CZ298670B6 - Použití cinidla pro výrobu léciva pro prevenci a/nebo lécení autoimunní choroby nebo lidské T lymfocytární leukemie nebo odmítnutí implantátu, farmaceutický prostredek a kit obsahující tento prostredek - Google Patents
Použití cinidla pro výrobu léciva pro prevenci a/nebo lécení autoimunní choroby nebo lidské T lymfocytární leukemie nebo odmítnutí implantátu, farmaceutický prostredek a kit obsahující tento prostredek Download PDFInfo
- Publication number
- CZ298670B6 CZ298670B6 CZ0001298A CZ1298A CZ298670B6 CZ 298670 B6 CZ298670 B6 CZ 298670B6 CZ 0001298 A CZ0001298 A CZ 0001298A CZ 1298 A CZ1298 A CZ 1298A CZ 298670 B6 CZ298670 B6 CZ 298670B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- agent
- etxb
- cells
- subunit
- antigenic determinant
- Prior art date
Links
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 title claims abstract description 128
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 47
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 title claims abstract description 26
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 title abstract description 93
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 11
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 title abstract description 7
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 title abstract description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims abstract description 59
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 22
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 claims abstract description 22
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 claims abstract description 21
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 36
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 36
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 36
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 claims description 8
- 239000007943 implant Substances 0.000 claims description 8
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 claims description 7
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 5
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 5
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 4
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 claims description 3
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 101
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 51
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 50
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 44
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 39
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 39
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 34
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 31
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 31
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 26
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 22
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 21
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 20
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 16
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 description 16
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 15
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 15
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 14
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 14
- 230000004044 response Effects 0.000 description 14
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 13
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 13
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 12
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 11
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 11
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 11
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 9
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 8
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 8
- 210000002011 intestinal secretion Anatomy 0.000 description 8
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 8
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 230000003844 B-cell-activation Effects 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 7
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 7
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 7
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 6
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 6
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 6
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 6
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 5
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 4
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 4
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- QPJBWNIQKHGLAU-IQZHVAEDSA-N ganglioside GM1 Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC[C@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)[C@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](CO)O1 QPJBWNIQKHGLAU-IQZHVAEDSA-N 0.000 description 4
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 4
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 4
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 4
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 4
- 229940097496 nasal spray Drugs 0.000 description 4
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 3
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 3
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 241000607284 Vibrio sp. Species 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 3
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000009386 Experimental Arthritis Diseases 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical group N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000033540 T cell apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 208000024340 acute graft versus host disease Diseases 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 2
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 2
- 230000009699 differential effect Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 2
- 108010055409 ganglioside receptor Proteins 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 2
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 2
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 2
- 238000004989 laser desorption mass spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 2
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000207 lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 230000020192 tolerance induction in gut-associated lymphoid tissue Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 102100034612 Annexin A4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000669 Annexin A4 Proteins 0.000 description 1
- -1 Asp amino acid Chemical class 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700031361 Brachyury Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 102100030497 Cytochrome c Human genes 0.000 description 1
- 108010075031 Cytochromes c Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- BAQCROVBDNBEEB-UBYUBLNFSA-N Metrizamide Chemical compound CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C(=O)N[C@@H]2[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)OC2O)O)=C1I BAQCROVBDNBEEB-UBYUBLNFSA-N 0.000 description 1
- 101001044384 Mus musculus Interferon gamma Proteins 0.000 description 1
- 101001033265 Mus musculus Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 101001043827 Mus musculus Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001002703 Mus musculus Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000960966 Mus musculus Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010089814 Plant Lectins Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 1
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108010078814 Tumor Suppressor Protein p53 Proteins 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000000961 alloantigen Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 210000000649 b-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000005266 beta plus decay Effects 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 230000025084 cell cycle arrest Effects 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000009134 cell regulation Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010428 chromatin condensation Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000001218 confocal laser scanning microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001236 detergent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000000212 effect on lymphocytes Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101150021159 etxB gene Proteins 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000010439 graphite Substances 0.000 description 1
- 229910002804 graphite Inorganic materials 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000008102 immune modulation Effects 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000004073 interleukin-2 production Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000005024 intraepithelial lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000005567 liquid scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229960000554 metrizamide Drugs 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000016379 mucosal immune response Effects 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000001151 other effect Effects 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000003726 plant lectin Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000026267 regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102220226165 rs771426932 Human genes 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000007781 signaling event Effects 0.000 description 1
- 230000007727 signaling mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/868—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving autoimmunity, allergy, immediate hypersensitivity, delayed hypersensitivity, immunosuppression, or immunotolerance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Použití cinidla pro výrobu léciva pro prevenci a/nebo lécení autoimunní choroby nebo lidské T lymfocytární leukemie, kde (i) cinidlem je EtxB (tepelne labilní enterotoxin z E. coli, podjednotka B) a/nebo CtxB (cholerový toxin, podjednotka B), neobsahující podjednotku A; (ii) jestliže cinidlo má býtpodáváno spolecne s antigenní determinantou, pak cinidlo a antigenní determinanta nejsou spojeny tak, že tvorí jediné úcinné cinidlo. Do rozsahu rešení rovnež náleží farmaceutický prostredek obsahující toto cinidlo a kit. Dalším aspektem je použití cinidla pro výrobu léciva pro prevenci a/nebo lécení odmítnutí implantátu nebo GVHD, kde (i) cinidlem je EtxB (tepelne labilní enterotoxin z E. coli, podjednotka B), neobsahující podjednotku A; (ii) jestliže cinidlo má být podáváno spolecne s antigenní determinantou, pak cinidlo a antigenní determinanta nejsou spojeny tak, že tvorí jediné úcinné cinidlo; a farmaceutický prostredek obsahující toto cinidlo.
Description
Použití činidla pro výrobu léčiva pro prevenci a/nebo léčení autoimunní choroby nebo lidské T lymfocytární leukemie nebo odmítnutí implantátu, farmaceutický prostředek a kit obsahující tento prostředek
Oblast techniky
Vynález se týká použití činidla pro výrobu léčiva pro prevenci a/nebo léčení autoimunní choroby nebo lidské T lymfocytární leukemie, nebo použití činidla pro výrobu léčiva pro prevenci a/nebo léčení odmítnutí implantátu nebo GVHD, dále farmaceutického prostředku obsahujícího toto činidlo a kitu obsahujícího tento farmaceutický prostředek. Konkrétně se vynález týká terapeutických činidel pro použití při léčení savčích, obzvláště lidských, autoimunních onemocnění a terapeutických činidel použitelných pro léčení lidských leukémii T-buněčného původu, jako takzvaných „vakcínových nosičů“ a jako činidla pro prevenci lidského odmítání transplantátu nebo onemocnění štěp versus hostitel (grafit versus host - GVHD).
Dosavadní stav techniky
Terapeutická činidla a autoimunní onemocnění.
V publikaci „Morphologic and Functional Alteration of Mucosal Cells by Cholera Toxin an its Subunit“ (Morfologická a funkční změna mukózních T buněk cholerovým toxinem a jeho podjednotkou), autoři Charles O. Elson a kol., The Journal of Immunology, 1995, 154; 1032-1040, je popsáno, že cholerový toxin (Ctx) a jeho podjednotka CtxB inhibují CD8+ a CD4+ T buňky.
Známa je rovněž publikace „Prevention ofAcute Graft-Versus-Host Disease by Treatment with NovelImmunosuppressant“ (Prevence akutního onemocnění štěp-versus-hostitel léčením novým imunosupresivem) od B. Yankeleviche a kol., The Journal of Immunology, 1995, 154: 361130 361 7. Tento článek identifikuje CtxB jako činidlo pro prevenci akutního onemocnění štěp-versus-hostitel (GVHD) při transplantaci kostní dřeně.
V mezinárodní publikované patentové přihlášce WO 95/10301 se popisuje činidlo pro vyvolání imunologické snášenlivosti zahrnující mukózně vázanou molekulu, vázanou ke specifickému tolerogenu.
Zkratka „Ctx“ bude dále používána k označení cholerového toxinu a „CtxB“ k označení podjednotky B cholerového toxinu. V jiných textech jsou někdy používána označení „CT“ nebo „Ct“ a „CTB“ nebo „CtB“. Zkratka „Etx“ bude dále používána pro označení tepelně nestabilního entero40 toxinu E. coli a „EtxB“ bude používána pro označení podjednotky B enterotoxinu Etx. V jiných textech jsou někdy používána označení „ET“ nebo „Et“ a „ETB“ nebo „EtB“.
Podstata vynálezu
Podstata předmětu vynálezu je založena na zjištění, že EtxB (jednotka B tepelně nestabilního enterotoxinu E. coli) se váže k GMl-gangliosidovým receptorům, které se nacházejí na površích savčích buněk a že tato vazba indukuje rozdílné účinky na populace lymfocytů, zahrnující odstranění CD8+ T buněk a související aktivaci B buněk. K těmto účinkům nedochází, pokud je použit mutant proteinu EtxB, kteiý postrádá účinek vazby na GM1.
Podstatou předmětného vynálezu je použití činidla pro výrobu léčiva pro prevenci a/nebo léčení autoimunní choroby nebo lidské T lymfocytární leukemie, kde:
(i) činidlem je EtxB (tepelně labilní enterotoxin z E. coli, podjednotka B) a/nebo CtxB (chole55 rový toxin, podjednotka B), neobsahující podjednotku A,
-1 CZ 298670 B6 (ii) jestliže činidlo má být podáváno společně s antigenní determinantou, pak činidlo a antigenní determinanta nejsou spojeny tak, že tvoří jediné účinné činidlo.
Podle jednoho z aspektů předmětného vynálezu se toto použití ve výhodném provedení podle 5 předmětného vynálezu vztahuje na prevenci a/nebo léčení autoimunních chorob, nejvýhodněji pro prevenci a/nebo léčení revmatoidní artritidy, roztroušené sklerózy nebo diabetes.
Podle dalšího aspektu předmětného vynálezu je při tomto použití uvedeným činidlem EtxB.
Podle dalšího aspektu předmětného vynálezu je při tomto použití činidlo podáváno bez společného podávání se samostatně reagujícím nebo zkříženě reagujícím antigenem.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží farmaceutický prostředek jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje činidlo pro použití k prevenci a/nebo léčení autoimunní choroby nebo lidské T lymfocytámí leukemie, kde:
(i) činidlem je EtxB (tepelně labilní enterotoxin z£. coli, podjednotka B) a/nebo CtxB (cholerový toxin, podjednotka B), neobsahující podjednotku A, (ii) jestliže činidlo má být podáváno společně s antigenní determinantou, pak činidlo a antigenní determinanta nejsou spojeny tak, že tvoří jediné účinné činidlo.
Výhodný je podle tohoto řešení farmaceutický prostředek k prevenci a/nebo léčení autoimunní choroby jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje činidlo, kde (i) tímto činidlem je EtxB (tepelně labilní enterotoxin z£. coli, podjednotka B) a/nebo CtxB (cholerový toxin, podjednotka B), neobsahující podjednotku A, (ii) jestliže činidlo má být podáváno společně s antigenní determinantou, pak činidlo a antigenní determinanta nejsou spojeny tak, že tvoří jediné účinné činidlo.
Podle dalšího aspektu předmětného vynálezu je výhodný farmaceutický prostředek pro prevenci a/nebo léčení revmatoidní artritidy, roztroušené sklerózy nebo diabetes, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje činidlo, kde (i) tímto činidlem je EtxB (tepelně labilní, enterotoxin z £. coli, podjednotka B) a/nebo CtxB (cholerový toxin, podjednotka B), neobsahující podjednotku A, (ii) jestliže činidlo má být podáváno společně s antigenní determinantou, pak činidlo a antigenní determinanta nejsou spojeny tak, že tvoří jediné účinné činidlo.
Výhodný je podle předmětného vynálezu farmaceutický prostředek, ve kterém je uvedeným činidlem EtxB.
Podle dalšího aspektu je podle předmětného vynálezu výhodný farmaceutický prostředek, při 40 jehož aplikaci je uvedené činidlo podáváno bez společného podávání se samostatně reagujícím nebo zkříženě reagujícím antigenem.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží kit jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje libovolnou formu výše uvedeného farmaceutického prostředku a odděleně od něj farmaceutický prostředek obsahující antigenní determinantu reagující sama se sebou nebo zkříženě reagující antigenní determinantu.
Podle dalšího aspektu do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží použití činidla pro výrobu léčiva pro prevenci a/nebo léčení odmítnutí implantátu nebo GVHD, kde (i) činidlem je EtxB (tepelně labilní, enterotoxin z £. coli, podjednotka B), neobsahující podjednotku A,
-2CZ 298670 B6 (ii) jestliže činidlo má být podáváno společně s antigenní determinantou, pak činidlo a antigenní determinanta nejsou spojeny tak, že tvoří jediné účinné činidlo.
Podle dalšího aspektu do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží farmaceutický prostředek jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje činidlo pro použití pro prevenci a/nebo léčení odmítnutí implantátu nebo GVHD, kde (i) činidlem je EtxB (tepelně labilní, enterotoxin z E. coli, podjednotka B), neobsahující podjednotku A, (ii) jestliže činidlo má být podáváno společně s antigenní determinantou, pak činidlo a antigenní io determinanta nejsou spojeny tak, že tvoří jediné účinné činidlo.
Autoimunita je termín, který je používán k popisu mechanismu, kterým tělo generuje imunitní odezvu na vlastní antigeny.
Prvním aspektem předmětného vynálezu je specifikace činidla pro prevenci a/nebo léčení autoimunní choroby nebo lidské T lymfocytámí leukemie, kde (i) činidlem je EtxB (tepelně labilní enterotoxin z E. coli, podjednotka B) a/nebo CtxB (cholerový toxin, podjednotka B), neobsahující podjednotku A, (ii) jestliže činidlo má být podáváno společně s antigenní determinantou, pak činidlo a antigenní determinanta nejsou spojeny tak, že tvoří jediné účinné činidlo.
Podle předmětného vynálezu bylo zjištěno, že činidla podle předkládaného vynálezu modulují lymfocytové populace, což vede k apoptóze CD8+ T buněk, zvýšené aktivaci CD4+ buněk a polyklonální aktivaci B buněk. Je pravděpodobné, že tato událost posune imunitní odezvu směrem k indukci Th2 asociovaných cytokinů. Má se za to, že takováto odezva na vlastní nebo křížově reagující antigeny zprostředkovává ochranu proti jistým autoimunním onemocněním.
Podle jednoho z provedení předmětného vynálezu je činidlo použito k výrobě léčiva k léčení autoimunního onemocnění, které již vypuklo. V tomto provedení je činidlo podáváno pacientovi bez nebo spolu se současným podáváním vlastního nebo křížově reagujícího antigenu. Podávání činidla podle tohoto provedení moduluje povahu imunitní odezvy na vlastní antigen a odklání ji od aktivace onemocnění způsobujících zánětů a tudíž chrání proti autoimunnímu onemocnění.
Podle dalšího provedení předmětného vynálezu je činidlo použito při metodě „vakcinace“ savčího subjektu proti autoimunnímu onemocnění, ve kterém je činidlo podáváno současně s vlast35 ním nebo křížově reagujícím antigenovým determinantem (nebo s kombinací různých vlastních nebo křížově reagujících antigenových determinantů), vztahujících se k uvedenému onemocnění. Tímto způsobem je imunitní odezva subjektu na vlastní nebo křížově reagující antigen odchýlena od aktivace patogeneze, takže tím chrání proti budoucí autoimunitní odezvě na vlastní antigen.
Podle tohoto provedení jsou a/nebo mohou být subjektu současně podávány terapeutické činidlo a vlastní nebo křížově reagující antigenovým determinant. Tím se míní to, že místo a doba podávání jak terapeutického činidla, tak antigenového determinantu, jsou takové, že je dosaženo potřebné modulace imunitního systému. Proto, i když terapeutické činidlo a antigenový determinant mohou být podávány v témže místě a v tutéž dobu, může dojít k tomu, že je výhodné podá45 vat terapeutické činidlo a antigenový determinant v různých okamžicích a v různých místech.
I když může být podání jednoduché dávky terapeutického činidla a antigenového determinantu dostatečné, do rozsahu tohoto řešení podle vynálezu rovněž spadá i podávání vícenásobných dávek.
Podle tohoto provedení mohou být terapeutické činidlo a antigenový determinant vázány, například vázány kovalentní vazbou, tak, aby tvořily jediné aktivní činidlo, ačkoliv výhodně je používáno oddělené podávání, ve kterém terapeutické činidlo a antigenový determinant nejsou tímto způsobem vázány, neboť je tím umožněno oddělené podávání jednotlivých částí.
-3 CL 298670 B6
Specifická autoimunní onemocnění, která mohou být léčena v souladu s tímto řešením, jsou autoimunní onemocnění, ve kterých je patologie spojena s buněčnou imunitou, jakoje revmatická artritida, roztroušená skleróza a diabetes.
Farmaceutický prostředek podle vynálezu může být vytvořen tak, aby mohl být podáván mukózní cestou (přes sliznici), například jako nosní sprej nebo parenterálně, kdy je prostředek vytvořen v injektovatelné formě pro podávání například intravenózní, intramuskulámí nebo subkutánní cestou.
Farmaceutické prostředky mohou být vytvořeny tak, že zahrnují vhodný vlastní nebo křížově reagující antigen. Alternativně může být vytvořena souprava, obsahující oddělené kompozice pro terapeutické činidlo a pro antigenový determinant.
Specifická terapeutická činidla, která mohou být použita podle tohoto předmětu vynálezu jsou EtxB a CtxB nebo jejich mutanty, zachovávající si účinek vazby na GM1.
Činidla pro použití podle vynálezu jsou výhodně v podstatě netoxická, ačkoliv jistý stupeň toxicity může být tolerován v případě náročné terapie tohoto typu.
Toto řešení se také vztahuje na všechna činidla, mající účinek vazby na GM1, určená pro léčení savčích autoimunních onemocnění, stejně tak jako na činidla, působící na GM-1 zprostředkované vnitrobuněčné signální události, které tím napodobují činidla, vážící se na GM-1.
Předmětný vynález tedy není omezen na použití proteinu EtxB jako terapeutického činidla pro léčení lidských autoimunních onemocnění. Na druhé straně aleje protein EtxB (který je pentamerem pěti identických podjednotek) výhodným provedením takového léčení podle předkládaného vynálezu. Kromě přírodního typu EtxB se toto výhodné provedení vynálezu také vztahuje na mutanty EtxB, které mají účinek vazby na GM-1 stejně tak jako na další ekvivalentní proteiny, jako je podjednotka B cholerového toxinu (CtxB) a jeho mutantů, které mají účinek vazby na GM-1.
Další terapeutická činidla pro léčení autoimunních onemocnění podle vynálezu jsou humanizované monoklonální protilátky, které váží GM1. Způsoby pro identifikaci a získávání takových činidel jsou odborníkům dobře známy z dosavadního stavu techniky.
Dalším aspektem předmětného vynálezu je použití výše specifikovaného činidla pro výrobu léčiva k prevenci a/nebo léčení lidských leukémií T-buněčného původu, jako jsou lidské leukémie CD8 T-buněčného původu, kde (i) činidlem je EtxB (tepelně labilní enterotoxin z E. coli, podjednotka B) a/nebo CtxB (cholerový toxin, podjednotka B), neobsahující podjednotku A, (ii) jestliže činidlo má být podáváno společně s antigenní determinantou, pak činidlo a antigenní determinanta nejsou spojeny tak, že tvoří jediné účinné činidlo.
Činidla pro použití podle tohoto aspektu předmětného vynálezu jsou výhodně v podstatě neto45 xická, ačkoliv jistý stupeň toxicity může být tolerován v případě náročné terapie tohoto typu.
S tímto druhým aspektem souvisí farmaceutický prostředek, který může být vytvořen tak, aby mohl být podáván mukózní cestou, například jako nosní sprej nebo parenterálně, kdy je prostředek vytvořen v injektovatelné formě pro podávání například intravenózní, intramuskulámí nebo subkutánní cestou.
Tento aspekt se také vztahuje na všechna činidla, mající účinek vazby na GM1, určená pro léčení lidských leukémií T-buněčného původu, stejně tak jako na činidla, působící na GM-1 zprostředkované vnitrobuněčné signální události, která tím napodobují prostředky, vážící se na GM-1.
-4CZ 298670 B6
Tento druhý aspekt vynálezu tedy není omezen na použití proteinu EtxB jako terapeutického činidla pro léčení lidských leukémií T-buněčného původu. Na druhé straně ale je protein EtxB výhodným provedením takového léčení podle předkládaného vynálezu. Kromě přírodního typu EtxB se toto výhodné provedení vynálezu také vztahuje na mutanty EtxB, které mají účinek vazby na GM-1 stejně tak jako na další ekvivalentní proteiny, jako je podjednotka B cholerového toxinu (CtxB) a jeho mutantů, které mají účinek vazby na GM-1.
Další terapeutická činidla pro léčení těchto onemocnění podle tohoto předmětu předkládaného vynálezu jsou humanizované monoklonální protilátky, které vážou GM1. Způsoby pro identifi10 kaci a získávání takových činidel jsou odborníkům pracujícím v tomto oboru z dosavadního stavu techniky dobře známy.
Třetím aspektem předmětného vynálezu je použití činidla pro výrobu léčiva pro prevenci a/nebo léčení odmítnutí implantátu nebo GVHD, kde (i) činidlem je EtxB (tepelně labilní enterotoxin z E. coli, podjednotka B), neobsahující podjednotku A, (ii) jestliže činidlo má být podáváno společně s antigenní determinantou, pak činidlo a antigenní determinanta nejsou spojeny tak, že tvoří jediné účinné činidlo.
Ve výhodném provedení podle tohoto aspektu mohou být popsaná terapeutická činidla použita pro prevenci odmítání transplantátu pevného orgánu, buď alogenického nebo xenogenického. Tato činidla také mohou být používána pro prevenci akutního onemocnění GVHD, například v průběhu procedury transplantace kostní dřeně.
V provedení podle tohoto aspektu předmětného vynálezu, při kterém je pacient ošetřen před transplantací, by mělo být terapeutické činidlo podáváno současně s aloantigenem nebo xenoantigenem.
V provedení podle tohoto aspektu předmětného vynálezu, ve kterém jsou terapeutické činidlo a alo- nebo xenogenní determinant podávány subjektu současně, se tím míní to, že místo a doba podávání jak terapeutického činidla, tak antigenového determinantu, jsou takové, že je dosaženo potřebné modulace imunitního systému. Proto, i když terapeutické činidlo a antigenový determinant mohou být podávány v témže místě a v tutéž dobu, může být výhodné podávat terapeutické činidlo a antigenový determinant v různých okamžicích a v různých místech. Dále mohou být terapeutické činidlo a antigenový determinant kovalentně vázány tak, aby tvořily jediné aktivní činidlo, ačkoliv výhodně je používáno oddělené podávání, ve kterém terapeutické činidlo a antigenový determinant nejsou tímto způsobem vázány, neboť je tím umožněno oddělené podávání jednotlivých částí.
Podle tohoto aspektu předmětného vynálezu, pokud je terapeutické činidlo používáno pro pre40 věnci GVHD, bude činidlo normálně aplikováno přímo na buňky, například na buňky kostní dřeně, které jsou určeny pro transplantaci.
Uvedené činidlo je výhodně v podstatě netoxické, ačkoliv jistý stupeň toxicity může být tolerován v případě náročné terapie tohoto typu.
S tímto třetím aspektem předmětného vynálezu rovněž souvisí farmaceutický prostředek pro léčení odmítání transplantátů, obsahující činidlo pro použití pro prevenci a/nebo léčení odmítnutí implantátu nebo GVHD, kde (i) činidlem je EtxB (tepelně labilní enterotoxin z E. coli, podjednotka B), neobsahující podjednotku A, (ii) jestliže činidlo má být podáváno společně s antigenní determinantou, pak činidlo a antigenní determinanta nejsou spojeny tak, že tvoří jediné účinné činidlo.
Farmaceutický prostředek podle tohoto aspektu může být vytvořen tak, aby mohl být podáván mukózní cestou, například jako nosní sprej nebo parenterálně, kdy je prostředek vytvořen
-5 CZ 298670 B6 v injektovatelné formě pro podávání například intravenózní, intramuskulámí nebo subkutánní cestou.
Farmaceutické prostředky mohou být vytvořeny tak, že zahrnují vhodný alo- nebo xenogenní determinant. Alternativně může být vytvořena souprava, obsahující oddělené kompozice pro terapeutické činidlo a pro antigenový determinant.
Tento třetí aspekt předmětného vynálezu se také vztahuje na všechna činidla, mající účinek vazby na GM1, určená pro prevenci/léčení odmítání transplantátu a GVHD, stejně tak jako na činidla, působící na GM-1 zprostředkované vnitrobuněčné signální události, která tím napodobují činidla, vázající se na GM-1.
Tento třetí aspekt předmětného vynálezu tedy není omezen na použití proteinu EtxB jako terapeutického činidla pro prevenci odmítání transplantátu. Na druhé straně aleje protein EtxB (který je pentamerem pěti identických podjednotek) výhodným provedením takového léčení podle předkládaného vynálezu. Kromě přírodního typu EtxB se toto výhodné provedení vynálezu také vztahuje na mutanty EtxB, které mají účinek vazby na GM-1 stejně tak jako na další ekvivalentní proteiny, jako je podjednotka B cholerového toxinu (CtxB) a jeho mutantů, které mají účinek vazby na GM-1.
Další terapeutická činidla pro léčení autoimunních onemocnění podle vynálezu jsou humanizované monoklonální protilátky, které váží GM1. Způsoby pro identifikaci a získávání takových činidel jsou odborníkům pracujícím v daném oboru z dosavadního stavu techniky běžně známy.
CtxB a EtxB již byly navrženy jako takzvané „vakcinové nosiče“. Bylo zjištěno, že základem pro tento jev je zčásti schopnost EtxB modulovat lymfocytové populace (jak bylo diskutováno výše) vazbou k receptoru GM-1.
Dalším aspektem předmětného vynálezu je použití výše specifikovaného činidla pro vakcinaci savčích subjektů.
Toto činidlo je schopno modulace imunitní odezvy, pokud je podáváno společně s k němu se nevztahujícím cizím antigenovým determinantem. Pokud je činidlo podáváno parenterálně, je taková imunomodulace v pojmech imunitní odezvy „směřována“ určitým požadovaným směrem.
Pokud je činidlo podáváno mukózně skněmu se nevztahujícím antigenem, jako takzvaný „mukózní adjuvans“, činidlo je schopno usnadnit mukózní imunitní odezvu na uvedený nevztahující se antigen. Antigen a činidlo mohou být podávány buď odděleně nebo mohou být spolu vázány, například kovalentní vazbou.
Činidlo je výhodně netoxické. Navíc pokud je činidlo podáváno mukózně gastrointestinální sliznicí, musí být schopno zůstat stabilní v průběhu průchodu gastrointestinálním traktem; například musí být odolné k proteolytické degradaci, stabilní při kyselém pH a odolné k detergentním účinkům žluči.
S tímto aspektem předmětného vynálezu rovněž souvisí farmaceutický prostředek pro vakcinaci savčích subjektů, obsahující výše specifikované činidlo.
Farmaceutický prostředek podle tohoto aspektu předmětného vynálezu může být vytvořen tak, aby mohl být podáván mukózní cestou (přes sliznici), například jako nosní sprej nebo parente50 rálně, kdy je prostředek vytvořen v injektovatelné formě pro podávání například intravenózní, intramuskulámí nebo subkutánní cestou.
Tento farmaceutický prostředek může být vytvořen tak, že zahrnuje vhodný antigenní determinant. Alternativně může být vytvořena souprava, obsahující oddělené kompozice pro terapeutické činidlo a pro antigenový determinant.
-6CZ 298670 B6
Tento aspekt předmětného vynálezu se také vztahuje na použití všech činidel, majících účinek vazby na GM1, jako imunomodulátorů, stejně tak jako na činidla, působící na GM-1 zprostředkované vnitrobuněčné signální události, která tím napodobují činidla, vážící se na GM-1.
Tento aspekt předmětného vynálezu tedy není omezen na použití proteinu EtxB jako imunomodulátoru. Na druhé straně ale je protein EtxB (který je pentamerem pěti identických podjednotek) výhodným provedením takového léčení podle předkládaného vynálezu. Kromě přírodního typu EtxB se toto výhodné provedení vynálezu také vztahuje na mutanty EtxB, které mají účinek vazby na GM-1 stejně tak jako na další ekvivalentní proteiny, jako je podjednotka B cholerového toxinu (CtxB) a jeho mutantů, majících účinek vazby na GM-1.
Další terapeutická činidla pro léčení autoimunních onemocnění podle tohoto aspektu předmětného vynálezu jsou humanizované monoklonální protilátky, které váží GM1. Způsoby pro identi15 fikaci a získávání takových činidel jsou odborníkům pracujícím v daném oboru z dosavadního stavu techniky běžně známy.
Pokud je terapeutické činidlo podle vynálezu protein, jako je podjednotka EtxB nebo podjednotka CtxB, může být produkováno pro použití podle kteréhokoli výše uvedeného aspektu před20 mětného vynálezu způsobem, ve kterém je gen nebo geny, kódující specifický peptidový řetězec (nebo řetězce), z něhož je protein vytvořen, vloženy do vhodného vektoru a potom použity pro transfekci vhodného hostitele. Například gen kódující polypeptidový řetězec, ze kterého se vytváří EtxB může být vložen například do plazmidu pMMB68, který je potom použit pro transfekci hostitelské buňky, jako je Vibrio sp.60.. Protein je purifikován a izolován způsobem, který je znám jako per se. Mutované geny, exprimující účinný mutant proteinu EtxB mohou být vytvořeny známými způsoby z genu přírodního typu.
Jak bylo řečeno výše, činidla, která mají účinek vazby na GM-1, jako jsou specificky navržené humanizované monoklonální protilátky, mohou být navržena a produkována způsobem, který je popsán výše způsoby, které jsou odborníkům pracujícím v daném oboru běžně známy.
Podle všech aspektů předmětného vynálezu může být činidlo, mající účinek vazby na GM-1, schopné křížové vazby GM1 receptorů. EtxB je jedním takovým činidlem, které je schopno křížové vazby GM1 receptorů, díky své pentamerické formě.
Přehled obrázků na výkresech
Vynález bude nyní ilustrován s odvoláním na přiložené obrázky a na příklady po nich následující.
Stručný popis obrázků
Obr. 1 představuje analýzu fyzikálně chemických vlastností EtxB a mutované podoby EtxB (EtxB(G33D).
Obr. 2 ilustruje, že receptorová vazba EtxB je podstatná pro jeho silnou imunogenicitu in vivo. Obr. 3 ilustruje kinetiku proliferace lymfocytů, která následuje po injekci EtxB myši.
Obr. 4 ilustruje, že EtxB způsobuje zvýšenou aktivaci B buněk.
Obr. 5 ilustruje, že EtxB způsobuje zvýšenou aktivaci CD4+ T buněk a odstranění CD8+ T buněk.
Obr. 6 ukazuje selektivní odstranění OVA-responzivních CD8+T buněk pomocí EtxB.
Obr. 7 ukazuje, že receptorová vazba podjednotkou EtxB indikuje změny vlastnosti lymfocytové jaderné morfologie buněk, které byly podrobeny apoptóze.
-7 CZ 298670 B6
Obr. 8 ukazuje apoptózu CD8+ T buněk, zprostředkovanou EtxB receptory, měřenou analýzou buněčného cyklu.
Obr. 9 a 9b ukazují výsledky experimentů prováděných s cílem ukázat, že vazba GM-1 podjednotkou EtxB inhibuje vývin kolagenem indukované artritidy u živočišného modelu.
Obr. 10 ukazuje výsledky experimentů prováděných s cílem ukázat, že EtxB, ale nikoli EtxB(G33D), indukuje apoptózu v populacích normálních lidských periferních krevních jednojademých buněk.
Obr. 11 ukazuje výsledky experimentů ukazujícím, že křížová vazba GM1 vede kapoptóze myších CTLL buněk.
Podrobný popis obrázků
Obrázek 1
Analýza fyzikálně chemických vlastností EtxB a EtxB(G33D).
(A) SDS-PAGE analýza EtxB nebo EtxB(G33D): 5 pg každého proteinu bylo analyzováno za redukčních podmínek v přítomnosti β-merkaptoethanolu jak s předchozím zahříváním tak i bez předchozího zahřívání. Pás 1 ukazuje přírodní typ EtxB, nezahřívaný. Pás 2, EtxB(G33D), nezahřívaný. Pás 3, přírodní typ EtxB, zahřívaný na 95 °C. Pás 4, EtxB(G33D), zahřívaný na 95 °C. Standardy molekulové hmotnosti (BioRad) jsou ukázány na levé straně panelu.
(B) Určení zdánlivé molekulové hmotnosti EtxB a EtxB(G33D) gelovou filtrační chromatografií:
standardní křivka (kroužky) byla generována ve směru shora dolů použitím hovězího sérového albuminu (66 kDa), albuminu slepičích vajec (45 kDa), hovězí erythrocytové karbonanhydrázy (29 kDa) a koňského srdečního cytochromu c (12,4 kDa). EtxB a EtxB(G33D) byly vymývány se zdánlivou molekulovou hmotností 36 kDa, respektive 38 kDa. Ve znamená vymývací objem proteinu a Voje mrtvý objem filtrační kolony.
(C) Test ELISA pro komparativní vazbu EtxB a EtxB(G33D) na gangliosid GM1: desky byly pokryty gangliosidem GM1, imobilizovány a inkubovány s 1 pg/ml buď EtxB nebo EtxB(G33D) zředěným sériově (3—krát) z 1 pg/ml.
Obrázek 2
Receptorová vazba ExtB je podstatná pro jeho silnou imunogenicitu in vivo
BALB/c myši (4 v každé skupině) byly buď injektovány s.c. EtxB nebo EtxB(G33D) v PBS nebo jim byl protein podán orálně v uhličitanovém pufru. Sérum bylo analyzováno 10 dní po dvou s.c. injekcích (A) nebo 1 týden po 3 orálních dávkách (B) a střevní sekrece byla analyzována 1 týden po 3 orálních dávkách (C). U vzorků kontrolních myší (neznázoměno) nebyla pozorována žádná reakce. Výsledky jsou znázorněny jako střední titrace protilátky IgG v séru, zatímco IgA ve střevní sekreci je vyjádřen jako „specifický účinek“, který bude popsán níže.
Obrázek 3
Kinetika lymfocytové proliferace
Myši byly injektovány i.p. 30 pg EtxB(G33D) v kompletním Freundově adjuvans. 10 dní později byly izolovány mezenterické lymfatické uzliny (MLN - mesenteric lymph nodes) a buňky byly inkubovány v nepřítomnosti antigenů (prázdné čtverce) nebo v přítomnosti 80 pg/ml EtxB (plné trojúhelníky) nebo rozloženou monomemí formou EtxB (vyplněné kroužky) nebo EtxB(G33D) (prázdné kroužky), generovanou zahříváním na 95 °C. Posledních 6 hodin každého vzorkovacího
-8CZ 298670 B6 dne byly buňky opakovaně vystaveny na krátkou dobu působení lpCi (3H) Thd. Data představují střední cpm a SEM trojnásobných jamek.
Obrázek 4
EtxB způsobuje zvýšenou aktivaci B buněk.
Myši byly imunizovány pomocí EtxB(G33D) v kompletním Freundově adjuvans (CFA - complete Freunďs adjuvant). Po 10 dnech byly buňky izolovány z mezenterických lymfatických uzlin ío a inkubovány v přítomnosti 80 pg/ml jednoho z proteinů EtxB a EtxB(G33D) a nebo směsi 40 pg/ml obou proteinů. Buňky byly označeny biotinovanou protilátkou proti CD25 (7D4) a phycoerythrinem (PE) konjugovanou protilátkou proti B220 (Ra3-6D2). Jako sekundární protilátkový konjugát byl použit FITC označený streptavidin. Byly také použity kontroly na protilátky. Dvoupaprsková cytometrická analýza byla provedena v den 4 proliferace.
Obrázek 5
EtxB způsobuje zvýšenou aktivaci CD4+T buněk a odstranění CD8*T buněk.
Imunizační procedura, izolace buněk a in vitro působení jsou stejné jako bylo uvedeno při popisu obr. 4. K detekci CD25 byly použity biotinované protilátky proti CD25 (7D4) a FITC označený streptavidin. Pro detekci CD4 a CD8 byly použity FITC (fluorescin izothiokyanátem) označené protilátky proti CD4 (RNRM4-5) a FITC označené protilátky proti CD8a (53-6.7). Byly také použity odpovídající kontroly na protilátky (neznázoměny).
Obrázek 6
Selektivní odstranění OVA-responzivních CD8+ T buněk podjednotkou EtxB
Buněčné kultury z mezenterických lymfatických uzlin odebrané z OVA-senzibilizovaných myší byly ponechány po 5 dní v nepřítomnosti antigenu nebo v přítomnosti OVA+EtxB, OVA+EtxB(G33D) nebo samotného OVA (ovalbuminu) s 100 pg OVA a 40 pg/ml každého z EtxB a EtxB(G33D) nebo 100 pg samotného OVA. Buňky byly označeny následujícími krysími protilátkami: FITC označenými protilátkami proti CD4 nebo FITC označenými protilátkami proti CD8a a biotinovanými protilátkami proti CD25 (IL-2Ra), následovanými streptavidinem-phycoerythrinem. Neoznačené buňky nebo buňky označené jen samotnou druhou protilátkou byly používány pro kontrolu. Buňky byly analyzovány pomocí FACS (Becton Dickinson). Vyšší vzrůst podílu buněk, které jsou CD25+ v kulturách obsahujících EtxB ve srovnání s ostatními vzorky, je způsoben přítomností vyššího podílu B buněk, exprimujících tento markér (neznázoměno). Stupnice fluorescenční intenzity je logaritmická.
Obrázek 7
Receptor vázaný podjednotkou EtxB indukuje alterace vlastností lymfocytové jaderné morfologie buněk, které podstoupily apoptózu.
Buňky mezenterické lymfatické uzliny, obsahující více než 90 % CD3+ T buněk a zbavené makrofágů, byly inkubovány po 18 hodin s buď 80 pg/ml EtxB nebo s 80 pg/ml ExtB(G33D) a označeny akridinovou oranží. Buňky byly prozkoumány konvenční anebo konfokální fluorescenční mikroskopií (Leica TCS 4D). Je ukázáno reprezentativní mikroskopické pole (x540) pro každé ošetření (EtxB na levé straně, EtxB(G33D) na pravé straně). Buňky, které byly inkubovány za nepřítomnosti antigenu, dávaly obraz podobný obrazu buněk ošetřených EtxB(G33D) (neznázorněno).
-9CZ 298670 B6
Obrázek 8
Apoptóza CD8+ T buněk, zprostředkována EtxB receptory měřená analýzou buněčného cyklu.
Podíl CD4+ a CD8+ slezinných T buněk (SPLTC - splenic T cells) v sub-G0/Gi stadiu buněčného cyklu byl určen proudovou cytometrickou analýzou obsahu DNA, kterou předcházelo označení pomocí propidium jodidem. Slezinné T buňky byly izolovány ze sleziny negativní selekcí, jak bylo popsáno výše. Po 18 hodin bylo na buňky působeno: (a) žádným antigenem, (b) 80 pg/ml EtxB(G33D) nebo (c) 80 pg/ml EtxB a potom byly označeny pomocí FITC označené krysí proío tilátky proti CD4 nebo FITC označené krysí protilátky proti CD8a. Buňky byly potom označeny propidium jodidem. Množství buněk současně označených propidium jodidem bylo určeno počítáním buněk, označených buď protilátkami proti CD4 nebo protilátkami proti CD. Tento experiment byl prováděn na buňkách, jichž se také týkaly výsledky uvedené na obr. 7 a v tabulce 3.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Tento příklad ilustruje, že pro indukci diferenciálních efektů na lymfocytové populace je potřebná GM-1 vazba.
Materiál a metody
Vytvoření receptor-vážícího mutantu EtxB
Substituce Gly-33 aminokyselinou Asp byla provedena v receptorovém vazebném místě lidského EtxB s použitím plazmidu pTRH29, odvozeného od fagemidového vektoru pBluescript IIKS+, který obsahuje geny pro A- a B-podjednotky Etx (Yu, J., Webb, H. a Hirst, T. R. (1992), Molec. Microbiol. 6, 1949-1958). Mutageneze byla provedena pomocí in vitro oligonukleotidově řízené mutagenní soupravy (Amersham International), používajíce jednovláknový pTRH29 jako templát a syntetický oligonukleotid (5-TCTCTTTTATCTGCCATCG-3') (od Microanalytical Facility, IAPGR, Cambridge Research Station, UK) jako mutagenní primer. Správná substituce Gly ami35 nokyselinou Asp byla potvrzena dideoxy sekvenací použitím Sequenase II (United States Biochemical Corp.) a vzniklý plazmid byl označen pTHR56. Mutantní etxB gen z pTRH56 byl vystřižen použitím restrikčních enzymů EcoRl a Spěl a vložen do pMMB68 (Sandkvist, M., Hirst, T. R. a Bagdasarian, M (1987) J. Bacteriol. 169, 4570—4576), čímž vznikl expresní vektor s širokým hostitelským rozsahem pTRH64, exprimující EtxB(G33D).
Antigeny
EtxB a EtxB(G33D) přírodního typu byly puntíkovány z kultivačního supematantu Vibrio sp.60 (pMMB68) a Vibrio sp.60 (pTRH64) použitím modifikace metody, kterou popsal Amin a Hirst (Amin, T. a Hirst, T. R. (1994) Prot. Express, and Purif. 5, 198-204). Stručně řečeno byly proteiny puntíkovány diafiltrací a hydrofobní interakční chromatografií a koncentrovány chromatografií na aniontové výměny. Proteinový roztok byl odsolen na koloně PD10 (Pharmacia, UK) vyvážené fyziologickým roztokem, tlumeným fosfátem (PBS - phosphate buffered šalině, 10 mM fosforečnanu sodného a 150 mM NaCl, pH 7,4) a uchováván při teplotě -30 °C.
Čistota EtxB a EtxB(G33D) byla potvrzena SDS polyakrylamidovou gelovou elektroforézou. Molekulární hmotnost jednotlivých monomerů byla potvrzena laserovou desorpční hmotovou spektrometrií (Protein Science Facility, University of Kent).
-10CZ 298670 B6
Zjevné molekulové hmotnosti EtxB a EtxB(G33D) byly určeny gelovou filtrační chromatografii použitím systému SMART (Pharmacia). Proteiny byly vymývány z kolony Superdex 75 PC 3.2/30 v PBS, pH 7,5.
Irreverzibilní denaturace pentamerů podjednotek B pro použití v testu lymfocytové proliferace (viz níže) bylo dosaženo zahříváním proteinů na 95 °C po dobu 5 minut.
Zvířata, vzorkové soubory a imunizační protokoly ío BALB/c myši (H-2, vysoká odezva na EtxB) o stáří 7-12 týdnů byly zakoupeny od Charles River Laboratories a umístěny v laboratořích univerzity v Kentu. Protilátková odezva na EtxB a EtxB(G33D) byla měřena po s.c. injekci 30 pg proteinu v PBS myši, následované posilovači dávkou po 10 dnech. Další skupina myší dostala tutéž dávku proteinu orálně v uhličitanu sodném (50 pg/ml) ve třech dávkách a s jednotýdenními intervaly. Kontrolním myším byl podán PBS.
Krev byla odebrána 10 dní po poslední s.c. injekci nebo jeden týden po posledním orálním krmení. Střevní sekrety živých myší byly izolovány v roztoku proteázového inhibitoru výše popsaným způsobem (Elson, C. O., Ealding, W. a Lefkowitz, J. (1984) J. Immunol. Meth. 67, 101-108) jeden týden po posledním krmení. Vzorky potom byly sonikovány a vyčištěny centrifugací (13226 g, 10 minut při teplotě 4 °C).
Pro pokusy s proliferaci bylo myším injektováno i.p. 30 pg EtxB nebo EtxB(G33D) v kompletním Freundově adjuvans (CFA) a po 10 dnech byly izolovány mezenterické lymfatické uzliny. Byly použity kontrolní neimunizované myši a jejich lymfatické uzliny byly izolovány stejným způsobem.
Testy ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assays)
Vazba EtxB nebo EtxB(G33D) na GM1 byla zkoumána testem BM1-ELISA (Amin, T., Hirst, T. R. (1994) Prot. Express, and Purif. 5, 198-204).
Séra a střevní sekrety byly testovány na přítomnost protilátek IgG a IgA proti B podjednotce ELISA testem, ve kterém byly vzorky aplikovány na mikrotitrační desky (Immulon I, Dynateck, USA), pokryté 5 pg/ml EtxB nebo EtxB(G33D) v PBS. Protilátky IgA proti B podjednotce v supematantech střevních sekretů byly extrapolovány ze standardní křivky vytvořené zaplněním
2 řádků jamek na každé desce 1 pg/ml králičí protilátky proti myší IgA (a specifický řetězec,
Zymed Lab, USA) v PBS, následovaném přidáním 1 pg/ml myšího myelomového IgA (MOPC 315, Sigma, USA). Pro měření úplného IgA byly jamky zaplněny králičí protilátkou proti myší IgA, následovanou přidáním supematantů střevních sekretů. Všechny vzorky byly sériově zředěny. Konjugát kozí protilátky proti myší IgG (Fc fragmentově specifického, Jackson Lab., USA) nebo kozí protilátky proti myší IgA (řetězcově specifického, Sigma) a peroxidázy byl zředěn a přidán do jamek. Byl určen titr protilátky IgG proti B podjednotce, udávající A450nm > 0,2. Jako „IgA specifická aktivita“ byla vypočtena odezva IgA protilátky proti B podjednotce na EtxB a EtxB(G33D) v střevních sekretech (rovná střední IgA anti-B podjednotka (pg/ml) dělená celkové IgA (pg/ml)).
Pro měření cytokinových úrovní IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 a IFN-γ byla použita metoda ELISA, jak bylo popsáno výše (Harper, Η. M., PhD Thesis, Univerzita v Bristolu (1995)). Stručně řečeno byly mikrotitrační desky zaplněny krysími protilátkami proti myším IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 a IFN-γ. Desky byly imobilizovány 2 % (objemově) hovězího sérového albuminu. Supematant z kultivačního prostředí byl přidán do jamek a zřeďován. Jedna řada na každé desce pro každý cytokin obsahovala standardní množství rekombinantních cytokinů. Desky potom byly inkubovány s 0,5 pg/ml biotinované monoklonální protilátky proticytokinu a následovala adice avidinperoxidázy a 3,3',5,5'-tetramethylbenzidenového (TMB) substrátu a čtení Α450ηιη·
- 11 CZ 298670 B6
Test proliferace lymfocytů
Myši byly usmrceny zlomením vazu, asepticky byly vyjmuty mezenterické lymfatické uzliny a rozmělněny protlačením sítem z nerezové oceli do Hankova vyváženého solného roztoku (HBSS - Hank balanced salt solution) (Flow Laboratories, Irvine, Renfrewshire, UK). Po centrifugaci (500 g, 10 minut, 4 °C) byly buňky promyty v HBSS a resuspendovány v modifikovaném Eaglově médiu (Flow), do kterého bylo přidáno 20 mM Hepes (Flow), 100 jednotek penicilinu, 100pg/ml streptomycinu, 4 mM L-glutaminu (Flow) a 2-merkaptoethanolu (úplné médium). Čerstvé autologní normální myší sérum z neimunizovaných myší bylo přidáno do konečné konío centrace 0,5 % (objemově). Kultury obsahovaly 2 x 104 životaschopných buněk na ml buď v 2 ml objemu na destičce s 24 jamkami nebo v 8 ml objemu v 25 cm3 baňce (Nunc A/S, Roskide, Dánsko) a byly vytvořeny za přítomnosti nebo nepřítomnosti antigenů, jak bylo vysvětleno v popisu obrázků. Kultuiy byly inkubovány při teplotě 37 °C ve zvlhčené atmosféře obsahující 5 % oxidu uhličitého a 95 % vzduchu po dobu 6 dní. Ve stanovených časových bodech bylo z kultur ode15 bráno 0,1 ml vzorku a přeneseno na desky s 96 jamkami se dnem tvaru U (Nunc) a opakovaně na krátkou dobu vystaveno působení lpCi/jamka (3H)-Thd (Amersham, U.K.) po dobu 6 dní před odebráním (Mach III harvesting 96 Tomtec, Orange, Conn., USA) a počítáním pomocí standardní tekutinové scintilace (1450 Micro β plus, LKB-Wallac, Turku, Finsko). Podobně bylo vzorkováno 0,5 ml supematantu z kultur pro cytokinovou analýzu. Supematant byl uchováván při 20 68 °C až do analýzy.
Fenotypová analýza kultivovaných buněk
Kultivované buňky odebrané v den 4 kultivace byly promývány a životaschopné buňky byly po centrifůgaci při 500 g po 15 minut při 20 °C získány interferencí HBSS/18% metrizamidu (Nyegaard and Co., Oslo, Norsko) gradientu. Buňky byly dvakrát promývány a resuspendovány v HBSS, obsahujícím 0,2 % azidu sodného (Sigma) a 10 % normálního krysího séra. Byly použity následující krysí protilátky (Pharmingen, San Diego, USA): fluorescin izothiokyanátem (FITC) označené protilátky proti CD4 (RNRM4-5), FITC označené protilátky proti CD8 (5330 6.7), biotinem označené protilátky proti CD25 (7D4) a phycoerythrinem (PE) označené protilátky proti B220 (RA3-6D2). Navíc byl pro biotinem označené protilátky použit streptavidin-PE neb streptavidin-FITC (Serotech, UK). Všechny protilátky byly zředěny v HBSS, obsahujícím azid a použity v předem stanovených koncentracích. Bylo smícháno 200 μΐ 2 x 106 buněk a 200 μΐ každé z protilátek, které byly inkubovány na ledu po 30 minut. Kde byly požadovány sekundární protilátky se streptavidinem-PE nebo streptavidinem-FITX, byly buňky s těmito protilátkami inkubovány po dalších 30 minut. Byly také vloženy vhodné kontrolní vzorky pro FITC a PE protilátky. Buňky byly promývány HBSS a potom analyzovány dvoupaprskovou cytometrií.
Výsledky
Vytváření a charakterizace receptor vázajícího mutantu EtxB
Oligonukleotidově řízenou mutagenezí EtxB byla provedena substituce Gly aminokyselinou Asp do B podjednotky tepelně nestabilního enterotoxinu E. coli s cílem vytvořit mutant podjednotky
B, který je defektivní v rozpoznávání receptoru. Mutovaný protein, označený jako EtxB(G33D) a přírodní typ EtxB byly puntíkovány až do dosažení homogenity (viz Materiál a metody). Molekulová hmotnost purifikovaného EtxB a mutovaného EtxB(G33D) byly určeny laserovou desorpční hmotovou spektrometrií. Hmotnosti byly v rozmezí 20 Da od teoretických hmotností 11702 a 11760 Da pro monomerickou podjednotku EtxB, respektive EtxB(G33D). Při analýze pomocí SDS-PAGE chromatografie bez předchozího zahřívání jak přírodní EtxB, tak EtxB(G33D) migrovaly jako diskrétní stabilní oligomery se zdánlivou molekulovou hmotností 42 kDa a 56 kDa (obr. 1A, pás 1, respektive pás 2). Pozorovaná mobilita při elektroforéze a SDSstabilita EtxB je charakteristickou vlastností pentameru podjednotek B (viz Sandkvist, M., Hirst, T. R. a Bagdasarian, M (1987) J. Bacteriol. 169, 4570—4576). Pomalejší mobilita při elektrofo55 réze v případě oligomerického EtxB(G33D) nevychází z rozdílu v počtu konstituentů monomeru
- 12CZ 298670 B6 podjednotky B, neboť jak pentamerický EtxB, tak i EtxB(G33D) vykazují podobné retenční časy, pokud jsou analyzovány gelovou filtrační chromatografií s vysokou rozlišovací schopností. Diskrepance mezi mobilitou EtxB(G33D) oligomeru vzhledem k EtxB přírodního typuje tedy pravděpodobně způsobena zavedením negativně nabitého Asp rezidua, způsobujícího redukci vazby
SDS a následnou pomalejší migraci.
EtxB a EtxB(G33D) byly také porovnány vzhledem kjejich stabilitě vpufrech o nízkém pH, odolnosti k 1,0 mg/ml trypsinu nebo proteinázy Ka relativní reaktivitě vzhledem k souboru monoklonálních a polyklonálních protilátek proti B podjednotce. V každém z těchto testů io EtxB(G33D) vykazuje vlastnosti, které jsou identické vlastnostem EtxB přírodního typu. Z toho bylo vyvozeno, že záměna Gly aminokyselinou Asp v reziduu 33 v EtxB nemění oligomerickou konfiguraci, SDS, pH nebo proteázovou stabilitu nebo reaktivitu s protilátkami ve srovnání s EtxB přírodního typu.
Schopnost EtxB(G33D) vázat se kjeho receptoru GM1 byla určena pomocí GM1-ELISA testu (obr. 1C). Ten ukázal vysoce významné snížení schopnosti mutantu vázat GM1 ve srovnání s proteinem přírodního typu (> 99% snížení při odečítání A450nm)· Dále, na rozdíl od EtxB přírodního typu, EtxB(G33D) není schopen vázat CHO buňky, pokud je zkoumán pomocí imunofluorescence. Z toho vyplývá, že EtxB(G33D) je defektivní vzhledem kjeho schopnosti vázat GM1 gangliosid a to in vitro a in šitu.
Silná imunogenicita EtxB in vivo je závislá na vazbě receptoru
Důležitost receptorové vazby pro imunogenicitu EtxB byla určována na myši po buď orálním podání nebo s.c. injekci EtxB nebo EtxB(G33D) v PBS. Výsledkem orálního podání byla detekce vysokého titru protilátky IgG v séru a aktivity IgA protilátky v střevních sekretech (obr. 2). Na rozdíl od toho při podobném režimu orální imunizace EtxB(G33D) nedošlo ke zjištění žádného zjistitelného protilátkového účinku. EtxB(G33D) indukoval sérovou protilátkovou odezvu na s.c. injekci, avšak odezva byla výrazně nižší ve srovnání s protilátkovou odezvou na EtxB přírodního typu s více než 160-násobným snížením vzhledem k střednímu protilátkovému titru, 1050 oproti 171 000. Z toho bylo vyvozeno, že receptorová vazba u EtxB je podstatná pro jeho silnou imunogenicitu in vivo.
Receptorová vazba neovlivňuje rozsah proliferace lymfocytů v přítomnosti EtxB nebo EtxB35 (G33D)
Byl zkoumán účinek EtxB nebo EtxB(G33D) na lymfocytovou proliferaci in vitro. Lymfocyty byly izolovány z myších podkolenních a mezenterických lymfatických uzlin (MLN) imunizovaných buď EtxB nebo EtxB(G33D) a byly stimulovány oběma proteiny nebo tepelně denaturova40 nými přípravky z EtxB nebo EtxB(G33D). Proliferační odezva lymfocytů odvozená z podkolenních nebo mezenterických lymfatických uzlin byla podobná. V obou případech rostla proliferace u každého proteinového přípravku s koncentrací podjednotek B. Reprezentativní soubor dat z pokusů užívajících mezenterické lymfatické uzliny je ukázán v tabulce 1. Řádová velikost odezvy na pentamer přírodního typu a jeho mutant byla srovnatelná a totéž platilo i pro pří45 tomnost tepelně denaturovaného monomeru přírodního typu nebo jeho mutantu. Obr. 3 ukazuje kinetiku proliferační odezvy, získanou v přítomnosti 80 pg/ml každého z proteinových přípravků. Reaktivita byla závislá na přítomnosti antigenu a chovala se obdobně v přítomnosti každého z proteinů. Reaktivita byla zjevná v den 3 kultivace s použitím [3H]-Thd, dosáhla vrcholu v den 4 a později odeznívala. Malé rozdíly v časování vrcholu odezvy nebyly pozorovány v opakovaných pokusech, což ukazovalo, že anamnestické charakteristiky odezvy na EtxB a EtxB(G33D) byly srovnatelné. Z toho bylo vyvozeno, že úroveň stimulace v přítomnosti přirozených proteinů není pravděpodobně ovlivňována receptorovou vazbou nebo vloženou mutací.
Receptorová vazba toxinu způsobuje imunomodulaci podsouborů B buněk a T buněk
- 13CZ 298670 B6
Pro prozkoumání, zda receptorová vazba EtxB vykazuje nějaký účinek na populace lymfoidních buněk in vitro byly lymfocyty izolovány z myších mezenterických lymfatických uzlin senzibil izovaných i.p. pomocí EtxB(G33D) a potom stimulovány buď pomocí EtxB nebo EtxB(G33D) obou. Dodatečně byl prováděn souběžný experiment s použitím lymfocytů z mezenterických lymfatických uzlin myši, která obdržela injekci EtxB a výsledky byly v zásadě identické s výsledky získanými u myší senzibilizovaných EtxB(G33D).
(i) EtxB způsobuje zvýšenou aktivaci B buněk
Účinek EtxB na B buňky byl zkoumán na základě exprese aktivačního markéru CD25 (IL-2Ra) v asociaci s B-buněčným markérem B220 (CD45R). Jak je ukázáno na obr. 4, počet B buněk v kulturách stimulovaných EtxB byl 62,9 % všech buněk, z nichž velká část (28,4 %) exprimovala buněčný aktivační markér CD25. Na rozdíl od toho podíl B buněk po stimulaci v přítomnosti EtxB(G33D) byl menší než jedna polovina poměru, který byl určen pro přírodní typ (22,6 %) a méně buněk bylo aktivováno (5,6 %). Aby se ověřilo, zda účinek EtxB byl dominantní, buňky byly inkubovány v přítomnosti ekvimolámí koncentrace EtxB a EtxB(G33D). Paprsková cytometrická data byla podobná datům, získaným po stimulaci samotným EtxB (60,6 % B buněk, z toho 26 % aktivovaných). Z toho bylo vyvozeno, že receptorová vazba EtxB zprostředkuje zvýšenou aktivaci B buněk in vitro.
(ii) EtxB způsobuje zvýšenou aktivaci CD4+ T buněk a úplné odstranění CD8+ T buněk
Pro určení vlivu receptorové vazby podjednotky B na T buňky byly lymfocyty označeny protilátkami na CD4 nebo na CD8 v asociaci s protilátkami na CD25 (obr. 5). Dodatečně byly některé buňky odděleně označeny protilátkami na CD3 markér (neznázoměno). Podíl T buněk exprimujících CD4 markér v případě jejich stimulace v přítomnosti EtxB byl 36,7 % a velká část z nich byla aktivována (32,7 %). Na rozdíl od toho nebyly v kultuře EtxB přítomny žádné detekovatelné CD8+ T buňky.
Pro srovnání, jak CD4+ T buňky, tak CD8+ T buňky byly přítomny v kultuře, stimulované v přítomnosti EtxB(G33D). Takové kultury obsahovaly velký podíl CD4+ T buněk (66,6 %), ale jen 12 % z nich bylo aktivováno. Podíl CD8+ T buněk zjištěných v přítomnosti EtxB(G33D) by 11,7 % celkového množství buněk, ale jen velmi malá část z nich byla aktivována, což ukazovala absence CD25 markéru. Navíc byl podíl odpovídajících buněk v přítomnosti směsi, sestávající z ekvimolámí koncentrace EtxB a EtxB(G33D) podobný podílu, získaného za přítomnosti samotného EtxB přírodního typu s 41,68 % CD4+ T buněk (z nichž 28,6 % bylo CD25+) a žádné detekovatelné CD8+ T buňky (obr. 5). Ve všech těchto analýzách byl podíl buněk, označených CD3 přibližně roven součtu těch, které exprimovaly markéry CD4 a CD8. Tato data ukazují, že vzrůst aktivace B buněk a CD4+ T buněk a selektivní odstranění CD8+ T buněk je zprostředkován receptorovou vazbou toxinu.
Produkce cytokinů
Aby se určilo, zda účinek EtxB na lymfocytové populace může záviset na změně v produkci cytokinů, byly buněčné kultury inkubovány s buď EtxB nebo EtxB(G33D) a ve dnech 2, 3, 4, 5 a 6 byly pro analýzu odebrány supematanty. Výsledky, získané ze vzorků ze dne 5, kdy byla detekována maximální koncentrace cytokinů, jsou ukázány v tabulce 2. Jak IFN-γ, tak IL-2 byly detekovány v supematantech z kultur, stimulovaných v přítomnosti EtxB nebo EtxB(G33D), ačkoliv relativní úrovně těchto cytokinů byly proměnné. Médium z buněk inkubovaných s přírod50 ním typem EtxB obsahovalo třikrát větší koncentraci IL-2 a 1,5 krát větší koncentraci IFN-γ ve srovnání se supematantem z kultur stimulovaných v přítomnosti IFN-γ. I přesto, že další proliferační kultury T buněk odpovídajících na další antigeny dávaly vysoké úrovně IL-4, IL-5 a IL10, žádný z těchto cytokinů nebyl zjištěn v kulturách, stimulovaných EtxB nebo EtxB(G33D). Vzrůst úrovně IL-2 a pokles úrovně IFN-γ následující po stimulaci EtxB ve srovnání s EtxB55 (G33D) s největší pravděpodobností odráží aktivovaný stav B buněk a CD4+ T buněk. Nicméně
-14CZ 298670 B6 výsledky ukazují, že hluboký účinek EtxB přírodního typu na populace CD8+ T buněk pravděpodobně není zprostředkován velkou změnou v profilu cytokinů v závislosti na vazbě receptorů.
Diskuse
Uvedená zkoumání ukazují, že vložení jednoho bodu mutace (G33D) v místě receptorové vazby EtxB způsobilo významný pokles schopnosti vázat GM1. Je důležité, že mutant EtxB(G33D) vykazoval shodné fyzikálně-chemické vlastnosti s přírodním typem EtxB co se týče konformace, jak bylo prokázáno gelovou chromatografií, stabilitou v SDS, kyselinách a proteázách. Když byly měřeny specifické odezvy na protilátky po imunizaci buď EtxB nebo EtxB(G33D), byly zjištěny dramatické rozdíly. Subkutánní injekce EtxB(G33D) myši měla za následek velmi významný pokles titru protilátek ve srovnání s přírodním typem (zhruba > 160krát), zatímco po orálním podání nebyla zaznamenána žádná odezva na protilátky. Je možné, že tyto rozdíly pocházejí z přerušení dominantního epitopu, který vystupuje buď při rozpoznávání molekuly protilátkou, nebo stimulace účinných T buněk pomáhá produkci protilátek. Nicméně stojí za povšimnutí, že náhrada Gly aminokyselinou Asp nemá žádný účinek na rozpoznávání podjednotky B souborem specifických polyklonálních a monoklonálních protilátek. Dále, proliferativní odezvy, získané pokud byly do kultury přidány EtxB nebo EtxB(G33D), byly srovnatelné bez ohledu na to, který protein byl použit pro stimulaci in vivo·, to dokazuje, že reaktivita buněk T nebyla specifická vzhledem k některé molekule. Z toho bylo vyvozeno, že vazba receptoru proteinem EtxB je podstatná pro jeho silnou imunogenicitu in vivo.
Důležitost vazby receptoru pro silnou imunogenicitu EtxB může být vysvětlena řadou způsobů. Za prvé, vazba podjednotky B proteinu Etx nebo Ctx k GM1 může zvýšit účinnost zachytávání těchto proteinů, což zvýší lokální proteinovou koncentraci, která je dostupná imunitnímu systému. O dalších třídách proteinů, které jsou schopny vázat mukózní povrchy, bylo zjištěno, že jsou imunogenně účinné (De Aizpura, H. J. a Russell-Jones, G. J. (1988) J. Exp. Med. 167, 440451). Pozorované rozdíly v imunogenicitě EtxB a jeho mutantu po orálním podání mohou vskutku být způsobeny účinným zachytáváním EtxB ve střevě. Nicméně dramatické rozdíly, které byly pozorovány po parenterální imunizaci (kdy antigen je podáván lokálně ve vysoké koncentraci) naznačují jiné efekty. Vazba EtxB na GM1 může například ovlivnit účinnost působení buněk, předkládajících antigen. Taková vazba může způsobit aktivaci buněk nesoucích proteiny II. třídy, konkrétně vzhledem k jejich expresi podstatných ko-stimulujících molekul, jako B7, což se vztahuje k jejich účinku získat zvýšenou antigen prezentující aktivitu (Jenkins, Μ. K. a
Johnson, J. G. (1993) Curr. Opin. Immunol. 5, 361-367). Alternativně může vazba receptoru mít přímý účinek na sub-populace lymfocytů. Rada pozorování z této studie podává silnou podporu tohoto názoru.
Studie in vitro dokazují, že EtxB byla schopna indukovat proliferaci senzibilizovaných buněk lymfatických uzlin. Tato vlastnost nebyla závislá na vazbě receptoru, neboť odezvy s podobnými anamnestickými charakteristikami byly získány s použitím EtxB, EtxB(G33D) nebo tepelně denaturovaných forem těchto proteinů, které nejsou schopny vázat GM1. Tato pozorování byla zajímavá sama o sobě, neboť bylo široce oznamováno, že komerční přípravky Ctx a CtxB nebo purifikovaného rekombinantního CtxB jsou silnými inhibitory proliferace lymfocytů in vitro.
Zjevná diskrepance mohla povstat ze skutečnosti, že předchozí experimenty byly prováděny na purifikovaných lymfocytech a v široké míře používaly mitogenem stimulované lymfocytové kultury (které nemají klonově omezené odezvy), kde mohl být obsažen jiný mechanismus. S tím bylo v konzistenci naše pozorování, že proliferace Con A-stimulovaných lymfocytů bylo vskutku inhibováno pomocí EtxB. Na druhé straně však analýzy buněčných populací v kulturách senzibi50 lizovaných buněk lymfatických uzlin stimulovaných buď EtxB nebo EtxB(G33D) odhalily důležité rozdíly vzhledem k B buňkám, stejně tak jako T buňkám nesoucím CD4 a CD8.
B buňky byly detekovány po 4 dnech kultivace v přítomnosti buď EtxB nebo EtxB(G33D). Nicméně srovnáním s EtxB(G33D) se ukázalo, že relativní poměr B buněk přítomných v kultuře s EtxB byl zvýšen o přibližně 100 %. Tento vzrůst byl svázán s expresí CD25 ve velmi vysokém
- 15CZ 298670 B6 podílu B buněk. V ukázaných experimentech byly reagující lymfocyty senzibilizovány pomocí EtxB in vivo.
Podobné pokusy s buňkami z EtxB imunizovaných myší odhalily srovnatelné výsledky. Tak tedy bez ohledu na libovolné in vivo účinky, spojené s vazbou receptoru, kultury v přítomnosti EtxB obsahovaly větší podíl B buněk ve srovnání s kulturami stimulovanými EtxB(G33D). Ukázalo se také, že tyto účinky na B buňky nejsou závislé, alespoň částečně, na regulaci T buňkami in vitro, neboť výsledky neukazují velký posun v profilu detekovaných cytokinů. Proto se in vitro vazba receptoru pomocí EtxB zdá být spojena s přímým účinkem na B buňky, který vyústil v propor10 cionální expanzi těchto populací i jejich aktivace. Hodno povšimnutí je také, že bylo ukázáno, že CtxB zvyšuje expresi MHC třídy II na panenských B buňkách, což je vlastnost, která nebyla nalezena u GM1 vážícího mutantu CtxB(G33D) (Francis, M. L., Ryan, J., Jobling, M. G., Holmes, R. K., Moss, J. a Mond, J. J. (1992) J. Immunol. 148, 1999-2005). Výsledky těchto experimentů naznačují přítomnost přímého mitogenního účinku EtxB na antigenově senzibilizované B buňky a ukazují, že takové efekty jsou zprostředkovány vazbou receptoru.
Kromě účinků EtxB na B buňky v kultuře ukázala cytometrická analýza, že tento toxoid způsobuje úplné odstranění jakékoliv detekovatelné CD8+ buňky. U tohoto efektu bylo také ukázáno, že závisí na vazbě receptoru, neboť u této populace T buněk nedošlo k odstranění v kulturách, obsahujících EtxB(G33D). Úplné odstranění CD8+ T buněk bylo pozorováno v kulturách, obsahujících EtxB u myší imunizovaných přírodním typem EtxB. Existují tři možné mechanismy, kterými může být takovýto účinek zprostředkován.
1) Je známo, že vazba Ctx nebo CtxB na GM1 u krysích buněk mezenterických lymfatických uzlin indukuje vytváření plaků a čepiček (Craig S. W. a Cuatrecasas P., (1975) Proč. Acad. Sci.
USA, Vol. 72, str. 3844-3848). Je možné, že v tomto procesu jsou EtxB-GMl komplexy a další molekuly, v to počítaje CD8, intemalizovány. Takový proces by zabránil cytometrické detekci těchto buněk s použitím CD8 jako markéru a může mít za následek jejich smrt v důsledku související ztráty povrchového TCR komplexu. I když to může vysvětlovat nepřítomnost CD8+ T buněk v kultuře, jiní autoři zjistili, že nedochází k žádné ztrátě TCR komplexu z povrchu lidské
Jarkat T buněčné linie, pokud byl použit CtxB (Imboden, J. B., Shoback, D. M., Pattison, G. a Stobo, J. D. (1986) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83, 5673-5677). Nepřítomnost efektů jako důsledek čepiček je podporován zjištěním, že CD3 a CD4 markéry nebyly ovlivněny.
2) Změnový mechanismus by zahrnoval efekty, vyvolávané cytokiny v kultuře. V této studii byly detekovány jak IL-2, tak IFN-γ. Výsledky však naznačují velký posun cytokinového profilu, který by mohl objasnit tak dramatické účinky na CD8+ T buňky.
3) Nepřítomnost CD8+ T buněk může vyplývat z aktivní indukce apoptózy. Smrt lymfocytů apoptózou může zahrnovat působení čepiček, jak je popsáno výše nebo může být zprostředkována v nepřítomnosti čepiček účinky na signální události v buňce. Aktivačně indukovaná programovaná smrt je závislá na Ca2+ a zahrnuje fosfatázy a kinázy. Bylo ukázáno, že vazba CtxB k lymfocytům inhibuje protein kinázovou C-dependentní proliferaci a indukuje výrazný vzrůst intracelulámího Ca2+, což je událost, která nebyla spojena se vzrůstem úrovně CAMP. Schopnost EtxB vyvolat odstranění CD8+ T buněk, ale ne odstranění CD4+ T buněk by mohla povstávat z diferenciálních účinků signálů spojených s CD4/CD8-TCR komplexem, vycházejících z křížové vazby GM1 na povrch těchto podsouborů lymfocytů. To by mohl být výsledek diferen45 ciální vazby toxoidu na membrány, jak bylo popsáno pro CtxB nebo alternativně díky diferenciálním signálním mechanismům v CD4+ a CD8+ T buňkách.
Za úplné nepřítomnosti detekovatelných CD8+ T buněk EtxB zvýšilo poměr CD4+ T buněk, které byly aktivovány, ve srovnání s receptor vázajícím mutantem. Podstatná potřeba CD4+ T buněk v odezvě na Ctx byla demonstrována in vivo. Důvod pro zvýšenou aktivaci tohoto podsouboru T buněk je však nejasný. Stojí za povšimnutí, že bylo ukázáno, že CtxB stimuluje DNA syntézu a buněčné dělení v netransformovaných myších 3T3 buňkách v klidovém stavu. Selektivní mitogenní efekt na CD4+ T buňky byl také nalezen v přítomnosti rostlinných lektinů, které váží Gal β— l-3-3GalNAc, což je táž komponenta, kterou EtxB váže vGMl. Nemůže být vyloučena mož-16CZ 298670 B6 nost, že EtxB zprostředkovává na vazbě GM1 závislý přímý účinek na CD4+ T buňky, který způsobuje jejich aktivaci. Nicméně je také možné, že zvýšená aktivace CD4+ T buněk v kulturách, obsahujících EtxB je následek popsaných změn v populacích B buněk a CD8+ T buněk. Je známo, že aktivace B buněk je spojena se zvýšením jejich schopnosti jako antigen prezentujících buněk pro CD4+ T buňky. Dále, CD8+ T buňky jsou obecně spojovány s regulační rolí v imunoreaktivitě jak in vivo, tak i in vitro. Jejich odstranění z proliferativních kultur T buněk je spojováno s prodloužením a zvýšenou úrovní dělení CD4+ T buněk.
V souhrnu může být silná imunogenicita EtxB in vivo, jak byla ukázána v této studii, výsledkem jeho schopnosti indukovat aktivaci B buněk, vycházející z účinků regulace růstu, následujících po vazbě na GM1. Aktivace CD4+ T a schopnost EtxB zvýšit produkci IL-2 v kultuře in vitro může poskytnout nutný signál pro další expanzi klonů B buněk. Odstranění CD8+ T buněk pomocí EtxB in vitro v této studii může také poskytnout jiný mechanismus imunoprotekce in vivo, která následuje po systemickém nebo orálním podání, obzvláště vzhledem k účasti těchto podsouborů buněk supresi imunitní odezvy a v orální toleranci. Z tohoto hlediska bylo ukázáno, že jak Ctx, tak Etx ruší orální toleranci k rozpustným proteinům a další studie užívají depleční účinek Ctx a Etx na intra-epiteliální lymfocyty ve střevu nebo v Peyerově plaku k vysvětlení tohoto mechanismu. Bylo ukázáno, že inhibiční účinek Ctx na CD8+ T buňky in vitro zabraňuje reakci štěp versus hostitel.
Závěrem lze konstatovat, že byla ukázána přítomnost silných imunomodulačních účinků EtxB na protilátkovou odezvu in vivo a na populace lymfocytů in vitro. Dále bylo ukázáno, že tyto účinky jsou zprostředkovány vazbou na receptor. Tyto poznatky se také vztahují k porozumění schopnosti Etx a Ctx působit jako silné adjuvans a jako potenciální proteinový nosič pro jiné antigeny a naznačují, že tyto vlastnosti jsou založeny na schopnosti toxoidů vázat gangliosidové receptory na povrchu lymfatických buněk.
Příklad 2
Tento příklad ilustruje, že účinky na CD8 buňky nezávisí na rozpoznávání antigenu ajsou zprostředkovány apoptózou.
Rekombinantní přípravky EtxB a EtxB(G33D) byly připraveny podle příkladu 1. Oba proteiny byly charakterizovány vzhledem kjejich vazbě na GM1, vazbě na soubor monoklonálních a polyklonálních protilátek a různým dalším fyzikálně chemickým vlastnostem. Ovalbumin (OVA) byl zakoupen od společnosti Sigma (Poole, UK). Mezenterické lymfatické uzliny (MLN) byly izolovány z BALB/c myší 8-10 týdnů starých (kmen s vysokou odezvou na EtxB [Nashar, T. O., a Hirst, T. R., 1995. Immunoregulatory role of H-2 and intra-H-2 alleles on antibody responses to recombinant preparations of B-subunits of Escherichia coli heat labile enterotoxin(rEtxB) and cholera toxin (rCtxB) (Imunoregulační role H-2 a intra-H-2 alel na protilátkové odezvy na rekombinantní přípravky podjednotek B tepelně nestabilního enterotoxinu Escherichia coli (rEtxB) a cholerového toxinu (rCtxB)). Vaccine 13:803]). Myším bylo i.p. injektováno 200 pg OVA (Sigma), emulzifikovaného v kompletním Freundově adjuvans (Sigma). Mezenterické lym45 fatické uzliny byly odstraněny 10 dní po injekci, rozmělněny protlačením sítem z nerezové oceli v HBSS (Flow, Irvine, UK). Získané buňky byly promývány v HBSS, centrifugovány (500 g, 10 minut, 4°C) a resuspendovány v modifikovaném Eaglově médiu (Flow), obsahujícím 20 mM HEPES, 100 jednotek penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu, 4 mM L-glutaminu a 5 x 10'5 M 2merkaptoethanolu (úplné médium), do kterého bylo přidáno 0,5 % (objemově) čerstvého auto50 logního myšího séra. Kultury, které obsahovaly 2 x 104 životaschopných buněk na ml v 2 ml objemu, na destičkách s 24 jamkami (Nunc, Roskide, Dánsko) byly vytvořeny v přítomnosti 100 pg/ml OVA (dialyzovány extenzivně v úplném médiu), buď samotné nebo s 40 pg/ml EtxB neo EtxB(G33D). Kultury byly inkubovány při teplotě 37 °C v atmosféře 5 % oxidu uhličitého a 95 % vzduchu po 5 dní. V požadovaný okamžik byly z kultur odebrány vzorky 0,1 ml a přene55 seny na destičky s 96 jamkami se dnem ve tvaru U (Nunc) a opakovaně na krátkou dobu vysta-17CZ 298670 B6 vény 1 pCi/jamka [3H] thymidinu (Amersham, UK) po 6 hodin před odebráním (Mach III harvesting 96; Tomtec, Orange, CT) a odečítány standardní tekutinovou scintilací (1450 Micro b plus; LKB-Walac, Turku, Finsko). Pro proudovou cytometrickou analýzu T buněk (Becton Dickinson, Erenbodegem-Aalst, Belgie) byly buňky označeny následujícími krysími protilátkami (PharMingen, Cambridge, UK): FITC označené protilátky proti CD4 (RNRM4-5) nebo FITC označené protilátky proti CD8oc (53-6.7) a biotinem označené protilátky proti CD25 (IL-2Rct) (7D4), následované streptavidinem-phycoerythrinem. Doplňkově byl pro biotinem označené protilátky označené FITC použit streptavidin. FACS analýza získaných buněk byly provedeny v den vrcholu proliferace (den 4), jak bylo určeno ze zabudovávání [3H] thymidinu.
Pro testy apoptózy byly z 8 až 10 týdnů starých BALB/c myší izolovány čerstvé buňky mezenterických lymfatických uzlin (MLNC) a slezinné T buňky. Buňky mezenterických lymfatických uzlin, obsahující více než 90 % CD3+ T buněk, jak bylo určeno proudovou cytometrickou analýzou, byly inkubovány po 2 hodiny v Petriho miskách (Costar, Cambridge, MA) v úplném médiu, obsahujícím 10 % FCS, při teplotě 37 °C v 5 % oxidu uhličitého a 95 % vzduchu, aby byly odstraněny adherentní buňky. Neadherentní frakce byly postupně odpipetovány, usazeny a před použitím dvakrát promývány v HBSS. Slezinné T buňky byly purifikovány negativní selekcí s použitím skleněných kuliček pokrytých normálním myším sérem následovaným králičí protilátkou proti myšímu γ-globulinu jak bylo popsáno (Wigzell, H. 1976. Specifická afinitní frakcio20 nace lymfocytů s použitím kolon skleněných nebo plastových kuliček. Scand. J. Immunol. 5:(suppl.5) 23.). Zvolená populace T buněk byla > 90 % CD3+, jak bylo určeno proudovou cytometrickou analýzou.
CD4+ T buňky a CD8+ T byly separovány následujícím způsobem: neadherentní buňky mezente25 rických lymfatických uzlin byly označeny krysími phycoerythrinovými protilátkami proti myší CD4 (4708-02) nebo FITC protilátkami proti myší CD8a (53-6.7) (PharMingen) a byly potom inkubovány s MACS koloidálními super-paramagnetickými mikrokuličkami, konjugovanými s kozími protilátkami proti krysímu IgG (H+L) F(ab')2 (PharMingen), postupujíce podle instrukcí výrobce. Ty byly aplikovány na mini-MACS kolonu (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach,
Německo), aby byly separovány jak pozitivně (>99 % čisté), tak negativně (> 90 % čisté) zvolené populace CD4 a CD8+ T buněk, jak bylo určeno cytometrickou analýzou.
Pro kvantifikaci apoptózy byly použity dvě metody:
i) označení DNA akridinovou oranží pro prozkoumání jaderné morfologie a ii) analýza buněčného cyklu následující po označení DNA propidium jodidem a buď protilátkami proti CD4 nebo protilátkami proti CD8.
Byly vytvořeny kultury 2 x 106/ml buněk mezenterických lymfatických uzlin, slezinných T buněk a frakcionovaných buněk mezenterických lymfatických uzlin v úplném médiu, obsahujících 10 %
FCS v nepřítomnosti nebo přítomnosti 80 pg/ml buď EtxB nebo EtxB(G33D) a zkoumány od 4 do 18 hodin. Po inkubaci byly buňky promývány HBSS a označeny 5 pg/ml akridinové oranže (Sigma). Thymocyty byly izolovány a ošetřeny za nepřítomnosti nebo v přítomnosti 10“7 M dexamethasonu a použity jako pozitivní kontrolní vzorek pro buňky podstupující apoptózu. Jaderné morfologické změny lymfocytů byly zkoumány konvenční nebo konfokální fluorescenční mikro45 skopií (Leica TCS 4D). Podíl CD4+ a CD8+ slezinných T buněk v sub-Go/G] stadiu buněčného cyklu byl určen proudovou cytometrickou analýzou DNA obsahu, provedenou po označení prepidium jodidem, jak bylo popsáno (O'Connor, P. M., Jackman, J., Jondle, D., Bhatia, K., Magrath,
I. a Kohn, K. W. 1993. Role of p53 tumor suppressor gene in cell cycle arrest and radiosensitivity of Burkitťs lymphoma cell lineš. Cancer Res. 53: 4776). Buňky izolované z 18 h kultur slezin50 ných T buněk inkubovaných samotné nebo v přítomnosti 40 pg/ml EtxB nebo EtxB(G33D) byly označeny FITC označenými krysími protilátkami proti CD4 nebo FITC označenými protilátkami proti CD8a. Označené buňky byly adjustovány na 1 x 106/ml ve studené HBSS, obsahující 20 mM HEPES a 0,5 mM EDTA a byly fixovány studeným ethanolem, přidávaným po kapkách.
-18CZ 298670 B6
Potom bylo přidáno 50 pg/ml propidium jodidu a 40 pg/ml ribonukleázy A (DNase free) a buňky byly inkubovány po 1 hodinu při pokojové teplotě. Relativní intenzita DNA označení propidium jodidem v CD4 a CD8+ T buňkách byla určena počítáním buněk.
V příkladu 1 pozorování, že CD8+ T buňky byly úplně odstraněny z kultury lymfatických buněk proliferujících v odezvě na EtxB, naznačovalo, že EtxB vykazuje polyklonální účinek na tento podsoubor T buněk. Aby se prozkoumalo, zdaje takový účinek závislý na aktivaci EtxB responzivních buněk, byly vytvořeny kultury z OVA-senzibilizovaných myší a stimulovány samotným OVA nebo OVA plus buď EtxB nebo mutantem EtxB(G33D). Podobné vrcholové úrovně proto liferace (den 4 kultury v každém případě) byly dosaženy v přítomnosti samotného OVA, OVA plus EtxB nebo OVA plus EtxB(G33D) (9734 ± 347, 12031 ± 135 respektive 9305 ± 290 c.p.m.). Nicméně došlo k dramatickému rozdílu v rozdělení podsouborů T buněk v těchto kulturách po 4 dnech (obr. 6). Všechny kultury obsahovaly CD4+ T buňky, ze kterých obdobné podíly koexprimovaly CD25. Na druhé straně CD8+ T buňky byly nezjistitelné v kulturách, inkubovaných s OVA plus EtxB, ale byly zjevně přítomné (i když neaktivované, jak bylo stanoveno expresí CD25) v kulturách s OVA plus EtxB(G33D) nebo samotným OVA. To dokládá, že EtxB indukuje odstranění CD8+ T buněk, odpovídajících na jiný antigen než EtxB. Navíc nepřítomnost takové odezvy u EtxB(G33D) indikuje, že odstranění je spouštěno následkem interakce toxoidu a receptoru. Bylo také zaznamenáno, že přítomnost EtxB přírodního typu způsobila významný vzrůst podílu B buněk ze kterých velké množství byly CD25+ (neznázoměny), jak bylo již dříve zjištěno u kultur, vykazujících odezvu na EtxB (příklad 1). Bylo proto vyvozeno, že obsazení receptoru EtxB má hluboký imunomodulační účinek na lymfocyty bez ohledu na jejich antigenovou specificitu.
Byla zkoumána možnost, že CD8+ T buňky podstupují apoptózu, pokud jsou kultivovány v přítomnosti EtxB. Buňky mezenterických mízních uzlin nebo purifikované slezinné T buňky z nesenzibilizovaných myší byly inkubovány s EtxB nebo EtxB(G33D) a byly zaznamenávány změny v jaderné morfologii buněk po označení akridinovou oranží po dobu od 4 do 18 hodin (tabulka 3 a obr. 7). Morfologické změny buněk byly charakterizovány v přítomnosti kondenzace chromatinu, která způsobovala lobulámí vzhled jader (obr. 7). Byly také pozorovány další vlastnosti buněk jako je tvoření puchýřků plazmové membrány a přítomnost apoptózních těles. Tyto morfologické změny nastaly přibližně u jedné třetiny každého buněčného přípravku, ošetřeného EtxB, zatímco v kulturách buněk s EtxB(G33D) nebo bez exogenního antigenů byl pozorován daleko menší výskyt (tabulka 3). Jelikož CD8+ T buňky tvořily 35-40 % buněk mezenterických mízních uzlin a přípravků slezinných T buněk, odstranění těchto buněk by mohlo vysvětlit pozorovanou apoptózu. Aby se zjistilo, zda tento případ skutečně nastal, byly populace purifikovaných CD8 a CD4+ T buněk kultivovány po 18 hodin v přítomnosti antigenů (tabulka 3). V negativně selektovaných populacích CD4+ T buněk (obsahujících > 90 % buněk nesoucích CD4) byly indukovány podobné podíly morfologických změn po ošetření buď EtxB, EtxB(G33D) nebo bez antigenů, což indikuje, že vazba EtxB na jeho receptor nespouští apoptózu tohoto podsouboru T buněk. Na rozdíl od toho více než 70 % negativně selektovaných CD8+ T buněk (>90 % čisté) vykazovalo morfologické změny, pokud byly kultivovány s EtxB přírodního typu, zatímco inkubace buď bez antigenů nebo s EtxB(G33D) způsobila změny jen u 11 až 19 % těchto buněčných populací. Dále, přítomnost malého množství kontaminujících buněk v použité purifikované popu45 láci (10 % v každém případě) nemůže vysvětlit pozorované efekty, neboť daleko více purifikované populace, obsahující více než 99 % CD8 nebo CD4+ T buněk (izolovaných pozitivní selekcí) vykazovaly odezvu na EtxB podobným způsobem (60 % bylo apoptických v přítomnosti EtxB ve srovnání s 7 % pro případ bez antigenů i pro případ ošetření s EtxB(G33D)) (tabulka 3). Apoptóza byla detekována u 40 % a 98 % thymocytů po 18 hodinách inkubace za nepřítomnosti, respektive v přítomnosti dexamethasonu.
Aby se prokázalo, že morfologické změny, pozorované v použitých kulturách byly konzistentní s indukcí apoptózy, byl vyhodnocen vznik subdiploidní DNA v kulturách slezinných T buněk, na které bylo po 18 hodin působeno EtxB. Buňky byly po současném označení propidium jodidem a buď protilátkami proti CD8 nebo protilátkami proti CD4 podrobeny cytometrické analýze
-19CZ 298670 B6 (obr. 8). Přibližně 48 % CD8+ T buněk z kultur, inkubovaných EtxB kleslo pod diploidní Go/Gi vrchol propidium jodidového označení, což naznačovalo, že podstupovaly apoptózu (O'Cinnor, P. M. a kol., viz výše). Malá část buněk, exprimujících CD4 v kulturách EtxB také vykazovala sub-Go/G] úrovně DNA (11 %, což může mít příčinu v smrti takto velkého podílu CD8+ T buněk). Na rozdíl od toho většina CD4 nebo CD8+ buněk, kultivovaných bez antigenu nebo v přítomnosti EtxB(G33D) byly v G0/Gi fázi buněčného cyklu, směně než 5 % vykazujícími apoptózu. Z toho bylo vyvozeno, že pozorované jaderné morfologické změny a přítomnost subGo/Gi úrovní DNA v podstatě části CD8+ T buněk ošetřených EtxB prokazuje selektivní apoptózu, spuštěnou choleře podobným enterotoxoidem. Neschopnost receptor vázajícího mutan10 tu, EtxB(G33D), indukovat podobné účinky dokazuje, že indukce apoptózy CD8+ T buněk je vázána na jeho schopnost vázat GM1 gangliosid.
Příklad 3
Skupiny 8 myších DBA/1 samců byly buď neošetřeny (skupina A) nebo jim bylo injektováno 100 pg hovězího kolagenu v CFA v den 0 intra-dermální (i.d.) injekcí do boku. Myši injektované kolagenem byly buď ponechány nechráněné (skupina B; pozitivní kontrola) nebo byly učiněny pokusy zabránit vývinu nemoci podáváním i.d. v místě, blízkém místu podání kolagenu: 100 pg
EtxB vIFA v den 0 (skupina C), 100 pg EtxB vIFA v den 14 (skupina D) nebo 100 pg EtxB(G33D) v IFA v den 0 (skupina E). Všechna zvířata, s výjimkou skupiny A, dostávala posilovači dávku kolagenu v IFA i.d. v den 21 a síla nemoci byla určena v den 45 měřením tloušťky kloubu zadní končetiny (experiment A) nebo měřením otoku prstů každé zadní končetiny (stupnice 0-3, kde 0 bylo normální a 3 představovalo maximální otok; experiment B).
Získané výsledky jsou podány na obr. 9a a 9b. Ty ukazují, že EtxB, ale nikoli EtxB(G33D), dramaticky chrání myši před vývinem kolagenem indukované artritidy.
Příklad 4a
Dva oddělené vzorky lidských souborů lymfocytů (získané od normálních lidských dárců krve) byly použity jako zdroj jednojademých buněk. Buňky byly izolovány na Ficollpaque a extenzivně promývány před kultivací v nepřítomnosti antigenu nebo s 80 pg/ml buď EtxB nebo EtxB(G33D), jak bylo ukázáno. Před kultivací populace buněk obsahovaly 24 % CD8+, 27 % CD4+, respektive 27 % CD8+ a 22,9 % CD4+ ve vzorku. Po kultivaci po dobu 18 hodin byl určen vzhled apoptických buněk ve vzorcích buněk, označených akridinovou oranží (jak bylo podrobně popsáno v příkladu 2). Získané výsledky jsou znázorněny na obr. 10, které ukazují, že EtxB, ale nikoli EtxB(G33D) indukuje apoptózu v populacích normálních lidských periferálních jednojademých krevních buněk.
Příklad 4b
Myší linie T buněk, CTLL-2, byly kultivovány do konfluence a potom byly buňky promývány, načež byly přesazeny v nepřítomnosti antigenu nebo s 80 pg/ml buď EtxB nebo EtxB(G33D), jak bylo ukázáno. Po 18 hodinách byly odebrány vzorky a podíl buněk vykazujících známky apoptózy byl určen použitím akridinové oranže (jak bylo detailně popsáno v příkladěu2). Získané výsledky jsou znázorněny na obr. 11. Ten ukazuje, že křížová vazba GM1 vede kapoptóze v části myších CTLL buněk.
-20CZ 298670 B6
Tabulka 1 - Lymfocytová proliferace v přítomnosti EtxB nebo EtxB(G33D)
| Dávka pg/ml | EtxB | EtxB(G33D) | EtxB* | EtxB(G33D): |
| 0 | 117.9 | 146.8 | 124.5 | 116.1 |
| 5 | (7,9) | (3,5) | (14,6) | (6,35) |
| 5 | 4928 (98,7) | 2860 (3,8) | 2424 (88,3) | 1431.5 (37,5) |
| 10 | 6978 (30,6) | 3681 (4,6) | 2518 (21,6) | 4231 (96,4) |
| ío 20 | 7084 (100) | 6912 (47,3) | 4394 (42,1) | 5075 (24,8) |
| 40 | 8844 (26) | 8586 (143,7) | 7431 (45,3) | 4368.5 (118,9) |
| 80 | 10 246 | 12 510 | 7986 | 7276 |
| 15 | (30,7) | (121,8) | (210,3) | (369,5) |
| 160 | 11 311 (247) | 13 525 (352,7) |
Myši byly injektovány i.p. 30 pg EtxB(G33D) v kompletním Freundově adjuvans (CFA). Po 10 20 dnech byly izolovány mezenterické lymfatické uzliny. Buňky byly izolovány a inkubovány po dny v přítomnosti EtxB, EtxB(G33D) nebo rozložených monomemích forem těchto proteinů (*), vytvořených zahříváním na 95 °C. Byla určena proliferace přidáváním 1 pCi (3H) dThd po posledních 6 hodin den 4. Data podávají střední cpm a SEM trojnásobných jamek. Buňky izolované z neimunizovaných myší daly <1500 cpm (dávka 160 pg/ml).
Tabulka 2 - Cytokinová analýza v přítomnosti EtxB nebo EtxB(G33D)
Protein IL-2 (pg/ml) IFN-γ (pg/ml)
EtxB 318 2700
EtxB(G33D) 67 4068
Myši byly injektovány EtxB(G33D) v CFA a po 10 dnech byly izolovány mezenterické lymfatické uzliny. Buňky byly inkubovány in vitro buď s EtxB nebo s EtxB(G33D) a vzorky super35 natantu byly analyzovány na obsah cytokinů v den 5 buněčné proliferace.
Tabulka 3 - komplexem EtxB-receptor zprostředkovaná apoptóza frakcionovaných lymfocytů
| Buňky | Doba (h) | Bez antigenů EtxB(G33D) | EtxB | |
| MLNC | 4 | 0’ (8) | 2 (0) | 1 (3) |
| 40 | 18 | 8 (10) | 5(18) | 29 (35) |
| SPLTC | 4 18 | 3 (7) 17 (5) | 2 (6) 16,5 (12) | 3(5) 31 (32) |
Negativní selekce
| CD4 | 18 | 5 (37) | 6 (31) | 9 (35) |
| 45 CD8 | 18 | 18 (11) | 19(15) | 76 (73) |
| Pozitivní selekce | ||||
| CD4 | 18 | 6 | 4 | 6 |
| CD8 | 18 | 7 | 7 | 60 |
Jaderné morfologické změny frakcionovaných CD4 a CD8+ T buněk po 4 hodinách nebo 18 hodinách inkubace v nepřítomnosti antigenu nebo s 80 pg/ml EtxB nebo EtxB(G33D) byly prozkoumány fluorescenční mikroskopií, která následovala po označení akridinovou oranží.
Úplné mezenterické lymfatické uzliny byly zbaveny adherentních buněk. SPLTC byly izolovány negativní selekcí na koloně skleněných kuliček pokrytých myším γ-globulinem a králičí protimyší sekundární protilátkou. Po označení krysími phycoetythrinovanými protilátkami proti myším CD4 nebo FITC označenými protilátkami proti myším CD8a byly získány frakcionované slezinné T buňky, které potom byly inkubovány s MACS koloidní super-paramagnetickými ío mikrokuličkami, konjugovanými s kozí protilátkou proti krysím IgG (H+L) F(ab')2. Ty potom byly separován použitím mini-MACS kolony, aby byly získány jako pozitivně (<99 % čisté), tak negativně (>90 % čisté) selektované frakce CD4 a CD8+ T buněk. Změny jaderné morfologie byly zkoumány od 4 do 18 hodin v náhodném vzorku 200 buněk na pokus, jak je popsáno na obr. 7. Maximální podíl apoptických buněk nastal po 18 hodinách. Data v závorkách, pokud jsou uvedena, podávají výsledky jiného odděleného pokusu. Data pro MLN a SPLTC představují souhrn ze čtyř pokusů.
* Podíl apoptických buněk
Claims (12)
- 25 1. Použití činidla pro výrobu léčiva pro prevenci a/nebo léčení autoimunní choroby nebo lidskéT lyfocytámí leukemie, kde:(i) činidlem je EtxB (tepelně labilní enterotoxin z E. coli, podjednotka B) a/nebo CtxB (cholerový toxin, podjednotka B), neobsahující podjednotku A, (ii) jestliže činidlo má být podáváno společně s antigenní determinantou, pak činidlo a antigenní30 determinanta nejsou spojeny tak, že tvoří jediné účinné činidlo.
- 2. Použití podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro prevenci a/nebo léčení autoimunní choroby.
- 3. Použití podle nároku 2 pro výrobu léčiva pro prevenci a/nebo léčení revmatoidní artritidy, 35 roztroušené sklerózy nebo diabetes.
- 4. Použití podle některého z předchozích nároků 1 až 3, kde činidlem je EtxB.
- 5. Použití podle některého z předchozích nároků 1 až 4, kde činidlo má být podáváno bez spo40 léčného podávání se samostatně reagujícím nebo zkříženě reagujícím antigenem.
- 6. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje činidlo pro použití k prevenci a/nebo léčení autoimunní choroby nebo lidské T lymfocytární leukemie, kde:(i) činidlem je EtxB (tepelně labilní enterotoxin z E. coli, podjednotka B) a/nebo CtxB (chole45 rový toxin, podjednotka B), neobsahující podjednotku A, (ii) jestliže činidlo má být podáváno společně s antigenní determinantou, pak činidlo a antigenní determinanta nejsou spojeny tak, že tvoří jediné účinné činidlo.
- 7. Farmaceutický prostředek podle nároku 6 k prevenci a/nebo léčení autoimunní choroby, 50 vyznačující se tím, že obsahuje činidlo, kde:(i) tímto činidlem je EtxB (tepelně labilní enterotoxin z£. coli, podjednotka B) a/nebo CtxB (cholerový toxin, podjednotka B), neobsahující podjednotku A,-22CZ 298670 B6 (ii) jestliže činidlo má být podáváno společně s antigenní determinantou, pak činidlo a antigenní determinanta nejsou spojeny tak, že tvoří jediné účinné činidlo.
- 8. Farmaceutický prostředek podle nároku 6 nebo 7 pro prevenci a/nebo léčení revmatoidní5 artritidy, roztroušené sklerózy nebo diabetes, vyznač u j í cí se tí m , že obsahuje činidlo, kde:(i) tímto činidlem je EtxB (tepelně labilní enterotoxin z E. coli, podjednotka B) a/nebo CtxB (cholerový toxín, podjednotka B), neobsahující podjednotku A, (ii) jestliže činidlo má být podáváno společně s antigenní determinantou, pak činidlo a antigenní ío determinanta nejsou spojeny tak, že tvoří jediné účinné činidlo.
- 9. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 6až 8, vyznačující se tím, že činidlem je EtxB.15
- 10. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 6 až 9, v y z n a č u j í c í se tím, že činidlo má být podáváno bez společného podávání se samostatně reagujícím nebo zkříženě reagujícím antigenem.
- 11. Kit, vy z n a č u j í c í se t í m , že obsahuje farmaceutický prostředek podle kteréhokoliv20 z předchozích nároků 6 až 9 a odděleně od něj farmaceutický prostředek obsahující antigenní determinantu reagující sama se sebou nebo zkříženě reagující antigenní determinantu.
- 12. Použití činidla pro výrobu léčiva pro prevenci a/nebo léčení odmítnutí implantátu nebo GVHD, kde:25 (i) činidlem je EtxB (tepelně labilní enterotoxin zE. coli, podjednotka B), neobsahující podjednotku A, (ii) jestliže činidlo má být podáváno společně s antigenní determinantou, pak činidlo a antigenní determinanta nejsou spojeny tak, že tvoří jediné účinné činidlo.30 13. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje činidlo pro použití pro prevenci a/nebo léčení odmítnutí implantátu nebo GVHD, kde (i) činidlem je EtxB (tepelně labilní enterotoxin z E. coli, podjednotka B), neobsahující podjednotku A, (ii) jestliže činidlo má být podáváno společně s antigenní determinantou, pak činidlo a antigenní35 determinanta nejsou spojeny tak, že tvoří jediné účinné činidlo.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9513733.7A GB9513733D0 (en) | 1995-07-05 | 1995-07-05 | Therapeutic agents |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ1298A3 CZ1298A3 (cs) | 1998-06-17 |
| CZ298670B6 true CZ298670B6 (cs) | 2007-12-19 |
Family
ID=10777189
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ0001298A CZ298670B6 (cs) | 1995-07-05 | 1996-07-05 | Použití cinidla pro výrobu léciva pro prevenci a/nebo lécení autoimunní choroby nebo lidské T lymfocytární leukemie nebo odmítnutí implantátu, farmaceutický prostredek a kit obsahující tento prostredek |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6287563B1 (cs) |
| EP (1) | EP0841939B1 (cs) |
| JP (1) | JP4024298B2 (cs) |
| KR (1) | KR100452000B1 (cs) |
| CN (1) | CN1313150C (cs) |
| AT (1) | ATE275968T1 (cs) |
| AU (1) | AU724516B2 (cs) |
| CA (1) | CA2225788C (cs) |
| CZ (1) | CZ298670B6 (cs) |
| DE (1) | DE69633393T2 (cs) |
| DK (1) | DK0841939T3 (cs) |
| ES (1) | ES2229276T3 (cs) |
| GB (1) | GB9513733D0 (cs) |
| HK (1) | HK1006496A1 (cs) |
| HU (1) | HU224248B1 (cs) |
| MX (1) | MX9800241A (cs) |
| NO (1) | NO319747B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ311762A (cs) |
| PL (1) | PL187266B1 (cs) |
| PT (1) | PT841939E (cs) |
| RU (1) | RU2203088C2 (cs) |
| SI (1) | SI0841939T1 (cs) |
| WO (1) | WO1997002045A1 (cs) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9326174D0 (en) * | 1993-12-22 | 1994-02-23 | Biocine Sclavo | Mucosal adjuvant |
| US20010036917A1 (en) | 1995-07-05 | 2001-11-01 | Williams Neil Andrew | Therapeutic agents |
| US7097845B2 (en) | 1997-04-23 | 2006-08-29 | Jacob Sten Petersen | Combinations of antigen and mucosal binding component for inducing specific immunological tolerance |
| GB9800487D0 (en) * | 1998-01-09 | 1998-03-04 | Oratol Limited | Therapies |
| GB9801871D0 (en) * | 1998-01-28 | 1998-03-25 | Univ Bristol | Therapies |
| EP1075274A2 (en) * | 1998-05-08 | 2001-02-14 | University Of Bristol | Immunomodulators for vaccines |
| US7914791B1 (en) * | 1998-05-08 | 2011-03-29 | Trident Pharmaceuticals, Inc. | Vaccine |
| US7041296B1 (en) | 1999-11-12 | 2006-05-09 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Methods of treating inflammatory bowel disease using cholera toxin B subunit |
| WO2001034175A2 (en) * | 1999-11-12 | 2001-05-17 | The Government Of The United States Of America, Asrepresented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services | Methods of treating inflammatory bowel disease using cholera toxin b subunit |
| CA2358061A1 (en) * | 2000-09-08 | 2002-03-08 | Stemcell Technologies Inc. | Novel antibody compositions for the negative selection of specific rat leukocyte subsets |
| GB0115382D0 (en) * | 2001-06-22 | 2001-08-15 | Univ Bristol | Mutant |
| US20050084967A1 (en) | 2002-06-28 | 2005-04-21 | Xcyte Therapies, Inc. | Compositions and methods for eliminating undesired subpopulations of T cells in patients with immunological defects related to autoimmunity and organ or hematopoietic stem cell transplantation |
| CA2899961C (en) * | 2013-02-14 | 2022-08-09 | Cornell University | Methods to protect against and treat multiple sclerosis |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5571787A (en) * | 1993-07-30 | 1996-11-05 | Myelos Corporation | Prosaposin as a neurotrophic factor |
| US5681571A (en) * | 1993-10-08 | 1997-10-28 | Duotol Ab | Immunological tolerance-inducing agent |
-
1995
- 1995-07-05 GB GBGB9513733.7A patent/GB9513733D0/en active Pending
-
1996
- 1996-07-05 WO PCT/GB1996/001614 patent/WO1997002045A1/en active IP Right Grant
- 1996-07-05 DK DK96922162T patent/DK0841939T3/da active
- 1996-07-05 JP JP50492797A patent/JP4024298B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-07-05 CN CNB961962585A patent/CN1313150C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-05 NZ NZ311762A patent/NZ311762A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-07-05 RU RU98101907/14A patent/RU2203088C2/ru active
- 1996-07-05 DE DE69633393T patent/DE69633393T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-05 PT PT96922162T patent/PT841939E/pt unknown
- 1996-07-05 EP EP96922162A patent/EP0841939B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-05 KR KR1019970709899A patent/KR100452000B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-07-05 ES ES96922162T patent/ES2229276T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-05 AU AU63142/96A patent/AU724516B2/en not_active Expired
- 1996-07-05 CA CA2225788A patent/CA2225788C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-05 AT AT96922162T patent/ATE275968T1/de active
- 1996-07-05 CZ CZ0001298A patent/CZ298670B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-07-05 SI SI9630697T patent/SI0841939T1/xx unknown
- 1996-07-05 HU HU9900147A patent/HU224248B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-07-05 PL PL96324424A patent/PL187266B1/pl unknown
-
1997
- 1997-12-29 US US08/999,458 patent/US6287563B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-01-02 NO NO19980005A patent/NO319747B1/no not_active IP Right Cessation
- 1998-01-07 MX MX9800241A patent/MX9800241A/es active IP Right Grant
- 1998-06-02 HK HK98104738A patent/HK1006496A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Shroff et al. | Commensal enteric bacteria engender a self-limiting humoral mucosal immune response while permanently colonizing the gut | |
| Douce et al. | Mucosal immunogenicity of genetically detoxified derivatives of heat labile toxin from Escherichia coli | |
| Doe | The intestinal immune system. | |
| Cebra et al. | The secretory IgA system of the gut | |
| AU2006235956B2 (en) | Methods and compositions for enhancing immune response and for the production of in vitro mabs | |
| US9518113B2 (en) | Monoclonal antibodies to interleukin 35 and methods of use thereof to inhibit regulatory T cell function | |
| CZ298670B6 (cs) | Použití cinidla pro výrobu léciva pro prevenci a/nebo lécení autoimunní choroby nebo lidské T lymfocytární leukemie nebo odmítnutí implantátu, farmaceutický prostredek a kit obsahující tento prostredek | |
| Ma et al. | Screening and identification of a chicken dendritic cell binding peptide by using a phage display library | |
| US20120003267A1 (en) | Therapeutic Agents | |
| Brams et al. | In vitro priming of human lymphocytes. II. Induction of antigen-specific IgG responses by repeated antigen stimulation | |
| Smith et al. | Induction by cells of immune responses to intestinal epithelial cell-associated components (ECAC): transfer with cultured murine mesenteric and popliteal/axillary lymph node cells | |
| Wu et al. | The secondary B cell lineage for phosphorylcholine is conserved in CBA/CaHN-xid/J mice | |
| Smith | An Investigation of Oral Tolerance and Priming in Vivo |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20150705 |