CZ1298A3 - Terapeutická činidla pro léčení autoimunitních onemocnění, farmaceutický prostředek, kit obsahující farmaceutický prostředek a použití - Google Patents
Terapeutická činidla pro léčení autoimunitních onemocnění, farmaceutický prostředek, kit obsahující farmaceutický prostředek a použití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ1298A3 CZ1298A3 CZ9812A CZ1298A CZ1298A3 CZ 1298 A3 CZ1298 A3 CZ 1298A3 CZ 9812 A CZ9812 A CZ 9812A CZ 1298 A CZ1298 A CZ 1298A CZ 1298 A3 CZ1298 A3 CZ 1298A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- etxb
- agent
- cells
- ctx
- binding
- Prior art date
Links
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 title claims abstract description 23
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims description 39
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 title description 32
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 103
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 91
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 81
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims abstract description 32
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 30
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 claims abstract description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 106
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 82
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 31
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 30
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 30
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 20
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 18
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 claims description 6
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000007781 signaling event Effects 0.000 claims description 3
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 claims 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 abstract description 3
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 45
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 45
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 40
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 38
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 38
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 31
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 29
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 28
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 28
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 24
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 19
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 18
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 16
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 16
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 16
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 15
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 14
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 14
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 14
- 230000004044 response Effects 0.000 description 14
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 12
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 12
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 10
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 10
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 10
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 8
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 8
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 7
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 7
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 7
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 7
- 210000002011 intestinal secretion Anatomy 0.000 description 7
- 230000003844 B-cell-activation Effects 0.000 description 6
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 6
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 6
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 6
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 6
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 5
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 5
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 5
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 5
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 230000033540 T cell apoptotic process Effects 0.000 description 4
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- QPJBWNIQKHGLAU-IQZHVAEDSA-N ganglioside GM1 Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC[C@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)[C@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](CO)O1 QPJBWNIQKHGLAU-IQZHVAEDSA-N 0.000 description 4
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 4
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 4
- 229940097496 nasal spray Drugs 0.000 description 4
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 3
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 3
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 3
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 3
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 3
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 3
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000009699 differential effect Effects 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000009386 Experimental Arthritis Diseases 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical group N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 101710182223 Toxin B Proteins 0.000 description 2
- 241000607284 Vibrio sp. Species 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 208000024340 acute graft versus host disease Diseases 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 101150008083 ant gene Proteins 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001218 confocal laser scanning microscopy Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 2
- 108010055409 ganglioside receptor Proteins 0.000 description 2
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 2
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 2
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 2
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 2
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 238000004989 laser desorption mass spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 2
- 210000000207 lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 102220226165 rs771426932 Human genes 0.000 description 2
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 230000020192 tolerance induction in gut-associated lymphoid tissue Effects 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- OZRFYUJEXYKQDV-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[2-[(2-amino-3-carboxypropanoyl)amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]butanedioic acid Chemical compound OC(=O)CC(N)C(=O)NC(CC(O)=O)C(=O)NC(CC(O)=O)C(=O)NC(CC(O)=O)C(O)=O OZRFYUJEXYKQDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 102100034612 Annexin A4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000669 Annexin A4 Proteins 0.000 description 1
- XUKUURHRXDUEBC-KAYWLYCHSA-N Atorvastatin Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1=C(C=2C=CC(F)=CC=2)N(CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC(O)=O)C(C(C)C)=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 XUKUURHRXDUEBC-KAYWLYCHSA-N 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108700031361 Brachyury Proteins 0.000 description 1
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 102100030497 Cytochrome c Human genes 0.000 description 1
- 108010075031 Cytochromes c Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101100133212 Drosophila melanogaster NetB gene Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- BAQCROVBDNBEEB-UBYUBLNFSA-N Metrizamide Chemical compound CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C(=O)N[C@@H]2[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)OC2O)O)=C1I BAQCROVBDNBEEB-UBYUBLNFSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101001044384 Mus musculus Interferon gamma Proteins 0.000 description 1
- 101001033265 Mus musculus Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 101001043827 Mus musculus Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001002703 Mus musculus Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000960966 Mus musculus Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010089814 Plant Lectins Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 1
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108010078814 Tumor Suppressor Protein p53 Proteins 0.000 description 1
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003092 anti-cytokine Effects 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 210000000649 b-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000005266 beta plus decay Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000025084 cell cycle arrest Effects 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000009134 cell regulation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010428 chromatin condensation Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001236 detergent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000000212 effect on lymphocytes Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101150021159 etxB gene Proteins 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000004073 interleukin-2 production Effects 0.000 description 1
- 210000005024 intraepithelial lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- GRHBQAYDJPGGLF-UHFFFAOYSA-N isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S GRHBQAYDJPGGLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 238000005567 liquid scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229960000554 metrizamide Drugs 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000016379 mucosal immune response Effects 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000003726 plant lectin Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- MFAFRIKAXPDIQH-UHFFFAOYSA-N propanoic acid;hydroiodide Chemical compound I.CCC(O)=O MFAFRIKAXPDIQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000026267 regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000007727 signaling mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/868—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving autoimmunity, allergy, immediate hypersensitivity, delayed hypersensitivity, immunosuppression, or immunotolerance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
I
Terapeutická činidla pro léčeni autoimunitnich onemocněni, farmaceutický prostředek, kit obsahující farmaceutický prostředek a použití i
J
Oblast techniky
Vynález se týká terapeutických činidel pro použití při léčení savčích, obzvláště lidských, autoimunitnich I____________o_nemo_c.nění---Vynález—se—ta-ké—-tý-k-á—feeisapeutiekýeh—činidel použitelných pro léčeni lidských leukémii T-buněčného původu, jako takzvaných vakcinových nosičů a jako činidla pro prevenci lidského odmítáni transplanátu nebo onemocnění štěp versus hostitel ' (graft versus host - GVHD) .
Dosavadní stav techniky
i. Terapeutická činidla a au to imunitní onemocnění.
. v článku, nazvaném Morphologic and Functional Alteration of
Mucosal Cells by Cholera Toxin an its Subunit (Morfologická a funkční změna mukózních T buněk cholerovým toxinem a jeho podjednotkou), autoři Charles 0. Elson a kol., The Journal of Immunology, 1995, 154; 1032-1040, je popsáno, že cholerový toxin (Ctx) a jeho podjednotka CtxB inhibují CD8+ a CD4+ T buňky.
Je také podána reference na článek nazvaný Prevention of Acute Graft-Versus-Host Disease by Treatment with Novel Immunosuppressant (Prevence akutního onemocněni štěpversus-hostitel léčením novým imunosupresivem) od B.
- Yankeleviche a kol.,· The Journal of Immunology, 1995, 154:
3611-3617. Tento článek identifikuje CtxB jako činidlo pro prevenci akutního onemocnění štěp-versus-hostitel (GVHD) při transplantaci kostní dřeně.
WO 95/10301 popisuje činidlo pro vyvolání imunologické -----------s-ná-ša-n-l-i-v-os-fe-i—z-ahmu-j-í-el—mu-kó-zně—vá-zanou—mrrlekulu, vázanou ke specifickému tolerogenu.
Zkratka Ctx bude dále používána k označení cholerového toxinu a CtxB k označení podjednotky B cholerového toxinu.
V jiných textech jsou někdy označovány jako CT nebo Ct a CTB nebo CtB”. Zkratka Etx bude dále používána pro označení tepelně nestabilního enterotoxinu E. coli a EtxB bude používána pro označení podjednotky B enterotoxinu Etx.
V jiných textech jsou někdy označovány jako ET nebo Et a ETB nebo EtB.
Podstata vynálezu
Základem pro všechny předměty předkládaného vynálezu je zjištění, že EtxB (jednotka B tepelně nestabilního enterotoxinu E. coli) se váže ke GMl-gangliosidovým receptorům, které se nacházejí na površích savčích buněk a
že tato vazba indukuje diferenciální účinky na populace lymfocytů, zahrnující odstranění CD8+ T buněk a související aktivaci B buněk. K těmto účinkům nedochází, pokud je použit mutant proteinu EtxB, který postrádá účinek vazby na GM1.
Autoimunitní onemocnění
Autoimunita je termín, který je používán k popisu mechanismu, kterým tělo generuje imunitní odezvu na vlastni antigeny.
-------:-----B-r-v-n-i-m-^-ředmětem—v-y-n-áie-zu—j-e------------------------------------------------ (I) činidlo mající účinek vazby na GM-1, jiné než Ctx nebo
Etx, nebo B podjednotka Ctx nebo Etx nebo (II) činidlo, působící na GM-1 zprostředkované vnitrobuněčné signální události, ale nemající účinek vazby na GM-1, jako činidlo pro léčení nebo prevenci autoimunitních onemocnění.
Bylo zjištěno, že činidla podle předkládaného vynálezu modulují lymfocytové populace, což vede k apoptóze CD8+ T buněk, zvýšené aktivaci CD4+ buněk a polyklonální aktivaci B 'Μ=^_^.μηέ^^=σ.θ.^ρχχνάέροάουηέ,^-ζ·θ-=^·3ΐο=-υ4ύ4ίθ3ύ—posune imunitní odezvu směrem k indukci Th2 asociovaných cytokinů. Má se za to, že takováto odezva na vlastní nebo křížově reagující antigeny zprostředkovává ochranu proti jistým autoimunitním onemocněním.
V prvním provedení tohoto prvního předmětu předkládaného vynálezu je činidlo použito ve způsobu léčení autoimunitního onemocněni, které již vypuklo. V tomto provedeni je činidlo podáváno pacientovi bez nebo spolu se současným podáváním vlastního nebo křížově reagujícího antigenu. Podávání činidla podle tohoto provedení prvního předmětu vynálezu moduluje povahu imunitní odezvy na vlastní antigen a odklání ji od aktivace onemocnění způsobujících zánětů a tudíž chrání proti autoimunitnímu onemocnění.
Ve druhém provedení tohoto prvního předmětu předkládaného vynálezu je činidlo použito jako způsob vakcinace savčího subjektu proti autoimunitnímu onemocnění, ve kterém je -------ě-i-n-i-d-1-θ—pod-á-vá-no—s-ou-ča-sné—s~νΙ^Έΐττίτη-neťbo-kríTžove reagujTčim antigenovým determinantem (nebo s kombinací různých vlastních nebo křížově reagujících antigenových determinantů), vztahujících se k uvedenému onemocnění. Tímto způsobem je imunitní odezva subjektu na vlastní nebo křížově reagující antigen odchýlena od aktivace patogeneze, takže tím chrání proti budoucí autoimunitní odezvě na vlastní antigen.
Podle tohoto prvního předmětu vynálezu jsou a nebo mohou být subjektu současně podávány terapeutické činidlo a vlastní . nebo, křížově reaguj ící antigenovým determinant. Tím-se míní, že místo a doba podávání jak terapeutického činidla, tak antigenového determinantu, jsou takové, že je dosaženo potřebné modulace imunitního systému. Proto, i když terapeutické činidlo a antigenový determinant mohou být podávány v témže místě a v tutéž dobu, může dojít k tomu, že je výhodné podávat terapeutické činidlo a antigenový determinant v různých okamžicích a v různých místech.
I když může být podáni jednoduché dávky terapeutického činidla a antigenového determinantu dostatečné, podávání vícenásobných dávek také spadá do rozsahu tohoto prvního předmětu vynálezu.
V tomto druhém provedení prvního předmětu vynálezu mohou být terapeutické činidlo a antigenový determinant vázány, například vázány kovalentní vazbou, tak, aby tvořily jediné aktivní činidlo, ačkoliv výhodně je používáno oddělené podávání, ve kterém terapeutické činidlo a antigenový -----d-ebe-rm-i-na-n-t—n-eg-s-ou—tíirrtO—způ-SOtrem va~zanyi neboť j“ě ťim umožněno oddělené podávání jednotlivých částí.
Specifická autoimunitní onemocnění, která mohou být léčena v souladu s tímto prvním předmětem vynálezu, jsou autoimunitní onemocnění, ve kterých je patologie spojena s buněčnou imunitou, jako je revmatická artritida, roztroušená skleróza a diabetes.
Tento první předmět předkládaného vynálezu se také navíc týká použiti Ctx, Etx nebo podjednotky B toxinu Ctx nebo Etx . =pr.o.=výr-obu léčiv, použité 1 ných - j a ko č ini de 1 pro- iéčen i nebo prevenci autoimunitních onemocnění.
Vynález se také týká farmaceutického prostředku pro léčení lidských autoimunitních onemocnění, obsahující:
(I) činidlo, mající účinek vazby na GM-1 nebo (II) činidlo, působící na GM-1 zprostředkované vnitrobuněčné signální události, ale nemající účinek vazby na GM-1
a jeho farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo.
Farmaceutický prostředek podle tohoto předmětu vynálezu může být vytvořen tak, aby mohl být podáván mukózni cestou (přes sliznici), například jako nosní spray nebo parenterálně, kdy je prostředek vytvořen v injektovatelné formě pro podávání například intravenózní, intramuskulární nebo subkutánní cestou.
Farmaceutické prostředky mohou být vytvořeny tak, že zahrnují vhodný vlastní nebo křížově reagující antigen.
-A-l-bem-a-t-i-v-ně---mů-že---být---vytvoře-na---soupravap----ob’sairaj“í“cí“ oddělené kompozice pro terapeutické činidlo a pro antigenový determinant.
Specifická terapeutická činidla, která mohou být použita podle tohoto předmětu vynálezu jsou EtxB a CtxB nebo jejich mutanty, zachovávající si účinek vazby na GM1.
Činidla pro použití podle prvního předmětu vynálezu jsou výhodně v podstatě netoxická, ačkoliv jistý stupeň toxicity může být tolerován v případě náročné terapie tohoto typu.
Tento první předmět vynálezu se také vztahuje na všechna činidla,, mající účinek vazby na GM1, určená pro léčení savčích autoimunitních onemocnění, stejně tak jako na činidla, působící na GM-1 zprostředkované vnitrobuněčné signální události, které tím napodobují činidla, vážící se na GM-1.
·· ♦ ·· ♦· ·· • · · · · · ·· · · • · é · « · ··· • ······· b · · · · · · • · · · · ·· · ·· · ·· ···· ··
Tento první předmět vynálezu tedy není omezen na použití proteinu EtxB jako terapeutického činidla pro léčení lidských autoimunitních onemocnění. Na druhé straně ale je protein EtxB (který je pentamerem pěti identických podjednotek) výhodným provedením takového léčení podle předkládaného vynálezu. Kromě přírodního typu EtxB se toto výhodné provedení vynálezu také vztahuje na mutanty EtxB, které mají účinek vazby na GM-1 stejně tak jako na dáTsi ekvivalentní proteiny, jako je podjednotka B cholerového toxinu (CtxB) a jeho mutantů, které mají účinek vazby na GM1.
Další terapeutická činidla pro léčení autoimunitních onemocnění podle prvního předmětu předkládaného vynálezu jsou humanizované monoklonální protilátky, které váží GM1. Způsoby pro identifikaci a získávání takových činidel jsou dobře známy odborníkům.
T-lymfocytové leukémie
Druhým předmětem předkládaného vynálezu je použití (I) činidla majícího účinek vazby na GM-1, jiného než Ctx nebo -Etx, nebo B podj ednotky Ctx nebo. Etx nebo _,_______ (II) činidla, působícího na GM-1 zprostředkované vnitrobuněčné signální události, ale nemajícího účinek vazby na GM-1, pro léčení lidských leukémií T-buněčného původu, jako jsou lidské leukémie CD8 T-buněčného původu.
Činidla pro použití podle druhého předmětu vynálezu jsou • ·
výhodně v podstatě netoxická, ačkoliv jistý stupeň toxicity může být tolerován v případě náročné terapie tohoto typu.
Tento druhý předmět předkládaného vynálezu se také navíc týká použití Ctx, Etx nebo podjednotek B toxinu Ctx nebo Etx pro výrobu léčiv pro léčeni lidských leukémií T-buněčného původu, jako jsou lidské leukémie CD8 T-buněčného původu.
Vynález se také týká farmaceutického prostředku pro léčení lidských leukémií T-buněčného původu, obsahujícího:
(I) činidlo, mající účinek vazby na GM-1 nebo ě-i-n-i-d-l-o—p-ů-s-obí-cí—n.a_GM^l_z_pr o středkované vnitřobuněčné signální události, ale nemající účinek vazby na GM-1 a jeho farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo.
Farmaceutický prostředek podle tohoto předmětu vynálezu může být vytvořen tak, aby mohl být podáván mukózní cestou, například jako nosní spray nebo parenterálně, kdy je prostředek vytvořen v injektovatelné formě pro podávání například intravenózní, intramuskulární nebo subkutánní cestou.
-.-„=,.=Te-nto=..druh.ý.^.pxe-dmě_t^ vynálezu se tgké vztahuje na všechna činidla, mající účinek vazby na GM1, určená pro léčení lidských leukémií T-buněčného původu, stejně tak jako na činidla, působící na GM-1 zprostředkované vnitrobuněčné signální události, která tím napodobují prostředky, vážící se na GM-1.
Tento druhý předmět vynálezu tedy není omezen na použití ·>
proteinu EtxB jako terapeutického činidla pro léčení lidských leukémií T-buněčného původu. Na druhé straně ale je protein EtxB výhodným provedením takového léčení podle předkládaného vynálezu. Kromě přírodního typu EtxB se toto výhodné provedeni vynálezu také vztahuje na mutanty EtxB, které mají účinek vazby na GM-1 stejně tak jako na další ekvivalentní proteiny, jako je podjednotka B cholerového toxinu (CtxB) á~3eho mutanťůg—ktexé-ma-jú—ůěú-ne-k—v-a-zb-y—Jia—GM_ 1.
Další terapeutická činidla pro léčení těchto onemocnění podi-e---boh-o-to---př.edmě±u předkládaného vynálezu jsou humanizované monoklonální protilátky, které vazí GMTt Způsoby pro identifikaci a získávání takových činidel jsou dobře známy odborníkům.
Odmítáni transplanátu a GVHD
Třetím předmětem předkládaného vynálezu je použití (I) činidla majícího účinek vazby na GM-1, jiného než Ctx nebo Etx, nebo B podjednotky Ctx nebo Etx nebo (II) činidla, působícího na GM-1 zprostředkované
- ,. Vn 1 t,r_o buněčné^ s ipnálni ..událostmi, ale nemá jícího účinek vazby na GM-1, jako terapeutického činidla pro prevenci/léčení odmítání transplanátu nebo GVHD.
Tento třetí předmět předkládaného vynálezu se také navíc týká použití Ctx, Etx nebo podjednotky B toxinu Ctx nebo Etx pro výrobu léčiv, použitelných jako léčiv pro prevenci odmítání transplanátu nebo GVHD.
Ve výhodném provedení tohoto předmětu vynálezu mohou být popsaná terapeutická činidla použita pro prevenci odmítání transplanátu pevného orgánu, buď alogenického nebo xenogenického. Tato činidla také mohou být používána pro prevenci akutního onemocnění GVHD, například v průběhu procedury transplantace Jcošbrrí-dřen±^---------------------
V provedení tohoto předmětu vynálezu, ve kterém je pacient ošetřen před transplantací, by mělo být terapeutická činidlo
--------p-cd-á-v-á-n-e—s-e-u-ša-s-n-ě—s—a-l-O-a.nt.ig_enem nebo xenoant igenem.__
V provedení tohoto předmětu vynálezu, ve kterém jsou terapeutické činidlo a alo- nebo xenogenní determinant podávány subjektu současně, se tím míní, že místo a doba podávání jak terapeutického činidla, tak antigenového determinantu, jsou takové, že je dosaženo potřebné modulace imunitního systému. Proto, i když terapeutické činidlo a antigenový determinant mohou být podávány v témže místě a v tutéž dobu, může být výhodné podávat terapeutické činidlo a antigenový determinant v různých okamžicích a v různých ____Dál.e._ mohou být terapeutické činidlo a antigenový determinant kovalentně vázány tak, aby tvořily jediné aktivní činidlo, ačkoliv výhodně je používáno oddělené podávání, ve kterém terapeutické činidlo a antigenový determinant nejsou tímto způsobem vázány, neboť je tím umožněno oddělené podávání jednotlivých částí.
Podle tohoto předmětu vynálezu, pokud je terapeutické «· « φ • · * ·
- 11 činidlo používáno pro prevenci GVHD, bude činidlo normálně aplikováno přímo na buňky, například na buňky kostní dřeni, které jsou určeny pro transplantaci.
Činidlo je výhodně v podstatě netoxické, ačkoliv jistý stupeň toxicity může být tolerován v případě náročné terapie tohoto typu.
Vynález se také týká farmaceutického prostředku pro léčení odmítání transplanátů, obsahující:
(I) činidlo, mající účinek vazby na GM-1 nebo
4-T-T-)—pů.s.o.b-í-cl na GM-1 zprostředkované vnitrobuněčné signální události, ale nemající účinek vazby ná“GM^l a jeho farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo.
Farmaceutický prostředek podle tohoto předmětu vynálezu může být vytvořen tak, aby mohl být podávána mukózní cestou, například jako nosní spray nebo parenterálně, kdy j e prostředek vytvořen v injektovatelné formě pro podávání například intravenózní, intramuskulární nebo subkutánní cestou.
.. Farmaceutické__prostředky mohou být vytvořeny tak, že zahrnují vhodný alo- nebo xenogenní determinant. Alternativně může být vytvořena souprava, obsahující oddělené kompozice pro terapeutické činidlo a pro antigenový determinant.
Tento třetí předmět vynálezu se také vztahuje na všechna činidla, mající účinek vazby na GM1, určená pro
prevenci/léčeni odmítáni transplanátu a GVHD, stejně tak jako na činidla, působící na GM-1 zprostředkované vnitrobuněčné signální události, která tím napodobují činidla, vážící se na GM-1.
Tento třetí předmět vynálezu tedy není omezen na použití proteinu EtxB jako terapeutického činidla pro prevenci odmítání transplanátu. Na druhé straně aíě je prote’i“n~EtxB(který je pentamerem pěti identických podjednotek) výhodným provedením takového léčení podle předkládaného vynálezu. Kromě přírodního typu EtxB se toto výhodné provedení 'vynážte-zu—také—v-z-ta-h-u-j-e—n-a—mu-ta-nty—Et-xB-,—které—maj_í_účine k vazby na GM-1 stejně tak jako na další ekvivalentní proteiny, jako je podjednotka B cholerového toxinu (CtxB) a jeho mutantů, které mají účinek vazby na GM-1.
Další terapeutická činidla pro léčení autoimunitních onemocnění podle prvního předmětu předkládaného vynálezu jsou humanizované monoklonální protilátky, které váží GM1. Způsoby pro identifikaci a získávání takových činidel jsou dobře známy odborníkům.
CtxB a EtxB již byly navrženy jako takzvané vakcinové nosiče. Bylo zjištěno, že základem pro tento jev je zčásti schopnost EtxB moduloval lymfocytové populace (jak bylo diskutováno výše) vazbou k receptoru GM-1.
Čtvrtým předmětem předkládaného vynálezu je tedy použití
9·4 • · « 9 9 9 9 9 99'9
9 9 9 9 9 9 99 99
-IQ — 9 9 9999 9 9 9 9 · 99 9 99
9 9 9 9 9 9 99 ♦ '· 9. 99 9999 99 99 (I) činidla majícího účinek vazby na GM-1, jiného než Ctx nebo Etx, nebo B podjednotky Ctx nebo Etx nebo (II) činidla, působícího na GM-1 zprostředkované vnitrobuněčné signální události, ale nemajícího účinek vazby na GM-1, pro vakcinaci savčích subjektů
Činidlo je schopno modulace imunitní odezvy, pokud je podáváno společně s k němu se nevztahujícím cizím antigenovým determinantem. Pokud je činidlo podáváno parenterálně, je taková imunomodulace v pojmech imunitní odezvy—-smě-řován-a——u-rěi-tým—po-ž-a-do-v-a-n-ým—s-mě-rem-.--Rok-ud—j-e----------činidlo podáváno mukózně s k němu se nevztahujícím antigenem, jako takzvaný mukózní adjuvans, činidlo je schopno usnadnit mukózní imunitní odezvu na uvedený nevztahující se antigen. Antigen a činidlo mohou být podávány buď odděleně nebo mohou být spolu vázány, například kovalentni vazbou.
Činidlo je výhodně netoxické. Navíc pokud je činidlo podáváno mukózně gastrointestinální sliznicí, musí být schopno zůstat stabilní v průběhu průchodu gastrointestinálním traktem; například musí, být odolné.. =k „ _________ ..
proteolytické degradaci, stabilní při kyselém pH a odolné k detergentním účinkům žluči.
Vynález se také týká farmaceutického prostředku pro vakcinaci savčích subjektů, obsahujícího:
(I) činidlo, mající účinek vazby na GM-1 nebo (II) činidlo, působící na GM-1 zprostředkované vnitrobuněčné
signální události, ale nemající účinek vazby na GM-1 a jeho farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo.
Farmaceutický prostředek podle tohoto předmětu vynálezu může být vytvořen tak, aby mohl být podávána mukózni cestou (přes » sliznici), například jako nosní spray nebo parenterálně, kdy je prostředek vytvořen v injektovatelné formě pro podávání například intravenózni! fnt r amu s’knTá'rn'i nebo s-utoku-tán-n-ícestou.
Farmaceutický prostředek může být vytvořen tak, že zahrnuje vhodný---an-t-íg-e-n-n-í---de-te-rminant--Al-t-exnativně může být vytvořena souprava, obsahující oddělené kompozice pro terapeutické činidlo a pro antigenový determinant.
Tento čtvrtý předmět vynálezu se také vztahuje na použití všech činidel, majících účinek vazby na GM1, jako imunomodulátorů, stejně tak jako na činidla, působící na GM1 zprostředkované vnitrobuněčné signální události, která tím napodobují činidla, vážící se na GM-1.
Tento čtvrtý předmět vynálezu tedy není omezen na použití -^-^.p-Eot-e-in-u—. E t-xB—gako^imunomodul-átoru.., _Na m druhé _straně^ ale _ j e protein EtxB (který je pentamerem pěti identických podjednotek) výhodným provedením takového léčení podle předkládaného vynálezu. Kromě přírodního typu EtxB se toto výhodné provedení vynálezu také vztahuje na mutanty EtxB, které mají účinek vazby na GM-1 stejně tak jako na další ekvivalentní proteiny, jako je podjednotka B cholerového toxinu (CtxB) a jeho mutantů, majících účinek vazby na GM-1.
• ·· • ·· • ·· • ··
Další terapeutická činidla pro léčení autoimunitních onemocnění podle čtvrtého předmětu předkládaného vynálezu jsou humanizované monoklonální protilátky, které váží GM1. Způsoby pro identifikaci a získávání takových činidel jsou dobře známy odborníkům.
Pokud je terapeutické činidTo podTe- vynále-zu—p-r-ote-i-n-v—j-a-k-oje podjednotka EtxB nebo podjednotka CtxB, může být produkováno pro použití podle kteréhokoli předmětu vynálezu způsobem, ve kterém je gen nebo geny, kódující specifický peptřdový---řetě-z-e-e---(-nebo---ře-t-ě.zc.el , z něhož je protein vytvořen, jsou vloženy do vhodného vektoru a potom pouzífy pro transfekci vhodného hostitele. Například gen kódující polypeptidový řetězec, ze kterého se vytváří EtxB může být vložen například do plasmidu pMMB68, který je potom použit pro transfekci hostitelské buňky, jako je Vibrio sp.6O. Protein je purifikován a izolován způsobem, který je znám jako per se. Mutované geny, exprimující účinný mutant proteinu EtxB mohou být vytvořeny známými způsoby z genu přírodního typu.
Jak bylo řečeno výše, činidla, které maji účinek vazby na GM-1, jako jsou specificky navržené humanizované monoklonální protilátky, mohou být navrženy a produkovány způsobem, který je nastíněn výše způsoby dobře známými odborníkům.
Podle všech předmětů vynálezu může být činidlo, mající účinek vazby na GM-1, schopné křížové vazby GM1 receptorů.
EtxB je jedním takovým činidlem, které je schopno křížové vazby GM1 receptorů, díky své pentamerické formě.
Přehled obrázků na výkresech &
Vynález bude nyní ilustrován s odvoláním na přiložené
---------obrázky a na po ničfi-našTědujdtcl—pí±k±ady-;------------------—
Stručný popis obrázků.
----------©br-;—1—p-řed-s-t-a-vug-e—analýzu fyzikálně chemických vlastností EtxB a mutované podoby EtxB (EtxB(G33D)).
Obr. 2 ilustruje, že receptorová vazba EtxB je podstatná pro jeho silnou imunogenicitu in vivo.
Obr. 3 ilustruje kinetiku proliferace lymfocytů, která následuje po injekci EtxB myši.
Obr. 4 ilustruje, že EtxB způsobuje zvýšenou aktivaci B «J| buněk.
Obr. 5 ilustruje, že EtxB způsobuje zvýšenou aktivaci CD4+ T buněk a odstranění CD8+ T buněk.
Obr. 6 ukazuje selektivní odstranění OVA-responsivních CD8+T buněk pomocí EtxB.
Obr. 7 ukazuje, že receptorová vazba podjednotkou EtxB »· ♦ ♦ · indukuje změny vlastnosti lymfocytové jaderné morfologie buněk, které byly podrobeny apoptóze.
Obr. 8 ukazuje apoptózu CD8+ T buněk, zprostředkovanou EtxB receptory, měřenou analýzou buněčného cyklu.
Obr. 9 a 9b ukazují výsledky experimentů prováděných s cílem ukázat, že vazba GM-1 pbdj“ěd.nOfkOU—EtxB—i-n-hi-bu-j-e—vývinkolagenem indukované artritidy u živočišného modelu.
Obr. 10 ukazuje výsledky experimentů prováděných s cílem -uká-za-t7—ž-e—EtxB-,—a-l-e—n-ikod_i_EtxB (G33D) , indukuje apoptózu v populacích normálních lidských periferních kreVnlrch“ jednojaderných buněk.
Obr. 11 ukazuje výsledky experimentů ukazujících, že křížová vazba GM1 vede k apoptóze myších CTLL buněk.
Podrobný popis obrázků
Obrázek 1
Analýza fyzikálně chemických vlastností EtxB a EtxB(G33D).
(A) SDS-PAGE analýza EtxB nebo EtxB(G33D): 5 μς každého proteinu bylo analyzováno za redukčních podmínek v přítomnosti β-merkaptoethanolu jak s předchozím zahříváním tak i bez předchozího zahřívání. Pás 1 ukazuje přírodní typ EtxB, nezahřívaný. Pás 2, EtxB(G33D), nezahřívaný. Pás 3, přírodní typ EtxB, zahřívaný na 95 °C. Pás 4, EtxB(G33D), zahřívaný na 95 °C. Standardy molekulové hmotnosti (BioRad)
- 18 jsou ukázány na levé straně panelu.
(B) Určeni zdánlivé molekulové hmotnosti EtxB a EtxB(G33D) gelovou filtrační chromatografií: standardní křivka (kroužky) byla generována ve směru shora dolů použitím hovězího sérového albuminu (66 kDa), albuminu slepičích vajec (45 kDa), hovězí erythrocytové karbonanhydrázy (29 IDa“) a kónš^keho s rděcnTho cytochromu c (12,4 kDa). EtxB a EtxB(G33D) byly vymývány se zdánlivou molekulovou hmotností 36 kDa, respektive 38 kDa. Ve znamená vymývací objem proteinu a Vo je mrtvý objem filtrační kolony.
(C) Test ELISA pro komparativní vazbu EtxB a EtxB(G33D) na gangliosid GM1: desky byly pokryty gangliosidem GM1, imobilizovány a inkubovány s 1 μς/πιΐ buď EtxB nebo EtxB(G33D) zředěným sériově (3-krát) z 1 μρ/ιηΐ.
Obrázek 2
Receptorová vazba ExtB je podstatná pro jeho silnou imunogenicitu in vivo __BALB/c myši (4 v každé skupině) byly buď injektovánv a . o
EtxB nebo EtxB(G33D) v PBS nebo jim byl protein podán orálně v uhličitanovém pufru. Sérum bylo analyzováno 10 dní po dvou s.c. injekcích (A) nebo 1 týden po 3 orálních dávkách (B) a střevní sekrece byla analyzována 1 týden po 3 orálních dávkách (C). U vzorků kontrolních myší (neznázorněno) nebyla pozorována žádná reakce. Výsledky jsou znázorněny jako střední titrace protilátky IgG v séru, zatímco IgA ve střevní sekreci je vyjádřen jako specifický účinek, který bude popsán níže.
Obrázek 3
Kinetika lymfocytové proliferace
Myši byly injektovány i.p. 30 μς EtxB(G33D) v kompletním Treaffdově aújuvans. Γ0 dni pozdě j i byly izolovány mezenterické lymfatické uzliny (MLN - mesenteric lymph nodes) a buňky byly inkubovány v nepřítomnosti antigenu (prázdné čtverce) nebo v přítomnosti 80 μς/πιΐ EtxB (plné Xroj_úiieJ..ni.kyL)----nebo----roz-l-o-ž-e-n-o-u---me-nome-rní----formou----EtxB' (vyplněné kroužky) nebo EtxB(G33D) (prázdné kroužky), generovanou zahříváním na 95 °C. Posledních 6 hodin každého vzorkovacího dne byly buňky opakovaně vystaveny na krátkou dobu působení ΙμΟί (3H) Thd. Data představují střední cpm a SEM trojnásobných jamek.
Obrázek 4
EtxB způsobuje zvýšenou aktivaci B buněk.
Myši byly imunizovány pomocí EtxB(G33D) v kompletním Freundoyě adjuvans _(CFA - cpmpi.ete-..Ereundí.s=add-uvanty=.^P-e^1O—· dnech byly buňky izolovány z mezenterických lymfatických uzlin a inkubovány v přítomnosti 80 μ9/π\1 jednoho z proteinů EtxB a EtxB(G33D) a nebo směsi 40 μς/ml obou proteinů. Buňky byly označeny biotinovanou protilátkou proti CD25 (7D4) a phycoerythrinem (PE) konjugovanou protilátkou proti B220 (Ra3-6D2). Jako sekundární protilátkový konjugát byl použit FITC označený streptavidin. Byly také použity kontroly na
protilátky. Dvoupaprsková cytometrická analýza byla provedena v den 4 proliferace.
Obrázek 5
EtxB způsobuje zvýšenou aktivaci CD4+T buněk a odstranění CD8*T buněk.
-Trmm-i-z-a-čn-i—p-ro-c^dnray izolace buněk a in vitro působení jsou stejné jako bylo uvedeno při popisu obr. 4. K detekci CD25 byly použity biotinované protilátky proti CD25 (7D4) a FITC označený straptavidin. Pro detekci CD4 a CD8 byly použity FITC (fluorescin isothio-kyanátem-)—o-z-n-a-če-n-é—p-roti-l-á-t-k-y—proti----CD4 (RNRM4-5) a FITC označené protilátky proti CD8a (536.7). Byly také použity odpovídající kontroly na protilátky (neznázorněny).
Obrázek 6
Selektivní odstraněni OVA-responsivních CD8+ T buněk podjednotkou EtxB
Buněčné kultury z mezenterických lymfatickýčh uzlin odebrané z OVA-sensibilizovaných myší byly ponechány po 5 dní v nepřítomnosti antigenu . nebo . .. v přítomnosti. OVA-i-EtxR. =
OVA+EtxB (G33D) nebo samotného OVA (ovalbuminu) s 100 pg OVA a 40 μς/πιΐ každého z EtxB a EtxB(G33D) nebo 100 pg samotného OVA. Buňky byly označeny následujícími krysími protilátkami: FITC označenými protilátkami proti CD4 nebo FITC označenými protilátkami proti CD8a a biotinovanými protilátkami proti CD25 (IL-2Ra), následovanými streptavidinem-phycoerythrinem. Neoznačené buňky nebo buňky označené jen samotnou druhou • * · protilátkou byly používány pro kontrolu. Buňky byly analyzovány pomoci FACS (Becton Dickinson). Vyšší vzrůst podílu buněk, které jsou CD25+ v kulturách obsahujících EtxB ve srovnání s ostatními vzorky, je způsoben přítomností vyššího podílu B buněk, exprimujících tento markér (neznázorněno). Stupnice fluorescenční intenzity je logaritmická.
Obrázek 7
Receptor vázaný podjednotkou EtxB indukuje alterace vlastností lymfocytové jaderné morfologie buněk, které podstoupily apoptózu,_______________________________________
Buňky mezenterické lymfatické uzliny, obsahující více než 90 % CD3+ T buněk a zbavené makrofágů, byly inkubovány po 18 hodin s buď 80 pg/ml EtxB nebo s 80 pg/ml EtxB(G33D) a označeny akridinovou oranží. Buňky byly prozkoumány konvenční anebo konfokální fluorescenční mikroskopií (Leica TCS 4D). Je ukázáno reprezentativní mikroskopické pole (x540) pro každé ošetření (EtxB na levé straně, EtxB(G33D) na pravé straně). Buňky, které byly inkubovány za nepřítomnosti aritigenu, dávaly obraz podobný obrazu buněk o š e t ře ných EtxB (G33 D) (ne z názor n ěn_o.)_.. ... . .
Obrázek 8
Apoptóza CD8+ T buněk, zprostředkovaná EtxB receptory, měřená analýzou buněčného cyklu.
Podíl CD4+ a CD8+ slezinných T buněk (SPLTC - splenic T cells) v sub-Go/Gi stádiu buněčného cyklu byl určen proudovou cytometrickou analýzou obsahu DNA, které předcházelo označeni pomoci propidium jodidem. Slezinné T buňky byly izolovány ze sleziny negativní selekcí, jak bylo popsáno výše. Po 18 hodin bylo na buňky působeno: (a) žádným antigenem, (b) 80 μς/ιηΐ EtxB(G33D) nebo (c) 80 μς/ιηΐ EtxB a potom byly označeny pomocí FITC označené krysí protilátky proti CD4 nebo FITC označené krysí protilátky proti CD8a. -B-u-ň-k-y—byi-y—potOm—o'znaceny propičTium jodidem. Množství buněk současně označených propidium jodidem bylo určeno počítáním buněk, označených buď protilátkami proti CD4 nebo protilátkami proti CD. Tento experiment byl prováděn na buňkách, jichž se také týkal_y_-V-ý-sXed-k-y—u-v-ede-ná—n-a—a—λτTabulce 3 .
Příklady provedeni vynálezu
Příklad 1
Tento příklad ilustruje, že pro indukci diferenciálních efektů na lymfocytové populace je potřebná GM-1 vazba.
Materiál a metody ____ _____ __......._____ Vytvoření receptor-vážícího mutantu EtxB
Substituce Gly-33 aminokyselinou Asp byla provedena v receptorovém vazebném místě lidského EtxB s použitím plasmidu pTRH29, odvozeného od fagemidového vektoru pBluescript IIKS+, který obsahuje geny pro A- a B23 podjednotky Etx (Yu, J., Webb, H. a Hirst, T.R. (1992), Molec. Microbiol. 6, 1949-1958). Mutageneze byla provedena pomoci in vitro oligonukleotidově řízené mutagenní soupravy (Amersham International), používajíce jednovláknový pTRH29 jako templát a syntetický oligonukleotid (5’ — TCTCTTTTATCTGCCATCG-3') (od Microanalytical Facility, IAPGR, Cambridge Research Station, UK) jako mutagenní primer. -Spr-á-vn-á—siib-st±ttrc’e GTy amlřío kyšeTi n o u Asp byla potvrzena dideoxy sekvenací použitím Sequenase II (United States Biochemical Corp.) a vzniklý plasmid byl označen pTRH56. Mutantní etxB gen z pTRH56 byl vystřižen použitím restrikčnich enzymů EcoRI__a__Spěl—a--v-l-o-ž-e-n--do--pMMB-6’8“
TSanďkvist, M. , Hirst, T.R. a Bagdasarian, M (1987) J. Bacteriol. 169, 4570-4576), čímž vznikl expresní vektor s širokým hostitelským rozsahem pTRH64, exprimující EtxB(G33D).
Antigeny
EtxB a EtxB(G33D) přírodního typu byly purifikovány z kultivačního supernatantu Vibrio spi 60 (pMMB68) a Vibrio sp.60 (pTRH64) použitím modifikace metody, kterou popsal
Túnin a Hirst (Amin, T. a Hirst, T. R..i (1994,)„ P ror.. Expres s . · and Purif. 5, 198-204). Stručně řečeno byly proteiny purifikovány diafiltrací a hydrofobní interakční chromatografii a koncentrovány chromatografii na aniontové výměny. Proteinový roztok byl odsolen na koloně . PD10 (Pharmacia, UK) vyvážené fyziologickým roztokem, tlumeným fosfátem (PBS - phosphate buffered šalině, 10 jnM fosforečnanu sodného a 150 mM NaCl, pH 7,4) a uchováván při
| ·· | • | ·· | ·· | • · | ·· | |
| • · | • | • · | • · | • · | • | • |
| • · | • · | • · | • | • · | ·· | |
| • · | ···· | • · · | • ··· | • | • | |
| • · | • | • ♦ | • | • | • | • |
| ·· | • | ·· | ···· | ·· | ·· |
teplotě -30 °C.
Čistota EtxB a EtxB(G33D) byla potvrzena SDS polyakrylamidovou gelovou elektroforézou. Molekulární hmotnost jednotlivých monomerů byla potvrzena laserovou desorpční hmotovou spektrometrií (Protein Science Facility, University of Kent).
Zjevné molekulové hmotnosti EtxB a EtxB(G33D) byly určeny gelovou filtrační chromatografii použitím systému SMART (Pharmacia). Proteiny byly vymývány z kolony Superdex 75 PC 3.2/30 v PBS, pH 7,5.__________________________________________
Irreverzibilní denaturace pentamerů podjednotek B pro použití v testu lymfocytové proliferace (viz níže) bylo dosaženo zahříváním proteinů na 95 °C po dobu 5 minut.
Zvířata, vzorkové soubory a imunizační protokoly
BALB/c myši (H-2, vysoká odezva na EtxB) o stáří 7-12 týdnů byly zakoupeny od Charles River Laboratories a umístěny v laboratořích university v Kentu. Protilátková odezva na EtxB a EtxB (G33D) by la__ měřena po s. c. . inj.ekci_3.0 μρ proteinu v PBS myši, následovaném posilovači dávkou po 10 dnech. Další skupina myší dostala tutéž dávku proteinu orálně v uhličitanu sodném (50 pg/ml) ve třech dávkách a s jednotýdenními intervaly. Kontrolním myším byl podán PBS. Krev byla odebrána 10 dní po poslední s.c. injekci nebo jeden týden po posledním orálním krmení. Střevní sekrety živých myší byly isolovány v roztoku proteázového inhibitoru
| ·· e ·· o· ·· «·« ···· · · | • · • · | ||
| „ r ···· ·· ··· — 20 — · · ···· · · · · · ··· ··· ··· · •· · ······ ·· | • · • · • · • · | ||
| výše popsaným | způsobem | (Elson, C.O., Ealding, | W. a |
| Lefkowitz, J. | (1984) J. | Immunol. Meth. 67, 101-108) | jeden |
týden po posledním krmení. Vzorky potom byly sonikovány a vyčištěny centrifugací (13226 g, 10 minut při teplotě 4 °C).
Pro pokusy s proliferací bylo myším injektováno i.p. 30 pg EtxB nebo EtxB(G33D) v kompletním Freundově adjuvans (CFA) a -po—-1-0—dnech—by±y—rzotovány mezenterιοΚεΤΊymf a t i c ké uzliny? Byly použity kontrolní neimunizované myši a jejich lymfatické uzliny byly izolovány stejným způsobem.
Testy ELISA (Enzyme Linked Immunasorbent-Assays-)-Vazba EtxB nebo EtxB(G33D) na GM1 byla zkoumána testem BM1ELISA (Amin, T., Hirst, T.R. (1994) Prot. Express, and Purif. 5, 198-204) .
Séra a střevní sekrety byly testovány na přítomnost protilátek IgG a IgA proti B podjednotce ELISA testem, ve kterém byly vzorky aplikovány na mikrotitrační desky (Immulon I, Dynateck, USA), pokryté 5 pg/ml EtxB nebo EtxB(G33D) v PBS. Protilátky IgA proti B podjednotce v supernatantech střevních sekretů .byly . ext.rHpjolo.vány^=^zes*^== ____= standardní křivky vytvořené zaplněním 2 řádků jamek na každé desce 1 pg/ml králičí protilátky proti myši IgA (a specifický řetězec, Zymed Lab, USA) v PBS, následovaném přidáním 1 pg/ml myšího myelomového IgA (MOPC 315, Sigma, USA). Pro měření úplného IgA byly jamky zaplněny králičí protilátkou proti myší IgA, následovanou přidáním supernatantů střevních sekretů. Všechny vzorky byly sériově
zředěny. Konjugát kozí protilátky proti myší IgG (Fc fragmentově specifického, Jackson Lab., USA) nebo kozí protilátky proti myší IgA (řetězcově specifického, Sigma) a peroxidázy byl zředěn a přidán do jamek. Byl určen titr protilátky IgG proti B podjednotc, udávající A450nm 0,2. Jako IgA specifická aktivita byla vypočtena odezva IgA protilátky proti B podjednotce na EtxB a EtxB(G33D) v -s-t-ře-vn-í-eh—s-ek-re-beoh—(-rovná střední IgA antF-^B podj ednot ka^ (pg/ml) dělená celkové IgA (μς/ιηΐ) ) .
Pro měření cytokinových úrovní IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 a
IFN-γ byla použita metoda ELISA,__j_a.k__bylo—pop-s-á-no—v-ý-š-e(Tiarper; H.M. , PUD Thesis, Universita v Bristolu (1995)). Stručně řečeno byly mikrotitrační desky zaplněny krysími protilátkami proti myším IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 a IFN-γ.
Desky byly imobilizovány 2 % (objemově) hovězího sérového albuminu. Supernatant z kultivačního prostředí byl přidán do jamek a zřeďován. Jedna řada na každé desce pro každý cytokin obsahovala standardní množství rekombinantnich cytokinů. Desky potom byly inkubovány s 0,5 μg/ml biOtinované monoklonální protilátky proticytokinu a následovala adice avidin-peroxidázy a 3,3',5,5~tetramethylbenzidenového (TMB) substrátu a,čtgní..A450_nm-__.„_
Test proliferace lymfocytů
Myši byly usmrceny zlomením vazu, asepticky byly vyjmuty mezenterické lymfatické uzliny a rozmělněny protlačením sítem z nerezové oceli do Hankova vyváženého solného roztoku (HBSS - Hank balanced salt solution) (Flow Laboratories,
Irvine, Renfrewshire, UK). Po centrifugaci (500 g, 10 minut, 4 °C) byly buňky promyty v HBSS a resuspendovány v modifikovaném Eaglově médiu (Flow) , do kterého bylo přidáno 20 mM Hepes (Flow), 100 jednotek penicilinu, 100 μg/ml streptomycinu, 4 mM L-glutaminu (Flow) a 2-merkaptoethanolu (úplné médium). Čerstvé autologni normální myší sérum z neimunizovaných myší bylo přidáno do konečné koncentrace 0,5 -%—(-©bj-emov-ěj-—Ku±tury—oVsalrovaTy 2 x Γ0’4 životaschopných buněk na ml buď v 2 ml objemu na destičce s 2 4 jamkami nebo v 8 ml objemu v 25 cm3 baňce (Nunc A/S, Roskide, Dánsko) a byly vytvořeny za přítomnosti nebo nepřítomnosti antigenů, jak bylo vysvětleno v popisu___obr.á.z.ků-.---Ku-ltu-ry---byiyírikubbvany při teplotě 37 °C ve zvlhčené atmosféře obsahující 5 % oxidu uhličitého a 95 % vzduchu po dobu 6 dní. Ve stanovených časových bodech bylo z kultur odebráno 0,1 ml vzorku a přeneseno na desky s 96 jamkami se dnem tvaru U (Nunc) a opakovaně na krátkou dobu vystaveno půdpbení ΙμΟΐ/jamka (3H)-Thd (Amersham, U.K.) po dobu 6 dní před odebráním (Mach III harvesting 96 Tomtec, Orange, Conn., USA) a počítáním pomocí . standardní tekutinové scintilace (1450 Micro β plus, LKB-Wallac, Turku, Finsko). Podobně bylo vzorkováno 0,5 ml supernatantu z kultur pro 1 cytokinovou analýzu. Supernatant byl uchováván při.-68 °C. až ____ do analýzy.
Fenotypová analýza kultivovaných buněk
Kultivované buňky odebrané v den 4 kultivace byly promývány a životaschopné buňky byly po centrifugaci při 500 g po 15 minut při 20 C získány interferencí HBSS/18 % metrizamidu
• · · · •···· c ·
I (Nyegaard and Co., Oslo, Norsko) gradientu. Buňky byly
I dvakrát promývány a resuspendovány v HBSS, obsahujícím 0,2 %
I azidu sodného (Sigma) a 10 % normálního krysího séra. Byly
I použity následující krysí protilátky (Pharmingen, San Diego,
I USA) : fluorescin isothiokyanátem (FITC) označené protilátky
I j proti CD4 (RNRM4-5), FITC označené protilátky proti CD8 (53—
I 6-7), biotinem označené protilátky proti CD25 (7D4) a
I--phyeoe-ryth-rin-em—(-PE~)—o-znra_č'e’né prOťiTatfky proti B220 fŘA3I 6D2). Navíc byl pro biotinem označené protilátky použit streptavidin-PE nebo streptavidin-FITC (Serotech, UK) . Všechny protilátky byly zředěny v HBSS, obsahujícím azid a ___________použity v předem stanovených kojicentracXGh-.—Byl-e—sm-teh-á-no200 μ1 2xl06 buněk a 200 μΐ každé z protilátek, které byly inkubovány na ledu po 30 minut. Kde byly požadovány sekundární protilátky se streptavidinem-PE nebo streptavidinem-FITC, byly buňky s těmito protilátkami inkubovány po dalších 30 minut. Byly také vloženy vhodné kontrolní vzorky pro FITC a PE protilátky. Buňky byly promývány HBSS a potom analyzovány dvouppaprskovou cytometrií.
Vytváření a charakterizace receptor vázajícího mutantu EtxB
Oligonukleotidově řízenou mutagenezí EtxB byla provedena substituce Gly aminokyselinou Asp do B podjednotky tepelně nestabilního enterotoxinu E. coli s cílem vytvořit mutant podjednotky B, který je detektivní v rozpoznávání receptoru. Mutovaný protein, označený jako EtxB(G33D) a přírodní typ
• · · •« <· ♦ ·
EtxB byly purifikovány až do dosažení homogenity (viz Materiál a methody). Molekulová hmotnost purifikovaného EtxB a mutovaného EtxB(G33D) byly určeny laserovou desorpční hmotovou spektrometrií. Hmotnosti byly v rozmezí 20 Da od teoretických hmotností 11702 a 11760 Da pro monomerickou podjednotku EtxB, respektive EtxB(G33D). Při analýze pomocí SDS-PAGE chromatografie bez předchozího zahřívání jak
------pží-redná—E-txBj t~a'k EtxB_(_G'3'3'D’) migrovaly jako diskrétní stabilní oligomery se zdánlivou molekulovou hmotností 42 kDa a 56 kDa (obr. 1Ά, pás 1, respektive pás 2). Pozorovaná mobilita při elektroforéze a SDS-stabilita EtxB je charakteristickou vlastností pentamexu—pod-j-ed-n-ote-k—B—(·νχζ_ --Savídkvistr, M. , Hirst, T.R. a Bagdasarian, M (1987) J.
Bacteriol. 169, 4570-4576). Pomalejší mobilita při elektroforéze v případě oligomerického EtxB(G33D) nevychází z rozdílu v počtu konstituentů monomeru podjednotky B, neboť jak pentamerický EtxB, tak i EtxB(G33D) vykazují podobné retenční časy, pokud jsou analyzovány gelovou filtrační chromatografií s vysokou rozlišovací schopností. Diskrepance mezi mobilitou EtxB(G33D) oligomeru vzhledem k EtxB přírodního· typu je tedy pravděpodobně způsobena zavedením negativně nabitého Asp residua, způsobujícího redukci vazby t SDS a následnou pomalejší migraci. ,, ... . . „ .......
EtxB a EtxB(G33D) byly také porovnány vzhledem k jejich stabilitě v pufrech o nízkém pH, odolnosti k 1,0 mg/ml trypsinu nebo proteinázy K a relativní reaktivitě vzhledem k souboru monoklonálních a polyklonálních protilátek proti B podjednotce. V každém z těchto testů EtxB(G33D) vykazuje vlastnosti, které jsou identické vlastnostem EtxB přírodního
- 30 typu. Z toho bylo vyvozeno, že záměna Gly aminokyselinou Asp v residuu 33 v EtxB nemění oligomerickou konfiguraci, SDS, pH nebo proteázovou stabilitu nebo reaktivitu s protilátkami ve srovnání s EtxB přírodního typu.
Schopnost EtxB(G33D) vázat se k jeho receptoru GM1 byla určena pomocí GM1-ELISA testu (obr. 1C) . Ten ukázal vysoce -v-ý-z-n-arané—sn-í-ž-enl—siohOpnosTžl mutantu vázat GM1 ve srovnání s proteinem přírodního typu ( > 99 % snížení při odečítání A450mn) · Dále, na rozdíl od EtxB přírodního typu, EtxB(G33D) není schopnen vázat CHO buňky, pokud je zkoumán pomocí imunof luorescence . Z toho v_y_pXý-v-á-,----ž-e---Et-xB-(-G-3-3-Dj----j_e_
ΈθϊθΚΏ/νηί vzhledem k jeho schopnosti vázat GM1 gangliosid a to in vitro a in sítu.
Silná imunogenicita EtxB in vivo je závislá na vazbě receptoru
Důležitost receptorová vazby pro imunogenicitu EtxB byla určována na myši po buď orálním podání nebo s.c. injekci EtxB nebo EtxB(G33D) v PBS. Výsledkem orálního podání byla detekce vysokého titru protilátky IgG v séru a aktivity IgA protilátky v střevních sekretech (obr .^.,2.) .. Na rozdíl od roho při podobném režimu orální imunizace EtxB(G33D) nedošlo ke zjištění žádného zjistitelného protilátkového účinku. EtxB(G33D) indukoval sérovou protilátkovou odezvu na s.c. injekci, avšak odezva byla výrazně nižší ve srovnání s protilátkovou odezvou na EtxB přírodního typu s více než 160 násobným snížením vzhledem k střednímu protilátkovému titru, 1050 oproti 171000. Z toho bylo vyvozeno, že receptorová • · · · <· vazba u EtxB je podstatná pro jeho silnou imunogenicitu in v i vo.
Receptorová vazba neovlivňuje rozsah proliferace lymfocytů v přítomnosti EtxB nebo EtxB(G33D)
Byl zkoumán účinek EtxB nebo EtxB(G33D) na lymfocytovou -p-to-l-i^e^ae-i—i-n—vi-tro-.—hymfccyty bylý izolovány z myších podkolenních a mezenterických lymfatických uzlin (MLN) imunizovaných buď EtxB nebo EtxB(G33D) a byly stimulovány oběma proteiny nebo tepelně denaturovanými přípravky z EtxB nebo EtxB(G33D). Proliferačni odezva__lymfocytů—od-v-e-z-e-n-á—zpO'dkO~iehhích nebo mezenterických lymfatických uzlin byla podobná. V obou případech rostla proliferace u každého proteinového přípravku s koncentrací podjednotek B. Reprezentativní soubor dat z pokusů užívajících mezenterické lymfatické uzliny je ukázán v tabulce 1. Řádová velikost odezvy na pentamer přírodního typu a jeho mutant byla srovnatelná a totéž platilo i pro přítomnost tepelně denaturovaného monomeru přírodního typu nebo jeho mutantu.
Obr. 3 ukazuje kinetiku ' proliferačni odezvy, získanou v přítomnosti 80 μα/ml každého z proteinových přípravků.
š·
Reaktivita byla obdobně závislá na přítomnosti ant i genu a choválase přítomnosti každého zjevná den 3 kultivace s z proteinů. Reaktivita byla použitím [3H]-Thd, dosáhla vrcholu den 4 a později odeznívala. Malé rozdíly v časování vrcholu odezvy nebyly pozorovány v opakovaných pokusech, což ukazovalo, že anamnestické charakteristiky odezvy na EtxB a EtxB(G33D) byly, srovnatelné. Z toho bylo vyvozeno, že úroveň stimulace v přítomnosti přirozených
proteinů není pravděpodobně ovlivňována receptorovou vazbou nebo vloženou mutací.
Receptorová vazba toxinu způsobuje imunomodulaci podsouborů B buněk a T buněk
Pro prozkoumání, zda receptorová vazba EtxB vykazuje nějaký -ú-čin-e-k—n-a—pepu-l-a-eeXL-ymf-o-tdnTch-doařTeMc^lFdzdňřo-byl y 1 ymf o c y t y izolovány z myších mezenterických lymfatických uzlin sensibilizovaných i.p. pomocí EtxB(G33D) a potom stimulovány buď pomocí EtxB nebo EtxB(G33D) nebo obou. Dodatečně byl prováděn souběžný experiment s __po-U-ži-tí-m---l-y-m-f-oe-y-t-ů---zmezenterických lymfatických uzlin myši, která obdržela injekci EtxB a výsledky byly v zásadě identické s výsledky získanými u myši sensibilizovaných EtxB(G33D).
(i) EtxB způsobuje zvýšenou aktivaci B buněk
Účinek EtxB na B buňky byl zkoumán na základě exprese aktivačního markéru CD25 (IL-2Ra) v asociaci s B-buněčným markérem B220 (CD45R) . Jak je ukázáno na obr. 4, počet B buněk v kulturách stimulovaných EtxB byl 62,9 % všech buněk, z nichž velká část (28,4 %J __exprimovala buněčný—a.k.t-iv.ačnd markér CD25. Na rozdíl od toho podíl B buněk po stimulaci v přítomnosti EtxB(G33D) byl menší než jedna polovina poměru, který byl určen pro přírodní typ (22,6 %) a méně buněk bylo aktivováno (5,6 %) . Aby se ověřilo, zda účinek EtxB byl dominantní, buňky byly inkubovány v přítomnosti ekvimolární koncentrace EtxB a EtxB(G33D). Paprsková cytometrická data byla podobná datům, získaným po stimulaci samotným EtxB
(60,6 % B buněk, z toho 26 % aktivovaných). Z toho bylo vyvozeno, že receptorová vazba EtxB zprostředkuje zvýšenou aktivaci B buněk in vitro.
(ii) EtxB způsobuje zvýšenou aktivaci CD4+ T buněk a úplné odstranění CD8+ T buněk
-P-r-e—u-rě-ení—vlivu—re-cepttrrove vazby7 podjednotky B na T buňky byly lymfocyty označeny protilátkami na CD4 nebo na CD8 v asociaci s protilátkami na CD25 (obr. 5). Dodatečně byly některé buňky odděleně označeny protilátkami na CD3 markér (ne zná zorněno) . Pódii T buněk_expjmirnuj-í-Gá-eh—GD4—ma-r-ker—v— 'případě jlsjTch stimulace v přítomnosti EtxB byl 36,7 % a velká část z nich byla aktivována (32,7 %) . Na rozdíl od toho nebyly v kultuře EtxB přítomny žádné detekovatelné CD8+ T buňky.
Pro srovnání, jak CD4+ T buňky, tak CD8+ T buňky byly přítomny v kultuře, stimulované v přítomnosti EtxB(G33D). Takové kultury obsahovaly velký podíl CD4+ T buněk (66,6 %), ale jen 12 % z nich bylo aktivováno. Podíl CD8+ T buněk zjištěných v přítomnosti EtxB(G33D) byl 11,7 % celkového množství buněk, ale jen velmi ,, malá část z nich . byla aktivována, což ukazovala absence CD25 markéru. Navíc byl podíl odpovídající buněk v přítomnosti směsi, sestávající z ekvimolární koncentrace EtxB a EtxB(G33D) podobný podílu, získaného za přítomnosti samotného EtxB přírodního typu s 41,68 % CD4+ T buněk (z nichž 28,6 % bylo CD25+) a žádné detekovatelné CD8+ T buňky (obr. 5). Ve všech těchto analýzách byl podíl buněk, označených CD3 přibližně roven
součtu těch, které exprimovaly markéry CD4 a CD8. Tato data ukazuji, že vzrůst aktivace B buněk a CD4+ T buněk a selektivní odstranění CD8+ T buněk je zprostředkován receptorovou vazbou toxinu.
Produkce cytokinů
--------Aby—s-e—u-rčú-i-07—zďa účxnerk-EtxB na lymfocytové populace může záviset na změně v produkci cytokinů, byly buněčné kultury inkubovány s buď EtxB nebo EtxB(G33D) a ve dnech 2, 3, 4, 5 a 6 byly pro analýzu odebrány supernatanty. Výsledky, _________získané ze vzorků ze dne 5,__kdy_byla—det-e-k-o-v-á-n-a—ma^ú-má-l-n-íkoncentrace cytokinů, jsou ukázány v tabulce 2. Jak IFN-γ, tak IL-2 byly detekovány v supernatantech z kultur, stimulovaných v přítomnosti EtxB nebo EtxB(G33D), ačkoliv relativní úrovně těchto cytokinů byly proměnné. Médium z buněk inkubovaných s přírodním typem EtxB obsahovalo třikrát větší koncentraci IL-2 a 1,5 krát větší koncentraci IFN-γ ve srovnání se supernatantem z kultur stimulovaných v přítomnosti IFN-γ. I přes to, že další proliferační kultury T buněk odpovídajících na další antigeny dávaly vysoké úrovně IL-4, IL-5 a IL-10, žádný z těchto cytokinů nebyl zjištěn v kulturách, stimulovaných .EtxB nebo EtxB(G33D). Vzrůst úrovně IL-2 a pokles úrovně IFN-γ následující po stimulaci EtxB ve srovnání s EtxB(G33D) s největší pravděpodobností odráží aktivovaný stav B buněk a CD4+ T buněk. Nicméně výsledky ukazují, že hluboký účinek EtxB přírodního typu na populace CD8+ T buněk pravděpodobně není zprostředkován velkou změnou v profilu cytokinů z závislosti na vazbě receptorů.
• 9
Diskuse
Uvedená zkoumáni ukazuji, že vloženi jednoho bodu mutace (G33D) v místě receptorové vazby EtxB způsobilo významný ’ pokles schopnosti vázat GM1. Je důležité, že mutant
EtxB(G33D) vykazoval shodné fyzikálně-chemické vlastnosti s I ·» i------------pří-r-o-dnim—-t-y-pe-m—EtxB—co—se—týěe—k-o-n-fe-rma-ee7 j-a-k—b-yioprokázáno gelovou chromatografií, stabilitou v SDS, kyselinách a proteázách. Když byly měřeny specifické odezvy na protilátky po imunizaci buď EtxB nebo EtxB(G33D), byly zjištěny dramatické rozdíly. Subkutánní injekce EtxB(G33D) myš_i~~měůra^za-následek velmi významný pokles ťitru protTláte^k ve srovnáni s přírodním typem (zhruba > 160 krát), zatímco po orálním podáni nebyla zaznamenána žádná odezva na protilátky. Je možné, že tyto rozdíly pocházejí z přerušení dominantního epitopu, který vystupuje buď při rozpoznávání molekuly protilátkou, nebo stimulace účinných T buněk pomáhá produkci protilátek. Nicméně stojí za povšimnuti, že náhrada Gly aminokyselinou Asp nemá žádný účinek na rozpoznáváni podjednotky B souborem specifických polyklonálních a monoklonálnich protilátek. Dále, proliferativni odezvy, , získané pokud byly do kultury přidány EtxB nebo EtxB(G33D), byly srovnatelné bez ohledu na to, který protein byl použit pro stimulaci in vivo; to dokazuje, že reaktivita buněk T nebyla specifická vzhledem k některé molekule. Z toho bylo vyvozeno, že vazba receptoru proteinem EtxB je podstatná pro jeho silnou imunogenicitu in vivo.
Důležitost vazby receptoru pro silnou imunogenicitu EtxB
může být vysvětlena řadou způsobů. Za prvé, vazba podjednotky B proteinu Etx nebo Ctx k GM1 může zvýšit účinnost zachytávání těchto proteinů, což zvýší lokální proteinovou koncentraci, která je dostupná imunitnímu systému. 0 dalších třídách proteinů, které jsou schopny * vázat mukózní povrchy, bylo zjištěno, že jsou imunogenně účinné (De Aizpura, H.J. a Russell-Jones, G.J. (1988) J.
---------------Exp---Med---1-67-,—4-4-0^4-5-1-)---Ro-z-OT£>v-ané—ro-zdíly—v—im-u-nog-en-i-ci-t-ě------------EtxB a jeho mutantu po orálním podání mohou vskutku být způsobeny účinným zachytáváním EtxB ve střevě. Nicméně dramatické rozdíly, které byly pozorovány po parenterální imunizaci (kdy antigen je podáván lokálně ve vysoké koncentraci^) n_a_zn_ačuj_í jxtné e^ektyc Vcrzba. EtxB“na GM1 může například ovlivnit účinnost působení buněk, předkládajících antigen. Taková vazba může způsobit aktivaci buněk nesoucích proteiny II. třídy, konkrétně vzhledem k jejich expresi podstatných ko-stimulujících molekul, jako B7, což se vztahuje k jejich účinku získat zvšenou antigen presentující aktivitu (Jenkins, M.K. a Johnson, J.G. (1993) Curr. Opin. Immunol. 5, 361-367). Alternativně může vazba receptoru mít přímý účinek na sub-populace lymfocytú. Řada pozorování z této studie podává silnou podporu tohoto názoru.
Studie in vitro dokazují, že EtxB byla schopna indukovat proliferaci sensibilizovaných buněk lymfatických uzlin. Tato vlastnost nebyla závislá na vazbě receptoru, neboť odezvy s podobnými anamnestickými charakteristikami byly získány s použitím EtxB, EtxB(G33D) nebo tepelně denaturovaných forem těchto proteinů, které nejsou schopny vázat GM1. Tato pozorováni byla zajímavá sama o sobě, neboť bylo široce oznamováno, že komerční přípravky Ctx a CtxB nebo purifikovaného rekombinantního CtxB jsou silnými inhibitory proliferace lymfocytů in vitro. Zjevná diskrepance mohla povstat ze skutečnosti, že předchozí experimenty byly prováděny na purifikovaných lymfocytech a v široké míře používaly mitogenem stimulované lymfocytové kultury (které
-----nema-jú.—kl-ono-v-ě—ome-z-ené—ode-z-v-y-)-,—k-de—mohl.—být—obs-a-ž-e-n—-jú-ný——------mechanismus. S tím bylo v konzistenci naše pozorování, že proliferace Con A-stimulovaných lymfocytů bylo vskutku inhibováno pomocí EtxB. Na druhé straně však analýzy buněčných populací v kulturách sensibilizovaných buněk lymřatrických uzlin- sXÍTnurovanych buď EtxB nebo EtxBdfGBSD') odhalily důležité rozdíly vzhledem k B buňkám, stejně tak jako T buňkám nesoucím CD4 a CD8.
B buňky byly detekovány po 4 dnech kultivace v přítomnosti buď EtxB nebo EtxB(G33D). Nicméně srovnáním s EtxB(G33D) se ukázalo, že relativní poměr B buněk přítomných v kultuře s EtxB byl zvýšen o přibližně 100 %. Tento vzrůst byl svázán s expresí CD25 ve velmi vysokém podílu B buněk. V ukázaných experimentech byly reagující lymfocyty sensibilizovány pomocí EtxB in vivo.
Podobné pokusy s buňkami z EtxB imunizovaných myší odhalily srovnatelné výsledky. Tak tedy bez ohledu na libovolné in vivo účinky, spojené s vazbou receptoru, kultury v přítomnosti EtxB obsahovaly větší podíl B buněk ve srovnání s kulturami stimulovanými EtxB(G33D). Ukázalo se také, že tyto účinky na B buňky nejsou závislé, alespoň částečně, na regulaci T buňkami in vitro, neboť výsledky neukazují velký posun v profilu detekovaných cytokinů. Proto se in vitro vazba receptoru pomocí EtxB zdá být spojena s přímým účinkem na B buňky, který vyústil v proporcionální expanzi těchto populací i jejich aktivace. Hodno povšimnutí je také, že bylo ukázáno, že CtxB zvyšuje expresi MHC třídy II na panenských B buňkách, což je vlastnost, která nebyla
-n-a-l-e-z-e-n-a—u—GM-1—v-á-žícL-ho—mutantu—C-txB-(-G-3-3.E-)---(-F-r.anc.Ls-,—
Ryan, J. , Jo-bling, M.G., Holmes, R.K., Moss, J. a Mond, J.J (1992) J. Immunol. 148, 1999-2005). Výsledky těchto experimentů naznačují přítomnost přímého mitogenního účinku EtxB na antigenově sensibilizované B buňky a ukazují, že takové-sfekty-j~sOir~z pros třerlkOványva^zbon-r eceptor uc
Kromě účinků EtxB na B buňky v kultuře ukázala cytometrická analýza, že tento toxoid způsobuje úplné odstranění jakékoliv detekovatelné CD8+ buňky. U tohoto efektu bylo také ukázáno, že závisí na vazbě receptoru, neboť u této populace T buněk nedošlo k . odstranění v kulturách, obsahujících EtxB(G33D). Úplné odstranění CD8+ T buněk bylo pozorováno v kulturách, obsahujících EtxB u myší imunizovaných přírodním typem EtxB. Existují tři možné mechanismy, kterými může být takovýto účinek zprostředkován.
1) Je známo, že vazba Ctx nebo CtxB na GM1 u krysích buněk mezenterických lymfatických uzlin indukuje vytváření plaků a čepiček (Craig S.W. a Cuatrecasas P., (1975) Proč. Acad. Sci. USA, Vol. 72, str. 3844-3848). Je možné, že v tomto procesu jsou EtxB-GMl komplexy a další molekuly, v to počítaje CD8, internalizovány. Takový proces by zabránil cytometrické detekci těchto buněk s použitím CD8 jako
- 39 markéru a může mít za následek jejich smrt v důsledku související ztráty povrchového TCR komplexu. I když to může vysvětlovat nepřítomnost CD8+ T buněk v kultuře, jiní autoři
| ·· | • | • · | 9 9 | ♦ · | |||||
| ♦ ♦ | • | • · | • · | 9 | 9 | • | 9 | ||
| • · | • · | • · | • | 9 | 9 | • · | |||
| • ♦ | ···· | • · | • | 9 9 9 | 9 | • | 9 | ||
| • 9 | • | • | • | 9 | 9 | • | 9 | ||
| 9 · | • | 4 · | • 9 · 9 | 9 9 | 99 |
zjistili, že nedochází k žádné ztrátě TCR komplexu z povrchu lidské Jarkat
T buněčné linie, pokud byl použit CtxB (Imboden, J.B.,
Shoback, D.M., Pattison,
Stobo, J.D.
(1986) Proč.
Nati. Acad. Sci. USA
83,
5673-5677) .
-Nepří-tomnos-t—eižekťů “j~ako důsledek čepiček je podporován zjištěním, že CD3 a CD4 markéry nebyly ovlivněny.
2) Změnový mechanismus by zahrnoval efekty, vyvolávané cytokiny v kultuře. V této studii byly detekovány jak IL-2, tak IFN -γ_.____Výsledky však----ne-na-zn-a-Gu-j-í----ve-l-ký----ptrstrn “cyťokinoveho profilu, který by mohl objasnit tak dramatické účinky na CD8+ T buňky.
3) Nepřítomnost CD8+ T buněk může vyplývat z aktivní indukce apoptózy. Smrt lymfocytů apoptózou může zahrnovat působení čepiček, jak je popsáno výše nebo může být zprostředkována v nepřítomnosti čepiček účinky na signální události v buňce. Aktivačně indukovaná programovaná smrt je závislá na Ca2+ a zahrnuje fosfatázy a kinázy. Bylo ukázáno, že vazba CtxB k lymfocytům inhibuje protein ' kinázovou C-dependentní proliferaci a indukuje výrazný vzrůst intracelulárního Ca2+, což je událost, která __ nebyla. spojena se vzrůstem úrovně CAMP. Schopnost EtxB vyvolat odstranění CD8+ T buněk, ale ne odstranění CD4+ T buněk by mohla povstávat z diferenciálních účinků signálů spojených s CD4/CD8-TCR komplexem, vycházejících z křížové vazby GM1 na povrch těchto podsouborů lymfocytů. To by mohlo být výsledek diferenciální vazby toxoidu na membrány, jak bylo popsáno pro CtxB nebo alternativně díky diferenciálním signálním mechanismům v
| ♦ · | • • | • t ·» ·· ·· • · · · · · · | |
| 40 - | • · | • « | « · · · · ·· |
| • · | • · · · | • · · · ♦ · · · · | |
| • · | • | • · · · « | |
| • · | • | 99 999· ·· ·· |
CD4* a CD8+ T buňkách.
Za úplné nepřítomnosti detekovatelných CD8+ T buněk EtxB zvýšilo poměr CD4+ T buněk, které byly aktivovány, ve srovnání s receptor vázajícím mutantem. Podstatná potřeba CD4+ T buněk v odezvě na Ctx byla demonstrována in vivo. Důvod pro zvýšenou aktivaci tohoto podsouboru T buněk je —v-š-a-k-^e-eg-asiaý-—Stog-í—za~pOVŠXrnnužtT; že-bylo ukázáno, že CtxB stimuluje DNA syntézu a buněčné dělení v netransformovaných myších 3T3 buňkách v klidovém stavu. Selektivní mitogenní efekt na CD4+ T buňky byl také nalezen v přítomnosti rostlinných lektinů, které váží—Ga-ΐβ—l^^-Gaů-NAeg—eo-ž—j-e~t’á’ž— ^-kompOnerTtaý Kterou EtxB váže v GM1. Nemůže být vyloučena možnost, že EtxB zprostředkovává na vazbě GM1 závislý přímý účinek na CD4+ T buňky, který způsobuje jejich aktivaci.
Nicméně je také možné, že zvýšená aktivace CD4+ T buněk v kulturách, obsahujících EtxB je následek popsaných změn v populacích B buněk a CD8+ T buněk. Je známo, že aktivace B buněk je spojena se zvýšením jejich schopnosti jako antigen presentujících buněk pro CD4+ T buňky. Dále, CD8+ T buňky jsou obecně spojovány s regulační rolí v imunofeaktivitě jak in vivo, tak i in vitro. Jejich odstranění z proliferativních kultur T buněk je spojováno s prodloužením a zvýšenou úrovní dělení CD4+ T buněk.
V souhrnu může být silná imunogenicita EtxB in vivo, jak byla ukázána v této studii, výsledkem jeho schopnosti indukovat aktivaci B buněk, vycházející z účinků regulace růstu, následujících po vazbě na GM1. Aktivace CD4+ T a schopnost EtxB zvýšit produkci IL-2 v kultuře in vitro může
- 41 ·· · poskytnout nutný signál pro další expanzi klonů B buněk. Odstranění CD8+ T buněk pomocí EtxB in vitro v této studii může také poskytnout jiný mechanismus imunoprotekce in vivo, která následuje po sys.temickém nebo orálním podání, obzvláště vzhledem k účasti těchto podsouborů buněk supresi imunitní odezvy a v orální toleranci. Z tohoto hlediska bylo ukázáno, že jak Ctx, tak Etx ruší orální toleranci k .r-o-zpu-s-tn-ým—p-pote-i-nům—a—datši studíe úzivaji depleční účinek Ctx a Etx na intra-epiteliální lymfocyty ve střevu nebo v Peyerově plaku k vysvětlení tohoto mechanismu. Bylo ukázáno, že inhibiční účinek Ctx na CD8+ T buňky in vitro zabraňuje reakci štěp versus hostitel.------------Závěrem lze konstatovat, že byla ukázána přítomnost silných imunomodulačních účinků EtxB na protilátkovou odezvu in vivo a na populace lymfocytů in vitro. Dále bylo ukázáno, že tyto účinky jsou zprostředkovány vazbou na receptor. Tyto poznatky se také vztahují k porozumění schopnosti Etx a Ctx působit jako silné adjuvans a jako potenciální proteinový nosič pro jiné antigeny a naznačují, že tyto vlastnosti jsou založeny na schopnosti toxoidů vázat gangliosidové receptory na povrchu lymfatických buněk.
Přiklad 2
Tento příklad ilustruje, že účinky na CD8 buňky nezávisí na rozpoznávání antigenu a jsou zprostředkovány apoptózou.
Rekombinantní přípravky EtxB a EtxB(G33D) byly připraveny podle příkladu 1. Oba proteiny byly charakterizovány vzhledem k jejich vazbě na GM1, vazbě na soubor monoklonálnich a polyklonálnich protilátek a různým dalším fyzikálně chemickým vlastnostem. Ovalbumin (OVA) byl zakoupen od společnosti Sigma (Poole, UK) . Mezenterické lymfatické uzliny (MLN) byly izolovány z BALB/c myši 8-10 týdnů starých (kmen s vysokou odezvou na EtxB [Nashar, T.O., a Hirst, T.R., 1995. Immunoregulatory role of H-2 and intra_H=2---aii-e-l-e-s---en---antibtdy respónses to rec omb i n ant preparations of B-subunits of Escherichia coli heat labile enterotoxin(rEtxB) and cholera toxin (rCtxB) (Imunoregulačni role H-2 a intra-H-2 alel na protilátkové odezvy na rekombinantni přípravky podjednotek _B_tep e-l-ně—n-e-st-abiin-i-ΐτο· •enterotoxinu EscReríclTia coli (rEtxB) a cholerového toxinu (rCtxB)). Vaccine 13:803]). Myším bylo i.p. injektováno 200 μς OVA (Sigma), emulsifikovaného v kompletním Freundově adjuvans (Sigma). Mezenterické lymfatické uzliny byly odstraněny 10 dní po injekci, rozmělněny protlačením sítem z nerezové oceli v HBSS (Flow, Irvine, UK). Získané buňky byly promývány v HBSS, centrifugovány (500 g, 10 minut, 4 °C) a resuspendovány v modifikovaném Eaglově médiu (Flow), obsahujícím 20 mM HEPES, 100 jednotek penicilinu, 100 μg/ml streptomycinu, 4 mM L-glutaminu a · 5 x 10“5 M 2merkaptoethanolu (úplné médium), do kterého bylo přidáno 0,5 % (objemově) čerstvého autologního myšího séra. Kultury, které obsahovaly 2 x 104 životaschopných buněk na ml v 2 ml objemu, na destičkách s 24 jamkami (Nunc, Roskide, Dánsko) byly vytvořeny v přítomnosti 100 μρ/ιηΐ OVA (dialyzovány extenzivně v úplném médiu), buď samotné nebo s 40 μg/ml EtxB nebo EtxB(G33D). Kultury byly inkubovány při teplotě 37 °C v atmosféře 5 % oxidu uhličitého a 95 % vzduchu po 5 dní. V • 9 požadovaný okamžik byly z kultur odebrány vzorky 0,1 ml a přeneseny na destičky s 96 jamkami se dnem ve tvaru U (Nunc) a opakovaně na krátkou dobu vystaveny 1 μθί/jamka [3H] thymidinu (Amersham, UK) po 6 hodin před odebráním (Mach III harvesting 96; Tomtec, Orange, CT) a odečítány standardní tekutinovou scintilací (1450 Micro b plus; LKB-Walac, Turku, Finsko). Pro proudovou cytometrickou analýzu T buněk (Becton _Di.cJ<ins.on-,—E^enbodegem-A-aT-s-tg—BeTgíej Bylý buňky označeny následujícími krysími protilátkami (PharMingen, Cambridge, UK): FITC označené protilátky proti CD4 (RNRM4-5) nebo FITC označené protilátky proti CD8a (53-6.7) a biotinem označené protilátky proti CD25_____(IL-2Rg)_____(_7_D_4_)_,-----ná-s-l-ede-v-a-né-sTxeptavřďřnem^phycoe^řýthrinemý Doplňkově byl pro 'biotinem označené protilátky označené FITC použit streptavidin. FACS analýza získaných buněk byly provedena v den vrcholu proliferace (den 4), jak bylo určeno ze zabudováváni [3H] thymidinu.
Pro testy apoptózy byly z 8-10 týdnů starých BALB/c myší izolovány čerstvé buňky mezenterických lymfatických uzlin (MLNC)_a slezinné T buňky. Buňky mezenterických lymfatických uzlin, obsahující více než 90 % CD3+ T buněk, jak bylo určeno proudovou cytometrickou analýzou, byly inkubovány po 2 hodiny v Petriho miskách (Costar, Cambridge, MA) v úplném médiu, obsahujícím 10 % FCS, při teplotě 37 °C v 5 % oxidu uhličitého a 95 % vzduchu, aby byly odstraněny adherentní buňky. Neadherentní frakce byly postupně odpipetovány, usazeny a před použitím dvakrát promývány v HBSS. Slezinné T buňky byly purifikovány negativní selekcí s použitím skleněných kuliček pokrytých normálním myším sérem
| ·· | • | ·· | ·· | e· | |||
| • · | • | • · | • ♦ | 4 · | • · | ||
| • | • | • · | • | • | • | • · | ♦ « |
| • | • | • · | » · | • | • | • ··· | • · |
| • | • | • | • | • | • | • | • · |
| ·· | • | *· | ···· | • · |
následovaným králičí protilátkou proti myšímu γ-globulinu jak bylo popsáno (Wigzell, H. 1976. Specifická afinitní frakcionace lymfocytů s použitím kolon skleněných nebo plastových kuliček. Scand. J. Immunol. 5:(suppl.5) 23.). Zvolená populace T buněk byla > 90 % CD3+, jak bylo určeno proudovou cytometrickou analýzou.
-C.D-43-T—buň-k-y— a—GDS^—T-HayT-y—sapaxovány-nasleduj icím způsobem:
neadherentní buňky mezenterických lymfatických uzlin byly označeny krysími phycoerythrinovanými protilátkami proti myší CD4 (4708-02) nebo FITC protilátkami proti myší CD8a (53-6.7) (PharM ingen) a byly potom inkubovány--s--MAGS-ko-lO±ďá±nimi super-paramagnetickými mikrokuličkami, konjugovanými s kozími protilátkami proti krysímu IgG (H+L) F(ab')2 (PharMingen), postupujíce podle instrukcí výrobce.
Ty byly aplikovány na mini-MACS kolonu (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Německo), aby byly separovány jak pozitivně ( >99 % čisté) , tak negativně ( > 90 % čisté) zvolené populace CD4 a CD8+ T buněk, jak bylo určeno cytometrickou analýzou.
Pro kvantifikaci apoptózy byly.použity dvě metody:
i) označení DNA akridinovou oranží pro^ prozkoumáni jaderné morfologie a ii) analýza buněčného cyklu následující po označení DNA propidium jodidem a buď protilátkami proti CD4 nebo protilátkami proti CD8.
Byly vytvořeny kultury 2 x 106/ml buněk mezenterických lymfatických uzlin, slezinných T buněk a frakcionovaných buněk mezenterických lymfatických uzlin v úplném médiu, obsahujícím 10 % FCS v nepřítomnosti nebo přítomnosti 80 pg/ml buď EtxB nebo EtxB(G33D) a zkoumány od 4 do 18 hodin. Po inkubaci byly buňky promývány HBSS a označeny 5 pg/ml akridinové oranže (Sigma). Thymocyty byly isolovány a
I 7 ošetřeny za nepřítomnosti nebo v přítomnosti 10 M dexamethasonu a použity íjako pozitivní kontrolní vzorek pro · Γ f
buňky podstupující apoptózu. Jaderné morfologické změny __2__.lym.fjO-cy_tů----b-yl-y-----z-k-oumány----konverrčňí nebo konfokální fluorescenční mikroskopií (Leica TCS 4D) . Podíl CD4+ a CD8 + slezinných T buněk v sub-Go/Gi stádiu buněčného cyklu byl určen proudovou cytometrickou analýzou DNA obsahu, provedenou po označeni propidium jodidem,__j_a.k_by-Lo—po-p-s-á-no--——-(-Θ—Gonnor*, PtMt; JábkmáhJ “J~ Jondle, D., Bhatia, K.,
Magrath, I. a Kohn, K.W. 1993. Role of p53 tumor suppressor gene in cell cycle arrest and radiosensitivity of Burkitťs lymphoma cell lineš. Cancer Res. 53: 4776). Buňky izolované z 18 h kultur slezinných T buněk inkubovaných samotné nebo v přítomnosti 40 pg/ml EtxB nebo EtxB(G33D) byly označeny FITC označenými krysími protilátkami proti CD4 nebo FITC označenými protilátkami proti CD8a. Označené buňky byly adjustovány na 1 x 10°/ml ve studené HBSS, obsahující 20 mM HEPES a 0,5 mM EDTA a byly fixovány studeným ethanolem, přidávaným po kapkách. Potom bylo přidáno 50 μς/ml propidium jodidu a 40 μg/ml ribonukleázy A (DNase free) a buňky byly inkubovány po 1 hodinu při pokojové teplotě. Relativní intenzita DNA označení propidium jodidem v CD4 a CD8+ T buňkách byla určena počítáním buněk.
V příkladu 1 pozorování, že CD8+ T buňky byly úplně odstraněny z kultury lymfatických buněk proliferujících v
odezvě na EtxB, naznačovalo, že EtxB vykazuje polyklonální účinek na tento podsoubor T buněk. Aby se prozkoumalo, zda je takový účinek závislý na aktivaci EtxB responsivnich buněk, byly vytvořeny kultury z OVA-sensibilizovaných myší a stimulovány samotným OVA nebo OVA plus buď EtxB nebo mutantem EtxB(G33D). Podobné vrcholové úrovně proliferace (den 4 kultury v každém případě) byly dosaženy v přítomnosti _____samotri.é.h.o—OVA-,—OVA—pl-u.-s—E-t-χ-Β—nebo~<3VPr~pďtrs E'ťxB7'G3’3O’) (97 3'4 ± 347, 12031 ± 135 respektive 9305 ± 290 c.p.m.). Nicméně došlo k dramatickému rozdílu v rozdělení podsouborů T buněk v těchto kulturách po 4 dnech (obr. 6) . Všechny kultury
| obsahovaly | CD4+ T buňky, ze kterých obdobné podíl-y--- |
^oexpr-i-movai-y CD 23. Na druhé straně ČD8+ T buňky byly nezjistitelné v kulturách, inkubovaných s OVA plus EtxB, ale byly zjevně přítomné (i když neaktivované, jak bylo stanoveno expresí CD25) v kulturách s OVA plus EtxB(G33D) nebo samotný OVA. To dokládá, že EtxB indukuje odstranění CD8+ T buněk, odpovídajících na jiný antigen než EtxB. Navíc nepřítomnost takové odezvy u EtxB(G33D) indikuje, že odstranění je spouštěno následkem interakce toxoidu a receptoru. Bylo také - zaznamenáno, že' přítomnost EtxB přírodního typu způsobila významný vzrůst podílu B buněk ze kterých velké množství byly CD25+ (neznázorněny), jak .bylo, již dříve zjištěno u kultur, vykazujících odezvu na EtxB (příklad 1). Bylo proto vyvozeno, že obsazení receptoru EtxB má hluboký imunomodulační účinek na lymfocyty bez ohledu na jejich antigenovou specificitu.
Byla zkoumána možnost, že CD8+ T buňky podstupuji apoptózu, pokud jsou kultivovány v přítomnosti EtxB. Buňky
φ φ φ φ φφφ ·· ···· φφ φφ mezenterických mízních uzlin nebo purifikované slezinné. T buňky z nesensibilizovaných myši byly inkubovány s EtxB nebo EtxB(G33D) a byly zaznamenávány změny v jaderné morfologii buněk po označení akridinovou oranží po dobu od 4 do 18 hodin (tabulka 3 a obr. 7). Morfologické změny buněk byly charakterizovány v přítomnosti kondenzace chromatinu, která způsobovala lobulární vzhled jader (obr. 7). Byly také pozorovány_dalš-í—v-l-a-sbuos-t-i—buněk—jádro j“e tvoření puchýřků plasmové membrány a přítomnost apoptózních těles. Tyto morfologické změny nastaly přibližně u jedné třetiny každého buněčného přípravku, ošetřeného EtxB, zatímco v kulturách buněk s EtxB(G33D) nebo bez exogenního antdg.an-u--bylpozorován—daleko menší výskyt (tabulka 3) . Jelikož CD8+ T buňky tvořily 35-40 % buněk mezenterických mízních uzlin a přípravků slezinných T buněk, odstranění těchto buněk by mohlo vysvětlit pozorovanou apoptózu. Aby se zjistilo, zda tento případ skutečně nastal, byly populace purifikovaných CD8 a CD4+ T buněk kultivovány po 18 hodin v přítomnosti antigenů (tabulka 3) . V negativně selektovaných populacích CD4+ T buněk (obsahujících > 90 % buněk nesoucích CD4) byly indukovány podobné podíly morfologických změn po ošetření buď EtxB, EtxB(G33D) nebo bez antigenů, což indikuje, že vazba EtxB na jeho receptor nespouští tohoto podsouboru
T buněk
Na rozdíl od toho více nez %
negativně selektovaných CD8+ T buněk vykazovalo morfologické změny, pokud byly kultivovány s EtxB přírodního typu, zatímco inkubace buď bez antigenů nebo s
EtxB(G33D) způsobila změny jen u
11-19 % těchto buněčných populací.
Dále, přítomnost malého množství kontaminujících buněk v použité purifikované populaci (10 % v každém
případě) nemůže vysvětlit pozorované efekty, neboť daleko více purifikované populace, obsahující více než 99 % CD8 nebo CD4+ T buněk (izolovaných pozitivní selekcí) vykazovaly odezvu na EtxB podobným způsobem (60 % bylo apoptických v přítomnosti EtxB ve srovnání s 7 % pro případ bez antlgenu i pro případ ošetření s EtxB(G33D)) (tabulka 3). Apoptóza byla detekována u 40 % a 98 % thymocytů po 18 hodinách inkubace -za—nep-ř-í-tOmne-s-tí-T—r e-s peictřve-v_p’řít omn osři“de x amethasonu.
Aby se prokázalo, že morfologické změny, pozorované v použitých kulturách byly konzistentní s indukcí apoptózy, byl vyhodnocen vznik subdiploidní DNA v_k.ulřu.rAch—
T b’une1<7 na' které bylo po 18 hodin působeno EtxB. Buňky byly po současném označení propidium jodidem a buď protilátkami proti CD8 nebo protilátkami proti CD4 podrobeny cytometrické analýze (obr. 8) . Přibližně 48 % CD8+ T buněk z kultur, inkubovaných EtxB kleslo pod diploidní G0/Gi vrchol propidium jodidového označení, což naznačovalo, že podstupovaly apoptózu (0'Connor, P.M. a kol., viz výše). Malá část buněk, exprimu j ících CD4 v kulturách EtxB také vykazovala sub-Go/Gi úrovně DNA (11 %, což může mít příčinu v smrti takto velkého podílu CD8+ T buněk). Na rozdíl od toho většina CD4 nebo CD8+ buněk,_ kultivovaných Joez antlgenu nebo v přítomnosti EtxB(G33D) byly v G0/Gi fázi buněčného cyklu, s méně než 5 % vykazujícími apoptózu. Z toho bylo vyvozeno, že pozorované jaderné morfologické změny a přítomnost sub-Go/Gx úrovní DNA v podstatné části CD8+ T buněk ošetřených EtxB prokazuje selektivní apoptózu, spuštěnou choleře podobným enterotoxoidem. Neschopnost receptor vázajícího mutantu, EtxB(G33D), indukovat podobné
účinky dokazuje, že indukce apoptózy CD8+ T buněk je vázána na jeho schopnost vázat GM1 gangliosid.
Příklad 3 č
Skupiny 8 myších DBA/1 samců byly buď neošetřeny (skupina A) ________ nebo jim bylo injektov.áno—1-0-0—pg—ho-vě-z-í-h-o—koď-agenu—v-CFA—v den 0 intra-dermální (i.d.) injekcí do boku. Myši injektované kolagenem byly buď ponechány nechráněné (skupina B; pozitivní kontrola) nebo byly učiněny pokusy zabránit vývinu nemoci podáváním i.d. v místě, blízkém místu podáni ---------kolagenu: 100 pg E-txB~v—I~FA~v-ďen~0^(s“kuplna~iΒ')Τ^Γ0(Γ“μς EtxB v IFA v den 14 (skupina D) nebo 100 pg EtxB(G33D) v IFA v den 0 (skupina E) . Všechna zvířata, s výjimkou skupiny A, dostávaly posilovači dávku kolagenu v IFA i.d. v den 21 a síla nemoci byla určena v den 45 měřením tloušťky kloubu zadní končetiny (experiment A) nebo měřením otoku prstů každé zadní končetiny (stupnice 0-3, kde 0 bylo normální a 3 představovalo maximální otok; experiment’ B) .
Získané výsledky jsou podány na obr. 9a a 9b. Ty ukazují, že <4 EtxB, ale nikoli EtxB(G33D), dramaticky chrání myši před vývinem kolagenem indukované artritidy.
Přiklad 4a
Dva oddělené vzorky lidské soubory lymfocytů (získané od normálních lidských dárců krve) byly použity jako zdroj
jednojaderných buněk. Buňky byly isolovány na Ficollpaque a extenzívně promývány před kultivaci v nepřítomnosti antigenu nebo s 80 μρ/ml buď EtxB nebo EtxB(G33D), jak bylo ukázáno. Před kultivací populace buněk obsahovaly 24 % CD8+, 27 % CD4 + , respektive 27 % CD8+ a 22,9 % CD4+ ve vzorku. Po £ kultivaci po dobu 18 hodin byl určen vzhled apoptických buněk ve vzorcích buněk, označených akridinovou oranží (jak __________bylo podrobně popsáno_v_p.ř.í-kl-adě—2-)——Zú-s-k-aná—výs±edfcy jdcru znázorněny na obr. 10, které ukazují, že EtxB, ale nikoli EtxB(G33D) indukuje apoptózu v populacích normálních lidských periferálních jednojaderných krevních buněk.
Příklad 4b
Myší linie T buněk, CTLL-2, byly kultivovány do konfluence a potom byly buňky promývány, načež byly přesazeny v nepřítomnosti antigenu nebo s 80 μς/πνΐ buď EtxB nebo EtxB(G33D), jak bylo ukázáno. Po 18 hodinách byly odebrány vzorky a podíl buněk vykazujících známky apoptózy byl určen použitím akridinové oranže (jak bylo detailně popsáno v příkladě 2). Získané výsledky jsou znázorněny na obr. 11. Ten ukazuje, že křížová vazba GM1 vede k apoptóze v části myších’ ~ČTLL buněk.
Tabulka 1 - Lymfocytová proliferace v přítomnosti EtxB nebo
EtxB(G33D)
Dávka pg/ml EtxB
EtxB(G33D) EtxB*
EtxB(G33D)*
| 0 | 117.9 (7.9) | 146.8 (3.5) | 124.5 (14.6) | 116.1 (6.35) |
| 5 | 4928 | 28 60 | 2424 | 1431.5 |
| i n | (98.7) | (3.8) | (88.3) | (37.5) |
| —±-U-------- | ----------o-y / o | 3ύο 1 | 2518 | 4231 |
| (30.6) | (4.6) | (21.6) | (96.4-) | |
| 20 | 7084 | 6912 | 4394 | 5075 |
| (100) | (47.3) | (42.1) | (24.8) |
| 40 | 8844 | 8586 | 7431 | 4368.5 | |
| • | (26) | (143.7)· | (45.3) | (118.9) | |
| 80 | 10246 | 12510 | 7986 | 7276 | |
| (30.7) | (121.8) | (210.3) | (369.5) | ||
| 160 | 11311 | 13525 | — | — | |
| 6»; | (247) | (352.7) | |||
| Myši byly Freundově | injektovány i.p. 30 μς adjuvans (CFA). Po 10 | EtxB(G33D) v dnech byly | kompletním izolovány |
mezenterické lymfatické uzliny. Buňky byly izolovány a inkubovány po 4 dny v přítomnosti EtxB, EtxB(G33D) nebo rozložených monomerních forem těchto proteinů (*), vytvořených zahříváním na 95 °C. Byla určena proliferace přidáváním 1 μθί (3H) dThd po posledních 6 hodin dne 4.
Data, podávají střední cpm a SEM trojnásobných jamek. Buňky izolované z neimunizovaných myší daly <1500 cpm (dávka 160 μς/ιηΐ) .
Tabulka 2 - Cytokinová analýza v přítomnosti EtxB nebo EtxB(G33D)
Protein
L-2—(pg-/ml-)
EtxB
EtxB(G33D)
318
-lW-γ—(pg/ml·)2700
4068
Myši b-y-l-y—;injektovány EtxB (G33D)—v~CEA~a poTO dnech byly izolovány mezenterické lymfatické uzliny. Buňky byly inkubovány in vitro buď s EtxB nebo s EtxB(G33D) a vzorky supernatantu byly analyzovány na obsah cytokinů v den 5 buněčné proliferace.
Tabulka 3 - komplexem EtxB-receptor zprostředkovaná apoptóza frakcionováných lymfocytů
| Buňky | Doba (h) | Bez | antigenů EtxB(G33D) | EtxB | ||
| MLNC | .........4 | V | 7s) | 2 (0) | 1 | (3) |
| 18 | 8 | (10) | 5 (18) | 29 | (35) | |
| SPLTC | ' 4 | 3 | (7) · | 2 (6) | 3 | (5) |
| 18 | 17 | (5) | 16.5(12) | 31 | (32) |
Negativní
| * | - 53 - | • · 9 • · · • · · · • · ···♦ 4 4 4 4 4' · | • 4 ·· • 4 4 4 9 9 9 • 44 4 | |||||
| • 4 4 | • 9 9 9 99 | |||||||
| selekce | ||||||||
| CD4 | 18 | 5 | (37) | 6 | (31) | 9 | (35) | |
| CD8 | 18 | 18 | (11) | 19 | (15) | 76 | (73) | |
| Pozitivní | ||||||||
| selekce | ||||||||
| CD4 | 18 | 6 | 4 | 6 | ||||
| CD8 | 18 | 7 | 7 | 60 |
Jaderné morfologické změny frakcionovaných CD4 a CD8+ T h buněk po 4 hodinách nebo 18 hodinách inkubace v
---------—nepřítomnosti antigenu nebo s 80 pg/ml EtxB nebo- EťxB(G33D) byly prozkoumány fluorescenční mikroskopii, která následovala po označeni akridinovou oranží. Úplné mezenterické lymfatické uzliny byly zbaveny adherantnich buněk. SPLTC byly izolovány negativní selekci na koloně skleněných kuliček pokrytých myším γ-globulinem a králičí proti-myší sekundární protilátkou. Po označení krysí phycoetythrinovanými protilátkami proti myším CD4 nebo FITC označenými protilátkami . proti myším CD8a byly získány ζ»·ι · z I frakcionované slezinné T buňky, které potom byly inkubovány s MACS koloidními super-paramagnetickými mikrokuličkami, kbňjugovaňými s kozí protilátkou proti krysím IgG (H+L) F(ab')2. Ty potom byly separovány použitím mini-MACS kolony, aby byly získány jako pozitivně (>99 % čisté), tak negativně (>90 % čisté) selektované frakce CD4 a CD8+' T buněk. Změny jaderné morfologie.byly zkoumány od 4 do 18 hodin v náhodném vzorku 200 buněk na pokus, jak je popsáno na obr. 7. Maximální podíl apoptických buněk nastal po 18 hodinách.
Claims (15)
1. Použiti (I) činidla majícího účinek vazby na GM-1, jiného než Ctx nebo Etx, nebo B podjednotky Ctx nebo Etx nebo (II) _____činidla,_____půs_ob.í.cího____na GMXL----zprost-ře-dk-Q-va-né------------ vnitrobuněčné signální události, ale nemajícího účinek vazby na GM-1, jako činidla pro léčení nebo prevenci autoimunitních onemocnění.
2. Použití Ctx, ETx nebo B podjednotky Ctx nebo Etx pro výrobu léčiv, použitelných jako činidel pro léčení nebo prevenci autoimunitních onemocnění.
3. Způsob léčení autoimunitních onemocnění, ve kterém je účinné množství činidla, zvoleného ze souboru, zahrnujícího (I) činidlo, mající účinek vazby na GM-1 nebo činidlo, působící na GM-1 zprostředkované vnitrobuněčné signální události, ale nemající účinek vazby na GM-1, podáváno savčímu subjektu
4. Způsob podle nároku 3, ve kterém uvedené činidlo je' podáváno spolu s vlastním nebo křížově reagujícím antigenem.
5. Farmaceutický prostředek pro léčení autoimunitních onemocnění, obsahující:
(I) činidlo, mající účinek vazby na GM-1 nebo savčích • · • φ (II) činidlo, působící na GM-1 zprostředkované vnitrobuněčné signální události, ale nemající účinek vazby na GM-1 a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo.
6. Farmaceutický prostředek podle nároku 5, dále obsahující vlastní nebo křížově reagující antigenový determinant.
7. Kit zahrnující farmaceutický prostředek podle_náro.ku_5__a od ní oddělený farmaceutický prostředek, obsahující vlastní nebo křížově reagující antigenový determinant.
8. Použití
-X-I-)—č-inidl-a—maý-í-eí-ho—úěi-ne-k—vazby na—GM-I7—j-íného—než—Ctx nebo Etx, nebo B podjednotky Ctx nebo Etx nebo (II) činidla, působícího na GM-1 zprostředkované vnitrobuněčné signální události, ale nemajícího účinek vazby na GM-1, pro léčení lidských leukémií T-buněčného původu.
9., Použití Ctx, ETx nebo B podjednotky Ctx nebo Etx pro výrobu léčiv pró léčení lidských leukémií T-buněčného
1?
původu.
10.
Způsob léčení lidských leukémií T-buněčného původu, ve kterém je účinné množství činidla, zvoleného ze souboru, zahrnuj ícího (I) činidlo, mající účinek vazby na GM-1 nebo (II) činidlo, působící na GM-1 zprostředkované vnitrobuněčné signální události, ale nemající účinek vazby na GM-1, podáváno savčímu subjektu.
?·
57 .• ·
11. Farmaceutický prostředek pro léčeni lidských leukémií Tbuněčného původu, obsahující:
(I) činidlo, mající účinek vazby na GM-1 nebo (II) činidlo, působící na GM-1 zprostředkované vnitrobuněčné signální události, ale nemající účinek vazby na GM-1 a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo.
12. Použití (I) činidla majícího účinek vazby na GM-1, jiného než Ctx nebo Etx, nebo B podjednotky Ctx nebo Etx nebo (II) činidla, působícího na GM-1 zprostředkované v-nit-robuněčné---sign-áini—udá-l-os-ti-,—a-l-e—nema-j-í-c-í-ho—úči-ne-k—v-a-z-b-yna GM-1, jako činidla pro prevenci/léčení odmítání transplanátu nebo GVHD.
13. Použití Ctx, ETx nebo B podjednotky Ctx nebo Etx pro výrobu léčiv pro prevenci odmítání transplanátu nebo GVHD.
GVHD, ve kterém je účinné množství činidla, zvoleného ze souboru, zahrnujícího (I) činidlo, mající účinek vazby ha GM-1 nebo (II) činidlo, působící na GM-1 zprostředkované vnitrobuněčné signální události, ale nemající účinek vazby na GM-1, podáváno savčímu subjektu.
15. Použiti (I) činidla majícího účinek vazby na GM-1, jiného než Ctx • ♦ · 9 •9 •· •· nebo Etx, nebo B podjednotky Ctx nebo Etx nebo (II) činidla, působícího na GM-1 zprostředkované vnitrobuněčné signální události, ale nemajícího účinek vazby na GM-1, pro vakcinaci savčího subjektu.
16. Způsob vakcinace savčího subjektu, ve kterém je účinné množství činidla, zvoleného ze souboru, zahrnujícího (I) činidlo, mající účinek vazby na GM-1, jiné než Ctx nebo Etx nebo (II) činidlo, působící na GM-1 zprostředkované vnitrobuněčné signální události, ale nemající účinek vazby na GM-1,
---podáváno—savč-ímu—subjektu—současně—s—účinným—množstvím -k--------němu se nevztahujícího cizího antigenového determinantu.
Zastupuj e:
Dr. Miloš Všetečka v.r.
1/11 b
Obr, la
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9513733.7A GB9513733D0 (en) | 1995-07-05 | 1995-07-05 | Therapeutic agents |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ1298A3 true CZ1298A3 (cs) | 1998-06-17 |
| CZ298670B6 CZ298670B6 (cs) | 2007-12-19 |
Family
ID=10777189
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ0001298A CZ298670B6 (cs) | 1995-07-05 | 1996-07-05 | Použití cinidla pro výrobu léciva pro prevenci a/nebo lécení autoimunní choroby nebo lidské T lymfocytární leukemie nebo odmítnutí implantátu, farmaceutický prostredek a kit obsahující tento prostredek |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6287563B1 (cs) |
| EP (1) | EP0841939B1 (cs) |
| JP (1) | JP4024298B2 (cs) |
| KR (1) | KR100452000B1 (cs) |
| CN (1) | CN1313150C (cs) |
| AT (1) | ATE275968T1 (cs) |
| AU (1) | AU724516B2 (cs) |
| CA (1) | CA2225788C (cs) |
| CZ (1) | CZ298670B6 (cs) |
| DE (1) | DE69633393T2 (cs) |
| DK (1) | DK0841939T3 (cs) |
| ES (1) | ES2229276T3 (cs) |
| GB (1) | GB9513733D0 (cs) |
| HK (1) | HK1006496A1 (cs) |
| HU (1) | HU224248B1 (cs) |
| MX (1) | MX9800241A (cs) |
| NO (1) | NO319747B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ311762A (cs) |
| PL (1) | PL187266B1 (cs) |
| PT (1) | PT841939E (cs) |
| RU (1) | RU2203088C2 (cs) |
| SI (1) | SI0841939T1 (cs) |
| WO (1) | WO1997002045A1 (cs) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9326174D0 (en) * | 1993-12-22 | 1994-02-23 | Biocine Sclavo | Mucosal adjuvant |
| US20010036917A1 (en) * | 1995-07-05 | 2001-11-01 | Williams Neil Andrew | Therapeutic agents |
| US7097845B2 (en) * | 1997-04-23 | 2006-08-29 | Jacob Sten Petersen | Combinations of antigen and mucosal binding component for inducing specific immunological tolerance |
| GB9800487D0 (en) * | 1998-01-09 | 1998-03-04 | Oratol Limited | Therapies |
| GB9801871D0 (en) * | 1998-01-28 | 1998-03-25 | Univ Bristol | Therapies |
| KR20010043441A (ko) * | 1998-05-08 | 2001-05-25 | 더 유니버시티 오브 브리스톨 | 백신용 면역조절제 |
| HUP0104842A3 (en) * | 1998-05-08 | 2002-12-28 | Univ Bristol Bristol | Vaccine |
| US7041296B1 (en) | 1999-11-12 | 2006-05-09 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Methods of treating inflammatory bowel disease using cholera toxin B subunit |
| WO2001034175A2 (en) * | 1999-11-12 | 2001-05-17 | The Government Of The United States Of America, Asrepresented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services | Methods of treating inflammatory bowel disease using cholera toxin b subunit |
| US20020155511A1 (en) * | 2000-09-08 | 2002-10-24 | Carolyn Horrocks | Novel antibody compositions for the negative selection of specific rat leukocyte subsets |
| GB0115382D0 (en) | 2001-06-22 | 2001-08-15 | Univ Bristol | Mutant |
| US20050084967A1 (en) | 2002-06-28 | 2005-04-21 | Xcyte Therapies, Inc. | Compositions and methods for eliminating undesired subpopulations of T cells in patients with immunological defects related to autoimmunity and organ or hematopoietic stem cell transplantation |
| CN105050621B (zh) * | 2013-02-14 | 2018-10-23 | 康奈尔大学 | 防止和治疗多发性硬化症的方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5571787A (en) * | 1993-07-30 | 1996-11-05 | Myelos Corporation | Prosaposin as a neurotrophic factor |
| US5681571A (en) * | 1993-10-08 | 1997-10-28 | Duotol Ab | Immunological tolerance-inducing agent |
-
1995
- 1995-07-05 GB GBGB9513733.7A patent/GB9513733D0/en active Pending
-
1996
- 1996-07-05 EP EP96922162A patent/EP0841939B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-05 SI SI9630697T patent/SI0841939T1/xx unknown
- 1996-07-05 JP JP50492797A patent/JP4024298B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-07-05 PT PT96922162T patent/PT841939E/pt unknown
- 1996-07-05 DE DE69633393T patent/DE69633393T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-05 AU AU63142/96A patent/AU724516B2/en not_active Expired
- 1996-07-05 CA CA2225788A patent/CA2225788C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-05 NZ NZ311762A patent/NZ311762A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-07-05 CZ CZ0001298A patent/CZ298670B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-07-05 CN CNB961962585A patent/CN1313150C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-05 RU RU98101907/14A patent/RU2203088C2/ru active
- 1996-07-05 PL PL96324424A patent/PL187266B1/pl unknown
- 1996-07-05 HU HU9900147A patent/HU224248B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-07-05 AT AT96922162T patent/ATE275968T1/de active
- 1996-07-05 WO PCT/GB1996/001614 patent/WO1997002045A1/en active IP Right Grant
- 1996-07-05 DK DK96922162T patent/DK0841939T3/da active
- 1996-07-05 ES ES96922162T patent/ES2229276T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-05 KR KR1019970709899A patent/KR100452000B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-12-29 US US08/999,458 patent/US6287563B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-01-02 NO NO19980005A patent/NO319747B1/no not_active IP Right Cessation
- 1998-01-07 MX MX9800241A patent/MX9800241A/es active IP Right Grant
- 1998-06-02 HK HK98104738A patent/HK1006496A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2237757T3 (es) | Metodos para inducir la tolerancia de celulas t a un injerto de tejido u organo. | |
| Doe | The intestinal immune system. | |
| PT721469E (pt) | Anticorpos anti-gp39 e suas utilizacoes2 | |
| AU2004253770A1 (en) | PAN-KIR2DL NK-receptor antibodies and their use in diagnostik and therapy | |
| KR20100126811A (ko) | 모노클로날 항체 및 그것의 방법 | |
| CZ1298A3 (cs) | Terapeutická činidla pro léčení autoimunitních onemocnění, farmaceutický prostředek, kit obsahující farmaceutický prostředek a použití | |
| Zafiropoulos et al. | Induction of antigen-specific isotype switching by in vitro immunization of human naive B lymphocytes | |
| AU2006235956A1 (en) | Methods and compositions for enhancing immune response and for the production of in vitro mabs | |
| US20140322274A1 (en) | Therapeutic Agents | |
| Gieni et al. | Allergen-specific modulation of cytokine synthesis patterns and IgE responses in vivo with chemically modified allergen. | |
| WO2003092615A2 (en) | Use of anti-cd1 antibodies for the modulation of immune responses | |
| US7790158B2 (en) | Methods for epitope-specific and cytokine/anticytokine combination immunotherapies | |
| MXPA00010934A (es) | Vacuna. | |
| US6846488B2 (en) | Chimeric antigen-enterotoxin mucosal immunogens | |
| WO1997017360A2 (en) | Methods for modulating t cell responses by manipulating a common cytokine receptor gamma chain | |
| Van Den Eertwegh et al. | In vivo TB cell interactions and cytokine-production in the spleen | |
| Calvert et al. | Immunoglobulin D—antibody or receptor? Part II. Functional aspects | |
| KR100646313B1 (ko) | 알러지 질환 예방 및 치료용 펩티드 또는 그의 염 및 이를함유한 의약 조성물 | |
| AU2002337708A1 (en) | Combination therapies for immune mediated diseases | |
| US20010033840A1 (en) | Methods for inducing T cell tolerance to a tissue or organ graft | |
| JPH03272693A (ja) | 免疫抑制因子の製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20150705 |