Antikörper gegen CD14, die mit Phycoerythrin (PE) konjugiert waren, und monoklonaler Antikörper gegen CD3, die mit ECD (Energie-gekoppeltem Farbstoff, einem PE-Texas-Rot-Konjugat) konjugiert waren. CD14 ist ein Marker für menschliche Monozyten/Makrophagen, während CD3 ein Marker für T-Lymphozyten ist. Die Verwendung dieser Fluorochrome (z.B. FITC, PE und ECD) ermöglichte durch 3-Farben-Durchflusszytometrie die gleichzeitige Untersuchung der Bindung von ZOT an Monozyten/Makrophagen und T-Lymphozyten in gemischten PBMC-Populationen. Man wusch die Zellen dann zweimal mit PBS (pH 7,2), das 1,0 % (g/v) BSA und 0,1 % Natriumazid enthielt und analysierte sofort durch Durchflusszytometrie unter Verwendung eines Epics Elite Durchflusszytometer/Zellsortierer-Systems.
In diesen Experimenten wurden Fluorochrom-markierte mAbs derselben Isotypen, aber mit irrelevanter Spezifität als Kontrollen verwendet. Man schloss Plättchen, Erythrozyten (falls vorhanden) und Zelldebris von der Analyse aus, indem ein geeignetes Fenster auf die Vorwärts-gegen-90 %-Lichtstreuung-Parameter gesetzt wurde. Für jede Probe erfasste man Daten von mehr als 10.000 Zellen. Die Datenanalyse erfolgte über das Epics Elite-Analyse-Softwarepaket (Coulter) oder das WinList „list-mode"-Analyse-Softwarepaket (Verity Software House, Topsham, ME).
B. Ergebnisse
Ein repräsentatives Experiment, das die Durchflusszytometrieanalyse der Zot-FITC-Bindung an menschliche T-Lymphozyten (CD3⁺) und Monozyten/Makrophagen (CD14⁺) zeigt, ist in 1 dargestellt. Wie aus den durchschnittlichen Fluoreszenzintensitätsgraden ersichtlich ist, zeigen die Ergebnisse, dass die Bindung von Zot-FITC bei Monozyten/Makrophagen um ein Mehrfaches höher ist als bei T-Lymphozyten. Weiterhin führt die Zugabe ansteigender Mengen von Zot-FITC zu einer verstärkten Bindung, die nach Zugabe von 40-60 μl Zot-FITC abzuflachen beginnt. Diese Ergebnisse zeigen, dass Zot vorzugsweise an menschliche Monozyten/Makrophagen bindet.
Anschließend wurde die Bindung von Zot-FITC an menschliche Monozyten/Makrophagen und Lymphozyten in Gegenwart von nicht-markiertem Zot untersucht, um zu bestimmen, ob das nicht-markierte Zot die Bindung blockieren kann. Wie in 2 gezeigt, verringerte die 30minütige Präinkubation von PBMC bei 37 °C mit 100 μl nicht-markiertem Zot und die anschließende 30minütige Zugabe von Zot-FITC (10 μl) bei 37 °C die Bindung von Zot-FITC um ∼33 % sowohl an Monozyten/Makrophagen als auch an T-Lymphozyten, was den Schluss nahe legt, dass die Bindung von Zot an diese Zellen rezeptorvermittelt erfolgt. Präinkubation von Zellen mit 100 μl aufgereinigtem MBP und anschließende 30minütige Zugabe von ZOT-FITC (10 μl) bei 37 °C hatte keinen Effekt auf die Blockierung der Bindung von Zot-FITC, was zeigt, dass die Blockierung mit nicht-markiertem Zot ein spezifisches Phänomen ist.
BEISPIEL 2
Proliferative Antworten menschlicher mononukleärer Zellen auf Mitogene und Antigene
A. Materialien und Methoden
Isolierung menschlicher mononukleärer Zellen des peripheren Blutes (PBMC) gesunder Freiwilliger
PBMC wurden durch Dichtegradientenzentrifugation über Lymphozytenauftrennungsmedium (LSM, Organon-Teknika, Durham, NC) von gesunden Freiwilligen isoliert. In Übereinstimmung mit dem Prüfungsausschuss der Universität von Maryland, Baltimore, waren die Spender Erwachsene und gaben informierte Zustimmung zur Blutabnahme. Die verwendeten PBMC waren frisch geerntet oder wurden allquotiert und in 10 % (v/v) FCS und 10 % (v/v) DMSO enthaltendem RPMI unter Verwendung einer Einfriervorrichtung mit kontrollierter linearer Geschwindigkeit (1 °C pro Minute, Planner Biomed, Salisbury, England) eingefroren, um die Zelllebensfähigkeit zu erhalten und die Wiedergewinnungsrate der Zellen zu maximieren. Bis zur Verwendung wurden die Zellen in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. In einigen Experimenten wurden die Zellen unmittelbar nach der Isolierung verwendet.
Herstellung von aufgereinigtem Zot
Das zot-Gen wurde über PCR mit Deep Vent Polymerase (New England Biolabs) amplifiziert, wobei DNA des Plasmids pBB241 (Baudry et al, supra) als Template verwendet wurde. Die verwendeten Vorwärts- und Rückwärts-Primer waren: 5'-CGGGATCCCGTATGAGTATCTTT-3' (SEQ ID NO:3) bzw. 5'-CCCAAGCTTGGGTCAAAATATACT-3' (SEQ ID NO:4). Die 5'-Enden dieser Oligonukleotide enthalten eine BamHI- bzw. eine HindIII-Restriktionsschnittstelle. Das erhaltene Amplicon (1,2 kb) wurde über 8,0 % (g/v) Agarose-Gelelektrophorese analysiert und mit einer „Xtreme spin column" (Pierce) von Salzen und freien Nukleotiden gereinigt. Danach verwendete man die oben genannten beiden Restriktionsenzyme für den Verdau des aufgereinigten Amplicons und inserierte das erhaltene, verdaute Amplicon in den Vektor pQE30 (Quiagen), der zuvor mit BamHI und HindIII verdaut worden war, wodurch man das Plasmid pSU113 erhielt. pQE30 ist ein Expressionsvektor, der zu hoher Expression eines rekombinanten Proteins mit einem 6-Polyhistidin-Tag (6×His) führt. Das Expressionsprodukt von Plasmid pSU113 ist somit ein 6×His-Zot-Fusionsprotein. pSU113 wurde dann in E.coli DH5a transformiert.
Zur Aufreinigung des 6×His-Zot-Fusionsproteins ließ man die erhaltenen, transformierten E.coli über Nacht bei 37 °C in 150 ml 2,0 % (g/v) Glucose, 25 μg/ml Kanamycin und 200 μg/ml Ampicillin enthaltender Luria Bertani-Nährlösung wachsen, bis die A₆₀₀ etwa 1,10 betrug. Danach gab man 75 ml der Über-Nacht-Kulturen zu 1000 ml Luria Bertani-Nährlösung, die 2,0 % (g/v) Glucose, 25 μg/ml Kanamycin und 200 μg/ml Ampicillin enthielt, und inkubierte etwa 3 h bei 37 °C unter starkem Schütteln, bis die A₆₀₀ etwa 0,7-0,9 betrug. Danach gab man IPTG bis zu einer Endkonzentration von 2,0 mM zu und ließ das Wachstum 5 h bei 37 °C weiterlaufen. Anschließend erntete man die Zellen durch 20minütige Zentrifugation mit 4000 × g, resuspendierte die Zellen in 5,0 ml/g Nassgewicht Puffer A, der 6,0 M GuHCl, 0,1 M Natriumphosphat und 0,01 M Tris-HCl (pH 8,0) enthielt, und rührte 1 h bei Raumtemperatur. Anschließend zentrifugierte man die Mischung 30 min mit 10.000 × g bei 4 °C, gab zu dem erhaltenen Überstand 4,0-5,0 ml/g Nassgewicht einer 50 Aufschlämmung von SUPERFLOW-Harz (QIAGEN) und rührte 1 h bei Raumtemperatur. Mit dem erhaltenen Harz wurde eine 1,6 × 8,0-Säule befüllt, die dann nacheinander gewaschen wurde mit Puffer A, Puffer B, der 8,0 M Harnstoff, 0,1 M Natriumphosphat und 0,01 M Tris-HCl (pH 8,0) umfasste, und Puffer C, der 8,0 M Harnstoff, 0,1 M Natriumphosphat und 0,01 M Tris-HCl (pH 6,3) umfasste. Jeden Waschschritt führte man solange durch, bis die A₆₀₀ der Durchflusslösung weniger als 0,01 betrug. Das 6×His-ZOT-Fusionsprotein wurde aus der Säule mit 20 ml Puffer C eluiert, der 250 mM Imidazol enthielt. Die das 6×His-ZOT-Fusionsprotein enthaltenden Fraktionen überprüfte man mit dem von Davis, Ann. N. Y. Acad. Sci., 121:404 (1964) beschriebenen Verfahren und färbte das Gel mit Comassie-Blau. Die 6×His-ZOT-Fusionprotein enthaltenden Fraktionen wurden gegen 8,0 M Harnstoff dialysiert, vereinigt und 100-fach mit PBS verdünnt. Danach gab man 4,0 ml einer 50 % Aufschlämmung von SUPERFLOW-Harz zu, rührte 2 h bei Raumtemperatur und belud mit dem erhaltenen Harz eine 1,6 × 8,0-Säule, die dann mit 50 ml PBS gewaschen wurde. Man eluierte das 6×His-Zot-Fusionsprotein mit 10 ml PBS, das 250 mM Imidazol enthielt, von der Säule. Das erhaltene Eluat dialysierte man gegen PBS und überprüfte das 6×His-ZOT-Fusionsprotein wie oben beschrieben über SDS-PAGE.
Herstellung und Aufreinigung von Kaninchen-anti-Zot-Antiserum
Um ein spezifisches Antiserum zu erhalten, exprimierte man ein chimäres Glutathion-S-Transferase-(GST)-Zot-Protein und reinigte es auf.
Genauer gesagt verwendete man Oligonukleotidprimer, um den zot-orf über Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung des Plasmids pBB241 (Baudry et al, supra) als Template-DNA zu amplifizieren. Der Vorwärts-Primer (TCATCACGGC GCGCCAGG, SEQ ID NO:5) entsprach den Nukleotiden 15-32 des orf von zot, und der Rückwärts-Primer (GGAGGTCTAG AATCTGCCCG AT, SEQ ID NO:6) entsprach dem 5'-Ende des orf von ctxA. Daher fehlten die Aminosäuren 1-5 von ZOT in dem erhaltenen Fusionsprotein. Man inserierte das Amplifizierungsprodukt in den Polylinker (SmaI-Schnittstelle), der am Ende des GST-Gens in pGEX-2T (Pharmacia, Milwaukee, WI) lokalisiert ist. pGEX-2T ist ein Expressionsvektor für Fusionsprotein, der ein kloniertes Gen als Fusionsprotein mit GST von Schistosoma japonicum exprimiert. Das Fusionsgen steht unter der Kontrolle des tac-Promotors. Nach Induktion mit IPTG erfolgt eine Derepression und das GST-Fusionsprotein wird exprimiert.
Man elektroporierte das erhaltene, als pLC11 bezeichnete rekombinante Plasmid in E. coli DH5α. Zur Αufreinigung von GST-Zot-Fusionsprotein beimpfte man 10 ml Luria Bertani-Nährlösung, die 100 μg/ml Ampicillin enthielt, mit einer einzelnen, pLC11 enthaltenden Kolonie und inkubierte über Nacht bei 37 °C unter Schütteln. Man verdünnte die Kultur 1:100 in 1,0 ml des gleichen frischen Mediums und ließ sie unter Schütteln bei 37 °C bis zu etwa 1,0 × 10⁸ Zellen/ml wachsen. Dann gab man 0,2 mM IPTG zu, um die GST-Zot-Expression zu induzieren, und inkubierte die Kultur weitere 3 h bei 37 °C. Danach pelletierte man die Bakterien, resuspendierte sie in 20 ml eiskaltem PBS (pH 7,4) und lysierte über das „French Press"-Verfahren. Das GST-Zot-Fusionsprotein war unter diesen Bedingungen nicht löslich, da es zusammen mit der Fraktion des Bakterienpellets sedimentierte. Daher resuspendierte man das Pellet in Laemli-Lysepuffer, der 0,00625 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,2 M 2-ME, 2,0 % (g/v) SDS, 0,025 % (g/v) Bromphenolblau und 10 % (v/v) Glycerin enthielt, führte eine Elektrophorese auf einem 8,0 % (g/v) PAGE-SDS-Gel durch, und färbte mit Coomassie-Brillantblau. Unter Verwendung einer Elektroseparationskammer (Schleicher & Schuell, Keene, NH) elektroeluierte man aus dem Gel eine Bande von etwa 70 kDa (26 kDa aus GST + 44 kDa aus Zot), die dem Fusionsprotein entsprach.
Man injizierte 10 μg des erhaltenen, eluierten Proteins (10-20 μg), das mit einem gleichen Volumen Freund's kompletten Adjuvans gemischt war, in ein Kaninchen. Vier und acht Wochen später verabreichte man zwei Booster-Dosen mit Freund's unvollständigem Adjuvans. Einen Monat später nahm man Blut von dem Kaninchen ab.
Um die Produktion spezifischer Antikörper zu bestimmen, transferierte man 10^–10 M Zot, zusammen mit den zwei Fusionsproteinen MBP-Zot und GST-Zot, auf eine Nylon-Membran und inkubierte eine 1:5000-Verdünnung des Kaninchenantiserums unter mäßigem Schütteln über Nacht bei 4 °C. Dann wusch man den Filter viermal 15 min mit 0,05 % (v/v) Tween 20 enthaltendem PBS (nachfolgend „PBS-T"), inkubierte 2 h bei Raumtemperatur mit einer 1:30.000-Verdünnung von Ziege-anti-Kaninchen-IgG, das mit Meerrettichperoxidase konjugiert war. Man wusch erneut viermal 15 min mit 0,1 % (v/v) Tween enthaltendem PBS und wies die immunreaktiven Banden über verstärkte Chemilumineszenz (Amersham) nach.
Das Kaninchenantiserum erkannte im Immunblot Zot ebenso wie MBP-Zot- und GST-Zot-Fusionsproteine, nicht dagegen die MBP-Negativkontrolle.
Um die Produktion geeigneter anti-Zot-Antikörper zu verifizieren, führte man weiterhin Neutralisierungsexperimente in Ussing-Kammern durch. Bei 60minütiger Präinkubation mit pZ14-Überstand bei 37 °C vermochte das Zot-spezifische Antiserum (1:100-Verdünnung) die Rt-Abnahme, die durch Zot bei einem in Ussing-Kammern aufgetragenen Kaninchen-Ileum induziert wurde, vollständig zu neutralisieren.
Danach führte man eine Affinitätsreinigung der anti-Zot-Antikörper unter Verwendung einer MBP-Zot-Affinitätssäule durch. Genauer gesagt, stellte man eine MBP-Zot-Affinitätssäule her, indem man über Nacht bei Raumtemperatur 1,0 mg aufgereinigtes MBP-Zot, das wie oben in Beispiel 1 beschrieben erhalten worden war, an ein prä-aktiviertes Gel (Aminolink, Pierce) immobilisierte. Man wusch die Säule mit PBS und belud sie dann mit 2,0 ml anti-ZOT-Kaninchenantiserum. Nach 90minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wusch man die Säule mit 14 ml PBS und eluierte die spezifischen anti-Zot-Antikörper mit 4,0 ml einer 50 mM Glycin (pH 2,5), 150 mM NaCl und 0,1 % (v/v) Triton X-100 umfassenden Lösung von der Säule. Der pH der eluierten Fraktionen von 1,0 ml wurde sofort mit 1,0 N NaOH neutralisiert.
Kulturbedingungen und Lymphoproliferationsassays
Man kultivierte PBMC (1,5 × 10⁶ Zellen/ml) in 1,0 ml komplettem Medium (cRPMI), das RPMI 1640 umfasste, welches 10 % (v/v) fötales Kälberserum und 50 μg/ml Gentamycin enthielt. Man inkubierte die Zellen bei 37 °C, 5 % CO₂ in 96-Well-Platten bei Fehlen oder in Gegenwart von Phytohämagglutinin (PHA, ein nicht-spezifisches Mitogen, das mit 2,0 μg/ml verwendet wurde) oder Tetanus-Toxoid (TT; ein spezifisches Antigen, das mit 2,0 μg/ml verwendet wurde; Connaught, Swift Water, PA) ohne oder zusammen mit aufgereinigtem ZOT (das mit 20 oder 60 μg/ml verwendet wurde) oder Rinderserumalbumin (BSA; ein Kontrollprotein, das mit 20 oder 60 μg/ml verwendet wurde; Fraktion V, Sigma, St. Louis, MO). In einigen Experimenten gab man beim Start der Kulturen auch anti-Zot-Kaninchenantiserum oder normales Kaninchenserum zu. Die Zellen kultivierte man zwei Tage (für PHA) oder sechs Tage (für TT) und gab 1,0 μCi/Well tritiiertes Thymidin zu. 20 h später erntete man die Platten mit einem Wallac Zellerntegerät (Gaithersburg, MD) und maß das eingebaute Thymidin mit einem Wallac Trilux Mikrobetazähler (Gaithersburg, MD).
B. Ergebnisse
Ein repräsentatives Experiment, das den Effekt von aufgereinigtem Zot auf die von PHA und Tetanus-Toxoid induzierte Proliferation menschlicher PBMC zeigt, ist in 3 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen klar, dass eine Inkubation mit Zot die durch Tetanus-Toxoid induzierte Proliferation deutlich unterdrückte (∼85 % bei 60 μg/ml), während sie auf die PHA-induzierte Proliferation keinen Effekt hatte. Darüber hinaus scheint die Unterdrückung der TT-induzierten Proliferation durch Zot dosisabhängig zu sein. Man beobachtete signifikant höhere Unterdrückungsgrade, wenn Zot mit 60 μg/ml (∼85 %) statt mit 20 μg/ml (∼56 % Unterdrückung) zugegeben wurde. Eine Zugabe von BSA, das als Kontrollprotein verwrendet wurde, hatte keinen Effekt auf die durch TT oder PHA induzierte Lymphozytenproliferation, wodurch die Spezifität der biologischen Aktivität von Zot gezeigt wurde.
Zur weiteren Untersuchung der Spezifität der durch Zot induzierten Unterdrückung TT-induzierter Proliferation inkubierte man PBMC bei Fehlen oder in Gegenwart von TT nur mit ZOT, mit ZOT + anti-ZOT-Kaninchenantiserum (verwendet in einer 1:10-Verdünnung) oder mit Zot + normalem Kaninchenserum (verwendet in einer 1:10-Verdünnung). Wie aus
4 ersichtlich ist, kehrte die Zugabe eines anti-Zot-Kaninchenantiserum die Zot-vermittelte Unterdrückung TT-induzierter Proliferation zu mehr als 50 % um. Eine Zugabe von normalem Kaninchenserum hatte keinen Effekt, wodurch die Spezifität Zot-vermittelter Effekte bestätigt wurde. Gleichermaßen verursachte die Zugabe von BSA keinen Effekt in diesem System.
BEISPIEL 3
Effekte von Zot auf die Aufnahme von FITC-Dextran durch menschliche Monozyten und Makrophagen
A. Materialien und Methoden
Isolierung menschlicher mononukleärer Zellen des peripheren Blutes (PBMC) von gesunden Freiwilligen
PBMC wurden durch Dichtegradientenzentrifugation über Lymphozytenauftrennungsmedium (LSM, Organon-Teknika, Durham, NC) von gesunden Freiwilligen isoliert. In Übereinstimmung mit dem Prüfungsausschuss der Universität von Maryland, Baltimore, waren die Spender Erwachsene und gaben informierte Zustimmung zur Blutabnahme. Die verwendeten PBMC waren frisch geerntet oder wurden allquotiert und in 10 % (v/v) FCS und 10 % (v/v) DMSO enthaltendem RPMI unter Verwendung einer Einfriervorrichtung mit kontrollierter linearer Geschwindigkeit (1 °C pro Minute, Planner Biomed, Salisbury, England) eingefroren, um die Zelllebensfähigkeit zu erhalten und die Wiedergewinnungsrate der Zellen zu maximieren. Bis zur Verwendung wurden die Zellen in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
Herstellung von aufgereinigtem 6×His-Zot
Das 6×His-Zot-Fusionsprotein wurde über das oben in Beispiel 2 beschriebene Verfahren hergestellt und aufgereinigt.
Aufnahme von löslichem Antigen
Die Fähigkeit zur Aufnahme von löslichem Antigen wurde unter Verwendung von Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-konjugiertem Dextran (MG 50.700; Sigma) gemessen. Man inkubierte frisch isolierte PBMC (500.000 Zellen in 0,5 ml cRPMI, das 10 % (v/v) hitzeinaktiviertes FCS und 50 μg/ml Gentamycin enthielt) bei Fehlen oder in Gegenwart von aufgereinigtem Zot (40 μg/ml) oder BSA (40 μg/ml) 3 h bei 37 °C in einem Endvolumen von 0,5 ml/50 ml-Röhrchen. Um die Adhärenz von Monozyten/Makrophagen an die Wände der Röhrchen zu verhindern, führte man diese Inkubation in silikoniserten Röhrchen unter Schütteln durch. Nach dieser Inkubation gab man FITC-Dextran (mit einer Endkonzentration von 300 μg/ml) und anti-CD14-Allophycocyanin (APC)-markierte und anti-HLA-DR Peridinin Chlorophyll Protein (PerCP)-markierte monoklonale Antikörper ohne Waschschritt zu jeder Kultur und inkubierte die Zellen 30 Minuten bei 37 °C oder auf Eis. Da die Aufnahme von FITC-Dextran und löslichen Antigenen im Allgemeinen über Pinocytose erfolgt, einem Temperatur-abhängigen Phänomen, werden Inkubationen bei 0 °C durchgeführt, um den Grad nicht-spezifischer Bindung von FITC-Dextran an die Zellen zu bestimmen.
In diesen Experimenten wurden CD14 und HLA-DR (ein Antigen des Haupthistokompatibilitätskomplexes der Klasse II, dessen Expressionsgrad bei Zellaktivierung zunimmt) zur Identifizierung von Monozyten/Makrophagen verwendet.
Man wusch die Zellen dann einmal mit eiskaltem PBS und trug sie sofort auf ein Coulter Epics Elite Durchflusszytometer/Zellsortierer-System (Coulter Corp., Miami, FL) auf. Die Analyse erfolgte über das WinList Softwarepaket (Verity Software House, Topsham, ME). Man erhielt die Prozentsätze von Zellen, die FITC-Dextran aufnahmen, durch Subtraktion des Prozentsatzes von Zellen, die FITC-Dextran bei 0 °C (Eis) aufnahmen vom Prozentsatz der Zellen, die FITC-Dextran bei 37 °C aufnahmen.
B. Ergebnisse
Ein repräsentatives Experiment, das die Effekte von Zot auf die Aufnahme von FITC-Dextran durch normale menschliche CD14⁺ HLA-DR⁺ Monozyten/Makrophagen zeigt, ist in den 5A-5D gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass Zot im Vergleich zu Zellen, die nur mit Medium oder BSA inkubiert wurden, die Aufnahme von FITC-Dextran durch menschliche Monozyten/Makrophagen deutlich (∼51-58 %) unterdrückte (5D). Zwischen dem Prozentsatz von Zellen, die FITC-Dextran in Medium oder in Gegenwart von BSA aufnahmen, waren keine signifikanten Unterschiede zu beobachten. Darüber hinaus unterband erwartungsgemäß die Inkubation bei 0 °C die Aufnahme von FITC-Dextran vollständig, wodurch bestätigt wurde, dass dieses Phänomen temperaturabhängig ist.
Es ist eine gesicherte Tatsache, dass die Aufnahme von Antigen durch APCs, beispielsweise Monozyten/Makrophagen, ein entscheidender Vorgang ist, der zur Aktivierung und Proliferation von Lymphozyten führt (Sztein et al, supra (1997)). Die Ergebnisse, die zeigen, dass Zot die Aufnahme von FITC-Dextran beeinflusst, zeigen, dass die immunregulatorischen Effekte von Zot auf die TT-induzierte Proliferation wenigstens teilweise durch Verringerung der Fähigkeit von Monozyten/Makrophagen zur Aufnahme von Antigen vermittelt werden, was zu Änderungen der Prozessierung und Präsentation von Antigen führt. Dies wird weiterhin durch die Tatsache gestützt, dass Zot die durch PHA induzierte Proliferation, einem Phänomen, das keine Prozessierung und Präsentation von Antigen erfordert, nicht beeinflusst.
BEISPIEL 4
Messungen der Anzahl von Bindungsstellen/Zelle von FITC-Zot in menschlichen Monozyten/Makrophagen und Lymphozyten
A. Materialien und Methoden
Isolierung menschlicher mononukleärer Zellen des peripheren Bluts (PBMC) von gesunden Freiwilligen
PBMC wurden durch Dichtegradientenzentrifugation über Lymphozytenauftrennungsmedium (LSM, Organon-Teknika, Durham, NC) von gesunden Freiwilligen isoliert. In Übereinstimmung mit dem Prüfungsausschuss der Universität von Maryland, Baltimore, waren die Spender Erwachsene und gaben informierte Zustimmung zur Blutabnahme. Die verwendeten PBMC wurden allquotiert und in 10 % (v/v) FCS und 10 % (v/v) DMSO enthaltendem RPMI unter Verwendung einer Einfriervorrichtung mit kontrollierter linearer Geschwindigkeit (1 °C pro Minute, Planner Biomed, Salisbury, England) eingefroren, um die Zelllebensfähigkeit zu erhalten und die Wiedergewinnungsrate der Zellen zu maximieren. Bis zur Verwendung wurden die Zellen in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. In einigen Experimenten wurden die Zellen unmittelbar nach der Isolierung verwendet.
Herstellung von aufgereinigtem 6×His-Zot
Die Herstellung von 6×His-Zot erfolgte wie in Beispiel 2 oben beschrieben.
Koniugation von Zot an Fluoresceinisothiocyanat (Zot-FITC)
Die Konjugation von Zot mit FITC erfolgte nach Standardverfahren. Kurz zusammengefasst dialysierte man Zot zur Entfernung freier NH₄ ⁺ Ionen und zur Anhebung des pH-Werts auf 9,2 über Nacht bei 4 °C gegen 500 ml FITC-Markierungspuffer, der 0,05 M Borsäure und 0,2 M NaCl umfasste, mit konzentriertem NaOH auf einen pH von 9,2 eingestellt und bei 4 °C aufbewahrt worden war. Dann gab man 20 μl 5,0 mg/ml FITC in DMSO pro Milligramm Zot zu und inkubierte anschließend 2 h bei Raumtemperatur. Nichtgebundenes FITC entfernte man dann durch Dialyse in 500 ml Dialysepuffer bei 4 °C mit zwei- oder dreimaligem Wechsel des Dialysepuffers im Verlauf von zwei Tagen, wobei der Dialysepuffer, der 0,1 M Tris-HCl (pH 7,4), 0,1 % (g/v) NaN₃ und 0,2 M NaCl umfasste, mit konzentriertem NaOH auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt und bei 4 °C aufbewahrt worden war. Diese Präparation wurde bis zur Verwendung bei 4 °C aufbewahrt.
Bindung von FITC-Zot an menschliche PBMC und Analyse über Durchflusszytometrie
Wie oben beschrieben isolierte PBMC inkubierte man mit zunehmenden Konzentrationen von Zot-FITC 30 min bei 37 °C in silikonisierten Röhrchen (um die Bindung von Makrophagen an die Wände der Teströhrchen zu verhindern) in Gegenwart monoklonaler Antikörper (mAb) gegen CD14, konjugiert mit Phycoerythrin (PE), und gegen CD3, konjugiert mit ECD (Energie-gekoppelter Farbstoff, ein PE-Texasrot-Konjugat). CD14 wird als Marker für menschliche Makrophagen verwendet, während CD3 als Macker für T-Lymphozyten verwendet wird. Die Verwendung dieser Fluorochrome (z.B. FITC, PE und ECD} ermöglichte es den Erfindern, durch 3-Farbendurchflusszytometrie gleichzeitig die Bindung von Zot an Makrophagen und T-Lymphozyten in gemischten PBMC-Populationen zu untersuchen. Nach dem Färben wusch man die Zellen zweimal mit PBS (pH 7,2), das 1,0 % (g/v) BSA und 0,1 % (g/v) NaAzid enthielt, und führte sofort eine Analyse über Durchflusszytometrie unter Verwendung eines Epics Elite Durchflusszytometrie/Zellsortierer-Systems (Beckman-Coulter, Miami, FL) durch. Bei diesen Experimenten wurden Fluorochrom-markierte mAbs der gleichen Isotypen, aber mit irrelevanter Spezifität als Kontrollen verwendet. Plättchen, Erythrozyten (falls vorhanden) und Zelldebris schloss man von der Analyse aus, indem ein geeignetes Fenster auf die Vorwärts-gegen-90 %-Lichtstreuung-Parameter gelegt wurde. Für jede Probe sammelten die Erfinder Daten von mehr als 10.000 Zellen. Die Datenanalyse erfolgte mit dem Epics Elite Analyse-Softwarepaket (Coulter) oder dem WinList „list-mode"-Analyse-Softwarepaket (Verity Software House, Topsham, ME). Die Mengen (in pM) von Zot-FITC, die zu jedem Röhrchen gegeben wurden, leiteten sich aus den zugegebenen Endkonzentrationen (in μg/ml) und dem bekannten MG von Zot (44.900) ab.
Berechnung der Zot-Bindungsstellen/Zelle
Unter Verwendung einer Standardkurve, die mit dem Quantum 26 MESF-Kit (Bereich 10.000 bis 500.000 MESF) und der QuickCal Kalibrierungssoftware nach den Herstellerempfehlungen (Flow Cytometry Standards Corporation, San Juan, Puerto Rico) erstellt worden war, wurde die durchschnittliche Fluoreszenzintensität jeder Population nach Inkubation mit Zot-FITC in die Anzahl von Zot-Bindungsstellen/Zelle umgerechnet. Die Fluoreszenzstandards im Quantum-Kit sind als Moleküle äquivalenter löslicher Fluorochrom (MESF)-Einheiten gegen Lösungen aufgereinigter fluoreszenter Farbstoffe kalibriert. Die Anzahl der Bindungsstellen pro Zelle (Makrophagen oder Lymphozyten) erhielt man aus MESF-Einheiten von Proben, die mit Zot-FITC inkubiert worden waren (wobei die nichtspezifische Bindung, d.h. MESF von FITC-markierten Maus-IgG-Kontrollen abgezogen wurde), und für das Fluorescein/Protein-Verhältnis (F/P) der verschiedenen verwendeten FITC-Zot-Chargen korrigiert waren.
B. Ergebnisse
Ein repräsentatives Experiment, das die Durchflusszytometrieanalyse der Bindung von Zot-FITC an menschliche T-Lymphozyten (CD3⁺) und Makrophagen (CD14⁺) zeigt, ist in 6 dargestellt. Wie durch die erhöhte Anzahl von Zot-Bindungsstellen/Zelle untermauert wird, zeigen die Ergebnisse, dass die Bindung von Zot-FITC bei Makrophagen um ein Mehrfaches höher ist als bei CD3⁺ T-Lymphozyten. Weiterhin zeigen diese Daten, dass die Bindung von Zot ein Phänomen ist, das der Sättigung unterliegt, wobei Sättigung bei etwa 0,5 pM (∼40 g/ml) erreicht wird. Darüber hinaus stellten die Erfinder fest, dass unter Sättigungsbedingungen ∼106.000 Zot-Bindungsstellen/Zelle bei menschlichen Makrophagen bzw. ∼9.000 Zot-Bindungsstellen/Zelle bei Lymphozyten vorliegen.
Zur Untersuchung der Verteilung von Zot-Bindungsstellen bei menschlichen Makrophagen und Lymphozyten wurde die oben beschriebene Vorgehensweise zur Bestimmung der Anzahl von Zot-Bindungsstellen/Zelle bei mehreren Freiwilligen angewendet. Die Ergebnisse zeigten, dass die durchschnittliche Anzahl von Zot-Bindungsstellen/Zelle im Durchschnitt bei Makrophagen etwa 10-fach (Durchschnitt = 104.649; Streuungsbereich = 56.791-142.840) höher ist als bei Lymphozyten (Durchschnitt = 10.684; Streuungsbereich = 4.802-18.662).
BEISPIEL 5
Kinetik der Bindung von Zot an menschliche Monozyten/Makrophagen und Lymphozyten
A. Materialien und Methoden
Isolierung menschlicher mononukleärer Zellen des peripheren Bluts (PBMC) von gesunden Freiwilligen
PBMC wurden von gesunden Freiwilligen wie oben in Beispiel 4 beschrieben isoliert.
Herstellung von aufgereinigtem 6×His-Zot
Die Herstellung von 6×His-Zot erfolgte wie oben in Beispiel 2 beschrieben.
Konjugation von Zot an Fluoresceinisothiocyanat (Zot-FITC)
Die Konjugation von Zot mit FITC wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt.
Kinetik der Bindungsassays
Die Bestimmung der Kinetik der Bindung von Zot an menschliche Zellen erfolgte über Durchflusszytometrie unter Verwendung von Zot-FITC-Konjugaten. Die Proben wurden in Echtzeit unter Verwendung eines EPIC ELITE Durchflusszytometrie/Zellsortierer-Systems (Beckman-Coulter, Miami, FL) analysiert. PBMC waren mit ECD (Energie-gekoppelter Farbstoff)-markiertem anti-CD3 mAb und mit PE (Phycoerythrin)-markiertem anti-CD-14 mAb gefärbt. Kontrollen für die Hintergrundfluoreszenz stellte man durch ein zusätzliches Aliquot jeder Zellsuspension her, wobei man die experimentellen mAb durch irrelevante mAb der gleichen Isotypen ersetzte, die mit den entsprechenden fluoreszenten Farbstoffen konjugiert waren. Dann wusch man mit anti-CD3- und anti-CD14-mABs markierte PBMC und bewahrte sie bis zur Analyse (innerhalb 1 h) in einem Eisbad auf, um Antigenmodulierung zu minimieren. Vor der Analyse ließ man die Zellen 15-20 min bei 37 °C in einem Wasserbad äquilibrieren und bewahrte sie für die Dauer des Experiments (12 min) unter Verwendung eines mit dem Durchflusszytometer verbundenen Manipulators für lebensfähige Proben (Kinetikmodul, Cytek, Fremont, CA) bei 37 °C auf, während Daten kontinuierlich erfasst wurden. Man erfasste 90-150 Sekunden Basis-FITC-Fluoreszenzgrade und stoppte die Datenerfassung für ∼10-15 Sekunden, um Zot-FITC (für eine Endkonzentration von 40 μg/ml) zu injizieren. Nach der Zugabe von Zot-FITC nahm man die Datenerfassung mit einer Geschwindigkeit von ∼300-600 Zellen/s über eine Gesamtdauer von 12 min sofort wieder auf. FITC-, PE- und ECD-Fluorochrom wurden durch einen luftgekühlten Argon-Laser (Emission bei 488 nm) angeregt. Die Ergebnisse wurden durch die WinList- und Isokontur-Analyse-Softwarepakete (Verity Software House, Topsham, ME) berechnet und angezeigt. Die Ergebnisse sind als isometrische Darstellungen der Zot-FITC-Intensität (y-Achse) gegen die Zeit (x-Achse) und gegen die Zellanzahl (z-Achse) für Zellen gezeigt, die sich im Fenster der CD3 (T-Lymphozyten) oder CD14 (Makrophagen) befanden.
B. Ergebnisse
Ein repräsentatives Experiment, das die Kinetik der Bindung von Zot-FITC an menschliche T-Lymphozyten (CD3⁺) und Makrophagen (CD14⁺) zeigt, ist in den 7A-7C gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Bindung von Zot an menschliche Makrophagen (7A) und Lymphozyten (7B) sehr schnell erfolgt, wobei ein Gleichgewicht innerhalb von 2 min nach Zugabe von Zot-FITC erreicht wird. Um die Zeit zu vergleichen, die für das Erreichen einer maximalen Bindung von Zot und einem anti-CD14 mAb erforderlich ist, wurden ähnliche Experimente mit nicht-markierten Zellen durchgeführt. In diesen Experimenten wurden Basiswerte der FITC-Fluoreszenz, wie oben beschrieben, erfasst, die Datenerfassung ∼10-15 s unterbrochen, um FITC-anti-CD14 mAb zu injizieren, und die Datenerfassung sofort für eine Gesamtdauer von 12 min wieder aufgenommen. Die Ergebnisse (7C) zeigen, dass maximale Zot-Bindungsgrade in kürzeren Zeiträumen (∼2 min) auftreten, als für die Einstellung eines Gleichgewichts von anti-CD14 mAb erforderlich ist (∼5 min).
BEISPIEL 6
Bindung von FITC-Zot an menschliche B- und T-Lymphozyten
A. Materialien und Methoden
Isolierung menschlicher mononukleärer Zellen des peripheren Blutes (PBMC) von gesunden Freiwilligen
PBMC wurden von gesunden Freiwilligen wie oben in Beispiel 4 beschrieben isoliert.
Herstellung von aufgereinigtem 6×His-Zot
Die Herstellung von 6×His-Zot erfolgte wie oben in Beispiel 2 beschrieben.
Koniugation von Zot mit Fluoresceinisothiocanat (Zot-FITC)
Die Konjugation von Zot mit FITC erfolgte wie oben in Beispiel 4 beschrieben.
Bindung von FITC-Zot an menschliche PBMC und Analyse über Durchflusszytometrie
Man inkubierte PBMC, die wie oben beschrieben isoliert worden waren, mit 40 μg/ml Zot-FITC 30 Minuten bei 37 °C in Gegenwart von mAb gegen CD14, der mit PE konjugiert war, mAb gegen CD3, der mit Tricolor (ein PE-Cy5-Konjugat) konjugiert war, und mit anti-CD19, das mit ECD (Energie-gekoppelter Farbstoff, ein PE-Texasrot-Konjugat) konjugiert war. CD14 ist ein Marker für menschliche Makrophagen, CD3 ist ein Marken für T-Lymphozyten und CD19 ist ein Marker für B-Lymphozyten. Die Verwendung dieser Fluorochrome (z.B. FITC, PE, TC und ECD) ermöglichte es den Erfindern, über 4-Farben-Durchflusszytometrie gleichzeitig die Bindung von Zot an Makrophagen, T- und B-Lymphozyten in gemischten PBMC-Populationen zu untersuchen. Nach dem Anfärben wusch man die Zellen zweimal mit PBS (pH 7,2), das 1,0 % (g/v) BSA und 0,1 % (g/v) NaAzid enthielt, und analysierte sofort über Durchflusszytometrie unter Verwendung eines Epics Elite Durchflusszytometer/Zellsortierer-Systems (Beckman-Coulter, Miami, FL). Bei diesen Experimenten wurden Fluorochrom-markierte mAbs der gleichen Isotypen, aber mit irrelevanter Spezifität als Kontrollen verwendet. Plättchen, Erythrozyten (falls vorhanden) und Zelldebris schloss man von der Analyse aus, indem ein geeignetes Fenster auf die Vorwärtsgegen-90 %-Lichtstreuung-Parameter gelegt wurde. Für jede Probe erfasste man Daten von mehr als 10.000 Zellen. Die Datenanalyse erfolgte mit dem Epics Elite Analyse-Softwarepaket (Coulter) oder dem WinList „list-mode"-Analyse-Softwarepaket (Verity Software House, Topsham, ME). Die Ergebnisse sind als Einzelfarben-Histogramme der Fluoreszenzintensität von Zot-FITC in T- (CD3⁺) und B-(CD19⁺) Populationen gezeigt, die auf Lymphozyten selektiert waren.
B. Ergebnisse
Ein Experiment, das die Bindung von Zot-FITC an menschliche T- (CD3⁺) und B-(CD19+) Lymphozyten zeigt, ist in 8 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass Zot in ähnlicher Weise sowohl an T- als auch an B-Lymphozyten bindet. In diesem Experiment war die Bindung von Zot-FITC an Makrophagen 5-8fach höher als die Bindung an T- oder B-Lymphozyten.
BEISPIEL 7
Unvermögen von Zot-Antagonisten zur Blockierung der Bindung von Zot-FITC
A. Materialien und Methoden
Isolierung menschlicher mononukleärer Zellen des peripheren Blutes (PBMC) von gesunden Freiwilligen
PBMC wurden wie oben in Beispiel 4 beschrieben von gesunden Freiwilligen isoliert.
Herstellung von aufgereinigtem 6×His-Zot
Die Herstellung von 6×His-Zot erfolgte wie oben in Beispiel 2 beschrieben.
Herstellung der Zot-Antagonisten FZI/0 und FZI/1
Die Peptidantagonisten FZI/0 (Gly Gly Val Leu Val Gln Pro Gly) (SEQ ID NO:7) und FZI/1 (Val Gly Val Leu Gly Arg Pro Gly) (SEQ ID NO:8) wurden chemisch synthetisiert und über allgemein bekannte Verfahren aufgereinigt, die beispielsweise in High Performance Liquid Chromatography of Peptides and Proteins: Separation Analysis and Conformation, Hrsg. Mant et al, C.R.C. Press (1991) beschrieben sind, wobei ein Peptidsynthesegerät verwendet wurde, beispielsweise Symphony (Protein Technologies, Inc).
Koniugation von Zot mit Fluoresceinisothiocyanat (Zot-FITC)
Die Konjugation von Zot mit FITC erfolgte wie oben in Beispiel 6 beschrieben.
Kulturbedingungen für die Blockierung der Bindung von FITC-Zot an menschliche PBMC und Analyse über Durchflusszytometrie
PBMC, die wie oben beschrieben isoliert worden waren, färbte man mit mAbs gegen CD14, die mit PE konjugiert waren, und mAbs gegen CD3, die mit ECD konjugiert waren (Energie-gekoppelter Farbstoff, ein PE-Texasrot-Konjugat). Dann wusch man die Zellen und inkubierte 15 min bei 4 °C in 400 μl AIM-V-Medium (GIBCO BRL, ein definiertes, serumfreies Medium, das routinemäßig für menschliche Lymphozytenkulturen verwendet wird) mit 0,2 % (g/v) NaAzid (um die Internalisierung/das Recycling zu blockieren) nur in Medium oder unter Zugabe von FZI/0 (4,0 mg/ml), FZI/1 (4,0 mg/ml), BSA (4,0 mg/ml; Negativkontrolle) oder unmarkiertem Zot (160 μg/ml; Positivkontrolle). Dann gab man zu jedem Röhrchen Zot-FITC für die Einstellung einer Endkonzentration von 40 μg/ml und inkubierte 5 min (die für die Einstellung eines Gleichgewichts erforderliche Zeit), wusch und untersuchte sofort im Durchflusszytometer. Im Vergleich mit der zugegebenen Konzentration an Zot-FITC wurden somit FZI/0, FZI/1 und BSA in 100-fachem Überschuss und nicht-markiertes Zot in 4-fachem Überschuss zugegeben. Unglücklicherweise verhinderten technische Schwierigkeiten bei der Gewinnung großer Mengen aufgereinigter, nicht-markierter Zot-Präparationen die Beurteilung von dessen Fähigkeit zur Blockierung der Zot-FITC-Bindung bei mehr als 4-fachem Überschuss. Plättchen, Erythrozyten (falls vorhanden) und Zelldebris wurden von der Analyse ausgeschlossen, indem man ein geeignetes Fenster auf die Vorwärts-gegen-90 %-Lichtstreuung-Parameter legte. Für jede Probe erfassten die Erfinder Daten von mehr als 10.000 Zellen. Die Datenanalyse erfolgte über das Epics Elite Analysen-Softwarepaket (Coulter) oder das WinList „list-mode"-Analyse-Softwarepaket (Verity Software House, Topsham, ME). Die Ergebnisse sind gezeigt als % Unterdrückung der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität von Zellen, die mit Zot-FITC in Gegenwart von Zot-Antagonisten, nicht-markiertem Zot oder BSA inkubiert wurden, bezogen auf die durchschnittliche Fluoreszenzintensität von Zellen, die nur mit Medium inkubiert wurden waren (der willkürlich ein Wert von 100 % zugeordnet wurde).
B. Ergebnisse
Ein repräsentatives Experiment, das den Effekt der Inkubation von PBMC drei verschiedener Freiwilligen mit Zot-Antagonisten, nicht-markiertem Zot oder BSA zeigt, ist in 9 gezeigt. Die Zugabe entweder des Zot-Antagonisten FZI/0 oder des Zot-Antagonisten FZI/1 in 100-fachem Überschuss blockierte die Bindung von Zot-FITC Makrophagen im Fenster von CD14⁺ nicht signifikant. In ähnlicher Weise beeinflusste die Zugabe von BSA in 100-fachem Überschuss die Bindung von Zot-FITC nicht. Im Gegensatz dazu blockierte die Präinkubation eines nur 4-fachen Überschusses an nicht-markiertem Zot die Bindung von Zot-FITC um 24-43 %. Diese Ergebnisse legen die Schlussfolgerung nahe, dass an der Bindung von Zot an menschliche Makrophagen ein Rezeptor mit Bindungsstellen beteiligt ist, die sich von denen der in Gehirn- und Darmgewebe identifizierten Zot/Zonulin-Rezeptoren unterscheiden.
BEISPIEL 8
Die Unterdrückung der durch Tetanus-Toxoid (TT) induzierten Proliferation durch Zot hängt ab von einem Faktor (Faktoren) der (die) in Serum vorliegt (vorliegen)
A. Materialien und Methoden
Isolierung menschlicher mononukleärer Zellen (PBMC) des peripheren Blutes von gesunden Freiwilligen
PBMC wurden wie oben in Beispiel 4 beschrieben von gesunden Freiwilligen isoliert.
Herstellung von aufgereinigtem 6×His-Zot
Die Herstellung von 6×His-Zot erfolgte wie oben in Beispiel 2 beschrieben.
Kulturbedingungen und Lymphoproliferationsassays
Man kultivierte PBMC (1,5 × 10⁶ Zellen/ml) entweder in jeweils 1,0 ml (a) AIM-V-Medium, (b) RPMI 1640, das 10 % (v/v) hitzeinaktiviertes, fötales Kälberserum und 50 μg/ml Gentamycin enthielt, oder (c) RPMI 1640, das 10 % (v/v) hitzeinaktiviertes humanes AB-Serum und 50 μg/ml Gentamycin enthielt. Man inkubierte die Zellen bei 37 °C, 5 % CO₂ in 96-Well-Platten bei Fehlen oder in Gegenwart von Tetanus-Toxoid (TT; ein spezifisches Antigen, das mit 2,0 μg/ml eingesetzt wurde; Wyeth, Marietta, PA) ohne oder mit aufgereinigtem Zot (60 μg/ml) oder Rinderserumalbumin (BSA; ein Kontrollprotein, 60 μg/ml; Fraktion V, Sigma, St. Louis, MO). Die Zellen inkubierte man sechs Tage und gab 1,0 Ci/Well tritiiertes Thymidin zu. 20 h später erntete man die Platten auf einem Wallac Zellerntegerät (Gaithersburg, MD) und maß das eingebaute Thymidin auf einem Wallac Trilux Mikrobetazähler (Gaithersburg, MD).
B. Ergebnisse
Die Ergebnisse aus drei unabhängigen Experimenten zeigten, dass keine Inhibierung der durch TT induzierten Proliferation zu beobachten war, wenn PBMC bei Fehlen von Serum inkubiert wurden, d.h. wenn das AIM-V definierte Medium für die Kulturen verwendet wurde. Tatsächlich war in den meisten Fällen das Gegenteil zu beobachten, d.h. die Inkubation von Zot bei Fehlen von Serum führte zu gesteigerten proliferativen Antworten gegenüber TT. Im Gegensatz dazu führte die Inkubation mit Zot zu einer deutlichen Unterdrückung der durch TT induzierten Proliferation, wenn die Kulturen in Gegenwart entweder von FCS oder von menschlichem AB-Serum durchgeführt wurden. Tatsächlich scheint die Gegenwart von menschlichem AB-Serum einen höheren Grad an Unterdrückung (bis zu 90 %) der durch TT induzierten Proliferation zu vermitteln als die Gegenwart von FCS.
BEISPIEL 9
Unterdrückung der CD14-Expression auf menschlichen Monozyten/Makrophagen durch Zot
A. Materialien und Methoden
Isolierung menschlicher mononukleärer Zellen des peripheren Blutes (PBMC) von gesunden Freiwilligen
PBMC wurden wie oben in Beispiel 4 beschrieben von gesunden Freiwilligen isoliert.
Herstellung von aufgereinigtem 6×His-Zot
Die Herstellung von 6×His-Zot erfolgte wie oben in Beispiel 2 beschrieben.
Kulturbedingungen und Analyse über Durchflusszytometrie
Man inkubierte PBMC, die wie oben beschrieben isoliert worden waren, bei 37 °C, 5 % CO₂ in 24-Well-Platten über verschiedene Zeiträume (4 h bis 7 Tage) bei Fehlen oder in Gegenwart von Tetanus-Toxoid (TT; ein spezifisches Antigen, das in einer Konzentration von 2,0 μg/ml verwendet wurde; Wyeth, Marietta, PA) ohne oder zusammen mit aufgereinigtem Zot (60 μg/ml) oder Rinderserumalbumin (BSA; ein Kontrollprotein, 60 μg/ml; Fraktion V, Sigma, St. Louis, MO). Dann färbte man die Zellen mit einem mAb gegen CD14, der mit FITC konjugiert war, und analysierte über Durchflusszytometrie. Plättchen, Erythrozyten (falls vorhanden) und Zelldebris wurden von der Analyse ausgeschlossen, indem ein geeignetes Fenster auf die Vorwärts-gegen- 90 %-Lichtstreuung-Parameter gelegt wurde. Für jede Probe wurden Daten von mehr als 10.000 Zellen erfasst. Die Datenanalyse erfolgte über das Epics Elite Analyse-Softwarepaket (Coulter) oder das WinList „list-mode"-Analyse-Softwarepaket (Verity Software House, Topsham, ME). Die Ergebnisse sind als Einzelfarben-Histogramme der CD14-Fluoreszenz auf Zellen gezeigt, die im Fenster der „Monozyten-Region" liegen, die durch die Vorwärtsstreuung-gegen-Seitwärtsstreuung-Eigenschaften menschlicher Makrophagen definiert ist.
B. Ergebnisse
Ein repräsentatives Experiment, das die Effekte der Inkubation von PBMC mit Zot auf die Expression von CD14 in menschlichen Makrophagen zeigt, ist in den 10A-10B enthalten. Die Zugabe von Zot führte innerhalb von 18 h Inkubation zu einer deutlichen Unterdrückung der Expression von CD14. Dieser Effekt war entweder bei Fehlen (10A) oder in Gegenwart (10B) von Tetanus-Toxoid sehr ausgeprägt. Die Zugabe von BSA beeinflusste die Expression von CD14 nicht. Kinetische Experimente zeigten, dass die durch Zot induzierte Unterdrückung der Expression von CD14 in ungefähr der Hälfte der Experimente bereits 4-6 h nach Kontakt mit Zot zu beobachten ist und dass die Expression von CD14 nach 7 Tagen in Kultur (dem letzten ausgewerteten Zeitpunkt) deutlich unterdrückt bleibt. CD14 ist ein Molekül auf der Oberfläche von Makrophagen, das als hochaffiner Rezeptor für Komplexe aus LPS-LPS-Bindungsprotein dient. Man nimmt daher an, dass die Herunterregulierung der Expression von CD14 durch Zot tiefgreifende Auswirkungen auf die Aktivierung von Makrophagen und deren Fähigkeit zur effektiven Initiierung T-Zellvermittelter Immunantworten hat.
BEISPIEL 10
Effekte von Zot auf die Lebensfähigkeit menschlicher Lymphozyten und Monozyten/Makrophagen
A. Materialien und Methoden
Isolierung menschlicher mononukleärer Zellen des peripheren Blutes (PBMC) von gesunden Freiwilligen
PBMC wurden von gesunden Freiwilligen wie oben in Beispiel 4 beschrieben isoliert.
Herstellung von aufgereinigtem 6×His-Zot
Die Herstellung von 6×His-Zot erfolgte wie oben in Beispiel 2 beschrieben.
Kulturbedingengen und Analyse über Durchflusszytometrie
Man inkubierte PBMC, die wie oben beschrieben isoliert worden waren, bei 37 °C, 5 % CO₂ in 24-Well-Platten über verschiedene Zeiträume (6 h bis 7 Tage) bei Fehlen oder in Gegenwart von Tetanus-Toxoid (TT; ein spezifisches Antigen, das in einer Konzentration von 2,0 μg/ml verwendet wurde; Wyeth, Marietta, PA) ohne oder zusammen mit aufgereinigtem Zot (40 μg/ml) oder Rinderserumalbumin (BSA; ein Kontrollprotein, 40 μg/ml; Fraktion V, Sigma, St. Louis, MO). Dann färbte man die Zellen mit dialysierten mAbs gegen CD14, die mit FITC konjugiert waren, und wusch sie. Zur Bestimmung der Zelllebensfähigkeit gab man Propidiumiodid (PI; 50 g/ml; ein Farbstoff, der einfach in tote Zellen aufgenommen wird, aber von lebensfähigen Zellen ausgeschlossen wird) zu den Zellsuspensionen und analysierte die Proben sofort über Durchflusszytometrie. Plättchen, Erythrozyten (falls vorhanden) und Zelldebris schloss man von der Analyse aus, indem ein geeignetes Fenster auf die Vorwärtsgegen-90 %-Lichtstreuung-Parameter gelegt wurde. Für jede Probe wurden Daten für mehr als 10.000 Zellen erfasst. Die Datenanalyse erfolgte durch das Epics Elite Analyse-Softwarepaket (Coulter) oder das WinList „list-mode"-Anlayse-Softwarepaket (Verity Software House, Topsham, ME). Die Ergebnisse sind gezeigt als % lebensfähige Zellen, die sich im Fenster der „Monozyten-Region" oder „Lymphozyten-Region" befanden, die auf der Grundlage der Vorwärtsstreuung-gegen-Seitwärtsstreuung-Eigenschaften dieser Zellpopulationen definiert sind.
B. Ergebnisse
Ein repräsentatives Experiment, das die Effekte der Inkubation von PBMC mit Zot auf die Lebensfähigkeit menschlicher Makrophagen und Lymphozyten zeigt, ist in 11 enthalten. Die Zugabe von Zot verursachte bereits nach einem Tag in Kultur eine mäßige Abnahme der Lebensfähigkeit von Makrophagen im Vergleich zu Kontrollen. Diese Abnahmen wurden am Tag 4 sehr ausgeprägt, und praktisch alle Makrophagen waren nach 7 Tagen in Kultur tot. Im Gegensatz dazu waren bis zum Tag 4 keine Unterschiede hinsichtlich der Lebensfähigkeit von Lymphozyten zu beobachten, die mit Zot inkubiert wurden oder die mit Medium oder BSA inkubiert wurden. Die Lebensfähigkeit der Lymphozyten nahm jedoch zu späteren Zeitpunkten in Gegenwart von Zot deutlich ab. Ähnliche Ergebnisse wurden festgestellt, wenn TT den Kulturen bei Fehlen oder in Gegenwart von Zot zugegeben wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass Zot die Lebensfähigkeit von Makrophagen zu relativ frühen Zeitpunkten beeinflusst, während die Effekte auf Lymphozyten nicht früher als nach wenigstens 4 Tagen in Kultur deutlich werden. Diese Beobachtungen liefern zusätzliche Informationen hinsichtlich der Mechanismen, die der durch Zot vermittelten Unterdrückung der Prozessierung und Präsentation von Antigen möglicherweise zugrunde liegen, und weisen auf einen frühen Effekt auf Makrophagen hin.
BEISPIEL 11
Durch Zot vermittelte Induktion der Produktion von Zytokin durch menschliche Monozyten/Makrophagen und Lymphozyten
A. Materialien und Methoden
Isolierung menschlicher mononukleärer Zellen des peripheren Blutes (PBMC) von gesunden Freiwilligen
PBMC wurden von gesunden Freiwilligen wie oben in Beispiel 4 beschrieben isoliert.
Herstellung von aufgereinigtem 6×His-Zot
Die Herstellung von 6×His-Zot erfolgte wie oben in Beispiel 2 beschrieben.
Kulturbedingungen
Man inkubierte PBMC, die wie oben beschrieben isoliert worden waren, bei 37 °C, 5 % CO₂ in 24-Well-Platten über verschiedene Zeiträume (6 h bis 4 Tage) bei Fehlen oder in Gegenwart von Tetanus-Toxoid (TT; ein spezifisches Antigen, das in einer Konzentration von 2,0 μg/ml verwendet wurde; Wyeth, Marietta, PA) ohne oder zusammen mit aufgereinigtem Zot (60 μg/ml) oder Rinderserumalbumin (BSA; ein Kontrollprotein, 60 μg/ml; Fraktion V, Sigma, St. Louis, MO). Für Untersuchungen, welche die Produktion von TNF-α, IL-1β, und IL-10 beinhalteten, sammelte man nach 6 h und an den Tagen 1, 2 und 4 den Inhalt der Wells in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen und zentrifugierte 10 min bei 4 °C mit 2.700 × g in einer gekühlten Eppendorf-Zentrifuge, um Zellen und Debris zu entfernen. Dann übertrug man die Überstände in neue Eppendorf-Röhrchen und fror diese bis zur Analyse bei –70 °C ein. Nach drei Tagen sammelte man die Überstände für die Messung von aus T-Lymphozyten stammenden Zytokinen (z.B. IL-2, IL-4 und IFN-γ) nach Stimulierung mit TT ohne oder mit aufgereinigtem Zot oder BSA.
Zytokin-Messungen durch Chemilumineszenz-ELISA
Ein Standard-Chemilumineszenz-Einfang-ELISA wurde verwendet, um das Vorliegen von Zytokinen in den Zellkulturüberständen nachzuweisen. Kurz zusammengefasst beschichtete man über Nacht bei 4 °C 1,0-2,0 μg/ml anti-Mensch-Zytokin-Antikörper auf schwarz-opake ELISA-Platten mit 96 Wells (Corning-Costar, Cambridge, MA) entweder in PBS (pH 7,4) (Biofluids) oder 0,1 M Natriumbicarbonat (pH 8,1). Man wusch die Platten mit PBS (pH 7,4), das 0,5 % (v/v) Tween-20 (Sigma) enthielt, und blockierte 2 h mit PBS (pH 7,4), das entweder 10 % (v/v) FCS oder 4,0 % (g/v) BSA enthielt. Nach dem Waschen gab man 100 μl Zellkulturüberstände oder rekombinante, menschliche Zytokine (als Standards) zu den Wells und inkubierte 2 h bei Raumtemperatur. Nach Waschen gab man die entsprechenden, mit Biotin konjugierten anti-Zytokin-mAbs zu den Wells (45 min bei Raumtemperatur), wusch und inkubierte 30 min bei Raumtemperatur mit Avidin-Peroxidase. Dann gab man das BM Chemilumineszenz ELISA-Reagens (Boehringer Mannheim, Gaithersburg, MD) zu und wies Chemilumineszenz mit einem 1450 Mikrobeta Trilux-Plattenlesegerät (Wallac, Gaithersburg, MD) nach. Die Antikörper gegen IL-1β bezog man von Endogen (Woburn, MA), alle anderen Antikörper von Pharmingen (San Diego, CA).
B. Ergebnisse
Ein repräsentatives Experiment, das die Fähigkeit von Zot zur Induzierung der Zytokin-Produktion durch menschliche Makrophagen zeigt, ist in den 12A-12C dargestellt. Die Zugabe von Zot (bei Fehlen von TT) induzierte die Produktion beträchtlicher Mengen von TNF-α bereits nach 6 h, wobei Spitzenwerte nach 24 h erreicht wurden (3.400-3.800 pg/ml) und die Konzentration danach abnahm, wobei Konzentrationen in der Nähe der Basiswerte nach vier Tagen erreicht wurden (12A). In Medium- oder BSA-Kulturen wurden niedrigere Konzentrationen von TNF-α festgestellt (1.000-1.100 pg/ml), was möglicherweise das Ergebnis unspezifischer Aktivierung von Makrophagen nach Adhärenz an Plastik darstellt. Ebenfalls zu beobachten war eine schwache Induktion von IL-1β durch Zot (∼40-60 pg/ml), die nach 2 Tagen Spitzenwerte erreichte bis zum Tag 4 deutlich abnahm (∼20 pg/ml) (12B). In Medium- oder BSA-Kulturen waren keine signifikanten Konzentrationen von IL-1β zu festzustellen. Schließlich führte die Inkubation mit Zot zur Produktion hoher Konzentrationen von IL-10 nach 6 h (1.000 pg/ml), wobei Spitzenwerte am Tag 1 erreicht wurden (1.500 pg/ml) und die Konzentrationen bis zum Tag 4 konstant blieben (12C). Ähnlich wie bei den Ergebnissen, die oben für TNF-α beschrieben wurden, wurden deutlich niedrigere Konzentrationen von IL-10 in Medium- oder BSA-Kulturen festgestellt, möglicherweise als Ergebnis unspezifischer Aktivierung von Makrophagen nach Adhärenz an Plastik. Die Gegenwart von TT veränderte weder die Kinetik noch die Stärke der Zytokin-Antworten, die nach Zugabe von Zot beobachtet wurden. Die Induktion hoher Konzentrationen starker proinflammatorischer Zytokine nach Kontakt mit Zot liefert zusätzliche Informationen hinsichtlich der Mechanismen, die der durch Zot vermittelten Unterdrückung der Prozessierung und Präsentation von Antigen zugrunde liegen können, und deutet erneut auf einen frühen Effekt auf Makrophagen hin. Beispielsweise nimmt man an, dass die durch Zot vermittelte Induktion der Produktion von IL-10, eines Zytokins, das als wesentlicher Inhibitor der Antwort vom Th1-Typ durch Inhibierung der Produktion von Zytokinen wie beispielsweise IL-2 bekannt ist, eine wesentliche Rolle bei der Unterdrückung der Antigen-induzierten, lymphoproliferativen Antworten spielt, die zu beobachten sind, wenn Zot den Kulturen zugegeben wird.
Ein repräsentatives Experiment, das die Effekte von Zot auf die Produktion von Zytokinen zeigt, die von T-Zellen stammen, ist in den 13A-13B gezeigt. Es wurde beobachtet, dass die Zugabe von Zot die durch Inkubation mit TT induzierte Produktion von IL-2 unterdrückte, während BSA keinen Effekt hatte (13A). Bei Fehlen von TT wurden keine messbaren Konzentrationen von IL-2 durch Zot induziert. Im Gegensatz dazu induzierte die Zugabe von Zot bei Fehlen von TT durchwegs die Produktion niedriger bis mäßiger Konzentrationen von IFN-γ, ähnlich den Konzentrationen, die durch TT induziert wurden (13B). Darüber hinaus steigerte Zot deutlich die Konzentrationen von TT-induziertem IFN, während BSA keinen Effekt hatte (13B). Schließlich wurde festgestellt, dass die Zugabe von Zot keine Produktion von IL-4 induzierte. Da IL-2 ein Zytokin ist, das eine wesentliche Rolle bei der Proliferation von Lymphozyten spielt, nimmt man an, dass die Unterdrückung der Produktion von IL-2 nach Antigenstimulation einer der Schlüsselmechanismen ist, welcher der durch Zot vermittelten Unterdrückung der durch TT induzierten Proliferation zugrunde liegt. Als weiterer Punkt von Bedeutung zeigt die Tatsache, dass Zot die Produktion von IFN-γ bei Fehlen oder in Gegenwart von TT ebenso wie die Produktion vieler proinflammatorischer Zytokine induziert, dass Zot seine immunregulatorischen Effekte auf verschiedenen Ebenen während des komplexen Vorgangs der Prozessierung und Präsentation von Antigen ausübt, der zur Erzeugung Antigen-spezifischer Immunantworten führt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Unterdrückung einer durch Antigen-präsentierende Zellen vermittelten Lymphozytenproliferation in einer Kultur von Zellen, die zuvor einem bestimmten Antigen ausgesetzt wurden, wobei man die Kultur mit einer Menge eines Zonula occludens-Toxin (Zot)-verwandten Immunregulators, der unter Zot oder Zonulin ausgewählt ist, in Kontakt bringt, wobei die Menge eine Herunterregulierung der Aktivität der Antigen-präsentierenden Zellen bewirkt.
Verfahren zur Unterdrückung einer durch Antigen-präsentierende Zellen vermittelten Lymphozytenproliferation in einer Kultur von Zellen als Antwort auf ein Antigen, wobei man die Kultur mit einer Menge eines Zot-verwandten Immunregulators, der unter Zot oder Zonulin ausgewählt ist, in Kombination mit dem Antigen in Kontakt bringt, wobei die Menge eine Herunterregulierung der Aktivität der Antigenpräsentierenden Zellen bewirkt.