CN1317975A - 应用Zot或zonulin以抗原特异性方式抑制淋巴细胞增殖的方法 - Google Patents

Abstract

对主要应用于免疫调节和免疫治疗领域的，采用Zot或Zonulin作为抗原提呈细胞活性和淋巴细胞增殖的抗原特异性抑制物的方法进行了阐述。具体地说，Zot和Zonulin以剂量依赖的方式抑制抗原提呈细胞介导的抗原特异性淋巴细胞增殖，该作用与巨噬细胞表面存在能与Zot以特异性和饱和方式结合的受体有关。这种免疫反应的下调至少部分与对抗原的摄取减少有关。

Description

应用Zot或zonulin以抗原特异性方式 抑制淋巴细胞增殖的方法

本发明的进行是受马里兰州巴尔的摩马里兰大学资助的。在此描述的某些研究得到国立卫生研究院(NIH)的资助，NIH资助基金号为No.DK-48373。政府拥有某些权利。

相关申请的交叉引用

本项申请是依照35U.S.Cξ111(a)提交的申请，声明依照35U.S.Cξ111(b)提交的、申请日为1998年9月14日、申请号为60/100,266的临时申请的有关35U.S.Cξ119(e)(i)的权益。

发明领域

本发明涉及应用Zot或zonulin引起的抗原特异性免疫反应下调。更具体地说，本发明提供一种通过应用有效剂量的Zot或zonulin以剂量依赖性方式抑制抗原提呈细胞介导的抗原特异性淋巴细胞增殖的方法。

                      发明背景Ⅰ．紧密连接和肌动蛋白细胞骨架

紧密连接(以下简称″tj″)或闭合带(以下简称为“ZO”)是吸收和分泌性上皮细胞的主要特征之一(Madara,J.Clin.Invest.,83:1089-1094(1989)；Madara，分泌性腹泻教科书，Lebenthal等，第11章，125-138页(1990年)。作为顶部和底侧部腔隙的屏障，紧密连接通过细胞旁通路选择性地调节离子和水溶性溶质的被动扩散(Gumbiner,Am.J.Physiol.,253(Cell Physiol.,22):C749-C758(1987))。这一屏障维持着与跨细胞途径有关的多种通路活动产生的任何梯度变化(Diamond,Physiologist,20:10-18(1977))。

大量证据表明，曾被认为属于静态结构的ZO其实是动态的，能很容易地应用到多种发育的(Magnuson等，Dev.Biol.,67:214-224(1978)；Revel等，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.,40:443-455(1976)；Schneeberger等，J.Cell Sci.,32:307-324(1978))、生理性的(Gilula等,Dev.Biol.,50:142-168(1976)；Madara等，J.Membr.Biol.,100:149-164(1987)；Mazariegos等，J.Cell Biol.,98:1865-1877(1984)；Sardet等，J.Cell Biol.,80:96-117(1979))和病理性的(Milks等，J.Cell Biol.,103:2729-2738(1986)；Nash等，Lab.Invest.,59:531-537(1988)；和Shasby等，Am.J.Physiol.,255(Cell Physiol.,24):C781-C788(1988))情况。发生这种适应性改变的调节机理目前尚未完全清楚，但是已经明确，在钙离子存在的情况下，ZO的装配是细胞相互作用的结果，即触发了复杂的级联生物化学反应，最终导致一种有组织ZO元件网络的形成和调节，对这些过程仅有部分了解(Diamond,Physiologist,20:10-18(1977))。一种侯选的跨膜蛋白闭合(occluding)束已经被鉴定(Furuse等，J.Membr.Biol.,87:141-150(1985))。

已经在膜接触部位下的胞浆膜斑块中发现6种蛋白，但它们的功能尚待确定(Diamond，见前)。ZO-1和ZO-2是作为一个异二聚体(Gumbiner等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,88:3460-3464(1991))与一个未明确特性的130KD蛋白质(ZO-3)存在于一个对去垢剂稳定的复合物中。大多数免疫电镜研究发现ZO-1恰好位于膜接触部位的下面(Stevenson等，Molec.Cell Biochem.,83:129-145(1988))。两种其它蛋白质Cingulin(Citi等，Nature(伦敦)，333:272-275(1988)和7H6抗原(Zhong等，J.Cell Biol.,120:477-483(1993))位于远离膜的位置，目前未被克隆。Rab13作为一种小的GTP结合蛋白，最近被发现也位于结合区域(Zahraoui等，J.Cell Biol.,124:101-115(1994))。已知其他小的GTP结合蛋白的功能是调节皮质细胞骨架，例如rho调节肌动蛋白-膜在局部接触部位的结合(Ridley等，Cell,70:389-399(1992))；rac调节生长因子诱导的膜边缘波动(Ridley等，Cell,70:401-410(1992))。基于有类似在较多了解的细胞连接、局部接触(Guan等，Nature,358:690-692(1992))和粘附连接(Tsukita等，J.Cell.Biol.,123:1049-1053(1993))等部位上斑块蛋白的已知功能，可以假设TJ相关的斑块蛋白参与跨细胞膜的双向信号传导和对皮质肌动蛋白细胞骨架连接的调节。

为适应上皮细胞对多种不同病理和生理刺激的反应，ZO必须能够进行快速和协同反应，而这种反应需要有一种复杂的调节系统存在。涉及ZO的装配和调节的这一机制的确切特性是目前研究的热点领域。

已有大量证据表明，在肌动蛋白细胞骨架和吸收性细胞的tj复合体之间存在着tj结构和功能联系(Gumbiner等，见前；Madara等，见前；和Drenchahn等，J.Cell Biol.,107:1037-1048(1988))。肌动蛋白细胞骨架是由微丝构成的复杂网状结构组成的，微丝准确的几何形态由多种肌动蛋白结合蛋白调节。一个肌动蛋白结合蛋白磷酸化状态调节细胞骨架与细胞浆膜连接的一个范例是一种被称为肉豆寇酰化、富含丙胺酸激酶C底物(此后简称为“MARCKS”)。MARCKS是一种特异的蛋白激酶C(以后简称为“PKC”)基底，该基底与浆膜的胞浆面相联系(Aderem,Elsevier Sci.Pub.(UK),438-443页，(1992))。当处于非磷酸化状态时，MARCKS与膜肌动蛋白交联。所以，通过MARCKS与膜连接的肌动蛋白网状结构可能相对较坚固(Hartwig等，Nature,356:618-622(1992))。激活的PKC将从膜上释放的MARCKS磷酸化，(Rosen等，J.Exp.Med.,172:1211-1215(1990)；和Thelen等，Nature，351:320-322(1991))。与MARCKS连接的肌动蛋白可能被从细胞膜上分离，并且变的更有弹性。当MARCKS被脱磷酸化后，它又返回到细胞膜并重新与肌动蛋白交联(Hartwig等，见前；和Thelen等，见前)。这些数据提示F-肌动蛋白网络可能通过依赖PKC的磷酸化过程被重排，肌动蛋白结合蛋白参与这一过程(MARCKS是其中的一种)。Ⅱ．小带闭合毒素(“Zot”)和zonulin

通过去除编码霍乱毒素(CT)ctxa基因方法构建出的多数霍乱弧菌疫苗侯选物都能产生高水平的抗体反应，但其中一半以上的疫苗仍能导致轻度腹泻(Levine等，Infect.Immun.,56(1):161-167(1988))。假设在缺乏霍乱毒素的情况下仍能产生一定程度的腹泻，可以推测霍乱弧菌可以产生其他肠毒性物质，这些物质仍然存在于去除ctxA序列的菌株中(Levine等，见前)。这样就发现了由霍乱弧菌产生的第二种毒素：小带闭合毒素(此后简称为“Zot”)，它可引起残余的腹泻(Fasano等，Pro.Nat.Acad.Sci.,USA,8:5242-5246(1991))。Zot基因迅速定位在ctx基因靠近。在霍乱弧菌菌株中Zot基因与ctx基因同时出现的高比例(Johnson等，J.Clin.Microb.,31/3:732-733(1993)；Karasawa等，FEBS Microbiology Letters,106:143-146(1993))提示Zot在典型霍乱造成的急性脱水中可能起协同作用。近来，在其他肠道病原菌中也发现了Zot基因(Tschape,第二届亚洲太平洋地区伤寒和其他沙门氏菌病专题研讨会，47(摘要)(1994)。

过去已经发现，当在家兔回肠上进行实验时Zot能通过调节细胞间紧密连接来增加肠道的通透性(Fasano等，见前)。还发现改变细胞旁通路可引起肠粘膜通透性增加。也发现Zot并不影响钠离子-葡萄糖偶联的主动转运过程、无细胞毒性和不能完全消除跨上皮阻力(Fasano等，见前)。

特别是最近发现，Zot能够可逆性开启肠道粘膜的紧密连接，因此当Zot与一种治疗药物同时经口服肠道给药时，能够影响治疗药物的肠道转运(WO 96/37196,U.S.专利5,827,534和U.S.专利5,665,389；每一专利在此引用并作为整体参考)。还发现Zot能够可逆性开启鼻腔粘膜的紧密连接，因此当与治疗药物合用时能增加治疗药物在鼻粘膜的吸收(WO 98/30211和U.S.专利5,908,825；在此引用并作为整体参考)。

在此引用并作为整体参考的U.S.专利5,864,014和5,912,323中，Zot受体已经从CaCo2细胞，心脏，肠道和脑组织中鉴定和分离出来。Zot受体可代表参与肠道上皮和鼻粘膜通透性的调节的细胞旁通路的第一步。

在此引用并作为整体参考的U.S.专利5,945,510中，与Zot免疫及功能相关的哺乳类动物蛋白，以及作为哺乳类动物紧密连接的生理调节物质已经被鉴定和纯化。这些被称做“zonulin”的哺乳类动物蛋白能够用于增强治疗药物通过肠道、鼻粘膜和血脑屏障等部位紧密连接的吸收。这些蛋白质进一步被证实能够与Zot受体结合。

1998年8月3日申请的尚未批准的U.S.专利申请09/127,815，题目为“zonulin的肽拮抗剂及其应用方法”，在此引用并作为整体参考。zonulin的肽类拮抗剂已经被鉴定。所述的肽拮抗剂能与Zot受体结合，但不能对哺乳类动物细胞紧密连接进行生理调节。这种肽类拮抗剂能完全抑制Zot和zonulin与Zot受体的结合，因而可以抑制Zot和zonulin对哺乳类动物细胞紧密连接开放的生理调节作用。Ⅲ．抗原提呈细胞和免疫反应

关于免疫反应和免疫调节的详细讨论参照由Sztein等编写的“免疫学最新进展”中的第10章：新一代疫苗，第99-125页，Eds.Levine等，(1997)，主要内容在此处参考引用。

预防病原感染的主要机理之一涉及特异性或获得性免疫。与先天性免疫相比，获得性免疫的作用机理是：当接触抗原或感染因子后诱导产生，包括，含于其他之中的，抗体、细胞毒性淋巴细胞(此后简称为“CTL”)和来源于T淋巴细胞的细胞因子(如干扰素-γ、白介素-4等)，当再次接触这些特异性抗原时反应程度放大。这种能够“回忆”以前对抗原的接触并迅速产生放大免疫应答反应(免疫记忆)的能力构成疫苗免疫预防感染原的基础。参与特异性免疫反应的主要细胞是T淋巴细胞和B淋巴细胞。

B淋巴细胞或B细胞来源于骨髓，是抗体分泌细胞(浆细胞)的前体。B细胞通过位于细胞膜上的免疫球蛋白受体识别抗原(蛋白质、碳水化合物或简单的化学基团)(Fearon等，Science,272:50-53(1996)；Ziegler-Heitbroack等，Immunol.Today,14:121-152(1993)；Banchereau等，Adv.Immunol.,52:125-262(1992))。当被抗原激发后，在T细胞、巨噬细胞和其他细胞来源的细胞因子的影响下，B细胞进行克隆扩增并开始表达抗体的同型体(IgM、IgG、IgE或IgA)。形体发生变异的，高亲和力B细胞可产生，并在生发中心和周围被抗原选择，该生发中心可在淋巴结、脾脏、Peyers斑和许多散在周围淋巴样系统的淋巴聚集处形成(Banchereau等，(1996)见前；Clark等，Ann.Rev.Immunol.,9:97-127(1991)；和MacLennan等，Immuno.Today,14:29-34(1993))。以上所述是B细胞记忆的基础。

与B细胞不同，T淋巴细胞或T细胞识别来源于存在于抗原提呈细胞(此后简称为“APC”)表面并与Ⅰ类或Ⅱ类主要组织相容复合物(MHC)分子结合的蛋白抗原的肽类。表达适度亲和力的T细胞受体(此后简称为“TCR”)的T淋巴细胞克隆受到抗原激发后增殖并发展成效应细胞(Fearon,(1996)见前；Sprent等，Cell,76:315-322(1994)；和Hendrick等，Germain，基础免疫学，第三版，第629-676页(1993))。当清除感染原后，抗原特异性克隆仍作为记忆T细胞，再次接触抗原后，会产生更强、更快和往往数量上不同的特异性免疫反应。

T细胞主要分两大群：表达CD4和CD8分子的T细胞。CD4和CD8是T细胞的表面糖蛋白，在通过结合Ⅰ类或Ⅱ类MHC分子的抗原提呈过程中分别作为重要的辅助分子(复合受体)(Hendrick等，见前(1993))。因此，CD4和CD8分子在稳定T细胞和APC的相互作用中起关键性作用，而APC则是由TCR复合物与提呈的MHC分子相关的抗原性肽类特异性结合后激活的。通常情况下CD4和CD8分子主要用于区分不同功能特征的T细胞，它们在Ⅱ类MHC分子限制和Ⅰ类MHC分子限制性T细胞激活时有重要作用。CD4+细胞(T辅助细胞或Th)主要参与炎症反应，协助B细胞产生抗体。CD8+细胞(细胞毒性T细胞或Tc)是CTL的主要成分，主要参与Ⅰ类MHC分子限制性杀伤被细菌、病毒和寄生虫等病原微生物感染后的靶细胞(Sztein等，J.Immunol.,155:3987-3993(1995)；Kaufman,Ann.Rev.Immunol,,11:129-163(1993)；和Immunol.Today,9:168-174(1988)；Townsend等，Cell,44:959-968(1986)；Malik等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,88:3300-3304(1991)；Sedegah等，J.Immunol.,149:966-971(1992)；Shearer等，Immunol.Today,17:21-24(1996))。

T细胞成功的抗原特异性激活导致T细胞增殖和分化(或淋巴细胞增殖)首先需要由T细胞表面的TCR和APC表面的MHC-抗原复合物相互作用产生的信号，其次还需要由可溶性因子如白介素-2，或CD28(一种共刺激分子)与APC表面的B7家族成员(如CD80(B7-1)或CD86(B7-2))等辅助性信号(Lenschow,Ann.Rev.Immunol.,14:233-258(1996)；Linsley等，Ann.Rev.Immunol.,11:191-212(1993))。关于CD28/B7共刺激通路和其他辅助稳定T细胞-APC相互作用(在淋巴细胞归巢中似乎也起重要作用)的粘附分子是近几年来重要的研究领域之一并且已经取得了许多重要进展。

将抗原提呈给T细胞涉及到APC细胞内的一系列过程，包括产生具有抗原性的肽类片段，这些肽类片段与MHC分子结合形成稳定的肽类-MHC复合体及将这些复合体转移到细胞表面并在T细胞表面被T细胞受体识别。有证据表明存在两种主要的抗原加工和提呈通路(经典途径)。其中的一条通路为“细胞浆通路”，主要用于提呈APC细胞内产生的肽类，如病毒蛋白、肿瘤抗原和与Ⅰ类MHC分子有关的自身肽类(Hendrick等，见前；和Germain等，见前(1993))。APC不能区分异己导致大量自身肽类复合物提呈到Ⅰ类MHC分子。在正常情况下，大多数选择性识别自身肽类的T细胞在T细胞分化过程中就被清除或者被积极下调，继之不能被自身肽类-Ⅰ类MHC分子复合体所激活。抗原处理和提呈的第二种经典通路是“内涵体通路”，主要用于提呈与Ⅱ类MHC分子结合的可溶性外源性抗原，参与APC对抗原的捕获，这一过程是通过与特异性受体结合或在液态中通过泡饮作用摄取来完成的(Lanzavecchia,Curr.Opin.Immunol.,8:348-354(1996))。通过TCR的T细胞激活在流感核蛋白中显示有200-600肽/MHC复合物(Falk等，Semin.Immunol.,5:81-94(1993))。在大多数免疫反应中，与Ⅰ类MHC分子相关的抗原决定簇触发CD8+CTL反应的活化，而来源于Ⅱ类MHC分子的可溶性蛋白复合物的抗原片段(簇)由CD4+Th细胞进行识别。这些发现是近年来对涉及早期免疫激活机制做作出的最重要贡献之一，对成功地开发疫苗十分重要。

如上所述，抗原的处理和提呈有两种“经典”通路。Ⅰ类MHC通路最常用于处理细胞成分蛋白，这些成分存在于大多数，并不是所有的，细胞腔隙中，包括细胞溶质、细胞核和线粒体(Falk等，见前(1993))，目的是为了CD8+CTL进行识别。Ⅱ类MHC通路主要用于处理和提呈外源性、能够提呈给CD4+Th细胞的抗原，如由细胞外细菌和其他感染性微生物产生的蛋白质。Ⅰ类和Ⅱ类MHC分子都是通过利用表面“受体”或“结合裂隙”与肽类抗原进行结合，但是两种分子对抗原的处理和准备途径截然不同。Ⅰ类抗原由“细胞浆通路”进行处理和准备。具体来说，细胞内合成的肽被降解成小的蛋白质片段，然后转运穿过内质网膜。在内质网内抗原片段与Ⅰ类MHC分子结合形成复合物，然后被转运至高尔基体，最终到达细胞表面并被TCR识别，给抗原特异性CTL扩增和分化，免疫反应的第一步提供信号。另一方面，Ⅱ类抗原由“内涵体通路”进行处理和准备，具体来说，自然抗原由循环中的APC捕获，抗原与特异性或非特异性受体结合。然后通过受体介导的胞吞或胞饮机理使抗原摄入APC内，进入细胞内的抗原被局限在内涵体内，后者是一种与膜连接的小泡，其主要功能是参与细胞内转运和降解抗原。被分裂的肽类片段与Ⅱ类MHC分子结合形成复合物，通过高尔基体转运进入内涵体，然后到达细胞表面并被TCR识别，为抗原特异性Th细胞的扩增和分化提供信号。

APC在产生免疫反应的过程中起极其关键的作用。以Ⅰ类限制方式将处理过的抗原提呈给CTL时，APC必须表达Ⅰ类MHC分子，并且能够在细胞表面表达内源性产生的与Ⅰ类MHC分子形成复合物的蛋白质。几乎所有能够产生可进入细胞胞浆的病毒、寄生虫或细菌蛋白质、或肿瘤抗原的细胞都可作为APC。以Ⅱ类限制的方式将处理过的抗原提呈给Th细胞时，APC必须能够通过特定抗原的特异性或非特异性受体来识别和结合抗原。能将抗原高效提呈给Th淋巴细胞的细胞可称之为专职APC，包括树突状细胞(DC)、巨噬细胞、B淋巴细胞、郎罕氏细胞，在某些情况下，人内皮细胞也可成为专职APC(Lanzavecchia，见前(1996))。

现在认为来源于骨髓的DC是最有效的提呈可溶性抗原的APC。DC从周围捕获抗原后游走到脾脏或淋巴结，在上述部位有效地激活Th细胞，特别是自身T细胞(Lanzavecchia，见前(1996)；Peters等，Immunol.Today,17:273-278(1996))。DC的几项独特特征使其能够高效提呈抗原。具体来说，它能够通过下述几种机制使可溶性抗原进入细胞内，包括细胞成分的胞饮作用，通过与CD23受体结合将抗原-抗体复合物纳入细胞内，将甘露糖化或岩藻糖化的抗原通过与甘露糖受体结合转入细胞内。这就使得DC能在短期内获得大量液体并贮存在含有Ⅱ类MHC分子和蛋白酶的溶酶体腔内。从结构上DC还能表达多种具有共刺激作用的分子和其它粘附分子，这些分子表达能够被前炎症细胞因子如白介素-1α、白介素-1β和肿瘤坏死因子α等上调，从而增强它们作为APC进行Ⅱ类MHC分子限制性Th免疫反应的功能。

巨噬细胞和其它单核巨噬细胞对来源于除病毒外的大多数病原微生物抗原来说可能是最有效的APC，这主要是通过它们能够吞噬像细菌和微生物等大的颗粒来实现的。在正常情况下，被吞噬了的微生物在吞噬溶酶体中被杀灭和消化，产生能够与Ⅱ类MHC分子结合并提呈给Th细胞的抗原片段。巨噬细胞作为有效APC的其他重要机制包括：它能够将抗原-抗体复合物与CD16,CD32,CD64受体结合，将可溶性抗原纳入细胞内；它能通过C3受体、其它补体成分、其它生长因子的刺激作用和胞饮作用将被补体包被的蛋白质纳入细胞内；另外，巨噬细胞能表达甘露糖受体，是前炎症细胞因子白介素-1α、白介素-1β、白介素-6、白介素-8、白介素-12、肿瘤坏死因子α和肿瘤坏死因子β的主要来源，这些因子在T细胞反应中发挥有效的免疫调节活性(Sztein等，见前(1997))。

B淋巴细胞在将可溶性抗原提呈给Th细胞时是非常有效的APC。其主要基础是B淋巴细胞能够通过B细胞受体复合物(BCR)结合并使特异性可溶性抗原有效地进入细胞，BCR是由膜免疫球蛋白(mIg)和Igα(CD79α)-Igβ(CD79β)异二聚体组成(Falk等，见前(1993))。

郎罕氏细胞(LC)来源于骨髓干细胞，被认为是表皮中唯一具有APC功能的细胞。LC经过淋巴管从表皮游出，到达局部淋巴结并成为DC。有趣的是，LC能表达CD1，而CD1是一种能够以非限制方式将非蛋白抗原，如微生物脂质和糖脂抗原，提呈给T细胞的非典型MHC分子。

本发明的焦点是APC介导免疫反应的抗原特异性下调。本发明起源于发现Zot能特异性地、饱和性地结合巨噬细胞表面受体。本发明描述了应用Zot或Zonulin作为抗原特异性免疫调节物和用于免疫治疗的方法。具体说，Zot和Zonulin都能以剂量依赖的方式抑制APC介导的抗原特异性淋巴细胞增殖，而并不影响丝裂素引起的反应。这种免疫反应的下调至少部分与抗原摄入的减少有关。

目前现有的免疫反应调节物如环孢素和类固醇类化合物，对抗原和免疫系统的丝裂素刺激有非特异性的作用(Reed等，J.Immunol.,137:150-154(1986))。在此公开的本发明具有在下调某一特定抗原的免疫反应的同时，不引起增加感染的机会和非特异性的全身免疫抑制等副作用的优点，而这些副作用对现有技术的免疫调节剂则是典型的。

                  发明概要

本发明的目的之一是提供一种下调动物宿主对特定抗原免疫反应的方法，并由此促进免疫基础治疗。具体说，本发明的目的之一是抑制抗原提呈细胞(APC)处理和向淋巴细胞提呈抗原的能力，从而抑制淋巴细胞增殖和继发的免疫系统对特定抗原的反应。

本发明的另一目的是提供一种对患自身免疫或免疫相关疾病，或如多发性硬化、类风湿性关节炎、胰岛素依赖性糖尿病、腹腔疾病、斯耶格伦氏(Sjogren’s)综合征、系统性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜、溶血性贫血、格雷夫斯氏(Grave)病、阿迪森氏病、自身免疫性睾丸炎、恶性贫血、脉管炎、自身免疫性凝血障碍、重症肌无力、多发性神经炎、天疱疮、类风湿性心肌炎、多发性肌炎、皮肌炎和硬皮病等疾病的动物给予有效量的Zot相关性免疫调节物进行治疗的方法。在一个可以选择的实施方案中，对患自身免疫性或免疫相关疾病或其他疾病的动物的治疗可联合应用有效剂量的Zot相关性免疫调节物和特异性自身免疫相关抗原。

本发明的另一目的是提供一种应用有效剂量的Zot相关性免疫调节物治疗组织或器官移植后动物产生的免疫排斥的方法。在一个可以选择的实施方案中，治疗组织或器官移植后发生免疫排斥可联合应用有效剂量的Zot相关性免疫调节物和特异性移植抗原。

本发明的另一目的是提供一种应用有效治疗剂量的Zot相关性免疫调节物治疗患炎症或过敏性疾病或其他疾病如哮喘、干癣、湿疹性皮炎、卡波齐氏肉瘤、多发性硬化症、炎性肠病、平滑肌细胞增生性疾病和与霉菌、病毒、寄生虫或细菌感染有关的炎症状态的动物的方法。在一个可以选择的实施方案中，治疗患炎症或过敏性疾病或其他疾病可联合应用有效剂量的Zot相关性免疫调节物和特异性炎症相关性抗原或过敏原。

                  插图的简要描述

图1表示淋巴细胞和巨噬细胞的Zot-FITC饱和结合曲线。数据表明Zot倾向于与人的单核细胞/巨噬细胞结合。

图2表示通过非标记的Zot阻断Zot-FITC结合。将外周血单核细胞与未标记的Zot预孵育可降低Zot-FITC与单核细胞/巨噬细胞和T淋巴细胞的结合，下降大约33％，提示Zot与这些细胞的结合是受体介导的。将细胞与纯MBP预孵育对Zot-FITC结合无影响，提示用非标记的Zot阻断是一种特异性现象。

图3表示Zot对PHA和破伤风类毒素诱导的人PBMC增殖的影响。数据表明Zot能显著抑制破伤风类毒素诱导的增殖，并呈剂量依赖性，而对PHA诱导的增殖无作用。

图4表示抗-Zot抗血清对Zot诱导的抑制人PBMC增殖的影响，人PBMC的增值是由破伤风类毒素诱导的。添加抗Zot抗血清可逆转Zot介导的对破伤风类毒素诱导的增殖抑制，抑制率超过50％。

图5A-5D表示Zot对正常人CD14+HLA-DR+巨噬细胞对FITC-葡聚糖摄取的影响。图5A描绘了在0℃FITC-葡聚糖在培养基中的摄取(2.9％)，代表抗原摄取对温度的依赖性。图5B描绘了在37℃FITC-葡聚糖在培养基中的摄取(46.0％)，代表对抗原摄取的对照。图5C描绘了在37℃FITC-葡聚糖在BSA中的摄取(39.0％)，代表对抗原摄取的阴性对照。图5D描绘在37℃FITC-葡聚糖在Zot中摄取(19.3％)，数据显示Zot降低抗原的摄取。

图6表示人巨噬细胞和淋巴细胞中每个细胞上FITC-Zot的结合位点数。PBMC与递增浓度的Zot-FITC孵育并用流式细胞仪进行分析。将与Zot-FITC孵育后每一群细胞的平均荧光强度用Quantum 26 MESF试剂盒构建的标准曲线转化成每个细胞上Zot的结合位点数。这些数据表明，Zot的结合是一种可饱和现象，当浓度为大约0.5pM时达到饱和，每个巨噬细胞细胞表面Zot结合位点的平均数(大约106000个)高于淋巴细胞(大约9000个)约10倍。

图7A-7C表示Zot结合人巨噬细胞和淋巴细胞的动力学。确定Zot与人细胞结合的动力学是用Zot-FITC共扼化合物通过流式细胞仪来完成的。标记抗-CD3-ECD和抗-CD-14-PE mAb的PBMC在实验中维持在37℃(12分钟)，数据用连接流式细胞仪的活性样本处理器(动力学模块)采集。采集基础FITC荧光水平90-150秒(由箭头指示)，停止读取数据10-15秒，进行Zot-FITC注射(图7A和7B)。图7C显示抗-CD14-FITC与未标记的人单核细胞/巨噬细胞结合的动力学。数据对CD3(淋巴细胞)或CD14(巨噬细胞)细胞的Zot-FITC强度(y轴)、相对时间(x轴)和细胞数(Z轴)进行等比显示。结果提示Zot与人巨噬细胞(图7A)和淋巴细胞(7B)结合十分迅速，在加入Zot-FITC后2分钟内即可达到平衡。

图8表示Zot-FITC与人T淋巴细胞和B淋巴细胞的结合。PBMC与Zot-FITC和T(CD3+)、B(CD19+)淋巴细胞上分子的单克隆抗体(mAb)进行孵育，然后用流式细胞仪进行分析。对应于前向相对侧向离散的淋巴区域的细胞的同位素FITC标记对照mAb(mIg)也显示可作为非特异性结合的标志。结果提示Zot与T和B淋巴细胞均能结合。

图9表示Zot拮抗剂不能阻断Zot-FITC结合。将用CD14-PE和CD3-ECD染色的PBMC冲洗并在4℃AIM-V培养基中单独，或与100倍多的FZI/0(SEQ ID NO:7),FZI/1(SEQ ID NO:8),BSA(阴性对照)或4倍多的未标记Zot(阳性对照)添加物共同孵育15分钟。然后将细胞与Zot-FITC孵育并用流式细胞仪进行分析。结果用相对在培养基中单独孵育的细胞的平均荧光强度(人为给定值为100％)，与Zot-FITC在Zot拮抗剂、未标记的Zot或BSA的存在下进行孵育的细胞的平均荧光强度的抑制百分比来表示。结果表明添加FZI/0或FZI/1 Zot拮抗剂并不能明显阻断Zot-FITC与CD14⁺巨噬细胞的结合。相反，与未标记的Zot预孵育能阻断Zot-FITC结合24-43％。

图10A-10B表示Zot抑制人单核/巨噬细胞CD14的表达。将PBMC在缺乏或存在TT、无或有纯Zot或BSA存在的条件下孵育18小时，用CD14-FITC染色并用流式细胞仪分析。结果用“单核细胞区域”细胞CD14荧光的单色直方图表示，所谓“单核细胞区域”是根据人巨噬细胞前向离散对侧向离散的特征来定义的。结果发现，加入Zot在缺乏(图10A)或存在TT(图10B)时能显著抑制CD14的表达。

图11表示Zot对人单核/巨噬细胞和淋巴细胞活力的影响。PBMC在有或无纯Zot或BSA存在的情况下培养不同时间，细胞活力用propidium碘排除试验和流式细胞仪来评估。结果用位于“单核细胞区”或“淋巴细胞区”中活细胞的百分比来表示，细胞区根据上述细胞前向对侧向的离散特征来定义。结果显示，加入Zot在相对早期就可影响巨噬细胞的活力，而对淋巴细胞活力的影响在培养至少4天以后才变得明显。

图12A-12C表示Zot介导的对人单核细胞/巨噬细胞产生细胞因子的诱导。PBMC在无或有纯Zot或BSA的条件下培养4天。指定时间收集上清液，细胞因子水平用化学荧光ELISA法测定。加入Zot可引起高水平肿瘤坏死因子-α(图12A)和白介素-10(图12C)的产生，早期6小时开始，24消失达到峰值。也观察到诱导少量白介素-1β(图12B)产生。

图13A-13B表示Zot介导的对人淋巴细胞产生细胞因子的诱导。PBMC在无或有TT、无或有纯Zot或BSA的条件下培养3天，上清液中的细胞因子水平用化学荧光ELISA法测定。加入Zot可引起由与TT孵育时诱发的白介素-2生成的抑制，在无TT存在时Zot不能诱导出可以测得的白介素-2(图13A)。相反，在无TT时，加入Zot能持续诱导干扰素-γ产生，与TT诱导产生的水平相似，并且TT诱导能明显增加干扰素-γ的水平(图13B)。

              本发明的详细描述

以往的研究集中在Zot和Zonulin对哺乳类动物多种组织上皮紧密连接(或闭合带)开启的生理调节能力上。这种调节对促进药物跨这些膜转运十分有用。在本研究过程中，Zot和Zonulin受体已经从CaCo2细胞、心脏、肠道和脑组织中鉴定并分离出来。除发现Zot受体外，zonulin肽类拮抗剂也被发现，所述的肽类拮抗剂能与Zot受体结合，但在功能上对哺乳类动物细胞紧密连接开启的生理调节并无作用(如缺乏生物活性)。肽类拮抗剂竞争性抑制Zot和Zonulin与Zot受体的结合，从而抑制Zot和Zonulin调节紧密连接的能力。

在已知Zot和Zonulin对细胞旁通路产生影响的前提下，又在从血液中分离出来的分化完全的巨噬细胞上发现Zot受体是令人惊奇的。最初不清楚为何像巨噬细胞这样的循环细胞具有与组织细胞调节有关分子的受体。在寻找问题答案的过程中，又发现了Zot和Zonulin同时对巨噬细胞活性具有生理调节功能。尽管不希望被理论所束缚，Zot似乎是阻断了巨噬细胞上的受体，与巨噬细胞表面受体以特异性和可饱和的方式相结合。通过与巨噬细胞结合，Zot改变了巨噬细胞处理抗原和向淋巴细胞提呈抗原的能力，最终以剂量依赖和抗原特异的方式抑制淋巴细胞对抗原的增殖反应。换言之，Zot引起抗原特异性免疫反应下调。后面关于这项结果的详细描述进一步提示这种免疫反应下调至少部分与抗原摄取减少有关。Zot似乎是一种多功能的蛋白质，通过调节摄取和运输抗原的双重机制来控制免疫反应。

小带闭合素或＂Zot＂由霍乱弧菌产生，产生Zot的特定霍乱弧菌菌株在本发明中并不十分重要。这些霍乱弧菌的实例包括569B,395和E7964(Levine等，见前；Johnson，等，见前；Karasawa等，见前)。

在此处“Zot”是指具有399个氨基酸的成熟蛋白质，以及保持调节紧密连接功能的突变体，例如氨基酸1-8的N末端缺失并不影响Zot活性，ZotN末端的融合蛋白对Zot活性也无影响。这种突变体能通过位点导向诱导突变的方法很容易制备，并且能如在此描述的方法检测Zot活性。

可以获取并纯化Zot，例如通过基因工程的方法从过度表达Zot基因的大肠杆菌菌株中获得(Baudry等，Infect.Immun.,60:428-434(1992))，也可通过单独或融合其他基因如麦芽糖结合蛋白(参照下面的实例1)、谷胱甘肽-硫-转移酶(参照下面的实例2)或6聚组氨酸(参照下面的实例2)。

在此处使用的术语“zonulin”是指分子量大约为47kDa的纯的活性蛋白质，这是通过SDS-聚丙酰氨凝胶电泳确定的。下面的N末端氨基酸序列：Asn Asp Gln Pro Pro Pro Ala Gly Val Thr Ala Tyr Asp Tyr LeuVal Ile Gln(SEQ ID NO:1)或下述N末端氨基酸序列：Glu Val Gln LeuVal Glu Ser Gly Gly Xaa Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu(SEQID NO:2)以及突变体等均保持了与Zot受体结合进而调节紧密连接的能力。

Zonulin可在多种哺乳类动物细胞和组织中生成或被发现，如兔或人细胞/组织。但zonulin特定哺乳类动物细胞/组织来源类型在本发明中并不十分重要。生成zonulin的哺乳类动物组织类型的实例包括心脏、肺脏、肠道、肝脏、脑、肾和胰脏。

zonulin的获得和纯化，可用抗Zot抗体通过亲和纯化色谱的方法进行，此方法在美国专利5,945,510的实例3中详细描述，在此参考引用。

此处使用的术语“Zot相关的免疫调节物”或“Zot相关的免疫调节分子”指Zot或zonulin，如上所述的定义。在此使用的术语“抑制”是指能导致淋巴细胞增殖有实质减少的APC任何活性的下调。活性的实例包括抗原摄取、抗原处理和抗原提呈。此处所说的“抑制”并不需要对功能或结果施加完全抑制。而主要是指部分抑制。

为治疗患自身免疫或免疫相关疾病，或如多发性硬化、类风湿性关节炎、胰岛素依赖性糖尿病、腹腔疾病、斯耶格伦氏(Sjogren’s)综合征、系统性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜、溶血性贫血、格雷夫斯氏(Grave)病、阿迪森氏病、自身免疫性睾丸炎、恶性贫血、脉管炎、自身免疫性凝血障碍、重症肌无力、多发性神经炎、天疱疮、类风湿性心肌炎、多发性肌炎、皮肌炎和硬皮病等疾病的动物宿主，可单独应用Zot相关性免疫调节物进行治疗或与特异性自身免疫相关抗原联合应用。与自身免疫疾病相关的特异性自身免疫抗原的实例是麸脘(与腹腔疾病有关的抗原)和髓磷脂碱性蛋白(与多发性硬化有关)。

为治疗动物在接受组织或器官移植后发生的免疫排斥反应，可单独应用Zot相关性免疫调节物或与特异性移植抗原联合应用。移植抗原可通过测定移植组织或器官的HLA来获得。

为治疗患炎症或过敏疾病，或如哮喘、干癣、湿疹性皮炎、卡波齐氏肉瘤、多发性硬化症、炎性肠病、平滑肌细胞增生性疾病和与霉菌、病毒、寄生虫或细菌感染有关的炎症状态等疾病的动物，可以单独应用Zot相关的免疫调节剂或与特异炎症相关抗原或过敏原联合应用。与炎症或过敏性疾病或其他疾病有关的特异性炎症相关抗原的实例是花粉和灰尘(与哮喘相关)、牛奶中的蛋白质或片段(与湿疹性皮炎有关)、髓磷脂碱蛋白(与多发性硬化有关)和与特定病毒、微生物或细菌等炎症状态有关的疫苗抗原。

本发明使得免疫反应发生抗原特异性下调。如上面所述，此发明的一个实施方案包括单独应用有效剂量的Zot相关免疫调节剂(Zot或Zonulin)或与特异性抗原联合，导致淋巴细胞对所述的抗原反应以剂量依赖的方式被特异性抑制。从此处的详细结果可以清楚地看到，本发明限于那些需要巨噬细胞调理的抗原提呈细胞处理和提呈的抗原。本发明涉及包括巨噬细胞和其他单核巨噬细胞、树突状细胞，B淋巴细胞，郎罕氏细胞和人内皮细胞在内的所有APCs。在优选的实施方案中，APC是一种巨噬细胞。

本发明在体内或体外环境中都可应用。唯一的关键是向动物细胞给药，所述的细胞是活的宿主或是细胞培养物。动物细胞定义为：来源于或存在于属于动物王国分类中的多细胞微生物中的有核而不含叶绿体的细胞，原代培养细胞，移植培养物或转化细胞系。

本发明中的受体或宿主动物并不重要，包括存在或来源于动物界中所有生物中的细胞。在一个优选到实施方案中，动物在哺乳类动物家族中选择。优选的动物和动物细胞是哺乳类动物细胞如：人、牛、羊、猪、猫、水牛、犬、山羊、马、猴、鹿和灵长类。最优选的动物或动物细胞是人或人细胞。

特定的给药方式和方法对本发明并不重要。最关键的是Zot相关免疫调节分子和抗原与巨噬细胞接触。在本发明的内容中，Zot相关免疫调节分子和抗原可以同时给予。也可选择先后给予。为简便起见，下面关于给药方式和药物制备的讨论将只讲抗原的制备和给药。当然，很明显，Zot相关免疫调节分子的给药方法也是用同样的方式。再者，尽管本讨论仅限于应用一种抗原，但很明显也可给予多种抗原，对多种抗原的免疫反应在随后能够自动下调。

成功的给药需要将药物运送至富含APC的环境中。优选的给药途径包括粘膜或淋巴组织这样的免疫系统靶位。因此鼻内、眼内、肠道内和阴道内给药是优选的途径。这并不排除胃肠外给药方式，如皮内、肌肉内、皮下和静脉给药也可能成为Zot或zonulin单独或与优选抗原联合给药的有效途径。

根据特定的给药途径，剂型可以是固体、半固体或液体制剂。剂型可包括添加剂、润滑剂、稳定剂、缓冲剂、外皮和赋形剂等，这些在药物制剂的范围内都是标准的。

关于给药方式，抗原可作为口服制剂为小肠给药。对这种为小肠给药的口服制剂在本领域中是为人熟知的，常常需要制成能抵抗胃酸的片剂或胶囊(Remington’s药物科学，16^th版，Eds.Osol,Mack出版公司，第89章(1980)；Digenis等，J.Pharm.Sci.,83:915-921(1994):Vantini等，Clinica Terapeutica,145:445-45l(1993)；Yoshitomi等，Chem.Pharm.Bull.,40:1902-1905(1992)；Thoma等，Pharmazie,46:33l-336(1991)；Morishita等，Drug Design and Delivery,7:309-319(1991)；和Lin等，Pharmaceutical Res.,8:919-924(1991)；其中每一篇在此引用并整体作为参考。

制造能抵抗胃酸的片剂需要添加，例如，乙酰苯二甲酸纤维素或乙酰对苯二酸纤维素。

胶囊是固体剂型，抗原被包饶在一个硬质或软质、可溶性的容器或凝胶壳中。制造过程中应用的凝胶是通过水解作用从含胶原的物质中获得。有两种凝胶，A型凝胶来源于猪皮，经酸处理后获得。B型凝胶从碱化处理的骨骼和动物皮肤中获得。应用硬质凝胶胶囊便于在给予一种单一抗原或为患者最佳考虑的以准确的剂量联合给药进行选择。硬质凝胶胶囊包括两部分，两部分重叠使得能完全包绕单一抗原或抗原与免疫调节分子的复合物。将抗原装入胶囊或制成含有抗原的能抵抗胃酸破坏的药粒，装入的部位在胶囊的长端，然后拧上帽。硬质凝胶胶囊大多通过凝胶制作，应用FD&C着色剂，有时应用避光物质如二氧化钛。为此USP允许凝胶中含有0.15％(W/v)的二氧化硫来预防凝胶制作过程中发生降解。

在本发明中，经小肠给药的口服制剂也包括用来预防抗原在胃中被胃酸显著灭活的含有水性缓冲剂的液体复合物，使得抗原以活性形式到达小肠。在本发明中应用的这种水性缓冲剂包括重碳酸盐缓冲液(pH5.5-8.7，优选大约PH7.4)。

当口服药物是液体剂型时，优选在给药前配制，减少稳定性的问题。在这种情况下，可通过溶解存在于水状缓冲剂中冻干的肽类拮抗剂来配制液体制剂。

同样地，本发明还考虑了其它药物输送颗粒，包括但不限于脂质体，螺旋体，水溶性聚合物和微球体。药剂成分可能进一步包含佐剂如单磷酰脂A,QS-21,ISCOMs和细胞因子。

抗原也可以以静脉用剂型输送到免疫系统的全身成分中。这些剂型在本领域中已为人熟知，通常包括生理性的稀释剂，如蒸馏水，或0.9％(w/v)NaCl。同样地，用药方式可以是肠道外，皮内，肌注，或皮下以及上述所提及的。这样用药的剂型很明显包含了药学上合适的形式，包括生理缓冲液，稀释液或类似物。

正如这里所用的，有效剂量的Zot-相关的免疫调节因子，如Zot或zonulin，是指能下调上述抗原提呈细胞活性的有效剂量，因此才可以有效的下调抗原提呈细胞介导的淋巴细胞增殖。所使用的特定量的抗原和Zot-相关的免疫调节分子对本发明来说并不关键，可以随着疾病或治疗条件以及接受治疗者年龄，体重和性别的改变而改变。一般说来，为了获取这样一个最终浓度，如在肠道或在血中，单独口服本发明药物复合物中Zot-相关的免疫调节分子的剂量通常在大约0.1μg至大约100μg之间，优选大约2.0μg至大约60μg之间，更优选大约是20μg至大约50μg之间。同样地，单独口服本发明药物复合物中的抗原量通常在大约0.01μg至大约1000μg范围之间，更优选大约0.1μg至大约100μg。很明显，抗原使用的正确剂量可以随着受治疗者疾病或紊乱的改变而改变，优选的范围可通过常规实验和优化措施确定。

下述提供的实例仅仅为了说明目的，并不限制本发明的保护范围。

                   实例1

FITC标记的Zot与淋巴细胞和巨噬细胞的结合A材料与方法

健康志愿者人外周血单核细胞(PBMC)的分离

PBMC是从健康志愿者中在淋巴细胞分离介质(LSM,Organon-Teknika,Durham,NC)中通过密度梯度离心分离的。供血者是成人并签署血液制品的知情同意书。使用的PBMC是新鲜或分装并采用可控的线性速度冷冻装置(每分钟1℃,Planner Biomed,Salisbury，英国)冻存在含10％的FCS(v/v)和10％DMSO(v/v)的RPMI中，以最大限度保存细胞的活性和细胞复苏。使用前细胞置于液氮中保存。在某些实验中，细胞分离后马上使用。

制备纯化的ZOT-MBP

培养用质粒pZ14转化的霍乱弧菌菌株CVD110(Michalski etal,Infect.Immun,G1:4462-4468,1993)，取5000ml上清液，使用可滤过分子量为10kDa以下的层流滤过器浓缩1000倍。pZ14含有霍乱弧菌zot基因，其构建在inter alia,WO 96/37196中已有详细的描述。将浓缩后的上清液通过8.0％(w/v)SDS-PAGE。通过考马思蓝染色SDS-PAGE凝胶来检测蛋白带。在相同的条件下，当与用质粒pTTQ181(Amersham,Arlington Heights,IL)转化的CVD110菌株比较时，没有检测到与Zot对应的蛋白带。因此，在pZ14中即使zot基因置于高度可诱导的、较强的tac启动子之后，在浓缩了1000倍的pZ14上清液中用考马思蓝染色的SDS-PAGE凝胶仍未检测到蛋白的水平。

因此，为了增加Zot的产量，可以将zot基因与麦芽糖结合蛋白(此后称为“MBP”)基因相融合产生MBP-ZOT融合蛋白。

MBP的载体pMAL-c2(Biolab)通过将zot基因融合到E.coli的malE基因上来表达和纯化Zot蛋白。这一构建使用了较强的、可以诱导的tac启动子，而malE的翻译起始信号可以使克隆的zot基因有较高的表达。pMAL-c2载体有一个准确的malE信号序列的缺失，可以使融合蛋白在胞浆中表达，利用MBP的亲和层析纯化来促进融合蛋白(Biolab)的分离。

更具体的是，将载体pMAL-c2用EcoRⅠ使其线性化(将malE基因3′末端切掉)，接上Klenow片段，并用XbaⅠ消化(在pMAL-c2多接头中有单一位点)。Orf编码的ZOT是从质粒pBB241亚克隆而来(Baudry等，Infect.Immun.,60:428-434,(1992))。质粒pBB241用BssHⅡ消化，连接上Klenow片段，然后用XbaⅠ消化。然后将平端XbaⅠ片段亚克隆进pMAL-c2，产生质粒pLC10-c。由于插入物和载体都有平端和粘端，正确的定向是malE的3′末端与插入物的5′末端融合。然后PLC10-c经电导入E.coli属DH5a。在pBB241中，BssHⅡ限制位点位于zot orf内。因此，在MBP-ZOT融合蛋白中，ZOT的1-8位氨基酸是缺失的。

为了纯化MBP-ZOT融合蛋白，将含有pLC10-c的单一菌落接种于10ml含0.2％(w/v)葡萄糖和100μg/ml的氨苄青霉素的Luria Bertani肉汤中，37℃持续震荡下孵育过夜。培养物以1∶100稀释于1ml相同的新鲜培养基中，持续震荡下37℃生长至大约1.0×10⁸细胞/ml。然后加入0.2mM的IPTG以诱导MBP-Zot的表达，37℃再孵育3hr。然后将细菌沉淀，并重悬于20ml冰冷的由20mM Tris-HCl,0.2M NaCl,1.0mMEDTA,10mM 2-ME,1.0mM NaN₃组成的“柱缓冲液”中。拍压处理使细菌悬液溶解，4℃13,000×g离心30min。收集上清液，用柱缓冲液1∶5稀释，并装入用柱缓冲液预平衡的1×10淀粉糖树脂柱(Biolabs,MBP-融合纯化系统)中。用5倍体积的柱缓冲液冲洗柱后，在柱缓冲液中加入10ml的10mM麦芽糖洗脱MBP-ZOT融合蛋白。1ml培养物的典型产量一般是2-3mg蛋白。

每20μgMBP-Zot中加入1.0μgXa因子蛋白酶(Biolabs)以便从纯化的MBP-Zot融合蛋白中在Zot的氨基末端前除去MBP融合物。将上述方法获得的Zot蛋白在8.0％(w/v)SDS-PAGE胶中电泳，使用电分离槽(Schleicher & Schuell,Keene,NH)将其从胶上电离洗脱。

在用Ussing槽检测时，所得的纯化Zot可诱导剂量依赖的RT降低，其ED₅₀值为7.5×10^-8M。

ZOT-MBP与荧光素异硫氰酸盐的结合作用(ZOT-FITC)

采用标准方法对Zot-MBP与FITC的进行结合。简单的说，Zot-BMP在500ml FITC标记的缓冲液中进行透析，缓冲液的组成是0.1M碳酸氢盐缓冲液(如，0.09M NaHCO₃+0.0085M Na₂CO₃)，用浓NaOH将PH值调至9.0并储存于4℃，在4℃储存8hr以便将PH值升至9.0。每毫克MBP-ZOT中加入10μl溶于DMSO中5.0mg/ml的FITC,PBS中4℃孵育过夜。未结合的FITC用500ml PBS(pH7.4)透析缓冲液经透析法除去，置于4℃储存2天，超过2天则在4℃换液2到3次。本产品在使用之前均储存于4℃。

FITC-ZOT与人PBMC的结合以及流式细胞仪分析

上述分离的PBMC与递增浓度的Zot-FITC在硅化试管中于37℃孵育60min(以预防巨噬细胞同试管壁的结合)，同时加入与藻红蛋白(PE)结合的CD14和与ECD(能量偶联染料，一种藻红蛋白-德克萨斯红结合体)结合的CD3单克隆抗体。CD14是人单核/巨噬细胞的标志，而CD3是T淋巴细胞的标志。这些荧光色素(如，FITC,PE和ECD)的使用可以通过三色流式细胞仪在混合的PBMC群中同时研究ZOT与PBMC中单核/巨噬细胞和T淋巴细胞的结合。然后用含有1.0％(w/v)BSA和0.1％(w/v)叠氮钠的PBS(pH7.2)冲洗两次，立即用Epics Elite流式细胞仪/细胞分捡系统进行流式细胞仪分析。

在这些实验中，对照采用的是荧光色素标记的同型但具有不同特异性的单克隆抗体。本分析通过设置对前离散比90％光离散参数合适的框架将血小板、红细胞(如果有的话)和细胞碎片排除。每一样品收集的数据都超过10,000个细胞。数据分析使用Epics Elite分析包(Coulter)或WinList list-mode分析包(Verity Software House,Topsham,ME)。B．结果

一个代表性的显示Zot-FITC结合的人T细胞(CD3+)和单核/巨噬细胞(CD14+)的流式细胞仪分析的试验见图1。结果表明，用平均荧光强度水平表示的Zot-FITC与单核/巨噬细胞的结合较其与T淋巴细胞的结合高数倍。而且，增加Zot-FITC的量会导致结合活性的增加，这种增加在加入40-60μl Zot-FITC后达到平衡。这些结果表明，Zot更倾向于与人单核/巨噬细胞结合。

其次，我们还检测了Zot-FITC在未标记Zot存在的情况下与人单核/巨噬细胞及淋巴细胞的结合，以便确定未标记Zot是否可以阻断这种结合。如图2所示，用100μl未标记Zot与PBMC在37℃预孵育30min后，加入10μl ZOT-FITC37℃ 30min,Zot-FITC与单核/巨噬细胞和T淋巴细胞的结合减少了33％以上，这表明Zot与这些细胞的结合是经受体调节的。将细胞与100μl纯化的MBP预孵育后加入10μlZOT-FITC于37℃置30min，不能阻断Zot-FITC的结合，表明未标记Zot的阻断作用是一个特异的现象。

                    实例2

       人单核细胞有丝分裂原和抗原的增殖反应A．材料与方法

健康志愿者人外周血单核细胞(PBMC)的分离

PBMC是从健康志愿者中在淋巴细胞分离介质(LSM,Organon-Teknika,Durham,NC)中通过密度梯度离心分离的。根据巴尔的摩马里兰大学制度审查委员会的规定，供血者是成人并签署血液制品的知情同意书。使用的PBMC是新鲜或分装并采用可控的线性速度冷冻装置(每分钟1℃,Planner Biomed,Salisbury，英国)冻存在含10％的FCS(v/v)和10％DMSO(v/v)的RPMI中，以最大限度保存细胞的活性和细胞复苏。使用前细胞置于液氮中保存。在某些实验中，细胞分离后马上使用。

制备纯化的Zot

zot基因用Deep Vent聚合酶(New England Biolabs)通过PCR方法扩增，使用pBB241质粒(Baudry等，见前)DNA作为模板。上游和下游引物分别是：5′-CGGGATCCCGTATGAGTATCTTT-3′(SEQ IDNO:3)；和5′-CCCAAGCTTGGGTCAAAATATACT-3′(SEQ ID NO:4)。这些寡核苷酸的5′末端分别包含了一个BamHⅠ和一个HindⅢ限制位点。目的扩增片段(1.2kb)在8.0％(w/v)琼脂糖胶中进行电泳分析，使用Xtreme旋转柱(Pierce)将其从盐和核苷酸中纯化。使用上述两种限制酶对扩增片段进行消化，将消化后所得的片段插入载体pQE30(Quiagen)中，载体pQE30已经被BamHⅠ和HindⅢ消化过，因此可以获得质粒pSU113。pQE30是一个表达载体，可以提供高水平的具有6个聚组氨酸条(6×His)的重组蛋白。质粒pSU113的表达产物因此是一个6×His-Zot的融合蛋白，然后pSU113转染进E.coli DH5a.

为了纯化6×His-Zot融合蛋白，将得到的转化E.coli在150ml含2.0％(w/v)的葡萄糖，25μg/ml卡那霉素和200μg/ml氨苄青霉素的Luria Bertani肉汤中37℃生长过夜，直到A₆₀₀约为1.10。然后，75ml过夜的培养物加入到1000ml含2.0％(w/v)的葡萄糖，25μg/ml卡那霉素和200μg/ml氨苄青霉素的Luria Bertani肉汤中，剧烈震荡下37℃生长大约3hr，直到A600约为0.7-0.9。然后，加入IPTG至终浓度为2.0mM，继续在37℃生长5hr。然后，4000×g离心20min后收获细胞，细胞在湿重5.0ml/g的缓冲液A中重悬，缓冲液A包括6.0M GuHCl,0.1M磷酸钠和0.01M Tris-HCl(pH 8.0)，室温下搅拌1hr。然后，将混合物4℃10,000×g离心30min，在上清液中加入湿重为4.0-5.0ml/g的50％SUPERFLOW树脂(QIAGEN)悬浮液，室温下搅拌1hr。将所得树脂装入1.6×8.0柱中，依次用缓冲液A，缓冲液B和缓冲液C冲洗，缓冲液B含8.0M尿素，0.1M磷酸钠，和0.01M Tris-HCl(pH8.0)，缓冲液C含8.0M尿素，0.1M磷酸钠，和0.01M Tris-HCl(pH6.3)，每一次清洗必须使清洗液的A₆₀₀低于0.01为止。用20ml含有250mM咪唑的缓冲液C将6×His-Zot融合蛋白从柱中洗脱。然后，含有6×His-Zot融合蛋白部分用SDS-SAGE检测，操作方法见Davis,Ann.N.Y.Acad.Sci.121:404,(1964)，胶用考马思蓝染色。含有6×His-Zot融合蛋白部分用8.0M尿素透析，然后在PBS中稀释100倍。然后加入4.0ml 50％SUPERFLOW树脂悬液，室温下搅拌2hr，将所得的树脂装入1.6×8.0柱中，用50ml PBS清洗。用10ml含有250mM咪唑的PBS将6×His-Zot融合蛋白从柱中洗脱。所获得的洗脱物用PBS透析，6×His-Zot融合蛋白如上述用SDS-PAGE检测。

兔抗Zot抗血清的制备和纯化

为了获得特异的抗血清，我们表达和纯化了一种嵌合的谷胱甘肽S-转移酶(GST)-Zot蛋白。

尤其是，用寡核苷酸引物通过多聚酶链式反应(PCR)以质粒PBB241作为模板DNA扩增zot orf(Baudry et al,supra)。上游引物(TCATCACGGC GCGCCAGG,SEQ ID NO:5)与zot orf的15-32核苷酸相对应，下游引物(GGAGGTCTAG AATCTGCCCG AT,SEQ IDNO:6)与5′端的ctxA orf相对应。因此，ZOT蛋白的1-5位氨基酸在所获得的融合蛋白中丢失。扩增产物插入pGEX-2T(Pharmacia,Milwaukee,WI)中GST基因末端的多接头处(SmaⅠ位点)。pGEX-2T是一个融合蛋白表达载体，可以与Schistosoma iaponicum的GST表达一个融合蛋白的克隆基因，这一融合基因在tac启动子的控制之下，用IPTG诱导可以使之衰退，GST融合蛋白表达。

所获得的融合质粒，即pLC11，经电导入E.coli DH5α。为了纯化GST-Zot融合蛋白，将PLC11的一个单独菌落接种于10ml含有100μg/ml氨苄青霉素的Luria Bertani肉汤中，震摇下37℃过夜。培养物在1ml相同的新鲜培养基中以1∶100稀释，震摇下37℃生长至1.0×10⁸细胞/ml。然后加入0.2MmIPTG以诱导GST-Zot的表达，将培养物于37℃继续孵育3hr将细菌沉淀后，在20ml冰冷PBS(pH 7.4)中重悬，用拍压方法使其溶解。在这些条件下GST-Zot融合蛋白是不溶性的，因此与细菌部分一起析出。因此，将剩余物在Laemli溶解缓冲液(0.00625M Tris-HCl(pH6.8),0.2M 2-ME,2.0％(w/v)SDS,0.025％(w/v)溴芬蓝和10％(v/v)甘油)中重悬，在8.0％(w/v)的PAGE-SDS胶中电泳，用考马思亮蓝染色。将与融合蛋白对应的在大约70kDa带(26kDa的GST+44kDa的Zot)，用电分离槽(Schleicher&Schuell,Keene,NH)将其从胶中电洗脱。

将10μg上述的洗脱蛋白(10-20μg)与等体积的弗氏完全佐剂混合后注射入兔。4和8周后，将两倍剂量与弗氏不完全佐剂混合后继续注射，一月后抽取兔血。

为了判断特异抗体是否产生，10^-10M的Zot，与两种融合蛋白MBP-Zot和GST-Zot一起，转移至尼龙膜上，与1∶5000稀释的兔抗血清4℃下孵育过夜，同时应中度震摇。将滤器用含0.05％(v/v)吐温20的PBS液(以后称为“PBS-T”)清洗4次，每次15min，与1∶30，000稀释的连接有辣根过氧化物酶的山羊抗兔IgG室温下孵育2hr，重新用含0.1％(v/v)吐温的PBS冲洗滤器4次，每次15min，用增强的化学发光仪(Amersham)来探测免疫反应带。

免疫印染实验发现，兔抗血清可以识别Zot，同时也可以识别MBP-Zot和GST-Zot融合蛋白，而在MBP阴性对照中未发现类似现象。

为了进一步确定合适的抗Zot抗体的产生，我们还用Ussing槽做了中和实验。将Zot特异的抗血清(1∶100稀释)与pZ14上清液37℃预孵育60min后，完全中和了由Zot诱导的兔Rt的减少，这一实验是用Ussing槽在兔回肠中发现的。

其次，抗Zot抗体是用MBP-Zot亲和柱亲和纯化。更特别的是，MBP-Zot亲和柱是用上述实例1中获得的1.0mg纯化的MBP-Zot在一预激活的胶(Aminolink,Pierce)上室温下固定过夜获得的。用PBS冲洗柱后在柱中装入2.0ml抗Zot兔抗血清。室温下孵育90min，用14mlPBS冲洗柱，用4.0ml含有50mM甘氨酸(pH2.5),150mM NaCl，和0.1％(v/v)Triton X-100的液体洗脱特异的抗Zot抗体后，立即用1.0NNaOH中和1ml洗脱部分的pH值。

培养条件和淋巴细胞增殖测定

PBMC(1.5×10⁶细胞/ml)在1.0ml完全培养基(cRPMI)中培养，培养基由含10％(v/v)胎牛血清和50μg/ml庆大霉素的RPMI1640组成。细胞置于96孔板培养，培养条件是37℃,5％CO₂，分别加入或不加植物血细胞凝集素(PHA，一种非特异的有丝分裂原，用量是2.0μg/ml)或破伤风类毒素(TT，一种特异抗原，用量是2.0μg/ml；Connaught,Swift Water,PA)，加入或不加纯化的ZOT(用量是20或60μg/ml)或牛血清白蛋白(BSA，一种对照蛋白，用量是20或60μg/ml；Fraction V,Sigma,St.Louis,MO)。在某些实验中，一种抗Zot兔抗血清或正常兔血清在开始也加入到培养基中。细胞培养2天(PHA)或6天(TT)后，每孔内加入1.0μCi氚标记的胸苷。培养板于20hr后用Wallac细胞收获器(Gaithersburg,MD)收获细胞，在Wallac TriluxMicrobeta计数器(Gaithersburg,MD)上测量掺入的胸苷。B．结果

代表性的实验显示纯化的Zot对由PHA或TT诱导的人PBMC增殖反应的影响，结果见图3。结果清楚表明，与Zot共同孵育可明显抑制TT诱导的增殖(60μg/ml剂量时抑制了85％)，而它对PHA诱导的增殖没有作用。而且，Zot对TT-诱导的增殖的抑制作用是剂量依赖性的。观察到用量为60μg/ml(85％)的Zot比用量为20μg/ml(56％)有明显更高的抑制水平。在TT或PHA诱导的淋巴细胞增殖中加入用作对照蛋白的BSA也没有反应，这表明Zot的生物活性是特异的。

为了进一步研究Zot对TT诱导的增殖的抑制作用的特异性，在加入或不加TT的情况下将PBMC与ZOT单独孵育、ZOT+抗ZOT兔抗血清(1∶10稀释)孵育或ZOT+正常兔血清(1∶10稀释)孵育。如图4中所示，加入抗ZOT兔抗血清使ZOT对TT诱导的增殖反应的抑制作用逆转了50％。而加入正常兔血清则没有此作用，证实了Zot介导效应的特异性。类似的，在这一实验中，加入BSA也没有此作用。

                   实例3

ZOT对人单核细胞和巨噬细胞内FITC-葡聚糖摄取的影响A．材料与方法

健康志愿者人外周血单核细胞(PBMC)的分离

PBMC是从健康志愿者中在淋巴细胞分离介质(LSM,Organon-Teknika,Durham,NC)中通过密度梯度离心分离的。根据巴尔的摩马里兰大学制度审查委员会的规定，供血者是成人并签署血液制品的知情同意书。使用的PBMC是新鲜或分装并采用可控的线性速度冷冻装置(每分钟1℃,Planner Biomed,Salisbury，英国)冻存在含10％的FCS(v/v)和10％DMSO(v/v)的RPMI中，以最大限度保存细胞的活性和细胞复苏。使用前细胞置于液氮中保存。在某些实验中，细胞分离后马上使用。

纯化的6×His-Zot的制备

6×His-Zot融合蛋白的制备及纯化步骤见实例2。

可溶抗原的摄取

摄取可溶性抗原能力的检测使用荧光素异硫氰酸盐(FITC)-结合的葡聚糖(MW 50,700；Sigma)。新鲜分离的PBMC(500,000细胞保存于0.5ml含10％(v/v)热灭活的FCS和50μg/ml的庆大霉素的cRPMI中)在加入或不加入纯化的ZOT(40μg/ml)或BSA(40μg/ml)37℃孵育3hr，终体积为0.5ml，置于50ml管中。孵育过程中将硅化试管剧烈震摇以防止单核细胞/巨噬细胞粘贴于管壁上。孵育后，不须清洗，加入FITC-葡聚糖(终浓度为300μg/ml)，异藻青蛋白(APC)标记的anti-CD14单抗和Peridinin叶绿素蛋白(PerCP)标记的anti-HLA-DR单抗，于37℃或冰上孵育30min。由于FITC-葡聚糖和通常的可溶性抗原的摄取依赖于胞饮作用，这是一个温度依赖的现象，因此，在0℃孵育的作用是建立FITC-葡聚糖与细胞结合的非特异水平。

在这些实验中，CD14和HLA-DR(一种主要的组织相容性抗原复合物Ⅱ类抗原，其表达水平随着细胞活性的增加而增加)用于鉴定单核/巨噬细胞。

然后细胞用冰冷的PBS清洗一次，立即在Coulter Epics Elite流式细胞仪/细胞分捡系统(Coulter Corp,Miami,FL)上计数。用WinList软件包(Vertity Software House,Topham,ME)对其结果进行分析。将37℃时与FITC-葡聚糖结合的细胞百分率减去0℃时与FITC-葡聚糖结合的细胞百分率便得到结合FITC-葡聚糖的细胞百分率。B．结果

代表性的实验显示了ZOT对正常人CD14+、HLA-DR+的单核/巨噬细胞摄取FITC-葡聚糖的影响，见图5A-5D。结果表明，与单独孵育在培养基或BSA中的细胞相比，ZOT明显抑制了人单核/巨噬细胞对FITC-葡聚糖的摄取作用(51-58％)(图5D)。而单独用培养基或加入BSA对结合FITC-葡聚糖的细胞百分率没有明显差异。而且，正如所期望的，在0℃孵育使FITC-葡聚糖的摄取完全消失，验证了这一现象是温度依赖的。

已有证据表明，由APCs如单核/巨噬细胞，引起的抗原摄取，是导致淋巴细胞激活和增殖的重要环节(Sztein等，见前，(1997))。结果表明，ZOT干预了FITC-葡聚糖的摄取，表明ZOT对TT-诱导的增殖的免疫调节作用至少部分是由于减少了单核/巨噬细胞摄取抗原的能力，导致了抗原加工与提呈的改变。这进一步由事实证明，ZOT并不影响PHA诱导的增殖，这一现象并不需要抗原加工和递呈。

                        实例4人单核细胞/巨噬细胞和淋巴细胞FITC-ZOT结合位点/细胞的检测A．材料与方法

健康志愿者人外周血单核细胞(PBMC)的分离

PBMC是从健康志愿者中在淋巴细胞分离介质(LSM,Organon-Teknika,Durham,NC)中通过密度梯度离心分离的。根据巴尔的摩马里兰大学制度审查委员会的规定，供血者是成人并签署血液制品的知情同意书。使用的PBMC是新鲜或分装并采用可控的线性速度冷冻装置(每分钟1℃,Planner Biomed,Salisbury，英国)冻存在含10％的FCS(v/v)和10％DMSO(v/v)的RPMI中，以最大限度保存细胞的活性和细胞复苏。使用前细胞置于液氮中保存。在某些实验中，细胞分离后马上使用。

纯化的6×His-Zot的制备

6×His-Zot融合蛋白的制备步骤见实例2。

ZOT与荧光素异硫氰酸盐(ZOT-FITC)的结合

ZOT与FITC的结合采用下列标准的技术。简单的说，ZOT在500mlFITC标记缓冲液中透析，缓冲液的组成为0.05M硼酸，0.2M NaCl,用浓NaOH将pH值调至9.2,4℃储存，4℃储存过夜以除去自由NH₄+离子，将pH值升至9.2。每克Zot中加入20μl浓度为5.0mg/ml FITC的DMSO溶液，室温下孵育2hr。未结合的FITC通过500ml透析缓冲液除去，缓冲液的组成是0.1M Tris-HCl(pH7.4),0.1％(w/v)NaN₃,0.2MNaCl，用浓NaOH将pH值调至7.4,4℃储存，在4℃放置两天换液2-3次。这一过程在使用之前一直储存于4℃。

FITC-ZOT与人PBMC的结合以及流式细胞仪分析

上述分离的PBMC与递增浓度的Zot-FITC在硅化试管中于37℃孵育60min(以预防巨噬细胞同试管壁的结合)，同时加入与藻红蛋白(PE)结合的CD14和与ECD(能量偶联染料，一种藻红蛋白-德克萨斯红结合体)结合的CD3单克隆抗体。CD14是人单核/巨噬细胞的标志，而CD3是T淋巴细胞的标志。这些荧光色素(如，FITC,PE和ECD)的使用可以通过三色流式细胞仪在混合的PBMC群中同时研究ZOT与PBMC中单核/巨噬细胞和T淋巴细胞的结合。染色后，用含有1.0％(w/v)BSA和0.1％(w/v)叠氮钠的PBS(pH7.2)冲洗两次，立即用Epics Elite流式细胞仪/细胞分捡系统进行流式细胞仪分析。在这些实验中，对照采用的是荧光色素标记的同型但具有不同特异性的单克隆抗体。本分析通过设置对前离散比90％光离散参数合适的框架将血小板、红细胞(如果有的话)和细胞碎片排除。每一样品收集的数据都超过10,000个细胞。数据分析使用Epics Elite分析包(Coulter)或WinList list-mode分析包(Verity Software House,Topsham,ME)。每管中加入的ZOT-FITC的数量(pM)由加入的终浓度(μg/ml)和已知的Zot的分子量决定。

Zot结合位点/细胞的计算

将Zot-FITC孵育后每一细胞群的平均荧光素密度都转换成Zot结合位点/细胞的数目，这种转换使用Quantum 26 MESF kit(范围在10,000至500,000 MESF之间)和QuickCal标定软件绘制的一种标准曲线来表示，其方法见产品说明书(Flow Cytometry Standards Corporation,San Juan,Puerto Rico)。Quantum kit的荧光素标准用等量可溶性荧光色素(MESF)单位分子比纯化荧光色素溶液来标定。每一细胞(巨噬细胞或淋巴细胞)的结合位点的数目从Zot-FITC孵育标本(非特异结合，如FITC标记的鼠IgG的MESF对照，去掉)的MESF单位得出，适用于所用的不同批次FITC-Zot的荧光素/蛋白比(F/P)。B．结果

代表性的实验显示了FITC-Zot与人T淋巴细胞(CD3⁺)和巨噬细胞(CD14⁺)结合的流式细胞仪分析结果，见图6。结果表明，正如ZOT结合位点的增加一样，巨噬细胞的FITC-Zot的结合比CD3⁺T淋巴细胞增加了许多倍。这些数据进一步表明Zot的结合是一可饱和现象，达到饱和时的浓度大约是0.5pM(40g/ml)。而且我们还观察到，在饱和条件下，人巨噬细胞和淋巴细胞分别有106,000和9,000个Zot结合位点。

为了探索人巨噬细胞和淋巴细胞Zot结合位点的分布，我们使用上述方法对多名志愿者进行了Zot结合位点的测定。结果表明，巨噬细胞上Zot结合位点的平均数目(平均数=104,649，范围在56,791-142,840)比淋巴细胞的Zot结合位点的平均数目(平均数=10,684，范围在4,802-18,662)大约平均高10倍。

                      实例5

Zot与人单核细胞/巨噬细胞和淋巴细胞结合的动力学A．材料与方法

健康志愿者中人周围血单核细胞(PBMC)的分离

健康志愿者的PBMC的分离见实例4。

纯化的6×His-Zot的制备

6×His-Zot融合蛋白的制备步骤见实例2。

ZOT与荧光素异硫氰酸盐(ZOT-FITC)的结合

ZOT与荧光素异硫氰酸盐(ZOT-FITC)的结合步骤见实例4。

结合动力学测定

Zot与人细胞结合的动力学测定使用ZOT-FITC结合和流式细胞仪。将标本即时用EPIC ELITE流式细胞仪/细胞分捡系统(Beckman-Coulter,Miami,FL)计数。PBMC用ECD(能量耦合染料)标记的抗-CD3 mAb和PE(藻红蛋白)标记的抗CD14 mAb染色。背景荧光素对照采用在同一细胞悬液剩余部分中用不相关的与相应的荧光素结合的同型单抗代替实验的单抗。然后清洗anti-CD3和anti-cd14单抗标记的PBMC，分析前置冰浴上(在1hr之内)以减少抗原性丢失。在分析之前，将细胞置37℃水浴中平衡15-20min，连接流式细胞仪的活性样本处理器(动力学模块，Cytek,Fremont,CA)在实验期间(12分钟)维持温度在37℃，同时数据持续采集。FITC荧光素基线水平收集90-150秒，数据的获取停顿10-15sec以注射FITC-Zot(终浓度为40μg/ml)。在总时间12min内以每秒300-600个细胞的速度加入Zot-FITC后立即采集数据。FITC,PE和ECD荧光素用冷气氩激光(发射488nm)激发。结果的计算和显示使用WinList and Isocontour分析包(Verity Software House,Topsham ME)。数据以等比表示，Zot-FITC密度(y轴)，时间(X轴)比细胞数目(Z轴)，细胞以CD3(T淋巴细胞)或CD14(巨噬细胞)来区分。B．结果

代表性的实验显示了Zot-FITC与人T淋巴细胞(CD3+)和巨噬细胞(CD14⁺)结合的动力学，结果见图7A-7C。结果提示Zot与人巨噬细胞(图7A)和淋巴细胞(图7B)结合迅速，在加入Zot-FITC 2min内到达平衡点。为了比较Zot与anti-CD14单抗到达最大结合所需要的时间，我们使用未标记细胞做了相同的实验。在这些实验中，基线FITC荧光素水平以上述相同方法收集，数据的收集停顿10-15秒以便注射FITC-anti-CD14mAb，之后数据重新开始收集总共12分钟。结果(图7C)提示Zot结合到达平衡时的最高水平(2min)较anti-CD14(5min)所需时间短。

                    实例6

       FITC-Zot与人B和T淋巴细胞的结合A．材料与方法

健康志愿者中人周围血单核细胞(PBMC)的分离

健康志愿者的PBMC的分离见实例4。

纯化的6×His-Zot的制备

6×His-Zot融合蛋白的制备步骤见实例2。

ZOT与荧光素异硫氰酸盐(ZOT-FITC)的结合

ZOT与荧光素异硫氰酸盐(ZOT-FITC)的结合步骤见实例4。

FITC-Zot与人PBMC的结合以及流式细胞仪分析

按上述方法分离的PBMC在与PE结合的CD14单抗，与三色(PE-Cy5结合)结合的CD3，与ECD(能量偶联染料，一种藻红蛋白-德克萨斯红结合体)结合的抗CD19单克隆抗体存在的情况下与40μg/ml的Zot-FITC 37℃孵育30min。CD14是人巨噬细胞的标志，而CD3是T淋巴细胞的标志，CD19是B淋巴细胞的标志。这些荧光色素(如，FITC,PE和ECD)的使用可以通过四色流式细胞仪在混合的PBMC群中同时研究ZOT与PBMC中单核/巨噬细胞和T淋巴细胞的结合。染色以后，用含有1.0％(w/v)BSA和0.1％(w/v)叠氮钠的PBS(pH7.2)冲洗两次，立即用Epics Elite流式细胞仪/细胞分捡系统(Beckman-Coulter,Miami,FL)进行流式细胞仪分析。在这些实验中，对照采用的是荧光色素标记的同型但具有不相关特异性的单克隆抗体。本分析通过设置对前离散比90％光离散参数合适的框架将血小板、红细胞(如果有的话)和细胞碎片排除。每一样品收集的数据都超过10,000个细胞。数据分析使用Epics Elite分析包(Coulter)或WinListlist-mode分析包(Verity Software House,Topsham,ME)。T(CD3⁺)和B(CD19⁺)淋巴细胞的荧光素强度结果以单色直方图表示。B．结果

Zot-FITC与人T(CD3⁺)和B(CD19⁺)淋巴细胞结合的结果见图8。结果表明Zot与T和B淋巴细胞的结合相似。在这一实验中，Zot-FITC与巨噬细胞的结合较其与T或B淋巴细胞的结合高5-8倍。

                     实例7

       Zot拮抗剂不能阻断Zot-FITC的结合A．材料与方法

健康志愿者中人周围血单核细胞(PBMC)的分离

健康志愿者的PBMC的分离见实例4。

纯化的6×His-Zot的制备

6×His-Zot融合蛋白的制备步骤见实例2。

FZI/0与FZI/1 Zot拮抗剂的制备

肽拮抗剂FZI/0(Gly Gly Val Leu Val Gln Pro Gly)(SEQ ID NO:7)和FZI/1(Val Gly Val Leu Gly Arg Pro Gly)(SEQ ID NO:8)通过化学合成，用已知方法纯化，如Mant等在肽和蛋白的高效液相色谱：分离分析和构型，C.R.C.Press,1991中描述的方法，和肽合成仪，如Symphony(Protein Technologies,Inc)。

ZOT与荧光素异硫氰酸盐(ZOT-FITC)的结合

ZOT与荧光素异硫氰酸盐(ZOT-FITC)的结合步骤见实例6。

阻断FITC-Zot与人PBMC结合的培养条件以及流式细胞仪分析

PBMC的分离见前述，用下述单抗染色：与PE结合CD14和与ECD(能量偶联染料，一种PE-德克萨斯-红结合物)结合的CD3。然后清洗细胞，在400μl AIM-V培养液(GIBCO BRL，一种限制性无血清培养基，通常用来培养人淋巴细胞)中4℃单独孵育15min，培养基中加入0.2％(w/v)叠氮钠(用来阻断内化/重循环)，或同时加入FZI/0(4.0mg/ml),FZI/1(4.0mg/ml),BSA(4.0mg/ml，阴性对照)或未标记Zot(160μg/ml，阳性对照)。然后将Zot-FITC加入至每一试管中，至终浓度为40μg/ml，孵育5min(到达平衡所需时间)，冲洗后立即放入流式细胞仪上。因此，与所加入的Zot-FITC浓度相比，将FZI/0,FZI/1和BSA以超过100倍的浓度加入，未标记Zot以超过4倍浓度加入。遗憾的是，大量获取纯化的未标记Zot具有技术性困难，这阻止了我们以高于4倍浓度的未标记Zot评价其阻断Zot-FITC结合力的能力。本分析通过设置对前离散比90％光离散参数合适的框架将血小板、红细胞(如果有的话)和细胞碎片排除。每一样品收集的数据都超过10,000个细胞。数据分析使用Epics Elite分析包(Coulter)或WinListlist-mode分析包(Verity Software House,Topsham,ME)。结果用相对在培养基中单独孵育的细胞的平均荧光强度(人为给定值为100％)，与Zot-FITC在Zot拮抗剂、未标记的Zot或BSA的存在下进行孵育的细胞的平均荧光强度的抑制百分比来表示。B．结果

代表性到实验显示了PBMC与Zot拮抗剂，未标记Zot或BSA孵育的影响，结果见图9。以超过100倍浓度加入Zot拮抗剂FZI/0或FZI/1并没有明显阻断Zot-FITC与CD14⁺巨噬细胞的结合。相似的，加入超过100倍浓度的BSA并没有引起Zot-FITC结合性的改变。与此相反的是，仅超过4倍的未标记Zot阻断了24-43％的Zot-FITC的结合。这些结果提示Zot与人巨噬细胞的结合涉及的受体具有不同的结合区域，这些Zot/zonulin受体已在脑和肠道组织中被鉴定。

                         实例8

Zot对破伤风类毒素(TT)-诱导的细胞增殖的抑制作用依赖于血浆存在的因子A．材料与方法

健康志愿者中人周围血单核细胞(PBMC)的分离

健康志愿者的PBMC的分离见实例4。

纯化的6×His-Zot的制备

6×His-Zot融合蛋白的制备步骤见实例2。

培养条件和淋巴细胞增殖测定

在1ml(a)AIM-V培养基，(b)含10％(v/v)热失活的胎牛血清和50μg/ml庆大霉素的RPMI 1640培养基，或(c)含10％(v/v)人灭活的人AB血清和50μg/ml庆大霉素的RPMI 1640培养基中培养PBMC(1.5×10⁶细胞/ml)。细胞的培养条件是37℃,5％CO₂，在96孔板中加入或不加破伤风类毒素(TT，一种特异抗原，使用浓度是2.0μg/ml,Wyeth,Marietta,PA)，同时加入或不加纯化的Zot(60μg/ml)或牛血清白蛋白(BSA，对照蛋白，60μg/ml,Fraction V,Sigma,St.Louis,MO)。细胞培养6天，每孔内加入1.0Ci的氚化胸苷。20小时后将细胞收获到Wallac细胞收获器上(Gaithersburg,MD)，用Wallac Trilux Microbeta计数器(Gaithersburg,MD)检测掺入的胸苷。B．结果

三种独立的实验结果显示，当PBMC在无血清存在的情况下TT-诱导的增殖没有被抑制，例如使用AIM-V限制培养基时。事实上在大多数条件下所观察的情况正好相反，如在无血清存在的条件下与Zot孵育可以使TT引起的增殖反应增加。与此相对照的是，当培养基中有FCS或人AB血清存在的情况下，与Zot孵育可以使TT-诱导的增殖明显被抑制。事实上，加入人AB血清可以使其对TT-诱导的增殖的抑制作用较加入FCS的抑制作用达到更高水平(超过90％)。

                      实例9

         Zot抑制人单核细胞/巨噬细胞CD14表达A．材料与方法

健康志愿者中人周围血单核细胞(PBMC)的分离

健康志愿者的PBMC的分离见实例4。

纯化的6×His-Zot的制备

6×His-Zot融合蛋白的制备步骤见实例2。

培养条件与流式细胞仪分析

上述分离的PBMC在37℃,5％CO₂,24孔板中孵育不同的时间(4小时至7天)，加入或不加入破伤风类毒素(TT，一种特异抗原，使用浓度是2.0μg/ml,Wyeth,Marietta,PA)，同时加入或不加纯化的Zot(60μg/ml)或牛血清白蛋白(BSA，对照蛋白，60μg/ml，片段V,Sigma,St.Louis,MO)。然后细胞用与FITC结合的CD14单抗染色，用流式细胞仪分析。本分析通过设置对前离散比90％光离散参数合适的框架将血小板、红细胞(如果有的话)和细胞碎片排除。每一样品收集的数据都超过10,000个细胞。数据分析使用Epics Elite分析包(Coulter)或WinList list-mode分析包(Verity Software House,Topsham,ME)。结果以“单核细胞区域”的细胞CD14荧光素单色直方图表示，基于是人巨噬细胞的前离散比侧离散特征来规定。B．结果

代表性到实验显示了Zot与PBMC孵育对人巨噬细胞CD14表达的影响，结果见图10A-10B。加入Zot孵育18小时后明显抑制了CD14的表达。这一抑制作用不管是(图10B)否(图10A)加入破伤风类毒素都非常明显。加入BSA并不影响CD14的表达。动力学实验发现大约一半的实验中Zot-诱导的CD14的表达抑制在加入Zot 4-6小时就能观察到，而且一直到第7天(实验观察的最后一个时间点)CD14的表达都明显受到抑制。CD14是巨噬细胞表面的一个分子，是LPS-LPS-结合蛋白复合物的高亲和力受体。因此，可以认为Zot引起的CD14表达下调对巨噬细胞的激活和有效的发动T细胞介导的免疫反应具有复杂的作用。

                          实例10

        Zot对人淋巴细胞和单核细胞/巨噬细胞活力的影响A．材料与方法

健康志愿者中人周围血单核细胞(PBMC)的分离

健康志愿者的PBMC的分离见实例4。

纯化的6×His-Zot的制备

6×His-Zot融合蛋白的制备步骤见实例2。

培养条件与流式细胞仪分析

上述分离的PBMC在37℃,5％CO₂,24孔板中孵育不同的时间(6小时至7天)，加入或不加入破伤风类毒素(TT，一种特异抗原，使用浓度是2.0μg/ml,Wyeth,Marietta,PA)，同时加入或不加纯化的Zot(40μg/ml)或牛血清白蛋白(BSA，对照蛋白，40μg/ml，片段V,Sigma,St.Louis,MO)。然后细胞用与FITC结合的CD14单抗染色，清洗。为了评价细胞的活力，propidium碘(PI,50g/ml，一种可以很易进入死亡细胞内而被存活细胞排出的染料)加入到细胞悬液中，将样品立即用流式细胞仪分析。本分析通过设置对前离散比90％光离散参数合适的框架将血小板、红细胞(如果有的话)和细胞碎片排除。每一样品收集的数据都超过10,000个细胞。数据分析使用Epics Elite分析包(Coulter)或WinList list-mode分析包(Verity Software House,Topsham,ME)。结果以“单核细胞区域”和“淋巴细胞区域”内存活细胞的百分比表示，基于前离散比侧离散的细胞特征。B．结果

代表性的实验显示了PBMC与Zot孵育对人巨噬细胞和淋巴细胞活力的影响，结果见图11。在培养第1天，与对照组相比，加入Zot可以使巨噬细胞的活力中度降低，至培养第4天，这种活力的降低变得非常明显，至第7天，几乎所有的巨噬细胞都已经死亡。与此相反的是，不管与Zot孵育还是与培养基或BSA孵育，淋巴细胞的活力在培养第4天之前几乎没有差异，然而，在以后的时间里，加入Zot可以使淋巴细胞的活力明显降低。培养基中加入TT后，不管是否加入Zot，可以看到类似的结果。这些结果表明，Zot在较早期就可影响巨噬细胞活力，而对淋巴细胞的影响却直到培养后第4天才开始明显。这些观察为针对巨噬细胞的早期效应，决定Zot介导的抑制抗原加工和提呈的机制提供了较多的依据。

                    实例11

Zot调节人单核细胞/巨噬细胞和淋巴细胞内细胞因子的产生A．材料与方法

健康志愿者中人周围血单核细胞(PBMC)的分离

健康志愿者的PBMC的分离见实例4。

纯化的6×His-Zot的制备

6×His-Zot融合蛋白的制备步骤见实例2。

培养条件

上述分离的PBMC在37℃,5％CO₂,24孔板中孵育不同的时间(6小时至4天)，加入或不加入破伤风类毒素(TT，一种特异抗原，使用浓度是2.0μg/ml,Wyeth,Marietta,PA)，同时加入或不加纯化的Zot(60μg/ml)或牛血清白蛋白(BSA，对照蛋白，60μg/ml，片段V,Sigma,St.Louis,MO)。由于本研究涉及TNF-α,IL-1β和IL-10的产生，将板内溶液在6小时和1,2和4天收集入1.5ml Eppendorf管中，4℃,2700×g离心10min以去除细胞和碎片。将上清液转移至新的Eppendorf管中，分析之前置于-70℃冷冻。用TT刺激，同时加入或不加Zot或BSA，用以检测T-淋巴细胞-来源的细胞因子(如IL-2,IL-4和IFN-γ)的上清液的收集则在培养3天以后。

用化学发光ELISA方法检测细胞因子

检测细胞培养上清液中细胞因子用标准化学发光捕获ELISA方法。简单的说，将1.0-2.0μg/ml的抗-人细胞因子抗体包被到96-孔黑色不透光ELISA培养板(Corning-Costar,Cambridge,MA)上，内含PBS(pH7.4)(Biofluids)或0.1M碳酸氢钠(pH8.1),4℃过夜。用含0.5％(v/v)吐温-20(Sigma)的PBS(Ph7.4)清洗培养板，用含10％(v/v)FCS的PBS(Ph7.4)或4.0％(w/v)BSA阻断2小时。清洗后，加入100μl细胞培养上清液或重组人细胞因子(标准品)室温孵育2小时。清洗后，加入与生物素结合的相应抗-细胞因子单克隆抗体(室温放置45分钟)，清洗后室温下与亲和素过氧化物酶孵育30分钟。然后加入BM化学发光ELISA试剂(宝灵曼，Gaithersburg,MD)，在1450Microbeta Trilux plate reader(Wallac,Gaithersburg,MD)下检测化学发光。抗-IL-1β抗体来自Endogen(Wobum,MA)，其它试剂来自Pharmingen(San Diego,CA)。B．结果

代表性的实验显示了Zot诱导人巨噬细胞产生细胞因子的能力，结果见图12A-12C。加入Zot(未加TT)在6小时后即产生了相当数量的TNF-α，培养后24小时到达峰值(3,400-3,800pg/ml)，其后开始下降，至培养后4天基本到达基线水平(图12A)。在培养基或BSA培养中，我们观察到有较低水平的TNF-α(1,000-1,100pg/ml)，这可能是由于巨噬细胞粘贴到塑料壁上时非特异激活所致。Zot可以诱导微弱的IL-1β表达(40-60pg/ml),2天后到达峰值，4天后下降很大(20pg/ml)(图12B)。在培养基或BSA培养中没有观察到明显的IL-1β。最后，Zot使IL-10在培养后6小时即产生很高水平(1,000pg/ml),1天后到达峰值(1,500pg/ml),4天后仍保持相同的浓度(图12C)。与上面描述的TNF-α情况相类似的是，IL-10在培养基或BSA中培养中的水平相对较低，可能是由于粘贴到塑料壁上非特异激活了巨噬细胞引起的。在加入Zot后加入TT并不能使细胞因子反应的动力学或量有所改变。Zot诱导高水平的强力前炎症因子为针对巨噬细胞的早期效应，决定Zot介导的抑制抗原加工和提呈的机制提供了较多的依据。例如，Zot诱导IL-10的产生，已知IL-10是Th1型反应的主要抑制剂，通过抑制如IL-2等细胞因子的产生而起作用，这在Zot加入到培养液后，产生的抑制抗原诱导的淋巴细胞增殖反应中可能起了重要作用。

代表性的实验显示了Zot对T-细胞来源的细胞因子产生的影响，结果见图13A-13B。观察到加入Zot抑制了由TT诱导的IL-2的产生，而BSA则无此作用(图13A)。在没有TT存在的情况下，Zot诱导下，没有出现可以检测的IL-2的水平。与此相反的是，即便在没有TT存在的情况下，加入Zot可以持续诱导低到中等量的IFN-γ的产生，类似于TT诱导的IFN-γ的产生(图13B)。其次，Zot明显增加了TT诱导的IFN-γ水平，而BSA则无此作用(图13B)。最后，还观察到加入Zot并不能诱导IL-4的产生。由于IL-2在淋巴细胞的增殖中具有重要作用，抗原刺激后抑制IL-2的产生可能是Zot抑制TT-诱导的增殖机制中重要的一环。同样重要的是，不管加入还是不加TT,Zot诱导IFN-γ以及许多前炎症因子的产生表明Zot在抗原的加工和提呈复杂过程中，在不同的水平上发挥了其免疫调节作用，期间抗原的加工和提呈又导致了抗原特异免疫反应的产生。

这里所引用的所有参考文献在此引用并整体作为参考。

尽管本发明已有详细的描述，而且也参考了具体的实施方案，但是对于本领域的普通专业人员可以明显看出，只要不背离其精神和范围都可对其做不同程度的改变和修饰。

                                  序列表<110>FASANO,Alessio

 Sztein,Marcelo B.

 LU,Ruiliang

 TANNER,Michael K.<120>以抗原特异的方式使用ZOT或Zonulin抑制淋巴细胞的增殖<130>P7574<140>09/000,000<141>1999-09-09<150>60/100,266<151>1998-09-10<160>8<170>Patent In Ver2.1<210>1<211>18<212>PRT<213>人<400>1Asn Asp Gln Pro Pro Pro Ala Gly Val Thr Ala Tyr Asp Tyr Leu Val Ile Gln1            5                       10                 15<210>2<211>20<212>PRT<213>人<220><221>不确定<222>(10)<223>X在位置10是一个氨基酸<400>2Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Xaa Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu1               5                   10                  15                  20<210>3<211>23<212>DNA<213>合成构建<400>3cgggatcccg tatgagtatc ttt<210>4<211>24<212>DNA<213>合成构建<400>4cccaagcttg ggtcaaaata tact<210>5<211>18<212>DNA<213>合成构建<400>5tcatcacggc gcgccagg<210>6<211>22<212>DNA<213>合成构建<400>6ggaggtctag aatctgcccg at<210>7<211>8<212>PRT<213>合成构建<400>7Gly Gly Val Leu Val Gln Pro Gly1               5<210>8<211>8<212>PRT<213>合成构建<400>8Val Gly Val Leu Gly Arg Pro Gly1               5

Claims (25)

1．一种在预先暴露于一种特定抗原的哺乳类动物宿主体内抑制抗原提呈细胞介导的淋巴细胞增殖的方法，包括给所述宿主应用有效剂量的选自Zot或zonulin的Zot-相关的免疫调节因子的步骤，所述剂量是有效地下调所述抗原提呈细胞活性的剂量。

2．一种抑制哺乳类动物宿主体内抗原提呈细胞介导对特定抗原的淋巴细胞增殖的方法，包括用有效剂量的选自Zot或zonulin的Zot-相关的免疫调节因子与所述特定抗原联合施药于所述宿主的步骤，所述剂量是有效地下调所述抗原提呈细胞活性的剂量。

3．一种治疗患自身-免疫或免疫相关紊乱或疾病的哺乳类动物宿主的方法，包括用有效剂量的选自Zot或zonulin的Zot-相关的免疫调节因子施药于所述宿主的步骤，所述剂量是有效地下调抗原提呈细胞-介导的淋巴细胞增殖的剂量。

4．一种治疗患自身-免疫或免疫相关紊乱或疾病的哺乳类动物宿主的方法，包括用有效剂量的选自Zot或zonulin的Zot-相关的免疫调节因子并与所述疾病或紊乱的特定抗原联合施药于所述宿主的步骤，所述剂量是有效地下调抗原提呈细胞-介导的淋巴细胞增殖的剂量。

5．一种治疗由于组织或器官移植所致的免疫排斥的哺乳类动物宿主方法，包括用有效剂量的选自Zot或zonulin的Zot-相关的免疫调节因子施药于所述宿主的步骤，所述剂量是有效地下调抗原提呈细胞-介导的淋巴细胞增殖的剂量。

6．一种治疗由于组织或器官移植所致的免疫排斥的哺乳类动物宿主的方法，包括用有效剂量的选自Zot或zonulin的Zot-相关的免疫调节因子并与特异的移植抗原联合施药于所述宿主的步骤，所述剂量是有效地下调抗原提呈细胞-介导的淋巴细胞增殖的剂量。

7．一种治疗患炎症或过敏性疾病或紊乱的哺乳类动物宿主的方法，包括用有效剂量的选自Zot或zonulin的Zot-相关的免疫调节因子施药于所述宿主的步骤，所述剂量是有效地下调抗原提呈细胞-介导的淋巴细胞增殖的剂量。

8．一种治疗患炎症或过敏性疾病或紊乱的哺乳类动物宿主的方法，包括用有效剂量的选自Zot或zonulin的Zot-相关的免疫调节因子并与特异的炎症相关抗原或过敏原联合施药于所述宿主的步骤，所述剂量是有效地下调抗原提呈细胞-介导的淋巴细胞增殖的剂量。

9．如权利要求3或4的方法，其中所述自体免疫或免疫相关疾病或紊乱选自多发性硬化、类风湿性关节炎、胰岛素依赖性糖尿病、腹腔疾病、斯耶格伦氏综合征、系统性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜、溶血性贫血、格雷夫斯氏病、阿迪森氏病、自身免疫性睾丸炎、恶性贫血、脉管炎、自身免疫性凝血障碍、重症肌无力、多发性神经炎、天疱疮、类风湿性心肌炎、多发性肌炎、皮肌炎和硬皮病。

10．如权利要求7或8的方法，其中所述炎症或过敏性疾病或紊乱选自以下疾病：哮喘、干癣、湿疹性皮炎、卡波齐氏肉瘤、多发性硬化症、炎性肠病、平滑肌细胞增生性疾病和与霉菌、病毒、寄生虫或细菌感染相关的炎症状态。

11．如权利要求1至8的方法，其中所述哺乳类动物宿主是人。

12．如权利要求1至8的方法，其中所述哺乳类动物宿主选自人，牛，羊，猪，猫，水牛，犬，山羊，马，驴，鹿和灵长类。

13．如权利要求1至8的方法，其中所述免疫调节因子与至少一种药学上可以接受的载体、佐剂和输送赋形剂混合施用。

14．如权利要求2、4、6或8的方法，其中所述抗原与至少一种药学上可以接受的载体、佐剂和输送赋形剂混合施用。

15．如权利要求2、4、6或8的方法，其中所述抗原和所述免疫调节因子是共同或连续施用。

16．如权利要求1至8中任何一项的方法，其中所述免疫调节因子施用于粘膜表面。

17．如权利要求2、4、6或8的方法，其中所述抗原和所述免疫调节因子施用于粘膜表面。

18．如权利要求16的方法，其中所述粘膜表面选自肠道上皮、淋巴组织、支气管相关的淋巴组织、鼻道相关的淋巴组织、生殖相关的淋巴组织和扁桃体。

19．如权利要求17的方法，其中所述粘膜表面选自肠道上皮、淋巴组织、支气管相关的淋巴组织、鼻道相关的淋巴组织、生殖相关的淋巴组织和扁桃体。

20．如权利要求1至8中任何一项的方法，其中所述免疫调节因子经肠道外施用。

21．如权利要求2、4、6或8的方法，其中所述抗原和所述免疫调节因子经肠道外施用。

22．如权利要求1至8中任何一项的方法，其中所述免疫调节因子的用药方式选自静脉用药，皮内用药，肌注用药和皮下用药。

23．在权利要求2、4、6或8的方法，其中所述抗原和所述免疫调节因子的用药方式选自静脉用药，皮内用药，肌注用药和皮下用药。

24．一种在预先暴露于一种特定抗原的培养细胞中抑制抗原提呈细胞介导的淋巴细胞增殖的方法，包括将培养物与一定剂量的选自Zot或zonulin的Zot-相关的免疫调节因子相接触的步骤，所述剂量是有效地下调所述抗原提呈细胞活性的剂量。

25．一种在对一种抗原反应的培养细胞中抑制抗原提呈细胞介导的淋巴细胞增殖的方法，包括将培养物与有效剂量的Zot-相关的免疫调节因子及所述抗原相接触，以下调所述抗原提呈细胞的活性的步骤，所述免疫调节因子选自Zot或zonulin，所述剂量是有效下调所述抗原提呈细胞活性的剂量。

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