CN117986351A

CN117986351A - 一种ra自身抗原表位多肽及其制备的抗原特异性t细胞疫苗、制备方法和应用

Info

Publication number: CN117986351A
Application number: CN202311848070.8A
Authority: CN
Inventors: 栗占国; 胡凡磊; 曹璐璐
Original assignee: Peking University Peoples Hospital
Current assignee: Peking University Peoples Hospital
Priority date: 2023-12-29
Filing date: 2023-12-29
Publication date: 2024-05-07

Abstract

本发明提供了一种RA自身抗原表位多肽及其制备的抗原特异性T细胞疫苗、制备方法和应用，属于免疫治疗技术领域。本发明通过对N端和C端的修饰和特定氨基酸的改造，使RA自身抗原表位多肽CII_1237‑1249具有刺激效果良好、半衰期延长的特点。CII_1237‑1249多肽作为类风湿关节炎自身抗原表位多肽，结合IL‑7和IL‑15以及IL‑2和PHA刺激，经灭活，流式分选抗原特异的CD4⁺T细胞，得到不增殖但保留免疫原性的抗原特异性T细胞疫苗。将抗原特异性T细胞疫苗皮下注射后，能有效纠正免疫失调，达到治疗类风湿关节炎的目的。本发明为类风湿关节炎的治疗提供了安全可靠的新方法。

Description

一种RA自身抗原表位多肽及其制备的抗原特异性T细胞疫苗、制备方法和应用

技术领域

本发明属于免疫治疗技术领域，具体涉及一种RA自身抗原表位多肽及其制备的抗原特异性T细胞疫苗、制备方法和应用。

背景技术

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是临床最常见的高致残性自身免疫病，该病的患病率是0.28％～0.41％，而缓解率仅为8.6％，未经正规治疗致残率高达75％，是我国致残率最高的疾病之一。类风湿关节炎的特点包括出现炎症性滑膜增生、慢性破坏性关节炎以及产生各类自身抗体(如类风湿因子、抗瓜氨酸化抗体等)，致使关节功能障碍和畸形，可累及心、肺、肾、神经等全身脏器。目前RA的治疗主要通过非甾体抗炎药(NSAIDs)和缓解病情抗风湿药(DMARDs)联合糖皮质激素进行一线治疗，但仅仅只有40％～50％的病人对于该治疗有响应。进一步联合生物制剂(如TNF抑制剂和JAK抑制剂)治疗，约70％的RA患者达到临床缓解或处于低疾病活动状态。目前我们仍面临缺乏RA特异性治疗手段的严峻形势，开发更安全有效的药物治疗实现RA个体化精准治疗是临床实践中亟待解决的问题。

自身抗原驱动的T异常细胞活化是RA发病中的关键因素，在内源性或者外源性因素影响下，导致机体对于某些自身抗原的反应性增强，促进自身抗原肽及HLA-DRB1与TCR特异性识别与结合，活化致病性的抗原特异性T细胞，从而介导慢性炎症反应。患者关节炎症部位，通过细胞接触与可溶性介质释放，抗原特异性T细胞刺激巨噬细胞和滑膜成纤维细胞，产生破坏骨和软骨的炎性介质和蛋白酶，促进关节炎症。同时抗原特异性T细也促进B细胞产生大量类风湿因子和抗环瓜氨酸蛋白抗体，引起滑膜炎症反应，进而导致关节病理损伤。

靶向T细胞的药物和技术在临床获得成功，以CTLA4融合蛋白Abatacept(阿巴西普)为代表的T细胞活化抑制疗法是目前较为成熟的方案，通过与抗原提呈细胞表面的CD80/CD86结合，阻止CD80/CD86与T细胞表面CD28的相互作用，从而抑制自身抗原诱导的T细胞活化、减弱其下游炎症反应，从而抑制破骨细胞生成发挥治疗作用。此外，目前已有多种T细胞相关的细胞因子融合蛋白或者单抗在临床上用于治疗类风湿关节炎。此外JAK1/2/3抑制剂能够同时抑制多种炎性细胞因子的功能，目前JAK抑制剂Tofacitinib在临床应用中病人有良好获益。然而上述方案均是无差别地阻断T细胞活化以及下游炎症、进行治疗，可能会导致广谱的免疫抑制，攻击发挥保护功能的效应细胞，不可避免地引起感染、消化道、肝肾损伤等副作用。在这样的治疗现状下，亟需我们加快寻找一种更安全有效的治疗手段控制疾病发生发展，纠正RA患者紊乱的免疫系统，实现RA患者个体化精准治疗。

目前以“免疫平衡恢复”作为治疗目标已得到免疫学专家和临床研究者的重视，包括使用治疗性疫苗达到免疫平衡恢复，T细胞疫苗作为一类细胞疫苗已在多种免疫病中发挥疗效。T细胞疫苗与减毒疫苗概念类似，是指通过处理灭活致病性T细胞，使其丧失致病性，但保留致病性T细胞的免疫特征，以期诱导免疫耐受发挥治疗效果。T细胞疫苗是近年来精准医疗的新方向，与传统疫苗只要通过体液免疫发挥作用不同，细胞疫苗可以同时调动细胞免疫与体液免疫。而与目前大热的CAR-T技术相比，CAR-T只靶向表达某一特定细胞亚群，而T细胞疫苗既能靶向多种自身反应性致病细胞，也能诱导免疫耐受，调节免疫系统恢复平衡，而这对自身免疫病的患者至关重要。前期T细胞疫苗在自身免疫病中的使用采用的是非靶向性扩增，并未分离其中具体细胞亚群，因而治疗效果有限，疗效有待进一步提高。

此外，免疫细胞通常难以识别整个抗原分子，而是通过表面受体识别抗原大分子的特定部分序列即抗原表位。抗原表位是抗原分子中主要的功能单位，能有效刺激机体的细胞免疫与体液免疫。目前T细胞的抗原表位通常为线性表位，确定是否为T细胞的表位需要预测该多肽与HLA结合亲和力强弱，以及利用T细胞增殖实验，酶联免疫吸附实验等确定活性。不同表位对应的自身抗原多肽的刺激效果差异较大，影响T细胞的活化及功能。由于旁观者耐受效应，尽管在类风湿关节炎中存在多种自身抗原参与发病机制，选择一种关键抗原诱导免疫耐受便可调节免疫系统恢复平衡。目前还未有利用自身抗原表位刺激T细胞增殖后产生抗原特异T细胞，并经这部分细胞分离用于制备抗原特异T细胞疫苗相关的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种RA类风湿关节炎自身抗原表位多肽，改造以延长其半衰期，提高免疫激活作用，达到特异刺激RA样本来源的外周抗原特异的CD4+增殖，并在IL-7与IL-15联合处理后增强其对自身抗原多肽反应性，利用抗原提呈细胞结合抗原多肽进一步促进其增殖最后利用IL-2与PHA获得目的细胞大量增殖的效果。

本发明的目的在于提供一种抗原特异性T细胞疫苗，通过免疫抑制调节性T细胞发挥作用，来实现治疗因全身免疫系统紊乱导致的关节病变。

本发明的目的还在于提供一种抗原特异性T细胞疫苗的制备方法，具有促进抗原特异T细胞快速增殖特点的同时还进行分离处理，获得高纯度抗原特异性T细胞疫苗后灭活制备抗原特异性T细胞疫苗。

本发明的目的还在于提供一种抗原特异性T细胞疫苗在制备类风湿关节炎药物中的应用。

本发明提供了一种类风湿关节炎自身抗原表位多肽，所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的N端谷氨酰胺替换为D型谷氨酰胺，所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的N端进行乙酰胺化修饰，同时所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的C端进行酰胺修饰。

本发明提供了一种抗原特异性T细胞疫苗，类风湿性关节炎样本来源的脾细胞经所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽刺激后灭活分离得到。

优选的，所述抗原特异性T细胞疫苗为灭活的抗原特异CD4⁺T细胞。

本发明提供了所述抗原特异性T细胞疫苗的制备方法，包括以下步骤：

将类风湿性关节炎样本来源的脾细胞或外周PBMC细胞在含所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的培养基中培养7天，与捕获有所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的抗原提呈细胞共培养3d，培养第8天用加入IL-7和IL-15培养，培养第13天加入IL-2和PHA培养，培养第16天收集细胞，灭活细胞，分离抗原特异性CD4⁺T细胞。

优选的，所述培养基以RPIM1640为基础培养基，还包括以下含量的组分：体积百分含量的10％FBS、5mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺、0.05mM巯基乙醇、100U/mL链霉素与青霉素5～10ng/mL的IL-15和IL-7；

所述培养基中，所述自身抗原的浓度为5～50μg/mL。

优选的，所述类风湿性关节炎样本来源的脾细胞的浓度为(1～10)×10⁷/mL。

优选的，所述捕获自身抗原的抗原提呈细胞的制备方法，将5～50μg/mL类风湿关节炎自身抗原表位多肽溶液与抗原提呈细胞进行共孵育；

所述抗原提呈细胞的浓度为(1～10)×10⁶/mL；

所述抗原提呈细胞包括滋养层细胞或成熟的树突状细胞；

所述滋养层细胞的制备方法，包括类风湿性关节炎样本来源的脾脏经裂红处理得到脾单个细胞，灭活，得到滋养层细胞；

所述成熟的树突状细胞的制备方法，将小鼠骨髓细胞裂红处理后分化培养，LPS诱导成熟得到成熟的树突状细胞；

所述分化培养时试剂为含10～25ng/mLGM-CSF和5～10ng/mL IL-4的水溶液；

培养第7天细胞和捕获自身抗原的抗原提呈细胞的数量比为1～5：1。

优选的，所述IL-7和IL-15的终浓度为5～20ng/mL；

所述IL-2的终浓度为5～20ng/mL；

所述PHA的终浓度为1～10μg/mL。

优选的，所述灭活细胞的方法为用20～50μg/mL丝裂霉素处理30～60min；

所述分离CD4⁺T细胞的方法为采用商品化四聚体抗体染色，分离抗原特异性CD4⁺T细胞。

本发明提供了所述抗原特异性T细胞疫苗或所述制备方法得到的抗原特异性T细胞疫苗在制备预防和/或治疗类风湿关节炎的药物中的应用。

本发明提供了一种改造后的类风湿关节炎自身抗原表位多肽，所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的N端谷氨酰胺替换为D型谷氨酰胺，所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的N端进行乙酰胺化修饰，同时所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的C端进行酰胺修饰。本发明通过筛选多个类风湿关节炎自身抗原表位多肽，患者外周PBMC与胶原诱导关节炎小鼠的CD4⁺T细胞联合anti-CD28刺激中的结果表明CII_1237-1249刺激效果更佳；对自身抗原多肽进行改造将N端谷氨酰胺替换成D型，并且将N端乙酰胺化，C端酰胺化的改造方式进行，延长多肽半衰期，提高免疫激活能力，因此，选择改造的CII_1237-1249作为类风湿关节炎自身抗原表位多肽制备抗原特异性T细胞疫苗。

本发明提供了一种抗原特异性T细胞疫苗，是由类风湿性关节炎样本来源的脾细胞或者外周PBMC细胞经类风湿关节炎自身抗原表位多肽刺激后特异扩增，经分离并灭活得到。所述抗原特异性T细胞疫苗针对类风湿性关节炎自身抗原具备高特异性，同时增殖速度快。同时验证抗原特异性T细胞疫苗对类风湿性关节炎的防治作用，结果表明抗原特异性T细胞疫苗通过免疫调节Tregs并且上调Tregs细胞表面相关抑制分子的表达从而达到防治类风湿性关节炎的目的。本发明提供了抗原特异性T细胞疫苗能够加强机体内免疫反应，增强机体对类风湿关节炎的治疗效果，具有针对性强、效果持久的特点，且使用安全不会产生任何毒副作用。

附图说明

图1为本发明实施例1中自身抗原表位多肽筛选结果，其中A为待筛选的三条抗原表位多肽的氨基酸序列，B为多肽免疫组库中几条多肽经算法预测其与HLA结合的强度，免疫原性强弱的评分结果，(C)获取RA患者的PBMC后采用不同浓度的自身抗原多肽刺激，72小时后采用CFSE稀释检测细胞增殖；(D)增殖指数SI＝多肽加入刺激组细胞增殖比例/未加入多肽的对照组细胞增殖比例，采用增殖指数比较不同浓度的多组自身抗原多肽的增殖能力；(E)胶原诱导的小鼠关节炎模型中获取脾细胞后，使用10μg/mL不同多肽刺激，检测细胞增殖；(F)增殖指数用于比较各组之间增殖能力的差别；

图2为本发明实施例1中采用的改造后自身抗原多肽的半衰期及免疫激活作用；A.对CII多肽进行改造的策略展示，将改造后多肽记为CII-mut；B.左图展示CII原型多肽半衰期变化，右边是改造后CII-mut多肽半衰期变化；C.获取RA患者的PBMC后采用改造的CII-mut刺激，72小时后采用CFSE稀释检测细胞增殖；D.获取RA患者的PBMC后采用改造的CII-mut刺激，48小时后检测培养上清中IFNγ、IL-17A与IL-6水平；

图3为本发明实施例2中抗原特异性T细胞疫苗有效性检测结果，A为抗原特异性T细胞疫苗对RA患者外周血单个核细胞PBMC中免疫细胞亚群的影响，B为抗原特异性T细胞疫苗对RA患者PBMC中产生的细胞因子的影响；C为含有的CD4⁺T细胞的效应/记忆细胞的比例检测结果，D为细胞的形态检测结果；

图4为实施例3中抗原特异性T细胞疫苗治疗后类风湿关节炎小鼠细胞亚群结果(A)与上清中的细胞因子结果(B)；

图5为抗原特异性T细胞疫苗治疗后类风湿关节炎小鼠疾病评分结果；

图6为实施例4中抗原特异性T细胞疫苗治疗后类风湿关节炎小鼠关节的骨侵蚀与骨破坏情况的micro-CT图；

图7为实施例4中抗原特异性T细胞疫苗治疗后类风湿关节炎小鼠脾脏中致病细胞亚群Th1/Th17变化情况；

图8为实施例4中抗原特异性T细胞疫苗治疗后类风湿关节炎小鼠引流淋巴结中上调Treg细胞比例结果；

图9为实施例5中抗原特异性T细胞疫苗治疗后CIA小鼠脾脏中Treg细胞比例和细胞表明免疫调控分子的变化情况。

具体实施方式

本发明提供了一种类风湿关节炎自身抗原表位多肽，所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1(QYMRCitADQAAGGLR)所示，所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的N端谷氨酰胺替换为D型谷氨酰胺，所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的N端进行乙酰胺化修饰，同时所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的C端进行酰胺修饰。

本发明采用多种自身抗原表位多肽，例如Vimentin(65-77)、Fibrinogenα(79-91)、Type II collagen，配制不同浓度来刺激HLA-DR+RA患者外周PBMC中CD4⁺T细胞增殖，结果表明CII_1237-1249刺激效果更佳，并且在10μg/mL与20μg/mL刺激效果类似，后续选定10μg/mL使用。在胶原诱导关节炎小鼠的CD4⁺T细胞中，联合anti-CD28刺激，结果也显示CII_1237-1249刺激效果更佳，因此以II型胶原多肽(QYMCitADQAAGGLR)作为制备抗原特异性T细胞疫苗的抗原多肽。在后续培养过程中多肽的稳定性影响到疫苗制备效果，本发明采用两种修饰方式(乙酰胺化修饰和酰胺修饰)对自身抗原进行改造来研究对多肽半衰期的影响，通过RA患者血清与200μM多肽等体积在37℃中共同孵育，取从0小时到72小时的多个时间点溶液上清，利用甲醇沉淀后通过HPLC检测，与标准品对比获得半衰期变化。结果显示：未经改造的CII_1237-1249自身抗原多肽半衰期t_1/2＝28.66min，经改造后CII_1237-1249自身抗原多肽半衰期显著延长，经72小时孵育仍然有75％左右的多肽保持稳定。

本发明提供了一种抗原特异性T细胞疫苗，类风湿性关节炎样本来源的脾细胞或外周PBMC经所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽刺激后特异增殖，经特异分离并灭活得到。

在本发明中，所述抗原特异性T细胞疫苗优选为CD4⁺T细胞。所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的刺激浓度优选为5～50μg/mL,更优选为5～30μg/mL，进一步优选为8～20μg/mL，最优选为10μg/mL。所述脾细胞的密度优选为1～10×10⁷/mL，更优选为1～5×10⁷/mL，最优选为1×10⁷/mL。所述刺激时，所述脾细胞的培养基优选为以RPIM1640为基础培养基，还包括以下含量的组分：体积百分含量的10％FBS、5mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺、0.05mM巯基乙醇、100U/mL青霉素与链霉素、5～10ng/mL的IL-15和IL-7。

将类风湿性关节炎样本来源的脾细胞或外周PBMC细胞，培养7天，与已捕获所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的抗原提呈细胞共培养3d，培养第8天用加入IL-7和IL-15培养，培养第13天加入IL-2和PHA培养，培养第16天收集细胞，灭活细胞，利用荧光标记的四聚体抗体特异分离抗原特异性CD4⁺T细胞。

在本发明中，类风湿性关节炎样本来源的模型小鼠的脾细胞或来源患者的外周PBMC细胞，以脾细胞为原料举例说明制备方法，具体按照步骤制备

得到：将患类风湿性关节炎小鼠的脾脏以及引流淋巴结样本，破碎后，经过裂红处理和PBS中和，收集脾细胞单细胞进行培养。所述裂红处理用溶液为1×裂红液。所述1×裂红液的配方优选为139.6mmol/LNH4Cl,16.96mmol/LTris，用1mol/L HCl调pH值至7.2。所述培养的温度优选为37℃。所述培养的时间优选为14～16d，更优选为16d。所述类风湿性关节炎样本来源的脾细胞的浓度优选为(1～10)×10⁷/mL，更优选为1～5×10⁷/mL，最优选为1×10⁷/mL。

在本发明中，所述培养基优选以RPIM1640为基础培养基，还包括以下含量的组分：体积百分含量的10％FBS、5mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺、0.05mM巯基乙醇、100U/mL青霉素与链霉素、5～10ng/mL的IL-15和5～10ng/mL IL-7。所述培养基中，所述自身抗原的浓度优选为2～50μg/mL，更优选为5～30μg/mL，进一步优选为8～20μg/mL，最优选为10μg/mL。体外创新地使用自身抗原表位多肽刺激后促进抗原特异性T细胞的增殖。所述培养的温度优选为37℃。所述培养的时间优选为14～16d，更优选为16d。

在本发明中，所述IL-7和IL-15的终浓度优选为5～10ng/mL，更优选为6～8ng/mL，最优选为7ng/mL。所述IL-2的终浓度为5～20ng/mL，更优选为10～15ng/mL。所述PHA的终浓度优选为1～10μg/mL，更优选为2～8μg/mL，最优选为5μg/mL。

在本发明中，所述灭活细胞的方法为用20～50μg/mL丝裂霉素处理30～60min，更优选为用30～40μg/mL丝裂霉素处理30min。所述分离CD4⁺T细胞的方法为采用商品化四聚体抗体染色，分离抗原特异性CD4⁺T细胞。

在本发明中，所述捕获自身抗原的抗原提呈细胞的制备方法，优选将15～25μg/mL类风湿关节炎自身抗原表位多肽溶液与抗原提呈细胞进行共孵育。所述抗原提呈细胞的浓度为(1～10)×10⁶/mL。所述抗原提呈细胞包括滋养层细胞或成熟的树突状细胞。所述滋养层细胞的制备方法，优选包括类风湿性关节炎样本来源的脾脏经裂红处理得到脾单个细胞，灭活，得到滋养层细胞。所述成熟的树突状细胞的制备方法，

在本发明中，小鼠骨髓细胞裂红处理后利用GM-CSF和IL-4分化培养，LPS诱导成熟得到成熟的树突状细胞。

在本发明中，培养第7天的细胞和捕获自身抗原的抗原提呈细胞优选为按照(1：1)～(5：1)的细胞数目之比，更优选为2：1。捕获自身抗原表位多肽的抗原提呈细胞的作用是在共培养过程中，将捕获的自身抗原表位多肽提呈给T细胞，使自身抗原表位多肽与T细胞表面的MHCII分子结合，进行进一步刺激T细胞反应，产生特异性T细胞。

在本发明中，所述IL-7和IL-15的终浓度优选为5～20ng/mL，更优选为5～10ng/mL，最优选为10ng/mL。IL-7和IL-15在培养第8天时加入作用是提高CD4+T细胞对自身抗原肽的敏感性，利于特异性扩增。

在本发明中，所述IL-2的终浓度优选为5～20ng/mL，更优选为8～15ng/mL，最优选为10ng/mL。所述PHA的终浓度优选为1～10μg/mL，更优选为5～10μg/mL，最优选为5μg/mL。所述IL-2和PHA在培养的最后三天添加作用是对培养体系中已存在的抗原特异性T细胞进行活化刺激后大量扩增获得足够数量的细胞用于后续疫苗制备。

在本发明中，所述灭活细胞的方法优选用25μg/mL丝裂霉素处理半小时。所述分离CD4⁺T细胞的方法为采用Stemcell CD4⁺分离磁珠进行分离。免疫磁珠法分离细胞基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。所述的抗原特异性T细胞的分离利用四聚体技术结合流式，TCR识别抗原提呈细胞或者靶细胞表面的MHC-抗原肽复合物，通过以带有信号标记的链霉亲合素为基础，交联四个MHC分子单体，将4个MHC-抗原肽单体分子及荧光染料组成MHC四聚体，通过流式细胞术成功实现对抗原特异性的T细胞的离体分析。本发明制备抗原特异性T细胞疫苗过程中，利用磁珠分选结合四聚体技术分离其中抗原特异性CD4⁺T细胞并且采用临床肿瘤治疗中丝裂霉素进行处理代替传统的放射源照射，获得纯度更佳的抗原特异性T细胞疫苗，并且这种处理方式更易在临床进行推广；获得增殖能力弱但保留免疫活性的抗原特异性T细胞疫苗，经自体回输后诱导免疫耐受，纠正免疫失调达到治疗目的。

在本发明中，为了检测所述抗原特异性T细胞疫苗的有效性，将上述制备的抗原特异性T细胞疫苗与PBMC共培养，分别检测几类细胞亚群和细胞因子的变化情况，结果表明，Treg是抗原特异性T细胞疫苗发挥治疗作用的关键细胞，同时有效抑制炎性细胞因子IFNγ的水平。

本发明提供了所述抗原特异性T细胞疫苗或所述抗原特异性T细胞疫苗在制备预防和/或治疗类风湿关节炎的药物中的应用。

在本发明中，以胶原诱导的关节炎小鼠(CIA)模型是一类经典的类风湿关节炎动物模型，与人类类风湿关节炎表型类似，均由自身抗体的产生进一步诱导全身免疫系统紊乱，导致关节病变。本发明实施例中，为了验证抗原特异性T细胞疫苗对类风湿关节炎的治疗效果，以CIA小鼠模型为实验对象，用抗原特异性T细胞疫苗免疫小鼠，结果表明能有效降低小鼠的肿胀程度，显著减轻骨侵蚀与骨破坏情况；此外，对于免疫系统的影响方面，治疗后Th1/Th17减少，Tfh、GCB减少，CD4⁺IL10⁺增多，Treg升高。Th1与Th17是类风湿关节炎中重要的致病细胞亚群，通过分泌细胞因子影响破骨细胞等；Tfh与GCB是通过影响自身抗体(这是该自身免疫病的重主要特点和发病机制)产生影响疾病进展。

下面结合实施例对本发明提供的一种RA类风湿关节炎自身抗原表位多肽及其制备的抗原特异性T细胞疫苗、制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种RA类风湿关节炎自身抗原表位多肽的筛选方法

1.通过IEDB数据库(https://www.iedb.org/)我们将RA患者中多个自身抗原，包括II型胶原，vimentin,Fibrinogen等，结合数据库中多种算法包括MHC结合预测，抗原提呈预测以及免疫原性预测，筛选在RA中关键自身抗原T细胞表位多肽。在RA患者自身抗原中的瓜氨酸修饰通过电荷改变增强与HLA结合能力，从而增强致病性，因而基于多种算法的Combined score以及在RA患者的瓜氨酸修饰特征，筛选图1所示的自身抗原多肽(图1中A和B)。

2.合成待筛选的抗原多肽，氨基酸序列如下：

Type II collagen(1237-1249)：QYMRCitADQAAGGLR(SEQ ID NO:1)；

Vimentin(65-77)：SAVRACitSSVPGVR(SEQ ID NO:2)；

Fibrinogenα(79-91)：QDFTNRCitINKLKNS(SEQ ID NO:3)。

3.将筛选的3条抗原多肽按照不同的浓度刺激HLA-DR+RA患者外周PBMC，检测CD4⁺T细胞增殖情况。具体方法如下：

选择RA病人抽取紫血两管，在台子里面利用无菌的PBMC分离液进行分离，先将血用PBS稀释到7mL，将以上轻轻铺在PBMC分离液上层，按照1800rpm、20min离心，吸取中间层的白膜，管底部是粒细胞和红细胞，加入5mL PBS清洗后，继续离心，获得PBMC。按照1×10⁶/mL PBMC进行刺激，刺激的抗原多肽的浓度包括以下三个浓度：2.5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL。

刺激指数(％)＝自身抗原多肽增殖细胞比例/无关肽或者不加多肽对照组增殖细胞×100％公式I。

结果显示，CII_1237-1249刺激效果更佳，并且在10μg/mL与20μg/mL刺激效果类似，后续选定10μg/mL使用(图1中C-D)。在胶原诱导关节炎小鼠的CD4⁺T细胞中，将抗原多肽联合anti-CD28刺激细胞，结果也显示，CII_1237-1249刺激效果更佳(图1中E-F)。因此，后续研究主要以II型胶原(QYMCitADQAAGGLR)为例研究。

改造自身抗原多肽并确定其半衰期及免疫激活效果(图2)

改造的方案是：自身抗原多肽C和N端换成分别换成酰胺和乙酰胺cap，然后把C和N端的天然氨基酸换成非天然D构型氨基酸，图2中A显示改造前后的示意图。多肽以固相、高效液相层析法纯化合成多肽，通过液质联用确定多肽的纯度(>95％)。多肽使用PBS溶解后与RA患者血清等体积混合孵育，孵育时间选择多个时间点，每个时间点制备3个复孔。然后从每个样品中取30μL上清加入60μL甲醇溶液中。离心后取上清使用HLPC-MS检测，通过与乙腈溶解的标准品确定出峰位置，在不同时间点后峰面积判断多肽在RA血清中的半衰期变化，图2中B显示：未经改造自身抗原多肽半衰期t_1/2＝28.66min，经两种改造后CII_1237-1249自身抗原多肽半衰期显著延长，经72小时孵育仍然有75％左右的多肽保持稳定。

分离HLA-DR+类风湿关节炎患者PBMC采用修饰的CII_1237-1249自身抗原多肽进行刺激72小时，CFSE稀释法检测CD4+T细胞增殖，利用公式I检测，图2中C发现经改造后CD4+T细胞增殖能力增强，图2中D上清中炎性细胞因子表达升高。

实施例2

一种抗原特异性T细胞疫苗的制备方法

1、实验动物：从北京华阜康生物科技股份有限公司购入无特定病原体(specificpathogen free,SPF)6～8周DBA1/J雄鼠，寄养于北京大学人民医院动物实验室SPF环境中，继续饲养7天后开始造模。

2、造模方式：将牛II型胶原(CII)溶解于0.1mol冰醋酸中，将CII的终浓度调整至4mg/mL，避光4℃过夜充分溶解。次日将溶解的CII与弗氏完全佐剂等体积混合，使二者充分乳化，获得终浓度为2mg/mL胶原乳剂。初次免疫：去除小鼠尾部毛发，皮内多点注射总量为200μg的胶原乳剂，记为免疫第0天；加强免疫：免疫第21天，按照同样的溶解方式获得CII溶液，将CII溶液与弗氏不完全佐剂充分乳化，在小鼠尾部多点皮内注射总量100μg的胶原乳剂。加强免疫后5天后小鼠陆续发病，14天达到高峰期，获得CIA小鼠。

3、自体抗原多肽的刺激以及特异性T细胞的增殖培养

CIA小鼠经CO₂安乐死后，暴露小鼠腹腔获取脾脏组织以及引流淋巴结放入含有1640培养基的培养皿置于冰上，将脾脏剪碎后研磨在70μm滤网过滤后获得单细胞悬液，一只小鼠的脾脏使用3mL的1×裂红液进行裂红，3倍体积的PBS中和后1800rpm、5min离心，细胞计数后将细胞按照1×10⁷/mL培养。培养体系加入10μg/mLCII多肽用于后续的抗原特异性T细胞疫苗，而不加抗原多肽直接培养组用作非抗原特异性T细胞疫苗用于对照。培养基的组成均由RPIM 1640+10％FBS+5mM HEPES+2mM L-谷氨酰胺+0.05mM巯基乙醇+100U/mL青霉素与链霉素+ng/mL的IL-15和IL-7。培养七天过程中隔日观察培养基的颜色和T细胞疫苗增殖的密度；

培养第7天加入抗原提呈细胞：

抗原提呈细胞为滋养层细胞或成熟DC细胞。

其中滋养层细胞的制备方法如下：将CIA小鼠的脾脏取出，裂红获得单细胞悬液；按照5×10⁷/mL添加培养基(以RPIM1640为基础培养基，还包括以下含量的组分：体积百分含量的10％FBS、5mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺、0.05mM巯基乙醇、100U/mL链霉素与青霉素)，使用50μg/mL丝裂霉素处理30min，随后清洗三遍，获得滋养层细胞；

DC细胞的制备方法如下：通过提前获得小鼠骨髓细胞后裂红经过25ng/mL GM-CSF与10ng/mL IL-4分化7天DC细胞；通过1μg/mL LPS诱导两天获得成熟DC，再经过50μg/mL丝裂霉素处理30min，随后清洗三遍，获得DC细胞。

将20μg/mL CII多肽与抗原提呈细胞在敷箱中共孵育12小时后，按照T细胞疫苗和抗原提呈细胞的数量比为2:1加入T细胞疫苗进行共培养，培养密度为0.5×10⁷/mL；

培养第8天加入终浓度为5～10ng/mLIL-15和IL-7。

培养第13天在该培养体系中加入终浓度为20ng/mL的IL-2和5μg/mL PHA。隔日观察培养基的颜色和细胞密度，在此阶段细胞会快速扩增，如有需要添加适量培养基；培养第16天，将细胞收集，使用25μg/mL丝裂霉素处理半小时，清洗三遍后，采用Stemcell CD4⁺分离磁珠(货号18952)进行分离，获得CD4⁺T细胞；生理盐水重悬成2×10⁷/mL的细胞悬液，得到抗原特异性T细胞疫苗。

以上培养的全过程的流程图在图3中A中展示，通过流式细胞术验证分离的纯度图3中B，并且检测其中含有的CD4⁺T细胞的效应/记忆细胞的比例图3中C，以及细胞的形态都做了相关检测图3中D。

实施例3

抗原特异性T细胞疫苗的有效性实验。

将实施例1制备的抗原特异性T细胞疫苗(CD4⁺T细胞)进行细胞计数，按照每孔加入4×10⁵/400μL个CD4⁺T细胞作为TCV单独孔，4×10⁵/400μLPBMC作为PBMC孔，同时设置以下实验组，CD4⁺T细胞：PBMC的数量比分别为1：1、1：2和1：4，实验组CD4⁺T细胞浓度为4×10⁵/400μL。

培养48小时后，检测以下指标：

(1)检测不同处理组中各个T细胞亚群变化，包括Th1/Th2/Th17/Treg；在培养48小时收细胞前进行PMA和离子霉素联合刺激4小时后进行破膜染色(ebioscience，货号88-8824-00)Treg进行破核染色(ebioscience，货号00-5523-00)。染色的抗体如表1所示。

表1染色的抗体

marker	品牌	货号
			PE-Cy7-CD4	Biolegend	300512
BV421-IL17A	Biolegend	512321
			FITC-IFNγ	Invitrogen	4S.B3
PE-IL-4	Invitrogen	2247540
			PE-Foxp3	Invitrogen	12-4777-4290
BV506-FVD	Invitrogen	65-0866-14

(2)检测上清中的炎性细胞因子变化，主要检测IFNγ、IL-17、IL-6、试剂盒购买欣博盛公司的试剂盒，参考试剂盒说明书进行。

结果

(1)不同免疫细胞的染色方案：

Th1(CD4⁺IFNγ⁺)、Th2(CD4⁺IL-4⁺)、Th17(CD4⁺IL^-17A⁺)、

Treg(CD4⁺Foxp3⁺)。

检测几类细胞亚群结果见图4中A。与PBMC单独培养组相比，实验组中Treg细胞比例升高。

(2)检测上清中的细胞因子结果见图4中B。与PBMC组单独培养相比相比，实验组培养上清中IFNγ显著减少。

实施例4

抗原特异性T细胞疫苗治疗类风湿关节炎的动物实验

按照实施例2的方法一共构建60只CIA造模小鼠，于加强免疫第五天后从中挑选评分一致(1～3分)小鼠随机入组：a.生理盐水对照组：b.非特异性T细胞疫苗治疗组；c.抗原特异性T细胞疫苗治疗组；皮下注射200μl生理盐水或者2×10⁶细胞，在入组小鼠的第1、7、14天治疗三次；在加强免疫的第21天牺牲小鼠，检测以下指标：

(1)每日监测一次小鼠关节肿胀情况，并进行评分，评分由2名实验人员同时独立进行，取两人评分的平均值作为最终评分。评分关节包括小鼠的前后肢共四个足关节，每个关节评分标准如下：肿胀脚趾少于2个为1分，多于2个为2分，脚掌肿胀为1分，脚踝肿胀为1分。每个关节最高4分，每只小鼠最高16分。

结果见图5。监测记录小鼠疾病评分，结果显示，与生理盐水组相比，T细胞疫苗整体有治疗效果；经过抗原刺激扩增获得的抗原特异性T细胞疫苗治疗效果显著优于非特异的T细胞疫苗。

(2)关节炎炎症

关节影像学和组织病理学指标，进行骨破坏的定性和定量的评价

利用小动物MicroCT检测治疗组与对照组关节炎小鼠关节的骨侵蚀与骨破坏。如图6所示，抗原特异性T细胞疫苗与未经抗原刺激的T细胞疫苗以及生理盐水组相比，骨侵蚀与骨破坏情况显著减轻，展现出良好的治疗效果。

(3)利用流式细胞术对不同处理组小鼠免疫亚群进行监测

将对照组和实验组模型小鼠的淋巴结分别置于1640含血清培养基中，滤网研磨，制成单细胞悬液，全部用于流式检测。脾脏置于含血清1640培养基中，用滤网研磨，制成单细胞悬液。加红细胞裂解液2ml，室温放置7min。常温，1600rpm，离心5min，弃上清。PBS缓冲液洗涤2次，离心后留沉淀，PBS重悬后细胞计数，调整细胞数量为2～3×10⁶/100μl，待用。流式检测方法如下：采用流式细胞术检测Th1/2/17，Treg等免疫细胞亚群的变化。具体染色步骤如下：

Th1/2/17：Th1(CD4⁺IFN-γ⁺)，Th2(CD4⁺IL-4⁺)，Th17(CD4⁺IL-17A⁺)

1)刺激：每个样本加入刺激液1ml(离子霉素1μg/ml，BFA 10μg/ml，PMA50ng/ml，溶解于1640无血清无双抗培养基)；37℃，避光刺激5h；

2)染色：表面染色—加入表面抗原染色标记(CD4-FITC，1:50)，4℃，避光，孵育30min。进行胞内染色前先破膜，之后加入胞内抗原染色标记(IL-17A-BV421，1:50；IFN-γ-PE，1:50：IL-4-APC，1:50)，4℃，避光，孵育30min。

3)检测：洗涤，离心，200μLPBS缓冲液重悬，送流式细胞仪检测。

Tfh：CD4⁺CD44⁺PD-1⁺CXCR5⁺Bcl-6⁺Foxp3^-；

Treg：CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺。

1)封闭：每个样本中加入CD16/CD32(即FcR的阻断单抗)，1:200；

2)染色：加入表面抗原染色标记(1:200或1:100)，室温，避光，摇床孵育40min；表面染色第二层：加入SA-BV711(1:100)，室温，避光，摇床孵育30min；破膜后胞内染色：加入胞内抗原染色标记(1:50)，4℃，避光孵育30min。

3)检测：洗涤，离心，200μLPBS缓冲液重悬，上机检测。

Th1与Th17是类风湿关节炎中重要的致病细胞亚群，通过分泌细胞因子影响破骨细胞等；Tfh与GCB是通过影响自身抗体产生影响疾病进展。实验结果表明，抗原特异性T细胞疫苗治疗后，Th1/Th17减少，Treg升高(图7、图8)。这说明抗原特异性T细胞疫苗能有效通过抑制致病细胞亚群达到治疗类风湿关节炎的作用。

实施例5

Treg是抗原特异性T细胞疫苗发挥治疗作用的关键细胞亚群。

根据文献调研，治疗性细胞疫苗中Treg是主要被影响的细胞亚群，而这群细胞在RA中也扮演重要角色。因此，本实施例经抗原特异性T细胞疫苗治疗关节炎小鼠，流式细胞术分析治疗后小鼠淋巴结与脾脏中Treg细胞数量和相关抑制分子的表达情况。

结果表明，经抗原特异性T细胞疫苗治疗后Treg细胞明显增多，并且上调细胞表面相关抑制分子的表达(图9中A和B)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种类风湿关节炎自身抗原表位多肽，其特征在于，所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的N端谷氨酰胺替换为D型谷氨酰胺，所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的N端进行乙酰胺化修饰，同时所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的C端进行酰胺修饰。

2.一种抗原特异性T细胞疫苗，其特征在于，类风湿性关节炎样本来源的脾细胞经权利要求1所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽刺激后灭活分离得到。

3.根据权利要求2所述抗原特异性T细胞疫苗，其特征在于，所述抗原特异性T细胞疫苗为灭活的抗原特异CD4⁺T细胞。

4.权利要求2或3所述抗原特异性T细胞疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将类风湿性关节炎样本来源的脾细胞或外周PBMC细胞在含权利要求1所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的培养基中培养7天，与捕获有所述类风湿关节炎自身抗原表位多肽的抗原提呈细胞共培养3d，培养第8天用加入IL-7和IL-15培养，培养第13天加入IL-2和PHA培养，培养第16天收集细胞，灭活细胞，分离抗原特异性CD4⁺T细胞。

5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述培养基以RPIM1640为基础培养基，还包括以下含量的组分：体积百分含量的10％FBS、5mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺、0.05mM巯基乙醇、100U/mL链霉素与青霉素5～10ng/mL的IL-15和IL-7；

所述培养基中，所述自身抗原的浓度为5～50μg/mL。

6.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述类风湿性关节炎样本来源的脾细胞的浓度为(1～10)×10⁷/mL。

7.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述捕获自身抗原的抗原提呈细胞的制备方法，将5～50μg/mL类风湿关节炎自身抗原表位多肽溶液与抗原提呈细胞进行共孵育；

所述抗原提呈细胞的浓度为(1～10)×10⁶/mL；

所述抗原提呈细胞包括滋养层细胞或成熟的树突状细胞；

8.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述IL-7和IL-15的终浓度为5～20ng/mL；

所述IL-2的终浓度为5～20ng/mL；

所述PHA的终浓度为1～10μg/mL。

9.根据权利要求4～8任意一项所述制备方法，其特征在于，所述灭活细胞的方法为用20～50μg/mL丝裂霉素处理30min～60min；

10.权利要求1或2所述抗原特异性T细胞疫苗或权利要求3～9任意一项所述制备方法得到的抗原特异性T细胞疫苗在制备预防和/或治疗类风湿关节炎的药物中的应用。