CN115785206B - 肺癌特异性分子靶标07及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新颖的肺癌特异性分子靶标07及其用途。将特异性分子靶标与受试者自体免疫细胞共培养，回输受试者体内后针对性杀伤肿瘤细胞，可以实现治疗肿瘤的目的。经本发明的分子靶标活化的DC细胞经分子靶标单抗检测，其负载阳性率大于90％。进一步地，且被活化的DC细胞上高表达CD80、CD86，并呈递至T淋巴细胞，成为特异性的识别肺癌细胞的CTL或MCTL细胞。临床治疗效果表明，MCTL单用、MCTL与化疗药物联用治疗肺癌的PR、CR及客观缓解率均优于单用化疗药物，其差异具有统计学意义。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学领域，特别涉及一种新颖肺癌特异性分子靶标及其用途。
背景技术
恶性肿瘤是严重影响人类健康、威胁人类生命的主要疾病之一。其早期诊断、及时治疗非常重要。近20年医学诊断技术发展非常迅速，新的诊断方法不断涌现，不仅可以发现小到0.5-1.0厘米的肿瘤，而且可以对肿瘤的范围做出正确的判断，尽管如此，医生也仅能对中晚期癌症做出临床诊断。
目前肿瘤的诊断主要依靠查体、影像学、病理学以及相关实验室检测。查体是肿瘤诊断的重要部分，在全面、系统检查基础上，结合病史进行重点器官的局部检查。随着医疗诊断技术的发展和诊断仪器的更新，各种影像学检查对肿瘤的诊断也起着重要作用。包括X线透视、摄片、造影、断层扫描，超声波检查，放射性核素扫描以及选择性血管造影等等，主要可为肿瘤提供确切的定位诊断。实验室检查对肿瘤有重要的辅助诊断的作用，包括酶学检查和免疫学检查。免疫学检查是基于癌细胞的新陈代谢与化学组成都和正常细胞不同，可以出现新的抗原物质，如原发性肝癌病人血清中出现的甲种胎儿球蛋白(AFP)、结肠癌的血清癌胚抗原(CEA)、胃癌的胃液硫糖蛋白(FSA)、胃癌相关抗原(GCAA)、а2糖蛋白(а2GP)等。
手术治疗、放疗、化疗是肿瘤常规治疗手段，但肿瘤的转移和复发问题很难突破。对于手术而言，局部治疗彻底，但创伤性较大，对微小病灶和转移病灶无效，术后复发或转移率很高。大约70％的肿瘤患者发现肿瘤时失去手术机会；60％以上患者会在术后2-5年内复发。对于放化疗而言，术后应用放化疗可以减少患者复发率，但由于其毒副反应无法耐受限制了其临床应用；过度的放化疗，损伤并摧毁了患者的免疫系统，加速了肿瘤患者死亡。
目前，细胞免疫治疗成为新兴肿瘤治疗方案，其是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外分选、诱导、培养和扩增后再回输到病人体内，直接作用于肿瘤细胞或通过激发、增强机体自身免疫功能达到治疗肿瘤的目的。然而，尽管肿瘤细胞免疫治疗已经被公认是继三大传统肿瘤治疗之后的第四种疗法，但其仍存在肿瘤特异性抗原少这一不容忽视的问题。
DC-CIK细胞技术中对树突状细胞(DC细胞)进行抗原负载，所使用的抗原绝大部分是肿瘤组织裂解物、肿瘤细胞系或国内外报道的抗原。这些抗原存在的最大的问题就是没有进行特异性的筛选，即没有在正常组织库和肿瘤组织库上进行特异性筛选。另一方面，这些抗原之间存在交叉反应，特异性差，很难使DC细胞在体外高效扩增并成熟，进而很难诱导出特异性的CTL。
另外，细胞免疫治疗也存在准备周期长这一缺陷。这是因为，前期需要对个体肿瘤细胞中全基因进行测序分析、找到突变位点后，合成相应抗原，再进行DC细胞的培养及回输。该治疗方案具有很高的特异性，但基因测序、由基因翻译合成蛋白需要经历很长时间，从检测开始到培养出合格的DC细胞大约要经过1-2个月，临床应用中患者等待时间较长。
随着分子生物学和免疫学的不断深入研究，研究者已经认识到肿瘤的检测与治疗已上升到了抗原表位肽水平，安全有效的多靶点、高特异性、个体化肿瘤靶向治疗技术正在成为肿瘤治疗的主要方向。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明提供了一种肺癌特异性肺癌多肽或寡肽，该多肽或寡肽能够刺激并活化抗原呈递细胞(APC)，使得APC细胞呈递针对肺癌的特异性抗原，进而有机体能够产生特异性靶向肺癌细胞的免疫细胞，实现特异性细胞免疫治疗。
为了提供肺癌特异性寡肽或多肽，本发明的发明人进行了坚持不懈地筛选、鉴定和功效验证。具体地，本发明的发明人进行了如下操作。将肺癌患者的血清进行富集和纯化。然后，对富集和纯化的血清进行质谱检测并筛选、鉴定出针对肺癌的特异性寡肽或多肽。进一步地，本发明的发明人将肿瘤患者血清水解获得肽段，经超高效液相和质谱获知所述肽段的氨基酸序列；将所述氨基酸序列与肽库进行比对，挑选出与肽库中阴性组织不表达、仅该肺癌组织表达的肽段即为分子靶标，其中所述的阴性组织为非肺癌组织，例如为正常组织及其他种类的肿瘤组织，例如肺癌组织、胃癌组织、结直肠癌组织。
因此，本发明提供了一种多肽，其包含如下的氨基酸序列：LLDAGFAV(SEQ ID NO：7)。示例性地，所述多肽由SEQ ID NO：7的氨基酸序列组成。
优选地，本发明的多肽能够与MHC(主要组织相容性复合物)结合并形成复合物多肽-MHC。示例性地，本发明的多肽能够与HLA分子结合并形成复合物多肽-HLA。进一步地，所述复合物能够被T细胞识别。优选地，所述MHC或者HLA是存在于抗原呈递细胞(APC)上的。
LLDAGFAV(SEQ ID NO：7)具有8个氨基酸残基。因此，应当理解的是，本发明的多肽应当允许具有其结合MHCI或MHCII分子的长度，例如8至45、8至40、8至35、8至30、或8至25个氨基酸的长度。例如，所述多肽可以由8至18、8至19、8至20、8至18、8至17、8至16、8至15、8至14、8至13、8至12、8至11、8至10、8至9个氨基酸残基组成。理论上，与MHC分子结合的抗原肽可以更长，因为更长的多肽中含有与MHC结合的基序部分，基序之外的其他氨基酸片段位于结合区域的两侧或一侧。
本发明还提供了一种融合蛋白，其包含本发明的多肽。由于本发明的目的之一在于将本发明的多肽在APC上呈递，并进一步刺激或诱导产生CTL。因此，融合蛋白的长度不宜过长，因为过长的融合蛋白仍将被酶切后才能被呈递至APC。因此，示例性地，所述融合蛋白的长度不超过100Aa，例如45-100，45-80，45-60，45-55Aa等等。
本发明还提供了一种复合物，其包含MHC或HLA，以及本发明的多肽或融合蛋白。
本发明还提供了一种刺激和活化APC细胞的方法，其包括将本发明的多肽和待活化的APC细胞接触的步骤，进而使得所述APC细胞负载作为分子靶标的多肽。
本发明还提供了一种分离的活化的APC细胞，所述细胞表面呈递本发明的多肽或其复合物，多肽-HLA复合物或多肽-MHC复合物。示例性地，所述分离的APC是通过将本发明中作为分子靶标的多肽和待活化的APC细胞接触并培养而得。
由于本发明的多肽是肿瘤(肺癌)特异性抗原，因此，本发明还涉及能特异性结合本发明多肽的分子(例如抗体)，以用于检测受试者血液中的肿瘤(肺癌)特异性抗原，用于诊断目的，或用于治疗目的。
因此，本发明还提供了一种检测受试者患有肺癌风险的方法，其中所述方法包括受试者的血液或血清与所述特异性结合本发明多肽的分子(例如抗体)接触的步骤，例如通过ELISA方法。
本发明还提供了一种检测受试者患有肺癌风险的检测试剂，其包含所述特异性结合本发明多肽的分子(例如抗体)。
本发明还提供了一种能够结合本发明多肽或其复合物的T细胞受体(TCR)。
本发明还提供了本发明的多肽、融合蛋白、复合物或串联多肽的用途，用于活化免疫细胞，例如APC细胞或T细胞。
本发明还提供了本发明的多肽、融合蛋白、复合物、串联多肽的用途，例如用于制备预防或治疗癌症(例如肺癌)的药物。
本发明还提供了一种药物组合物或药物，所述组合物或药物含有药学上可接受的载体以及本发明所述的肽、复合物、融合蛋白、串联多肽、分离的细胞(例如APC或T细胞)。
示例性地，所述药物或者所述药物组合物为疫苗。
本发明还提供了一种预防或治疗疾病(例如肺癌)的方法，包括给需要的对象施用有效量的本发明所述的多肽、复合物、融合蛋白、串联多肽、或本发明所述的细胞。
本发明还提供了一种特异性针对肺癌的细胞毒性T细胞(CTL)，其包括将本发明的负载了分子靶标的APC细胞与T细胞共培养，进而得到特异性靶向肺癌的细胞毒性T细胞(CTL)。
本发明还提供了细胞组合物，其包括本发明活化的APC细胞和T细胞或CTL细胞。
本发明还提供了另外一种细胞组合物，其包括本发明活化的APC细胞和CIK细胞。
由于本发明活化的APC细胞能够呈递肺癌特异性分子靶标，因此，其能够作为针对肺癌的治疗性或者预防性疫苗。因此，本发明还提供了一种针对肺癌的治疗性或者预防性疫苗，其包括本发明所述的肽、复合物、融合蛋白、串联多肽、分离的细胞(例如活化的APC细胞)，以及任选的佐剂，例如偶联至KLH和/或与免疫佐剂GM-CSF组合。
进一步地，本发明还提供了一种预防或者治疗肺癌的方法，其包括将本发明的疫苗施用至受试者体内。
为躲避有机体免疫系统对其攻击，癌细胞通常会发生基因突变并进化出新的功能，进而产生耐药性。为了防止癌细胞针对单一的分子靶标产生的“逃逸”，可以考虑增加分子靶标，以提高疗效。基于此，本发明提供了将本发明的针对肺癌的分子靶标与其他的针对肺癌的分子靶标进行联合的多靶标解决方案。
具体地，本发明的分子靶标可以与选自如下组的肺癌特异性分子靶标中的一个或多个进行组合，以用于肺癌的预防和治疗，其中所述的组由如下多肽组成：
含有AETTGLIKL(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的多肽；
含有LESLAVIL(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列的多肽；
含有EVLSIMGVY(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列的多肽；
含有FLLSGLGGL(SEQ ID NO：4)的氨基酸序列的多肽；
含有GEFLAFQTVHL(SEQ ID NO：5)的氨基酸序列的多肽；
含有IANITTVW(SEQ ID NO：6)的氨基酸序列的多肽；
含有RSSSLPSW(SEQ ID NO：8)的氨基酸序列的多肽；
含有SLSEVVVPM(SEQ ID NO：9)的氨基酸序列的多肽；
含有YLCSGSSYFVL(SEQ ID NO：10)的氨基酸序列的多肽。
因此，本发明提供了一种多肽组合，其包含含有SEQ ID NO：7的多肽以及由含有SEQ ID NOs：1、2、3、4、5、6、8、9或10的多肽组成的组中任1种、任2种、任3种、任4种、任5种、任6种、任7种、任8种或任9种。示例性地，本发明的多肽组合包含含有SEQ ID NO：7的多肽以及含有SEQ ID NOs：8的多肽的组合；含有SEQ ID NO：7的多肽以及含有SEQ ID NOs：9的多肽的组合；含有SEQ ID NO：7的多肽以及含有SEQ ID NOs：10的多肽的组合。进一步示例性地，本发明的多肽组合包含SEQ ID NO：7和SEQ ID NOs：1-6、8-10中的任一个，例如SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8的组合，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9的组合，SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：10的组合等等。
本发明还提供了一种串联多肽，所述串联多肽包含SEQ ID NOs：1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的多肽组成的组中任2种、任3种、任4种、任5种、任6种、任7种、任8种或任9种，或含有1种多肽的至少两个重复单元，例如2、3、4、5、6、7、8或9个SEQ ID NO：7串联在一起。该串联多肽中相邻多肽之间可以直接相连，或通过连接子相连。
进一步地，本发明还提供了一种刺激和活化APC细胞的方法，其包括将本发明的多肽、多肽组合或串联多肽和待活化的APC细胞接触的步骤，进而使得所述APC细胞负载作为分子靶标的多肽或多肽组合。
本发明还提供了一种活化的APC细胞，其是通过将本发明中作为分子靶标的多肽、多肽组合或串联多肽和待活化的APC细胞接触并培养而得。
本发明还提供了一种特异性针对肺癌的细胞毒性T细胞(CTL)，其包括将本发明的负载了单一分子靶标或分子靶标组合(多分子靶标)的APC细胞与淋巴细胞共培养，进而得到特异性靶向肺癌的单靶点细胞毒性T细胞或多靶点细胞毒性T细胞(MCTL)。
本发明还提供了细胞组合物，其包括本发明中单分子靶标活化的或多分子靶标活化的APC细胞和免疫细胞。
本发明还提供了另外一种细胞组合物，其包括本发明单分子靶标活化的或者多分子靶标活化的APC细胞和CIK细胞。
同样的，由于本发明单分子靶标活化的或多分子靶标活化的APC细胞能够呈递肺癌特异性分子靶标，因此，其能够作为针对肺癌的治疗性或者预防性疫苗。因此，本发明还提供了一种针对肺癌的治疗性或者预防性疫苗，其包括本发明单分子靶标或多分子靶标，或包括单分子靶标活化的或多分子靶标活化的APC细胞。
进一步地，本发明还提供了一种预防或者治疗肺癌的方法，其包括将多分子靶标活化的本发明的APC细胞或本发明的细胞组合物施用至受试者体内。
事实上，基于本发明的多肽及其相关复合物、融合蛋白、串联蛋白、细胞等，本领域技术人员可以将其应用于各个方面。示例性地，可以将本发明的复合物用于筛选与其结合的TCR，其步骤包括：
(i)将候选TCR分子与本发明所述多肽-MHC复合物接触；
(ii)筛选出与(i)中多肽-MHC复合物结合的TCR分子。
由于本发明中针对肺癌的分子靶标是经过大量的筛选并进行了统计分析获得的，因此其针对肺癌具有极其显著的代表性。因此，本发明对于肺癌的治疗或者预防具有操作简便、治疗周期短、治疗效果突出的明显优势。
与DC-CIK技术相比，本发明具有特异性高、靶向性强的特点。DC-CIK利用肿瘤相关抗原如肿瘤细胞裂解物、组织匀浆等刺激APC细胞，这些相关抗原没有经过组织库筛选与正常组织、炎性组织等存在交叉反应，且这些抗原是全蛋白，直接影响DC的提呈效率。CTL或MCTL应用经靶标肽库筛选的小分子多肽抗原，精准定位肿瘤细胞，同时这些小分子多肽符合APC细胞对抗原的提呈要求，大大提高了提呈效率，加强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
本发明成功筛选、鉴定并验证出受试者体内的肿瘤特异性抗原(分子靶标)，体外合成治疗性靶标，并与受试者自体免疫细胞共培养，回输受试者体内后针对性杀伤肿瘤细胞，实现治疗肿瘤的目的。
在本发明的具体实施方式中，经本发明的分子靶标活化的DC细胞经靶标单抗检测，其负载阳性率大于90％。进一步地，且被活化的DC细胞上高表达CD80、CD86，并呈递T淋巴细胞，成为特异性的识别肺癌细胞的CTL或MCTL细胞。临床治疗效果表明，MCTL单用、MCTL与化疗药物联用治疗肺癌的PR、CR及客观缓解率均优于单用化疗药物，其差异具有统计学意义。
本发明所述治疗性疫苗与受试者自体免疫细胞共培养，精准定位和多靶点直接杀伤肿瘤细胞，且通过作用于免疫系统，增强机体的免疫应答，最终延长患者生存期，提高生存质量。
定义：
治疗性疫苗：在感染病原微生物或患有某些疾病的机体中，通过诱导特异性的免疫应答，达到治疗或防止疾病恶化的天然、人工合成或用基因重组技术表达的生物制品。
MCTL(Multi-target Cytotoxic T Lymphocyte)：多靶点细胞毒性T细胞
CTL(Cytotoxic T Lymphocyte):细胞毒性T细胞
DC-SCT(Specific Cluster Target of Dendritic Cell)：特异性树突状细胞集群靶标
DC(Dendritic Cell)：树突状细胞
CIK(Cytokine-Induced Killer)：细胞因子诱导的杀伤细胞
PBMC(Peripheral blood mononuclear cell)：外周血单个核细胞
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。在此不再一一累述。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1是加入和未加入SEQ ID NO：7多肽FACS结果，其中：a代表加入多肽的CD80流式细胞结果图；b代表加入多肽的CD86流式细胞结果图；c代表未加入多肽的CD80流式细胞结果图；d代表未加入多肽的CD86流式细胞结果图。
图2是MCTL多肽刺激淋巴细胞增殖结果，其中A和B：各组淋巴细胞在不同时间点450nm吸光度。
图3是不同时间点各组CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤效率，其中：A代表不同靶/效细胞比共孵育18小时，各组CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤效率；B代表不同靶/效细胞比共孵育24小时，各组CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。
图4是肿瘤细胞增殖能力分析结果。
图5是细胞因子IL-2水平分析结果。
图6是细胞因子IFN-r水平分析结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
应当理解，在本发明中寡肽和多肽是可以替换的，因为对于本领域技术人员而言寡肽和多肽并没有一个严格区分的界限。
可以显而易见理解的是，本发明涵盖了多肽的变体，例如在SEQ ID NO:1-10中的任一序列中具有1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列。
示例性地，所述取代是指在相同位置，某个氨基酸残基被其他氨基酸残基替代，优选地为相同性质的氨基酸之间的替换，例如疏水性氨基酸之间的替换。插入的氨基酸残基可以在任何位置插入，插入的氨基酸残基也可以全部或部分相邻，或插入的氨基酸之间均不相邻。氨基酸缺失可以是在任何位置删除1、2或3个氨基酸残基，优选地删除1个或2个氨基酸残基。
进一步示例性地，取代可以发生在任何氨基酸之间。保守氨基酸取代是优选的。术语“保守氨基酸取代”是指氨基酸残基被具有相似性质的侧链的另一个氨基酸残基取代。根据侧链，将氨基酸残基划分为多个家族。侧链的实例包括：碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸和谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸)、非极性侧链(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和色氨酸)、β-支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)、脂肪族侧链(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸和苏氨酸)、芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)、酰胺侧链(例如天冬酰胺和谷氨酰胺)、以及含硫的侧链(例如半胱氨酸和蛋氨酸)。保守氨基酸取代优选是在相同家族内的氨基酸残基之间的取代。保守氨基酸取代的实例包括谷氨酸残基取代为天冬氨酸残基、苯丙氨酸残基取代为酪氨酸残基、亮氨酸残基取代为异亮氨酸残基、异亮氨酸残基取代为缬氨酸残基、丙氨酸残基取代为丝氨酸残基以及组氨酸残基取代为精氨酸残基。
对于多肽的变体，可以验证该变体是否为活性变体。例如可以将变体多肽与APC(例如DC细胞)接触，然后对APC细胞进行靶标单抗检测，如APC细胞上高表达CD80、CD86，则该变体是活性变体。
本发明还涵盖了串联多肽，例如所述的串联多肽包含了SEQ ID NOs:1-10或其变体中的两种或两种以上，或一种多肽的至少2个重复单元。需要注意的是，为了在APC上呈递肿瘤特异性抗原，本发明的多肽可以以串联多肽的形式与APC接触。
本领域技术人员已知，本发明所述的多肽可以在氨基酸序列之间的一个或多个位置进行翻译后修饰，例如乙酰化、磷酸化等。进一步地，可以将多肽进行人工修饰，例如对其氨基酸残基替换为氨基酸类似物或模拟物。更进一步地，可以将一种或多种物质，例如氨基酸、肽及其类似物添加到多肽的N末端和/或C末端。例如，可以添加组氨酸标签，或者可以与蛋白质一起形成融合蛋白。也可以将可检测标记结合至多肽。当这种物质与多肽结合时，该物质可以例如用生物酶或通过细胞内加工而被加工，以产生多肽。此类物质可以调节多肽的溶解度，改善肽的稳定性(例如蛋白酶抗性)，允许将多肽特异性地递送至所期望的组织或器官，或增强抗原呈递细胞对多肽的摄取。这样的物质也可以是增加肽诱导CTL的能力的物质，例如，另一种激活T细胞的肽。
本领域技术人员公知，抗原呈递细胞内通过蛋白酶将肿瘤抗原酶解成为多肽片段，并与主要组织相容性复合物(MHC)结合形成多肽-MHC复合物，并呈递至APC细胞表面。多肽-MHC复合物进一步与淋巴细胞表面结合，刺激并活化该淋巴细胞成为细胞毒性T细胞(CTL)。
因此，本发明的提供了一种多肽-MHC复合物，所述复合物中包含本发明所述的多肽或其变体。所述MHC分子可以是MHC I类分子或MHCⅡ类分子。在一个优选的实施方式中，所述MHC分子是HLA-A、HLA-B和HLA-C，或是HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP。进一步地，MHC分子也可以是MHC III类分子。
本发明还提供了与上述多肽、串联多肽或复合物结合的分子及细胞。
产生本发明多肽-MHC复合物的方法是本领域技术人员已知的，例如将多肽与HLA分子结合。
本发明的多肽-MHC复合物可以用于筛选或检测与其结合的分子，如T细胞受体(TCR)。
在细胞免疫过程中，抗原通常与MHC复合物一起递呈到细胞表面。因此，本发明还提供了一种分离的细胞，所述细胞能够递呈本发明的多肽或多肽-MHC复合物到其表面。示例性地，所述细胞为免疫细胞，例如APC，例如DC(树突细胞)，或B细胞，或T2细胞。优选地，呈递本发明所述的多肽或多肽-MHC复合物的细胞是分离的。所述细胞可以不是天然递呈本发明所述的复合物的。递呈本发明所述多肽-MHC复合物的细胞可用于分离T细胞和T细胞受体，所述T细胞由所述多肽或复合物激活并进一步被分选出来，体外增殖后用于回输受试者体内。
在一个具体的实施方式中，获得分离的T细胞的方法包括用本发明多肽或多肽-MHC复合物或呈递其的细胞接触T细胞。利用标记抗体，激活的T细胞可以通过流式细胞仪(FACS)进行分选，分选的细胞可以体外增殖培养。
本发明还提供了核酸分子，所述核酸分子包括编码本发明的多肽、多肽变体、串联多肽，例如cDNA。所述核酸可以通过本领域已知的人工合成方法合成。由于遗传密码的简并性，本领域技术人员应理解，不同核酸序列可以编码相同的氨基酸序列。
基于上述核酸，本发明还提供了载体。该载体中包括本发明所述的核酸序列。示例性地，所述载体是表达载体，例如质粒、噬菌体、病毒等。合适的噬菌体和病毒载体包λ-噬菌体，EMBL噬菌体、猿猴病毒、牛疣病毒、Epstein-Barr病毒、溶瘤病毒、小鼠肉瘤病毒、鼠类乳癌病毒、慢病毒等。
本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞中包括本发明所述的载体或核酸，此类细胞可以是哺乳动物细胞，表达本发明的肽。
本发明还提供了一种分子(例如TCR和抗体)，所述分子可以用来作为免疫治疗剂或诊断试剂。该分子可以和肽结合，或与肽和MHC分子形成的复合物结合。
本发明的TCR可以是本领域已知的任何形式，例如，异二聚体，或以单链。
本发明中，“抗体”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特异性结合位点的分子，其可以全天然、或部分人工合成、或全部人工合成。术语“抗体”包括抗体片段、其衍生物、功能性等效物以及同源抗体、人源化抗体，所述抗体片段包括免疫球蛋白结合区，所述结合区是抗体结合区或与抗体结合区同源。其可以全天然、或部分人工合成、或全部人工合成。人源化抗体可以是修饰的抗体，其含有非人抗体的可变区(例如，小鼠)以及人抗体的恒定区。
抗体的例子可以是同型免疫球蛋白(例如IgG、IgE、IgM、IgD以及IgA)以及它们同型的亚类；片段包括抗原结合区，比如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；以及双链抗体。抗体可以是多抗或单抗，优选为单克隆抗体。
本发明中，TCR和抗体可以存在于细胞表面，如T细胞表面。因此本发明还提供了一种分离的T细胞，所述T细胞结合本发明的复合物。
本发明还提供了所述的多肽及其变体、多肽组合、多肽-MHC复合物、串联多肽、细胞、结合分子的用途，例如用于制备预防或治疗癌症的药物。
本发明还提供了一种药物组合物，所述组合物含有药学上可接受的载体以及所述的肽、多肽组合、多肽-MHC复合物、串联多肽、细胞、结合分子或细胞。
对于本发明所述药物组合物，其剂型可以是适用于任何适当的给药途径，如注射(包括皮下，肌肉，腹腔或静脉注射)、吸入或口服、或经鼻、或经肛门等途径。所述组合物可以通过药学领域已知的任何方法制备，例如在无菌条件下，通过将活性成分与载体或赋形剂混合。
本发明的多肽、多肽组合、串联多肽、复合物或细胞可以以疫苗组合物的形式提供。所述疫苗组合物可以用于治疗或预防癌症，其中所述疫苗组合物中可以进一步含有佐剂。
在本发明中，抗原提呈细胞(APC)例如选自单核细胞、单核细胞源性细胞、巨噬细胞、树突状细胞(DC)，优选为DC细胞。
所述抗原呈递细胞优选为树突细胞(DC)。
主要组织相容性复合物(MHC)是编码人类白细胞抗原(HLA)基因的基因复合物。HLA基因被表达为在人类细胞表面上展示给循环T细胞的蛋白质异二聚体。HLA基因是高度多态性的，允许其微调适应性免疫系统。
MHC分子有三类：MHC I、MHC II和MHC III。MHC I类分子由一条α重链和β-2-微球蛋白组成；MHC II类分子由一条α和一条β链组成。MHC分子结构中包含一个结合槽，用于与肽进行非共价相互作用；MHCⅢ主要编码补体成分，例如肿瘤坏死因子(TNF)和热休克蛋白70(HSP70)等。
大部分有核细胞上表达MHC-I类分子。他们主要呈递内源性的蛋白、缺陷核糖体产物(DRIP)和较大肽裂解生成的肽。然而，外源性来源的肽也经常在MHC-I类分子上发现。MHCII类分子主要发现于抗原呈递细胞(APC)上，并且主要呈递，例如，在内吞作用过程中由APC占据并且随后被加工的外源性或跨膜蛋白的肽。
肽和MHC I类的复合体由负载相应T细胞受体(TCR)的CD8阳性T细胞进行识别，而肽和MHC II类分子的复合体由负载相应TCR的CD4阳性辅助T细胞进行识别。
CD4+T辅助细胞在诱导和维持CD8阳性细胞毒性T细胞的有效反应中发挥重要作用。在肿瘤部位，T辅助细胞维持着对细胞毒性T细胞(CTL)有益的细胞因子环境并吸引效应细胞，如CTL、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞和粒细胞。
在没有炎症的情况下，MHC II类分子的表达主要局限于免疫系统细胞，尤其是抗原提呈细胞(APC)。在癌症患者的肿瘤细胞中发现有MHC II类分子的表达。
对于本发明的肽或变体，其可进一步修饰以提高稳定性和/或与MHC分子结合，从而引发更强的免疫反应。肽序列的改进方法是本领域内所熟知的，例如，反式肽键和非肽键的引入等。
术语“分离”表示一物质从其原来的环境(例如，如果是天然发生的则是天然环境)中被移走。例如，活体动物中的天然核苷酸或多肽不是分离的，但是，从天然系统中一些或所有共存物质中分离出来的核苷酸或多肽是分离的。此类多核苷酸可能是载体的一部分和/或此类多核苷酸和多肽可能是一种组合物的一部分，并且由于该载体或组合物不是其天然环境的一部分，因此它仍然是分离的。
本发明从外周血筛选并鉴定出肺癌受试者体内的阳性分子靶标，即肿瘤特异性抗原。将该阳性分子靶标与受试者的免疫细胞进行体外共培养后回输至受试者体内，进而对性地杀伤体内肿瘤细胞。
实施例1：筛选针对肺癌的特异性分子靶标
为筛选出针对肺癌的特异性分子靶标，进行如下操作。
(1)采集受试者血清后进行血清的富集、纯化、收集：
富集：向受试者血清添加等体积的富集细胞的溶液，混匀；
纯化：将混匀液加入Oasis Prime HLB SPE柱进行过滤纯化；
洗脱收集：过滤液完全通过后利用洗脱柱上吸附的靶标，各收集洗脱液约20μl。
(2)将处理好的血清样品进行液相质谱检测：当样品进入高效液相色谱后，经过色谱柱的有效分离，使不同物质按照时间先后次序依次进入质谱的离子源，进入离子源的被检测物质经过电离和碎裂后形成的各种带电分子依据质荷比不同会依次达到质谱检测器TOF，对检测器的信号进行分析，得到每个分子的分子量等具体数据。通过和靶标数据库进行比对，最终鉴定出了针对肺癌的特异性分子靶标。
AETTGLIKL(SEQ ID NO：1)；
LESLAVIL(SEQ ID NO：2)；
EVLSIMGVY(SEQ ID NO：3)；
FLLSGLGGL(SEQ ID NO：4)；
GEFLAFQTVHL(SEQ ID NO：5)；
IANITTVW(SEQ ID NO：6)；
LLDAGFAV(SEQ ID NO：7)；
RSSSLPSW(SEQ ID NO：8)；
SLSEVVVPM(SEQ ID NO：9)；
YLCSGSSYFVL(SEQ ID NO：10)。
(3)利用多肽合成平台进行目的靶标的合成、纯化得到治疗性分子靶标，用于下一步患者的治疗。
实施例2：细胞培养
按照临床采血要求采集80-120ml外周血，利用淋巴细胞分离液，通过密度梯度离心法将血液中的单个核细胞(PBMC)分离出来。根据PBMC计数结果，用培养液将细胞调整到约1×107个细胞/ml，接种至培养瓶中，每瓶接种10-15ml培养液，置二氧化碳培养箱孵育，37℃；5％CO2；孵育30min。
树突状细胞是通过收集PBMC培养瓶中贴壁细胞而制备的。同时，通过Ficoll-Paque密度梯度离心或磁性细胞分选法，从同一受试者分别制备T细胞。树突细胞用多肽培养，然后与T细胞混合培养，并回收T细胞。T细胞的激活或诱导可以例如通过T细胞的增殖活性或T细胞的细胞因子释放来确认。
具体而言，将收集的树突细胞加入含单个(SEQ ID Nos：1-10中任一个)或多个分子靶标(SEQ ID Nos：1-10)的DC细胞培养液，置二氧化碳培养箱中培养，37℃；5％CO2，其中单个肽的含量均为5μg/mL。
收获活化的DC细胞，将其加入到悬浮T细胞中培养，即获得单靶点杀伤性T细胞或多靶点杀伤性T细胞(MCTL细胞),并任选地将单靶点杀伤性T细胞或MCTL细胞进一步培养增殖。
实施例3：分子靶标对DC细胞的活化
采集人体外周血，提取PBMC细胞，用含自体血浆的RPM1640培养液在37℃、5％CO2条件下静置培养30min，贴壁法分离人体外周血DC细胞，移除非贴壁细胞。实验组用含靶标多肽的新鲜CellGenix树突细胞培养基，37℃及5％CO2进行DC细胞的培养，培养5天后，针对收获细胞进行流式检测。
分别针对10个单肽(5μg/mL)和10个肽的混合液(其中各肽的含量相同，5μg/mL)进行验证，同时设定对照组，对照组用不含靶标多肽的新鲜CellGenix树突细胞培养基，37℃及5％CO2进行DC细胞的培养，培养5天后，收获细胞进行流式检测。
结果表明：加入靶标后负载的DC细胞活化率提高，高表达CD80、CD86，未加靶标(对照)的DC细胞CD80、CD86表达低(见下表)。
表1：各分子靶标单独对于DC细胞的活化
示例性地，对于SEQ ID NO:7，其FACS结果如图1所示。
实施例4
4例肺癌患者提供外周血，完成以下研究。
人体外周血DC细胞分离及培养采用贴壁法，用含自体血浆的RPM1640培养液在37℃、5％CO2条件下静置培养PBMC，移除非贴壁细胞(用于后续CIK细胞培养)，贴壁细胞用含TNF-a、GM-CSF和IL-4的新鲜CellGenix树突细胞培养基，37℃及5％CO2培养，每2-3d补液并补充细胞因子。
向实验组DC细胞培养体系中加入混合肽(SEQ ID Nos：1-10)(MCTL肿瘤多肽),其中各肽的浓度均为5μg/mL。体外CIK细胞的培养，不加特异性MCTL肿瘤多肽，其余均同MCTL的培养。
外周血DC细胞培养5天后，按照DC:CIK＝1:8的比例进行混合后，继续培养≥3天后，进行淋巴细胞功能检测，其中：
实验组：DC细胞(经MTCL肿瘤多肽刺激)+CIK细胞联合培养(肽-DC-CIK)；
对照组1：DC细胞(无MTCL肿瘤多肽刺激)+CIK细胞联合培养(DC-CIK)；
对照组2：单纯CIK细胞(CIK)，
其中，(1)分别在第0d、2d、4d、6d，利用CCK-8法检测细胞增殖情况；(2)分别在18h、24h利用CCK8法检测不同组细胞对肿瘤细胞株的杀伤作用(靶效比1:10、10:20、1:30)。同时设单独效应细胞组和单独靶细胞组，每组设3个复孔。
实验结果如下：
(1)采用CCK-8法体外测量混合肽(MCTL多肽)对淋巴细胞增殖作用，测量时间点分别为0d、2d、4d、6d。结果如图2(A-B)所示，实验组与对照组均增殖明显，但混合肽组在d4(z＝-3.79,p<0.001)、d6(z＝-2.95,p<0.01)时，吸光度显著高于单纯CIK组，结果有统计学差异。提示混合肽可刺激淋巴细胞的增殖。(2)不同靶/效比例下，不同组的杀伤效率结果显示：观察实验组与对照组1、对照组2在18h与24h的杀伤效率，混合肽组显示出高于其他两个对照组的趋势，如图3A-B所示。
实施例5：体外评价多肽诱导的免疫细胞对肺腺癌细胞的杀伤功能及活性
选定5株肺腺癌细胞系(NCI-H2228、NCI-H522、HCC78、NCI-H23、NCI-H358)作为靶细胞，从细胞增殖、细胞因子、细胞凋亡三个方面评价根据实施例2所制备的MCTL细胞体外杀伤的活性。
结果显示：MCTL细胞对5株肺腺癌有杀伤作用，其中对NCI-H2228的杀伤效率最高，此外在效应细胞在与靶细胞共同作用时会释放Human IL-2和Human IFN-γ，未释放HumanIL-10。
肿瘤细胞增殖能力分析：将效应细胞与5种不同的靶细胞共同作用48h后，通过细胞增殖能力分析效应细胞对靶细胞的杀伤作用。结果如图4所示：在效靶比为40:1时，效应细胞对5株靶细胞均有杀伤作用；在效靶比20:1、10:1、5:1时，效应细胞对NCI-H2228、NCI-H358、HCC78这3株靶细胞具有杀伤作用，其中对NCI-H2228的杀伤效率最高。
细胞因子水平分析：将效应细胞与5种不同的靶细胞共同作用24h后，收获细胞培养上清检测Human IFN-r、Human IL-2、Human IL-10的含量，分析效应细胞的杀伤功能。
结果如图5和图6所示：针对5株靶细胞NCI-H2228、NCI-H522、HCC78、NCI-H23、NCI-H358,效应细胞作用于NCI-H23和NCI-H2228时Human IL-2的释放水平较高；效应细胞作用于不同靶细胞，Human IFN-γ释放量存在差异，当效应细胞作用于靶细胞NCI-H2228、NCI-H522、HCC78、NCI-H358时，Human IFN-γ的释放水平基本维持在100pg/ml左右；当效应细胞与NCI-H23以40:1的效靶比共孵育时，Human IFN-γ的释放水平有较大幅度增强，释放量为220pg/ml左右，而以20:1、10:1、5:1的效靶比共孵育时hIFN-γ的释放水平基本维持在100pg/ml左右。此外，当效应细胞与靶细胞作用时，培养上清中未检测到hIL-10。
由此可见，细胞治疗产品对5株肺腺癌均有杀伤作用。此外，在效应细胞在与靶细胞共同作用时会释放一定水平的hIL-2和hIFN-γ炎性因子，但未释放hIL-10抑制因子。
实施例6:临床实验
根据实施例2的方法制备患者的MCTL细胞，并将该MCTL细胞与特瑞普利单抗(抗PD-1单抗)联合用于晚期NSCLC的二线治疗。系统性治疗的患者每3周接受12个周期特瑞普利单抗治疗，9个周期MCTL细胞治疗，之后接受特瑞普利单抗和MCTL细胞维持治疗直至疾病进展或出现无法耐受的毒性。
从2019年6月到2020年10月，共招募了14位年龄在43-70岁(中位年龄为59岁)的患者。鳞状/非鳞状比为50％/50％。13例(92.8％)ECOG PS＝0-1，5例(35.7％)有胸腔积液，3例(21.4％)存在骨转移。在13个可评估的患者中，ORR和DCR分别为38.4％和71.4％。在数据截止时，中位PFS为399天(约13.3个月)。不良事件(AEs)5例(38.4％)，其中免疫相关的不良事件为甲状腺功能低下(3例，23％)和身体虚弱(2例，15.4％)，但没有发生≥3级不良事件
由此可见，多靶点细胞毒T细胞(MCTL)联合特瑞普利单抗作为晚期NSCLC的二线治疗，其耐受性良好且结果令人鼓舞。
PR：部分缓解(partial response)，靶病灶最大径之和减少≥30％，至少维持4周。
CR：完全缓解(complete response)，所有靶病灶消失，无新病灶出现，且肿瘤标志物正常，至少维持4周。
SD：疾病稳定(stable disease)，靶病灶最大径之和缩小未达PR，或增大未达PD。
PD：疾病进展(progressive disease)，靶病灶最大径之和至少增加≥20％，或出现新病灶。
疾病控制率DCR＝PR+CR+SD
客观缓解率ORR＝PR+CR
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 河北博海生物工程开发有限公司
<120> 肺癌特异性分子靶标07及其用途
<130> 22SG1F1942
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分子靶标1
<400> 1
Ala Glu Thr Thr Gly Leu Ile Lys Leu
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分子靶标2
<400> 2
Leu Glu Ser Leu Ala Val Ile Leu
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分子靶标3
<400> 3
Glu Val Leu Ser Ile Met Gly Val Tyr
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分子靶标4
<400> 4
Phe Leu Leu Ser Gly Leu Gly Gly Leu
1 5
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分子靶标5
<400> 5
Gly Glu Phe Leu Ala Phe Gln Thr Val His Leu
1 5 10
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分子靶标6
<400> 6
Ile Ala Asn Ile Thr Thr Val Trp
1 5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分子靶标7
<400> 7
Leu Leu Asp Ala Gly Phe Ala Val
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分子靶标8
<400> 8
Arg Ser Ser Ser Leu Pro Ser Trp
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分子靶标9
<400> 9
Ser Leu Ser Glu Val Val Val Pro Met
1 5
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分子靶标10
<400> 10
Tyr Leu Cys Ser Gly Ser Ser Tyr Phe Val Leu
1 5 10
Claims (1)
1.一种体外刺激和活化APC细胞的方法，其包括将多肽组合和待活化的APC细胞接触的步骤，进而使得所述APC细胞负载作为分子靶标的多肽，其中所述的APC细胞是DC细胞，其中所述多肽组合包含如下氨基酸序列的多肽：LLDAGFAV(SEQ ID NO：7)，以及选自如下组的肺癌特异性分子靶标中的9种，其中所述的组由如下多肽组成：
AETTGLIKL(SEQ ID NO：1)氨基酸序列；
LESLAVIL(SEQ ID NO：2)氨基酸序列；
EVLSIMGVY(SEQ ID NO：3)氨基酸序列；
FLLSGLGGL(SEQ ID NO：4)氨基酸序列；
GEFLAFQTVHL(SEQ ID NO：5)氨基酸序列；
IANITTVW(SEQ ID NO：6)氨基酸序列；
RSSSLPSW(SEQ ID NO：8)氨基酸序列；
SLSEVVVPM(SEQ ID NO：9)氨基酸序列；和
YLCSGSSYFVL(SEQ ID NO：10)氨基酸序列。
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