KR100452000B1 - 치료제와자가면역질환 - Google Patents
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Abstract
(i) 본 발명은 Ctx 또는 Etx, 또는 Ctx 및 Etx의 B 서브유니트외에, GM-1 결함 활성을 갖는 제제; 또는
(ii) GM-1 매개된 세포내 시그널링 작용에 영향을 미치나, GM1- 결합 활성은 없는 제제를 자가면역 질환의 치료 또는 예방용 제제로 사용하는 방법을 개시한다.
이들 제제는 인체 T 세포 백혈병의 치료, 이식 거부반응 또는 GVHD의 예방, 또는 포유류 검체를 백신 면역시키기 위한 백신 접종에 사용할 수 있다.
Description
챠알스 오. 엘손 등의 "Morphologic and Functional Alterations of Mucosal T Cells by Cholera Toxin and its B subunit"라는 표제의 글[The Journal of Immunology, 1995, 154: 1032-1040]에는 콜레라 독소(Ctx) 및 이 CtxB 서브유니트가 CD8+및 CD4+T 세포를 저해한다고 개시되어 있다.
또한, 비.양켈레비치 등의 "Prevention of Acute Graft-Versus-Host Disease by Treatment with a Novel Immuilosuppressant"라는 표제의 논문[The Journal of Immunology, 1995, 154:3611-3617]을 참고할 수 있다. 이 논문에는 골수 이식에 있어서 급성 이식편 대 숙주 질환(GVHD) 예방용 제제로서 CtxB를 개시하고 있다.
WO 95/10301호는 특정 관용원에 결합된 점막 결합 분자를 함유하는 면역학적 관용 유도제를 개시하고 있다.
본 명세서에 사용된 용어, "Ctx" 는 콜레라 독소를 의미하고 "CtxB"는 이 콜레라 독소의 B 서브유니트를 의미한다. 다른 문헌들에서, 이 용어들은 때로 각각 "CT" 또는 "Ct" 및 "CTB" 또는 "CtB"라고 표시되기도 한다. 본 명세서의 용어 "Etx"는 이.콜리의 비내열성 장관독을 의미하고, "EtxB"는 Etx의 B 서브유니트이다. 이 용어들은 다른 문헌에서 각각 "LT" 또는 "Lt" 및 "LTB" 또는 "LtB"라고 표시되기도 한다.
본 발명은 포유류, 특히 인간의 자가면역 질환 치료에 사용하기 위한 치료제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 인간 이식편 거부 반응 및 이식편 대 숙주 질환(GVHD)의 예방에 사용하기 위한 제제, 그리고 소위 "백신 캐리어"로서 T 세포 기원의 인간 백혈병 치료에 유용한 치료제에 관한 것이다.
도 1은 EtxB 및 EtxB의 변이 형태(EtxB(G33D))의 생리화학적 특성의 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 EtxB에 의한 수용체 결합이 생체 내에서 그 잠재 면역원성에 필수적임을 나타내는 도면이다.
도 3은 EtxB를 마우스에게 주사한 후, 림프구 증식의 동태를 나타내는 도면이다.
도 4는 EtxB가 B 세포의 증가된 활성화를 유발함을 나타내는 도면이다.
도 5는 EtxB가 CD4+T 세포의 증가된 활성화 및 CD8+세포의 고갈을 유발함을 나타내는 도면이다.
도 6은 EtxB에 의한 OVA-반응성 CD8+T 세포의 선택성 고갈을 나타내는 도면이다.
도 7은 EtxB에 의한 수용체 결합이 고사를 진행하는 세포의 림프구 핵 형태학 특성의 변경을 유도함을 나타내는 도면이다.
도 8은 세포 주기 분석에 의해 측정된 바와 같이 CD8+T 세포의 EtxB 수용체-매개성 고사를 나타내는 도면이다.
도 9a 및 9b는 EtxB에 의한 GM-1 결합이 동물 모델에서 콜라겐 유도된 관절염의 진행을 저해하는 것을 나타내기 위해 수행한 실험 결과를 도시하는 도면이다.
도 10은 EtxB(G33D)가 아니라 EtxB가 정상적인 인간 말초 혈액 단핵 세포군에서 고사를 유도하는 것을 예시하기 위해 수행한 실험 결과를 도시하는 도면이다.
도 11은 GM-1의 교차 결합이 쥐 CTLL 세포 일부에서 고사를 유도하는 것을 예시하는 실험의 결과는 나타내는 도면이다.
도면의 상세한 설명
도 1
EtxB 및 EtxB(G33D)의 생리 화학적 특성의 분석
(A) EtxB 및 EtxB(G33D)의 SDS-PAGE 분석: 각 단백질 5 ㎍은, 예비 가열을 수행하거나 수행하지 않고 β-머캅토에탄올의 존재하에 환원 조건에서 분석하였다. 1 레인: 야생형 EtxB, 가열하지 않음. 2레인: EtxB(G33D), 가열하지 않음. 3 레인: 야생형 EtxB, 95℃에서 가열함. 4 레인: EtxB(G33D), 95℃에서 가열함. 분자량 표준물(바이오라드)은 패널의 좌측에 제시되어 있다.
(B) 겔 여과 크로마토그래피에 의한 EtxB 및 EtxB(G33D)의 겉보기 분자량의 측정: 표준 곡선()은 상단으로부터 하단으로 소 혈청 알부민(66 kDa), 암탉 난 알부민(45 kDa), 소 적혈구 카르본산 탈수효소(29kDa) 및 말 심장 시토크롬 c(12.4 kDa)를 이용하여 작성했으며; EtxB 및 EtxB(G33D)는 각각 겉보기 분자량 36 kDa 및 38 kDa으로 용출되었다. Ve는 상기 단백질의 용출 용적이며, Vo는 상기 겔 여과 칼럼의 공극 용적이다.
(C) 강글리오사이드(ganglioside) GM1에 대한 EtxB 및 EtxB(G33D)의 길항 결합을 위한 ELISA: 평판은 GM1으로 피복하고, 차단하고, EtxB 또는 EtxB(G33D) 1 ㎍/㎖와 함께 항온 배양하고 1 ㎍/㎖로부터 연속적으로(3배) 희석하였다.
도 2
EtxB에 의한 수용체 결합은 생체 내에서 그 잠재 면역원성에 필수적이다.
BALB/c 마우스(각 그룹당 4마리)는 PBS 내의 EtxB 또는 EtxB(G33D)로 피하주사하거나 중탄산나트륨 완충액내의 상기 단백질을 경구 투여하였다. 2회 피하 주사하고 10일이 경과된 후(A) 또는 3회 경구 투여하고 1주일이 경과한후(B) 혈청을 분석하였으며, 장 분비물은 3회 경구 투여하고 1주일이 경과한 후(C) 분석하였다. 대조군 마우스로부터 취한 샘플에서는 반응이 검출되지 않았다(도시되지 않음). 결과는 혈청 내의 평균 IgG 항체 역가로 나타냈으며, 장 분비물내의 IgA는 후술하는 바와 같이 "특이적 활성"으로 나타냈다.
도 3
림프구 증식의 동태
마우스에게 완전 프로인트 보조제 중 EtxB(G33D) 30 ㎍을 복강내 주사하였다. MLN이 10일후 분리되었으며, 세포는 항원()의 부재 또는 80 ㎍/㎖의 EtxB(), EtxB(G33D)(△) 또는 95℃에서 가열하여 생성된 EtxB() 및 EtxB(G33D)()의 분리된 단량체 형태의 존재하에서 항온 배양하였다. 각 샘플 채취일의 최종 6 시간에 세포에게 (3H)Thd 1 μCi로 펄스를 가하였다. 데이타는 3개의 웰에서 측정한 평균 cpm 및 SEM으로 나타냈다.
도 4
EtxB는 B 세포의 증가된 활성화를 유발한다.
마우스는 CFA 중 EtxB(G33D)로 면역화하였다. 세포는 10일 후에 MLN으로부터 분리하고, EtxB 또는 EtxB(G33D) 80 ㎍/㎖ 또는 각각의 단백질 40 ㎍/㎖의 혼합물의 존재 하에서 항온배양하였다. 세포는 비오티닐화된 항-CD25(7D4) 및 피코에리트린(PE) 항-B220(Ra3-6D2)으로 표지하였다. 스트렙타비딘 FITC는 2차 항체 접합체로서 사용하였다. 또한, 항체에 대한 대조군도 포함시켰다(되시되지 않음). 이중 유동 세포계측법은 증식 4일째에 수행하였다.
도 5
EtxB는 CD4+T 세포의 증가된 활성화 및 CD8+T 세포의 고갈을 유발한다.
면역화 절차, 세포 분리 및 시험관내 항원 투여는 도 4의 설명부분에 기술된 바와 같다. CD25를 검출하기 위해, 비오티닐화된 항-CD25(7D4) 및 스트렙타비딘 FITC를 사용하였다. CD4 및 CD8을 검출하기 위해서, FITC 표지된 항-CD4(RNRM4-5) 및 FITC 표지된 항-CD8α(53-6.7)을 사용하였다. 상기 항체에 대한 적합한 대조군도 포함시켰다(도시되지 않음).
도 6
EtxB에 의한 OVA-반응성 CD8+T 세포의 선택적 고갈
OVA-초회항원 자극된 마우스로부터 유래한 MLN에서 취한 세포 배양물은 항원의 부재 또는 OVA + EtxB, OVA + EtxB(G33D) 또는 OVA만의 존재하에서 100 ㎍의 OVA와 40 ㎍/㎖의 EtxB 또는 EtxB(G33D)의 양, 또는 10 ㎍의 OVA 단독의 용량으로 5일에 걸쳐 얻었다. 세포는 다음 래트 항체로 표지하였다: FITC-항-CD4 또는 FITC-항-CD8α 및 비오틴-항-CD25(IL-2Rα)에 이은 스트렙타비딘-피코에리트린. 염색되지 않은 세포 또는 2차 항체만으로 염색된 세포도 대조군에 포함시켰다. 세포는 FACS(벡톤 디킨슨)로 분석하였다. 기타 처리와 비교하여 EtxB를 함유하는 배양물에있어서 CD25+인 전체 세포의 비율이 증가하는 것은 이러한 마커를 발현하는 B 세포의 높은 비율에 기인한다(도시되지 않음). 형광 광도의 스케일은 로그이다.
도 7
EtxB에 의한 수용체 결합은 고사를 진행하는 세포의 림프구 핵 형태 특성의 변경을 유도한다.
>90% CD3+T 세포를 포함하고, 대식 세포가 고갈된 MLNC는 EtxB 80 ㎍/㎖ 또는 EtxB(G33D) 80 ㎍/㎖과 함께 18 시간 동안 항온 배양하고, 아크리딘 오렌지로 염색하였다. 세포는 통상적인 또는 공초점의 형광 현미경(라이카 TCS 4D)으로 검사하였다. 각각의 처리에 대한 대표적인 현미경 시야(x540)가 도시되어 있다(EtxB, 좌측 패널; EtxB(G33D), 우측 패널). 항원 부재 하에서 배양된 세포는 EtxB(G33D)로 처리한 세포와 유사한 결과를 나타냈다(자료는 나타내지 않음).
도 8
세포 주기 분석에 의해 측정된, CD8+T 세포의 EtxB 수용체가 매개하는 고사
세포 주기의 서브 G0/G1기에서 CD4+및 CD8+SPLTC의 비율은 요오드화프로피듐을 이용하여 염색한 후에 DNA 함량의 유동 세포 측정법에 의해 측정하였다. SPLTC는 상기한 바와 같은 음성 선택에 의해 비장으로부터 분리하였다. 상기 세포는 (a) 항원 없이, (b) EtxB(G33D) 80 ㎍/㎖ 또는 (c) EtxB 80 ㎍/㎖로 18 시간 동안 처리한 후, FITC-래트 항-CD4 또는 FITC-래트 항-CD8α를 이용하여 염색하였다.상기 세포는 요오드화프로피듐으로 후속 염색하였다. 요오드화프로피듐으로 공동 염색된 세포의 비율은 항-CD4 또는 항-CD8 항체로 염색된 세포에 대해 게이팅(gating) 하므로써 측정하였다. 본 실험은 세포에 대해 수행하였으며, 그 결과는 도 7 및 표 3에 나타냈다.
본 발명의 모든 측면은, EtxB(이.콜리 비내열성 장관독의 순수한 B 서브유니트)가 포유류 세포의 표면에서 발견되는 GM1-강글리오사이드 수용체에 결합하고, 이러한 결합이 CD8+T 세포의 특이적인 고갈 및 이와 관련된 B 세포의 활성화를 비롯하여 림프구 개체수에 대한 특별한 효과(differential effect)를 유도한다는 발견에 근거를 두고 있다. 이러한 효과는, GM1 결합 활성이 결여된 변종 EtxB 단백질을 이용하는 경우에는 나타나지 않는다.
자가면역 질환
자가면역은 신체가 자가 항원에 대하여 면역 반응을 일으키는 기작을 나타내는데 사용되는 용어이다.
본 발명의 제1측면에 따르면, 자가면역 질환의 치료 또는 예방 제제로서 사용하기 위해서
(i) Ctx나 Etx, 또는 Ctx와 Etx의 B 서브유니트 이외의, GM-1 결합 활성을가진 제제; 또는
(ii) GM-1 결합 활성은 보유하지 않지만, GM-1 매개된 세포내 신호 전달 사건에 영향을 미치는 제제가 제공된다.
본 발명에 따른 제제는 CD8+T 세포에 있어서 고사의 유발, CD4+세포의 활성화 증가 및 B 세포의 다클론 활성화를 초래하는 림프구 개체수를 조절하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 사건은 면역 반응을 Th2와 연관된 시토킨의 유도 반응쪽으로 이동시킬 가능성이 있다. 이러한 자가 또는 교차 반응성 항원에 대한 반응은, 특정 자가면역 질환에 대한 방어를 매개하는 것으로 생각된다.
이러한 본 발명의 제1 측면에 대한 제1 양태에 있어서, 상기 제제는 진행중에 있는 자가면역 질환을 치료하는 방법에 사용된다. 이 양태에 있어서, 상기 제제는 자가 항원이나 교차 반응성 항원의 보조 투여와 함께 또는 보조 투여없이 환자에게 투여된다. 본 발명의 제1 측면의 본 양태에 따라 제제를 투여하면 자가-항원쪽으로의 면역 반응의 성질을 조절하여 질환 유발성 염증의 활성화가 일어나지 않도록 하며, 이에 따라 자가면역 질환이 예방된다.
본 발명의 제1 측면의 제2 양태에 있어서, 제제는 자가면역 질환에 대하여 포유류 검체를 "예방접종"하는 방법에 사용되며, 이 때 제제는 상기 질환과 관련된 자가 항원 결정인자 또는 교차 반응성 항원 결정인자(또는 상이한 자가 또는 교차 반응성 항원 결정인자의 조합물)와 함께 투여한다. 이러한 방법에서, 검체의 자가 항원이나 교차 반응성 항원에 대한 면역 반응은 병원이 활성화되지 않게 전환되고,따라서 자가 항원에 대한 미래의 자가면역 반응을 예방한다.
이러한 본 발명의 제1 측면에 있어서, 치료제 및 자가 또는 교차 반응성 항원 결정인자를 검체에게 보조 투여하거나 보조 투여할 수 있다. 이에 따라, 치료제와 항원 결정인자 각각의 투여 부위 및 시간은 필요한 면역계의 조절이 얻어지는 것으로 결정된다. 따라서, 치료제와 항원 결정인자는 동시에 동일한 부위로 투여할 수 있지만, 항원 결정인자와는 다른 시간과 다른 부위에 치료제를 투여하는 것이 유리할 수도 있다.
또한, 치료제와 항원 결정인자의 단일 용량이 만족스러울 수 있지만, 복수회 용량도 본 발명의 범위에 포함되는 것이다.
본 발명의 제1 측면의 제2 양태에 있어서, 치료제와 항원 결정인자는, 예컨대 공유 결합으로 결합시켜 단일 활성제를 형성할 수 있지만, 치료제와 항원 결정인자를 결합시키지 않고 별도 투여하는 것이 상이한 성분들을 분리 투여할 수 있어서 바람직하다.
본 발명의 이러한 측면에 따라 치료될 수 있는 구체적인 자가면역 질환은, 류마티스양 관절염, 다발성 경화증 및 당뇨병과 같이 세포 매개성 질환이 병리에 관련된 자가면역 질환이다.
또한, 본 발명의 제1 측면에 있어서, 자가면역 질환의 예방 제제로서 사용할 약제의 제조에 있어서 Ctx, Etx 또는 Ctx나 Etx의 B 서브유니트의 사용이 제공된다.
또한,
(i) GM-1 결합 활성을 보유한 제제; 또는
(ii) GM-1 결합 활성은 보유하지 않지만 GM-1 매개의 세포내 신호 전달사건에 영향을 미치는 제제,
및 이의 약학적 허용 담체 또는 희석제를 함유하는 인간 자가면역 질환 치료용 약학 조성물도 제공된다.
본 발명의 이 측면의 약학 조성물은, 예컨대 비강내 분무와 같은 점막 경로로 투여할 수 있도록 조제하거나 또는 비경구적으로, 예컨대 정맥내, 근육내 또는 피하 경로로 투여할 수 있도록 조성물을 주사용 형태로 조제할 수 있다.
이러한 약학 조성물은 적절한 자가 또는 교차 반응성 항원과 함께 조제할 수 있다. 대안으로, 각각의 치료제와 항원 결정인자를 위해 별도의 조성물을 함유하는 키트를 제공할 수도 있다.
이러한 측면의 본 발명에 사용할 수 있는 특정 치료제는 GM1 결합 활성을 보유하는 EtxB 및 CtxB 또는 이의 변종이다.
본 발명의 제1 측면에 사용하기 위한 제제는 본질적으로 비독성인 것이 바람직하지만, 이러한 유형의 중증 치료시에는 어느 정도의 독성은 관용될 수 있다.
이와 같은 본 발명의 제1 측면은, 포유류 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한 GM1 결합 활성을 가진 모든 제제의 사용을 포함할 뿐만 아니라, GM-1 매개의 세포내 신호 전달 사건에 영향을 미치고, 따라서 GM-1 결합제를 모방하는 제제의 사용을 포함한다.
따라서, 이러한 본 발명의 제1 측면은 인간 자가면역 질환의 치료에 있어서치료제로서의 EtxB 단백질의 사용에 한정되는 것은 아니다. 그러나, 이러한 치료에 EtxB 단백질(5개의 동일한 서브유니트들의 5량체임)의 사용은 본 발명의 바람직한 양태를 나타낸다. 또한 본 발명의 바람직한 양태는, 야생형 EtxB 외에도 GM-1 결합 활성을 가진 EtxB의 변종 뿐만 아니라 이와 등가의 다른 단백질, 예컨대 콜레라 독소 B 서브유니트(CtxB) 및 GM1 결합 활성을 가진 이것의 변종도 포함한다.
본 발명의 제1 측면에 따라 자가면역 질환 치료용 기타 치료제는 GM1과 결합하는 인간화된 단일클론 항체이다. 이러한 제제를 동정하고 제조하는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.
T-림프구 백혈병
본 발명의 제2 측면에 따르면, T 세포 기원의 인간 백혈병, 예컨대 CD8 T 세포 기원의 인간 백혈병의 치료에 사용하기 위해서
(i) Ctx나 Etx, 또는 Ctx와 Etx의 B 서브유니트 이외의, GM-1 결합 활성을 가진 제제; 또는
(ii) GM-1 결합 활성을 보유하지 않지만 GM-1 매개의 세포내 신호 전달사건에 영향을 미치는 제제가 제공된다.
본 발명의 제2 측면에 사용하기 위한 제제는 실질적으로 비독성인 것이 바람직하지만, 이러한 유형의 중증 요법에는 어느 정도의 독성은 관용될 수 있다.
또한, 본 발명의 제2 측면에 있어서, CD8 T 세포 기원의 인간 백혈병과 같은 T 세포 기원의 인간 백혈병 치료용 약제의 제조에 있어서 Ctx, Etx, 또는 Ctx와 Etx의 B 서브유니트의 사용도 제공된다.
또한,
(i) GM-1 결합 활성을 가진 제제; 또는
(ii) GM-1 결합 활성은 보유하지는 않지만 GM-1 매개의 세포내 신호 전달사건에 영향을 미치는 제제,
및 이의 약학적 허용 담체 또는 희석제를 함유하는 T 세포 기원의 인간 백혈병 치료용 약학 조성물도 제공된다.
본 발명의 이 측면의 약학 조성물은, 예컨대 비강내 분무와 같은 점막 경로로 투여할 수 있도록 조제하거나, 또는 비경구적으로, 예컨대 정맥내, 근육내 또는 피하 경로로 투여할 수 있도록 조성물을 주사용 형태로 조제할 수 있다.
이와 같은 본 발명의 제2 측면은 T 세포 기원의 인간 백혈병의 치료에 사용하기 위한 GM1 결합 활성을 가진 모든 제제의 사용을 포함할 뿐만 아니라, GM-1 매개의 세포내 신호 전달 시건에 영향을 미치고, 따라서 GM-1 결합제를 모방하는 제제의 사용을 포함한다.
따라서, 이러한 본 발명의 제2 측면은 인간 T 세포 백혈병의 치료에 있어서 치료제로서의 EtxB 단백질의 사용에 한정되는 것은 아니다. 그러나, 이러한 치료에 EtxB 단백질의 사용은 본 발명의 바람직한 양태를 나타낸다. 또한 본 발명의 바람직한 양태는, 야생형 EtxB 외에 GM-1 결합 활성을 가진 EtxB의 변종 뿐만 아니라 이와 등가의 다른 단백질, 예컨대 콜레라 독소 B 서브유니트(CtxB) 및 GM1 결합 활성을 가진 이것의 변종도 포함한다.
본 발명의 제2 측면에 따라서 이들 질환의 치료용인 기타 치료제는 GM1과 결합하는 인간화된 단일클론 항체이다. 이러한 제제를 동정하고 제조하는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.
이식편 거부 반응 및 GVHD
본 발명의 제3 측면에 따르면, 이식편 거부 반응 또는 GVHD의 예방/치료용 치료제로서 사용하기 위해서
(i) Ctx나 Etx, 또는 Ctx와 Etx의 B 서브유니트 이외의, GM-1 결합 활성을 가진 제제; 또는
(ii) GM-1 결합 활성을 보유하지는 않지만 GM-1 매개의 세포내 신호 전달시건에 영향을 미치는 제제가 제공된다.
또한, 본 발명의 제3 측면에 있어서, 이식편 거부 반응 또는 GVHD 예방용 약제의 제조에 있어서 Ctx, Etx 또는 Ctx나 Etx의 B 서브유니트의 사용이 제공된다.
본 발명의 이러한 측면의 바람직한 양태에 있어서, 기재된 치료제는 동종원성이나 이종원성의 고형 기관 이식편 거부 반응의 예방에 사용할 수 있다. 또한, 예컨대 골수 이식 과정동안 급성 이식편 대 숙주 질환(GVHD)의 예방에 사용할 수도 있다.
환자가 이식 전에 처치되는 본 발명의 이 측면의 양태들에 있어서, 치료제는 동종항원 또는 이종항원과 공동 투여될 수 있다. 또한, 환자가 이식 후에 처치되는 양태에서, 치료제는 항원의 보조 투여 없이 이용된다.
본 발명의 이러한 측면의 양태에 있어서, 치료제와 동종 항원 결정인자 또는 이종 항원 결정 인자를 검체에게 공동 투여하는 경우, 치료제와 항원 결정인자 각각의 투여 부위와 시간은 필요한 면역계의 조절이 얻어지도록 결정된다. 따라서, 치료제와 항원 결정인자는 동시에 동일한 부위로 투여할 수 있지만, 항원 결정인자와는 다른 시간과 다른 부위에 치료제를 투여하는 것이 유리할 수도 있다. 또한, 치료제와 항원 결정인자는, 예컨대 공유 결합으로 결합되어 단일 활성제를 형성할 수 있지만, 치료제와 항원 결정 인자를 결합시키지 않고 별도 투여하는 것이 상이한 성분들을 분리 투여할 수 있어 바람직하다.
또한, 치료제와 항원 결정인자의 단일 용량이 만족스러울 수 있지만, 다수회 용량도 본 발명의 범위에 포함된다.
상기 제제가 GVHD의 예방에 사용되는 본 발명의 이러한 측면에 있어서, 제제는 통상 이식하고자 하는 세포, 예컨대 골수 세포에 직접 투여할 수 있다.
제제는 실질적으로 비독성인 것이 바람직하지만, 이러한 유형의 중증 치료시에는 어느 정도의 독성은 관용될 수 있다.
또한,
(i) GM-1 결합 활성을 가진 제제; 또는
(ii) GM-1 결합 활성은 보유하지 않지만 GM-1 매개의 세포내 신호 전달사건에 영향을 미치는 제제,
및 이의 약학적 허용 담체 또는 희석제를 함유하는 이식편 거부 반응의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물도 제공된다.
본 발명의 이 측면의 약학 조성물은, 예컨대 비강내 분무와 같은 점막 경로로 투여할 수 있도록 조제하거나, 또는 비경구적으로, 예컨대 정맥내, 근육내 또는피하 경로로 투여할 수 있도록 주사용 형태로 조성물을 조제할 수 있다.
이러한 약학 조성물은 적절한 동종-또는 이종-항원 결정인자와 함께 조제될 수 있다. 또는, 각각의 치료제와 항원 결정인자에 대한 별도의 조성물을 함유하는 키트를 제공할 수도 있다.
이와 같은 본 발명의 제3 측면은 이식편 거부 반응이나 GVHD의 예방/치료에 사용하기 위한 GM1 결합 활성을 가진 모든 제제의 사용을 포함할 뿐만 아니라 GM-1 매개의 세포내 신호 전달 사건에 영향을 미치고, 따라서 GM-1 결합 제제를 모방하는 제제의 사용을 포함한다.
따라서, 이러한 본 발명의 제3 측면은 이식편 거부 반응의 치료에 있어서 치료제로서의 EtxB 단백질의 사용에 제한되는 것은 아니다. 그러나, 이러한 치료용 EtxB 단백질(5개의 동일한 서브유니트들의 5량체임)의 사용은 본 발명의 바람직한 양태를 나타내는 것이다. 또한 본 발명의 바람직한 양태는, 야생형 EtxB 외에도, GM-1 결합 활성을 가진 EtxB의 변종 뿐만 아니라 이와 등가의 다른 단백질, 예컨대 콜레라 독소 B 서브유니트(CtxB) 및 GM1 결합 활성을 가진 이것의 변종도 포함한다.
본 발명에 따른 이식편 거부 반응의 치료용 기타 치료제는 GM1과 결합하는 인간화된 단일클론 항체이다. 이러한 제제를 동정하고 제조하는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.
예방접종
CtxB와 EtxB는 소위 "백신 캐리어"로서 이미 제안된 바 있다. 이 효과의 근원은, 부분적으로 GM-1 수용체에 결합하여 림프구 개체수를 조절하는 EtxB의 능력에 있다(전술한 바와 같음)는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명의 제4 측면에 따라서, 포유류 검체의 예방 접종에 사용하기 위해서
(i) Ctx나 Etx, 또는 Ctx나 Etx의 B 서브유니트 이외의, GM-1 결합 활성을 가진 제제; 또는
(ii) GM-1 결합 활성을 보유하지 않지만 GM-1 매개의 세포내 신호 전달사건에 영향을 미치는 제제가 제공된다.
이 제제는 관련이 없는 이종 항원 결정인자와 함께 투여되는 경우 면역 반응을 조절할 수 있다. 이 제제를 비경구적으로 투여하는 경우, 이러한 면역조절은 특정한 목적 방향으로 "지향되는" 면역 반응에 의한 것이다. 이 제제를 소위 "점막 보조제"로서 관련이 없는 항원과 함께 점막으로 투여하는 경우에, 이 제제는 비관련 항원에 대한 점막의 면역 반응을 용이하게 할 수 있다. 이 항원과 제제는 별도 성분으로서 함께 투여하거나, 예컨대 공유 결합에 의해 함께 결합시킬 수 있다.
제제는 비독성인 것이 바람직하다. 또한, 제제를 위장 점막을 통해 점막 전달해야만 하는 경우에, 제제는 위장관을 통과하는 동안에도 안정성을 유지할 수 있어야 한다; 예컨대, 제제는 단백질 분해에 내성이 있고, 산 pH에도 안정해야 하며, 담즙의 세제 작용에도 내성이 있어야 한다.
또한,
(i) GM-1 결합 활성을 가진 제제; 또는
(ii) GM-1 결합 활성은 보유하지 않지만 GM-1 매개의 세포내 신호 전달사건에 영향을 미치는 제제, 및 이의 약학적 허용 담체 또는 희석제를 함유하는, 포유류 검체의 예방 접종에 사용하기 위한 약학 조성물도 제공된다.
본 발명의 이러한 측면의 약학 조성물은, 예컨대 비강내 분무와 같은 점막 경로로 전달할 수 있도록 조제하거나, 또는 비경구적으로, 예컨대 정맥내, 근육내 또는 피하 경로로 전달할 수 있도록 주사용 형태로 조성물을 조제할 수 있다.
이러한 약학 조성물은 적절한 항원 결정인자와 함께 조제할 수 있다. 또는, 각각의 치료제와 항원 결정인자에 대한 별도의 조성물을 함유하는 키트를 제공할 수도 있다.
이와 같은 본 발명의 제4 측면은 면역조절제로서 GM1 결합 활성을 가진 모든 제제의 사용을 포함할 뿐만 아니라, GM-1 매개의 세포내 신호 전달 사건에 영향을 미치고, 따라서 GM-1 결합 제제를 모방하는 제제의 사용을 포함한다.
따라서, 본 발명의 제4 측면은 면역조절제로서의 EtxB 단백질의 사용에만 제한되는 것은 아니다. 그러나, 이러한 방식의 EtxB 단백질(5개의 동일한 서브유니트들의 5량체임)의 사용은 본 발명의 일양태를 나타낸다. 또한 본 발명의 바람직한 양태는, 야생형 EtxB 외에도, GM-1 결합 활성을 가진 EtxB의 변종 뿐만 아니라 이와 등가의 다른 단백질, 예컨대 콜레라 독소 B 서브유니트(CtxB) 및 GM1 결합 활성을 가진 이것의 변종도 포함한다.
본 발명의 이 측면에 따른 면역조절제로서 사용하기 위한 기타 대체 치료제는 GM1와 결합하는 인간화된 단일클론 항체이다. 이러한 제제를 동정하고 제조하는방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.
본 발명의 치료제가 EtxB 서브유니트 또는 CtxB 서브유니트와 같은 단백질인 경우, 상기 본 발명의 모든 측면에 사용하기 위해서, 이들은 이 단백질을 만드는 특정 폴리펩티드 쇄(들)를 암호하는 유전자(들)를 적합한 벡터에 삽입한 다음, 이를 사용하여 적합한 숙주를 형질감염시키는 방법으로 제조할 수 있다. 예컨대, EtxB 어셈블 유래의 폴리펩티드 쇄를 암호하는 유전자를, 예컨대 플라스미드 pMMB68로 삽입한 다음, 이를 사용하여 비브리오종 60과 같은 숙주 세포를 형질 감염시킬 수 있다. 단백질은 공지된 방법으로 정제 및 분리한다. 활성 돌연변이 EtxB 단백질을 발현하는 돌연변이 유전자는, 야생형 유전자로부터 공지의 방법으로 생산할 수 있다.
전술한 바와 같이, 예컨대 특이적으로 고안된 인간화된 단일클론 항체와 같이 GM-1 결합 활성을 가진 제제는 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 전술한 바와 같이 고안 및 생산할 수 있다.
또한, 본 발명의 모든 측면에 있어서 GM1 결합 활성을 가진 제제는 GM1 수용체를 교차 결합시킬 수 있다. EtxB는 그 5량체 형태로 인하여 GM1 수용체에 교차 결합시킬 수 있는 하나의 제제이다.
본 발명은 첨부되는 도면과 하기 실시예를 참고로 하여 예시할 것이다.
실시예 1
본 실시예는 림프구 군에 대한 특별한 효과를 유도하는 GM-1 결합의 필요조건을 예시한다.
재료 및 방법
EtxB의 수용체 결합 변종의 생성
Gly-33의 Asp로의 치환을, Etx의 A- 및 B- 서브유니트에 관한 유전자를 함유하는 파지미드 벡터 피블루스크립트 IIKS+의 유도체인 플라스미드 pTRH29를 이용하여 인간 EtxB의 수용체 결합 부위 내로 도입하였다[참조: Yu, J., Webb, H. & Hirst, T.R., Molec. Microbiol. 6, 1949-1958 (1992)], 돌연변이 유발은 주형으로서 1본쇄 p7RH29와 돌연변이 유발 프라이머로서 합성 올리고뉴클레오티드(5'-TCTCTTTTATCTGCCATCG-3') (영국, 캠브리지 리서치 스테이션, IAPGR, 마이크로어낼리티칼 퍼실리티에서 입수가능)을 이용한 시험관내 올리고뉴클레오티드 지향성 돌연변이 유발 키트(아머샴 인터내쇼날)를 사용하여 수행하였다. 정확한 글리신의 아스파르트산으로의 치환은 시퀘나제 II(유나이티드 스테이츠 바이오케미칼 코오포레이숀)를 이용한 디데옥시 서열결정법으로 확인하였으며, 생성된 플라스미드는pTRH56으로 명명하였다. pTRH로부터 취한 변종 EtxB 유전자는 EcoRI 및 SpeI 제한 효소를 이용하여 절단하였으며, pMMB68[참조:Sandkvist, M., Hirst, T.R. & Bagdasarian, M. J. Bacteriol. 169, 4570-4576 (1987)]내로 삽입하여 EtxB(G33D)를 발현하는 광범위한 숙주 범위의 발현 벡터 pTRH64를 산출하였다.
항원
야생형 EtxB 및 EtxB(G33D)는 Amin과 Hirst에 의해 보고된 방법을 변형시킨 방법으로 각각 비브리오 종 60(pMMB64) 및 비브리오 종 60(pTRH64)의 배양 상청액으로부터 정제하였다[참조: Amin, T. 및 Hirst, T.R., Prot. Express, ana Purif. 5, 198-204 (1994)]. 개략적으로 설명하면, 단백질을 디아필트레이션(diafiltration) 및 소수성 상호작용 크로마토그래피로 정제하고, 음이온-교환 크로마토그래피로 농축하였다. 상기 단백질 용액은 인산염 완충 염수(PBS; 10 mM 인산 나트륨, 150 mM 염화나트륨, pH 7.4)로 평형처리된 PD10 칼럼(영국, 파마시아)에서 탈염하고, -30℃에서 보관하였다.
EtxB 및 EtxB(G33D)의 순도는 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 확인하였다. 개개의 단량체의 분자량은 레이져 탈착 질량 분석법으로 화인하였다(유니버시티 오브 켄트, 프로테인 사이언스 퍼실리티).
EtxB 및 EtxB(G33D)의 겉보기 분자량은 SMART 시스템(파마시아)을 이용하는 겔 여과 크로마토그래피로 측정하였다. 단백질은 PBS(pH 7.5)에서 수퍼덱스 75 PC3.2/30 칼럼으로부터 용출시켰다.
림프구 증식 분석(후술함)에 사용하기 위한 B 서브유니트 오량체의 비가역변성은 95℃에서 5분 동안 상기 단백질을 가열하므로써 달성하였다.
동물, 샘플 수집 및 면역화 프로토콜
7 내지 12 주의 BALB/c 마우스(H-2d; EtxB에 대한 높은 반응자)는 챨스 리버 레보러토리즈로부터 구입하였으며, 켄트 대학의 동물 보호소에 두었다. EtxB 또는 EtxB(G33D)에 대한 항체 반응은 PBS 내의 단백질 30 ㎍을 마우스에게 피하 주사하고, 10일 후에 추가 항원 자극한 후 측정하였다. 다른 마우스 그룹에서는, 중산탄나트륨 중 동일한 단백질 용량(50 ㎍/㎖)을 3회 1 주일 간격으로 경구 투여하였다. 대조군 마우스에게는 PBS를 투여하였다. 최종 피하 주사한 지 10일 후, 또는 최종 경구 급식한지 1주일 후 혈액을 수거하였다. 살아있는 마우스로부터 취한 위분비물은, 최종 급식한 지 1 주일 후에, 상기한[참조: Elson, C.O., Ealding, W. & Lefkowitz, J., J. Immunol. Meth. 67, 101-108(1984)] 바와 같이 프로테아제 저해제 용액 내에서 분리하였다. 이어서, 샘플을 초음파 처리하고, 원심분리하여(13,226 x g; 4℃에서 10분) 맑게하였다.
증식 분석을 위해, 마우스에게 완전 프로인트 보조제(CFA) 중 EtxB 또는 EtxB(G33D) 30 ㎍을 복강내 주사하고, 10일 후에 장간막 림프절을 분리하였다. 또한, 비면역화한 대조군 마우스도 포함시켰으며, 동일한 방식으로 그들의 림프절을 분리하였다.
효소 결합된 면역 흡착 분석(ELISA)
GM1에 대한 EtxB 또는 EtxB(G33D)의 결합은 GM1-ELISA에 의해 조사하였다[참조: Amin, T. & Hirst, T. R., Prot. Express and Purif 5, 198-204 (1994)].
혈청 및 장 분비물은, 샘플이 PBS 중 EtxB 또는 EtxB(G33D) 5 ㎍/㎖로 코팅된 미량역가 평판(미국, 다이나틱의 이뮬론 I)에 적용되는 ELISA에 의해 항-B 서브유니트 IgG 및 IgA 항체의 존재에 대해 조사하였다. 장 분비물 상청액 내의 항-B 서브유니트 IgA 항체는 각 평판상에 PBS 중 1 ㎍/㎖의 토끼 항-마우스 IgA(α 쇄 특이적, 자임드 랩)로 2열의 웰을 코팅한 후, 1 ㎍/㎖의 마우스 골수종 IgA(MOPC 315, 미국 시그마)를 첨가하여 형성한 표준 곡선으로부터 외삽하였다. 총 IgA를 측정하기 위해, 토끼 항-마우스 IgA로 웰을 피복한 후, 장 분비물 상청액을 첨가하였다. 모든 샘플은 연속적으로 희석하였다. 염소 항-마우스 IgG(Fc 단편 특이적; 미국 잭슨 랩) 또는 염소 항-마우스 IgA(쇄 특이적; 시그마) 퍼옥시다제 복합체는 희석하여, 모든 웰에 첨가하였다. 항-B 서브유니트 IgG 역가, A450nm≥0.2로 측정되었다. 장 분비물 중 EtxB 및 EtxB(G33D) 각각에 대한 IgA 항-B 서브유니트 반응은 "IgA 특이적 활성"으로 계산하였다[평균 IgA 항-B 서브유니트(㎍/㎖)/총 IgA(㎍/㎖)].
IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 및 IFN-의 시토킨 농도를 측정하는 ELISA법을, 전술한 바와 같이[참조: Harper, H. M., 브리스톨 대학 박사 논문 (1995)]사용하였다. 개략적으로, 미량역가 평판은 마우스 IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 및 IFN-에 대한 래트 항체로 코팅하였다. 2%(w/v) 소 혈정 알부민으로 평판을 블록시켰다. 배양 배지로부터 취한 상등액을 웰에 첨가하고, 희석하였다. 각 시토킨에 대한 각각의평판상의 1열은 표준량의 재조합 시토킨을 함유하였다. 이어서, 평판은 비오티닐화된 항-시토킨 단일클론 항체 0.5 ㎍/㎖와 함께 배양한 후, 아비딘-퍼옥시다제 및 3,3',5,5'-테트라메틸벤지덴(TMB) 기질을 첨가하고, A405nm에서 판독하였다.
림프구 증식 분석
마우스를 경부 탈구에 의해 희생시키고, 장간막 림프절을 무균적으로 적출하고, 스테인레스 강 메스를 이용하여 행크의 평형처리한 염 용액(HBSS)(영국 렌프루션 어빈의 플로우 레버러토리즈) 내로 잘게 썰어넣었다. 세포는 HBSS중에서 원심분리(500 x g, 4℃에서 10분)하여 세척하고, 20 mM Hepes(플로우), 100 IU 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 4 mM L-글루타민(플로우) 및 2-머캅토에탄올이 첨가된 개질된 이글 배지(완전 배지; 플로우)에 재현탁시켰다. 면역화되지 않은 마우스로부터 취한 새로운 자가이식성의 정상적인 마우스 혈청은 최종 농도 0.5%(부피/부피)로 첨가하였다. 배양물은 24웰 평판에서 2 ㎖ 부피 또는 25 cm3플라스크(덴마크 로스키드의 눈크 에이/에스)중 8 ㎖ 부피 내에 2 x 106생세포/㎖를 함유하였으며, 도면의 설명 부분에서 제시된 바와 같이 항원의 존재 및 부재 하에서 유지하였다. 배양물은 5% 이산화탄소 및 95% 공기로 이루어진 가습대기 내에서 37℃에서 6일 동안 항온 배양하였다. 바람직한 시점에서 샘플 0.1 ㎖를 상기 배양물로부터 제거하고, 96 웰의 U자형 바닥 평판(눈크)에 옮겼으며, 수거하기(미국 코네티컷 오렌지의 마크 III 수거 96 톰테크)전에 6 시간 동안 [3H]-Thd(영국 아머샴)의 1 μCi/웰로펄스를 가하였으며, 표준 액체 신틸레이션(핀란드 투르쿠 LKB-월락의 1450 마이크로 β 플러스)으로 계수하였다. 유사하게, 시토킨 분석을 위해 상청액 0.5 ㎖를 배양물로부터 샘플링하였다. 세포는 펠렛화하였으며, 상청액은 분석 시까지 -68℃에서 저장하였다.
배양된 세포의 표현형 분석
배양 4일째에 수거한 배양된 세포를 세척하고, 생세포는 20℃에서 500 ×g로 15분 동안 원심분리한 다음 HBS8/18% 메트리자미드(노르웨이, 오슬로의 나이에가르트 앤드 컴퍼니) 구배의 계면에서 회수하였다. 세포는 2회 세척하고, 0.2% 나트륨 아지드(시그마) 및 10% 정상 래트 혈청을 함유하는 HBSS 내에 재현탁시켰다. 하기 래트 항체(미국, 샌디에고, 파밍엔)를 사용하였다: 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 표지된 항-CD4(RNRM4-5) , FITC 표지된 항-CD8(53-6.7), 비오틴-표지된 항-CD25(7D4) 및 피코에리트린(PE) 표지된 항-B220(RA3-6D2). 또한, 비오틴-표지된 항체로는 스트렙타비딘-PE 또는 스트렙타비딘-FITC(영국 세로테크)를 사용하였다. 모든 항체는 아지드를 함유하는 HBSS 내에서 희석하였으며, 미리 결정된 농도로 사용하였다. 2 x 106세포 200 ㎕ 및 각각의 항체 200 ㎕를 혼합하고, 얼음 상에서 30분 동안 항온 배양하였다. 스트렙타비딘-PE 또는 FITC 2차 항체가 필요한 경우, 세포를 이들 항체와 함께 추가의 30분 동안 항온 배양하였다. 또한, FITC 및 PE 항체에 대한 대조군도 포함시켰다. 세포는 HBSS로 세척한 후, 2 유동 세포계측법(벡톤 디킨슨)으로 분석하였다.
결과
EtxB의 수용제 결합·변종의 생성 및 특성
Gly의 Asp로의 치환은 EtxB의 올리고뉴클레오티드-유도된 돌연변이 유발에 의해 비내열성 이. 콜리 엔테로톡신의 B 서브유니트 내로 도입하여 수용체 인식에 결함이 있는 변종 B 서브유니트를 생성하였다. EtxB(G33D)로 명명된 변종 단백질과 야생형 EtxB는 균질하게 레이저 탈착 질량 분석으로 정제하였다(참조: 재료 및 방법). 정제된 EtxB 및 EtxB(G33D)의 분자량은 레이저 탈착 질량 분석으로 측정하였다. 질량은 각각 단량체 EtxB 및 EtxB(G33D)에 대해 이론적인 질량 11702 및 1176O Da의 20 Da내에 있다. 예비 가열하지 않고 SDS-PAGE에 의해 분석하는 경우, 야생형 EtxB 및 EtxB(G33D)는 이산성의 안정한 올리고머로서 이동하였으며, 겉보기 분자량은 42 kDa 및 56 kDa이다(각각 도 1A의 1 레인 및 2 레인). EtxB의 관찰된 전기영동 이동성 및 SDS-안정성은 B 서브유니트 5량체의 특징적인 특성이다[참조: Sandkvist, M., Hirst, T.R. & Bagdasarian, M., J. Bacteriol. 169, 4570-4576 (1987)]. 올리고머 EtxB(G33D)의 더 느린 전기영동 이동성은 구성 B 서브유니트 단량체 수의 차이에 기인하는 것이 아닌데, 그 이유는 고 분리능 겔 여과 크로마토그래피에 의한 분석시 5량체성 EtxB 및 EtxB(G33D) 둘다 유사한 체류 시간을 나타내기 때문이다. 따라서, EtxB(G33D) 올리고머의 야생형 EtxB에 대한 전기영동 이동성은, SDS 결합의 감소 및 후속적인 더 느린 이동을 초래하는 음으로 하전된 Asp 잔기의 도입에 기인하는 것으로 생각된다.
또한 EtxB 및 EtxB(G33D)를 저 pH 완충액에서의 안정성, 트립신 또는 프로테인아제 K의 1.0 mg/㎖에 대한 내성 및 항-B 서브유니트 모노클로날 및 다클론 항체에 대한 상대적인 반응도를 비교하였다. 이들 각 시험에서 EtxB(G33D)는 야생형 EtxB와 동일한 특성을 나타내었다. 따라서, EtxB의 잔기 33에서 Gly의 Asp로의 치환은 야생형 EtxB와 비교하여 올리고머의 입체배치, SDS, pH 또는 프로테아제 안정성, 또는 항체 반응성을 변화시키지 않는다는 결론을 얻었다.
수용체 GM1에 결합하는 EtxB(G33D)의 능력은 GM1-ELISA를 사용하여 평가하였다(도 1C). 이는 야생형 단백질과 비교하여 GM1에 결합시키는 변종의 능력의 상당한 감소를 보여주었다(A450nm판독시 >99% 감소). 또한, 야생형 EtxB와 대조적으로 EtxB(G33D)는 면역형광법으로 검사하였을 때 CHO 세포에 결합하지 않았다. EtxB(G33D)는 시험관내 및 동일계에서 GM1 강글리오시드와 결합하는 능력에 결함을 갖고 있다는 결론을 얻었다.
생체내에서 EtxB의 잠재 면역원성은 수용체 결합 능력에 좌우된다.
EtxB의 면역원성에 있어서 수용체 결합의 중요성은 PBS중 EtxB 또는 EtxB(G33D)의 경구 전달 또는 피하 주사 후에 마우스에서 평가하였다. EtxB의 경구 전달로 혈청 중 고 IgG 항체 역가 및 장 분비물 IgA 항체 활성을 검출하였다(도 2). 대조적으로, EtxB(G33D)의 경구 면역화의 유사한 방법은 임의의 검출가능한 항체 활성을 발생시키지 못했다. EtxB(G33D)는 피하 주사후에 혈청 항체 반응을 유도하지만, 그 반응은 야생형 EtxB에 대한 항체 반응과 비교하여 상당히 낮다. 즉, 각각 1050 대 171000으로 평균 항체 역가가 >160배 감소된다. EtxB에 의한 수용체 결합은 생체 내에서 잠재 면역원성을 위해 필수적이라는 결론을 얻었다.
수용체 결합은 EtxB 또는 EtxB(G33D)의 존재하에 림프구 증식 범위에 영향을 주지 않는다.
시험관내 림프구 증식에 대한 EtxB 또는 EtxB(G33D)의 영향을 검사하였다. 림프구를 EtxB 또는 EtxB(G33D)로 면역화시킨 마우스의 슬와부 및 장간막 림프절(MLN)로부터 분리하고, 단백질이나 EtxB 또는 EtxB(G33D)의 열-변성된 제제로 시험관내에서 자극시켰다. 슬와부 또는 MLN으로부터 유도된 림프구의 증식 반응은 유사하였다. 각 경우에, 각 단백질 제제에 대한 증식은 B 서브유니트 농도의 증가에 따라 증가하였다. MLN을 사용한 실험으로부터 얻은 대표적인 데이터를 표 1에 제시한다. 야생형 및 변종 오량체에 대한 반응 크기는 열-변성화된 야생형 및 변종 단량체의 존재하에서의 크기와 비교할 만하다. 도 3은 각 단백질제제 80 ㎍/㎖의 존재하에 얻은 증식 반응의 동태를 보여준다. 반응도는 항원의 존재와 관련이 있으며, 각 단백질의 존재하에 유사한 패턴을 따른다. 반응도는 [3H]-Thd의 혼입으로 배양 3일째에 명확해졌으며, 4일째에 최대에 도달하였고, 그후 웨이닝(waining)했다. 도 3에서 분명한 피크 반응 타이밍의 미묘한 차이는 반복 실험에서는 관찰되지 않는데, 이는 EtxB 및 EtxB(G33D)에 대한 반응의 기왕 특성이 동등하다는 것을 보여준다. 천연 단백질의 존재하에 자극 정도는 수용체 결합 또는 도입된 돌연변이에 의해 영향을 받을 것 같지 않다는 결론을 얻었다.
독소 수용체 결합은 B 세포 및 T 세포 서브세트의 면역조정을 유발한다.
EtxB에 의한 수용체 결합이 시험관 내에서 림프계 세포군에 영향을 나타내는지 여부를 시험하기 위해서, EtxB(G33D)를 사용하여 복강내로 초회 항원 자극한 마우스의 MLN으로부터 림프구를 분리한 후, EtxB 또는 EtxB(G33D) 또는 이들의 혼합물을 사용하여 자극시켰다. 추가적으로, EtxB를 주사한 마우스로부터 MLN-유도된 림프구를 사용한 평행 실험을 진행하여, EtxB(G33D) 초회 항원 자극한 마우스로부터 얻은 것과 실질적으로 동일한 결과를 얻었다.
(i) EtxB는 B세포의 증가된 활성을 유발한다
B 세포에 대한 EtxB의 효과는 B세포 마커 B220(CD45R)과 활성화 마커 CD25(IL-2Rα)를 발현시켜 검사하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, EtxB로 자극된 배양물의 B세포 수는 총 세포의 62.9% 였으며, 이중 높은 비율(28.4%)이 세포 활성화 마커 CD25를 발현하였다. 대조적으로, EtxB(G33D)의 존재하에서 자극한 후의 B세포의 비율은 야생형의 것에 비해 1/2 미만(22.26%)이었으며, 보다 작은 비율만이 활성화되었다(5.6%). EtxB에 의해서 나타나는 효과가 우성인지의 여부를 결정하기 위해서, 동물 농도의 EtxB 및 EtxB(G33D)의 존재하에 세포를 항온 배양시켰다. 유동 세포 계측 데이타는 야생형 EtxB 단독의 존재하에 자극시킨 후 얻은 것과 유사하였다(B세포 60.6%, 이중 26%가 활성화됨). EtxB의 수용체 결합 특성은 시험관내에서 B세포의 증가된 활성을 매개한다는 결론을 얻었다.
(ii) EtxB는 CD4+T 세포의 증가된 활성화 및 CD8+T 세포의 완전고갈을 유발한다.
T세포에 대한 B 서브유니트 수용체 결합의 영향을 조사하기 위해서, CD25에 대한 항체와 CD4 또는 CD8에 대한 항체로 림프구를 표지하였다(도 5). 추가적으로, 일부 세포를 CD3 마커에 대한 항체로 별도로 표지하였다(도시되지 않음). EtxB의 존재하에 자극된 경우 CD4마커를 발현하는 세포의 비율은 36.7%였으며, 이중 고 비율(32.7%)이 활성화되었다. 대조적으로, 검출가능한 CD8+T 세포는 EtxB 함유 배양물에 존재하지 않았다.
비교하면, CD4+및 CD8+T 세포는 EtxB(G33D)의 존재하에 자극된 배양물에 존재하였다. 상기 배양물은 높은 비율의 CD4+T 세포를 함유하였으나(66.6%), 이중 12% 만이 활성화되었다. EtxB(G33D)의 존재하에 검출되는 CD8+T 세포의 비율은 총 세포수의 11.7%였으나, 이중 활성화되는 것은 거의 없으며, 이는 CD25 마커의 부재로 알 수 있다. 또한, EtxB 및 EtxB(G33D)의 동물 농도로 구성된 혼합물의 존재하에, 반응하는 세포의 패턴은 야생형 EtxB 단독의 존재하의 세포 패턴과 유사하였다; CD+T 세포가 41.68%이고 (이중 28.6%는 CD25+였음), 검출가능한 CD8+T 세포는 없음(도 5). 모든 분석에서, CD3로 염색한 세포의 비율은 CD4 및 CD8 마커를 발현시키는 것들의 합과 대략적으로 같다. 이들 데이타는 B세포 및 CD+T 세포의 활성화의 증가와 CD8+T 세포의 선택적 고갈이 독소 수용체 점유도(occupancy)에 의해 매개된다는 것을 입증한다.
시토킨의 생성
림프구 군에 대한 EtxB의 효과가 시토킨 생성의 변화에 의존하는지 여부를 평가하기 위해서, 세포 배양물을 EtxB 또는 EtxB(G33D)를 사용하여 항온배양하고, 분석을 위해서 상청액을 2, 3, 4, 5 및 6일째에 제거하였다. 시토킨의 최대 농도가 검출된 경우 5일째에 수거한 시료에서 얻은 결과는 표 2에 제시되어 있다. 시토킨의 상대적 농도는 다양하지만, IFN-및 IL-2는 모두 EtxB 또는 EtxB(G33D)의 존재하에 자극된 배양물의 상청액에서 검출되었다. 야생형 EtxB와 항온 배양한 세포의 배지는, EtxB(G33D)의 존재하에 자극된 배양물의 상청액과 비교하여 3배 높은 농도의 IL-2 및 1.5배 낮은 농도의 IFN-를 포함하였다. 기타 항원에 반응하는 기타 증식 T세포 배양물은 고농도의 IL-4, IL-5 및 IL-10을 산출할 수 있다는 발견에도 불구하고, 이들 시토킨은 EtxB 또는 EtxB(G33D)로 자극된 배양물에서는 검출되지 않았다. EtxB(G33D)와 비교하여, EtxB로 자극시킨 후에 IL-2의 농도 증가 및 IFN-의 농도 감소는 B 및 CD4+T 세포의 활성 상태를 가장 잘 반영한 것 같다. 그럼에도 불구하고, 이들 결과는 CD8+T 세포군에의 야생형 EtxB의 상당한 영향이 수용체 점유의 결과로서 시토킨 프로파일에 주요 이동에 의해서 매개될 것 같지 않다는 것을 보여준다.
토의
이들 조사는 EtxB의 수용체 결합 부위에 단일 점 변이(G33D)를 도입하면 GM1을 결합시키는 능력의 상당한 손실을 유발한다는 것을 보여준다. 변종 EtxB(G33D)는 겔 크로마토그래피, SDS, 산 및 프로테아제의 안정성에 의해 나타나는 바와 같이, 입체 배치에 대한 야생형 EtxB와 동일한 생리 화화적 특성을 나타낸다는 것은 중요하다. 특이적 항체 반응을 EtxB 또는 EtxB(G33D)로 면역화시킨 후에 측정하였을 때, 급격한 차이를 나타내었다. 마우스에서 EtxB(G33D)를 사용한 피하 주사는 야생형과 비교하여 항체 역가의 상당한 감소(약 >160 배)를 나타내는 항체 반응은 경구 투여 후에 검출되지 않았다. 이들 차이는 항체에 의한 분자의 인식, 또는 항체 생성을 위해 효과적인 T 세포 보조 자극에 관한 우성 에피토프의 파괴로부터 유도할 수 있다. 그러나, Gly의 Asp로의 치환은 특이적 다클론 및 모노클로날 항체의 패널에 의한 B 서브유니트의 인식에 영향을 주지 않는다는 것은 주목할 만하다. 추가로, EtxB 또는 EtxB(G33D)를 배양물에 첨가할 때 얻어지는 증식성 반응은, 생체내 초회 항원 자극으로 어떤 단백질을 사용하는지에 관계없이 비교할 만하다; 이는 T 세포 반응성은 각 분자에 특이적이지 않다는 것을 보여준다. 그러므로 EtxB에 의한 수용체 결합은 생체내에서 잠재 면역원성을 위해 필수적이라는 결론을 얻었다.
EtxB의 잠재 면역원성에 있어서 수용체 결합의 중요성은 다양한 방법으로 설명할 수 있다. 우선, GM1에 대한 Etx 및 Ctx의 B 서브유니트 결합은 이들 단백질의 흡수 효율을 증가시킬 수 있으며, 면역계에 이용할 수 있는 국부 단백질 농도를 증가시킨다. 점막 표면에 결합할 수 있는 단백질의 기타 종류는 효과적인 면역원으로 알려져있다(De Aizpura, H.J. & Russell-Jones, G.J.(1988) J. Exp. Med. 167, 440-451). 경구 투여 후의 EtxB 및 이의 변종에서 관찰된 차이는 장 루멘으로부터 EtxB의 효과적인 흡수에 의한 것이다. 그러나, 비경구 면역화(항원을 고농도에서국부적으로 전달할 때)후에 급격한 차이는 기타 효과를 암시한다. 예를 들어, GM1에 대한 EtxB의 결합은 항원 제시 세포 활성의 효율에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 결합은, 특히 후천적으로 상승되는 항원 제시 활성에 관한 B7과 같은 실질적인 공자극 분자의 발현에 대하여, 클래스 II 보유 세포의 활성화를 일으킨다(Jenkins, M.K. & Johnson, J.G. (1993) Curr. Opin. Immunol., 5, 361-367(1993)). 대안적으로, 수용체 결합은 림프구 아군에 직접적인 영향을 줄 수 있다. 이 연구에서 얻은 다양한 관찰은, 이것이 실제로 그 경우임을 나타내는 강력한 증거를 제공한다.
시험관내 연구는 EtxB가 초회 항원 자극된 림프절 세포의 증식을 유발할 수 있다는 것을 보여주었다. 유사한 기왕 특성을 갖는 반응은 야생형 EtxB, EtxB(G33D) 또는 GMI에 결합할 수 없는 단백질의 열-변성된 단량체 형태를 사용하여 얻을 수 있기 때문에, 이 특성은 수용체 결합과 관계가 없었다. Ctx 및 CtxB의 시판용 제제 또는 정제된 재조합 CtxB는 시험관내에서 림프구 중식을 강력하게 억제한다고 널리 보고되어 있기 때문에, 이들 관찰은 그 자체가 흥미롭다. 종래의 실험은 정제된 림프구에서 수행되었고, 대개 미토겐 자극 림프구 배양물(클론에 의한 반응을 제한하지 않음)을 사용하였으며, 상이한 기작을 포함할 수 있다는 사실로부터 명백한 모순이 생길 수 있다. 이것은, Con A-자극된 림프구 증식이 EtxB에 의해서 실제로 저해된다는 관찰과 일치한다. 그러나, EtxB 또는 EtxB(G33D)로 자극시킨 초회 항원 자극된 림프절 세포의 배양물에서의 세포군 분석은 CD4 및 CD8-보유 T-세포 뿐만 아니라 B세포에 대해서도 중요한 차이점을 보여준다.
B 세포는 EtxB 또는 EtxB(G33D)의 존재하에 배양물 중에서 4일 후에 검출되었다. 그러나, EtxB(G33D)와 비교하여, EtxB에 의한 배양물에 존재하는 B세포의 상대적 비율은 약 100%로 증가하였다. 이러한 증가는 매우 높은 비율의 B 세포에서의 CD25의 발현과 관련이 있었다. 제시된 실험에서, 반응하는 림프구는 생체내에서 EtxB(G33D)로 초회 항원 자극되었다. EtxB로 면역화된 마우스 유래의 세포를 사용한 유사한 실험은 유사한 결과를 나타내었다. 따라서, 수용체 결합과 연관된 임의의 생체내 효과와 관련없이, EtxB의 존재하의 배양물은 EtxB(G33D)로 자극시킨 것과 비교하여 더 많은 비율의 B세포를 포함하였다. 이들 결과는 검출된 시토킨의 프로파일에 있어서 주요한 이동을 시사하지 않기때문에, B 세포에 대한 이들 영향은 또한 시험관내에서 T세포에 의한 조절에 적어도 부분적으로는 관련이 없는 것으로 보인다. 따라서, 시험관내에서 EtxB에 의한 수용체 결합은 B세포에의 직접적인 효과와 관련되어 있어, 군의 비례적인 팽창과 활성화를 초래한다. 또한 CtxB는 항원 자극을 받은 적이 없는 B 세포상에서 MHC 클래스 II의 발현의 증가를 나타내며, 이는 GM1 결합 변종 CtxB(G33E)에 의해 나타나지 않는 특성이다(Francis, M.L., Ryan, J., Jobling, M.G., Holmes R.K., Moss, J. & Mond J.J. (1992) J. Immunol. 148, 1999-2005). 상기 실험 결과는, 항원으로 초회 자극한 B세포에 있어서 EtxB에 의한 직접적인 분열 촉진 인자 효과의 존재를 제시하였으며, 상기 효과는 수용체 결합에 의해 매개된다는 것을 입증한다.
배양물에서 B세포에 대한 EtxB의 효과 이외에, 유동 세포 계측법으로부터 톡소이드가 임의의 검출가능한 CD8+세포의 완전 고갈을 유발시킨다는 것이 밝혀졌다.또한, T 세포군이 EtxB(G33D)를 함유하는 배양물에서 고갈되지 않기 때문에, 상기 효과는 수용체 결합에 의존하는 것으로 보여진다. 추가로, EtxB를 함유하는 배양물내의 CD8+세포의 완전한 고갈이, 야생형 EtxB로 면역화시킨 마우스로부터 관찰되었다. 이 효과가 매개되는 가능한 3가지 기작이 있다. 즉, 1) 래트 MLN 세포에서 GM1에 대한 Ctx 또는 CtxB의 결합은 패취(patch) 및 캡 형성을 유도한다는 것이 알려져 있다(Craig S.W. ana Cuatrecasas P., (1975)Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 72, p 3844-3848). 상기 방법에서 CD8을 비롯하여 EtxB-GM1 복합체 및 기타 분자를 내면화시키는 것이 가능하다. 그러한 과정은 CD8을 마커로서 사용하여 이들 세포의 유동 세포 계측에 의한 검출을 방지하고, 표면 TCR 복합체의 관련된 소실에 기인한 사멸을 일으킬 수 있다. 후자는 배양물에서 CD8+T 세포의 부재를 설명할 수 있지만, CtxB가 사용된 경우 인간 자켓(Jarkat) T 세포주의 표면으로부터 TCR 복합체의 소실이 없음을 발견하였다(Imboden, J.B., Shoback, D. M. Pattison, G. & Stobo, J.D. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5673-5677). 캡핑의 결과로서 효과의 부재는 CD3 및 CD4 마커가 영향을 받지 않는다는 발견에 의해 뒷받침된다. 2) 또 다른 기작은 배양물 중 시토킨에 의해 형성되는 효과를 포함한다. 이 연구에서, IL-2 및 IFN-모두 검출되었다. 그러나, 이 결과는 CD8+T 세포의 극적인 효과를 설명하는 시토킨 프로파일에 있어서 주요한 이동을 제시하지 않는다. 3) CD8+T 세포의 부재는 고사의 활성 유도에 기한 것일 수 있다. 고사에 의한 림프구의 사멸은전술한 바와 같은 캡핑을 포함할 수 있으며, 또는 세포내의 신호 전달에 대한 효과에 의해 캡핑의 부재하에 매개될 수 있다. 활성화에 의해 유도된 계획형 사멸은 Ca2+에 의존하여, 포스파타아제 및 키나아제를 포함한다. 림프구에의 CtxB의 결합은 단백질 키나아제 C-의존성 증식을 저해함을 나타내고 세포내 Ca2+의 현저한 증가를 유도하는데, 이 사건은 CAMP 농도의 증가와는 관련이 없다. CD4+T 세포는 아니지만 CD8+T 세포를 고갈시키는 EtxB의 능력은, 림프구의 서브세트 표면에 GM1을 가교시켜서 생긴 CD4/CD8-TCR 복합체와 관련된 신호의 특별한 효과에 의한 것일 수 있다. 이는 CtxB로 보고된 막에 톡소이드의 특별한 결합 또는 CD4+및 CD8+T 세포에 있어서 특별한 신호 전달 기작의 결과일 수 있다.
검출가능한 CD8+T 세포의 완전한 부재하에, EtxB는, 수용체 결합 변종과 비교하여, 활성화된 CD4+T의 비율을 증가시켰다. Ctx에 반응하는 CD4+T 세포에 대한 필수 조건은 생체내에서 입증하였다. 그러나, T 세포 서브세트의 증가된 활성의 원인은 불분명하다. CtxB는 정지상태의 비-형질전환된 마우스 373 세포의 세포 분열 및 DNA 합성을 자극하는 것으로 밝혀졌음은 주목할 만하다. 또한 CD4+T 세포에서 선택적인 분열 촉진 인자의 효과는, EtxB가 GM1에 있어서 결합하는 동일한 성분인 Galβ-1-3-3 GalNAc에 결합하는 식물 렉틴의 존재하에 발견되었다. EtxB가 CD4+T세포에서 GM1-결합 의존성의 직접적인 효과를 매개하여 활성을 유발할 가능성을 배제할 수 없다. 그러나, EtxB 함유 배양물에서 CD4+T 세포의 증가된 활성화는, 상기한 바와 같이 B 세포 및 CD8+T 세포군으로 변화시킨 결과일 수 있다. B 세포 활성화는 CD4+T 세포에 대한 항원 제시세포로서의 응답성의 증가와 관련이 있는 것으로 알려져있다. 또한, CD8+T 세포는 생체내 및 시험관내에서 면역 반응성의 조절 역활과 광범위한 관련이 있다. T 세포 증식 배양물로부터 이를 제거하는 것은 CD4+T 세포 분열의 장기화 및 레벨의 상승과 관련이 있다.
이들을 합쳐서 생각하면, 상기 연구에서 제시한 바와 같이, 생체내 EtxB의 잠재 면역원성은 GM1에 결합한 후 성장 조절 효과에 의해 발휘되는 B세포의 활성화 촉진능의 결과로서 발생한다고 제안할 수 있다. CD4+T 세포의 활성화 및 시험관내 배양물중 IL-2의 생성을 증가시키는 EtxB의 능력은 B세포 클론을 추가로 확대시키는데 필요한 신호를 제공할 수 있다. 본 연구에서 시험관내 EtxB에 의한 CD8+T 세포의 고갈은, 특히 면역 반응의 억제 및 경구 관용에서 세포의 서브세트를 포함한다는 견지에서 전신 또는 경구 전달후에 생체내 면역강화의 또 다른 기작을 제공할 수 있다. 이러한 점에서, Ctx 및 Etx는 동시 공급되는 가용성 단백질에 대한 경구 관용성을 배제하는 것으로 보이며, 기타 연구는 상기 기작을 설명하기 위한 장 및 파이어판의 돔(dome)에서 표피내 림프구에 대한 Ctx 및 CtxB 고갈 효과와 관련이있다. 시험관내 CD8+T 세포에 대한 CtxB-저해 효과는 이식편대 숙주 반응을 예방하는 것으로 밝혀졌다.
결론적으로, 생체내 항체 반응 및 시험관내 림프구 군과 관련하여 EtxB에 의한 강력한 면역조정 효과의 존재가 입증된다. 추가로, 이들 효과는 수용체 결합에 의해서 매개됨이 입증되었다. 또한 우리의 발견은 Etx 및 Ctx가 유효 보조제 및 항원용 유효 단백질 담체로 작용할 수 있다는 이해에 적합하며, 상기 특성은 림프 세포의 표면할 수 강글리오사이드 수용체에 이들 톡소이드를 결합시키는 능력에 달려있다는 것을 제안한다.
실시예 2
본 실시예는 CD8세포상의 효과가 항원 인지와 관련이 없으며 고사에 의해 매개된다는 것을 예시한다.
EtxB 및 EtxB(G33D)의 재조합 제제는 실시예 1에서와 같이 제조하였다. 2개의 단백질은, 모두 GM1에 대한 결합, 모노클로날 및 다클론 항체의 패널에 대한 결합 및 각종 기타 생리 화학적 특성과 관련하여 특성화하였다. 난알부민(OVA)을 시그마(영국, 풀레)에서 구입하였다. 장간막 림프절(MLN)을 8∼10주령의 BALB/c 마우스[(EtxB에 대한 고 반응 종(Nashar, T.O. and Hirst, T.R. 1995. Immunoregulatory role of H-2 and intra-H-2 alleles on antibody responses to recombinant preparations of B-subunits of Escherichia Coli heat-labile enterotoxin(rEtxB) and cholera toxin(rCtxB). Vaccine 13: 803)]로부터 분리하였다. 불완전한 프로인트 보조액(시그마)에 유화시킨 OVA(시그마) 200㎍을 마우스에게 복강내 주사하였다. MLN을 주사한지 10일 후에 제거하고, 스테인레스 강 메쉬를 통하여 HBSS내로 분쇄하였다(영국, 어빈, 플로우). 회수된 세포를 원심분리(500g, 10분, 4℃)하여 HBSS내에서 세척하고, 새로운 자가 마우스 혈장 0.5%(v/v)가 첨가된, 20 mM의 HEPES, 100IU의 페니실린, 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신, 4 mM의 L-글루타민 및 5×10-5M의 2-머캅토에탄올을 함유하는 변형된 이글 배지(완전 배지)(플로우)에 재현탁시켰다. 배양물은 24웰 평판(Nunc, 덴마크 로스키드 소재)내의 2 ㎖ 용적 중 2×106생세포/㎖를 포함하고, 단독 또는 EtxB 또는 EtxB (G33D) 40 ㎍/㎖와 함께 OVA(완전 배지에서 고도로 투석됨) 100 ㎍/㎖의 존재하에 확립하였다. 배양물을 5%의 CO2및 95%의 공기에서 5일 동안 37℃에서 항온 배양하였다. 원하는 시점에서, 0.1 ㎖ 시료를 배양물로부터 제거하고, 96웰 U 자형 바닥 평판(Nunc)으로 옮기고, 수거(Mach III harvesting 96: 코네티컷주 오렌지의 톰테크) 및 표면 액체 신틸레이션(1450 마이크로 b 플러스; LKB-Wallac, Turku, 핀랜드)으로 계수하기 전에 1μCi/웰의 [3H]티미딘(영국, 아머샴)을 사용하여 6시간 동안 펄스시켰다. T 세포의 유동 세포 계측(Becton Dickinson, Erenbodegem-Aalst, Belgium)을 위해서, 세포를 하기 래트 항체로 염색하였다: FITC 표지된 항-CD4(RNRM4-5) 또는 FITC-항-CD8α(53-6.7) 및 비오틴-표지된 항-CD25(IL-2Rα)(7D4)와, 그 다음 스트렙타비딘-피코에리트린. 또한, 비오틴-표지된 항체용으로 FITC-표지된 스트렙타비딘을 사용하였다. [3H]티미딘 혼입에 의해서 측정되는 회수된 세포의 FACS 분석은 최대 증식일(4일)에 수행하였다.
고사 분석을 위해서, 새로운 MLN 세포(MLNC) 및 비장 T 세포(SPLTC)를 8∼10주된 BALB/c 마우스로부터 분리하였다. 유동 세포 계측법에 의해 측정하는 경우, 유착세포를 제거하기 위해서 5% CO2및 95% 공기하에 37℃에서 10% FCS를 함유하는 완전 배지의 페트리 디쉬(Costar, Cambridge, MA)내에 >90% CD3+T 세포를 포함하는 MLNC를 2시간 동안 항온 배양하였다. 이어서, 비-유착 분획을 피펫으로 제거하고, 펠렛화시킨 후, 사용전에 HBSS에서 2회 세척하였다. 전술한 바와 같이 SPLTC를 정상 마우스 혈장과 토끼 항-마우스-글로블린으로 코팅시킨 유리 비드를 사용하여 음성 선택으로 정제하였다(Wigzell, H. 1976. 유리 또는 플라스틱 비드 칼럼을 사용한 림프구의 특이적 친화도 분획. Scand. J. Immunol. 5:(suppl. 5) 23). 선택된 T 세포군은 유동 세포 계측법으로 측정하였을 때 >90% CD3+였다.
CD4+및 CD8+T 세포를 하기와 같이 분리하였다: 비-유착 MLNC를 래트 피코에리트린-항-마우스 CD4(4708-02) 또는 FITC-항-마우스 CD8α(53-6.7)(PharMingen)으로 표지한 후, 제조자의 지시에 따라 염소 항-래트 IgG(H+L)F(ab')2(PharMingen)와 접합시킨 MACS 콜로이드 초상자성 미세비드와 함께 항온처리하였다. 유동 세포 계측법으로 측정하면, 양성적으로(>99% 순도) 및 음성적으로(>90% 순도) 선택한 분획을 분리하기 위해서 이들을 미니-MACS 칼럼(독일 베르기쉬 글라트바하에 소재하는 밀테니 바이오테크)에 가하였다.
고사를 정량화하기 위해 2가지 방법, 즉 i) 핵 형태를 시험하기 위해서 아크리딘 오렌지를 이용한 DNA 염색법, 및 ii) 프로피듐 요오드화물, 및 항-CD4 또는 항-CD8 항체를 사용하여 DNA 염색한 후에 세포 주기 분석법을 사용하였다. 2×106/㎖ MLNC, SPLTC 및 분획된 MLNC 배양물은, 80 ㎍/㎖의 EtxB 또는 EtxB(G33D)의 부재 또는 존재하에 10% FCS를 함유하는 완전배지에 설정하고, 4 내지 18 시간에 검사하였다. 항온처리 후에, 세포를 펠렛화하고, HBSS로 세척한 후 5 ㎍/㎖ 아크리딘 오렌지(시그마)로 염색하였다. 흉선세포를 10-7M 덱사메타존의 부재 또는 존재하에 분리 및 처리하고, 고사를 진행하는 세포의 양성 대조군으로 사용하였다. 림프구에서의 핵 형태 변화를 통상적인 또는 공초점 형광 현미경(Leica TCS 4D)으로 검사하였다. 세포 주기의 서브-G0/G1기에서 CD4+및 CD8+SPLTC의 비율은 전술한 바와 같이 프로피듐 요오드화물로 염색한 후에 DNA 함량의 유동 세포 계측법에 의해서 측정하였다(O' Connor, P. M., Jackman, J., Jondle, D., Bhatia, K., Magrath, I. 및 Kohn, K.W. 1993. 세포주기 정지기에서 p53 종양 억제 유전자의 역할 및 Burkitt's 림프종 세포주의 방사능민감도, Cancer. Res. 53: 4776) 단독, 또는 40 ㎍/㎖의 EtxB 또는 EtxB(G33D)와 함께 항온 배양시킨 SPLTC의 18 시간 배양물으로부터 분리된 세포를 FITC 래트 항-CD4 또는 FITC-항-CD8α로 염색하였다. 염색된세포를 20 mM의 HEPES 및 0.5 mM의 EDTA를 함유하는 차가운 HBSS에서 1×106㎖로 조정하고, 냉각 에탄올을 적가하여 고정시켰다. 이어서, 50 ㎍/㎖ 프로피듐 요오드화물 및 40 ㎍/㎖의 리보뉴클레아제 A(DNase는 없음)를 첨가하고, 세포를 실온에서 1 시간 동안 항온 배양하였다. CD4 및 CD8+T 세포내에 프로피듐 요오드화물로 염색한 DNA의 상대적 강도는 각 mAB로 동시 염색한 세포상에서 게이팅하여 측정하였다.
실시예 1에서, CD8+T 세포가 EtxB에 반응하여 증식하는 림프절 세포의 배양물로부터 완전히 고갈된다는 결과는, EtxB가 T세포 서브세트상에서 다클론 효과를 발휘함을 제안하였다. 상기 효과가 EtxB 반응성 세포의 활성화에 관여하는지 여부를 조사하기 위해서, 배양물을 OVA-초회 항원 자극된 마우스로부터 설립하고, OVA 단독, 또는 OVA + EtxB 또는 변종 EtxB(G33D)으로 자극시켰다. 유사한 증식 피크 레벨(각 경우에 배양 4일째)은 OVA 단독, OVA + EtxB 또는 OVA + EtxB(G33D)의 존재하에 얻어졌다(각각 9734±347, 12,031±135, 및 9305±290 c.p.m.). 그러나, 4일 후에 이들 배양물에서 T 세포 서브세트의 분배에 급격한 차이가 있었다(도 6). 모든 배양물은 활성화 마커 CD25를 유사한 비율로 공동 발현하는 CD4+T 세포를 포함하였다. 그러나, CD8+T 세포는 OVA 플러스 EtxB로 항온처리한 배양물에서는 검출되지 않았으나, (CD25 발현에 의해서 평가된 바와 같이 활성화되지는 않지만) OVA+EtxB(G33D) 또는 OVA 단독으로 사용한 배양물에서는 분명히 존재하였다. 이는 EtxB가 EtxB 이외의 항원에 반응하는 CD8+ T 세포의 고갈을 유발한다는 사실을 확립시킨다. 더구나, 상기 EtxB(G33D)에 대한 반응의 부재는, 그러한 고갈이 톡소이드 수용체 상호작용 후에 일어난다는 것을 제시한다. 또한 야생형 EtxB의 존재는 이전에 EtxB 반응성 배양물에서 발견된 바와 같이(실시예 1) 다수가 CD25+(도시되지 않음)인 B세포의 비율에 있어서 상당한 증가를 유발시켰다는 점을 인지해야 한다. 따라서, EtxB에 의한 수용체 점유도는 항원 특이성에 관계없이 림프구상에 상당한 면역조정 효과를 나타낸다는 결론을 얻었다.
EtxB의 존재하에 배양된 경우 CD8+T 고사를 진행할 가능성을 조사하였다. 항원 자극하지 않은 마우스로부터의 MLNC 또는 정제된 SPLTC를 EtxB 또는 EtxB(G33D)와 항온 배양시키고, 아크리딘 오렌지로 염색한 후에 세포 핵 형태의 변화를 4 내지 18 시간 동안 기록하였다(표 3 및 도 7). 세포 형태 변화는 소엽 모양의 핵을 형성하게 하는 크로마틴 응축의 존재에 의해 특성화하였다(도 7). 혈장막의 수포와 같은 기타 세포 특성 및 고사체의 존재를 또한 관찰하였다. 이들 형태 변화는 EtxB로 처리한 각 세포 제제의 약1/3에서 발생하는 반면, EtxB(G33D)와 함께 배양된 또는 이종 항원 없이 배양된 세포에서 훨씬 낮은 발생 빈도가 관찰되었다(표 3). CD8+T 세포는 MLNC 및 SPLTC 제제의 ∼35%∼ 40% 비율을 차지하기 때문에, 이들 세포의 고갈은 관찰된 고사를 설명할 수 있다. 상기 경우에 해당하는지의 여부를 확인하기 위해서, 정제된 CD8 및 CD4+T 세포군을 항원의 존재하에 18 시간동안 배양하였다(표 3). 유사한 비율의 형태 변화가 EtxB, EtxB(G33D)와 함께 또는 항원 없이 처리한 CD4+T 세포 (>90% CD4-보유 세포 함유)의 음으로 선택된 모집단에서 유도되며, 이는 수용체에 대한 EtxB의 결합이 상기 T 세포 서브세트에서 고사를 일으키지 않는다는 것을 의미한다. 대조적으로, 음으로 선택된 CD8+T 세포(>90% 순도)의 >70%는 야생형 EtxB와 함께 배양시켰을 때 형태변화를 나타내었으며; 항원없이 또는 EtxB(G33D)와 함께 항온 배양하면 각각 상기 T세포군의 11∼19%만을 변화시켰다. 추가로, 사용한 정제 개체군에서 적은 수로 존재하는 오염 세포는(각 경우 ∼10%), CD8 또는 CD4+T-세포(양성 선택에 의해서 분리)를 >99% 포함하는 고도로 정제된 개체군이 유사한 방식으로 EtxB에 반응하기 때문에 관찰된 효과를 설명할 수 없다(EtxB의 존재하에서는 60%가 고사, 대조적으로 항원이 없고 EtxB(G33D)로 처리한 경우에는 7%가 고사)(표 3). 고사는 각각 덱사메타존의 부재하에 또는 존재하에 18 시간 동안 배양한 후에 흉선 세포의 40% 및 98%에서 검출되었다.
배양물에서 관찰되는 형태 변화가 고사의 유도와 일치한다는 것을 보여주기 위해서, EtxB로 18 시간 동안 처리한 SPLTC 배양물 중 서브이배체 DNA의 외관을 평가하였다. 프로피듐 요오드화물 및 항-CD8 또는 항-CD4 항체로 공동 염색한 후에 세포를 유동 세포 계측법으로 분석하였다(도 8). EtxB와 함께 항온 배양시킨 배양물으로부터의 CD8+T 세포의 약 48%는 프로피듐 요오드화물 염색의 이 배체 G0/G1피크 아래에 있으며, 이는 고사를 진행하고 있다는 것을 알려준다(O'Connor, P.M.등, 전술). 또한 EtxB와의 배양물에서 CD4를 발현하는 세포의 작은 비율이 DNA의 서브-G0/G1농도를 나타내었다(∼11%; CD8+T 세포의 고 비율의 사멸로부터 발생). 대조적으로, 항원없이 또는 EtxB(G33D)의 존재하에 배양된 대다수의 CD4 또는 CD8+T 세포의 주요부는, <5%의 고사를 나타내면서 세포주기의 G0/G1기에 존재하였다. 본 연구진은 EtxB로 처리된 CD8+T 세포의 실질적인 비율에 있어서 관찰된 핵 형태 변화, 및 DNA의 서브-G0/G1레벨의 존재가, 콜레라와 유사한 엔테로톡신에 의해 발생하는 선택적인 고사를 나타낸다는 결론을 얻었다. 수용체 결합 변종, 즉 EtxB(G33D)가 유사한 효과를 유도하는데 실패했다는 것은 CD8+T 고사의 유도가 GM1 강글리오사이드에 결합할 수 있는 능력과 연관되었다는 것을 입증한다.
실시예 3
8마리의 수컷 DBA/1마우스의 각 그룹은 항원투여하지 않거나(그룹 A) 또는 0일째에 CFA중 소 콜라겐 100㎍을 옆구리로 피내(i.d.)주사하였다. 콜라겐을 주사한 마우스는 비보호되거나(그룹 B, 양성 대조군), 또는 0일에 IFA중 100㎍의 EtxB(그룹 C), 14일에 IFA중 100㎍의 EtxB(그룹 D) 또는 0일에 IFA중 100㎍의 EtxB(G33D)(그룹 E)의 콜라겐 항원으로 이웃하는 부위에 피내 투여하므로서 질환의 진행의 예방을 시도할 수 있다. 그룹 A의 동물을 제외한 모든 동물에게 21일째에 피내로 IFA중 콜라겐의 추가 자극 투여량을 주고, 뒷다리 발목-두께(실험 A)를 측정하거나 또는 팽창에 대해 뒷다리 발가락을 등급화하므로서 45일째에 병의 경중을 평가하였다(등급 0-3, 여기서 0= 정상, 및 3= 최대 팽화; 실험 B).
얻은 결과는 도 9a 및 9b에 나타나있다. 이들은 EtxB(G33D)가 아니라 EtxB가 콜라겐-유도된 관절염의 진행으로부터 마우스를 극적으로 보호하는 것을 보여준다.
실시예 4a
2개의 별도의 인간 버피 코트(buffy coat) 시료(정상 인간 혈액 공급자로부터 얻음)를 단핵 세포의 공급원으로서 사용하였다. Ficoll-paque상에서 세포를 분리하고, 항원의 부재하에, 또는 지표로서 EtxB 또는 EtxB(G33D) 80 ㎍/㎖를 사용하여 배양하기 세척하였다. 배양하기 전에, 세포군은 각 시료에 대하여 24%, CD8+, 27% CD4+ 및 27% CD8+, 22.9% CD4+를 포함하였다. 18시간 동안 배양한 후에, 고사 세포의 외관은 아크리딘 오렌지로 염색한 세포의 시료에서 평가하였다(실시예 2에서 상세히 설명). 얻은 결과는 도 10에 제시되어 있다: 이는 EtxB(G33D)가 아니라 EtxB가 정상 인간 말초혈액 단핵세포 군에서 고사를 유발한다는 것을 예시한다.
실시예 4b
쥐 T 세포주, CTLL-2를 전면 성장될 때까지 배양된 다음, 항원의 부재하에, 또는 지시한 바와 같이 80 ㎍/㎖의 EtxB 또는 EtxB(G33D)와 함께 1×106세포/㎖에서 재접종하기 전에 세포를 세척하였다. 18 시간 후에, 시료를 제거하고 고사의 징후를 보이는 세포의 비율을 아크리딘 오렌지를 사용하여 평가하였다(실시예 2에 상세히 설명). 얻은 결과는 도 11에 나타나있다. 도 11은, GM1의 가교결합이 쥐의CTLL 세포와 비례하여 고사를 유도함을 보여준다.
[표 1]
EtxB 또는 EtxB(G33D)의 존재하의 림프구 증식
완전 프로인트 보조액(CFA)중 EtxB(G33D) 30 ㎍을 마우스에게 복강내 투여하였다. 장간막 림프절을 10일 후에 분리하였다. 세포를 분리하고, EtxB, EtxB(G33D) 또는 95℃에서 가열하여 산출된, 분해된 단량체 형태의 단백질의 존재하에 4日간 항온처리하였다. 4일 째 최종 6시간 동안 (3H) dThd 1 μCi를 첨가하여 증식을 측정하였다. 데이타는 3중 웰의 평균 cpm 및 SEM을 나타낸다. 비면역화시킨 마우스에서 분리한 세포는 <1500 cpm(160 ㎍/㎖ 용량)을 나타내었다.
[표 2]
EtxB 또는 EtxB(G33D)의 존재하의 시토킨 분석
CFA중 EtxB(G33D)를 마우스에게 주사하고, 장간막 림프절을 10일 후에 분리하였다. 이어서, 세포를 EtxB 또는 EtxB(G33B)과 함께 생체내에서 항온 배양하고, 상청액 시료를 세포 증식 5일 째에 시토킨 함량에 대해 분석하였다.
[표 3]
분획된 림프구중 고사를 매개하는 EtxB-수용체
항원의 부재하에, 또는 80 ㎍/㎖의 EtxB 또는 EtxB(G33D)와 함께 또는 18 시간 배양한 후에 분획화된 CD4 및 CD8+T 세포의 핵 형태 변화를, 아크리딘 오렌지로 염색한 후에 형광 형미경으로 검사하였다. 전 MLN에서 유착 세포를 제거하였다. SPLTC는 2차 항체로서 마우스-글로블린 및 토끼 항-마우스를 사용하여 코팅한유리 비드 칼럼에서 음성 선택으로 분리하였다. 분획화된 SPLTC는, 래트 피코에리트린-항-마우스 CD4 또는 FITC-항-마우스 CD8α로 표지한 후에 얻어지며, 그후 염소 항-래트 IgG(H+L)F(ab')2와 접합된 MACS 콜로이드의 초상자성 미세비드와 함께 배양하였다. CD4 및 CD8+T 세포의 양성적으로(>99% 순도) 및 음성적으로(>90% 순도) 선택한 분획을 얻기 위해서 미니-MACS를 사용하여 분리하였다. 핵 형태 변화는, 도 7의 범례에 기술된 바와 같이 치료 1회당 200개 세포의 무작위 시료 중에 4 내지 18 시간에 검사하였다. 고사 세포의 최대 %는 18 시간후에 발생하였다. 괄호안의 데이타는 또 다른 별도의 실험에서 얻은 결과를 나타낸다. MLN 및 SPLTC에 대한 데이트는 총 4회 실험의 합계를 나타내는 것이다.a퍼센트는 고사된 세포.
Claims (9)
- (i) 면역조절인자가 Ctx 또는 Etx, 또는 Ctx의 B 서브유니트 또는 Etx의 서브유니트이고;(ii) 면역조절인자가 항원 또는 항원성 결정 인자와 공동 투여되는 경우, 면역조절인자와 항원 또는 항원성 결정 인자가 단일 활성제를 형성하도록 결합되지 않은 것이 특징인 면역조절인자를 포함하는 자가면역 질환, 이식편 거부 반응, GVHD 또는 인간 T 세포기원 백혈병의 치료 및/또는 예방에 사용되는 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 자가면역 질환의 치료 및/또는 예방에 사용되는 약학 조성물.
- 제2항에 있어서, 류마티스양 관절염, 다발성 경화중 또는 당뇨병의 치료 및 또는 예방에 사용되는 약학 조성물.
- 제1항, 제2항 및 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제제가 EtxB 인 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 제제가 자가 항원 또는 교차 반응성 항원의 공동 투여 없이 투여되는 약학 조성물.
- 제1항에 따른 약학 조성물과 이와는 별도로 자가 항원성 결정인자 또는 교차 반응 항원성 결정인자를 함유하는 약학 조성물을 포함하는 키트.
- 제1항에 따른 약학 조성물을 검체에 투여하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 포유류 검체의 면역 반응 조절방법.
- 제7항에 있어서, 자가면역 질환, 이식편 거부 반응, GVHD 또는 T 세포 기원 백혈병의 치료 및/또는 예방을 위한 방법.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 약학 조성물이 자가 항원 또는 교차 반응성 항원과 공동투여 되는 방법.
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