PL187266B1 - Kompozycja farmaceutyczna do wywoływania zróżnicowanego wpływu na populacje limfocytów, zestaw zawierający co najmniej dwie oddzielne kompozycje farmaceutyczne, zastosowanie czynnika do produkcji leku do wywoływania zróżnicowanego wpływu na populacje limfocytów oraz zastosowanie czynnika Etx, Ctx, podjednostki B Etx lub podjednostki B Ctx do produkcji leku do modulowania odpowiedzi immunologicznej - Google Patents
Kompozycja farmaceutyczna do wywoływania zróżnicowanego wpływu na populacje limfocytów, zestaw zawierający co najmniej dwie oddzielne kompozycje farmaceutyczne, zastosowanie czynnika do produkcji leku do wywoływania zróżnicowanego wpływu na populacje limfocytów oraz zastosowanie czynnika Etx, Ctx, podjednostki B Etx lub podjednostki B Ctx do produkcji leku do modulowania odpowiedzi immunologicznejInfo
- Publication number
- PL187266B1 PL187266B1 PL96324424A PL32442496A PL187266B1 PL 187266 B1 PL187266 B1 PL 187266B1 PL 96324424 A PL96324424 A PL 96324424A PL 32442496 A PL32442496 A PL 32442496A PL 187266 B1 PL187266 B1 PL 187266B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- etxb
- cells
- subunit
- antigenic determinant
- ctx
- Prior art date
Links
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims abstract description 19
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims abstract description 19
- 230000003608 autoimmunological effect Effects 0.000 title 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims abstract description 51
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 46
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 45
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 41
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims abstract description 22
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 21
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims abstract description 20
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 18
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 17
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 claims abstract description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 16
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 230000009699 differential effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 12
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 11
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 claims abstract description 11
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 claims abstract description 9
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims abstract description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 65
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 42
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 41
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 41
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 26
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 13
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000000961 alloantigen Effects 0.000 claims description 6
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 claims description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 117
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 77
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 44
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 43
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 43
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 41
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 34
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 34
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 29
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 25
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 25
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 24
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 21
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 20
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 15
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 15
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 15
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 15
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 14
- 230000004044 response Effects 0.000 description 13
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 12
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 12
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 10
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 10
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 10
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 10
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 9
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 9
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 8
- 210000002011 intestinal secretion Anatomy 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 7
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 7
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 7
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 6
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 6
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 5
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 5
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 5
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 5
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 5
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 4
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 4
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 4
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 3
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 3
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 3
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 3
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 3
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 241000607284 Vibrio sp. Species 0.000 description 3
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 3
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 3
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 3
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 3
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 2
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000009386 Experimental Arthritis Diseases 0.000 description 2
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000033540 T cell apoptotic process Effects 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 108010078814 Tumor Suppressor Protein p53 Proteins 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 230000000919 anti-host Effects 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 210000004970 cd4 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 2
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 2
- 108010055409 ganglioside receptor Proteins 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000004989 laser desorption mass spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 230000003844 B-cell-activation Effects 0.000 description 1
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 description 1
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- -1 Fluorescein isocyanate Chemical class 0.000 description 1
- 230000035519 G0 Phase Effects 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- BAQCROVBDNBEEB-UBYUBLNFSA-N Metrizamide Chemical compound CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C(=O)N[C@@H]2[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)OC2O)O)=C1I BAQCROVBDNBEEB-UBYUBLNFSA-N 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010089814 Plant Lectins Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 1
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-O acridine;hydron Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3[NH+]=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000000544 articulatio talocruralis Anatomy 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000025084 cell cycle arrest Effects 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010428 chromatin condensation Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000000459 effect on growth Effects 0.000 description 1
- 230000000212 effect on lymphocytes Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101150021159 etxB gene Proteins 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- QPJBWNIQKHGLAU-IQZHVAEDSA-N ganglioside GM1 Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC[C@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)[C@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](CO)O1 QPJBWNIQKHGLAU-IQZHVAEDSA-N 0.000 description 1
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000004073 interleukin-2 production Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000005024 intraepithelial lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000000207 lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229960000554 metrizamide Drugs 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000016379 mucosal immune response Effects 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 1
- 229940097496 nasal spray Drugs 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000003726 plant lectin Substances 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 230000007727 signaling mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000020192 tolerance induction in gut-associated lymphoid tissue Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/868—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving autoimmunity, allergy, immediate hypersensitivity, delayed hypersensitivity, immunosuppression, or immunotolerance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
1 . Zastosowanie czynnika do produkcji leku do wywolywania zróznicowanego wplywu na populacje limfocy- tów, bedacego dzialajacym in vivo immunomodulatorem, posiadajacym wlasciwosci immunogenne wywierajace wplyw na wydarzenia sygnalizacji wewnatrzkomórkowej, w których posredniczy GM-1, wybranego z grupy obejmujacej Etx, Ctx, podjednostke B Etx, podjednostke B Ctx, przeciwciala i ich pochodne, przy czym, gdy lek zawiera równiez, i/lub jest podawany lacznie z determinanta antygenowa czynnik i determinanta antygenowa stanowia oddzielne czynniki aktywne. 7. Kompozycja farmaceutyczna do wywolywania zróznicowanego wplywu na populacje limfocytów, zwlasz cza do leczenia lub zapobiegania chorobie lub chorobom takim jak choroba autoimmunologiczna, bialaczka typu T-komórkowego, odrzut przeszczepu, reakcja przeszczepu przeciw gospodarzowi (G V H D ) lub szczepienia ssaka, za wierajaca substancje aktywna i farmaceutycznie dopuszczalny nosnik lub rozcienczalnik, znamienna tym, ze jako sub stancje aktywna zawiera czynnik bedacy dzialajacym in vivo immunomodulatorem, posiadajacym wlasciwosci immu nogenne wywierajace wplyw na wydarzenia sygnalizacji wewnatrzkomórkowej, w których posredniczy GM-1, wybrany z grupy obejmujacej Etx, Ctx, podjednostke B Etx, podjednostke B Ctx, przeciwciala i ich pochodne, przy czym, gdy kompozycja zawiera równiez, i/lub jest podawana lacznie z determinanta antygenowa czynnik i determinanta antyge nowa stanowia oddzielne czynniki aktywne. 12. Zestaw zawierajacy co najmniej dwie oddzielne kompozycje farmaceutyczne, znamienny tym, ze zawiera co najmniej jedna kompozycje farmaceutyczna do wywolywania zróznicowanego wplywu na populacje limfocytów, zwlaszcza do leczenia lub zapobiegania chorobie lub chorobom takim jak choroba autoimmunologiczna, bialaczka typu T-komórkowego, odrzut przeszczepu, reakcja przeszczepu przeciw gospodarzowi (G V H D ) lub szczepienia ssaka, za wierajaca substancje aktywna i farmaceutycznie dopuszczalny nosnik lub rozcienczalnik, i jako substancje aktywna zawierajaca czynnik bedacy dzialajacym in vivo immunomodulatorem, posiadajacym wlasciwosci immunogenne wy wierajace wplyw na wydarzenia sygnalizacji wewnatrzkomórkowej, w których posredniczy GM-1, wybrany z grupy obejmujacej Etx, Ctx, podjednostke B Etx, podjednostke B Ctx, przeciwciala i ich pochodne, przy czym, gdy kompozy cja zawiera równiez, i/lub jest podawana lacznie z determinanta antygenowa czynnik i determinanta antygenowa sta nowia oddzielne czynniki aktywne, oraz co najmniej jedna kompozycje zawierajaca wlasna lub reagujaca krzyzowo determinante antygenowa. PL PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie czynnika do produkcji leku do wywoływania zróżnicowanego wpływu na populacje limfocytów, zastosowanie czynnika Etx, Ctx, podjednostki B Etx lub podjednostki B Ctx do produkcji leku do modulowania odpowiedzi immunologicznej oraz kompozycja farmaceutyczna do wywoływania zróżnicowanego wpływu na populacje limfocytów i zestaw zawierający co najmniej dwie oddzielne kompozycje farmaceutyczne, użyteczne w leczeniu chorób autoimmunologicznych u ssaków, zwłaszcza ludzi, ludzkich białaczek typu T-komórkowego, jako tak zwane „nośniki szczepionki” i do stosowania w zapobieganiu odrzutom przeszczepów po zabiegach transplantacji u ludzi oraz w zapobieganiu chorobie reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi (GVHD).
Charles O. Elson i wsp. w artykule: „Morphologic and Functional Alterations of Mucosal T Cells by Cholera Toxin and its B Subunit” (Zmiany morfologiczne i funkcjonalne komórek T w błonie śluzowej spowodowane toksyną cholery i jej podjednostką B) opublikowanym w czasopiśmie The Journal of Immunology (154, 1032-1040, 1995) ujawnili, że toksyna przecinkowca cholery (Ctx) i podjednostką CtxB hamują komórki CD 8+ i CD4+ T.
B. Yankelevich i wsp. w pracy: „Prevention of Acute Graft-Versus-Host Disease by Treatment with a Novel Immunosuppressant” (Zapobieganie ostrej fazie choroby reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi przez leczenie nowym środkiem immunosupresyjnym) opublikowanej w czasopiśmie The Journal of Immunology (154, 3611-3617, 1995) określił CtxB jako czynnik przydatny do użycia w transplantacji szpiku kostnego w celu zapobiegania ostrej reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi (GVHD).
W publikacji międzynarodowego zgłoszenia patentowego WO 95/10301 ujawniono środek indukujący tolerancję immunologiczną, zawierający cząsteczkę wiążącą się z błoną śluzową przyłączoną do swoistego tolerogenu.
Stosowany w niniejszym opisie termin „Ctx” oznacza toksynę przecinkowca cholery a „CtxB” oznacza podjednostkę B tej toksyny. W innych publikacjach, cząsteczki te mogą być czasami oznaczane odpowiednio symbolami „CT” albo „Ct” i „CTB” lub „CtB”. Termin „Etx” oznacza w niniejszym opisie ciepłochwiejną enterotoksynę E. coli a „EtxB” oznacza podjednostkę B tej enterotoksyny. W innych publikacjach, mogą one być czasami oznaczane odpowiednio symbolami „lT” albo „Lt” i „LTB” lub „LtB”.
187 266
Podstawą wszystkich aspektów niniejszego wynalazku jest odkrycie, że EtxB (czysta podjednostką B ciepłochwiejnej enterotoksyny E. coli) wiąże się z receptorami gangliozydowymi GM1, znajdującymi się na powierzchni komórek ssaków i że to wiązanie indukuje zróżnicowane wpływy na populacje limfocytów, włącznie ze swoistym tłumieniem komórek CD8 T i z towarzyszącą aktywacją komórek B. Działania te nie występują jeśli zastosuje się zmutowane białko EtxB, pozbawione właściwości wiązania GM1.
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie czynnika do produkcji leku do wywoływania zróżnicowanego wpływu na populacje limfocytów, będącego działającym in vivo immunomodulatorem, posiadającym właściwości immunogenne wywierające wpływ na wydarzenia sygnalizacji wewnątrzkomórkowej, w których pośredniczy GM-1, wybranego z grupy obejmującej Etx, Ctx, podjednostkę B Etx, podjednostkę B Ctx, przeciwciała i ich pochodne, przy czym, gdy lek zawiera również, i/lub jest podawany łącznie z determinantą antygenową, czynnik i determinanta antygenowa stanowią oddzielne czynniki aktywne.
Korzystnie wpływ wywierany na wydarzenia sygnalizacji wewnątrzkomórkowej, w których pośredniczy GM-1 wywołany jest czynnikiem mającym aktywność wiązania GM-1.
Korzystnym jest zastosowanie do produkcji leku do leczenia lub zapobiegania chorobie lub chorobom takim jak choroba autoimmunologiczna, białaczka typu T-komórkowego, odrzut przeszczepu, reakcja przeszczepu przeciw gospodarzowi (GVHD), zwłaszcza do szczepienia ssaka, a w szczególności do podawania efektywnej ilości czynnika łącznie z efektywną ilością obcej, niespokrewnionej determinanty antygenowej.
Korzystnie determinantę antygenową stanowi antygen własny lub reagujący krzyżowo, alloantygen lub ksenoantygen.
Przedmiot wynalazku stanowi także kompozycja farmaceutyczna do wywoływania zróżnicowanego wpływu na populacje limfocytów, zwłaszcza do leczenia lub zapobiegania chorobie lub chorobom takim jak choroba autoimmunologiczna, białaczka typu T-komórkowego, odrzut przeszczepu, reakcja przeszczepu przeciw gospodarzowi (GVHD) lub szczepienia ssaka, zawierająca substancję aktywną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik, charakteryzująca się tym, że jako substancję aktywną zawiera czynnik będący działającym in vivo immunomodulatorem, posiadającym właściwości immunogenne wywierające wpływ na wydarzenia sygnalizacji wewnątrzkomórkowej, w których pośredniczy GM-1, wybrany z grupy obejmującej Etx, Ctx, podjednostkę B Etx, podjednostkę B Ctx, przeciwciała i ich pochodne, przy czym, gdy kompozycja zawiera również, i/lub jest podawana łącznie z determinantą antygenową, czynnik i determinanta antygenowa stanowią oddzielne czynniki aktywne.
Korzystnie wpływ wywierany na wydarzenia sygnalizacji wewnątrzkomórkowej, w których pośredniczy GM-1, wywołany jest czynnikiem mającym aktywność wiązania GM-1.
Korzystnie determinantę antygenową stanowi antygen własny lub reagujący krzyżowo, alloantygen lub ksenoantygen.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie czynnika wybranego z grupy obejmującej Etx, Ctx, podjednostkę B Etx lub podjednostkę B Ctx do produkcji leku do modulowania odpowiedzi immunologicznej, charakteryzujące się tym, że gdy lek zawiera również, i/lub jest podawany łącznie z determinantą antygenową, czynnik i determinanta antygenowa stanowią oddzielne czynniki aktywne.
Wynalazek dotyczy także zastosowania czynnika wybranego z grupy obejmującej Etx, Ctx, podjednostkę B Etx, podjednostkę B Ctx, przeciwciała i ich pochodne, do produkcji leku do modulowania odpowiedzi immunologicznej, charakteryzującego się tym, że czynnik posiada aktywność wiązania GM-1, przy czym, gdy lek zawiera również, i/lub jest podawany łącznie z determinantą antygenową, czynnik i determinanta antygenowa stanowią oddzielne czynniki aktywne.
Przedmiotem wynalazku jest również zestaw zawierający co najmniej dwie oddzielne kompozycje farmaceutyczne, charakteryzujący się tym, że zawiera co najmniej jedną kompozycję farmaceutyczną do wywoływania zróżnicowanego wpływu na populacje limfocytów, zwłaszcza do leczenia lub zapobiegania chorobie lub chorobom takim jak choroba autoimmunologiczna, białaczka typu T-komórkowego, odrzut przeszczepu, reakcja przeszczepu przeciw
187 266 gospodarzowi (GVHD) lub szczepienia ssaka, zawierającą substancję aktywną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik, i jako substancję aktywną zawierającą czynnik będący działającym in vivo immunomodulatorem, posiadającym właściwości immunogenne wywierające wpływ na wydarzenia sygnalizacji wewnątrzkomórkowej, w których pośredniczy GM-1, wybrany z grupy obejmującej Etx, Ctx, podjednostkę B Etx, podjednostkę B Ctx, przeciwciała i ich pochodne, przy czym, gdy kompozycja zawiera również, i/lub jest podawana łącznie z determinantą antygenową, czynnik i determinanta antygenowa stanowią oddzielne czynniki aktywne, oraz co najmniej jedną kompozycję zawierającą własną lub reagującą krzyżowo determinantę antygenową.
Korzystnie wpływ wywierany na wydarzenia sygnalizacji wewnątrzkomórkowej, w których pośredniczy GM-1, wywołany jest czynnikiem mającym aktywność wiązania GM-1.
Korzystnie determinantę antygenową stanowi antygen własny lub reagujący krzyżowo, ailoantygen lub ksenoantygen.
Autoimmunizacja jest określeniem stosowanym do opisu mechanizmu, według którego organizm generuje odpowiedź immunologiczną na własne antygeny.
Okazało się, że czynniki zastosowane według wynalazku modulują populacje limfocytów, prowadząc do indukowania apoptozy w komórkach CD 8+ T, zwiększonej aktywacji komórek CD4+ i poliklonalnej aktywacji komórek B. Wydarzenia te przesuwają prawdopodobnie odpowiedź immunologiczną w kierunku indukowania cytokin związanych z pomocniczymi komórkami Th2. Przyjmuje się, że takie odpowiedzi na antygeny własne lub reagujące krzyżowo uczestniczą w ochronie przed niektórymi chorobami autoimmunologicznymi.
Czynniki te zastosowane według wynalazku w sposobie leczenia rozwijającej się w organizmie choroby autoimmunologicznej podaje się pacjentowi razem z antygenem własnym lub reagującym krzyżowo bądź bez takiego antygenu. Podanie tego czynnika zgodnie z tym rozwiązaniem pierwszego aspektu wynalazku moduluje charakter odpowiedzi immunologicznej w ten sposób, że odciąga antygen własny od aktywacji wywołującego chorobę stanu zapalnego, chroniąc przed chorobą autoimmunologiczną.
W przypadku zastosowania do „szczepienia” ssaka przeciw chorobie autoimmunologicznej czynniki te podaje się pacjentowi razem z własną lub reagującą krzyżowo determinantą antygenową (lub z kombinacją różnych własnych lub reagujących krzyżowo determinant antygenowych) związanych z tą chorobą. W ten sposób odciąga się odpowiedź immunologiczną osobnika na antygen własny albo na antygen reagujący krzyżowo od aktywacji procesu patogenezy, chroniąc przed przyszłą odpowiedzią autoimmunologiczną na własny antygen.
Czynnik terapeutyczny i własną lub reagującą krzyżowo determinantę antygenową można podawać osobnikowi łącznie. Rozumie się przez to, że miejsce i czas podania każdego ze składników: czynnika terapeutycznego i determinanty antygenowej tak się dobiera, aby osiągnąć potrzebne modulowanie układu odpornościowego. Tak więc, jakkolwiek można podać czynnik terapeutyczny i determinantę antygenową w tym samym momencie i w tym samym miejscu, to może być korzystne podanie czynnika terapeutycznego w innym czasie i w innym miejscu niż determinanty antygenowej.
Chociaż mogą być wystarczające pojedyncze dawki czynnika terapeutycznego i determinanty antygenowej to zakresem ujawnienia objęte są również dawki wielokrotne.
Czynnik terapeutyczny i determinantę antygenową można przykładowo związać kowalencyjnie, wytwarzając pojedynczy czynnik aktywny, jednak podanie oddzielne, w którym czynnik terapeutyczny i determinanta antygenowa nie są w ten sposób związane jest korzystne, gdyż umożliwia oddzielne podanie różnych części składowych.
Do specyficznych chorób autoimmunologicznych, które można leczyć zgodnie z wynalazkiem należą choroby autoimmunologiczne, których patologia wiąże się z odpornością typu komórkowego, takie jak reumatoidalne zapalenie stawów, stwardnienie rozsiane i cukrzyca.
Możliwe jest zastosowanie wszystkich czynników wykazujących aktywność wiązania GM-1 do leczenia chorób autoimmunologicznych, białaczek ludzkich typu T-komórkowego, zapobiegania i leczenia odrzutów przeszczepów bądź reakcji przeciw gospodarzowi jak również jako immunomodulatorów, oraz tych czynników, które wywierają wpływ na wydarzenia
187 266 sygnalizacji wewnątrzkomórkowej, w których pośredniczy GM-1, naśladujących przez to czynniki wiążące GM-1.
Jednakże zastosowanie białka EtxB (będącego pentamerem złożonym z pięciu identycznych podjednostek) do tego typu leczenia stanowi korzystne rozwiązanie według wynalazku. Poza EtxB typu dzikiego, ten korzystny aspekt wynalazku rozciąga się ponadto na mutanty EtxB wykazujące aktywność wiązania GM-1 oraz na inne równoważne białka, takie jak podjednostka B toksyny przecinkowca cholery (CtxB) i jej mutanty zachowujące aktywność wiązania GM-1.
Do innych czynników terapeutycznych stosowanych do leczenia chorób autoimmunologicznych, białaczek ludzkich typu T-komórkowego, zapobiegania i leczenia odrzutów przeszczepów bądź reakcji przeciw gospodarzowi jak również jako immunomodulatorów, zgodnie z wynalazkiem należą humanizowane przeciwciała monoklonalne wiążące GM-1. Sposoby identyfikacji i otrzymywania takich czynników są znane.
W zastosowaniu według wynalazku do wytwarzania leku do zapobiegania odrzutom przeszczepów lub reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi opisane czynniki terapeutyczne można stosować do zapobiegania odrzutom przeszczepów narządów miąższowych, allogenicznych bądź ksenogenicznych. Można je również stosować do zapobiegania ostrym reakcjom przeszczepu przeciw gospodarzowi (GVHD), przykładowo, podczas zabiegów przeszczepiania szpiku kostnego.
W tych przypadkach, gdy pacjent jest leczony przed transplantacją, czynnik terapeutyczny może być podany łącznie z alloantygenem lub ksenoantygenem. W rozwiązaniach, w których pacjent jest leczony po transplantacji, czynnik terapeutyczny podaje się bez antygenu.
W takim rozwiązaniu, w którym pacjentowi podaje się czynnik terapeutyczny łącznie z determinantą allo- albo kseno-antygenową, miejsce i czas podania każdego ze składników: czynnika terapeutycznego i determinanty antygenowej tak się dobiera aby osiągnąć potrzebne modulowanie układu odpornościowego. Tak więc, jakkolwiek można podać czynnik terapeutyczny i determinantę antygenową w tym samym momencie i w tym samym miejscu, to może być korzystne podanie czynnika terapeutycznego w innym czasie i w innym miejscu niż determinanty antygenowej. Ponadto, czynnik terapeutyczny i determinantę antygenową można związać kowalencyjnie, wytwarzając pojedynczy czynnik aktywny, jednak podanie oddzielne, w którym czynnik terapeutyczny i determinanta antygenowa nie są w ten sposób związane jest korzystne, gdyż umożliwia oddzielne podanie różnych części składowych.
Chociaż mogą być wystarczające pojedyncze dawki czynnika terapeutycznego i determinanty antygenowej, to zakresem ujawnienia objęte są również dawki wielokrotne.
Gdy czynnik terapeutyczny stosuje się do zapobiegania reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi, czynnik ten można normalnie podać bezpośrednio do komórek, przykładowo do komórek szpiku kostnego, które mają być przeszczepiane. Czynnik ten powinien być zasadniczo nietoksyczny, jakkolwiek w ciężkiej terapii tego typu można dopuścić pewien stopień toksyczności.
CtxB i EtxB proponowano uprzednio jako tak zwane „nośniki szczepionek”. Obecnie odkryto, że przyczyną takiego działania jest po części zdolność EtxB do modulowania populacji limfocytów (opisana powyżej) na drodze wiązania receptora GM-1.
Czynnik przeznaczony do użycia w szczepieniu ssaków ma zdolność modulowania odpowiedzi immunologicznej jeśli jest podany łącznie z niespokrewnioną, obcą determinantą antygenową. Jeśli czynnik został dostarczony pozajelitowo, wówczas takie immunomodulowanie jest w terminologii odpowiedzi immunologicznej określane jako „skierowane” w określonym, pożądanym kierunku. Jeśli czynnik ten został podany przez śluzówkę z niespokrewnionym antygenem jako tak zwany „adiuwant śluzówkowy”, ma on zdolność ułatwiania śluzówkowej odpowiedzi immunologicznej na ten niespokrewniony antygen. Antygen i czynnik terapeutyczny można dostarczać do organizmu razem jako oddzielne składowe albo można je łączyć, przykładowo, wiązaniami kowalencyjnymi.
Czynnik ten jest korzystnie nietoksyczny. Poza tym, jeśli ma on być dostarczony śluzówkowo, przez śluzówkę układu trawiennego, powinien wykazywać trwałość podczas prze187 266 chodzenia przez przewód pokarmowy. Przykładowo, powinien on być odporny na degradację proteolityczną, powinien być trwały w kwaśnym pH i odporny na detergentowe działanie żółci.
Jeśli czynnik terapeutyczny zastosowany według wynalazku jest białkiem, takim jak podjednostka EtxB albo podjednostka CtxB, można go wytworzyć, do stosowania we wszystkich aspektach niniejszego wynalazku, sposobem polegającym na tym, że konstruuje się gen bądź geny kodujące określony łańcuch polipeptydowy (albo łańcuchy polipeptydowe), z których złożone jest to białko, dokonuje się insercji tego genu (genów) do odpowiedniego wektora i przygotowany wektor stosuje się do transfekcji odpowiedniego gospodarza. Przykładowo, gen kodujący łańcuch polipeptydowy, z którego zbudowany jest EtxB można wbudować do plazmidu pMMB 68 i ten plazmid użyć następnie do transfekcji komórek gospodarza, takich jak komórki Vibrio sp.60. Białko oczyszcza się i izoluje w znany sposób. Geny zmutowane, dające ekspresję aktywnego zmutowanego białka EtxB można konstruować znanymi technikami z genów typu dzikiego.
Jak podano powyżej, czynniki wykazujące aktywność wiązania GM-1, takie jak specyficznie zaprojektowane, humanizowane przeciwciała monoklonalne, można konstruować i wytwarzać jak opisano powyżej, wykorzystując znane techniki.
We wszystkich aspektach wynalazku, czynnik wykazujący aktywność wiązania GM-1 może również posiadać zdolność sieciowania receptorów GM1. Jednym z takich środków jest EtxB. Ma on zdolność sieciowania receptorów GM1 dzięki swej budowie pentamerycznej.
Kompozycję farmaceutyczną według wynalazku można sporządzać tak, aby mogła być dostarczana drogą poprzez śluzówkę, przykładowo w formie spreju donosowego albo pozajelitową i wówczas kompozycję tę przygotowuje się w formie iniekcyjnej dostosowanej do podawania dożylnego, domięśniowego lub podskórnego.
Czynniki przeznaczone do zastosowania w kompozycji według wynalazku, korzystnie powinny być zasadniczo nietoksyczne, jakkolwiek w ciężkiej terapii tego typu można dopuścić pewien stopień toksyczności.
Wynalazek jest poniżej zilustrowany na załączonych rysunkach i w przykładach.
Krótki opis rysunków
Figura 1 przedstawia wyniki analizy własności fizykochemicznych EtxB i zmutowanej formy EtxB, czyli EtxB(G33D)).
Figura 2 pokazuje, że wiązanie receptora przez EtxB ma podstawowe znaczenie dla jego silnej immunogenności in vivo.
Figura 3 ilustruje kinetykę proliferacji limfocytów po iniekcyjnym podaniu myszom
EtxB.
Na fig. 4 wykazano, że EtxB powoduje zwiększoną aktywację komórek B.
Na fig. 5 wykazano, że EtxB powoduje zwiększoną aktywację komórek CD4+ T i tłumienie komórek CD 8+ T.
Figura 6 przedstawia selektywne tłumienie przez EtxB komórek CD 8+ T reagujących na albuminę jaja (OVA).
Figura 7 pokazuje, że wiązanie receptora przez EtxB indukuje zmiany w morfologii jąder limfocytów charakterystyczne dla komórek ulegających apoptozie.
Figura 8 przedstawia oznaczoną przez analizę cyklu komórkowego, apoptozę komórek CD 8 T w wyniku wiązania EtxB z receptorem.
Figura 9a i fig. 9b przedstawiają wyniki doświadczeń przeprowadzonych w celu wykazania, że wiązanie receptora GM-1 przez EtxB hamuje rozwój indukowanego kolagenem zapalenia stawów na modelu zwierzęcym.
Figura 10 przedstawia wyniki doświadczenia przeprowadzonego w celu udowodnienia, że EtxB ale nie EtxB(G33D) indukuje apoptozę w populacji normalnych ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej.
Figura 11 przedstawia wyniki doświadczenia, ilustrującego fakt, że sieciowanie GM-1 prowadzi do apoptozy w części mysich komórek CTLL.
Szczegółowy opis rysunków
Figura 1 przedstawia analizę własności fizyko-chemicznych EtxB i EtxB(G33D).
187 266 (A) Analiza SDS-PAGE EtxB i EtxB(G33D)): 5 pg każdego białka analizowano w warunkach redukujących w obecności β-merkaptoetanolu, z uprzednim ogrzewaniem lub bez ogrzewania. Pasmo 1 przedstawia nieogrzewany EtxB typu dzikiego. Pasmo 2 przedstawia nieogrzewany EtxB(G33D)). Pasmo 3 jest ogrzanym do temperatury 95°C EtxB typu dzikiego. Pasmo 4 reprezentuje ogrzany do temperatury 95°C EtxB(G33D)). Standardy mas cząsteczkowych (BioRad) są podane po lewej stronie panelu.
(B) Oznaczenie pozornej masy cząsteczkowej EtxB i EtxB(G33D)) metodą chromatografii z filtracją żelową: krzywą standardową (oznaczoną kółkami) wykreślono stosując od góry do dołu: albuminę surowicy bydlęcej (66 kDa), albuminę jaja kurzego (45 kDa), bydlęcą anhydrazę węglanową erytrocytów (29 kDa) i cytochrom C z serca końskiego (12,4 kDa). EtxB i EtxB(G33D)) eluowano przy pozornych masach cząsteczkowych odpowiednio 36 kDa i 38 kDa. Ve oznacza objętość eluatu białka a Vo oznacza objętość międzyziarnową kolumny do filtracji żelowej.
(C) Próba ELISA do porównawczego oznaczenia wiązania EtxB i EtxB(G33D)) z receptorem gangliozydowym GM-1: płytki pokrywano GM1, blokowano i inkubowano z ilością 1 pg/ml albo EtxB albo EtxB(G33D)), rozcieńczonych seryjnie (3 krotnie) od stężenia 1 pg/ml.
Figura 2 wykazuje, że wiązanie-receptora przez EtxB ma podstawowe znaczenie dla jego silnej immunogenności in vivo.
Myszom BALB/c (po 4 w każdej grupie) wstrzykiwano podskórnie EtxB albo EtxB(G33D) w PBS albo białka te podawano doustnie w buforze dwuwęglanowym. Surowice analizowano po 10 dniach od dwu podskórnych iniekcji (A) albo po tygodniu od podania 3 dawek doustnych (B). Wydzieliny jelitowe analizowano po tygodniu od podania 3 dawek doustnych (C). W próbkach pochodzących od myszy kontrolnych nie wykryto żadnej reakcji (nie jest to przedstawione). Wyniki są wyrażone jako średnie miano przeciwciała IgG w surowicy. W wydzielinie jelitowej wyniki przedstawiono w postaci „swoistej aktywności” IgA, co jest opisane poniżej.
Figura 3 przedstawia kinetykę proliferacji limfocytów. Myszom dootrzewnowo wstrzyknięto 30 pg EtxB(G33D)) w kompletnym adiuwancie Freunda. Po 10 dniach izolowano krezkowe węzły chłonne (MLN) i komórki inkubowano bez antygenu (białe kwadraty) albo w obecności 80 pg/ml EtxB (czarne trójkąty), EtxB(G33D) (białe trójkąty) albo w obecności rozszczepionych monomerycznych form EtxB (czarne kółka) i EtxB(G33D)) (białe kółka), uzyskanych przez ogrzewanie w temperaturze 95°C. Przez ostatnie 6 godzin każdego dnia próby, komórki poddawano działaniu promieniowania 1 pCi z (;’H)-tymidyny. Dane przedstawiają średnią ilość impulsów/minutę (cpm) i średnią SEM z trzech równoległych oznaczeń.
Na fig. 4 wykazano, że EtxB powoduje zwiększoną aktywację komórek B.
Myszy immunizowano za pomocą EtxB(G33D) w kompletnym adiuwancie Freunda (CFA). Po 10 dniach, z krezkowych węzłów chłonnych (MLN) izolowano komórki i inkubowano je w obecności 80 pg/ml albo EtxB albo EtxB(G33D) bądź w obecności mieszaniny po 40 pg/ml każdego białka. Komórki znakowano biotynylowanym anty-CD25 (7D4) i znakowanym fikoerytryną (PE) przeciwciałem anty-B220 (Ra3-6D2). Jako drugi koniugat przeciwciała użyto streptawidynę znakowaną izocyjanianem fluoresceiny (FITC). Wykonano również próbki kontrolne dla przeciwciał (nie pokazane). Podwójną analizę cytometryczną przeprowadzono na 4 dzień proliferacji.
Figura 5 wykazuje, że EtxB powoduje zwiększoną aktywację komórek CD4+ T i tłumienie komórek CD 8+ T.
Procedurę immunizacji, izolacji komórek i napiętnowania in vitro opisano w opisie do fig. 4. Do wykrywania CD25 użyto biotynylowane przeciwciało anty-CD25 (7D4) i streptawidynę-FITC. Do detekcji CD4 i CD 8 użyto znakowane FITC przeciwciało anty-CD4 (RNRM4-5) i znakowane FITC przeciwciało anty-CD 8 a (53-6.7). Wykonano również próby kontrolne dla przeciwciał (nie pokazane).
Figura 6 przedstawia selektywne tłumienie przez EtxB komórek CD 8 + T reagujących na albuminę jaja (OVA).
Hodowle komórek z krezkowych węzłów chłonnych, pobrane od napiętnowanych przez OVA myszy ustalano przez 5 dni w obecności antygenu albo w obecności OVA + EtxB,
187 266
OVA + EtxB(G33D) albo samej OVA, stosując 100 pg OVA i po 40 pg/ml EtxB albo EtxB(G33D) lub 100 pg samej OVA. Komórki znakowano następującymi przeciwciałami szczurzymi: FITC-anty CD4 albo FITC-anty-CD 8α i podwójnie: za pomocą biotyno-anty-CD25 (IL-2Ra) i następnie streptawidyno-fikoerytryny. Jako kontrole użyto komórki niebarwione albo komórki barwione samym drugim przeciwciałem. Komórki analizowano w automatycznym fluorescencyjnym sorterze komórek (FACS; Becton Dickinson). Wyższy wzrost udziału komórek CD25-dodatnich w całkowitej ilości komórek w hodowlach zawierających EtxB w porównaniu z innymi traktowaniami wynika z obecności wyższej proporcji komórek B, w których zachodzi ekspresja tego markera (nie jest to przedstawione). Intensywność fluorescencji podano w skali logarytmicznej.
Figura 7 ilustruje, że wiązanie receptora przez EtxB indukuje zmiany w morfologii jąder limfocytów charakterystyczne dla komórek ulegających apoptozie.
Komórki krezkowych węzłów chłonnych zawierające >90% komórek CD3+ i pozbawione makrofagów inkubowano przez 18 godzin z EtxB (80 pg/ml) albo z EtxB(G33D) (80 pg/mi) i barwiono oranżem akrydynowym. Komórki badano pod normalnym mikroskopem lub pod fluorescencyjnym mikroskopem współogniskowym (Leica TCS 4D). Figura przedstawia reprezentatywne pole mikroskopowe (powiększenie 540 razy) dla każdego traktowania. Panel po lewej stronie przedstawia działanie EtxB a panel po prawej stronie - działanie EtxB(G33D). Doświadczenia z komórkami, które inkubowano bez antygenu dały podobne wyniki do tych, jakie otrzymano dla komórek traktowanych EtxB(G33D) (nie są one przedstawione).
Figura 8 przedstawia oznaczoną przez analizę cyklu komórkowego apoptozę komórek CD 8+ T w wyniku wiązania EtxB z receptorem.
Udział populacji komórek CD4+ i CD 8+ T śledziony (SPLTC) w fazie sub-Gę/G1 cyklu rozwojowego komórki oznaczono przez analizę zawartości DNA metodą cytometrii przepływowej po barwieniu jodkiem propidium. Komórki SPLTC izolowano ze śledziony przez selekcję negatywną w sposób opisany powyżej. Na komórki działano w czasie 18 godzin: (a) brakiem antygenu, (b) EtxB(G33D) w stężeniu 80 pg/ml albo (c) EtxB w stężeniu 80 pg/ml, po czym barwiono je przeciwciałami szczurzymi, FITC-anty CD4 albo FITC-anty-CD8α. Następnie komórki barwiono jodkiem propidium. Udział (proporcję) komórek podwójnie barwionych jodkiem propidium oznaczano przez bramkowanie komórek zabarwionych albo przeciwciałami anty-CD4 albo anty-CD 8. Ten eksperyment przeprowadzono na komórkach. Jego wyniki są również podane na fig. 7 i w tabeli 3.
Przykłady
Przykład I. W niniejszym przykładzie wykazano, że do indukowania różnicujących działań na populacje limfocytów potrzebne jest związanie receptora GM-1.
Materiały i metody
Generowanie wiążącego receptor mutantu EtxB
W miejscu wiązania receptora w ludzkim EtxB wprowadzono wymianę Gly-33 na Asp stosując plazmid pTRH29, pochodną wektora fagmidowego pBluescript IIKS+, który to plazmid zawiera geny dla podjednostek A i B Etx (Yu J., Webb H. i Hirst T. R., Molec. Microbiol., 6, 1949-1958, 1992). Mutagenezę przeprowadzono w zestawie do sterowanej oligonukleotydem mutagenezy in vitro (Amersham International) stosując jednoniciowy pTRH29 jako matrycę i syntetyczny oligonukleotyd (5'-TCTCTTTTATCTGCCATCG-3') pochodzący z Microanalytical Facility, IAPGR, Cambridge Research Station (W. Brytania) jako primer mutagenezy. Prawidłowe podstawienie Asp w miejsce Gly potwierdzono metodą didezoksysekwencjonowania z użyciem enzymu Sequenase II (United States Biochemical Corp.). Otrzymany plazmid oznaczono symbolem pTRH56. Zmutowany gen etxB wycięto z pTRH56 enzymami restrykcyjnymi EcoRI i SpeI i wbudowano go do plazmidu pMMB 68 (Sandkvist M., Hirst T.R. i Bagdasarian M., J. Bacteriol., 169, 4570-4576, 1987) otrzymując wektor ekspresyjny dla szerokiego zakresu gospodarzy, pTRH64, dający ekspresję białka EtxB(G33D).
Antygeny
EtxB typu dzikiego i EtxB(G33D) oczyszczano z supernatantów hodowli, odpowiednio Vibrio sp. 60 (pMMB 68) i Vibrio sp. 60 (pTRH64), korzystając z modyfikacji metody opisanej przez Amin'a i Hirst'a (Amin T. i Hirst T.R., Prot. Express, and Purif., 5, 198-204, 1994).
187 266
Pokrótce, białka oczyszczano przez diafiltrację i chromatografię interakcji hydrofobowej i zatężano metodą chromatografii aniono-wymiennej. Roztwory białka odsalano na kolumnie PD 10 (Pharmacia, W. Brytania) zrównoważonej buforowanym fosforanem roztworem soli fizjologicznej (PBS) o składzie: 10 mM fosforan sodu, 150 mM NaCl (pH=7,4) i przechowywano w temperaturze -30°C.
Czystość EtxB i EtxB(G33D) potwierdzono metodą elektroforezy w żelu SDS-poliakryloamidowym. Masą cząsteczkową poszczególnych monomerów potwierdzono metodą laserowej, desorpcyjnej spektrometrii masowej (Protein Science Facility, University of Kent).
Pozorne masy cząsteczkowe EtxB i EtxB(G33D) oznaczano metodą chromatografii z filtracją żelową w układzie SMART (Pharmacia). Białka eluowano z kolumny PC 3.2/30 wypełnionej żywicą Superdex 75 w PBS (pH=7,5).
Nieodwracalną denaturację pentamerów podjednostki B do użycia w próbach na proliferację limfocytów (poniżej) uzyskano przez utrzymywanie tych białek w temperaturze 95°C w czasie 5 minut.
Zwierzęta, zbieranie próbek i protokoły immunizacji.
Myszy BALB/c (H-2d, silnie odpowiadające na EtxB) w wieku 7-12 tygodni otrzymano z Charles River Laboratories i utrzymywano w zwierzętami University of Kent. Odpowiedzi przeciwciał na EtxB względnie na EtxB(G33D) oznaczano po podskórnym wstrzyknięciu myszom 30 pg białka w PBS ) po podaniu dawki przypominającej po 10 dniach. Innej grupie myszy podano tę samą dawkę białka doustnie w dwuwęglanie sodu (50 pg/ml) trzykrotnie, w odstępach co tydzień. Myszom kontrolnym podawano PBS. Po upływie 10 dni od ostatniego podskórnego wstrzyknięcia albo po tygodniu od ostatniego podania doustnego pobrano krew. Wydzieliny jelitowe od myszy żyjących izolowano w roztworze inhibitora proteazy, jak opisano poprzednio (Elson C.O., Ealding W. i Lefkowitz J., J. Immunol. Meth. ,67, 101-108, 1984) po upływie tygodnia od ostatniego podania doustnego. Próbki poddano działaniu ultradźwięków i klarowano przez wirowanie w czasie 10 minut z szybkością 13,226 x g w temperaturze 4°C.
W próbach na proliferację, myszom wstrzykiwano dootrzewnowe 30 pg EtxB względnie EtxB(G33D) w kompletnym adiuwancie Freunda (CFA) i po upływie 10 dni izolowano krezkowe węzły chłonne. Włączono również kontrolne myszy nie immunizowane. Ich węzły chłonne izolowano w podobny sposób. Enzymatyczna próba na immunosorbencie (ELISA).
Wiązanie EtxB lub EtxB(G33D) z Gm1 oznaczano techniką GM1-ELISA (Amin T. i Hirst T.R., Prot. Express, and Purif., 5, 198-204, 1994).
Surowice i wydzieliny jelitowe badano na obecność przeciwciał IgG i IgA przeciw podjednostce B techniką ELISA. W tej próbie, próbki nanoszono na płytki do mikromianowania (Immulon I, Dynateck, USA) uprzednio powleczone stężeniem 5 pg/ml EtxB albo EtxB(G33D) w PBS. Miana przeciwciał IgA przeciw podjednostce B w supematantach wydzieliny jelitowej ekstrapolowano z krzywej standardowej otrzymanej w próbie, w której powleczono dwa rzędy wgłębień w każdej płytce ilością 1 pg/ml króliczej IgA anty-mysiej (swoistej dla łańcucha α, Zymed Lab., USA) w PBS i następnie dodano 1 pg/ml IgA szpiczaka mysiego (MOPC 315, Sigma, USA). W celu pomiaru całkowitej IgA, wgłębienia powleczono króliczą IgA antymysią i następnie dodano supernatanty z wydzieliny jelitowej. Dla wszystkich próbek wykonano rozcieńczenia seryjne. Koniugat anty-mysiej IgG kozła (swoistej dla fragmentu Fc; Jackson Lab., USA) albo anty-mysiej IgA kozła (swoistej dla łańcucha a; Sigma) z peroksydazą rozcieńczono i dodano do wszystkich wgłębień. Oznaczano miano IgG przeciw podjednostce B dające A450 nm > 0,2. Wyliczono odpowiedź IgA na podjednostkę B dla EtxB i EtxB(G33D) w wydzielinach jelitowych w postaci „swoistej aktywności IgA” [stosunek średniego miana IgA przeciw podjednostce B w pg/ml do miana całkowitej IgA w pg/ml],
Do pomiaru poziomów cytokin IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 i IFN-γ użyto technikę ELISA opisaną uprzednio (Harper H. M., PhD thesis, University of Bristol, 1995). Pokrótce, płytki do mikromianowania powlekano przeciwciałami szczura na mysie IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 i IFN-γ. Płytki blokowano 2% (wag./obj.) roztworem albuminy surowicy bydlęcej. Do wgłębień dodano supernatanty z pożywki hodowli i rozcieńczono je. Jeden rząd na każdej płytce dla danej cytokiny zawierał standardową ilość rekombinantowej cytokiny. Następnie płytki inkubowano
187 266 z biotynylowanymi monoklonalnymi przeciwciałami przeciw danej cytokinie i dodano awidyno-peroksydazę oraz, substrat - 3,3', 5,5'-tetrametylobenzyden (TMB), po czym prowadzono odczyt przy A 405 nm·
Próba na proliferacją limfocytów
Myszy uśmiercano przez dyslokację szyjną, aseptycznie wycinano krezkowe węzły chłonne i przeciskano je przez sito ze stali nierdzewnej do zrównoważonego roztworu soli Hanka (HBSS) dostarczonego przez Flow Laboratories, Irvine, Renfrewshire, W. Brytania). Komórki przemyto przez wirowanie z szybkością 500 x g, w czasie 10 minut, w temperaturze 4°C w roztworze HBSS i zawieszono w modyfikowanej pożywce Eagle'a (Flow), do której dodano 20 mM buforu Hepes (Flow), 100 jednostek międzynarodowych penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 4 mM L-glutaminy (Flow) i 2-merkaptoetanol (pożywka kompletna). Dodano świeżą autologiczną, normalną surowicę mysią od nie immunizowanych myszy do końcowego stężenia 0,5% (obj.). Hodowle zawierały 2 x 10 żywych komórek/ml bądź w objętościach po 2 ml w płytkach 24-wgłębieniowych bądź w objętościach po 8 ml w kolbach 25 ml (Nunc A/S, Roskide, Dania). Ustalano je w obecności antygenów lub bez dodatku antygenów, jak podano w opisie do figur. Hodowle inkubowano w temperaturze 37°C w nawilgotnionej atmosferze z zawartością 5% CO2 i 95% powietrza przez 6 dni. W żądanych punktach czasu z hodowli pobierano próbki po 0,1 ml i przenoszono je do 96-dolkowych płytek z dnami w kształcie litery U (Nunc) i napromieniano [3H]-Thd w dawce 1 pCi/wgłębienie (Amersham, W. Brytania) przez 6 godzin, po czym zebrano je w zestawie Mach III 96 Tomtec (Orange, Conn. USA) i poddano zliczeniu w standardowym cieczowym liczniku scyntylacyjnym 1450 Micro & plus, LKB-Wallac, Turku, Finlandia). Podobnie, z hodowli pobierano po 0,5 ml supernatantu do analizy cytokin. Komórki peletkowano i supernatanty przechowywano w temperaturze -68°C do czasu analizy.
Analizafenotypowa wyhodowanych komórek
Wyhodowane komórki, zebrane w czwartym dniu hodowli przemyto, komórki żywe odzyskano na granicy faz gradientu HBSS/18% metryzamid (Nyegaard and Co., Oslo, Norwegia) i wirowano je z szybkością 500 x g przez 15 minut w temperaturze 20°C. Komórki dwukrotnie przemyto i zawieszono w HBSS zawierającym 0,2% azydku sodu (Sigma) i 10% normalnej surowicy szczurzej. Użyto następujące przeciwciała szczurze dostarczone przez firmę Pharmingen, San Diego, USA: znakowane izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) przeciwciało anty-CD4 (RNRM4-5), znakowane FITC przeciwciało anty-CD8 (53-6.7), znakowane biotyną przeciwciało anty-CD25 (7D4) i znakowane fikoerytryną (PE) przeciwciało anty-B220 (RA3-6D2). Dodatkowo, do przeciwciał znakowanych biotyną użyto znaczniki: streptawidyna-PE albo streptawidyna-FITC (Serotech, W. Brytania). Wszystkie przeciwciała rozcieńczono w HBSS zawierającym azydek i stosowano w z góry określonych stężeniach. Ilość po 200 pl stężenia 2 x 106 komórek i po 200 pl każdego z przeciwciał zmieszano i inkubowano na lodzie przez 30 minut. Jeśli potrzebne były wtórne przeciwciała streptawidyna-PE albo streptawidynaFITC, komórki inkubowano z tymi przeciwciałami przez dodatkowe 30 minut. Przeprowadzono również odpowiednie próby kontrolne dla przeciwciał FITC i PE. Komórki przemywano w HBSS i następnie analizowano metodą cytometrii przepływowej (Becton Dickinson).
Wyniki
Generowanie i charakteryzacja wiążącego receptor mutanta EtxB.
W celu generowania zmutowanej podjednostki B, pozbawionej zdolności rozpoznawania receptora, wprowadzono wymianę Gly na Asp w podjednostce B ciepłochwiejnej enterotoksyny E. coli techniką sterowanej oligonukleotydem mutagenezy EtxB. Zmutowane białko, oznaczone symbolem EtxB(G33D) oraz EtxB typu dzikiego oczyszczono do homogenności (patrz dział: „Materiały i metody”). Masę cząsteczkową oczyszczonych EtxB i EtxB(G33D) oznaczono metodą laserowej desorpcyjnej spektrometrii masowej. Masy te mieściły się w granicach 20 Da teoretycznych mas 11702 i 11760 Da odpowiednio dla monomerycznych EtxB i EtxB(G33D). Analizowanie metodą elektroforezy SDS-PAGE bez uprzedniego ogrzewania, zarówno EtxNB typu dzikiego jak i EtxB(G33D) migrowały jako oddzielne trwałe oligomery o pozornych masach cząsteczkowych 42 kDa i 56 kDa (fig. 1A, odpowiednio pasmo 1 i pasmo 2). Obserwowana ruchliwość elektroforetyczna i trwałość podczas elektroforezy z użyciem SDS białka EtxB
187 266 jest charakterystyczną własnością pentameru podjednostki B. (Sandkvist M., Hirst T. R. i Bagdasarian M., J. Bacteriolog., 169, 4570-4576, 1987). Mniejsza ruchliwość elektroforetyczna oligomerycznego EtxB(G33D) nie wynika z różnicy w ilości składników monomerycznych podjednostki B gdyż obydwa pentameryczne EtxB i EtxB(G33D) wykazywały podobne czasy retencji podczas analizy metodą wysokorozdzielczej chromatografii z filtracją żelową. Niezgodność w ruchliwości elektroforetycznej oligomeru EtxB(G33D) w odniesieniu do EtxB typu dzikiego wynika prawdopodobnie z wprowadzenia reszty Asp z ładunkiem ujemnym, co powoduje redukcję w wiązaniu z SDS i w następstwie - wolniejszą migrację.
Porównywano również stabilność EtxB i EtxB(G33D) w buforach o niskiej wartości pH, ich odporność na stężenia 1,0 mg/ml trypsyny i proteinazy K i reaktywność względną wobec panelu przeciwciał monoklonalnych i poliklonalnych przeciw podjednostce B. W każdej z tych prób EtxB(G33D) wykazywał własności identyczne z EtxB typu dzikiego. Wynika z tego, że podstawienie Asp w miejsce Gly w pozycji 33 w EtxB nie zmienia konfiguracji oligomerycznej, stabilności w SDS, przy niskiej wartości pH, podczas działania proteazy ani reaktywności wobec przeciwciał w porównaniu z EtxB typu dzikiego.
Zdolność EtxB(G33D) do wiązania się z jego receptorem GM1 oceniano w próbie GM1-ELISA (fig. 1C). Próba ta wykazała wysoko znamienne obniżenie zdolności tego mutanta do wiązania GM-1 w porównaniu z białkiem typu dzikiego (>99% obniżenie w odczycie A450 nm).
Poza tym, w odróżnieniu od EtxB typu dzikiego, EtxB(G33D) nie wiązał się z komórkami CHO w próbie immunofluorescencji. Okazało się, że EtxB(G33D) jest defektywny pod względem zdolności wiązania gangliozydowego GM-1 in vitro i in situ. Silna immunogenność EtxB in vivo zależy od wiązania receptora..
Znaczenie wiązania receptora dla immunogenności EtxB oceniano w próbie immunogenności na myszach po podaniu doustnym lub po wstrzyknięciu podskórnym EtxB albo EtxB(G33D) w PBS. Po podaniu doustnym EtxB, wykrywano wysokie miana IgG w surowicy i aktywność przeciwciała IgA w wydzielinach jelitowych (fig. 2). Odwrotnie, przy podobnym reżimie immunizacji doustnej za pomocą EtxB(G33D) nie powstawała wykrywalna aktywność przeciwciał. EtxB(G33D) indukował wytwarzanie przeciwciał w surowicy po podaniu podskórnym, jednak odpowiedź ta była znacznie słabsza w porównaniu z odpowiedzią przeciwciał na EtxB typu dzikiego, ze 160-krotnym zmniejszeniem średniego miana przeciwciał, (odpowiednio 1050 wobec 171000). Wynika stąd, że wiązanie receptora przez EtxB ma zasadnicze znaczenie dla jego silnej immunogenności in vivo.
Wiązanie z receptorem nie ma wpływu na stopień proliferacji limfocytów w obecności EtxB ani EtxB(G33D).
Badano wpływ EtxB i EtxB(G33D) na proliferację limfocytów in vitro. Limfocyty izolowano z podkolanowych i krezkowych węzłów chłonnych (MLN) myszy immunizowanych za pomocą EtxB albo EtxB(G33D) i stymulowanano je in vitro albo białkiem albo denaturowanym wysoką temperaturą preparatem EtxB albo EtxB(G33D). Odpowiedź proliferacyjna limfocytów pochodzących z węzłów podkolanowych i z węzłów krezkowych była podobna. W każdym przypadku wzrastała proliferacja w odpowiedzi na każdy z preparatów białkowych wraz ze wzrostem stężenia podjednostki B. Reprezentatywny zestaw danych z tego doświadczenia z użyciem komórek MlN jest podany w tabeli 1. Wielkości odpowiedzi na pentamery i monomery powstałe po denaturacji ciepłem, zarówno typu dzikiego jak i zmutowane, były porównywalne. Na fig. 3 jest przedstawiona kinetyka odpowiedzi proliferacyjnych uzyskanych w obecności 80 pg/ml każdego z tych preparatów białkowych. Reaktywność była zależna od obecności antygenu i podlegała podobnym prawidłom w obecności każdego białka. Reaktywność uwidaczniała się w trzecim dniu hodowli znakowanej za pomocą pHj-tymidyny, uzyskując pik w czwartym dniu i następnie opadając. Drobnych różnic w czasie występowania pików odpowiedzi widocznych na fig. 3 nie obserwowano w powtarzanych doświadczeniach, co dowodzi faktu, że charakterystyczne cechy pamięciowe tych odpowiedzi na EtxB i na EtxB(G33D) są porównywalne. Wypływa stąd wniosek, że na poziom stymulacji w obecności białek natywnych nie ma prawdopodobnie wpływu wiązanie z receptorem ani wprowadzona mutacja.
187 266
Wiązanie receptora przez toksynę powoduje immunomodulację podzbiorów limfocytów B i limfocytów T.
W celu zbadania, czy wiązanie receptora przez EtxB wywiera jakiś wpływ na populacje komórek limfoidalnych in vitro, izolowano limfocyty z MLN myszy napiętnowanych dootrzewnowo za pomocą EtxB(G33D) a następnie stymulowano je albo EtxB albo EtxB(G33D) albo ich mieszaniną. Dodatkowo przeprowadzono równoległe doświadczenie z użyciem limfocytów pochodzących z MLN od myszy, którym wstrzyknięto EtxB. Uzyskano w zasadzie identycne wyniki z tymi, jakie otrzymano dla myszy napiętnowanych za pomocą EtxB(G33D).
(i) EtxB powoduje zwiększoną aktywację komórek B
Wpływ EtxB na limfocyty B badano na drodze ekspresji markera aktywacji CD25 (!L-2R«) w połączeniu z markerem komórek B, B220 (CD45R). Jak to jest uwidocznione na fig. 4, ilość komórek B w hodowlach stymulowanych EtxB wynosiła 62,9% ogólnej ilości komórek. Z tej liczby duża część (28,4%) wytwarzała marker aktywacji komórek, CD25. Odwrotnie, udział komórek B po stymulacji w obecności EtxB(G33D) wynosił mniej niż połowę tego, który występował w przypadku typu dzikiego (22,26%), i mniejsza ilość komórek ulegała aktywacji (5,6%). W celu ustalenia, czy wpływy wywierane przez EtxB są domimujące, komórki inkubowano w obecności równomolowych stężeń EtxB i EtxB(G33D). Dane z cytometrii przepływowej były podobne do tych, jakie uzyskano po stymulowaniu w obecności samego EtxB typu dzikiego (60,6% komórek B, z czego 26% było aktywowanych). Wynika stąd, że właściwość wiązania receptora przez EtxB wywołuje zwiększoną aktywację komórek B in vitro.
(ii) EtxB powoduje zwiększoną aktywację komórek CD4+ T i całkowite stłumienie komórek CD8+ T.
W celu zbadania wpływu wiązania receptora przez podjednostkę B na komórki T, limfocyty znakowano przeciwciałami przeciw CD4 lub przeciw CD8 w połączeniu z przeciwciałami przeciw CD25 (fig. 5). Dodatkowo, niektóre komórki oddzielnie znakowano przeciwciałami przeciw markerowi CD3 (nie jest to pokazane). Udział komórek T, w których zachodzi ekspresja markera CD4 po stymulacji w obecności EtxB wynosił 36,7%, z czego duża część tych komórek (32,7%) była aktywowana. Odwrotnie, w hodowli zawierającej EtxB nie wykryto komórek cD8+ T.
Dla porównania, zarówno komórki CD4+ T jak i CD8+ T były obecne w hodowli stymulowanej wobec EtxB(G33D). Takie hodowle zawierały dużą część komórek CD4+ T (66,6%) ale tylko 12% z tej ilości było aktywowanych. Udział komórek CD8+ T w obecności EtxB(G33D) wynosił 11,7% całkowitej ilości komórek, ale bardzo mało z nich było aktywowanych, co stwierdzano przez nieobecność markera CD25. Dodatkowo, w obecności mieszaniny równomolowych stężeń EtxB i EtxB(G33D), wartości dla odpowiadających komórek były podobne do tych, które występowały w obecności samego EtxB typu dzikiego: 41,68% komórek CD4+ T, z których 28,6% było CD25+ i brak komórek CD8+ T (fig. 5). We wszystkich tych analizach, proporcja komórek barwiących się CD3 była mniej więcej równa sumie komórek, w których zachodziła ekspresja markerów CD4 i CD8. Dane te wykazują, że zwiększenie aktywacji komórek B i komórek CD4+ T oraz selektywne tłumienie komórek CD8+ T zachodzi pod wpływem okupowania receptora przez toksynę.
Produkcja cytokin
Dla oceny, czy wpływ EtxB na populacje limfocytów mógł być zależny od zmiany w pro-dukcji cytokin, inkubowano hodowle komórkowe z EtxB albo z EtxB(G33D) i pobierano do analizy supernatanty w dniach 2, 3, 4, 5 i 6. Wyniki uzyskane z próbek pobranych w piątym dniu, kiedy wykryto maksymalne stężenie cytokin, są przedstawione w tabeli 2. W supernatantach z hodowli stymulowanych w obecności EtxB lub EtxB(G33D) wykryto zarówno IFN-γ jak i IL-2, jakkolwiek względne poziomy tych cytokin różniły się. Pożywka z hodowli komórek inkubowanych z EtxB typu dzikiego zawierała trzykrotnie wyższe stężenie IL-2 i 1,5-krotnie niższy poziom IFN-γ w porównaniu z supernatantami hodowli stymulowanych w obecności EtxB(G33D). Pomimo wykrycia, że inne hodowle proliferujących komórek T, odpowiadające na inne antygeny, dawały wysokie poziomy IL-4, IL-5 i IL-10, to żadnej z tych
187 266 cytokin nie wykryto w hodowlach stymulowanych EtxB albo EtxB(G33D). Wzrost poziomu IL-2 i spadek poziomu IFN-γ po stymulacji EtxB w porównaniu ze stymulacją EtxB(G33D) odzwierciedla prawdopodobnie stan aktywacji komórek B i komórek CD4+ T. Mimo to, wyniki świadczą o tym, że mocno wyrażony wpływ EtxB typu dzikiego na populację komórek CD8+ T nie wynika prawdopodobnie z większego przesunięcia w profilu cytokin w następstwie okupowania receptora.
Omówienie wyników
Powyższe badania wykazały, że wprowadzenie mutacji w jednym punkcie (G33D) w miejscu wiązania receptora z EtxB powoduje znaczną utratę zdolności wiązania GM1. Co ważne, zmutowany EtxB(G33D) wykazywał identyczne własności fizykochemiczne jak EtxB typu dzikiego w odniesieniu do konformacji oznaczonej metodą chromatografii żelowej, trwałości w SDS, trwałości w środowisku kwaśnym i wobec proteaz. Oznaczenia swoistych odpowiedzi przeciwciał na immunizację przez EtxB albo EtxB(G33D) wykazały ich ogromne różnice. Podskórne wstrzyknięcie myszom EtxB(G33D) powodowało wysoce znamienny spadek miana przeciwciał w porównaniu z podaniem EtxB typu dzikiego (około >160 razy), a po podaniu doustnym nie wykryto odpowiedzi w postaci wytwarzania przeciwciał. Możliwe jest, że te różnice wynikają z rozerwania dominującego epitopu zaangażowanego albo w rozpoznawaniu cząsteczki przez przeciwciało albo stymulacja efektywnych komórek T pomaga w wytwarzaniu przeciwciał. Zasługuje jednak na uwagę fakt, że podstawienie Asp w miejsce Gly nie ma wpływu na rozpoznanie podjednostki B przez panel swoistych przeciwciał poliklonalnych i monoklonalnych. Ponadto, były porównywalne odpowiedzi proliferacyjne wówczas, gdy do hodowli dodano EtxB albo EtxB(G33D), niezależnie od tego, które białko było użyte do napiętnowania in vivo, co dowodzi faktu, że reaktywność komórek T nie była swoista wobec którejś cząsteczki. Wynika stąd, że wiązanie receptora przez EtxB ma podstawowe znaczenie dla jego silnej immunogenności in vivo.
Znaczenie wiązania receptora dla silnej immunogenności EtxB można tłumaczyć na wiele sposobów. Po pierwsze, wiązanie podjednostki B Etx i Ctx z GM1 może zwiększać wydajność pobierania tych białek, prowadząc do wzrostu miejscowego stężenia białek dostępnych dla układu immunologicznego. Inne klasy białek o zdolności wiązania się z powierzchniami błony śluzowej okazały się skutecznymi immunogenami (De Aizpura H. J. i Russell-Jones G. J., J. Exp.. Med. 167, 440-451, 1988). Zaobserwowane różnice w immunogenności EtxB i jego mutanta po podaniu doustnym mogą rzeczywiście wynikać z wydajnego poboru EtxB ze światła jelit. Jednakże ogromne różnice zaobserwowane po podaniu parenteralnym (gdy antygen dostarcza się miejscowo w dużym stężeniu) wskazują na inne efekty. Przykładowo, wiązanie EtxB z GM1 może wpływać na wydajność aktywności komórek prezentujących antygen. Takie wiązanie powinno powodować aktywację komórek niosących klasy II, zwłaszcza w odniesieniu do ekspresji koniecznych cząsteczek kostymulujących, takich jak B7, co jest związane z nabywaniem przez nie zwiększonej aktywności prezentowania antygenu (Jenikins M. K. i Johnson J. G., Curr. Opin. Immunol. 5, 361-367, 1993). Alternatywnie, wiązanie receptora może mieć bezpośredni wpływ na sub-populacje limfocytów. Wiele obserwacji w niniejszych badaniach dostarcza silnego dowodu, że w tym przypadku ma to rzeczywiście miejsce.
Badania in vitro wykazały, że EtxB ma zdolność indukowania proliferacji napiętnowanych komórek węzłów limfatycznych. Ta właściwość nie była zależna od wiązania receptora gdyż odpowiedzi o podobnych charakterystykach pamięciowych uzyskano stosując albo EtxB typu dzikiego albo EtxB(G33D) lub też powstałe po denaturacji ciepłem formy monomeryczne tych białek, które nie mogą wiązać GM1. Te obserwacje są interesujące same dla siebie, gdyż szeroko podaje się, że handlowe preparaty Ctx i CtxB bądź oczyszczone rekombinantowe CtxB wykazują silny hamujący wpływ na proliferację limfocytów in vitro. Ta pozorna niezgodność może wynikać stąd, że poprzednie doświadczenia prowadzono na limfocytach oczyszczonych, szeroko stosując hodowle limfocytów stymulowane mitogenem (odpowiedzi w tych koloniach nie są ograniczone klonalnie), w których może być zaangażowany inny mechanizm. Zgodna z tym była nasza obserwacja, że proliferacja stymulowanych Con-A limfocytów była rzeczywiście hamowana przez EtxB. Jednakże analizy populacji komórek w ho187 266 dowlach napiętnowanych komórek węzłów limfatycznych, stymulowanych EtxB albo EtxB(G33D), ujawniły istotne różnice w odniesieniu do komórek B i do komórek T niosących CD4 i CD8.
Komórki B wykrywano po 4 dniach hodowli w obecności EtxB albo EtxB(G33D). Jednak w porównaniu z EtxB(G33D), względny udział komórek B w hodowlach z EtxB wzrastał o około 100%. Ten wzrost był związany z ekspresją CD25 na bardzo dużej części komórek B. W przedstawionym doświadczeniu, odpowiadające limfocyty napiętnowano za pomocą EtxB(G33D) in vivo. Podobne doświadczenia z komórkami pochodzącymi od myszy immunizowanych EtxB dały podobne wyniki. Tak więc, niezależnie od jakichkolwiek efektów in vivo związanych z wiązaniem receptora, hodowle prowadzone w obecności EtxB zawierały większą proporcję komórek B niż te, które stymulowano za pomocą EtxB(G33D). Te wpływy na komórki B wydają się przynajmniej częściowo niezależne od regulowania przez komórki T in vitro, ponieważ wyniki nie wskazują na większe przesunięcie w profilu wykrytych cytokin. Tak więc, w próbach in vitro, wiązanie receptora przez EtxB wydaje się związane z bezpośrednim wpływem na komórki B, powodując proporcjonalną ekspansję tej populacji oraz jej aktywację. Jest również godne uwagi, że Ctx zwiększa ekspresję głównego układu zdolności tkankowej klasy II w kierunku wytwarzania na dziewiczych komórek B, właściwość, która nie występowała u wiążącego GM1 mutantu EtxB(G33E) (Francis M. L., Ryan J., Jobling M. G., Holmes R. K., Moss J. i Mond J. J., J. Immunol., 148, 1999-2005, 1992). Wyniki tych badań wskazują na występowanie bezpośrednich efektów mitogennych wywieranych przez EtxB na komórkach B napiętnowanych antygenem i dowodzą, że we wpływach tych pośredniczy wiązanie receptora.
Poza wpływem EtxB na komórki B w hodowlach, analiza metodą cytometrii przepływowej wykazała, że ten toksoid wywołuje całkowite tłumienie komórek CD8+ (nie są one wykrywalne). Jeszcze raz okazało się, że ten efekt jest zależny od wiązania receptora, gdyż ta populacja komórek T nie była tłumiona w hodowlach zawierających EtxB(G33D). Dalej, całkowite tłumienie komórek CD8+ w hodowlach zawierających EtxB zaobserwowano w preparatach pochodzących od myszy immunizowanych przez EtxB typu dzikiego. Są trzy możliwe mechanizmy, według których efekt ten może występować 1). Wiadomo, że wiązanie Ctx albo CtxB z GM1 na szczurzych komórkach krezkowych węzłów chłonnych indukuje tworzenie się plam i czapeczek (Craig S. W. i Cuatrecasas P., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 38443848, 1975). Możliwe jest, że w tym procesie, kompleksy EtxB-GM1 i inne cząsteczki, w tym CD8, ulegają internalizacji. Taki proces powinien zapobiegać detekcji tych komórek metodą cytometrii przepływowej z użyciem CD8 jako markera i może powodować ich śmierć w wyniku utraty kompleksu powierzchniowego TCR. Jakkolwiek ten ostatni może odpowiadać za nieobecność komórek CD8+ T w hodowli, w innych nie stwierdzano utraty kompleksu TCR z powierzchni ludzkiej linii komórek T Jarkata przy użyciu CtxB (Imboden J. B., Shoback D. M., Pattison G. i Stobo J. D., (Proc. Natl. Acad. Sci. uSa, 83, 5673-5677, 1986). Za tłumaczeniem braku działania procesem „capping” przemawia spostrzeżenie, że markery CD3 i CD4 pozostały bez wpływu; 2) w alternatywnym mechanizmie powinny być zaangażowane efekty wywierane przez cytokiny w hodowli. W tym badaniu, wykrywano zarówno IL-2 jak i IFN-γ. Jednakże wyniki nie wskazują na większe przesunięcie w profilu cytokin, które mogłoby tłumaczyć tak dramatyczny wpływ na komórki CD8+ T 3). Nieobecność komórek CD8+ T może być wynikiem aktywacji indukcji apoptozy. W śmierci limfocytów przez apoptozę może pośredniczyć capping, co opisano powyżej, albo proces ten może przebiegać bez cappingu, drogą wpływu na wydarzenia sygnalizacji w komórce. Indukowana aktywacją programowana śmierć jest zależna od jonów Ca2+ i wymaga obecności fosfataz i kinaz. Okazało się, że wiązanie CtxB z limfocytami hamowało zależną od kinazy proteinowej C proliferację i indukowało znaczący wzrost poziomu wewnątrzkomórkowego Ca2+, wydarzeń, które nie są związane ze wzrostem poziomu cyklicznego monofosforanu adenozyny (CAMP). Zdolność EtxB do tłumienia komórek CD8+ T ale nie komórek CD4+ T może być rezultatem zróżnicowanych wpływów sygnałów związanych z kompleksem CD4/CD8-TCR wynikających z sieciowania GM1 na powierzchni tego podzbioru limfocytów. Może to wynikać z różnicującego wiązania
187 266 tego toksoidu na błonie, co zostało opisane dla CtxB albo alternatywnie z różnych wpływów na mechanizmy sygnalizacji w komórkach CD4+ T i CD8+ T.
Przy całkowitej nieobecności wykrywalnych komórek CD8+ T, EtxB zwiększał udział komórek CD4+ T, które były aktywowane w porównaniu z mutantem wiążącym receptor. Zasadnicze wymagania dla komórek CD4+ T w odpowiedzi na Ctx zostały zademonstrowane in vivo. Przyczyna zwiększonej aktywacji tego podzbioru komórek T jest jednak niejasna. Należy mieć na uwadze, iż wykazano, że CtxB stymuluje syntezę DNA i podział komórki w znajdujących się w spoczynku, nietransformowanych komórkach mysich 3T3. Selektywny wpływ mitogeniczny na komórki CD4+ T zaobserwowano również w obecności lektyn roślinnych, które wiązały się z Gaip-1-3-3-GalNAc, tym samym komponentem, z którym wiąże się EtxB w GM1. Nie można wykluczyć ewentualności, że EtxB uczestniczy w zależnym od wiązania z GM1 bezpośrednim wpływie na komórki CD4+ T, powodując ich aktywację. Jednakże jest również możliwe, że zwiększona aktywacja komórek CD4+ T w hodowlach zawierających EtxB jest konsekwencją opisanych wyżej zmian w populacjach komórek B i komórek CD8 T. Wiadomo, że aktywacja komórek B jest związana ze wzrostem ich kompetencji jako komórek prezentujących antygen komórkom CD4+ T. Ponadto, komórki CD8+ T łączy się powszechnie z rolą regulacyjną w reaktywności immunologicznej, zarówno in vivo jak i w badaniach in vitro Usunięcie ich z proliferacyjnych hodowli komórek T wiąże się z wydłużonym i zwiększonym poziomem dzielenia się komórek CD4+ T.
Biorąc powyższe pod uwagę, można przypuszczać, że silna immunogenność EtxB in vivo, jak wykazano to w tym badaniu, występuje jako rezultat zdolności zwiększania aktywacji komórek B, wyrażającej się wpływem na procesy regulacji wzrostu w wyniku związania z GM1. Aktywacja komórek Cd4+ T i zdolność EtxB do zwiększania produkcji IL-2 w hodowli in vitro może dostarczać niezbędnego sygnału do dalszej ekspansji klonów komórek B. Tłumienie komórek CD8+ T przez EtxB w próbach in vitro w tym badaniu może świadczyć o innym mechanizmie potęgowania reakcji immunologicznej in vivo po podaniu systemowym lub doustnym, zwłaszcza w świetle zaangażowania tego podzbioru komórek w supresji odpowiedzi immunologicznej i w tolerancji przy podaniu doustnym. W tym względzie, dla wytłumaczenia tego mechanizmu, przydatna jest obserwacja, że zarówno Ctx jak i Etx znoszą tolerancję doustną na dodane rozpuszczalne białka a inne badania świadczą o tłumieniu przez Ctx i CtxB limfocytów wewnątrznabłonkowych w jelicie lub w kopułce kępki Peyera. Okazało się, że hamujący wpływ CtxB na komórki CD8+ T w próbach in vitro zapobiega reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi.
Konkludując, wykazano, że EtxB wywiera silne działanie immunomodulujące na odpowiedź przeciwciał in vivo i na populacje limfocytów in vitro. Ponadto wykazano, że w tym działaniu uczestniczy wiązanie z receptorem. Nasze spostrzeżenia odnoszą się również do zrozumienia zdolności Etx i Ctx do działania jako silne adiuwanty i jako potencjalne nośniki białek dla innych antygenów i wskazują, że te właściwości polegają na zdolności tych toksoidów do wiązania receptorów gangliozydowych na powierzchni komórek limfoidalnych.
Przykład II. W niniejszym przykładzie wykazano, że działanie na komórki CD8 nie zależy od rozpoznania antygenu i pośredniczy w nim proces apoptozy.
Przygotowano rekombinantowe preparaty EtxB i EtxB(G33D) jak w przykładzie I. Obydwa białka były dobrze scharakteryzowane w odniesieniu do wiązania z GM1, wiązania z panelem przeciwciał monoklonalnych i poliklonalnych i pod względem różnych innych własności fizyko-chemicznych. Albuminę jaja (OVA) dostarczyła firma Sigma (Poole, W. Brytania). Krezkowe węzły chłonne (MLN) wyizolowano od myszy BALB/c w wieku 8-10 tygodni (szczepu o silnej odpowiedzi na EtxB) (Nashar T. O. i Hirst T. R.: „Immunoregulatory role of H-2 and intra H-2 alleles on antibody responses to recombinant preparations of B-subunits of Escherichia coli heat-labile enterotoxin (rExtB) and cholera toxin (rCtxB) [Immunomodulacyjna rola alleli H-2 i intra H-2 w odpowiedziach przeciwciał na rekombinantowe preparaty podjednostek B ciepłochwiejnej enterotoksyny E. coli (rExtB) i toksyny przecinkowca cholery (rCtxB)], Vaccine, 13,803, 1995). Myszom wstrzyknięto dootrzewnowo 200 pg OVA (Sigma) zemulgowanej w niekompletnym adiuwancie Freunda (Sigma). Po 10 dniach od iniekcji pobierano MLN, przeciskano je przez sito ze stali nierdzewnej do roztworu HBSS (Flow, Irvine,
187 266
W. Brytania). Wyodrębnione komórki przemywano w HBSS przez wirowanie z szybkością 500 g w czasie 10 minut w temperaturze 4°C i zawieszano w modyfikowanej pożywce Eagle'a (Flow) zawierającej ponadto 20 mM HEPES, 100 jednostek międzynarodowych penicyliny, 100 pg/ml streptomycyny, 4 mM L-glutaminy i 5 x 10'5 M 2 merkaptoetanolu (pożywka kompletna) i do której dodano 0,5% (objętościowych) świeżej autologicznej surowicy mysiej. Hodowle zawierały 2x10 żywych komórek/ml w objętościach po 2 ml w płytkach 24-wgłębieniowych (Nunc, Roskide, Dania).
Hodowle te ustalano w obecności 100 pg/ml albuminy jaja (OVA) (uprzednio dializowanej wyczerpująco w pożywce kompletnej), z dodatkiem albo bez dodatku 40 pg/ml EtxB bądź EtxB(G33D). Hodowle inkubowano w temperaturze 37°C w atmosferze 5% dwutlenku węgla i 95% powietrza przez 5 dni. W żądanych punktach czasu z hodowli pobierano próbki po 0,1 ml i przenoszono je do 96-dołkowych płytek z wgłębieniami w kształcie litery U (Nunc) i napromieniano promieniowaniem [3H]-tymidyny (Amersham, W. Brytania) w dawce pCi/wgłębienie przez 6 godzin, po czym zbierano je w aparacie Mach III harvesting 96; Tomec, Orange, CT) i liczono w standardowym cieczowym liczniku scyntylacyjnym (1450 Micro b plus; LKB Wallac, Turcu, Finlandia). Do przepływowej analizy cytometrycznej komórek T (Becton Dickinson, Erenbodegem-Aalst, Belgia) komórki barwiono następującymi przeciwciałami szczurzymi (PharMingen, Cambridge, W. Brytania): znakowanym FITC antyCD4 (RNRM4-5) lub FITC-anty-CD8a (53-6.7) i znakowanym biotyną anty-CD25 (IL-2Ra) (7D4) i następnie streptawidyno-fikoerytryną. Dodatkowo, dla przeciwciał znakowanych biotyną użyto FITC-znakowaną streptawidynę. W dniu, w którym wystąpił pik proliferacji (dzień 4), co oznaczono przez wprowadzenie (3H]-tymidyny, przeprowadzono analizę odzyskanych komórek w automatycznym sorterze komórek (FACS).
W celu zbadania apoptozy, wyizolowano świeże komórki MLN (MLNC) i komórki T śledziony (SPLTC) od myszy BALB/c w wieku 8-10 tygodni. Komórki MLNC zawierające >90% komórek CD3+ T według oznaczenia metodą cytometrii przepływowej, inkubowano przez godziny na płytkach petriego (Costar, Cambridge, MA) w pożywce kompletnej zawierającej 10% cielęcej surowicy płodowej (FCS), w temperaturze 37°C, w atmosferze 5% dwutlenku węgla i 95% powietrza, dla usunięcia komórek adherencyjnych. Frakcję nieadheren-cyjną odpipetowano, speletkowano i dwa razy przemyto w HBSS przed następnym użyciem. Komórki SPLTC oczyszczono przez negatywną selekcję, stosując perełki szklane powleczone normalną surowicą mysią i następnie anty-mysimi γ-globulinami królika w znany sposób (Wigzell H.: „Specific affinity fractionation of lymphocytes using glass or plastic bead columns” [Francjonowanie limfocytów z wykorzystaniem swoistego powinowactwa na kolumnach wypełnionych perełkami szklanymi lub plastikowymi], Scand. J. Immunol. 5 (Suppl.5),· 23, 1976). Wyselekcjonowana populacja komórek T miała >90% komórek CD3+ według oznaczenia metodą cytometrii przepływowej.
Komórki CD4+ T i CD8+ T rozdzielono następująco: nieadherencyjne komórki MLNC znakowano za pomocą szczurzego przeciwciała fikoerytryno-anty-mysiego CD4 (4708-02) albo FITC-anty-mysiego CD8a (53-6.7) (PharMingen) i inkubowano z koloidalnymi superparamagnetycznymi mikroperełkami sortera MACS skoniugowanymi z przeciw-szczurzą IgG kozła (H + L) F(ab ')2 (PharMingen), postępując według instrukcji producenta. Nanoszono je na kolumny mini-MACS (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Niemcy) dla oddzielenia wyselekcjonowanych przez selekcję pozytywną (>99% czystości) od wyselekcjonowanych przez selekcję negatywną (>90% czystości) populacji komórek CD4 i CD8+ T (oznaczenia przeprowadzono metodą cytometrii przepływowej).
Do ilościowego oznaczenia apoptozy użyto dwie metody: i) barwienie DNA oranżem akrydynowym w celu zbadania morfologii jądra i (ii) analizę cyklu komórkowego po barwieniu DNA jodkiem propidium i albo przeciwciałami anty-CD4 albo anty-CD8. Hodowle zawierające ilości po 2 x 106 komórek MLNC, SPLTC i frakcjonowanych MLNC w ml ustalano w kompletnej pożywce zawierającej 10% cielęcej surowicy płodowej (FCS) z dodatkiem lub bez dodatku 80 pg/ml albo EtxB albo EtxB(G33D) i obserwowano od 4 do 18 godzin. Po inkubacji, komórki peletkowano, przemywano HBSS i barwiono stężeniem 5 pg/ml oranżu akrydynowego (Sigma).
187 266 współogmi i CD8+ T
Tymocyty izolowano, traktowano stężeniem 10'7 M deksametazonu lub pozostawiono nietraktowane i stosowano jako kontrolę pozytywną dla komórek podlegających apoptozie. Zmiany morfologiczne w jądrach limfocytów badano metodą konwencjonalnei i skowej mikroskopii fluorescencyjnej (Leica TCS 4D). Proporcję komórek CD4 śledziony (SPLTC) w stadium G0/G1 cyklu rozwojowego komórki oznaczano metodą cytometrii przepływowej zawartości DNA po barwieniu jodkiem propidium w sposób opisany przez O'Connor'a (O'Connor P. M., Jackman J., Jondle D., Bhatia K., Magrath I. i Kohn K. W.: „Role of p53 tumor suppressor gene in cell cycle arrest and radiosensitivity of Burkitt's lymphoma cell lines” [Rola rakowego genu supresorowego p53 w zahamowaniu cyklu rozwojowego komórki i wrażliwość na napromienianie linii komórek chłoniaka Burkitta], Cancer Res., 53, 4776, 1993). Komórki izolowane z 18 godzinnych hodowli komórek T śledziony (SPLTC) inkubowanych bez dodatku albo z dodatkiem 40 pg/ml EtxB albo EtxB(G33D) barwiono za pomocą znakowanego FITC szczurzego przeciwciała anty-CD4 albo FITC-antyCD8a. Barwione komórki doprowadzano do stężenia 1 x 106 /ml w zimnym HBSS zawierającym 20 mM HEPES i 0,5 mM EDTA i utrwalano zimnym etanolem dodawanym kroplami. Następnie dodano 50 pg/ml jodku propidium i 40 pg/ml rybonukleazy A (wolnej od DNA-zy) i komórki inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej. Względną intensywność barwienia DNA jodkiem propidium w komórkach CD4 i CD8+ T oznaczano przez bramkowanie komórek wspólnie barwionych każdym z przeciwciał monoklonalnych.
W przykładzie I zaobserwowano, że komórki CD8+ T ulegają całkowitemu tłumieniu w hodowlach węzłów chłonnych proliferujących w odpowiedzi na EtxB, co nasuwa sugestię, że EtxB wywiera efekt poliklonalny na ten podzbiór komórek T. W celu zbadania, czy ten efekt jest zależny od aktywacji komórek odpowiadających na EtxB, ustalono hodowle pochodzące od myszy napiętnowanych albuminą jaja (OVA) i stymulowano je albo samą OVA albo OVA z dodatkiem EtxB albo mutantu EtxB(G33D). Uzyskano podobne piki poziomów proliferacji (czwarty dzień hodowli w każdym przypadku) w hodowlach prowadzonych w obecności samej OVA, OVA plus EtxB albo OVA plus EtxB(G33D) (odpowiednio: 9734 ± 347, 12031 ± 135 i 9305 ± 290 impulsów/minutę). Wystąpiła jednak ogromna różnica w dystrybucji podzbiorów komórek T w tych hodowlach po 4 dniach (fig. 6). Wszystkie hodowle zawierały komórki CD4 T, z których w podobnych proporcjach komórek zachodziła ko-ekspresja markera aktywacji CD25. Jednakże, komórki Cd8+ T były niewykrywalne w hodowlach inkubowanych z OVA plus EtxB ale były one wyraźnie obecne (jakkolwiek nie były aktywowane według oceny metodą ekspresji CD25) w hodowlach z OVA plus EtxB(G33D) albo z samą OVA. Świadczy to o tym, że EtxB indukuje tłumienie komórek CD8+ T odpowiadających na antygen inny niż EtxB. Ponadto, brak takiej odpowiedzi na EtxB(G33D) wskazuje na to, że tłumienie jest wyzwalane po interakcji toksoidu z receptorem. Zauważono również, że obecność EtxB typu dzikiego powodowała znaczący wzrost udziału komórek B, z których ogromną liczbę stanowiły komórki CD25 (nie pokazane), tak jak wykryto poprzednio dla hodowli odpowiadających na EtxB (przykład I). Wyciągnięto stąd wniosek, że okupowanie receptora przez EtxB wywiera wyraźnie zaznaczone działanie immunomodulujące na limfocyty, niezależne od ich swoistości antygenowej.
Zbadano możliwość, że komórki CD8+ T ulegają apoptozie podczas hodowli w obecności EtxB. Inkubowano MLNC albo oczyszczone komórki SPLTC wyizolowane od nienapiętnowanych myszy razem z EtxB albo EtxB(G33D) i śledzono zmiany w morfologii jądra komórkowego po barwieniu oranżem akrydynowym w czasie 4 do 18 godzin (tabela 3 i fig. 7). Zmiany morfologiczne w komórkach charakteryzowały się kondensacją chromatyny, co powodowało płacikowy wygląd jądra (fig. 7). Obserwowano również inne cechy komórek, takie jak bąblowanie błony plazmatycznej i obecność ciałek apoptotycznych. Te zmiany morfologiczne pojawiały się u około jednej trzeciej komórek w każdym z preparatów komórkowych traktowanych EtxB, natomiast znacznie mniejsze występowanie tych zmian obserwowano w komórkach hodowanych w obecności EtxB(G33D) albo bez egzogennego antygenu (tabela 3). Ponieważ komórki CD8 T stanowią około 35-40% komórek w preparatach MLNC i SPLTC, tłumienie tych komórek może być powodem obserwowanej apoptozy. W celu ustalenia, czy rzeczywiście zachodzi ten przypadek, hodowano populacje oczyszczonych komórek CD8 T i CD4+ T
187 266 w czasie 18 godzin w obecności antygenów (tabela 3). Indukowano podobne procentowości zmian morfologicznych w populacjach negatywnie wyselekcjonowanych komórek CD4+ T (zawierających >90% komórek niosących CD4) pod działaniem EtxB albo EtxB(G33D) albo bez antygenu, co wskazuje, że wiązanie EtxB z jego receptorem nie uwalnia procesu apoptozy w tym podzbiorze komórek T. Odwrotnie, u >70% negatywnie wyselekcjonowanych komórek CD8 T (>90% czystości) występowały zmiany morfologiczne po hodowli z EtxB typu dzikiego. Inkubacja bez antygenu albo z EtxB(G33D) powodowała zmiany w tylko odpowiednio 11 i 19% tej populacji komórek T. Obecność niewielkiej ilości komórek stanowiących zanieczyszczenie w użytych oczyszczonych populacjach (około 10% w każdym przypadku) nie może być odpowiedzialna za obserwowane zmiany, gdyż znacznie lepiej oczyszczone populacje, zawierające >99% komórek CD8 albo CD4+ T (izolowane przez selekcję pozytywną) odpowiadało na EtxB w podobny sposób [u 60% występowała apoptoza w obecności EtxB w porównaniu z 7% przy braku antygenu i w obecności EtxB(G33D)] (tabela 3). Apoptozę wykryto odpowiednio w 40% i 98% tymocytów po 18-godzinnej inkubacji w nieobecności lub w obecności deksametazonu. Dla wykazania, że zmiany morfologiczne obserwowane w naszych hodowlach były zgodne ze zmianami wynikającymi z indukcji apoptozy, dokonano oceny wyglądu subdiploidalnego DNA w hodowlach SPLTC traktowanych przez 18 godzin EtxB. Komórki poddawano analizie metodą cytometrii przepływowej po ko-barwieniu jodkiem propidium i albo przeciwciałami anty-CD8 albo przeciwciałami anty-CD4 (fig. 8). Około 48% spośród komórek CD8 T z hodowli inkubowanych z EtxB spadało poniżej piku fazy diploidalnej G0/G1 podczas barwienia jodkiem propidium, co wskazuje, że komórki te ulegały apoptozie (O'Connor P. M. i wsp., jak wyżej). Również niewielki udział komórek, w których zachodziła ekspresja CD4, w hodowlach prowadzonych w obecności EtxB wykazywał poziomy fazy sub-G0/G1 (około 11%, co może być wynikiem śmierci tak wysokiego procentu komórek CD8+ T). Odwrotnie, większość komórek CD4 lub CD8+ T hodowanych bez antygenu albo wobec EtxB(G33D) znajdowała się w fazie G0/G1 cyklu komórkowego, z czego u <5% występowała apoptoza. Stwierdziliśmy, że zaobserwowane zmiany morfologiczne w jądrze i obecność DNA z fazy sub-Go/Gi w znaczącym procencie komórek CD8+ T traktowanych EtxB wskazuje na selektywną apoptozę, uwalnianą przez cholero-podobny enterotoksoid. Niemożność indukowania podobnych efektów przez wiążący receptor mutant EtxB(G33D) świadczy o tym, że indukowanie apoptozy komórek CD8+ T jest związane ze zdolnością wiązania gangliozydu GM1.
Przykład III. Grupy po 8 samców myszy DBA/1 pozostawiano nietraktowane (grupa A) albo wstrzykiwano im po 100 pg kolagenu cielęcego w kompletnym adiuwancie Freunda w dniu 0, śródskórnie, do boku. Myszy, którym wstrzyknięto kolagen pozostawały albo niechronione (grupa B; kontrola pozytywna) albo zapobiegano rozwojowi choroby przez śródskórne podanie w miejscu sąsiadującym z miejscem wstrzyknięcia kolagenu: 100 pg EtxB w niekompletnym adiuwancie Freunda w dniu 0 (grupa C), 100 pg EtxB w niekompletnym adiuwancie Freunda w dniu 14 (grupa D) albo 100 pg EtxB(G33D) w niekompletnym adiuwancie Freunda w dniu 0 (grupa E). Wszystkie zwierzęta, za wyjątkiem zwierząt z grupy A, otrzymały przypominającą dawkę kolagenu w niekompletnym adiuwancie Freunda śródskórnie w dniu 21. Stopień ciężkości choroby oceniano w dniu 45 przez pomiar grubości stawu skokowego kończyny tylnej (doświadczenia A) albo przez punktową ocenę liczbową opuchlizny (w skali 0-3, gdzie 0 oznacza stan normalny a 3 oznacza maksymalną opuchliznę, doświadczenie B).
Uzyskane wyniki zilustrowano na fig. 9a i 9b. Wykazują one, że EtxB ale nie EtxB(G33D) ogromnie chroni myszy przed rozwojem indukowanego kolagenem zapalenia stawów.
Przykład IVa. Dwie oddzielne próbki „kożuszka” skrzepu ludzkiej krwi (otrzymanej od normalnych dawców krwi) użyto jako źródło komórek jednojądrzastych. Komórki izolowano w gradiencie fikolu i wyczerpująco przemyto, po czym hodowano je bez antygenu albo z dodatkiem 80 pg/ml EtxB albo EtxB(G33D), jak wskazano. Przed hodowlą, populacje komórek zawierały w każdej próbce odpowiednio 24% CD8+ i 27% CD4+ oraz 27% CD8+ i 22,9 CD4+. Po 18-godzinnej hodowli oceniano wygląd komórek apoptotycznych w próbkach komórek barwionych oranżem akrydynowym (jak w przykładzie II). Wyniki są przedstawione
187 266 na fig. 10. Wykazują one, że EtxB ale nie EtxB(G33D) indukuje apoptozę w populacji normalnych ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej.
Przykład IVb. Mysią linię komórek T, CTLL-2, hodowano aż do uzyskania płynięcia, następnie komórki przemyto i powtórnie posiano w ilości 1 x 106 komórek/ml na pożywkę bez dodatku antygenu albo z dodatkiem 80 pg/ml EtxB albo EtxB(G33D), jak wskazano. Po 18 godzinach hodowli pobrano próbki i określano procent komórek wykazujących oznaki apoptozy, stosując oranż akrydynowy (szczegóły w przykładzie II). Otrzymane wyniki są przedstawione na fig. 11. Wykazują one, że sieciowanie GM1 prowadzi do apoptozy w części mysich komórek CTLL.
Tabela 1:
Proliferacja limfocytów w obecności EtxB albo EtxB(G33D)
| Dawka pg/ml | EtxB | EtxB(G33D) | EtxB* | EtxB(G33D)* |
| 0 | 117,9 | 146,8 | 124,5 | 116,1 |
| (7,9) | (3,5) | (14,6) | (6,35) | |
| 5 | 4928 | 2860 | 2424 | 1431,5 |
| (98,7) | (3,8) | (88,3) | (37,5) | |
| 10 | 6978 | 3681 | 2518 | 4231 |
| (30,6) | (4,6) | (21,6) | (96,4) | |
| 20 | 7084 | 6912 | 4394 | 5075 |
| (100) | (47,3) | (42,1) | (24,8) | |
| 40 | 8844 | 8586 | 7431 | 4368,5 |
| (26) | (143,7) | (45,3) | (118,9) | |
| 80 | 10246 | 12510 | 7986 | 7276 |
| (30,7) | (121,8) | (210,3) | (369,5) | |
| 160 | 11311 (247) | 13525 (352,7) |
Myszom wstrzyknięto dootrzewnowo 30 pg EtxB(G33D) w kompletnym adiuwancie Freunda (CFA). Po 10 dniach izolowano krezkowe węzły chłonne. Komórki izolowano i inkubowano przez 4 dni w obecności EtxB, EtxB(G33D) albo rozszczepionych, monomerycznych form tych białek (*), generowanych przez ogrzanie do temperatury 95°C. Proliferację oznaczano przez dodanie 1 pCi (3H)-d-tymidyny w ostatnich 6 godzinach w czwartym dniu. Dane oznaczają średnią ilość impulsów/minutę (cpm) i średnią SEM z trzech równoległych pomiarów na płytkach. Komórki izolowane od myszy nieimmunizowanych dawały < 1500 cpm (dawka 160 pg/ml).
Tabela 2:
Analiza cytokin w hodowlach prowadzonych obecności EtxB albo EtxB(G33D)
| Białko | IL-2 (pg/ml) | IFN-γ (pg/ml) |
| EtxB | 318 | 2700 |
| EtxB(G33D) | 67 | 4068 |
Myszom wstrzyknięto EtxB(G33D) w kompletnym adiutancie Freunda (CFA) i po 10 dniach izolowano krezkowe węzły chłonne. Następnie komórki inkubowano in vitro albo z EtxB albo z EtxB(G33D) i w piątym dniu proliferacji komórek analizowano próbki supernatantów na obecność cytokin.
187 266
Tabela 3:
Apoptoza wywołana połączeniem EtxB-receptor we frakcjonowanych limfocytach
| Komórki | Czas (godziny) | Bez antygenu | EtxB(G33D) | EtxB |
| MLNC | 4 | 0a (8) | 2(0) | 1 (3) |
| 18 | 8(10) | 5(18) | 29 (35) | |
| SPLTC | 4 | 3(7) | 2(6) | 3(5) |
| 18 | 17(5) | 16,5 (12) | 31 (32) | |
| Selekcja negatywna | ||||
| CD4 | 18 | 5(37) | 6(31) | 9(35) |
| CD8 | 18 | 18(11) | 19(15) | 76 (73) |
| Selekcja pozytywna | ||||
| CD4 | 18 | 6 | 4 | 6 |
| CD8 | 18 | 7 | 7 | 60 |
Zmiany morfologiczne w jądrach we frakcjonowanych komórkach CD4 i CD8+ T po 4 i po 18 godzinach inkubacji bez antygenu albo z dodatkiem 80 (ag/ml EtxB lub EtxB(G33D) badano w mikroskopie fluorescencyjnym po barwieniu oranżem akrydynowym. Całkowite MLN pozbawiano komórek adherencyjnych. SPLTC izolowano przez negatywną selekcję na kolumnie wypełnionej perełkami szklanymi powleczonymi mysimi γ-globulinami i antymysią immunoglobuliną królika jako drugim przeciwciałem. Frakcjonowane SPLTC otrzymano po znakowaniu połączeniem: fikoerytryna-antymysie CD4 szczura albo FITC-antymysie CD8a, i po następnej inkubacji z koloidalnymi, supermagnetycznymi mikroperełkami mACS skoniugowanymi z anty-szczurzą IgG kozła (H + L) F(ab')2. Wydzielano je stosując kolumny mini-MACS do otrzymywania zarówno frakcji selekcjonowanych pozytywnie (>99% czystości) jak i negatywnie (>90% czystości) komórek CD4 i CD8+ T. Morfologiczne zmiany w jądrach oznaczano w czasie od 4 do 18 godzin w losowej próbce 200 komórek na jedno traktowanie, jak to jest podane w opisie do fig. 7. Maksymalny procent komórek apoptotycznych pojawił się po 18 godzinach. Dane w nawiasach, tam, gdzie są podane, przedstawiają wyniki z innego, osobnego doświadczenia. Dane dla MLN i SPLTC reprezentują wszystkie cztery doświadczenia.
A - procent komórek apoptotycznych.
187 266
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.
Cena 4,00 zł.
Claims (14)
- Zastrzeżenia patentowe1. Zastosowanie czynnika do produkcji leku do wywoływania zróżnicowanego wpływu na populacje limfocytów, będącego działającym in vivo immunomodulatorem, posiadającym właściwości immunogenne wywierające wpływ na wydarzenia sygnalizacji wewnątrzkomórkowej, w których pośredniczy GM-1, wybranego z grupy obejmującej Etx, Ctx, podjednostkę B Etx, podjednostkę B Ctx, przeciwciała i ich pochodne, przy czym, gdy lek zawiera również, i/lub jest podawany łącznie z determinantą antygenową, czynnik i determinanta antygenowa stanowią oddzielne czynniki aktywne.
- 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wpływ wywierany na wydarzenia sygnalizacji wewnątrzkomórkowej, w których pośredniczy GM-1 wywołany jest czynnikiem mającym aktywność wiązania GM-1.
- 3. Zastosowanie według zastrz. 1 do produkcji leku do leczenia lub zapobiegania chorobie lub chorobom takim jak choroba autoimmunologiczna, białaczka typu T-komórkowego, odrzut przeszczepu, reakcja przeszczepu przeciw gospodarzowi (GVHD).
- 4. Zastosowanie według zastrz. 3 do produkcji leku do szczepienia ssaka.
- 5. Zastosowanie według zastrz. 4 do podawania efektywnej ilości czynnika łącznie z efektywną ilością obcej, niespokrewnionej determinanty antygenowej.
- 6. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, znamienne tym, że determinantę antygenową stanowi antygen własny lub reagujący krzyżowo, alloantygen lub ksenoantygen.
- 7. Kompozycja farmaceutyczna do wywoływania zróżnicowanego wpływu na populacje limfocytów, zwłaszcza do leczenia lub zapobiegania chorobie lub chorobom takim jak choroba autoimmunologiczna, białaczka typu T-komórkowego, odrzut przeszczepu, reakcja przeszczepu przeciw gospodarzowi (GVHD) lub szczepienia ssaka, zawierająca substancję aktywną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik, znamienna tym, że jako substancję aktywną zawiera czynnik będący działającym in vivo immunomodulatorem, posiadającym właściwości immunogenne wywierające wpływ na wydarzenia sygnalizacji wewnątrzkomórkowej, w których pośredniczy GM-1, wybrany z grupy obejmującej Etx, Ctx, podjednostkę B Etx, podjednostkę B Ctx, przeciwciała i ich pochodne, przy czym, gdy kompozycja zawiera również, i/lub jest podawana łącznie z determinantą antygenową, czynnik i determinanta antygenowa stanowią oddzielne czynniki aktywne.
- 8. Kompozycja według zastrz. 7, znamienna tym, że wpływ wywierany na wydarzenia sygnalizacji wewnątrzkomórkowej, w których pośredniczy GM-1, wywołany jest czynnikiem mającym aktywność wiązania GM-1.
- 9. Kompozycja według zastrz. 7 albo 8, znamienna tym, że determinantę antygenową stanowi antygen własny lub reagujący krzyżowo, alloantygen lub ksenoantygen.
- 10. Zastosowanie czynnika wybranego z grupy obejmującej Etx, Ctx, podjednostkę B Etx lub podjednostkę B Ctx do produkcji leku do modulowania odpowiedzi immunologicznej, znamienne tym, że gdy lek zawiera również, i/lub jest podawany łącznie z determinantą antygenową, czynnik i determinanta antygenowa stanowią oddzielne czynniki aktywne.
- 11. Zastosowanie czynnika wybranego z grupy obejmującej Etx, Ctx, podjednostkę B Etx, podjednostkę B Ctx, przeciwciała i ich pochodne, do produkcji leku do modulowania odpowiedzi immunologicznej, znamienne tym, że czynnik posiada aktywność wiązania GM-1,187 266 przy czym, gdy lek zawiera również, i/lub jest podawany łącznie z determinantą antygenową, czynnik i determinanta antygenowa stanowią oddzielne czynniki aktywne.
- 12. Zestaw zawierający co najmniej dwie oddzielne kompozycje farmaceutyczne, znamienny tym, że zawiera co najmniej jedną kompozycję farmaceutyczną do wywoływania zróżnicowanego wpływu na populacje limfocytów, zwłaszcza do leczenia lub zapobiegania chorobie lub chorobom takim jak choroba autoimmunologiczna, białaczka typu T-komórkowego, odrzut przeszczepu, reakcja przeszczepu przeciw gospodarzowi (GVHD) lub szczepienia ssaka, zawierającą substancję aktywną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik, i jako substancję aktywną zawierającą czynnik będący działającym in vivo immunomodulatorem, posiadającym właściwości immunogenne wywierające wpływ na wydarzenia sygnalizacji wewnątrzkomórkowej, w których pośredniczy GM-1, wybrany z grupy obejmującej Etx, Ctx, podjednostkę B Etx, podjednostkę B Ctx, przeciwciała i ich pochodne, przy czym, gdy kompozycja zawiera również, i/lub jest podawana łącznie z determinantą antygenową, czynnik i determinanta antygenowa stanowią oddzielne czynniki aktywne, oraz co najmniej jedną kompozycję zawierającą własną lub reagującą krzyżowo determinantę antygenową
- 13. Zestaw według zastrz. 12, znamienny tym, że wpływ wywierany na wydarzenia sygnalizacji wewnątrzkomórkowej, w których pośredniczy GM-1, wywołany jest czynnikiem mającym aktywność wiązania GM-1.
- 14. Zestaw według zastrz. 12 albo 13, znamienny tym, że determinantę antygenową stanowi antygen własny lub reagujący krzyżowo, alloantygen lub ksenoantygen.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9513733.7A GB9513733D0 (en) | 1995-07-05 | 1995-07-05 | Therapeutic agents |
| PCT/GB1996/001614 WO1997002045A1 (en) | 1995-07-05 | 1996-07-05 | Therapeutic agents and autoimmune diseases |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL324424A1 PL324424A1 (en) | 1998-05-25 |
| PL187266B1 true PL187266B1 (pl) | 2004-06-30 |
Family
ID=10777189
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL96324424A PL187266B1 (pl) | 1995-07-05 | 1996-07-05 | Kompozycja farmaceutyczna do wywoływania zróżnicowanego wpływu na populacje limfocytów, zestaw zawierający co najmniej dwie oddzielne kompozycje farmaceutyczne, zastosowanie czynnika do produkcji leku do wywoływania zróżnicowanego wpływu na populacje limfocytów oraz zastosowanie czynnika Etx, Ctx, podjednostki B Etx lub podjednostki B Ctx do produkcji leku do modulowania odpowiedzi immunologicznej |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6287563B1 (pl) |
| EP (1) | EP0841939B1 (pl) |
| JP (1) | JP4024298B2 (pl) |
| KR (1) | KR100452000B1 (pl) |
| CN (1) | CN1313150C (pl) |
| AT (1) | ATE275968T1 (pl) |
| AU (1) | AU724516B2 (pl) |
| CA (1) | CA2225788C (pl) |
| CZ (1) | CZ298670B6 (pl) |
| DE (1) | DE69633393T2 (pl) |
| DK (1) | DK0841939T3 (pl) |
| ES (1) | ES2229276T3 (pl) |
| GB (1) | GB9513733D0 (pl) |
| HK (1) | HK1006496A1 (pl) |
| HU (1) | HU224248B1 (pl) |
| MX (1) | MX9800241A (pl) |
| NO (1) | NO319747B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ311762A (pl) |
| PL (1) | PL187266B1 (pl) |
| PT (1) | PT841939E (pl) |
| RU (1) | RU2203088C2 (pl) |
| SI (1) | SI0841939T1 (pl) |
| WO (1) | WO1997002045A1 (pl) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9326174D0 (en) * | 1993-12-22 | 1994-02-23 | Biocine Sclavo | Mucosal adjuvant |
| US20010036917A1 (en) * | 1995-07-05 | 2001-11-01 | Williams Neil Andrew | Therapeutic agents |
| US7097845B2 (en) * | 1997-04-23 | 2006-08-29 | Jacob Sten Petersen | Combinations of antigen and mucosal binding component for inducing specific immunological tolerance |
| GB9800487D0 (en) * | 1998-01-09 | 1998-03-04 | Oratol Limited | Therapies |
| GB9801871D0 (en) * | 1998-01-28 | 1998-03-25 | Univ Bristol | Therapies |
| WO1999058145A2 (en) * | 1998-05-08 | 1999-11-18 | University Of Bristol | Immunomodulators for vaccines |
| KR20010043441A (ko) * | 1998-05-08 | 2001-05-25 | 더 유니버시티 오브 브리스톨 | 백신용 면역조절제 |
| CA2391415C (en) * | 1999-11-12 | 2013-08-06 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Methods of treating inflammatory bowel disease using cholera toxin b subunit |
| US7041296B1 (en) | 1999-11-12 | 2006-05-09 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Methods of treating inflammatory bowel disease using cholera toxin B subunit |
| CA2358061A1 (en) * | 2000-09-08 | 2002-03-08 | Stemcell Technologies Inc. | Novel antibody compositions for the negative selection of specific rat leukocyte subsets |
| GB0115382D0 (en) * | 2001-06-22 | 2001-08-15 | Univ Bristol | Mutant |
| US20050084967A1 (en) | 2002-06-28 | 2005-04-21 | Xcyte Therapies, Inc. | Compositions and methods for eliminating undesired subpopulations of T cells in patients with immunological defects related to autoimmunity and organ or hematopoietic stem cell transplantation |
| AU2014216127B2 (en) | 2013-02-14 | 2018-07-12 | Cornell University | Methods to protect against and treat multiple sclerosis |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5571787A (en) * | 1993-07-30 | 1996-11-05 | Myelos Corporation | Prosaposin as a neurotrophic factor |
| US5681571A (en) * | 1993-10-08 | 1997-10-28 | Duotol Ab | Immunological tolerance-inducing agent |
-
1995
- 1995-07-05 GB GBGB9513733.7A patent/GB9513733D0/en active Pending
-
1996
- 1996-07-05 HU HU9900147A patent/HU224248B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-07-05 NZ NZ311762A patent/NZ311762A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-07-05 CA CA2225788A patent/CA2225788C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-05 RU RU98101907/14A patent/RU2203088C2/ru active
- 1996-07-05 SI SI9630697T patent/SI0841939T1/xx unknown
- 1996-07-05 JP JP50492797A patent/JP4024298B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-07-05 WO PCT/GB1996/001614 patent/WO1997002045A1/en active IP Right Grant
- 1996-07-05 PL PL96324424A patent/PL187266B1/pl unknown
- 1996-07-05 PT PT96922162T patent/PT841939E/pt unknown
- 1996-07-05 CN CNB961962585A patent/CN1313150C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-05 ES ES96922162T patent/ES2229276T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-05 KR KR1019970709899A patent/KR100452000B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-07-05 CZ CZ0001298A patent/CZ298670B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-07-05 DE DE69633393T patent/DE69633393T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-05 EP EP96922162A patent/EP0841939B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-05 DK DK96922162T patent/DK0841939T3/da active
- 1996-07-05 AU AU63142/96A patent/AU724516B2/en not_active Expired
- 1996-07-05 AT AT96922162T patent/ATE275968T1/de active
-
1997
- 1997-12-29 US US08/999,458 patent/US6287563B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-01-02 NO NO19980005A patent/NO319747B1/no not_active IP Right Cessation
- 1998-01-07 MX MX9800241A patent/MX9800241A/es active IP Right Grant
- 1998-06-02 HK HK98104738A patent/HK1006496A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Robinson et al. | Oral vaccination of mice against tetanus with recombinant Lactococcus lactis | |
| Tao et al. | Induction of IL-4-producing CD4+ T cells by antigenic peptides altered for TCR binding. | |
| US7790167B2 (en) | Methods and compositions for enhancing immune response and for the production of in vitro Mabs | |
| Kraehenbuhl et al. | Transepithelial transport and mucosal defence II: secretion of IgA | |
| Douce et al. | Mucosal immunogenicity of genetically detoxified derivatives of heat labile toxin from Escherichia coli | |
| AU2006235956B2 (en) | Methods and compositions for enhancing immune response and for the production of in vitro mabs | |
| PL187266B1 (pl) | Kompozycja farmaceutyczna do wywoływania zróżnicowanego wpływu na populacje limfocytów, zestaw zawierający co najmniej dwie oddzielne kompozycje farmaceutyczne, zastosowanie czynnika do produkcji leku do wywoływania zróżnicowanego wpływu na populacje limfocytów oraz zastosowanie czynnika Etx, Ctx, podjednostki B Etx lub podjednostki B Ctx do produkcji leku do modulowania odpowiedzi immunologicznej | |
| US20140322274A1 (en) | Therapeutic Agents | |
| TW202039587A (zh) | 供合成胜肽免疫原作為免疫刺激劑的人工混雜t輔助細胞抗原決定位 | |
| CN109758575B (zh) | 充分多样的双亲性mhc ii结合多肽、免疫载体微球及其制备方法和应用 | |
| Cohen et al. | Immune response genes have a variable influence on the selection of antigenic foreign and self determinants of insulin. | |
| Hisatsune et al. | CD8+ T cells specific to the exogenous antigen. Mode of antigen recognition and possible implication in immunosuppression. | |
| Calvert et al. | Immunoglobulin D—antibody or receptor? Part II. Functional aspects | |
| RU2214271C2 (ru) | Способ применения zot или зонулина для ингибирования антиген-специфической пролиферации лимфоцитов | |
| Samodal et al. | Immunomodulatory Effects by a Heat Shock Protein dnaJ-Derived Peptide in Rheumatoid Arthritis | |
| Mackewicz | Molecular and cellular features governing T cell responsiveness to a defined protein antigen | |
| CA2131898A1 (en) | Methods and compositions for the modulation of host immune response to allergens |