KR19990028578A - 자가면역 질환용 치료제 - Google Patents
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Abstract
(i) 본 발명은 Ctx 또는 Etx, 또는 Ctx 및 Etx의 B 서브유니트외에, GM-1 결합 활성을 갖는 제제; 또는
(ii) GM-1 매개된 세포내 시그널링 작용에 영향을 미치나, GM1- 결합 활성은 없는 제제를 자가면역 질환의 치료 또는 예방용 제제로 사용하는 방법을 개시한다.
이들 제제는 인체 T 세포 백혈병의 치료, 이식 거부반응 또는 GVHD의 예방, 또는 포유류 검체를 백신 면역시키기 위한 백신 접종에 사용할 수 있다.
Description
문헌[챠알스 오. 엘손등, "Morphologic and Functional Alterations of Mucosal T Cells by Cholera Toxin and its B subunit", The Journal of Immunology, 1995, 154; 1032-1040]에서는 콜레라 독소(Ctx) 및 이 CtxB 서브유니트가 CD8+및 CD4+T 세포를 억제한다는 것을 개시하고 있다.
또다른 참고문헌으로서 문헌[비.양켈레비치 등, "Prevention of Acute Graft-Versus-Host Disease by Treatment with a Novel Immunosuppressant", The Journal of Immunology, 1995, 154:3611-3617]이 있다. 이 문헌에서는 급성 이식편 대 숙주 질환(GVHD)을 예방하기 위해 골수 이식에 사용하기 위한 제제로서 CtxB를 개시하고 있다.
WO 95/10301호는 특정 톨레로겐에 결합된 점막-결합 분자를 함유하는 면역학적 관용-유도제를 개시하고 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "Ctx"라는 용어는 콜레라 독소를 의미하고 "CtxB"는 이 콜레라 독소의 B 서브유니트를 의미한다. 다른 문헌들에서는, 이 용어들은 때로 각각 "CT" 또는 "Ct" 및 "CTB" 또는 "CtB"라고 표시되기도 한다. 본원에서 "Etx" 라는 용어는 이,콜리 열 불안정성 내독소를 의미하고, "EtxB"는 Etx의 B 서브유니트이다. 이 용어들은 다른 문헌에서 각각 "LT" 또는 "Lt" 및 "LTB" 또는 "LtB"라고 표시되기도 한다.
본 발명은 포유류, 특히 인간의 자가면역 질환을 치료하는데 사용하기 위한 치료제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 인체 이식 거부 반응 및 이식편 대 숙주 질환(GVHD)의 예방에 사용하기 위한 제제로서, 그리고 소위 "백신 캐리어"로서 T 세포 기원의 인체 백혈병 치료에 유용한 치료제에 관한 것이다.
도 1은 EtxB 및 EtxB의 변형(EtxB(G33D))의 생리화학적 특성의 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 EtxB에 의한 수용체 결합이 생체 내에서 그의 유효 면역원성에 필수적임을 나타내는 도면이다.
도 3은 EtxB를 마우스에게 주사한 후, 림프구 증식의 역학을 나타내는 도면이다.
도 4는 EtxB가 B 세포의 증가된 활성화를 야기시킴을 나타내는 도면이다.
도 5는 EtxB가 CD4+T 세포의 증가된 활성화 및 CD8+세포의 고갈을 야기시킴을 나타내는 도면이다.
도 6은 EtxB에 의한 OVA-반응성 CD8+T 세포의 선택성 고갈을 나타내는 도면이다.
도 7은 EtxB에 의한 수용체 결합이 세포소멸을 수행하는 세포의 림프구 핵 형태 특성의 변경을 유도함을 나타내는 도면이다.
도 8은 세포 주기 분석에 의해 측정된 바와 같이 CD8+T 세포의 EtxB 수용체-매개된 세포소멸을 나타내는 도면이다.
도 9a 및 9b는 EtxB에 의한 GM-1 결합이 동물 모델에서 콜라겐 유도된 관절염의 진전을 억제하는 것을 나타내기 위해 수행한 실험 결과는 나타내는 도면이다.
도 10은 EtxB(EtxB(G33D)는 아님)가 정상적인 인간 말초 혈액 단핵 세포 군집에서 세포사멸을 유도하는 것을 예시하기 위해 수행한 실험 결과를 나타내는 도면이다.
도 11은 GM-1의 교차 결합이 설치류 CTLL 세포 부분에서 세포소멸을 유도하는 것을 예시하는 실험의 결과는 나타내는 도면이다.
발명의 상세한 설명
도 1
EtxB 및 EtxB(G33D)의 생리 화학적 특성의 분석
(A) EtxB 및 EtxB(G33D)의 SDS-PAGE 분석: 각 단백질 5 ㎍은 전 가열을 수행하거나 수행하지 않고 β-메르캅토에탄올의 존재하의 환원 조건하에서 분석하였다. 1 레인: 야생형 EtxB, 가열하지 않음. 2레인: EtxB(G33D), 가열하지 않음. 3 레인: 야생형 EtxB, 95℃에서 가열함. 4 레인: EtxB(G33D), 95℃에서 가열함. 분자량 표준물(바이오 라드)은 패널의 좌측에 나타냈다.
(B) 겔 여과 크로마토그래피에 의한 EtxB 및 EtxB(G33D)의 겉보기 분자량의 측정: 표준 곡선(○)은 상단으로부터 하단으로 소 혈청 알부민(66 kDa), 암탉 난 알부민(45 kDa), 소 적혈구 탄산 탈수 효소(29kDa) 및 말 심장 시토크롬 c(12.4 kDa)를 이용하여 나타냈으며; EtxB 및 EtxB(G33D)는 각각 겉보기 분자량 36 kDa 및 38 kDa로 용출되었다. Ve는 상기 단백질의 용출 부피이며, Vo는 상기 겔 여과 칼럼의 공극 부피이다.
(C) 강글리오사이드(ganglioside) GM1에 대한 EtxB 및 EtxB(G33D)의 비교 결합을 위한 ELISA: 평판은 GM1로 코팅하고, 차단하고, 1 ㎍/㎖로부터 연속적으로(3배) 희석한 EtxB 또는 EtxB(G33D) 1 ㎍/㎖와 함께 배양하였다.
도 2
EtxB에 의한 수용체 결합은 생체 내에서 그의 유효 면역원성에 필수적이다.
BALB/c 마우스(각 그룹당 4마리)는 PBS 내의 EtxB 또는 EtxB(G33D)로 피하 주사하거나 중탄산나트륨 내의 상기 단백질을 경구 투여하였다. 2회 피하 주사하고 10일이 경과된 후(A) 또는 3회 경구 투여하고 1주일이 경과한 후(B) 혈청을 분석하였으며, 소화관 분비물은 3회 경구 투여하고 1주일이 경과한 후(C) 분석하였다. 대조용 마우스로부터 취한 샘플에서 반응은 검출되지 않았다(자료는 나타내지 않음). 결과는 혈청 내의 평균 IgG 항체 역가로 나타냈으며, 소화관 분비물 내의 IgA는 후술하는 바와 같이 "특이 활성"으로 나타냈다.
도 3
림프구 증식의 역학
마우스에게 프로인트 완전 보조제내의 EtxB(G33D) 30 ㎍을 복강내 주사하였다. MLNs는 10일후 분리하였으며, 세포는 항원(□)의 부재 또는 EtxB(▲), EtxB(G33D)(△) 80 ㎍/㎖ 또는 95℃에서 가열하여 생성된 EtxB(●) 및 EtxB(G33D)(○)의 분리된 단량체 형태의 존재 하에서 배양하였다. 각 샘플 채취일의 말미 6 시간에 세포에게 (3H)Thd 1 μCi로 펄스를 가하였다. 자료는 3개의 웰에서 측정한 평균 cpm 및 SEM으로 나타냈다.
도 4
EtxB는 B 세포의 증가된 활성화를 야기시킨다.
마우스는 프로인트 완전 보조제 내의 EtxB(G33D)으로 면역화하였다. 세포는 10일 후에 MLN으로부터 분리하고, EtxB 또는 EtxB(G33D) 80 ㎍/㎖ 또는 각각의 단백질 40 ㎍/㎖의 혼합물의 존재 하에서 배양하였다. 세포는 비오티닐화된 항-CD5(7D4) 및 피코에리트린(PE) 항-B220(Ra3-6D2)으로 표지하였다. 스트렙타비딘 FITC는 제 2 항체 복합체로 사용하였다. 또한, 항체를 위한 대조군도 포함시켰다(자료는 나타내지 않음). 이중 유동 세포계측법은 증식 4일째에 수행하였다.
도 5
EtxB는 CD4
+
T 세포의 증강된 활성화 및 CD8
+
T 세포의 고갈을 야기시킨다.
면역화 방법, 세포 분리 및 시험관내 항원 투여는 도 4의 설명부분에 기술된 바와 같이 수행하였다. CD25를 검출하기 위해, 비오티닐화된 항-CD25(7D4) 및 스트렙타비딘 FITC를 사용하였다. CD4 및 CD8을 검출하기 위해, FITC 표지된 항-CD4(RNRM4-5) 및 FITC 표지된 항-CD8α(53-6.7)을 사용하였다. 상기 항체를 위한 적합한 대조용은 포함시켰다(자료는 나타내지 않음).
도 6
EtxB에 의한 OVA-반응성 CD8
+
T 세포의 선택적 고갈
OVA-항원 자극된 마우스로부터 유래한 MLN으로부터 취한 세포 배양물은 항원의 부재 또는 OVA + EtxB, OVA + EtxB(G33D) 또는 OVA만의 존재 하에서 5일 동안 유지하였는데, OVA의 양은 100 ㎍, EtxB 또는 EtxB(G33D) 각각의 양은 40 ㎍/㎖였고, OVA 단독으로 사용할 때 그 양은 100 ㎍이었다. 세포는 하기 하는 쥐 항체로 표지하였다: FITC-항-CD4 또는 FITC-항-CD8α 및 비오틴-항-CD25(IL-2Rα)에 이은 스트렙타비딘-피코에리트린. 비-염색된 세포 또는 제 2 항체만으로 염색된 세포도 대조용으로 포함시켰다. 세포는 FACS(벡톤 디킨슨)로 분석하였다. 기타 처리에 비해 EtxB를 함유하는 배양물 내의 CD25+인 전체 세포의 비율에 따른 더 높은 증가는 이러한 마커를 발현하는 B 세포의 더 높은 비율에 기인한다(자료는 나타내지 않음). 형광 세기의 크기는 로그로 나타냈다.
도 7
EtxB에 의한 수용체 결합은 세포소멸을 수행하는 세포의 림프구 핵 형태 특성의 변경을 유도한다.
＞90% CD3+T 세포를 포함하고, 거식 세포가 고갈된 MLNC는 EtxB 80 ㎍/㎖ 또는 EtxB(G33D) 80 ㎍/㎖과 함께 18 시간 동안 배양하고, 아크리딘 오렌지로 염색하였다. 세포는 통상적인 또는 공초점 형광 현미경(라이카 TCS 4D)으로 조사하였다. 각각의 처리에 대한 대표적인 현미경 시야(x540)를 나타냈다(EtxB, 좌측 패널; EtxB(G33D), 우측 패널). 항원 부재 하에서 배양된 세포는 EtxB(G33D)로 처리한 세포와 유사한 결과를 나타냈다(자료는 나타내지 않음).
도 8
세포 주기 분석에 의해 측정한 바와 같이 CD8
+
T 세포의 EtxB 수용체-매개된 세포소멸
세포 주기의 서브 G0/G1기에서 CD4+및 CD8+SPLTC의 비율은 요오드화 프로피듐을 이용한 염색 후에 DNA 함량의 유동 세포 측정법에 의해 측정하였다. SPLTC는 상기한 바와 같은 음성 선택에 의해 비장으로부터 분리하였다. 상기 세포는 (a) 항원 없이, (b) EtxB(G33D) 80 ㎍/㎖ 또는 (c) EtxB 80 ㎍/㎖로 18 시간 동안 처리한 후, FITC-쥐 항-CD4 또는 FITC-쥐 항-CD8α를 이용하여 염색하였다. 상기 세포는 요오드화 프로피듐으로 후속 염색하였다. 요오드화 프로피듐으로 동시 염색된 세포의 비율은 항-CD4 또는 항-CD8 항체로 염색된 세포에 대해 게이팅(gating) 하므로써 측정하였다. 본 실험은 세포에 대해 수행하였으며, 그 결과는 도 7 및 표 3에 나타냈다.
본 발명의 모든 양태들은 EtxB(이.콜리 열 불안정성 내독소의 순수한 B 서브유니트)가 포유류 세포의 표면에서 발견되는 GM1-강글리오사이드 수용체에 결합하고, 이러한 결합이 CD8+T 세포의 특이적인 고갈 및 이와 관련된 B 세포의 활성화를 비롯하여 림프구 개체들에 대한 차등 효과를 유도한다는 발견에 근거를 두고 있다. 이러한 효과는 GM1 결합 활성이 결실된 변종 EtxB 단백질을 이용하는 경우에는 나타나지 않는다.
자가면역 질환
자가면역은 체내의 자가 항원에 의해 면역 반응이 발생하는 기작을 나타내는데 사용하는 용어이다.
본 발명의 제 1목적에 따르면, 자가면역 질환의 치료나 예방의 제제로서 사용하기 위한 (i) Ctx나 Etx, 또는 Ctx와 Etx의 B 서브유니트이외의 다른 GM-1 결합 활성을 가진 제제; 또는 (ii) GM-1 결합 활성을 가지고 있지 않은 GM-1 매개의 세포내 시그널링 작용에 영향을 미치는 제제를 제공한다.
본 발명에 따른 제제는 CD8+T 세포 소멸 유도, CD4+세포의 활성화 증가 및 B 세포의 폴리클로널 활성화를 유도하는 림프구 개체를 조절하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 작용은 면역 반응을 Th2 결합된 시토킨의 유도 반응쪽으로 이동시킬 가능성이 있다. 이러한 자가 또는 교차 반응성 항원에 대한 반응이 특정 자가면역 질환에 대한 보호반응을 매개하는 것으로 생각된다.
이러한 본 발명의 제 1 목적에 대한 제 1 양태에 있어서, 상기 제제는 진행중에 있는 자가면역 질환을 치료하는 방법에 사용된다. 이 양태에 있어서, 상기 제제는 자가 항원이나 교차 반응성 항원과 함께 또는 단독으로 환자에게 투여된다. 본 발명의 제 1 목적의 제 1 양태에 따라 제제를 투여하면 자가-항원쪽으로의 면역 반응의 성질을 조절하여 질환 유발성 염증의 활성화가 일어나지 않도록 하며, 이에 따라 자가면역 질환을 예방한다.
본 발명의 제 1 목적에 대한 제 2 양태에 있어서, 제제는 자가면역 질환에 대하여 포유류 검체를 "백신화"하는 방법에 사용되며, 이 때 제제는 상기 질환과 관련된 자가 항원 결정인자 또는 교차 반응성 항원 결정인자(또는 여러 자가 또는 교차 반응성 항원 결정인자의 조합물)와 함께 동시투여한다. 이러한 방법에서, 검체의 자가 항원이나 교차 반응성 항원에 대한 면역 반응은 병원론이 활성화되지 않게 전환되고, 따라서 자가 항원에 대한 미래의 자가면역 반응을 예방한다.
이러한 본 발명의 제 1 목적에 있어서, 검체에게 치료제 및 자가 또는 교차 반응성 항원 결정인자를 동시 투여하거나 동시 투여할 수도 있다. 이에 따라, 치료제와 항원 결정인자 각각의 투여 부위와 시간은 필요로 되는 면역계의 조절이 얻어지는 정도이다. 따라서, 치료제와 항원 결정인자는 동시에 동일한 부위로 투여할 수 있지만, 항원 결정인자와는 다른 시간과 다른 부위에 치료제를 투여하는 것이 유리할 수도 있다.
또한, 치료제와 항원 결정인자의 단독 투여량이 만족스러울 수 있지만, 복수 투여량도 상기 본 발명의 목적의 영역에 포함되는 것이다.
본 발명의 제 1 목적의 제 2 양태에 있어서, 치료제와 항원 결정인자는 예컨대 공유 결합과 같이 결합되어 단독 활성제를 형성할 수 있지만, 치료제와 항원 결정 인자를 결합시킴이 없이 별도 투여하는 것이 다른 성분들의 분리 투여가 가능해지기 때문에 바람직하다.
본 발명의 이러한 양태에 따라 치료될 수 있는 구체적인 자가면역 질환은 병변이 세포-매개 면역과 연관된 자가면역 질환으로서, 예컨대 류마티스양 관절염, 다발성 동맥경화증 및 당뇨병이 있다.
또한, 본 발명의 제 1 목적하에서 자가면역 질환을 예방하기 위한 제제로서 사용하기 위한 약제 제조에 있어서 Ctx, Etx 또는 Ctx나 Etx의 B 서브유니트의 용도도 제공된다.
또, (i) GM-1 결합 활성을 가진 제제; 또는 (ii) GM-1 결합 활성은 갖지 않으나 GM-1 매개의 세포내 시그널링 작용에 영향을 미치는 제제, 및 이의 약학적 허용성 담체 또는 희석제를 함유하는, 인체 자가면역 질환 치료용 약학 조성물도 제공한다.
이러한 목적의 본 발명의 약학 조성물은 점막 경로로 투여할 수 있도록, 예컨대 비측 분무액으로서 조제하거나, 또는 조성물을 예컨대 정맥내, 근육내 또는 경피 경로로 투여할 수 있도록 주사용 형태로 조제하여 비경구적으로 투여할 수 있도록 조제할 수 있다.
이러한 약학 조성물은 적절한 자가 또는 교차 반응성 항원과 함께 조제될 수 있다. 또는, 치료제와 항원 결정인자를 각각 별도의 조성물로 함유하는 키트를 제공할 수도 있다.
이러한 양태의 본 발명에 사용할 수 있는 구체적인 치료제는 GM1 결합 활성을 보유하는 EtxB 및 CtxB 또는 이의 변종이다.
본 발명의 제 1 목적에 사용하기 위한 제제는 본질적으로 비독성인 것이 바람직하지만, 이러한 유형의 중증 치료시에는 약간의 독성은 허용될 수 있다.
이와 같은 본 발명의 제 1 목적은 포유류 자가면역 질환을 치료하는데 사용하기 위한 GM1 결합 활성을 가진 모든 제제, 뿐만 아니라 GM-1 매개의 세포내 시그널링 작용에 영향을 미치고, 따라서 GM-1 결합 제제와 유사한 제제의 사용을 포함한다.
따라서, 이러한 본 발명의 제 1 목적은 인체 자가면역 질환의 치료에 치료제로서 EtxB 단백질의 사용에 제한되는 것은 아니다. 그러나, 상기 치료 용도에 EtxB 단백질(5개의 동일한 서브유니트들의 5량체임)의 사용은 본 발명의 바람직한 양태를 나타내는 것이다. 야생형 EtxB 외에도, 또한 본 발명의 바람직한 양태는 GM-1 결합 활성을 가진 EtxB의 변종 뿐만 아니라 이와 등가의 다른 단백질, 예컨대 콜레라 독소 B 서브유니트(CtxB) 및 GM1 결합 활성을 가진 이것의 변종도 포함한다.
본 발명의 제 1 목적에 따라 자가면역 질환 치료에 사용하기 위한 기타 다른 치료제는 GM1에 결합하는 인체화된 모노클로널 항체이다. 이러한 제제를 동정하고 제제하는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.
T-림프구 백혈병
본 발명의 제2목적에 따르면, T 세포 기원의 인체 백혈병, 예컨대 CD8 T 세포 기원의 인체 백혈병의 치료에 사용하기 위한 (i) Ctx나 Etx, 또는 Ctx와 Etx의 B 서브유니트이외의 다른 GM-1 결합 활성을 가진 제제; 또는 (ii) GM-1 결합 활성을 가지고 있지 않은 GM-1 매개의 세포내 시그널링 작용에 영향을 미치는 제제를 제공한다.
본 발명의 제 2 목적에 사용하기 위한 제제는 본질적으로 비독성인 것이 바람직하지만, 이러한 유형의 중증 치료시에는 약간의 독성은 허용될 수 있다.
또한, 본 발명의 제 2 목적하에서 CD8 T 세포 기원의 인체 백혈병과 같은 T 세포 기원의 인체 백혈병을 치료하기 위한 약제의 제조에 Ctx, Etx 또는 Ctx나 Etx의 B 서브유니트의 용도도 제공된다.
또, (i) GM-1 결합 활성을 가진 제제; 또는 (ii) GM-1 결합 활성은 갖지 않으나 GM-1 매개의 세포내 시그널링 작용에 영향을 미치는 제제, 및 이의 약학적 허용성 담체 또는 희석제를 함유하는, T 세포 기원 인체 백혈병의 치료를 위한 약학 조성물도 제공한다.
이러한 목적의 본 발명의 약학 조성물은 점막 경로로 투여할 수 있도록, 예컨대 비측 분무액으로서 조제하거나, 또는 조성물을 예컨대 정맥내, 근육내 또는 경피 경로로 투여할 수 있도록 주사용 형태로 조제하여 비경구적으로 투여할 수 있도록 조제할 수 있다.
이와 같은 본 발명의 제 2 목적은 T 세포 기원의 인체 백혈병을 치료하는데 사용하기 위한 GM1 결합 활성을 가진 모든 제제, 뿐만 아니라 GM-1 매개의 세포내 시그널링 작용에 영향을 미치고, 따라서 GM-1 결합 제제와 유사한 제제의 사용을 포함한다.
따라서, 이러한 본 발명의 제 2 목적은 인체 T 세포 백혈병의 치료에 치료제로서 EtxB 단백질의 사용에 제한되는 것은 아니다. 그러나, 상기 치료 용도에 EtxB 단백질의 사용은 본 발명의 바람직한 양태를 나타내는 것이다. 야생형 EtxB 외에도, 또한 본 발명의 바람직한 양태는 GM-1 결합 활성을 가진 EtxB의 변종 뿐만 아니라 이와 등가의 다른 단백질, 예컨대 콜레라 독소 B 서브유니트(CtxB) 및 GM1 결합 활성을 가진 이것의 변종도 포함한다.
본 발명의 제 2 목적에 따라 자가면역 질환 치료에 사용하기 위한 기타 다른 치료제는 GM1에 결합하는 인체화된 모노클로널 항체이다. 이러한 제제를 동정하고 제제하는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.
이식 거부 반응 및 GVHD
본 발명의 제 3 목적에 따르면, 이식 거부 반응이나 GVHD를 예방/치료하기 위한 치료제로서 사용하기 위한 (i) Ctx나 Etx, 또는 Ctx와 Etx의 B 서브유니트이외의 다른 GM-1 결합 활성을 가진 제제; 또는 (ii) GM-1 결합 활성을 가지고 있지 않은 GM-1 매개의 세포내 시그널링 작용에 영향을 미치는 제제를 제공한다.
또한, 본 발명의 제 3 목적하에서 기관 이식 거부 반응이나 GVHD를 예방하기 위한 약제 제조에 있어서의 Ctx, Etx 또는 Ctx나 Etx의 B 서브유니트의 용도도 제공된다.
이러한 본 발명의 목적의 바람직한 양태에 있어서, 기재된 치료제는 동종원성이나 이종원성의 중실 기관 이식 거부 반응의 예방에 사용할 수 있다. 또한, 예컨대 골수 이식 과정동안 급성 이식편 대 숙주 질환(GVHD)의 예방에 사용할 수도 있다.
이러한 본 발명의 목적의 양태들에 있어서, 이식 이전에 환자에게 처치하는 경우에 상기 치료제는 동종항원이나 이종항원과 동시 투여될 수 있다, 또한, 이식 후 환자에게 처치하는 경우에는 치료제는 항원을 동시 투여함이 없이 이용한다.
이러한 본 발명의 목적을 달성하는 양태에 있어서, 치료제와 동종 항원 결정인자 또는 이종 항원 결정 인자를 검체에게 동시 투여하는 경우에, 치료제와 항원 결정인자 각각의 투여 부위와 시간은 필요로 되는 면역계의 조절이 얻어지는 정도이다. 따라서, 치료제와 항원 결정인자는 동시에 동일한 부위로 투여할 수 있지만, 항원 결정인자와는 다른 시간과 다른 부위에 치료제를 투여하는 것이 유리할 수도 있다. 또한, 치료제와 항원 결정인자는 예컨대 공유 결합과 같이 결합되어 단독 활성제를 형성할 수 있지만, 치료제와 항원 결정 인자를 결합시킴이 없이 별도 투여하는 것이 다른 성분들의 분리 투여가 가능해지기 때문에 바람직하다.
또한, 치료제와 항원 결정인자의 단독 투여량이 만족스러울 수 있지만, 복수 투여량도 상기 본 발명의 목적의 영역에 포함되는 것이다.
이러한 본 발명의 목적에 있어서, 제제가 GVHD의 예방에 사용되는 경우에, 제제는 일반적으로 이식될 세포, 예컨대 골수 세포에 직접 투여하는 것도 가능하다.
본 발명의 제 3 목적에 사용하기 위한 제제는 본질적으로 비독성인 것이 바람직하지만, 이러한 유형의 중증 치료시에는 약간의 독성은 허용될 수 있다.
또한, (i) GM-1 결합 활성을 가진 제제; 또는 (ii) GM-1 결합 활성은 갖지 않으나 GM-1 매개의 세포내 시그널링 작용에 영향을 미치는 제제, 및 이의 약학적 허용성 담체 또는 희석제를 함유하는, 이식 거부 반응의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물도 제공한다.
이러한 목적의 본 발명의 약학 조성물은 점막 경로로 투여할 수 있도록, 예컨대 비측 분무액으로서 조제하거나, 또는 조성물을 예컨대 정맥내, 근육내 또는 경피 경로로 투여할 수 있도록 주사용 형태로 조제하여 비경구적으로 투여할 수 있도록 조제할 수 있다.
이러한 약학 조성물은 적절한 동종- 또는 이종-항원 결정인자와 함께 조제될 수 있다. 또는, 치료제와 항원 결정인자를 각각 별도의 조성물로 함유하는 키트를 제공할 수도 있다.
이와 같은 본 발명의 제 3 목적은 이식 거부 반응이나 GVHD의 예방/치료에 사용하기 위한 GM1 결합 활성을 가진 모든 제제, 뿐만 아니라 GM-1 매개의 세포내 시그널링 작용에 영향을 미치고, 따라서 GM-1 결합 제제와 유사한 제제의 사용을 포함한다.
따라서, 이러한 본 발명의 제 3 목적은 이식 거부 반응의 치료에 치료제로서 사용하기 위한 EtxB 단백질의 용도에 제한되는 것은 아니다. 그러나, 상기 치료 용도에 EtxB 단백질(5개의 동일한 서브유니트들의 5량체임)의 사용은 본 발명의 바람직한 양태를 나타내는 것이다. 야생형 EtxB 외에도, 또한 본 발명의 바람직한 양태는 GM-1 결합 활성을 가진 EtxB의 변종 뿐만 아니라 이와 등가의 다른 단백질, 예컨대 콜레라 독소 B 서브유니트(CtxB) 및 GM1 결합 활성을 가진 이것의 변종도 포함한다.
본 발명의 제 3 목적에 따라 이식 거부 반응의 치료에 사용하기 위한 기타 다른 치료제는 GM1에 결합하는 인체화된 모노클로널 항체이다. 이러한 제제를 동정하고 제제하는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.
백신접종
CtxB와 EtxB는 소위 "백신 캐리어"로서 이미 제안된 바 있다. 본 발명자들은 이러한 작용의 근거가 부분적으로 GM-1 수용체에 대한 결합에 의해 림프구 개체(전술한 것)를 조절하는 EtxB의 작용에 의한 것이라는 것을 발견하였다.
따라서, 이러한 본 발명의 제 4 목적으로서, 포유류 검체의 백신 접종 사용하기 위한 (i) Ctx나 Etx, 또는 Ctx와 Etx의 B 서브유니트이외의 다른 GM-1 결합 활성을 가진 제제; 또는 (ii) GM-1 결합 활성을 가지고 있지 않은 GM-1 매개의 세포내 시그널링 작용에 영향을 미치는 제제를 제공한다.
이 제제는 관련이 없는 이종 항원 결정인자와 함께 투여되는 경우 면역 반응을 조절할 수 있다. 이 제제를 비경구적으로 투여하는 경우에, 이러한 면역조절성이란 특정한 목적 방향으로 면역 반응이 지향성인 것을 의미한다. 이 제제를 소위 "점막 보조제"로서 관련이 없는 항원과 함께 점막으로 투여하는 경우에, 이 제제는 무관련 항원에 대한 점막의 면역 반응을 용이하게 할 수 있다. 이 항원과 제제는 별도 성분으로서 함께 투여하거나, 예컨대 공유 결합에 의해 함께 결합시킬 수도 있다.
제제는 비독성인 것이 바람직하다. 또한, 제제를 위장 점막을 통해 점막 투여해야만 하는 경우에, 제제는 위장관을 통해 이동하는 동안에도 안정성을 유지할수 있어야만 한다; 예컨대, 제제는 단백분해성 분해에 내성이 있고, 산 pH에도 안정해야 하며 담즙의 계면활성 작용에도 내성이 있어야 한다.
또한, (i) GM-1 결합 활성을 가진 제제; 또는 (ii) GM-1 결합 활성은 갖지 않으나 GM-1 매개의 세포내 시그널링 작용에 영향을 미치는 제제, 및 이의 약학적 허용성 담체 또는 희석제를 함유하는, 포유류 검체의 백신 접종에사용하기 위한 약학 조성물도 제공한다.
이러한 목적의 본 발명의 약학 조성물은 점막 경로로 투여할 수 있도록, 예컨대 비측 분무액으로서 조제하거나, 또는 조성물을 예컨대 정맥내, 근육내 또는 경피 경로로 투여할 수 있도록 주사용 형태로 조제하여 비경구적으로 투여할 수 있도록 조제할 수 있다.
이러한 약학 조성물은 적절한 항원 결정인자와 함께 조제될 수 있다. 또는, 치료제와 항원 결정인자를 각각 별도의 조성물로 함유하는 키트를 제공할 수도 있다.
이와 같은 본 발명의 제 4 목적은 면역조절제로서 GM1 결합 활성을 가진 모든 제제, 뿐만 아니라 GM-1 매개의 세포내 시그널링 작용에 영향을 미치고, 따라서 GM-1 결합 제제와 유사한 제제의 사용을 포함한다.
따라서, 이러한 본 발명의 제 4 목적은 면역조절제로서의 EtxB 단백질의 용도에만 제한되는 것은 아니다. 즉, 상기 치료 용도에 EtxB 단백질(5개의 동일한 서브유니트들의 5량체임)의 사용은 본 발명의 바람직한 양태를 나타내는 것이다. 야생형 EtxB 외에도, 또한 본 발명의 바람직한 양태는 GM-1 결합 활성을 가진 EtxB의 변종 뿐만 아니라 이와 등가의 다른 단백질, 예컨대 콜레라 독소 B 서브유니트(CtxB) 및 GM1 결합 활성을 가진 이것의 변종도 포함한다.
본 발명의 제 4 목적에 따라 면역조절제로서 사용하기 위한 기타 다른 치료제는 GM1에 결합하는 인체화된 모노클로널 항체이다. 이러한 제제를 동정하고 제제하는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.
본 발명의 치료제가 EtxB 서브유니트 또는 CtxB 서브유니트와 같은 단백질인 경우에, 상기 본 발명의 모든 목적에 사용하기 위한 본 발명의 제제는 이 단백질을만드는 특정 폴리펩티드 쇄(들)를 암호하는 유전자(들)를 적합한 벡터에 삽입한 다음, 이를 사용하여 적합한 숙주를 형질감염시키는 방법으로 생산할 수 있다. 예컨대, EtxB를 어셈블리하는 폴리펩티드 쇄를 암호하는 유전자는 예컨대 플라스미드 pMMB68에 삽입된 다음, 이를 사용하여 비브리오 종 60과 같은 숙주 세포를 형질감염시킬 수 있다. 그 다음 단백질은 당해 기술분야에 공지된 방법으로 정제 및 분리한다. 이러한 야생형 유전자를 사용하여 공지의 방법으로 활성 돌연변이 EtxB 단백질을 발현하는 돌연변이 유전자도 생산할 수 있다.
전술한 바와 같이, 예컨대 특이적으로 고안된 인체화된 모노클로널 항체와 같이 GM-1 결합 활성을 가진 제제는 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 전술한 바와 같이 고안되어 생산할 수 있다.
또한, 본 발명의 모든 양태들에서 GM1 결합 활성을 가진 제제는 GM1 수용체에 교차 결합할 수 있다. EtxB는 그 5량체 형태로 인하여 GM1 수용체에 교차 결합할 수 있는 하나의 제제이다.
본 발명은 첨부되는 도면과 하기 실시예를 참고로 하여 구체적으로 예시될 것이다.
실시예 1
본 실시예는 림프구 군집에 대한 차등 효과를 유도하는 GM-1 결합의 필요성을 예시한다.
재료 및 방법
EtxB의 수용체 결합 변종의 생성
Gly-33의 Asp로의 치환은 Etx의 A- 및 B- 서브유니트를 위한 유전자를 함유하는 파지미드 벡터 피블루스크립트 IIKS+의 유도체인 플라즈미드 pTRH29를 이용하여 인체 EtxB의 수용체 결합 부위 내로 도입하였다[참조: Yu, J., Webb, H. & Hirst, T.R., Molec. Microbiol. 6, 1949-1958 (1992)]. 돌연변이 유발은 주형으로서 일본쇄 pTRH29를 이용하고, 돌연변이 유발성 프라이머로서 합성 올리고뉴클레오티드(5'-TCTCTTTTATCTGCCATCG-3')(영국, 캠브리지 리서치 스테이션, IAPGR, 마이크롤어낼리티칼 퍼실리티에서 제조됨)을 이용하는 시험관내 올리고뉴클레오티드-유도된 돌연변이 유발 키트(아메르샴 인터내쇼날)를 이용하여 수행하였다. 정확한 글리신 대 아스파르트산 치환은 시퀘나제 II(유나이티드 스테이츠 바이오케미칼 코오포레이숀)를 이용하는 디데옥시 서열결정법으로 확인하였으며, 생성된 플라즈미드는 pTHR56으로 지칭하였다. pTHR로부터 취한 변종 EtxB 유전자는 EcoRI 및 SpeI 제한 효소를 이용하여 절단하였으며, pMMB68 내로 삽입[참조: Sandvist, M., Hirst, T.R. & Bagdasarian, M. J. Bacteriol. 169, 4570-4576 (1987)]하여 EtxB(G33D)를 발현하는 넓은 숙주 범위의 벡터 pTHR64를 생성하였다.
야생형 EtxB 및 EtxB(G33D)는 각각 비브리오 에스피.60(pMMB64) 및 비브리오 에스피.60(pTRH64)의 배양 상등액으로부터 Amin과 Hirst에 의해 보고된 방법을 변경하여 정제하였다[참조: Amin, T. 및 Hirst, T.R., Prot. Express. and Purif. 5, 198-204 (1994)]. 개략적으로 단백질은 한외여과 및 소수성 상호작용 크로마토그래피로 정제하고, 음이온-교환 크로마토그래피로 농축하였다. 상기 단백질 용액은 인산염 완충처리된 염수(PBS; 10mM 인산 나트륨, 150mM 염화 나트륨, pH 7.4)로 평형처리된 PD10 칼럼(파마시아)에서 탈염하고, -30℃에서 저장하였다.
EtxB 및 EtxB(G33D)의 순도는 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 확인하였다. 개개의 단량체의 분자량은 레이져 탈착 질량 분광광도법으로 학인하였다(유니버시티 오브 켄트, 프로테인 사이언스 퍼실리티).
EtxB 및 EtxB(G33D)의 겉보기 분자량은 SMART 시스템(파마시아)을 이용하는 겔 여과 크로마토그래피로 측정하였다. 단백질은 PBS(pH 7.5)에서 수퍼덱스 75 PC3.2/30 칼럼으로부터 용출시켰다.
림프구 증식 분석(후술함)을 위한 B 서브유니트 오량체의 비가역 변성은 95℃에서 5분 동안 상기 단백질을 가열하므로써 수행하였다.
동물, 샘플 수집 및 면역화 프로토콜
7 내지 12 주의 BALB/c 마우스(H-2d; EtxB에 대한 높은 반응자)는 챨스 리버 레버러토리즈로부터 구입하였으며, 켄트 대학의 동물 보호소에 유지하였다. EtxB 또는 EtxB(G33D)에 대한 항체 반응은 PBS 내의 단백질 30 ㎍을 마우스에게 피하 주사하고, 10일후에 추가 항원 자극 한후 측정하였다. 다른 마우스 그룹은 동일한 양의 중산탄나트륨 내의 단백질(50 ㎍/㎖)을 3가지 경우에서 1 주일 간격으로 경구 투여하였다. 대조용 마우스는 PBS를 투여하였다. 최종 피하 주사하고 10일후, 또는 최종 경구 주입하고, 1주일후 혈액을 수집하였다. 살아있는 마우스로부터 취한 소화관 분비물은 이미 기술된 바와 같이 최종 주입하고 1주일후 프로테아제 억제제 용액 내에서 분리하였다[참조: Elson, C.O., Ealding, W. & Lefkowitz, J., J. Immunol. Meth. 67, 101-108 (1984)]. 이어서, 샘플은 초음파처리하고, 원심분리하여 세정하였다(13,226 x g; 4℃에서 10분).
증식 분석을 위해, 마우스에게 프로인트 완전 보조제 내의 EtxB 또는 EtxB(G33D) 30 ㎍을 복강내 주입하고, 10일 후에 장간막 림프절을 분리하였다. 또한, 비면역화한 대조용 마우스도 포함시켰으며, 동일한 방식으로 그들의 림프절을 분리하였다.
효소 결합된 면역 흡착 분석(ELISA)
GM1에 대한 EtxB 또는 EtxB(G33D)의 결합은 GM1-ELISA에 의해 조사하였다[참조: Amin, T. & Hirst, T. R., Prot. Express and Purif. 5, 198-204 (1994)].
혈청 및 소화관 분비물은, 샘플이 PBS 내의 EtxB 또는 EtxB(G33D) 5 ㎍/㎖로 코팅된 미량역가 평판(미국, 다이나틱의 이뮬론 I)에 적용되는 ELISA에 의해 항-B 서브유니트 IgG 및 IgA 항체의 존재에 대해 조사하였다. 소화관 분비물 상등액 내의 항-B 서브유니트 IgA 항체는 각 평판상에 PBS 내의 1 ㎍/㎖의 토끼 항-마우스 IgA(α 쇄 특이성, 미국, 자이메트 랩)를 2열의 웰에 코팅한후, 1 ㎍/㎖의 마우스 흑색종 IgA(미국, 시그마, MOPC 315)를 첨가하여 형성한 표준 곡선으로부터 외삽하였다. 총 IgA를 측정하기 위해, 웰은 토끼 항-마우스 IgA를 피복한후, 소화관 분비물 상등액을 첨가하였다. 모든 샘플은 연속적으로 희석하였다. 염소 항-마우스 IgG(Fc 단편 특이성; 미국, 잭슨 랩) 또는 염소 항-마우스 IgA(쇄 특이성; 시그마) 퍼옥시다제 복합체는 희석하고, 모든 웰에 첨가하였다. 항-B 서브유니트 IgG 역가는 A405nm≥0.2로 측정되었다. 소화관 분비물 내의 EtxB 및 EtxB(G33D)에 대한 IgA 항-B 서브유니트 "IgA 특이 활성"으로 계산하였다[평균 IgA 항-B 서브유니트(㎍/㎖)/총 IgA(㎍/㎖)].
IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 및 IFN-γ의 시토킨 농도는 이미 기술한 ELISA 법을 이용하여 측정하였다[참조: Harper, H.M., 브리스톨 대학 박사 논문 (1995)]. 개략적으로, 미량역가 평판은 마우스 IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 및 IFN-γ에 대한 래트 항체로 코팅하였다. 2%(w/v) 소 혈정 알부민으로 평판을 블록시켰다. 배양 배지로부터 취한 상등액은 웰에 첨가하고, 희석하였다. 각 시토킨에 대한 각각의 평판상의 1열은 표준량의 재조합 시토킨을 함유하였다. 이어서, 평판은 비오티닐화된 항-시토킨 단일클론 항체 0.5 ㎍/㎖와 함께 배양한 후, 아비딘-퍼옥시다제 및 3,3',5,5'-테트라메틸벤지덴(TMB) 기질을 첨가하고, A405nm에서 판독하였다.
림프구 증식 분석
마우스는 자궁경부 탈구에 의해 희생시키고, 장간막 림프절은 무균 적출하고, 스테인레스 강 메스를 이용하여 행크의 평형처리한 염 용액(HBSS)(영국, 렌프루셔, 어빈의 플로우 레버레토리즈) 내로 잘게 썰어넣었다. 세포는 HBSS내에서 원심분리(500 x g, 4℃에서 10분)하여 세척하고, 20mM Hepes(플로우), 100 IU 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 4 mM L-글루타민(플로우) 및 2-메르캅토에탄올이 첨가된 개질된 이글 배지(완전 배지; 플로우)에 재현탁시켰다. 면역화되지 않은 마우스로부터 취한 새로운 자가이식성의 정상적인 마우스 혈청은 최종 농도 0.5%(부피/부피)로 첨가하였다. 배양물은 24웰 평판의 2 ㎖ 부피 또는 25 cm3플라스크(덴마크, 로스키드의 눈크 에이/에스)내의 8 ㎖ 부피 내에 2 x 106생 세포/㎖를 함유하였으며, 도면의 설명 부분에서 제시된 바와 같이 항원의 존재 및 부재 하에서 유지하였다. 배양물은 5% 이산화탄소 및 95% 공기로 이루어진 가습 대기 내에서 37℃에서 6일 동안 배양하였다. 바람직한 시간에 샘플 0.1 ㎖를 상기 배양물로부터 제거하고, 96 웰의 U자형 바닥 평판(눈크)에 이전하였으며, 수거(미국, 코네티컷, 오렌지의 마크 III 하비스팅 96 톰테크)하기 6 시간 전에 [3H]-Thd(영국 아메르샴)의 1 μCi/웰로 펄스를 가하였으며, 표준 액체 섬광 계수법으로 계수하였다(핀란드, 투르쿠, LKB-월락, 1450 마이크로 β 플러스). 유사하게, 상등액 0.5 ㎖를 배양물로부터 취하고, 시토킨 분석에 사용하였다. 세포는 펠릿화하였으며, 상등액은 분석 시까지 -68℃에서 저장하였다.
배양된 세포의 표현형 분석
배양 4일에 수거한 배양된 세포는 세척하고, 생 세포는 HBSS/18% 메트리자미드(노르웨이, 오슬로의 나이에가르트 앤드 컴퍼니) 구배의 계면에서 회수하고, 이어서 500 x g로 20℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 세포는 2회 세척하고, 0.2% 나트륨 아지드(시그마) 및 10% 정상 래트 혈청을 함유하는 HBSS 내에 재현탁하였다. 하기 래트 항체(미국, 샌디에고, 파르밍겐)를 사용하였다: 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 표지된 항-CD4(RNRM4-5) , FITC 표지된 항-CD8(53-6.7), 비오틴-표지된 항-CD25(7D4) 및 피코에리트린(PE) 표지된 항-B220(RA3-6D2). 또한, 비오틴-표지된 항체로는 스트렙타비딘-PE 또는 스트렙티비딘-FITC(영국, 세로테크)를 사용하였다. 모든 항체는 아지드를 함유하는 HBSS 내에서 희석하였으며, 미리 결정된 농도로 사용하였다. 2 x 106세포 200 ㎕ 및 각각의 항체 200 ㎕를 혼합하고, 얼음 상에서 30분 동안 배양하였다. 스트렙타비딘-PE 또는 FITC 2차 항체가 필요한 경우, 세포는 이들 항체와 함께 추가로 30분 동안 배양하였다. 또한, FITC 및 PE 항체를 위한 대조용도 포함시켰다. 세포는 HBSS로 세척한 후, 유동 세포계수법(벡톤 디킨슨)을 2회 수행하여 분석하였다.
결과
EtxB의 수용제 결합 변종의 생성 및 특정화
Gly의 Asp로의 치환은 EtxB의 올리고뉴클레오티드-유도된 돌연변이 유발에 의해 열에 약한 이. 콜리 내독소의 B 서브유니트 내로 도입하여 수용체 인식에 결함이 있는 변종 B 서브유니트를 생성하였다. 상기 변종 단백질은 EtxB(G33D)로 지칭하였으며, 야생형 EtxB는 균질하게 정제하였다(참조: 재료 및 방법). 정제된 EtxB 및 EtxB(G33D)의 분자량은 레이져 탈착 질량 분광광도법으로 측정하였다. 질량은 각각 단량체성 EtxB 및 EtxB(G33D)에 대해 이론적인 질량인 11702 및 11760의 20 Da내에 있다. 가열하지 않고 SDS-PAGE에 의해 분석하는 경우, 야생형 EtxB 및 EtxB(G33D)는 겉보기 분자량이 42 kDa 및 56 kDa인 불연속적인 안정한 올리고머로서 이동하였다(각각 도 1A의 1 레인 및 2 레인). EtxB의 관찰된 전기영동 이동성 및 SDS-안정성은 B 서브유니트 5량체의 특징적인 특성이었다[참조: Sandkvist, M., Hirst, T.R. & Bagdasarian, M., J. Bacteriol. 169, 4570-4576 (1987)]. 올리고머성 EtxB(G33D)의 더 느린 전기영동 이동성은 구성 B 서브유니트 단량체의 수 차이에 기인하는 것이 아닌데, 그 이유는 고해상 겔 여과 크로마토그래피에 의한 분석시 5량체성 EtxB 및 EtxB(G33D) 둘다 유사한 체류 시간을 나타내기 때문이다. 따라서, EtxB(G33D) 올리고머의 야생형 EtxB에 대한 전기영동 이동성은, SDS 결합의 감소 및 후속적인 더 느린 이동을 초래하는 도입된, 음으로 하전된 아스파르트산 잔기에 기인하는 것으로 생각된다.
또한 EtxB 및 EtxB(G33D)를 저 pH 완충액에서의 안정성, 트립신 또는 프로테인아제 K의 1.0mg/㎖에 대한 내성 및 항-B 서브유니트 모노클로날 및 폴리클로날 항체에 대한 상대적인 반응도를 비교하였다. 이들 각 시험에서 EtxB(G33D)는 야생형 EtxB와 동일한 특성을 나타내었다. 따라서, EtxB의 잔기 33에서 Gly의 Asp로의 치환은 야생형과 비교하여 올리고머 배열, SDS, pH 또는 프로테아제 안정성, 또는 항체 반응도를 변화시키지 않는다는 결론을 얻었다.
수용체 GM1에 결합하는 EtxB(G33D)의 능력은 GM1-ELISA를 사용하여 평가하였다(도 1C). 이는 야생형 단백질과 비교되는 GM1에 결합시키는 변이체의 능력의 상당한 감소를 보여주었다(A450nm리딩에서 >99% 감소). 또한, 야생형 EtxB과 대조적으로 EtxB(G33D)는 면역형광법으로 검사하였을 때 CHO 세포에 결합하지 않았다. EtxB(G33D)는 시험관내 및 본래의 위치에서 GM1 강글리오시드와 결합하는 능력에 결점을 갖고 있다는 결론을 얻었다.
생체내에서 EtxB의 유효 면역원성은 수용체 결합 능력에 달려있다.
EtxB의 면역원성에 수용체의 결합의 중요성은 PBS내 EtxB 또는 EtxB(G33D)의 경구 전달 또는 피하 주사후에 마우스에서 평가하였다. EtxB의 경구 전달로 혈청내 고 IgG 항체 역가 및 소화관 분비내 항체 활성을 검출하였다(도 2). 대조적으로, 유사한 EtxB(G33D)의 경구 면역화는 임의의 검출가능한 항체 활성을 발생시키지 못했다. 야생형 EtxB에 대한 항체 반응과 비교하여 상당히 낮지만, EtxB(G33D)는 각각 1050 대 171000으로 평균 항체 역가에서 >160배 감소로 피하 주사후에 혈장 항체 반응을 야기시켰다. EtxB에 의한 수용체 결합은 생체내에서 유효 면역원성을 위해 필수적이라는 결론을 얻었다.
수용체 결합은 EtxB 또는 EtxB(G33D)의 존재하에 임파구 증식 범위에 영향을 주지 않는다.
시험관내 림프구 증식에 대한 EtxB 또는 EtxB(G33D)의 영향을 시험하였다. 림프구를 EtxB 또는 EtxB(G33D)로 면역화하고, 및 단백질 또는 EtxB 또는 EtxB(G33D)의 열-변성된 제제로 시험관내에서 자극시킨 슬와부 및 장간막 림프절(MLN)로부터 분리하였다. 슬와브 또는 MLN으로 유도된 림프구의 증식 반응은 유사하였다. 각 경우에, 각 단백질 제제에 대한 증식은 B 서브유니트 농도를 증가시키면서 증가하였다. MLN을 사용한 시험으로부터의 대표적인 데이터는 표1에 나타나있다. 야생형 및 변종 오량체에 대한 반응 크기는 열-변성화된 야생형 및 변종 단량체의 존재하에서의 크기와 비교할 만하다. 도 3은 각 단백질 제제 80㎍/㎖의 존재하에 수득한 증식 반응의 속도를 보여준다. 반응도는 항원의 존재와 관련이 있으며, 각 단백질의 존재하에 유사한 패턴을 따른다. 반응도는 4일에 피크에 달하는 [3H]-Thd의 유입으로 배양 3일에 분명해졌다. 도 3에서 분명한 피크 반응 타이밍의 미묘한 차이는 반복실험에서는 관찰되지 않으며, EtxB 및 EtxB(G33D)에 대한 병력을 비교할 만하다는 것을 보여준다. 천연 단백질의 존재하에 자극 정도는 수용체 결합 또는 유입된 변종에 의해 영향을 받을 것 같지 않다는 결론을 얻었다.
독소 수용체 결합은 B 세포 및 T 세포 서브세트의 면역조정을 유발시킨다
EtxB에 의한 수용체 결합이 시험관내에서 림프 세포군집에 영향을 나타내는지 여부를 시험하기 위해서, EtxB(G33D)를 사용하여 복강내 감작된 마우스의 MLN로부터 림프구를 분리시킨 후, EtxB 또는 EtxB(G33D) 또는 둘의 혼합물을 사용하여 자극시켰다. 추가적으로, EtxB를 주입시킨 마우스로부터 MLN-유도된 림프구를 사용한 평행 실험을 진행하고, EtxB(G33D) 감작된 마우스로부터 수득된 것들에 대해 실질적으로 동일한 결과를 얻었다.
(i) 독성 수용체 결합는 B세포의 증가된 활성을 유발한다
B세포 상에서 EtxB의 효과는 B세포 마커 B220(CD45R)과 관련하여 활성 마커CD25(IL-2Rα)를 발현시켜 조사하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, EtxB로 자극된 배양물의 B세포 수는 총 세포의 62.9% 였으며, 이중 세포 활성 마커 CD25가 고 비율(28.4%)로 발현되었다. 대조적으로, EtxB(G33D)의 존재하에서 자극후의 B세포의 비율은 야생형의 것보다 1/2 미만(22.26%)이었으며, 활성화된 것은 거의 없었다(5.6%) EtxB에 의해서 나타나는 효과가 우성인지의 여부를 설정하기 위해서, 동몰 농도의 EtxB 및 EtxB(G33D)의 존재하에 세포를 배양시켰다. 유동 계측 데이터는 야생형 EtxB 단독의 존재하에 자극시킨 후 수득된 것과 유사하였다(B세포 60.6%, 이중 26% 활성). EtxB의 수용체 결합 특성은 시험관내에서 B세포의 증가된 활성을 매개한다는 결론을 얻었다.
(ii) EtxB는 CD4
+
T 세포의 증가된 활성 및 CD8
+
T 세포의 완전 고갈을 유발한다
T세포에 대한 B 서브유니트 수용체 결합의 영향을 시험하기 위해서, CD25에 대한 항체와 관련하여 CD4 또는 CD8에 대한 항체로 림프구를 표지하였다(도 5). 추가적으로, 일부 세포를 CD3 마커에 대한 항체로 별도로 표지하였다(도시되지 않음). EtxB의 존재하에 자극된 T 세포를 발현시키는 CD4마커의 비율은 36.7%였으며, 이중 고 비율(32.7%)이 활성화되었다. 대조적으로, 검출할 수 없는 CD8+T 세포가 EtxB 함유 배양물에서 존재하였다.
비교하면, CD4+및 CD8+T 세포는 EtxB(G33D)의 존재하에 자극된 배양물에서 존재하였다. 상기 배양물은 높은 비율의 CD4+T(66.6%)를 함유하였으나, 단지 이중 12% 만이 활성화되었다. EtxB(G33D)의 존재하에 검출되는 CD8+T 세포의 비율은 총 세포수의 11.7%였으나, 이중 활성화되는 것은 거의 없으며 이는 CD25 마커의 부재로 알 수 있다. 추가적으로, EtxB 및 EtxB(G33D)의 동일한 몰 농도로 구성된 혼합물의 존재하에, 반응하는 세포의 패턴은 야생형 EtxB 단독의 존재하의 세포 패턴과 유사하였다; 41.68% CD+T 세포( 이중 28.6%는 CD25+) 및 검출할 수 없는 CD8+T 세포(도 5). 모든 분석에서, CD3로 염색한 세포의 비율은 대략 CD4 및 CD8 마커를 발현시키는 것들의 합과 같다. 이들 자료는 B세포 및 CD+T 세포의 활성의 증가와 CD+8 T 세포의 선택성 고갈이 독소 수용체 점유도에 의해 매개된다는 것을 보여준다.
시토킨의 생성
림프구 군에 대한 EtxB의 효과의 시토킨 생성 변화에 대한 의존 여부를 평가하기 위해서, 세포 배양물은 EtxB 또는 EtxB(G33D)를 사용하여 항원처리 시키고, 분석을 위해서 상등액은 2, 3, 4, 5 및 6일에 회수하였다. 시토킨의 최대 농도가 검출될 때 5일에 수거한 시료에서 얻은 결과는 표 2에 나타내었다. 시토킨의 상대 농도가 다양하지만, IFN-γ 및 IL-2는 모두 EtxB 또는 EtxB(G33D)의 존재하에 자극된 배양물의 상등액에서 검출되었다. 야생형 EtxB로 배양한 세포의 배지는, EtxB(G33D)의 존재하에 자극된 배양물의 상등액과 비교하여 3-배 높은 농도의 IL-2 및 1.5배 낮은 농도의 IFN-γ를 포함하였다. 기타 항원에 반응하는 기타 증식 T세포 배양물은 고농도의 IL-4, IL-5 및 IL-10를 수득할 수 있다는 결과에도 불구하고, 이들 시토킨은 EtxB 또는 EtxB(G33D)로 자극된 배양물에서 검출되지 않았다. EtxB와 비교하여, EtxB로 자극시킨 후에 IL-2의 농도 증가 및 IFN-γ 농도 감소는 B 및 CD4+T 세포의 활성 상태를 가장 잘 반영한 것 같다. 그럼에도 불구하고, CD8+T 세포군상에 야생형 EtxB의 상당한 영향은 수용체 점유도의 결과로 시토킨 프로파일에 주요 이동에 의해서 매개될 것 같지 않다는 것을 보여준다.
토의
이들 조사는 EtxB의 수용체 결합 부위에 단일 점 변이(G33D)의 유입은 GM1을 결합시키는 능력의 상당한 손실을 유발하였다는 것을 보여준다. 변종 EtxB(G33D)는 겔 크로마토그래피, SDS의 안정성, 산 및 프로테아제에 의해서 나타난 바와 같이 구조와 관련하여 야생형 EtxB에 대한 동일한 생리-화화적 특성을 나타낸다는 것은 중요하다. 특이 항체 반응을 EtxB 또는 EtxB(G33D)로 면역화시킨 후에 측정하였을 때, 급격한 차이를 나타내었다. 마우스에서 EtxB(G33D)를 사용한 피하 주사는 야생형과 비교하여 항체 역가의 상당한 감소(약 >160 배)를 나타낸 반면 항체 반응은 경구 투여 후에 검출되지 않았다. 이들 차이는 항체에 의한 분자의 인식, 또는 항체 생성을 위한 효과적인 T세포 보조 자극에 포함된 우성 에피토프의 파괴로부터 유도되는 것이 가능하다. 그러나, Gly의 Asp로의 치환은 특이 폴리클로날 및 모노클로날 항체의 패널에 의한 B 서브유니트의 인식에 영향을 주지 않는다는 것은 주목할 만하다. 추가로, EtxB 또는 EtxB(G33D)를 배양물에 첨가할 때 수득한 증식성 반응은 생체내 항원 자극으로 어떤 단백질을 사용하는지에 관계없이 비교할 만하다; T 세포 반응성은 각 분자에 특이적이지 않다는 것을 나타낸다. 그러므로 EtxB에 의한 수용체 결합은 생체내에서 유효 면역원성을 위해 필수적이라는 결론을 얻었다.
EtxB의 유효 면역원성에 수용체의 결합의 중요성은 다양한 방법으로 설명할 수 있다. 우선, GM1에 대한 Etx 및 Ctx의 B 서브유니트 결합은 이들 단백질의 포집 효율을 증가시킬 수 있으며, 면역 시스템에 이용할 수 있는 국부 단백질 농도를 증가시킨다. 점막 표면에 결합할 수 있는 단백질의 기타 부류는 효과적인 면역원으로 알려져있다(De Aizpura, H.J. & Russell-Jones, G.J.(1988) J. Exp. Med. 167, 440-451). EtxB 및 경구 투여후의 이의 변종에서 관찰된 차이는 소화관의 루멘으로부터 EtxB의 효과적인 포집에 의한 것이다. 그러나, 비경구 면역화 후에 급격한 차이는(항원이 고농도에서 국부적으로 전달될 때) 기타 효과를 암시한다. 예를 들어, GM1에 대한 EtxB의 결합은 세포 활성이 존재하는 항원의 효율에 영향을 준다. 상기 결합은 특히 B7과 같이 실질적으로 동시-자극되는 분자의 발현에 대하여 II-보유 세포 부류의 활성을 유발하며, 이는 활성을 나타내는 증가된 항원의 획득과 관련이 있다(Jenkins, M.K. & Johnson, J.G. (1993) Curr. Opin. Immunol. 5, 361-367). 대안적으로, 수용체 결합은 림프군의 아군에 직접적인 영향을 준다. 이 연구에서 다양한 관찰은 실제로 해당하는 경우에 대한 강력한 증거를 제공한다.
시험관내 연구는 EtxB가 감작된 림프절 세포의 증식을 유발할 수 있다는 것을 보여주었다. 유사한 병력 특성을 갖는 반응이 야생형 EtxB, EtxB(G33D) 또는 GM1에 결합할 수 없는 단백질의 열-변성된 단량체 형태를 사용하여 수득할 수 있기 때문에, 이 특성은 수용체 결합과 관계가 없었다. Ctx 및 CtxB의 시판용 제제 또는 정제된 재조합 CtxB는 시험관내에서 림프구 증식을 강력하게 억제한다고 널리 보고되어 있기 때문에, 이들 관찰은 그 자체가 흥미롭다, 종래의 실험은 정제된 림프구에서 수행되었고 대개 사용된 분열 촉진 인자를 자극시키는 림프구 배양물(클로날 제한된 반응이 없음)에서 수행한다는 사실에서 분명한 모순이 있으며, 상이한 기작을 포함할 수 있다. Con A-자극된 림프구 증식이 EtxB에 의해서 실제로 억제된다는 관찰과 일치한다. 그러나, EtxB 또는 EtxB(G33D)로 자극시킨 감작된 림프절 세포의 배양물에서의 세포군 분석은 CD4 및 CD8-함유 T-세포 뿐만 아니라 B세포에 대해서도 중요한 차이점을 보여준다.
B세포는 EtxB 또는 EtxB(G33D)가 존재하는 배양물에서 4일 후에 검출되었다. 그러나, EtxB(G33D)와 비교하여, EtxB를 사용한 배양물에 존재하는 B세포의 상대적인 비율은 약 100%로 증가하였다. 이러한 증가는 매우 높은 비율의 B세포상에 CD25의 발현과 관련이 있었다. 제시된 실험에서, 반응하는 림프구는 생체내에서 EtxB(G33D)로 감작되었다. EtxB로 면역화된 마우스의 세포를 사용한 유사한 실험은 비교할 만한 결과를 나타내었다. 따라서, 수용체 결합과 연관된 임의의 생체내 효과와 관련없이, EtxB가 존재하는 배양물은 EtxB(G33D)로 자극시킨 것과 비교하여 더 많은 비율의 B세포를 포함하였다. B세포상에서의 상기 효과가 검출된 시토킨의 프로파일을 주요 이동시키지 않을 때, 또한 시험관내에서 T세포에 의해 최소한 부분적으로 조절되지 않는 것을 보여주었다. 따라서, 시험관내에서 EtxB에 의한 수용체 결합이 B세포상에 직접적인 효과와 관련하여 나타나며, 활성 뿐만 아니라 개체군의 비례적인 팽창을 유발하였다. 또한 CtxB는 무극 B 세포상에서 MHC 클래스 II의 발현의 증가를 나타내며, 이는 GM1 결합 변종 CtxB(G33E)에 의해 나타나지 않는 특성이다(Francis, M.L., Ryan, J., Jobling, M.G., Holmes R.K., Moss, J, & Mond J.J. (1992) J. Immunol. 148, 1999-2005). 상기 실험 결과는 항원-감작된 B세포상에 EtxB에 의한 직접적인 분열 촉진 인자 효과의 존재를 제시하였으며, 상기 효과는 수용체 결합에 의해 매개된다는 것을 나타낸다.
배양물에서 B세포상에 EtxB의 효과 이외에, 유동 세포 계측법으로 독소가 임의의 검출가능한 CD8+세포의 완전 고갈을 유발시킨다는 것이 밝혀졌다. T 세포군이 EtxB(G33D)를 함유하는 배양물에서 고갈되지 않기 때문에, 상기 효과는 수용체 결합에 관련된다고 보여진다. 추가로, EtxB를 함유하는 배양물내의 CD8+세포의 완전한 고갈을 야생형 EtxB로 면역화시킨 마우스로부터 관찰하였다. 상기 효과는 3가지 가능한 기작에 의해서 매개될 수 있다. 1) 래트 MLN 세포상의 GM1에 대한 Ctx 또는 CtxB의 결합은 패취(patch) 및 캡 형성을 유발한다(Craig S.W. and Cuatrecasas P., (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 72, p 3844-3848). 상기 방법에서 CD8을 비롯하여 EtxB-GM1 복합체 및 기타 분자를 내화시키는 것이 가능하다. 상기 과정은 CD8을 마커로 사용하여 이들 세포의 유동 세포 계측을 방지하고, 표면 TCR 복합체의 관련된 소실에 의해서 사멸을 일으킬 수 있다. 표면 TCR 복합체의 관련된 소실이 배양물에서 CD8+T 세포의 부재를 설명할 수 있지만, CtxB가 사용될 때 인체 자켓(Jarkat) T 세포주의 표면으로부터 TCR 복합체의 고갈을 발견할 수 없다(Imboden, J.B., Shoback, D. M. Pattison, G, & Stobo, J.D. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5673-5677). 캡핑 결과의 영향 부재는 CD3 및 CD4 마커가 영향을 받지 않는다는 것을 뒷받침한다. 2) 또 다른 기작은 배양물의 시토킨에 의해 형성되는 효과를 포함한다. 상기 연구에서, IL-2 및 IFN-γ 모두 검출되었다. 그러나, 결과는 CD8+T 세포상의 급격한 효과를 설명하는 시토킨 프로파일에 주요 이동을 제시하지 않는다. 3) CD8+T 세포의 부재는 세포사멸의 활성 유도에 의한 것일 수 있다. 세포소멸에 의한 림프구의 사멸은 전술한 바와 같은 캡핑을 포함할 수 있으며, 또는 세포내의 시그날화 효과로 캐핑의 부재하에 매개할 수 있다. 활성-유발 프로그램된 사멸은 Ca2+와 관련이 있으며, 포스파타아제 및 키나아제를 포함한다. 림프구에 CtxB의 결합은 단백질 키나아제 C-의존 증식을 억제하고 세포내 Ca2+의 현저한 증가를 야기시키며, 이는 CAMP 농도의 증가와는 관련이 없다는 것을 보여준다. CD8+(CD44T 세포는 아님)를 고갈시키는 EtxB의 능력은 CD4/CD8-TCR 복합체와 관련된 시그날의 차등 효과에 의한 것일 수 있으며, 이는 림프구의 서브세트 표면에 GM1을 가교시켜서 형성된다. 이는 CtxB로 보고된 막에 독소의 차등 결합 또는 CD4+및 CD8+T 세포 차등 시그날 기작의 결과이다.
검출가능한 CD8+T 세포의 완전한 부재하에, EtxB는 수용체 결합 변종과 비교하여 활성화된 CD4+T와 비례하여 증가하였다. 생체내에서 Ctx에 반응하는 CD4+T세포를 필수 요건으로 나타내었다. 그러나, T 세포 서브세트의 증가된 활성의 원인은 불분명하다. CtxB는 침묵 비-형질변형된 마우스 3T3 세포의 DNA 합성 및 세포 분열을 자극하는 것으로 보여지는 것은 주목할 만하다. CD4+T세포상에 선택적인 분열 촉진 인자 효과는 또한 EtxB가 GM1내에 결합하는 동일한 성분인 Galβ-1-3-3 GalNAc에 결합하는 식물 렉틴의 존재하에 발견된다. EtxB가 CD4+T상에 GM1-결합과 관련된 직접적인 효과를 매개하여 활성을 유발하는 가능성은 불가능하지 않다. 그러나, EtxB함유 배양물에서 CD4+T 세포의 증가된 활성은 이를 B 세포 및 CD8+T 세포군으로 변화시킨 결과이다. B 세포 활성은 CD4+T 세포를 위해 항원이 존재하는 세포로서 감응도의 증가와 관련이 있는 것으로 알려져있다. 또한, CD8+T 세포는 생체내 또는 시험관내에서 면역 반응성의 조절 역활과 광범위한 관련이 있다. T 세포 증식 배양물으로부터 이를 제거하는 것은 CD4+T 세포 분열의 연장되고 증가된 농도와 관련이 있다.
상기 연구에서 보는 바와 같이 이들을 함께 취하면, 생체내의 EtxB의 유효 면역원성은 GM1에 결합한 후 성장 조절 효과에 의해 발휘되는 B세포의 활성 증가 능력의 결과로서 발생한다고 제안할 수 있다. CD4+T 세포의 활성 및 시험관내 배양물에서 IL-2의 생성을 증가시키는 EtxB의 능력은 B세포 클론의 추가의 팽창을 위해서 필요한 시그날을 제공할 수 있다. 상기 연구에서 생체내 EtxB에 의한 CD8+T 세포의 고갈은 특히 면역 반응의 억제 및 경구 면역에서 세포의 서브세트를 포함한다는 견지에서 세포의 전신 또는 경구 전달후에 생체내 면역강화의 또 다른 기작을 제공할 수 있다. 이러한 점에서, Ctx 및 Etx는 동시 공급되는 가용성 단백질에 대한 경구 내성을 제거하는 것을 보여주며, 본 연구에 포함된 Ctx 및 CtxB 고갈은 상기 기작을 설명하기 위한 소화관 및 파이어판의 돔(dome)에서 표피내 림프구에 영향을 준다. 시험관내 CD8+T 세포상의 CtxB-억제 효과는 이식조직과 숙주 반응의 억제를 보여준다.
결론적으로, 유효 면역조정 효과의 존재는 생체내 항체 반응 및 생체외 각 림프구 개체군의 EtxB에 의한 영향이 있다는 것을 보여준다. 추가로, 이들 효과는 수용체 결합에 의해서 매개된다. 또한 우리의 발견은 유효 면역보강제 및 기타 항원용 유효 단백질 담체로 작용하는 Etx 및 Ctx 능력의 이해와 관련이 있으며, 상기 특성은 림프 세포의 표면상의 강글리오사이드 수용체에 이들 독소를 결합시키는 능력에 달려있다는 것을 제안한다.
실시예 2
이 실시예는 CD8세포상의 효과가 항원 인지와 관련이 없으며 세포 소멸에 의해 매개된다는 것을 예시하고 있다.
EtxB 및 EtxB(G33D)의 재조합 제제는 실시예 1에서와 같이 제조하였다. 두 단백질은 모두 GM1에 대한 결합, 모노클로날 및 폴리클로날 항체의 패널에 대한 결합 및 각종 기타 생리-화학적 특성과 관련하여 특성화하였다. 난알부민(OVA)을 시그마(영국, 풀레)에서 구입하였다. 장간막 림프절(MLN)을 8-10주된 BALB/c 마우스로부터 분리하였다[(EtxB에 대한 고 반응 균주(Nashar, T.O. and Hirst, T.R. 1995. H-2 및 인트라-H-2 대립유전자의 면역 보강 역할은 에스케리치아 콜리 열-불안정한 내독소(rEtxB) 및 콜레라 독소(rCtxB)의 B-서브유니트 재조합 제제에 반응하는 것이다. Vaccine 13: 803)]. 불완전한 프로인트 보조액(시그마)에 유화시킨 OVA(시그마) 200㎍을 마우스에게 복강내 주사하였다. MLN을 주사 10일 후에 제거하고, 스테인레스 스틸을 통하여 HBSS내로 분쇄하였다(영국, 어빈, 플로우). 회수된 세포를 원심분리(500g, 10분, 4℃)하여 HBSS내에서 세척하고, 새 자가 마우스 혈장 0.5%(v/v)가 첨가된, 20mM의 HEPES, 100IU의 페니실린, 100㎍/㎖의 스테렙토마이신, 4mM의 L-글루타민 및 5×10-5M의 2-메르캅토에탄올를 함유하는 변형된 이글스 배지(완전 배지)(플로우)에 재현탁시켰다. 배양물은 24웰 플레이트( Nunc, 덴마크, 로스키드소재)내의 2㎖중 2×106생세포/㎖를 포함하고, 단독, 또는 EtxB 또는 EtxB (G33D) 40㎍/㎖와 함께 사용하여 OVA 100㎍/㎖(완전 배지에서 광범위하게 투석됨)의 존재하에 설정하였다. 배양물을 5%의 CO2및 95%의 공기에서 5일 동안 배양하였다. 원하는 시점에서, 0.1㎖ 시료를 배양물에서 제거하고 96웰 U-하부 플레이트(Nunc)로 이동시키고, 수확(Mach III harvesting 96; Tomtec, Orange, 코네티컷) 및 표면 액체 섬광 계수법(1450 마이크로 b 플러스; LKB-Wallac, Turku, 핀랜드)으로 계수하기 전에 1μCi/웰의 [3H]티미딘(영국, 아머샴)을 사용하여 6시간 동안 펄스시켰다. T 세포의 유동 세포 계측법(Becton Dickinson, Erenbodegem-Aalst, Belgium)을 위해서, 세포를 하기 래트 항체로 염색시켰다: FITC 표지된 항-CD4(RNRM4-5) 또는 FITC-항-CD8α(53-6.7) 및 비오틴-표지된 항-CD25(IL-2Rα)(7D4), 스트렙트아비딘-피코에리트린. 추가적으로, 비오틴-표지된 항체용으로 FITC-표지된 스트렙타비딘을 사용하였다. [3H]티미딘 유입에 의해서 측정되는 회수된 세포의 FACS 분석은 증식의 피크 일(4일)에 수행하였다.
세포 소멸 분석을 위해서, 새로운 MNL 세포(MLNC) 및 비장 T 세포(SPLTC)를 8-10주된 BALB/c 마우스로부터 분리하였다. 유동 세포 계측법에 의해 측정할 때, 유착세포를 제거하기 위해서 5% CO2및 95% 공기의 37℃에서 10% FCS를 함유하는 완전 배지의 페트리 디쉬(Costar, Cambridge, MA)내에 >90% CD3+T 세포를 포함하는 MLNC를 2시간 동안 배양하였다. 이어서, 비-유착 분획을 피펫으로 제거하고, 펠렛화시킨 후 사용전에 HBSS에서 2회 세척하였다. SPLTC를 정상 마우스 혈장과 전술한 바와 같이 토끼 항-마우스 γ-글로블린으로 코팅시킨 유리비드를 사용하여 음성 선택으로 정제하였다(Wigzell, H. 1976. 유리 또는 플라스틱 비드 칼럼을 사용한 림프구의 특이 친화도 분획. Scand. J. Immunol. 5:(suppl. 5) 23). 선택된 T 세포군은 유동 세포 계측법으로 측정하였을 때 >90%였다.
CD4+및 CD8+T 세포를 하기와 같이 분리하였다: 비-유착 MLNC를 래트 피코에리트린-항-마우스 CD4(4708-02) 또는 FITC-항-마우스 CD8α(53-6.7)(PharMingen)으로 표지한 후, 제조자의 지시에 따라 염소 항-래트 IgG(H+L)F(ab')2(PharMingen)으로 콘쥬게이트시킨 MACS 콜로이달 초-상자성 미세비드를 사용하여 항온처리하였다. 유동 세포 계측법으로 측정할 때 양성적으로(>99% 순도) 및 음성적으로(>90% 순도) 선택한 분획을 분리하기 위해서 CD4 및 CD8+T 세포를 미니-MACS 칼럼에 적용하였다.
세포 소멸을 정량화하기 위해 2가지 방법을 사용하였다: i) 핵 형태를 시험하기 위해서 아크리딘 오렌지로 DNA 염색, 및 ii) 프로피듐 요오드화물, 및 항-CD4 또는 항-CD8 항체를 사용하여 DNA 염색후에 세포 주기 분석. 2×106/㎖ MLNC, SPLTC 및 분획된 MLNC 배양물은 80㎍/㎖의 EtxB 또는 EtxB(G33D)의 부재 또는 존재하에 10% FCS를 함유하는 완전배지에 설치하고, 4 내지 18 시간에 검사하였다. 항온처리 후에, 세포를 펠렛화하고, HBSS로 세척한 후 5㎍/㎖ 아크리딘 오렌지(시그마)로 염색하였다. 흉선세포를 10-7M 덱사메타존의 부재 또는 존재하에 분리 및 처리하고, 세포 소멸을 진행하는 세포의 양성 대조군으로 사용하였다. 림프구에서의 핵 형태 변화를 통상적인 또는 공초점 형광 현미경(Leica TCS 4D)에 의해서 검사하였다. 세포 주기의 서브-G0/G1기에서 CD4+및 CD8+SPLTC의 비율은 전술한 바와 같이 프로피듐 요오드화물로 염색한 후에 DNA 함량의 유동 세포 계측법에 의해서 측정하였다(O' Connor, P. M., Jackman, J., Jondle, D., Bhatia, K., Magrath, I. 및 Kohn, K.W. 1993. 세포주기 정지기에서 p53 종양 억제 유전자의 역할 및 Burkitt's 림프종 세포주의 방사능감응도, Cancer. Res. 53: 4776). 단독, 또는 40㎍/㎖의 EtxB 또는 EtxB(G33D)와 함께 사용하여 배양시킨 SPLTC의 18 시간 배양물으로부터 분리된 세포를 FITC 래트 항-CD4 또는 FITC-항-CD8α로 염색하였다. 염색된 세포를 20mM의 HEPES 및 0.5mM의 EDTA를 함유하는 냉각 HBSS중 1×106/㎖로 조정하고, 냉각 에탄올을 적가하여 고정시켰다. 이어서, 50㎍/㎖ 프로피듐 요오드화물 및 40㎍/㎖의 리보뉴클레아제 A(DNase는 없음)를 첨가하고, 세포를 실온에서 1 시간 동안 배양시켰다. CD4 및 CD8+T 세포내에 프로피듐 요오드화물로 염색한 DNA의 상대적 강도는 각 mAB로 동시 염색한 세포상을 게이팅시켜 측정하였다.
실시예 1에서, CD8+T 세포는 EtxB가 T세포 서브세트상에서 폴리클로날 효과를 발휘하도록 제안된, EtxB에 반응하는 증식 림프절 세포의 배양물을 완전히 소모하였다. 상기 효과가 EtxB 반응성 세포의 활성에 관여하는지 여부를 조사하기 위해서, 배양물을 OVA-감작된 마우스로부터 설정하고, OVA 단독, 또는 OVA + EtxB 또는 변종 EtxB(G33D)와 함께 자극시켰다. 증식의 유사한 피크 정도(각 경우에 배양 4일)는 OVA 단독, OVA + EtxB 또는 OVA + EtxB(G33D)의 존재하에 얻어진다(각각 1974±347, 12,031±135, 및 9305±290 c.p.m.). 그러나, 4일 후에 이들 배양물에서 T 세포 서브세트의 분배에 급격한 차이가 있었다(도 6). 모든 배양물은 활성 마커 CD25를 유사한 비율로 공동 발현하는 CD4+T 세포를 포함하였다. 그러나, CD8+T 세포는 OVA 플러스 EtxB로 항온처리한 배양물에서는 검출되지 않았으나, (비록 CD25 발현에 의해서 평가된 바와 같이 활성화되지는 않지만) OVA + EtxB(G33D) 또는 OVA 단독으로 사용한 배양물에서는 분명히 존재하였다. 이는 EtxB이 EtxB 이외의 항원에 반응하는 CD8+T 세포의 소모를 유발한다는 사실을 확립시킨다. 더구나, 상기 EtxB(G33D)에 대한 반응의 부재는 소모가 독소 수용체 상호작용 후에 일어난다는 것을 알려준다. 또한 야생형 EtxB의 존재는 이전에 EtxB 반응성 배양물에서 발견된 바와 같이(실시예 1) 다수가 CD25+(도시되지 않음)인 B세포의 비율에 상당한 증가를 유발시켰다는 점을 인지해야 한다. 따라서, EtxB에 의한 수용체 점유도는 항원 특이성에 관계없이 림프구상에 상당한 면역조정 효과를 나타낸다는 결론을 얻었다.
EtxB의 존재하에 배양된 CD8+T 세포가 세포 소멸을 진행할 가능성을 조사하였다. 비감작된 마우스로부터의 MLNC 또는 정제된 SPLTC를 EtxB 또는 EtxB(G33D)로 배양시키고, 아크리딘 오렌지로 염색한 후에 세포 핵 형태의 변화를 4 내지 18 시간 동안 기록하였다(표 3 및 도 7). 세포 형태 변화는 소엽 모양의 핵을 형성하게 하는 크로마틴 응축의 존재하에 특성화하였다(도 7). 혈장막의 수포와 같은 기타 세포 특성 및 세포 소멸체의 존재를 또한 관찰하였다. 이들 형태 변화는 EtxB로 처리한 각 세포 제제의 약1/3에서 발생하는 반면, EtxB(G33D)를 사용한 또는 이종의 항원 없이 배양된 세포에서 휠씬 낮은 발생 빈도가 관찰되었다(표 3). CD8+T 세포는 MLNC 및 SPLTC 제제의 ~35%~ 40% 비율을 차지하기 때문에, 이들 세포의 고갈은 관찰된 세포 소멸을 설명할 수 있다. 상기 경우에 해당하는지의 여부를 확인하기 위해서, 정제된 CD8 및 CD4+T 세포군을 항원의 존재하에 18 시간 동안 배양하였다(표 3). 유사한 비율의 형태 변화가 EtxB, EtxB(G33D)와 함께 또는 항원 없이 처리한 음성적으로 선택된 CD4+T 세포군(>90% CD4-함유 세포 포함)을 유발시키며, 이는 수용체에 대한 EtxB의 결합이 상기 T 세포 서브세트에서 세포 소멸을 일으키지 않는다는 것을 위미한다. 대조적으로, 음성으로 선택된 CD8+T 세포(>90% 순도)의 >70%가 야생형 EtxB로 배양시켰을 때 형태변화를 나타내었으며; 반면 항원없이 또는 EtxB(G33D)을 사용한 배양은 각각 상기 T세포군의 11-19%만을 변화시킨다. 추가로, 사용한 정제 개체군에서 적은 수로 존재하는 오염세포는(각 경우 ~10% ) CD8 또는 CD4+T-세포(양성 선택에 의해서 분리)를 >99% 포함하는 고도로 정제된 개체군이 유사한 방식(EtxB의 존재하에 60%는 세포 소멸, 대조적으로 항원이 없고 EtxB(G33D) 처리한 경우 7%)으로 EtxB에 반응하기 때문에 관찰된 효과를 설명할 수 없다(표 3). 세포 소멸은 각각 덱사메타존의 부재하에 또는 존재하에 18 시간 동안 배양한 후에 흉선 세포의 40% 및 98%에서 검출되었다.
배양물에서 관찰되는 형태 변화가 세포 소멸의 유도와 관련이 있다는 것을 보여주기 위해서, EtxB로 18 시간 동안 처리한 SPLTC 배양물중 서브이배체 DNA의 형태를 평가하였다. 프로피듐 요오드화물 및 항-CD8 또는 항-CD4 항체로 동시 염색한 후에 세포를 유동 원형질 세포 계측법으로 분석하였다(도 8). EtxB로 배양시킨 배양물으로부터의 CD8+T 세포의 약 48%가 프로피듐 요오드화물 염색의 이배체 G0/G1피크 아래에 있으며, 이는 세포 소멸을 진행하고 있다는 것을 알려준다(O'Connor, P.M. 등, 전술). 또한 EtxB를 사용한 배양물에서 CD4를 발현하는 세포의 작은 비율이 DNA의 서브-G0/G1농도를 나타내었다(~11%; CD8+T 세포의 고 비율의 사멸로부터 발생). 대조적으로, 항원없이 또는 EtxB(G33D)의 존재하에 배양되는 대다수의 CD4 또는 CD8+T 세포는 <5%의 세포 소멸을 나타내면서 세포주기의 G0/G1기에서 존재하였다. 본 연구진은 EtxB로 처리한 CD8+T 세포의 실질적인 비율에서 관찰된 핵 형태 변화, 및 DNA의 서브-G0/G1농도의 존재는 콜레라와 유사한 내독소에 의해 발생하는 선택적인 세포 소멸을 나타낸다는 결론을 얻었다. 수용체 결합 변종, 즉 EtxB(G33D)가 유사한 효과를 유발시키는데 실패했다는 것은 CD8+T 세포 소멸의 유도가 GM1 강글리오사이드에 결합할 수 있는 능력과 연관되었다는 것을 나타낸다.
실시예 3
8 수컷 DBA/1마우스 군은 항원투여하지 않거나(그룹 A) 또는 0일째에 CFA내의 소 콜라겐 100㎍을 측부로 피내(i.d.)주사하였다. 콜라겐 주입된 마우스는 비보호되거나(그룹 B; 양성 대조군) 또는; 0일에 IFA중 100㎍의 EtxB(그룹 C), 14일에 IFA중 100㎍의 EtxB(그룹 D) 및 0일에 IFA중 100㎍의 EtxB(G33D)(그룹 E)의 콜라겐 항원으로 이웃하는 부위에 피내 투여하므로서 질환의 진전을 방지하도록 시도할 수 있다.
그룹 A의 동물을 제외한 모든 동물에게 21일에 피하로 IFA중 콜라겐의 추가 자극 투여량을 주고, 병의 정도는 후사지 과관절 두께(실험 A)를 측정하거나 또는 팽창을 위한 각 후 사지를 등급화하므로서 45일째에 평가하였다(등급 0-3, 여기서 0= 정상, 및 3= 최대 팽화; 실험 B).
수득한 결과는 도 9a 및 9b에 나타나있다. 이들은 EtxB가 콜라겐-유도된 관절염의 발달로부터 극적으로 보호되는 것을 보여준다(EtxB(G33D)는 아님).
실시예 4a
2개의 별도 인체 황갈색 코트 시료(정상 인체 혈액 공급자에서 수득)를 단핵 세포의 공급원으로 사용하였다. Ficoll-paque상에서 세포를 분리하고, 항원의 부재하에, 또는 지표로서 EtxB 또는 EtxB(G33D) 80㎍/㎖를 사용하여 배양하기 전에 광범위하게 세척하였다. 배양시키기 전에 각 시료에 대하여 세포군은 24% CD8+, 27% CD4+ 및 27% CD8+, 22.9% CD4+을 포함하였다. 배양 18 시간 후에, 소멸 세포의 외관은 아크리딘 오렌지로 염색한 세포의 시료에서 평가하였다(실시예 2에서 상세히 설명). 수득한 결과는 도 10에 나타나있다; 이는 EtxB(G33D)가 아니라 EtxB가 정상 인체 말초혈액 단핵 세포군에서 소멸을 유발한다는 것을 예시하고 있다.
실시예 4b
설치류 T 세포주, CPLL-2을 융합시키기 위해서 배양시킨 후 항원의 부재하에, 또는 지표로서 EtxB 또는 EtxB(G33D)의 존재하에 1×106세포/㎖에서 재접종하기 전에 세포를 세척하였다. 18 시간 후에, 시료를 제거하고 세포 소멸의 징후를 보이는 세포의 비율을 아크리딘 오렌지를 사용하여 평가하였다(실시예 2에서 상세히 설명). 수득한 결과는 표 1에 나타나있다. 이는 설치류 CTLL 세포와 비례하여 세포 소멸을 유도하는 GM1의 가교를 보여준다.
| 투여량 ㎍/㎖ | EtxB | EtxB(G33D) | EtxB* | EtxB(G33D)* |
| 0 | 117.9(7.9) | 146.8(3.5) | 124.5(14.6) | 116.1(6.35) |
| 5 | 4928(98.7) | 2860(3.8) | 2424(88.3) | 1431.5(37.5) |
| 10 | 6978(30.6) | 3681(4.6) | 2518(21.6) | 4231(96.4) |
| 20 | 7084(100) | 6912(47.3) | 4394(42.1) | 5075(24.8) |
| 40 | 8844(26) | 8586(143.7) | 7431(45.3) | 4368.5(118.9) |
| 80 | 10246(30.7) | 12510(121.8) | 7986(210.3) | 7276(369.5) |
| 160 | 11311(247) | 13525(352.7) | --- | --- |
완전 프로인트 보조액(CFA)내의 EtxB(G33D) 30 ㎍을 마우스에게 복강내 투여하였다. 장간막 림프절을 10일 후에 분리하엿다. 세포를 4일 동안 95℃에서 가열하여 생성되는, EtxB, EtxB(G33D) 또는 이들 단백질(*)의 분해된 단량체 형태의 존재하에 분리 및 항온처리하였다. 4일 째 최종 6시간 동안 (3H) dThd 1 μCi를 첨가하여 증식을 측정하였다. 비면역화시킨 마우스에서 분리한 세포는 <1500 cpm(160㎍/㎖ 투여량)을 나타내었다.
| 단백질 | IL-2(pg/㎖) | IFN-γ(pg/㎖) |
| EtxB | 318 | 2700 |
| EtxB(G33D) | 67 | 4068 |
CFA내의 EtxB(G33D)를 마우스에게 주사하고, 장간막 림프절을 10일 후에 분리하였다. 이어서, 세포는 EtxB 또는 EtxB(G33D)를 사용하여 생체내에서 배양하고, 상등액 시료는 세포 증식 5일 째에 시토킨 함량을 분석하였다.
| 세포 | 시간(h) | 항원 없음 | EtxB(G33D) | EtxB |
| MLNC | 4 | 0a(8) | 2(0) | 1(3) |
| 18 | 8(10) | 5(18) | 29(35) | |
| SPLTC | 4 | 3(7) | 2(6) | 3(5) |
| 18 | 17(5) | 16.5(12) | 31(32) | |
| 음성 선택 | ||||
| CD4 | 18 | 5(37) | 6(31) | 9(35) |
| CD8 | 18 | 18(11) | 19(15) | 76(73) |
| 양성 선택 | ||||
| CD4 | 18 | 6 | 4 | 6 |
| CD8 | 18 | 7 | 7 | 60 |
항원의 부재하에, 또는 EtxB 또는 EtxB(G33D)의 80㎍/㎖를 사용하여 4 또는 18 시간 배양한 후에 분획화된 CD4 및 CD8+T 세포의 핵 형태 변화는 아크리딘 오렌지로 염색한 후에 형광 물질 형미경 검사를 통하여 검사하였다. 총 MLN은 유착 세포가 고갈되었다. SPLTC는 2차 항체로서 마우스 γ-글로블린 및 토끼 항-마우스를 사용하여 코팅한 유리 비드 칼럼에서 음성 선택으로 분리하였다. 분획화된 SPLTC는 염소 항-래트 IgG(H+L)F(ab')2로 콘쥬게이트시킨 MACS 콜로이드의 초-상자성 미세비드를 사용하여 배양된 피코에리트린-항-마우스 CD4 또는 FITC-항-마우스 CD8α로 표지한 후에 수득하였다. 양성적으로(>99% 순도) 및 음성적으로(>90% 순도) 선택한 분획을 수득하기 위해서 미니-MACS를 사용하여 CD4 및 CD8+T 세포를 분리하였다. 핵 형태 변화는 도 7의 범례에 기술된 바와 같이 1회 처리당 무작위 시료 200 세포에서 4 내지 18 시간에 검사하였다. 세포 소멸의 최대 비율은 18 시간후에 발생하였다. 괄호안의 자료는 또 다른 별도의 실험 결과를 나타낸다. MLN 및 SPLTC에 대한 자료는 총 4개의 실험을 대표하는 것이다.*소멸된 세포 백분율.
Claims (16)
- (i) Ctx 또는 Etx, 또는 Ctx 및 Etx의 B 서브유니트외에, GM-1 결합 활성을 갖는 제제; 또는(ii) GM-1 매개된 세포내 시그널링 작용에 영향을 미치나, GM-1 결합 활성은 없는 제제 중에서 선택된 제제로서, 자가면역 질환의 치료 또는 예방을 위해 사용되는 제제.
- 자가 면역 질환의 치료 또는 예방을 위한 제제로서 사용하기 위한 약제 제조에 사용되는 Ctx, Etx, 또는 Ctx 또는 Etx의 B 서브유니트의 용도.
- (i) GM-1 결합 활성을 갖는 제제; 또는(ii) GM-1 매개된 세포내 시그널링 작용에 영향을 미치나, GM-1 결합 활성은 없는 제제에서 선택된 제제의 유효량을 포유동물 검체에게 투여하여 자가면역 질환을 치료하는 방법.
- 제 3 항에 있어서, 상기 제제가 자가 또는 교차-반응 항원과 동시 투여되는 방법.
- (i) GM-1 결합 활성을 갖는 제제; 또는(ii) GM-1 매개된 세포내 시그널링 작용에 영향을 미치나, GM-1 결합 활성은 없는 제제, 및 이의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 포유동물의 자가면역 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물 .
- 제 5 항에 있어서, 자가 항원 결정 인자 또는 교차 반응 항원 결정 인자를 추가로 포함하는 약학적 조성물.
- 제 5 항에서 정의한 약학적 조성물을 포함하고, 이와는 별도로 자가 반응 또는 교차-반응 항원성 결정 인자를 포함하는 약학적 조성물을 포함하는 키트.
- (i) Ctx 또는 Etx, 또는 Ctx 및 Etx의 B 서브유니트외에, GM-1 결합 활성을 갖는 제제; 또는(ii) GM-1 매개된 세포내 시그널링 작용에 영향을 미치나, GM-1 결합 활성은 없는 제제 중에서 선택된 제제로서, T 세포 기원의 인체 백혈병 치료에 사용되는 제제.
- T 세포 기원의 인체 백혈병 치료하기 위한 약제 제조에 사용되는 Ctx 또는 Etx, 또는 Ctx 및 Etx의 B 서브유니트의 용도.
- (i) GM-1 결합 활성을 갖는 제제; 또는(ii) GM-1 매개된 세포내 시그널링 작용에 영향을 미치나, GM-1 결합 활성은 없는 제제 중에서 선택된 제제의 유효량을 포유류 검체에게 투여하여, T 세포 기원의 인체 백혈병을 치료하는 방법.
- (i) GM-1 결합 활성을 갖는 제제; 또는(ii) GM-1 매개된 세포내 시그널링 작용에 영향을 미치나, GM-1 결합 활성은 없는 제제, 및 이의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 T 세포 기원의 인체 백혈병 치료용 약학적 조성물.
- (i) Ctx 또는 Etx, 또는 Ctx 및 Etx의 B 서브유니트외에, GM-1 결합 활성을 갖는 제제; 또는(ii) GM-1 매개된 세포내 시그널링 작용에 영향을 미치나, GM-1 결합 활성은 없는 제제 중에서 선택된 제제로서, 이식 거부 반응 또는 GVHD의 예방/치료에 사용되는 제제.
- 이식 거부 반응 또는 GVHD의 예방을 위한 약제 제조에 사용되는 Ctx 또는 Etx, 또는 Etx 또는 Ctx의 B 서브유니트의 용도.
- (i) GM-1 결합 활성을 갖는 제제; 또는(ii) GM-1 매개된 세포내 시그널링 작용에 영향을 미치나, GM-1 결합 활성은 없는 제제에서 선택된 제제의 유효량을 포유류 검체에게 투여하여, 이식 거부반응 또는 GVHD을 예방 또는 치료하는 방법.
- (i) Ctx 또는 Etx, 또는 Ctx 및 Etx의 B 서브유니트외에, GM-1 결합 활성을 갖는 제제; 또는(ii) GM-1 매개된 세포내 시그널링 작용에 영향을 미치나, GM-1 결합 활성은 없는 제제 중에서 선택된 제제로서, 포유류 검체의 백신 접종에 사용되는 제제.
- (i) Ctx 및 Etx외에, GM-1 결합 활성을 갖는 제제; 또는(ii) GM-1 매개된 세포내 시그널링 작용에 영향을 미치나, GM-1 결합 활성은 없는 제제중에서 선택된 제제의 유효량을 관련성 없는 이종 항원 결정 인자의 유효량과 함께 포유류 검체에게 동시 투여하여, 포유류 검체에게 백신을 접종하는 방법.
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