CN1313150C - 自身免疫疾病的治疗剂 - Google Patents

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Abstract

现已发现可使用一种制剂治疗或者预防自身免疫疾病，该制剂为：(i)除了Ctx或者Etx，或者Ctx及Etx的B亚单位，具有结合GM1活性的一种制剂；(ii)对GM1介导的细胞内信号有作用，但无GM1结合活性的一种制剂。这些制剂还可用来治疗人T细胞白血病，预防移植物排斥或者GVHD，或者用于哺乳类动物疫苗接种。

Description

自身免疫疾病的治疗剂
本发明涉及用来治疗哺乳类动物尤其是人类自身免疫疾病的治疗剂。本发明还涉及作为所谓的“疫苗载体”用来治疗T细胞起源的人类白血病的治疗剂，和用来预防人类移植排斥反应及移植物抗宿主疾病(GVHD)的治疗剂。
Charles O.Elson等人在The Journal of Immunology，1995，154；1032-1040杂志上发表了题为“霍乱毒素及其B亚单位对粘膜T细胞形态及功能的改变”的文章，该研究发现霍乱毒素(Ctx)及CtxB亚单位能抑制CD8+及CD4+T细胞。
B.Yankelevich等人在The Journal of Immunology，1995，154；3611-3617杂志中还发表了题为“以新的免疫抑制制剂预防急性移植物抗宿主疾病”的文章。该研究发现CtxB可在骨髓移植中作为预防急性移植物抗宿主疾病(GVHD)的一种制剂。
WO95/10301中发现了一种免疫耐受诱发制剂，该制剂含有结合有特异耐受原的粘膜结合分子。
在本文中术语“Ctx”是指霍乱毒素，而“CtxB”是指霍乱毒素的B亚单位。在其它的文章中也被相应地表示为“CT”或者“Ct”及“CTB”或者“CtB”。文中的术语“Etx”是指大肠杆菌热不稳定肠毒素，而“EtxB”是指Etx的B亚单位。在其它的文章中有时也被相应地表示为“LT”或者“Lt”及“LTB”或者“LtB”。
本发明的基础是基于这样一个发现，即EtxB(大肠杆菌热不稳定肠毒素的纯B亚单位)可与存在于哺乳类动物细胞表面的GM1-神经节苷脂受体结合，而且此结合可引发淋巴细胞群不同的反应，其中包括去除CD8+T细胞同时激活B细胞。但当采用突变的没有GM1结合活性的EtxB时则没有上述的效应。
自身免疫疾病
自身免疫是描述身体对自身抗原产生免疫反应的机理的术语。
根据本发明第一个方面用来预防或者治疗自身免疫疾病的下面制剂：
(i)除了Ctx或者Etx，或者Ctx及Etx的B亚单位，具有GM-1结合活性的制剂；或
(ii)对具有GM-1介导的细胞内信号有作用而没有GM-1结合活性的制剂。
本发明的制剂可调节淋巴细胞群，即引发CD8+T细胞凋亡，增强CD4+细胞的活性并使B细胞多克隆激活。上述过程可使免疫反应向诱导Th2相关的细胞因子方向移动。对自身或者交叉反应抗原所产生的这些反应可调节一些自身免疫疾病的保护。
在本发明上述第一方面的第一个实施方案中，治疗制剂用于治疗正在进展中的自身免疫疾病。在该实施方案中，给病人单独服用制剂或者与自身或者交叉反应抗原一起联合给病人服用该制剂。根据本发明第一个方面中的该实施方案，服用制剂能调节免疫反应使自身抗原不激活引起疾病的炎症从而治疗自身免疫疾病。
在本发明第一方面的第二个实施方案中，将制剂以“接种”的方法给哺乳类动物使用，使其治疗自身免疫疾病，其中制剂可与所述疾病有关的自身或者交叉反应抗原决定簇物质(或者为一种不同的自身或者交叉反应抗原决定簇物质的混合物)联合给予。经过上述的所谓接种后，可使对自身抗原或者交叉反应抗原的宿主免疫反应远离病理活化，从而保护对自身抗原的进一步反应。
在本发明的第一个方面中，可将治疗制剂及自身或者交叉反应抗原决定簇联合给予病人。我们可以通过改变每种治疗制剂及抗原决定簇给药的给药部位及时间来调节免疫系统。所以，可将治疗制剂及抗原决定簇同时并且同一个部位给予，但是如将治疗制剂与抗原决定簇在不同的时间及不同的部位分别给予可能会有较好的效果。
给予单剂量的治疗制剂及抗原决定簇可能会有较好的效果，但多剂量也包括在本发明范围内。
在本发明第一个方面的第二个实施方案中，可将治疗制剂及抗原决定簇连接在一起，如通过共价键结合从而形成单一的活性制剂，虽然分别给药，其中治疗制剂与抗原决定簇不是象上述的那样连接在一起，是优选的，因为这可使不同部分分别给药。
根据本发明的这个方面可以治疗的特异自身免疫疾病是其病理与细胞介导免疫有关的自身免疫疾病，如类风湿性关节炎，多发性硬化症及糖尿病。
另外，在本发明的第一个方面中，提供了用Ctx，Etx或者Ctx或者Etx的B亚单位制备用作预防自身免疫疾病的制剂的药物。
本发明还提供了一种治疗人类自身免疫疾病的药物组合物，该组合物含有
(i)一种具有GM-1结合活性的制剂；或
(ii)一种对GM-1介导的细胞内信号传导有作用，但无GM-1结合活性制剂；
及药物可接受的载体或者稀释剂。
本发明的药物组合物可以配制成经粘膜途径给药的剂型，如鼻腔喷雾剂，或者配制成注射给药的剂型，如通过静咏肌肉内或者皮下途径给药。
药物组合物可与合适的自身或者交叉反应抗原配制在一起。也可将其制成药盒，其包括治疗剂和抗原决定簇物质的分开组分。
用于本发明的特异治疗制剂是EtxB和CtxB或者是保留有其GM-1结合活性的突变物。
在本发明第一个方面中所用的制剂虽然在一些严重的治疗情况下可以耐受一定程度的毒性，但以无毒为较好。
本发明中的第一个方面中可将其延伸，从而包括所有用于治疗哺乳动物自身免疫疾病的具有GM-1结合活性的制剂，具有GM-1介导的细胞内信号传导作用的制剂和模拟GM-1结合活性的制剂。
所以，本发明的第一个方面并不局限于使用EtxB蛋白作为治疗制剂来治疗人自身免疫疾病。可是，使用EtxB蛋白(其为有五个相同亚单位的五聚体)进行上述治疗是本发明中有较好代表性的一个实施例。除了野生型的EtxB，本发明也可延伸至一些突变型的EtxB，这些突变蛋白具有GM-1结合的活性，另外也可是其它一些类似的蛋白如具有GM-1结合活性的霍乱毒素B亚单位(CtxB)，和其突变体。
根据本发明的第一个方面，治疗自身免疫疾病的其它治疗制剂是结合GM-1的人型单克隆抗体。识别及制备这些制剂的方法在本领域是众所周知的。
T-淋巴细胞白血病
根据本发明的第二个方面，提供了符合下面条件的制剂
(i)除了Ctx或者Etx，或者Ctx及Etx的B亚单位，具有GM-1结合活性的制剂；或者
(ii)可介导GM-1细胞内信号传导，但无GM-1结合活性的制剂；
这些制剂用来治疗人T细胞起源的白血病，如人CD8T细胞起源的白血病。
在本发明第二个方面中所用的制剂虽然在一些严重的治疗情况下可以有一定程度的毒性，但以无毒为较好。
另外，在本发明的第二个方面中，提供了用Ctx或Etx或Ctx和Etx的B亚单位制备用于治疗人T细胞起源白血病如人CD8T细胞起源白血病的药物。
本发明还提供了一种治疗人T细胞起源白血病的药物组合物，该组合物含有
(i)一种具有GM-1结合活性的制剂；或者
(ii)一种可介导GM-1细胞内信号传导，但无GM-1结合活性制剂；
及药物可接受的载体或者稀释剂。
本发明的药物组合物可以配制成经粘膜途径给药的剂型，如鼻腔喷雾剂，或者配制成注射给药的剂型，如通过静脉，肌肉内或者皮下途径给药。
本发明中的第二个方面可将其延伸，从而包括所有用于治疗人T细胞起源白血病的，具有GM-1结合活性的制剂，具有GM-1介导的细胞内信号传导作用的制剂及模拟GM-1结合活性的制剂。
所以，本发明的第二个方面并不局限于使用EtxB蛋白作为治疗制剂来治疗人T细胞白血病。可是，使用EtxB蛋白进行上述治疗是本发明中有较好代表性的一个实施例。除了野生型的EtxB，本发明也可延伸至一些突变型的EtxB，这些突变蛋白具有GM-1结合的活性，另外也可是其它一些类似的蛋白如具有GM-1结合的活性的霍乱毒素B亚单位(CtxB)和其突变体。
根据本发明的第二个方面，治疗上述疾病的其它治疗制剂是结合GM-1的人型单克隆抗体。识别及制备这些制剂的方法在本领域是众所周知的。
移植排斥反应及GVHD
根据本发明的第三个方面，提供了符合下面条件的制剂
(i)除了Ctx或者Etx，或者Ctx及Etx的B亚单位，具有GM-1结合活性的制剂；或者
(ii)可介导GM-1细胞内信号传导，但无GM-1结合活性的制剂；
这些制剂用来预防/治疗移植排斥反应或者GVHD。
另外，在本发明的第三个方面中，提供了用Ctx，Etx或者Ctx或者Etx的B亚单位制备用于预防移植排斥反应或者GVHD的药物。
在本发明这方面的优选实施例中，所述的治疗制剂可用来预防同种或者异种基因实体器官移植物的排斥反应。它们也可用来预防急性移植物抗宿主反应(GVHD)，如在骨髓移植中。
在本发明这方面的实施例中，如果在移植前对病人进行治疗，则治疗制剂应与同种或者异种抗原联合服用。实施例中如果移植后对病人进行治疗，则治疗制剂不与抗原联合服用。
在本发明这方面的实施例中，可将治疗制剂及同种或者异种抗原决定簇联合给病人服用。我们可以通过改变每种治疗制剂及抗原决定簇给药的给药部位及时间来调节免疫系统。所以，可将治疗制剂及抗原决定簇同时并且同一个部位给予，但是如将治疗制剂与抗原决定簇在不同的时间及不同的部位分别给予可能会有较好的效果。另外可将治疗制剂及抗原决定簇通过共价键结合从而形成单一的活性制剂，当然如果是分别服用，其中治疗制剂及抗原决定簇不是象上述的那样连接在一起，则会更有利，因为这可不同部分分别给予。
给予单剂量的治疗制剂及抗原决定簇可能会有较好的效果，但多剂量也包括在本发明范围内。
在本发明的这方面中，如制剂是用来预防GVHD，则通常情况下制剂与要移植细胞直接接触，如要被移植的骨髓细胞。
虽然在一些特殊治疗情况下可耐受一定程度的毒性，但制剂最好是无毒的。
本发明还提供了一种治疗移植排斥反应的药物组合物，该组合物含有
(i)一种具有GM-1结合活性的制剂；或者
(ii)一种可介导GM-1细胞内信号传导，但无GM-1结合活性制剂；
及药物可接受的载体或者稀释剂。
本发明在该方面的药物组合物可以配制成经粘膜途径给药的剂型，如鼻腔喷雾剂，或者配制成注射给药的剂型，如通过静脉，肌肉内或者皮下途径给药。
药物组合物可与合适的同种或者异种抗原决定簇配制在一起。也可将其制成药盒的形式，其包括治疗制剂及抗原决定簇的各自组分。
本发明中的第三个方面可延伸到包括所有预防/治疗排斥移植物反应或者GVHD的具有GM-1结合活性制剂，具有GM-1介导的细胞内信号传导作用的制剂及模拟GM-1结合活性的制剂。
所以，本发明的第三个方面并不局限于使用EtxB蛋白作为治疗制剂来治疗排斥移植反应。可是，使用EtxB蛋白(其为有五个相同亚单位的五聚体)进行上述治疗是本发明中有较好代表性的一个实施例。除了野生型的EtxB，本发明也可延伸至一些突变型的EtxB，这些突变蛋白具有GM-1结合的活性，另外也可是其它一些类似的蛋白如具有GM-1结合的活性的霍乱毒素B亚单位(CtxB)和其突变体。
根据本发明，治疗移植物排斥反应的其它治疗制剂是结合GM-1的人型单克隆抗体。识别及制备这些制剂的方法，在本领域是众所周知的。
疫苗
CtxB及EtxB已被认为可作为所谓的“疫苗载体”。现已发现之所以有这种作用部分原因是因为EtxB可与GM-1受体结合从而调节淋巴细胞群的功能(如上所述)。
所以，根据本发明第四个方面提供用于哺乳类动物疫苗的下面制剂：
(i)除了Ctx或者Etx，或者Ctx及Etx的B亚单位，具有GM-1结合活性的制剂；
(ii)具有GM-1介导的细胞内信号传导作用而没有GM-1结合活性的制剂。
当该制剂与一种无关的外部抗原决定簇一起服用时，可以调节免疫反应。如果制剂是经非口服途径给予，可以调节免疫反应使其按照特殊的需要来进行。如果制剂是与一种无关的所谓的“粘膜佐剂”抗原一起经粘膜给予，则可以有助于粘膜对无关抗原的反应。抗原与制剂可以作为不同的成分一起服用，也可经过如共价键的方式连接在一起给予。
制剂最好是无毒的。另外，如果制剂是通过胃肠道粘膜给予，需在经胃肠道转运时保持稳定，例如不被蛋白酶水解，酸性pH条件下保持稳定以及对胆汁的去污作用保持稳定。
本发明还提供了一种用作为哺乳类动物疫苗的药物组合物，该组合物含有
(i)一种具有GM-1结合活性的制剂；或者
(ii)一种可介导GM-1细胞内信号传导，但无GM-1结合活性制剂；
及药物可接受的载体或者稀释剂。
本发明在该方面的药物组合物可以配制成经粘膜途径给药的剂型，如鼻腔喷雾剂，或者配制成注射给药的剂型，如通过静脉，肌肉内或者皮下途径给药。
药物组合物可与合适的抗原决定簇配制在一起。也可将其制成药盒的形式，其包括治疗制剂及抗原决定簇的分别组分。
本发明中的第四个方面可延伸至包括所有作为免疫调节剂的具有GM-1结合活性的制剂，具有GM-1介导的细胞内信号传导作用的制剂和模拟GM-1结合活性的制剂。
所以，本发明的第四个方面并不局限于使用EtxB蛋白作为免疫调节剂。可是，使用EtxB蛋白(其为有五个相同亚单位的五聚体)进行上述治疗是本发明中有代表性的一个实施例。除了野生型的EtxB，本发明也可延伸至一些突变型的EtxB，这些突变蛋白具有GM-1结合的活性，另外也可以是其它一些类似的蛋白如具有GM-1结合的活性的霍乱毒素B亚单位(CtxB)和其突变体。
根据本发明的这个方面，用作为免疫调节剂的其它治疗制剂是结合GM-1的人型单克隆抗体。识别及制备这些制剂的方法，在本领域是众所周知的。
如果本发明中所用的治疗制剂为蛋白质，如EtxB亚单位或者CtxB亚单位，这些制剂可采用基因工程的方法来制备，即将编码蛋白质的特异多肽链(或者多个链)的基因或者多个基因插入到合适的载体中，然后再转染合适的宿主。例如，将编码EtxB组件的多肽链基因插入到如质粒pMMB68，然后再将该质粒转染宿主细胞如 Vibrio sp.60。用已知的方法纯化并分离蛋白质。表达活性突变EtxB蛋白的突变基因，可通过已知的方法从野生型的基因中制备。
如前所述，具有GM-1结合活性的制剂，如特殊设计的人型单克隆抗体可通过上述的方法来设计并制备。
在本发明中，具有GM-1结合活性的制剂也有可能交叉连接GM-1受体。EtxB就是这样一种制剂，它可以其五聚体形式与GM-1受体交叉连接。
本发明现在将通过下面的图示及实例进行说明。
图1为EtxB及突变型EtxB(EtxB(G33D))的理化性质分析；
图2说明EtxB与受体的结合是其在体内表现有很强的免疫原性的基础；
图3为给小鼠注射EtxB后淋巴细胞增殖的动力学变化情况；
图4说明EtxB使B细胞活性增加；
图5说明EtxB使CD4+T细胞活性增加，但使CD8+T细胞减少；
图6说明EtxB可选择性地清除OVA一反应活性的CD8+T细胞；
图7说明EtxB与受体结合后可引起细胞进行性编程性细胞死亡的淋巴细胞核形态改变；
图8说明通过细胞周期分析发现EtxB受体可介导CD8+T细胞凋亡；
图9a和9b为在一个关节炎动物模型中EtxB与GM-1结合后抑制胶原生成的结果；
图10为EtxB而非EtxB(G33D)引起正常人外周血中单核细胞编程性凋亡的实验结果；
图11为GM1交联后引起小鼠CTLL细胞编程性凋亡的实验结果；
图1
EtxB和EtxB(G33D)的理化性质分析。
(A)EtxB或者EtxB(G33D)的SDS-PAGE分析：在还原的条件下并且在β-巯基乙醇存在的情况下，预先加热或者不加热分析5μg各蛋白质。1道，野生型EtxB，未加热。2道，EtxB(G33D)，未加热。3道，野生型EtxB，加热至95℃。4道，EtxB(G33D)，加热至95℃。标准分子量(BioRad)在道的左手边。
(B)通过胶过滤色谱法测定EtxB及EtxB(G33D)的表观分子量：先从上到下制备出标准曲线：小牛血清白蛋白(66kDa)，鸡蛋白蛋白(45kDa)，牛红细胞碳酸酐酶(29kDa)及马心脏细胞色素c(12.4kDa)；洗脱的EtxB及EtxB(G33D)的表观分子量分别为36kDa和38kDa；Ve-蛋白质的洗脱体积，凝胶过滤柱的Vo-外水体积。
(C)用ELISA方法分析EtxB及EtxB(G33D)与神经节苷酯GM1的结合情况：将平板涂以GM1，封闭，并与1μg/ml开始系列稀释(3倍)EtxB或者EtxB(G33D)一起孵育。
图2
EtxB与受体的结合是其在体内具有强烈免疫原性的基础。
给BALB/c小鼠(每组4只)注射(s.c.)溶于PBS中的EtxB或者EtxB(G33D)，或者将溶于碳酸氢盐缓冲液中的上述蛋白质进行口服。在二次s.c.注射(A)后10天或者三次口服(B)后1周分析血清，并在3次口服后(C)1周分析肠分泌物。在对照小鼠的标本中未发现任何反应(未示)。结果用血清中的IgG抗体滴度来表示，而肠分泌的IgA以下述的‘特异活性’来表示。
图3
淋巴细胞增殖的动力学
给小鼠i.p.注射30μg溶于完全弗氏佐剂的EtxB(G33D)。10天后分离MLN细胞，并在下面的条件下培养细胞：无抗原存在(空心方块)，80μg/ml的EtxB(实心三角形)，80μg/ml的EtxB(G33D)(空心三角形)，或者经过加热至95℃产生的解离的单体形式的EtxB(实心圆圈)及EtxB(G33D)(空心圆圈)。每次取样当天以1μCi的(3H)Thd脉冲细胞并持续6小时。数据以三份孔的cpm及SEM的均值来表示。
图4
EtxB使B细胞活性增加
用溶于CFA的EtxB(G33D)免疫小鼠。10天后从MLN中分离细胞，并在80μg/ml EtxB或者EtxB(G33D)，或者每种蛋白40μg/ml的混合物存在的条件下培养细胞。以生物素化的抗-CD25(7D4)及藻红蛋白(PE)抗-B220(Ra3-6D2)标记细胞。用链酶抗生物素蛋白FITC作为第二抗体结合物。另外还有抗体的对照组(未示)。在增殖的第4天用双向流式细胞计进行分析。
图5
EtxB引发的CD4+T细胞活性增加及CD8+T细胞减少。
免疫过程，细胞分离及体外激发可见图4的说明。使用生物素化的抗-CD25(7D4)及链酶抗生物素蛋白FITC检测CD25。使用)FITC标记抗-CD4(RNRM4-5及FITC标记抗-CD8α(53-6.7)检测CD4及CD8。另外还有适当的对照抗体(未示)。
图6
使用EtxB选择性地去除OVA-反应活性的CD8+T细胞
用OVA致敏小鼠，然后分离出MLN细胞并在下面的条件下培养5天：没有抗原存在，OVA+EtxB，OVA+EtxB(G33D)，或者100μg的OVA与40μg/ml EtxB或者EtxB(G33D)，或者只有100μg的OVA。细胞用下面的大鼠抗体标记：FITC-抗-CD4或者FITC-抗-CD8α，和都带有生物素-抗-CD25(IL-2Rα)，然后再用链酶抗生物素蛋白-藻红蛋白。另外还包括对照组的未染色细胞及仅用第二抗体染色的细胞。使用FACS(Becton Dickinson)分析细胞。在含有EtxB培养物中的CD25+与经其它处理的细胞相比在总细胞中占有较高的百分比，这是因为表达该标记物的B细胞比例较高(未示)。荧光的强度以log表示。
图7
EtxB与受体结合引起细胞进行性程序死亡的淋巴细胞核的形态特征性改变将含有＞90％CD3+T细胞及去除了巨噬细胞的MLNC在80μg/ml EtxB或者80μg/ml EtxB(G33D)存在的条件下培养18小时，并用吖啶橙进行染色。采用常规或者同焦点荧光显微镜(Leica TCS 4D)观察细胞。每个处理选择一个代表性的显微视野(x540)(EtxB，于左手道；EtxB(G33D)，于右手道)。在没有抗原存在条件下培养的细胞与经EtxB(G33D)处理过的所得结果类似(未示)。
图8
采用细胞周期分析检测EtxB受体介导的CD8+T细胞程序性凋亡。
采用碘化丙锭染色并用流式细胞计分析DNA含量来测定在处于细胞周期亚G0/G1期中CD4+及CD8+SPLTC的比例。通过上述的阴性筛选法从脾脏中分离出SPLTC。细胞如下处理18小时：(a)无抗原，(b)80μg/ml EtxB(G33D)或者(c)80μg/ml EtxB，然后用FITC-大鼠抗-CD4或者FITC-大鼠抗-CD8进行染色。随后细胞用碘化丙锭染色。通过测定经抗-CD4或者抗-CD8染色的细胞得出与碘化丙锭共同染色细胞的比例。该实验在细胞水平进行，其结果见图7或者表3。
实例
                        实例1
该实例主要说明进行GM-1结合以引起淋巴细胞群不同反应的需求。
材料及方法
制备与受体结合的突变型EtxB
使用质粒pTRH29，该质粒为菌粒载体pBluescript IIKS+的衍生物，含有Etx的A-及B-亚单位基因，将Gly33到Asp替换片段插入人EtxB受体的结合位点(Yu，J.，Webb，H.& Hirst，T.R.(1992)，Molec.Microbiol.6，1949-1958)。使用单链pTRH29作为模板，并用一合成的寡核苷酸(5′-TCTCTTTTATCTGCCATCG-3′)(来自the Microanalytical Facilty，IARGR，Cambridge Research Station，UK)作为突变引物，在体外用一寡核苷酸引导的突变盒(Amersham International)进行致突变。使用测序酶II(UnitedStates Biochemical Corp.)用双脱氧测序法证实正确的Gly到Asp替换片段，并将所得的质粒命名为pTRH56。使用EcoRI及SpeI限制酶将突变的etxB基因从pTRH56中切下来，并且插入质粒pMMB68(Sandkvist，M.，Hirst，T.R.& Bagdasarian，M.(1987)J.Bacteriol.169，4570-4576)从而得到一个大范围的宿主表达载体，表达EtxB(G33D)的pTRH64。
抗原
使用Amin和Hirst报道的修正方法(Amin，T.，& Hirst，T.R.(1994)Prot.Express.and Purif.5，198-204)，分别从相应的Vibrio sp.60(pMMB68)和Vibrio sp.60(pMMB64)的培养上清液中纯化野生型的EtxB及EtxB(G33D)。简言之，用渗滤法和疏水反应层析法纯化蛋白质，并用离子交换层析法进行浓缩。用磷酸盐缓冲液(PBS；10mM磷酸钠，150mM NaCl，pH7.4)平衡过的PD10柱子(Pharmacia，UK)对蛋白质溶液进行脱盐并且在-30℃的条件下储存。
EtxB和EtxB(G33D)的纯度通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳来证实。各单体的分子量通过激光解吸质谱来证实(Protein Science Facility，University of Kent)。
使用SMART系统(Pharmacia)采用凝胶过滤层析测定EtxB和EtxB(G33D)的表观分子量。将蛋白质从以PBS，pH7.5平衡过的Superdex 75 PC 3.2/30柱子中洗脱。
通过将蛋白质在95℃条件下加热5分钟，使用于淋巴细胞增殖分析(见下)的B亚单位五聚体发生不可逆的变性。
动物，样本收集和免疫步骤
从Charles River实验室购买7-12周龄的BALB/c小鼠(H-2d；对EtxB高反应性)，然后在Kent大学动物房饲养。给小鼠经s.c.注射溶于PBS中的30μg蛋白质，10天后进行增强注射，然后测定对EtxB或者EtxB(G33D)的抗体反应。另一组小鼠分三次间隔一周口服溶于碳酸钠中相同剂量的蛋白质(50μg/ml)。给对照小鼠服用PBS。在最后一次s.c.注射后10天或者口服喂养后一周取血。在最后一次喂养一周后，通过前述的方法在蛋白酶抑制剂溶液中分离活小鼠的肠分泌物(Elson，C.O.，Ealding，W.&Lefkowitz，J.(1984)J Immunol.Meth.67，101-108)。然后将样本进行超声并离心(13,226xg，10分钟，于4℃)。
为了增殖分析实验给小鼠i.p.注射溶于完全佛氏佐剂(CFA)的30μgEtxB或者EtxB(G33D)，并于10天后分离肠系膜淋巴结。另外还包括对照未被免疫的小鼠并以类似的方法分离其淋巴结。
酶连免疫吸附分析(ELISAs)
采用GM1-ELISA分析检测EtxB或者EtxB与GM1的结合(G33D)(Amin，T.，& Hirst，T.R.(1994)Prot.Express.and Purif.5，198-204)。
将微型滴定板(Immulon I，Dynateck，USA)上涂以溶于PBS的EtxB或者EtxB(G33D)5μg/ml，然后采用ELISA方法检测血清及肠分泌物中抗B亚单位IgG及IgA抗体。用溶于PBS的1μg/ml兔抗小鼠IgA(α链特异；Zymed Lab，USA)涂于每个微型板的2排孔，然后再加入1μg/ml的小鼠骨髓瘤IgA(MOPC 315，Sigma，USA)制成标准曲线，通过此标准曲线推断出肠分泌物上清中抗-B亚单位IgA抗体。为了测定总的IgA，将孔内涂以兔抗-小鼠IgA，然后再加入肠分泌物上清。系列稀释所有样本。稀释山羊抗-小鼠IgG(Fc片段特异；Jackson Lab.，USA)或者山羊抗-小鼠IgA(链特异；Sigma)过氧化酶结合物。测定抗-B亚基IgG的滴定度，得A450nm＞＝0.2。肠分泌物中各个Etx和EtxB(G33D)对IgA抗-B亚单位的反应以“IgA的特异活性”来表示[平均IgA抗-B亚单位(μg/ml)/总IgA(μg/ml)]。
如前所述，采用ELISA方法测定IL-2，IL-4，IL-5，IL-10及IFN-γ细胞因子的水平(Harper，H.M.，PhD thesis，University of Bristol(1995))。简言之，将微型滴定板上涂以对小鼠IL-2，IL-4，IL-5，IL-10及IFN-γ的大鼠抗体。将微型滴定板用2％(w/v)的小牛血清白蛋白进行封闭。将培养液上清加入孔内并且稀释。细胞因子每个微型板中有一排含有一种标准剂量的重组细胞因子孔。将微型板与0.5μg/ml的生物素化的抗-细胞因子单克隆抗体一起孵育，随后加入亲和素-过氧化物酶及3，3′，5，5′-四甲基连苯胺(TMB)并在波长A405nm处读数。
淋巴细胞增殖的测定
使用颈椎脱臼法处死小鼠，在无菌条件下取出肠系膜淋巴结，碾碎并将其通过一不锈钢网进入Hank′s平衡盐溶液中(HBSS)(FlowLaboratories，Irvine，UK)。用HBSS通过离心冲洗细胞(500xg，10分钟，4℃)，再用改进的Eagle′s培养液(Flow)重新悬浮细胞，然后向该悬浮液中加入20mM Hepes(Flow)，100IU青霉素，100μg/ml链霉素，4mM L-谷氨酸(Flow)及2-巯基乙醇(完全培养液)。加入未免疫新鲜小鼠自体正常血清使其浓度为0.5％(v/v)。使24-孔微型板2ml或者25cm3培养瓶(Nunc A/S，Roskide，Denmark)8ml体积的培养液中有2×106个活细胞/ml，并按图示说明在抗原存在及缺乏的条件下建立细胞培养。将细胞在37℃，含有5％CO2及95％潮湿空气的条件下培养6天。在设计好的时间点，从细胞培养液中取出0.1ml样本并将其转移至96孔U-形底板内(Nunc)，在收集前6小时(Mach III harvesting 96 Tomtec，Orange，Conn.USA)用[3H]-Thd(Amersham，U.K.)以1μCi/孔进行标记并用标准的液闪烁计1450Microβplus进行计数(LKB-Wallac，Turku，Finland)。类似地，从细胞培养中取0.5ml上清进行细胞因子分析。将细胞离心沉淀，并将上清在68℃条件下储存待用。
培养细胞的表型分析
在培养的第4天收集细胞并且冲洗，在HBSS/18％甲泛萄胺(Nyegaardand Co.，Oslo，Norway)的交界处收集活细胞然后在20℃500xg的条件下梯度离心15分钟。冲洗细胞二次并用含有0.2％叠氮化钠(Sigma)和10％正常大鼠血清的HBSS将细胞再次悬浮。采用下面的大鼠抗体(Pharmingen，San Diego，USA)：荧光素异硫氰酸酯(盐)(FITC)标记的抗-CD4(RNRM4-5)，FITC标记的抗-CD8(53-6.7)，生物素标记的抗-CD25(7D4)和藻红蛋白(PE)标记的抗-B220(RA3-6D2)。另外还采用生物素-标记的抗体链霉抗生物素蛋白-PE或者链霉抗生物素蛋白-FITC(Serotech，UK)。所有抗体用含有叠氮化物的HBSS来稀释并配制成事先设计好的浓度。将200μL2×106个细胞和200μL的各种抗体混合，并且在冰上孵育30分钟。如果需要链霉抗生物素蛋白-PE或者FITC第二抗体，应将细胞与这些抗体再另外孵育30分钟。另外还包括合适的FITC和PE对照抗体。用HBSS冲洗细胞，然后用2流式细胞计进行分析。
结果
EtxB受体结合突变体的产生及特点
为了产生一个有识别受体缺陷的突变的B亚单位，用寡核苷酸-引导的EtxB突变将Gly到Asp替换片段引入E.coli热不稳定肠毒素的B亚单位。将命名为EtxB(G33D)的突变蛋白和野生型EtxB纯化至均一性(参见材料和方法)。采用激光解吸附质谱测定纯化的EtxB和EtxB(G33D)的分子量。所测得的分子量与相应的EtxB和EtxB(G33D)单体理论分子量11702和11760Da误差在20Da之内。如果在进行SDS-PAGE分析前不加热，野生型EtxB和EtxB(G33D)均以各自稳定的寡聚体进行迁移，表观分子量为42kDa和56kDa(图1A，相应地为1道和2道)。已观察到的EtxB的泳动速度及SDS-稳定性是B亚单位五聚体的特性(见Sandkvist，M.，Hirst，T.R.&Bagdasarian，M.(1987)J.Bacteriol.169，4570-4576)。寡聚体EtxB(G33D)的泳动速度较慢，但由于在进行高分辨凝胶过滤层析分析时五聚体EtxB和EtxB(G33D)的保留时间类似，所以其不是因为构成B亚单位单聚体的数量不同所致。EtxB(G33D)与野生型EtxB泳动速度的差异可能是因为引入带负电荷的Asp残基使其与SDS的结合减少而使迁移速度减慢。
另外还就EtxB和EtxB(G33D)在低pH缓冲液中的稳定性，对1.0mg/ml胰蛋白酶或者蛋白酶K的耐受性，以及对一系列抗-B亚单位的单克隆抗体及多克隆抗体的相应的反应性进行了比较。在上述的每个实验中EtxB(G33D)显示了与野生型EtxB相同的性质。因此认为在EtxB的33残基引入Gly到Asp替换片段后与野生型EtxB比较并没有改变寡聚体的构形，SDS，pH或者蛋白酶的稳定性，或者抗体的反应性。
采用GM1-ELISA方法来评估EtxB(G33D)与其受体GM1的结合能力(图1C)。与野生型蛋白质比较，突变体与GM1的结合能力明显减弱(在A450nm处读数减少＞99％)。另外，与野生型EtxB比较，当用免疫荧光进行检测时显示EtxB(G33D)不与CHO细胞结合。因此认为EtxB(G33D)在体外和原位与GM1神经节甙酯结合能力上的缺陷。
EtxB在体内所具有的强烈免疫原性是依赖于其与受体结合
通过给小鼠口服或者s.c.注射溶于PBS的EtxB或者EtxB(G33D)来评估受体结合对EtxB免疫原性的重要性。口服EtxB可使血清中IgG抗体的滴度升高，并使肠分泌物中IgA的活性升高(图2)。但是相反的，类似的EtxB(G33D)口服免疫方案不产生可测定出的抗体活性。s.c.注射EtxB(G33D)后确可引起血清中的抗体反应，但与野生型的EtxB比较反应非常低，平均抗体滴度减少＞160倍，相应地为1050和171000。因此认为EtxB与受体结合是其在活体内具有强烈免疫原性的基础。
在EtxB或者EtxB(G33D)存在的条件下受体结合不影响淋巴细胞增殖的程度
在体外检测了EtxB或者EtxB(G33D)对淋巴细胞增殖的影响。从经过EtxB或者EtxB(G33D)免疫小鼠的帼窝及肠系膜淋巴结(MLN)分离出淋巴细胞，并在体外用蛋白质或者用经加热变性的EtxB或者EtxB(G33D)进行刺激。来源于帼窝或者MLN淋巴细胞的增殖反应是类似的。在上述的情况中，对蛋白增殖反应的增加是随着B亚单位浓度的增加而增加的。由MLN所进行实验的一组代表性数据见表1。对野生型和突变五聚体的反应程度与对经加热后变性的野生型和突变单聚体的反应类似。图3所示的为在80μg/ml上述各种蛋白质存在的条件下所得的增殖反应的动力学变化。反应性依赖于抗原的存在，且在各种蛋白质存在下反应的形式类似。掺入[3H]-Thd的培养在第3天出现反应，在第4天反应达到高峰，以后减弱。在图3中可见经过重复实验出现峰值反应的时间没有不同，说明对EtxB及EtxB(G33)免疫反应回忆能力的特点是类似的。因此认为在天然蛋白质存在的条件下，刺激的水平不会受受体结合或者引入的突变的影响。
毒素与受体的结合可引起B细胞和T细胞亚群的免疫调节
为了检测EtxB与受体结合是否在体外对淋巴细胞群产生影响，分离经i.p.注射EtxB(G33D)致敏小鼠的MLN淋巴细胞，然后用EtxB或者EtxB(G33D)或者两者的混合物进行刺激。此外还进行一个平行实验，即给小鼠注射EtxB并分离其MLN淋巴细胞，结果发现与用EtxB(G33D)致敏小鼠所得的结果基本一致。
(i)EtxB引起B细胞活性增加
通过与B细胞标记物B220(CD45R)有关的激活标记物CD25(IL-2Rα)表达来检测EtxB对B细胞的作用。如图4所示经EtxB刺激的细胞培养中B细胞数占总细胞数的62.9％，其中表达细胞激活标记物CD25的细胞占很高的比例(28.4％)。相反地，经EtxB(G33D)刺激后的B细胞数与野生型比较少了一半(22.26％)，并且激活的细胞数也较少(5.6％)。为了证实EtxB所产生的作用是主要的，将细胞在等摩尔的EtxB和EtxB(G33D)中孵育。仅用EtxB刺激后，采用流式细胞计所得的结果是类似的(60.6％的B细胞，其中有26％被激活)。因此认为在体外EtxB与受体结合可使B细胞激活增加。
(ii)EtxB可使CD4+T细胞激活增加并完全去除CD8+T细胞
为检测B亚单位与受体结合对T细胞的影响，将淋巴细胞用与抗CD25的抗体有关的抗CD4或者CD8的抗体标记淋巴细胞(图5)。此外有些细胞可用CD3标记物的抗体进行标记(未示)。用EtxB刺激后，表达CD4标记物的T细胞比例为36.7％。其中有高比例的细胞被激活(32.7％)。相反的，在含有EtxB的细胞培养中未发现CD8+T细胞。
为比较，在EtxB(G33D)刺激后的培养细胞中，CD4+及CD8+T细胞均存在。在CD4+T细胞占很大的比例(66.6％)的培养物中，其中只有12％被激活。在EtxB(G33D)存在的情况下，CD8+T细胞所占的比例为细胞总数的11.7％，并且CD25标记物缺乏表明其中只有很少的细胞被激活。而在等摩尔浓度的EtxB和EtxB(G33D)混合物存在的情况下，细胞的反应方式与单独使用野生型EtxB的方式类似；CD4+T细胞占41.68％(其中CD25+占28.6％)，但未见CD8+T细胞(图5)。在所有上述的分析中，被CD3染色的细胞比例与表达CD4和CD8标记物细胞的总和相等。上述这些实验数据证实毒素受体的结合可使B细胞和CD4+T细胞的激活增加，并选择性地去除CD8+T细胞。
细胞因子的产生
为了评估EtxB对淋巴细胞群的作用是否依赖于细胞因子产生的变化，将细胞培养物与EtxB或者EtxB(G33D)一起孵育，并在培养的第2，3，4，5和6天取上清液进行分析。表2所示在培养的第5天细胞因子的浓度达到最高。虽然这些细胞因子的相对浓度有所不同，但在在EtxB或者EtxB(G33D)存在下刺激的细胞培养液上清中可检测出IFN-γ和IL-2。在与野生型EtxB一起孵育的细胞培养液中所含的IL-2浓度要较与EtxB(G33D)一起孵育的高3倍，而其所含的IFN-γ浓度要低1.5倍。尽管对其它抗原反应而增殖的T细胞产生高浓度的IL-4，IL-5和IL-10，但在与EtxB或者EtxB(G33D)一起孵育的细胞培养液中并未发现这些细胞因子。与EtxB(G33D)比较，与EtxB一起孵育的细胞培养液中IL-2浓度升高而IFN-γ降低，这可能是由于B和CD4+T细胞的激活状态不同所致。上述这些结果说明野生型EtxB对CD8+T细胞的强烈作用不像是因为与受体结合而引起细胞因子的主要迁移所介导的。
讨论
上述这些研究表明在EtxB与受体结合的位点引入一个点突变(G33D)可使其与GM1的结合能力明显降低。重要的是，突变体EtxB(G33D)与野生型EtxB比较，其理化性质完全相同，如经胶层析分析其构向相同，在SDS中，酸中和蛋白酶中的稳定性也相同。在用EtxB或者EtxB(G33D)免疫后测定特异的抗体反应会发现有很大不同。与野生型比较，给小鼠皮下注射EtxB(G33D)可导致抗体的滴度明显降低(ca＞160倍)，而如果经口服给予则检测不到免疫反应。出现这种差异可能是由于抗体识别分子的主要表位或者协助产生抗体的有效T细胞刺激的主要表位被破坏。然而，值得关注的是Gly到Asp的替换片段对于一系列的多克隆及单克隆抗体识别B亚单位并无影响。另外，在体内无论用何种蛋白进行致敏，将EtxB或者EtxB(G33D)加入到培养细胞中所得的增殖反应是类似的；这说明T细胞对任何一种分子的反应都不是特异的。因此认为EtxB与受体的结合是其在体内具有强烈免疫原性的基础。
EtxB与受体结合所致的强烈的免疫原性的重要性可以通过许多方法来解释。首先，Etx和Ctx的B亚单位与GM1的结合可以增加摄取这些蛋白的效率，提高免疫系统所需的局部蛋白质的浓度。还发现可与粘膜结合的其它种类蛋白质也是有效的免疫原(De Aizpura，H.J.& Russell-Jones，G.J.(1988)J.Exp.Med.167，440-451)。经口服后所观察到的EtxB及其突变体免疫原性上的差异可能是由于肠道可有效吸收EtxB所致。而经非口服途径免疫后(使局部抗原达到很高的浓度)所致的明显差异提示还有其它作用。例如，EtxB与GM1结合后可影响抗原代表细胞活性的效力。这种结合可使II型细胞激活，尤其是可使其表达重要的联合刺激分子如B7的表达，B7与它们需要的增强抗原代表活性有关(Jenkins，M.K.& Johnson，J.G.(1993)Curr.Opin.Immunol.5，361-367)。另外，受体结合可能还对淋巴细胞亚群有直接的作用。本研究的一系列观察均非常明确地证实上述观点。
体外的研究表明EtxB可使致敏的淋巴结细胞发生增殖。由于使用野生型EtxB，EtxB(G33D)还是这些蛋白质加热变性后不能与GM1结合的单聚体形式，所得到的反应回忆能力的特点是类似的，所以说上述的特性与受体结合无关。因为已有许多报道认为商业化制备的Ctx和CtxB或者是纯化的重组CtxB在体外可强烈抑制淋巴细胞增殖，这就使得上述的研究非常有趣。这一明显的差异可能是由于以往的实验使用纯化的淋巴细胞进行实验，并多使用促分裂原刺激淋巴细胞培养物(其不是克隆限制的反应)，这就可能引入其它不同的反应机制。与我们实验观察一致的是EtxB确可抑制Con A刺激的淋巴细胞增殖。对用EtxB或者EtxB(G33D)刺激的致敏的淋巴结细胞群分析揭示了B细胞及带有CD4和CD8的T细胞间的重要不同。
在EtxB或者EtxB(G33D)存在的情况下，培养4天后可发现B细胞。可是与EtxB(G33D)比较，加入EtxB培养物中B细胞的相应的比例增加几乎100％。该增加与CD25对有很高比例的B细胞的表达有关。这个实验显示反应的淋巴细胞在体内用EtxB(G33D)致敏。类似的，用EtxB免疫小鼠细胞揭示了相似结果。所以，在含高比例B细胞的EtxB存在下的培养物与用EtxB(G330)刺激的培养物比较，在体内可不考虑与受体结合有关的效果。由于实验结果并未显示所检测细胞因子的主要位移，所以在体外对B细胞的作用至少部分与T细胞的调节无关。因此，在体外EtxB与受体结合可直接作用于B细胞，这不仅导致该细胞群激活也导致其按比例扩张。还值得注意的是CtxB可使II型MHC对原始B细胞表达增加，而突变体CtxB(G33E)与GM1结合后并未显示有该特性(Francis，M.L.，Ryan，J.，Jobling，M.G.，Holmes R.K.，Moss，J.& Mond J.J.(1992)J.Immunol.148，1999-2005)。这些实验的结果提示EtxB对抗原致敏的B细胞有直接的促分裂作用，并证实这些作用是因为受体结合介导所致。
此外除了EtxB对培养物中B细胞的作用外，流式细胞计分析显示该类毒素可完全去除检测到的CD8+细胞。由于该T细胞群在含有EtxB(G33D)培养物中并未被去除，所以再一次显示该作用依赖于受体结合。另外从野生型EtxB免疫的小鼠可观察到在含EtxB的培养物中的CD8+细胞被完全去除。有三种可能的机制可介导上面的作用。1)已知Ctx或者CtxB与大鼠MLN细胞上的GM1结合后可引起帽和斑的形成(Craig S.W.andCuatrecasas P.，(1975)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.72，pages3844-3848)。有可能在该过程中包括CD8的EtxB-GM1混合物和其它分子，被内化。这一过程可能会妨碍流式细胞计发现采用CD8作为标记物的细胞，并可因为丧失与表面TCR复合物的结合而导致其死亡。虽然后者可以说明培养细胞中CD8+细胞的缺失，但其它的实验发现当采用CtxB时人Jarkat T细胞系的表面没有发现TCR复合物缺失(Imboden，J.B.，Shoback，D.M.，Pattison，G，& Stobo，J.D.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83，5673-5677)。由于发现CD3和CD4标记物不受影响，故提示加帽反应可使反应不发生。2)另一个机制可能是细胞培养中的细胞因子所致。在该研究中，检测到了IL-2和IFN-γ。可是这个结果并不说明细胞因子的一系列变化可解释对CD8+T细胞的强烈作用。3)CD8+T细胞的缺失可能是由于发生程序性细胞凋亡的活性诱导。程序性凋亡所致的淋巴细胞死亡可参与上述的加帽反应，或者在没有加帽反应情况下由发生在细胞内的信号传导来介导。激活所引起的程序死亡依赖于Ca2+并与磷酸酶和激酶有关。CtxB与淋巴细胞结合后可抑制蛋白激酶C依赖的增殖，并且可导致细胞内的Ca2+明显增加，而这一过程与CAMP水平的增加无关。EtxB去除CD8+而非CD4+T细胞的能力可能是由于CD4/CD8-TCR复合物与淋巴细胞亚群表面上的GM1发生交连后而产生的信号有所不同所致。上述作用可能是CtxB与膜上类毒素结合不同所致，或者也可能是CD4+和CD8+T细胞的信号传导机制不同所致。
与突变体和受体结合比较，在可检测的CD8+T细胞完全缺乏中，EtxB增加了激活的CD4+T细胞的比例。在体内已证实在对Ctx反应中CD4+T细胞是基本需求。可是使该T细胞亚群激活增加的原因目前尚不清楚。CtxB有一个很明显的特性是可使处于静止期的小鼠未转化3T3细胞的DNA合成增加并促使细胞分裂。另外还发现植物凝集素有选择性地致CD4+T细胞分裂的作用，植物凝集素可与Galβ-1-3-3GalNAc结合，而EtxB与GM1结合时也是与这一部分结合。不能除外EtxB介导了对CD4+T细胞的GM1结合依赖性直接作用并使它们激活的可能性。然而，在含有EtxB的培养物中CD4+T细胞激活增加也可能是由于上述的B细胞及CD8+T细胞变化而导致的。已知B细胞的激活与它们作为代表CD4+T细胞的抗原的能力增加有关。而CD8+T细胞在体内及体外均广泛参与各种免疫反应的调节。从增殖的T细胞培养中消去它们与CD4+T细胞长时间高水平的分裂有关。
总之，在本研究中EtxB通过与GM1结合后的生长调节作用，使B细胞激活增加，从而EtxB在体内具有很强的免疫原性。CD4+T细胞的激活以及EtxB在体外的细胞培养中可使IL-2产生增加，所有这些都可提供B细胞克隆进一步增殖所需的信号。在本研究中EtxB在体外可去除CD8+T细胞，其在系统或者口服后，特别是根据该细胞亚群参与了免疫反应抑制及口服耐受，故还提供了体内免疫增强的另一机理。在这方面已有研究显示Etx和Ctx可去除同时服用可溶性蛋白所产生的口服耐受，而其它一些研究提示Ctx和CtxB可去除对肠道上皮内淋巴细胞以及集合淋巴结的作用，这也可以解释上述作用的发生机理。CtxB在体外对CD8+T细胞的抑制作用也表明其可预防移植物抗宿主反应。
总之已经证实EtxB在体内对抗体反应很强，而在体外对淋巴细胞群的作用存在着很强的免疫调节作用。另外还证实这些作用是由于受体结合所介导。我们研究的发现还可说明Etx和Ctx有作为其它抗原有效的佐剂以及潜在的蛋白载体的能力，并且提示这些性质有赖于这些类毒素与淋巴细胞表面的神经节甙酯受体的结合能力。
                        实例2
本实例说明对于CD8细胞的作用与抗原的识别无关，该作用是由程序性细胞死亡所介导的。
如实例1中所述制备重组的EtxB和EtxB(G33D)制剂。这两种蛋白质都与GM1结合，与一系列单克隆及多克隆抗体结合，并且具有其它各种理化性质。卵白蛋白(OVA)由Sigma(Poole，UK)购得。肠系膜淋巴结(MLN)从8-10周龄的BALB/c小鼠中分离得到[对EtxB高反应的种系(Nashar，T.O.and Hirst，T.R.1995.Immunoregulatory role of H-2 and intra-H-2alleles on antibidy responses to recombinant prepatations of B-subunits of Escherichia coli heat-labile enterotoxin(rEtxB)andcholera toxin(rCtxB).Vaccine 13：803.)]。给小鼠i.p.注射用不完全弗氏佐(Sigma)剂乳化的200μgOVA(Sigma)。注射10天后取出MLN，捣碎并通过一不锈钢滤网滤入HBSS(Flow，Irvine，UK)。用HBSS通过离心冲洗回收的细胞(500xg，10分钟，4℃)，再用含20mM Hepes(Flow)，100IU青霉素，100μg/ml链霉素，4mM L-谷氨酸(Flow)及2-巯基乙醇(完全培养液)改进的Eagle′s培养液(Flow)重新悬浮细胞。向其中加入0.5％(v/v)新鲜小鼠自体正常血清。24-孔微型板(Nunc A/S，Roskide，Denmark)中2ml体积的培养液有2×106个活细胞/ml，并在100μg/mlOVA(经完全细胞培养液充分透析过的)单独或者与40μg/ml EtxB或者EtxB(G33D)一起存在的条件下建立细胞培养。将细胞在37℃，5％CO2及95％空气的条件下培养5天。在设计好的时间点，从细胞培养液中取出0.1ml样本并将其转移至96孔U-形底板内(Nunc)，在收集前(Mach III harvesting96 Tomtec，Orange，Conn.USA)用[3H]-胸苷(Amersham，U.K.)以1μCi/孔进行脉冲6小时并用标准的液闪烁计进行计数(1450Micro βplus，LKB-Wallac，Turku，Finland)。采用流式细胞计(Becton Dickinson，Erenbodegem-Aalst，Belgium)分析T细胞，细胞用下面的大鼠抗体进行染色(Pharmingen，Cambridge，UK)：FITC标记的抗-CD4(RNRM4-5)或者FITC-抗-CD8α(53-6.7)以及生物素标记的抗-CD25(IL-2Rα)(7D4)，还有链霉抗生物素蛋白-藻红蛋白。另外，对生物素标记的抗体采用FITC标记的链霉抗生物素蛋白。回收细胞的FACS在增殖高峰期(第4天)掺入[3H]胸苷进行分析。
为了细胞程序性死亡分析，从8-10周龄的BALB/c小鼠体内分离出新鲜的MLN细胞(MLNC)及脾T细胞(SPLTC)。以流式细胞计检测MLNC含有＞90％CD3+T细胞，并将其在佩特里培养皿内(Costar，Cambridge，MA)用含有10％FCS的完全培养液在37℃，5％CO2和95％空气的条件下孵育2小时以去除粘附的细胞。未粘附的馏分用吸管去除，在使用前将其沉淀并用HBSS冲洗2次。按照已被描述过的方法(Wigzell，H.1976.Specific affinityfractionation of lymphocytes using glass or plastic bead columns.Scand.J.Immunol.5：(suppl.5)23.)将玻璃珠表面涂以正常的小鼠血清，随后再加入兔抗-小鼠-γ球蛋白，采用阴性筛选的方法纯化SPLTC。流式细胞计检测，所选出的T细胞群＞90％的为CD3+T细胞。
CD4+T细胞和CD8+T细胞用如下的方法进行分离：未粘附的MLNC用大鼠藻红蛋白-抗-小鼠CD4(4708-02)或者FITC-抗-小鼠CD8α(53-6.7)(PharMingen)进行标记，按照厂家说明用山羊抗-大鼠IgG(H+L)F(ab′)2(PharMingen)与MACS胶态超顺磁微型珠结合，然后将其与细胞一起孵育。再将其上微型-MACS柱(Miltenyi Biotech，Bergisch Gladbach，Germany)经流式细胞计检测分离出阳性的(＞99％的纯度)和阴性的(＞90％的纯度)CD4和CD8+T细胞。
有两种方法可给细胞程序性死亡定量：i)用吖啶黄染色DNA以观察核的形态，ii)用碘化丙锭和抗-CD4或者抗-CD8抗体染色DNA以观察细胞周期。用含有10％FCS及含有或者不含有80μg/ml EtxB或者EtxB(G33D)的完全培养液建立2×106/ml MLNC，SPLTC和分好的MLNC的培养物，在4到18小时期间进行观察。孵育后沉淀细胞并用HBSS进行冲洗，然后用5μg/ml吖啶黄染色(Sigma)。分离淋巴细胞并用含有或者不含有10-7M的地塞米松进行处理，并用作正在经历凋亡的细胞的阳性对照。使用常规或者差式荧光显微镜(Leica，TCS 4D)观察淋巴细胞核形态的改变。如文献所述(O′Connor，P.M.，Jackman，J.，Jondle，D.，Bhatia，K.，Magrath，I.andKohn，K.W.1993.Role of p53 tumor suppressor gene in cell cyclearrest and radiosensitivity of Burkitt′s lymphoma cell lines.Cancer.Res.53：4776.)以碘化丙锭染色后，用流式细胞计分析DNA含量从而测定出细胞周期中处于G0/G1亚期的CD4+和CD8+SPLTC的比例。将与含有或者不含有40μg/ml EtxB或者EtxB(G33D)孵育18小时的SPLTC培养细胞中分离的细胞用FITC大鼠抗-CD4或者FITC-抗-CD8α进行染色。将染色的细胞用含有20mM HEPES和0.5mM EDTA的冰冷HBSS调整至1×106/ml，然后滴入冰冷的乙醇进行固定。随后加入50μg/ml的碘化丙锭和40μg/ml核酸酶(无DNase)并将细胞在室温下孵育1小时。通过闸门控制用每种mAB共同染色的细胞，从而测定出CD4和CD8+T中碘化丙锭染色DNA的相对强度。
在实例1中，发现对EtxB反应增殖的淋巴结细胞培养中CD8+T细胞完全消失，这说明EtxB对该T细胞亚群有多克隆作用。为了研究这一作用是否与EtxB反应细胞的激活有关，取OVA致敏小鼠的细胞进行培养，并用OVA或者OVA加EtxB或者突变体EtxB(G33D)刺激该培养细胞。在单独使用OVA，OVA加EtxB或者EtxB(G33D)的情况下(分别为9734+347，12,031+135和9305+290c.p.m.)，细胞培养所得到的增殖峰值类似(每组均在培养的第4天)。可是4天后在这些培养中T细胞亚群的分布却出现了很大的差异(图6)。所有培养中含有CD4+T细胞，其中共同表达激活标记物CD25的比例类似。然而，与OVA加EtxB一起孵育的培养中未见CD8+T细胞，而与OVA加EtxB(G33D)或者单独与OVA一起孵育的培养中可清楚的观察到CD8+T细胞(虽没有象CD25表达那样被激活)。这说明EtxB可去除对除了EtxB以外的一种抗原反应的CD8+T细胞。更具体讲，对EtxB(G33D)无这种反应说明上述细胞的去除是因为类毒素受体相互反应所致。正如以前在的对EtxB反应的细胞培养中发现的(实例1)，还注意到在野生型EtxB存在的条件下可引起B细胞部分显著增加，其中大部分是CD25+(未示)。因此认为，EtxB与受体结合后可对淋巴细胞产生很强的调节作用，而这与抗原的特异性无关。
另外还研究了在EtxB存在的条件下CD8+T细胞经历程序性细胞死亡的可能性。将从未致敏的小鼠中分离出的MLNC或者纯化的SPLTC与EtxB或者EtxB(G33D)一起孵育，在4到18小时期间经丫啶黄染色后观察细胞核形态的改变(表3和图7)。细胞形态变化的特点是由于核分叶所致的染色体浓缩表现(图7)。另外还观察到如细胞膜泡沫样改变和凋亡体等其它细胞凋亡的特征。在用EtxB处理过的细胞培养中约有三分之一有上述这些形态变化，而用EtxB(G33D)或者无外源性抗原处理过的细胞培养中只有非常少部分的细胞观察到上述改变(表3)。由于CD8+T细胞占MLNC和SPLTC中的35-40％，故这些细胞的消失可计算观察到的凋亡。为了证实这一想法，在抗原存在的条件下培养纯化的CD+8和CD4+T细胞18h(表3)。用EtxB，EtxB(G33D)或者不用抗原处理经阴性法选择出的CD4+T细胞群(含有＞90％带有CD4的细胞)，可引起类似百分比的形态变化，这说明EtxB与受体结合并不能引起该细胞亚群发生凋亡。相反地，用野生型EtxB处理的经阴性法选择出的CD8+T细胞(＞90％的纯度)有＞70％的发生形态改变，但如果不用抗原或者只用EtxB(G33D)处理则该T细胞群中只有11-19％发生形态改变。另外，由于高纯度的含有＞99％的CD8或者CD4+T细胞(用阳性法筛选分离)对EtxB以类似的方式发生反应(在EtxB存在的条件下60％出现凋亡，而不用抗原或者用EtxB(G33D)处理后只有7％出现凋亡)，所以所使用的纯化细胞群中含有少量的污染细胞(约10％)并不影响结果(表3)。在地塞米松不存在或者存在的条件下孵育18小时，相应地有40％和98％的胸腺细胞发生凋亡。
为了证实在我们的培养中所观察到的形态变化与发生细胞凋亡时一致，本研究还评估了在经EtxB处理18小时后，SPLTC培养中亚二倍体DNA出现的情况。在经碘化丙锭及抗-CD8或者抗-CD4抗体共同染色后，采用流式细胞计分析细胞(图8)。与EtxB孵育的CD8+T细胞培养中约有48％低于碘化丙锭染色二倍体G0/G1的峰值，这说明这些细胞正在经历凋亡(O′Connor，P.M.et al，supra)。在用EtxB处理的培养中，有一小部分表达CD4的细胞也显示有亚-G0/G1 DNA的水平(～11％；这可能是由于大部分CD8+T细胞死亡所致)。相反地，在不用抗原或者用EtxB(G33D)培养的大部分CD4或者CD8+T细胞处于G0/G1细胞周期，只有＜5％的细胞出现凋亡。我们认为用EtxB处理CD8+T细胞部分后所出现的核形态改变以及DNA亚G0/G1水平是由于霍乱样肠类毒素引发的选择性细胞凋亡所致。突变体EtxB(G33D)与受体结合后不能引发类似的反应证实引发CD8+T细胞凋亡与其与GM1神经节甙酯的结合能力有关。
                        实例3
以8只雄性DBA/1小鼠为一组，其中一组为未致敏组(A组)，或者在实验前(0天)用CFA溶解的牛胶原100μg在小鼠侧面皮内注射(i.d.)。注射胶原的小鼠中有一部分未被保护(B组，阳性对照组)，或者为了防止疾病的发生在胶原致敏部位的附近于0天i.d.给予用IFA溶解的100μg EtxB(C组)，在14天给予用IFA溶解的100μg EtxB(D组)，或在0天给予用IFA溶解的100μg EtxB(G33D)(E组)。除了A组，所有动物在21天接受增强剂量的注射，在45天通过测量后肢踝处的厚度来评估疾病的严重性(实验A)，或者通过对后肢水肿的评分来评估(0-3级，其中0＝正常，而3＝最严重的水肿；实验B)。
图9a和9b所示为所得的结果。这些结果说明是EtxB，而非EtxB(G33D)可非常有效地保护由胶原所致的关节炎的发生。
                        实验4a
两种分开的人的附有淡黄色样本(从正常人的血液中得到)作为单核细胞的来源。用菲可帕克试剂分离细胞，充分冲洗，然后按照说明不加抗原或者将80μg/ml的EtxB或者EtxB(G33D)加入培养液的情况下培养细胞。在进行培养前每种样本的细胞群相应地含有24％CD8+，27％CD4+和27％CD8+，22.9％CD4+。在培养18小时后用吖啶黄染色细胞来评估凋亡细胞的出现(详见实例2)。所得结果见图10；这些结果说明是EtxB，而非EtxB(G33D)引起正常人外周血中单核细胞凋亡。
                        实验4b
培养小鼠T细胞系，CTLL-2并使其长满，冲洗细胞，然后以1×106个细胞/ml的浓度接种，并按说明不加抗原或者加入80μg/ml EtxB或者EtxB(G33D)。18小时后取样并采用吖啶黄染色来评估发生凋亡细胞的百分比(详见实例2)。所得结果见图11。这些结果说明GM1的交联可致一部分小鼠CTLL细胞发生凋亡。
表1-在加有EtxB或者EtxB(G33D)的情况下淋巴细胞的增殖
  剂量μg/ml   EtxB   EtxB(G33D)   EtxB*   EtxB(G33D)*
  0510204080160   117.9(7.9)4928(98.7)6978(30.6)7084(100)8844(26)10246(30.7)11311(247)   146.8(3.5)2860(3.8)3681(4.6)6912(47.3)8586(143.7)12510(121.8)13525(352.7)   124.5(14.6)2424(88.3)2518(21.6)4394(42.1)7431(45.3)7986(210.3)-----   116.1(6.35)1431.5(37.5)4231(96.4)5075(24.8)4368.5(118.9)7276(369.5)-----
给小鼠i.p.注射30μg的溶解于完全弗氏佐剂(CFA)的EtxB(G33D)。10天后分离肠系膜淋巴结。分离细胞并在EtxB，EtxB(G33D)或者经95℃加热后产生的这些蛋白分离的单体形式(*)存在的条件下孵育细胞4天。在第4天的后6个小时加入1μCi的(3H)dThd并测定细胞增殖。均值用3个孔样本的平均cpm和SEM来表示。从未致敏小鼠中分离出的细胞给出＜1500cpm的数值(剂量160μg/ml)。
表2-在EtxB或者EtxB(G33D)存在的条件下分析细胞因子
  蛋白质   IL-2(pg/ml)   IFN-γ(pg/ml)
  EtxBEtxB(G33D)   31867   27004068
给小鼠注射溶解于CFA的EtxB(G33D)并在10天后分离肠系膜淋巴结细胞。然后在体外加入EtxB或者EtxB(G33D)孵育细胞并在细胞增殖第5天取上清分析细胞因子的含量。
表3-在分离的淋巴细胞中EtxB-受体介导的细胞凋亡
  细胞   时间(小时)   无抗原   EtxB(G33D)   EtxB
  MLNCSPLTC   418418   0a(8)8(10)3(7)17(5)   2(0)5(18)2(6)16.5(12)   1(3)29(35)3(5)31(32)
  阴性法筛选
  CD4CD8   1818   5(37)18(11)   6(31)19(15)   9(35)76(73)
  阳性法筛选
  CD4CD8   1818   67   47   660
在无抗原或者加入80μg/ml EtxB或者EtxB(G33D)的情况下孵育4或者18小时后，以吖啶黄染色并用荧光显微镜观察分类的CD4及CD8+T细胞中核的形态变化。去除MLNC中的粘附细胞。在玻璃珠柱表面涂以小鼠γ-球蛋白，且兔抗-小鼠抗体作为第二抗体，采用阴性选择法分离出SPLTC。用大鼠藻红蛋白-抗-小鼠CD4或者FITC-抗-小鼠CD8α标记，然后得到分出的SPLTC，与结合有山羊抗-大鼠IgG(H+L)F(ab′)2的MACS胶体超顺磁微型珠一起孵育。采用微型-MACS柱分离这些细胞，从而得到阳性的(＞99％纯度)及阴性的(＞90％的纯度)筛选出的CD4和CD8+T细胞部分。在4到18小时如图7说明中所述的方法检测200个细胞中随机样本的核形态变化。凋亡细胞的最大百分比发生在18小时以后。在括号中的数据为另一个不同实验的结果。MLNC和SPLTC数据为四个实验的均值。a为凋亡细胞的百分比。

Claims (11)

1.一种物质在制备用于预防和/或治疗自身免疫疾病、移植物排斥或GVHD的药物中的用途，其中：
(i)该物质选自：Etx、EtxB、Ctx和/或CtxB；
(ii)该物质不与抗原连接。
2.根据权利要求1的用途，其中所述药物用于预防和/或治疗自身免疫疾病。
3.根据权利要求2的用途，其中所述药物用于预防和/或治疗类风湿性关节炎、多发硬化或糖尿病。
4.根据权利要求1-3任一项的用途，其中该物质是EtxB。
5.根据权利要求1-3任一项的用途，其中所述药物不含有自身或交叉反应性抗原。
6.根据权利要求1-3任一项的用途，其中所述药物含有自身或交叉反应性抗原。
7.药物组合物，其包含用于预防和/或治疗自身免疫疾病、移植物排斥或GVHD的物质，其中：
(i)该物质选自：Etx、EtxB、Ctx和/或CtxB；
(ii)该物质不与抗原连接。
8.根据权利要求7的组合物，其中该物质是EtxB。
9.根据权利要求7的组合物，其中所述组合物不含有自身或交叉反应性抗原。
10.根据权利要求7的组合物，其中所述组合物含有自身或交叉反应性抗原。
11.试剂盒，其含有根据权利要求7-8任一项的药物组合物和与其分开的包含自身或交叉反应性抗原决定簇的药物组合物。
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