WO2002029021A2 - Biotechnologisches verfahren zur herstellung von hydroxy-stickstoff-heterocyclus-carbonsäuren - Google Patents

Biotechnologisches verfahren zur herstellung von hydroxy-stickstoff-heterocyclus-carbonsäuren Download PDF

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WO2002029021A2
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Laurent Marilley
Thomas SCHRÄDER
Barbara Thiemer
Jan R. Andereesen
Knut Burgdorf
Andreas Tinschert
Dieter Haas
Thomas Zimmermann
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Lonza Ag
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
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    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring

Definitions

  • the present invention relates to an enzyme with 6-methylnicotinic acid 2-dehydrogenase activity, polypeptides which form the subunits of this enzyme, DNA which codes for this enzyme or the polypeptides, nectors in which this DNA is inserted, microorganisms which are associated with this DNA or the vectors are transformed, and processes for the preparation of hydroxy-nitrogen-heterocycle-carboxylic acids of the general formulas
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 which may be the same or different, each represent a hydrogen atom, a halogen atom, an alkyl group, an alkoxy group, an aryl group, an arylalkyl group, a heteroaryl group or a carboxylic acid group
  • X is Nitrogen atom or CR 5 , where R 5 is a hydrogen or halogen atom, means either using the new enzyme or the polypeptides or using the corresponding genetically modified or recombinant microorganisms (microorganisms which have been transformed with the DNA according to the invention).
  • the invention also relates to the use of already known microorganisms of the genus Ralstonia / Burkholderia, which are referred to below as “wild strains”, for the production of hydroxy-nitrogen-heterocycle-carboxylic acids under certain process parameters.
  • Hydroxy-nitrogen heterocycle carboxylic acids also mean their salts, in particular their water-soluble salts, for example the alkali metal or ammonium salts.
  • the enzyme with 6-methylnicotinic acid 2-dehydrogenase activity also has
  • Nicotinic acid dehydrogenase activity is a Nicotinic acid dehydrogenase activity.
  • 2-hydroxynicotinic acid are important intermediates in drug synthesis.
  • 2-hydroxynicotinic acid serves as a starting material for 2-chloronicotinic acid (US-A-4 081 451), which is an important intermediate for the production of pharmaceuticals (Ann. Pharm. Fr., 1980, 38 (3), pp. 243-252 ).
  • nicotinic acid is converted into 2-hydroxynicotinic acid by means of microorganisms which contain a specific hydroxylase and are selected such that they utilize 6-methylnicotinic acid as the only source of carbon and energy via 2-hydroxy-6-methylnicotinic acid.
  • microorganisms which contain a specific hydroxylase and are selected such that they utilize 6-methylnicotinic acid as the only source of carbon and energy via 2-hydroxy-6-methylnicotinic acid.
  • these microorganisms have the disadvantage that they require a very long cultivation time, since the doubling time with 6-methylnicotinic acid is long. Therefore, the process is not economical.
  • the object of the present invention is to provide a biotechnological process for the preparation of hydroxy-nitrogen-heterocycle-carboxylic acids, such as, for example, 2-hydroxynicotinic acid, in which the biocatalyst to be used either requires no enrichment time or can be grown more quickly.
  • This object is achieved with the enzyme according to claim 1 and the polypeptides according to claim 3, the DNA according to claims 4 and 5, the microorganisms according to claim 9 and the methods according to claims 12 and 13.
  • the present invention accordingly relates to an enzyme with 6-methylnicotinic acid 2-dehydrogenase activity, polypeptides which form the subunits of this enzyme, DNA which codes for the enzyme or the polypeptides, and microorganisms which are transformed with this DNA.
  • Another object of the invention is a process for the preparation of hydroxy-nitrogen-heterocycle-carboxylic acids using the enzyme or the transformed microorganisms or using the "wild strains" under certain process parameters.
  • the invention is illustrated by the following figures.
  • Fig. 1 shows the SDS-PAGE of the enriched / purified 6-methylnicotinic acid 2-dehydrogenase.
  • Fig. 2 shows the lineweaver burk plot.
  • Fig. 3 shows the inhibition of the enzyme.
  • Fig. 4 shows the absorption spectrum of the enzyme.
  • Fig. 6 shows the growth of Ralstonia / Burkholderia with pyridine-2,5-dicarboxylic acid.
  • Fig. 7 shows the relative hydroxylation rate (%) with nicotinic acid as a starting material.
  • Figure 8 shows the restriction map of the DNA sequence.
  • Figures 9A and 9B show the construction of plasmids pLM25C, pLM25E and pLM25D and pLM81E, pLM81D and pLM81C.
  • 11A, 1 IB and 1 IC show the growth of Comamonas acidovorans D3 with or without
  • an enzyme with 6-methylnicotinic acid 2-dehydrogenase activity can be isolated from microorganisms which can utilize 6-methylnicotinic acid as the sole source of carbon, nitrogen and energy.
  • Microorganisms such as the “wild strains” Ralstonia / Burkholderia, in particular Ralstonia / Burkholderia KIE101 (DSM 6920), which have already been described in detail in EP-A-0 559 116, are particularly suitable for this isolation
  • the enzyme according to the invention is purified (enriched) using standard chromatographic methods, preferably by means of ion exchange chromatography and / or gel filtration and / or hydrophobic interaction chromatography in the order of ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, gel filtration, ion exchange chromatography and hydrophobic interaction chromatography.
  • the enzyme has the following properties:
  • the DNA according to the invention or the DNA fragments which code for a 6-methylnicotinic acid 2-dehydrogenase and the polypeptide subunits are indicated by the restriction map according to FIG. 8 and the nucleotide sequences in SEQ ID No. 2, 4 and 6.
  • the polypeptides according to the invention are identified by the amino acid sequences SEQ ID No. 1, 3 and 5 characterized.
  • the invention also includes the functionally equivalent genetic variants and mutants of the above-mentioned nucleotide sequences, ie genes which are derived from the wild-type organisms and whose gene products are essentially unchanged in their biological function.
  • the functionally equivalent genetic variants and mutants thus include, for example, base exchanges in the context of the known degeneration of the genetic code, as described, for. B. can be generated artificially in order to adapt the gene sequence to the preferred codon utilization of a particular microorganism in which expression is to take place.
  • the genetic variants and mutants also include deletions, insertions and substitutions of bases or codons, insofar as the biological function of the gene products of genes modified in this way are essentially unchanged. This includes z. B. gene sequences which have a relatively high homology to the wild-type sequences, such as for example higher than 60%, and under stringent hybridization conditions with the
  • Hybridization conditions are e.g. B. temperatures between 55 and 70 ° C and at 0.4 mM to
  • Ndh 6-methylnicotinic acid 2-dehydrogenase
  • This enzyme comprises at least three detected structural subunits, hereinafter referred to as NdhA, NdhB, and NdhC.
  • NdhA the corresponding amino acid sequence in SEQ ID No. 2
  • NdhB the nucleotide sequence of NdhB
  • NdhC the nucleotide sequence of NdhC in SEQ ID No. 6
  • SEQ ID No. 5 shown.
  • the operon coding for Ndh also contains two further open reading frames ("Open reading frames" of the "ORF"), which code for other proteins whose function has not yet been clarified.
  • ORF open reading frames
  • the nucleotide sequence of ORF1 also referred to as ndhD, is shown in SEQ ID No. 8 and the corresponding amino acid sequence in SEQ ID No. 7 shown.
  • ORF2 also referred to as ndhE
  • SEQ ID 13 is shown in SEQ ID 13 and the corresponding amino acid sequence in SEQ ID 14.
  • the wild strains already described, which are also used as starting material for isolating the enzyme according to the invention or the polypeptides, can serve as starting material for isolating the DNA according to the invention.
  • the isolation of the intact genes or the intact DNA fragments can be carried out according to known methods starting from a gene bank of a suitable microorganism such as, for. B. the genus Ralstonia / Burkholderia, in particular with the name Ralstonia / Burkholderia KIE101 (DSM 6920), from which the ndh genes or fragments thereof are isolated in a known manner by hybridization with labeled oligonucleotides which contain partial sequences of the ndh genes and be cloned.
  • a suitable microorganism such as, for. B. the genus Ralstonia / Burkholderia, in particular with the name Ralstonia / Burkholderia KIE101 (DSM 6920)
  • the ndh genes are expediently placed under the control of a strong promoter.
  • the choice of promoter depends on the desired expression conditions, for example on whether a constitutive or induced expression is desired or on the microorganism in which the expression is to take place.
  • Suitable promoters are e.g. B. P L and P R of phage lambda (cf. Schauter et al., Gene 1987, 52, 279-283), the Pt r c promoter (A ann et al., Gene 1988, 69, 301-315) , the promoters P Nm , Psi (M.
  • the Püp promoter (Amann et al., Gene 1983, 25, 167-178), the P ⁇ ac - Promoter (Amann et al., Gene 1983, 25, 167-178) and the P tac promoter, a hybrid of the mentioned P t ⁇ and P ⁇ ac promoters, which can be used as a constitutive or inducible promoter (Radorel and Bennet , Gene 1982, 20, 231-243).
  • the promoter P ⁇ ac is used.
  • the recombinant ndh genes are expediently incorporated into known suitable vectors, preferably into expression vectors, using known techniques.
  • Autonomous and self-replicating plasmids or integration vectors can be used as vectors.
  • vectors with a specific host spectrum and vectors with a broad host spectrum are suitable as vectors.
  • vectors with a specific host spectrum e.g. B. for E. coli are pBR322 (Bolivar et al., Gene, 2, 95-113), the commercially available pBLUESCRIPT-KS + ® , pBLUESCRIPT-SK + ® (Stratagene), pUC18 / 19 (Yannisch-Perron et al., Gene , 1985, 33, 103-119), pK18 / 19 (Pridmore, Gene, 1987, 56, 309-312), pRK290X (Alvarez-Morales et al., Nucleic Acids Research, 14, 4207- 4227), pGEM-T ® ( Promega), pME285 (Haas and Itoh, Gene 1985, 36, 27-36) or its derivatives and pRA95 (available from Nycomed Pharma AS, Huidove, Denmark).
  • All vectors which are suitable for Gram-negative bacteria can be used as “broad host rank” vectors.
  • “broad host rank” vectors are pRK290 (Ditta et al., Proc. Nat. Acad. Sei. 1980, 77 , 7347-7351) or its derivatives, pKT240 (Bagdasarian et al, Gene 1983, 26, 273-282) or its derivatives, pGSS33 (Sharpe, Gene 1984, 29, 93-102), pVKIOO (Knauf and Nester, Plasmid 1982 , 8, 45-54) or its derivatives, pBBRIMCS (Kovach et al, Biotech.
  • the plasmids pLM25, pLM25C, pLM25D, pLM25E, pLM81, pLM81 C, pLM8 ID and pLM81E or their derivatives and subclones were obtained (FIGS. 9A and 9B).
  • the plasmids pLM25C and pLM25E are preferably used.
  • the ndh gene fragments or vectors should be introduced into the desired host strains which are suitable for expression.
  • the microorganisms are expediently transformed in a customary manner known per se with the vectors containing the ndh DNA fragments.
  • the microorganisms can then contain the ndh gene fragment either on a vector molecule or integrated in their chromosome.
  • Suitable host strains are either microorganisms which already contain the genes for a suitable cofactor background or microorganisms which are modified using genetic engineering methods in such a way that they genes for this cofactor background contain together with the genes according to the invention.
  • Suitable cofactors are molybdenum cofactors such as. B. molybdopterin, especially molybdopterin cytosine dinucleotide, flavine nucleotide cofactors such as. B. flavin adenine dinucleotide (FAD) and iron sulfur cofactors.
  • microorganisms which already contain the suitable cofactor background are microorganisms of the genus Pseudomonas, Comamonas, Rhodococcus, Agrobacterium, Arthrobacter and Hydrogenophaga.
  • the microorganisms of the genus Pseudomonas, Comamonas, Rhodococcus, Agrobacterium, Arthrobacter and Hydrogenophaga are microorganisms of the genus Pseudomonas, Comamonas, Rhodococcus, Agrobacterium, Arthrobacter and Hydrogenophaga.
  • Comamonas testosteroni such as B. Comamonas testosteroni 63, Pseudomonas putida, Pseudomonas carboxydovorans, Pseudomonas carboxydoflava, Pseudomonas diminuta, Rhodococcus sp. such as B. Rhodococcus sp. Bl, Agrobacterium sp. such as B. Agrobacterium sp. IB, Arthrobacter sp., Arthrobacter picolinophilus and Hydrogenophaga pseudoflora.
  • the strains Comamonas acidovorans D3 and Comamonas testosteroni 63 are particularly suitable.
  • Examples of microorganisms into which the suitable cofactor background can be cloned together with the genes according to the invention are Bacillus, Acinetobacter, Alcaligenes, Escherichia, Clostridium, Proteus and Rhodobacter.
  • the microorganisms of the species Bacillus niacini, Alkaligenes faecalis, Escherichia coli, Clostridium barkeri, Proteus vulgaris, Rhodobacter sphaeroides and Rhodobacter capsulatus are preferably suitable.
  • the method is preferably carried out by means of microorganisms which already contain the suitable cofactor background.
  • microorganism Comamonas acidovorans D3, containing plasmid pLM25C was deposited on May 31, 2001 with the German Collection for Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, according to the Budapest contract under number DSM 14326.
  • the biotransformation according to the invention can take place either by means of the isolated polypeptides and enzymes described above (immobilized or not immobilized), by means of genetically modified microorganisms which have been transformed with the DNA or fragments thereof according to the invention, or by means of the “wild strains” of the genus Ralstonia / Burkholderia, before the actual biotransformation, either in the presence of an inducing growth substrate or in the presence of a suitable non-inducing growth substrate and an inductor.
  • An immobilized enzyme is understood to mean an enzyme which is bound or adsorbed on a suitable carrier material and is present, for example, embedded in a polymer.
  • Nitrogen heterocycle carboxylic acids of the general formulas IV to VI can be used as substrates (starting materials) for the biotransformation
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 which may be the same or different, each represent a hydrogen atom, a halogen atom, an alkyl group, an alkoxy group, an aryl group, an arylalkyl group, a heteroaryl group or a carboxylic acid group and X represents a nitrogen atom or CR 5 , wherein R 5 is a hydrogen or halogen atom, can be used
  • Alkyl alone or in compositions such as arylalkyl, here and in the following means linear or branched alkyl, preferably C ⁇ _ ⁇ o-alkyl, especially C ⁇ -4-alkyl.
  • alkyl are methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, tert-butyl, Pentyl, ⁇ eopentyl, hexyl and its isomers
  • alkoxy here and below means linear or branched alkoxy, preferably C 1 -C 10 -alkoxy, in particular C 1 -C 6 -alkoxy.
  • alkoxy are methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, isobutoxy, tert-butoxy, pentyloxy and its isomers and hexyloxy and its isomers
  • Halogen here and below means F, Cl, Br or I.
  • a group of carboxylic acids is the group -COOH Aryl, alone or in compositions such as arylalkyl, means phenyl or naphthyl, substituted or unsubstituted.
  • substituted aryl means an aryl substituted with one or more halogen atoms and / or alkyl groups. Examples of substituted aryl are bromophenyl, chlorophenyl, tolyl, ethylnaphthyl and chloronaphthyl.
  • Arylalkyl preferably means substituted or unsubstituted benzyl.
  • Heteroaryl is preferably pyridyl, quinolyl or isoquinolyl.
  • Appropriate substrates are nicotinic acid, 6-fluoronicotinic acid, 5,6-difluoronicotinic acid,
  • 6-chloronicotinic acid 5,6-dichloronicotinic acid, 6-bromnicotinic acid, 6-methylnicotinic acid, pyrazine-2-carboxylic acid, 5-chloropyrazine-2-carboxylic acid, 5-methylpyrazine-2-carboxylic acid, 6-methoxynicotinic acid, picolinic acid, pyridine-3, 5-dicarboxylic acid and quinoline-3-carboxylic acid.
  • the microorganisms according to the invention are grown before the proper biotransformation in the presence of an inducing growth substrate or in the presence of a suitable non-inducing growth substrate and an inductor.
  • the microorganisms of the genus Ralstonia / Burkholderia KIE101 are known and have already been described in EP-A-0 559 116. These microorganisms were already described on
  • “Functionally equivalent variants and mutants” are understood to mean microorganisms which have essentially the same properties and functions as the original microorganisms. Such variants and mutants can be formed accidentally, for example by UV radiation.
  • an “inducing growth substrate” is understood to mean either a nutrient medium which contains an inductor or a compound which activates the corresponding enzyme in the microorganism and with which the microorganism can grow.
  • An “nutrient medium” is here and in following either a "full medium” like for example Nutrient Broth (NB), Luria Broth (LB) or a mineral salt medium such as e.g. B. according to Tinschert et al. (Arch. Microbiol. 1997, 168, 355-361) and Kulla et al. (Arch. Microbiol.
  • the mineral salt media can be enriched with vitamins.
  • All water-soluble vitamins such as p-aminobenzoic acid, biotin, pantothenates, thiamine, pyridoxal hydrochloride and vitamins of the vitamin B 12 group such as, for example, B. Cyanocobalamin.
  • the additional energy source is expediently added in an amount of 0.01 to 10% by weight, preferably in an amount of 0.1 to 5% by weight.
  • the vitamins are expediently added in an amount of 0.0001 to 0.1% by weight.
  • non-inducing growth substrate is understood to mean compounds with which the microorganism grows but the corresponding enzyme in the microorganism is not activated.
  • an aqueous suspension is expediently used.
  • An aqueous suspension is understood to mean a microorganism suspension which is cultivated in a buffer or in a mineral salt medium.
  • a low-molecular phosphate buffer is preferably used as the buffer. 10-300 mM potassium or sodium phosphate buffers can be used as low-molar phosphate buffers.
  • Pyridine derivatives or pyrazine derivatives can be used as suitable non-inducing growth substrates.
  • Pyridine-2,5-dicarboxylic acid is expediently used as the pyridine derivative.
  • 5-Methylpyrazine-2-carboxylic acid is expediently used as the pyrazine derivative.
  • Pyridine-2,5-dicarboxylic acid is preferably used as a suitable non-inducing growth substrate.
  • 6-alkylnicotinic acid derivatives are suitable as inducers, such as 6-methylnicotinic acid and 2-hydroxy-6-methylnicotinic acid.
  • the concentration of the inductor is expediently in a range from 0.01 to 10% by weight, preferably in a range from 0.01 to 5% by weight.
  • microorganisms are preferably grown in the presence of an inducing growth substrate, such as in a complete medium additionally containing an inductor or in a mineral salt medium additionally containing inductor and yeast extract.
  • an inducing growth substrate such as in a complete medium additionally containing an inductor or in a mineral salt medium additionally containing inductor and yeast extract.
  • the cultivation and selection is usually carried out at a temperature of 5 to 45 ° C., preferably at a temperature of 20 to 35 ° C. and at a pH of 4 to 10, preferably at a pH of 6 to 9.
  • the biotransformation can be carried out in media customary in the art, for example in low-molecular phosphate buffers such as sodium or potassium phosphate buffers, HEPES buffers, citrate buffers, Tris-HCl, carbonate buffers such as sodium or potassium carbonate buffers, borate buffers or imidazole buffers.
  • low-molecular phosphate buffers such as sodium or potassium phosphate buffers, HEPES buffers, citrate buffers, Tris-HCl, carbonate buffers such as sodium or potassium carbonate buffers, borate buffers or imidazole buffers.
  • the low-molecular phosphate buffers are expediently in the concentration range of 1-500 mM, preferably 1-200 mM. If a neutralized substrate solution is used, the biotransformation can also be carried out in water (unbuffered).
  • the biotransformation is expediently carried out at a temperature of 15 to 70 ° C., preferably at a temperature of 20 to 40 ° C.
  • the pH is usually in a range from 5 to 10, preferably from 6 to 9.
  • the biotransformation is expediently carried out with a single or continuous addition of substrate in such a way that the substrate concentration does not exceed 1000 mM, preferably 500 mM.
  • the biotransformation is expediently carried out under aerobic conditions.
  • Aerobic conditions are culture conditions in which the microorganisms are supplied with oxygen. This can e.g. B. in shaking culture by atmospheric oxygen or in submerged culture by blowing in molecular oxygen or atmospheric oxygen.
  • “Relatively high substrate concentrations” are expediently understood to mean concentrations of at least 5 mM, preferably of at least 10 mM.
  • Oxygen-limiting conditions is understood to mean if the substrate for the biotransformation is added after the biomass has been grown and the actual biotransformation is then carried out without shaking and without aeration.
  • the hydroxy nitrogen heterocycle carboxylic acids obtained are obtained in a manner customary in the art, for example by precipitation using an acid such as sulfuric acid.
  • the preferred hydroxy-nitrogen heterocycle carboxylic acids are 2-hydroxy-6-methyl-nicotinic acid, 2-hydroxynicotinic acid, 2-hydroxy-6-chloronicotinic acid, 2-hydroxy-5,6-dichloro-nicotinic acid, 2-hydroxy-6- fluoronicotinic acid, 2-hydroxy-5,6-difluoronicotinic acid, 2-hydroxy-6-methoxynicotinic acid, 6-hydroxypicolinic acid, 3-hydroxypyrazine-2-carboxylic acid, 3-hydroxy- 5-methylpyrazine-2-carboxylic acid, 3-hydroxy-5- chloropyrazine-2-carboxylic acid and 2-hydroxyquinoline-3-carboxylic acid.
  • example 1 2-hydroxy-6-methyl-nicotinic acid, 2-hydroxynicotinic acid, 2-hydroxy-6-chloronicotinic acid, 2-hydroxy-5,6-dichloro-nicotinic acid, 2-hydroxy-6- fluoronicotinic acid, 2-hydroxy-5,6-di
  • Ralstonia / Burkholderia KIE101 was aerobic in the medium according to Tinschert et al. (Arch. Microbiol. 1997, 168, 355-361) with a) 6-methylnicotinic acid, b) 2-hydroxy-6-methyl-nicotinic acid or c) pyridine-2,5-dicarboxylic acid as the only source of carbon and energy.
  • Biomasses grown in 2-hydroxy-6-methylnicotinic acid show good induction of the enzyme and the induction level in these two biomasses is at approximately the same, high level (FIG. 7;
  • the standard test method mixture contained 50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.8), 10 mM nicotinic acid and 0.04% (w / v) nitro blue tetrazolium chloride (NBT) in a final volume of 1 ml.
  • the reaction was carried out by adding the enzyme at 37 ° C started and the activity was continuously increased by the increase in absorption at 535 nm (extinction coefficient:
  • the wet cells were suspended in twice the volume of buffer A (50 mM Tris-HCl, pH 7.5) and after adding 3 ⁇ l benzonase per 10 ml suspension and 10 mM phenylmethanesulfonyl fluoride, the cells were treated twice with the French press at 110 MPa , Cell debris and membranes were removed by centrifugation at 30,000xg for 30 minutes and at 100,000xg for 1 hour. The remaining supernatant was called crude extract.
  • the chromatography column size to be used during the purification and the corresponding flow rates were used in accordance with the total protein content.
  • the crude extract was first applied to a Q-Sepharose "Fast Flow" column which had been equilibrated with buffer A.
  • the column was washed with buffer A and the bound 6-methylnicotinic acid-2-dehydrogenase was treated with a linear buffer A- Gradients containing up to 1.0 M KC1 in buffer A.
  • the active fractions were pooled and brought to a final concentration of 1 M
  • the fractions with 6-methylnicotinic acid 2-dehydrogenase activity were combined and the subsequent chromatography on a Mono Q column was carried out according to that using Q-Sepharose. After adding 0.5 M ammonium sulfate to the obtained "6-methylnicotinic acid 2-dehydrogenase pool" (containing about 0.8 M KC1), the precipitated protein was removed by centrifugation. The supernatant was placed on a butyl-Sepharose column, which with buffer A containing 0.5 M ammonium sulfate had been applied. The 6-methylnicotinic acid 2-dehydrogenase was eluted with buffer A containing 0.5 M ammonium sulfate.
  • the enzyme obtained was desalted by means of a G-25 column which had been equilibrated with buffer A, and the purified protein was stored at -20 ° C.
  • the enzyme was enriched 134 times in 5 steps.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the samples were incubated for 4 min at 95 ° C after adding the same volume of denaturing buffer.
  • the electrophoresis was carried out at constant current at 25 mA and at maximum voltage.
  • the gels were stained either using Coomassie Brilliant Blue or using "silver stain".
  • the structure of the subunits was determined using SDS-PAGE.
  • the enzyme consists of 3 different detected structural subunits with a molecular weight of 16,000 D, 30,000 D and 75,000 D.
  • the results are summarized in FIG. 1.
  • the added molecular weights gave a total of 121,000 D, which speaks for a 1: 1 stoichiometry.
  • the presence of a hexamer ⁇ 2 ß ⁇ 2 is derived from these data.
  • the pH optima of the various substrates were measured in the following buffer solutions: 50 mM potassium phosphate buffer (pH 5.0-7.5), 50 mM Tris-HCl (pH 7.0-8.5) and 50 mM HEPES ([4- (2-hydroxyethyl) piperazino] ethanesulfonic acid; pH 7.5-9.5).
  • the pH optima for 3 different substrates are summarized in Table 2.
  • the kinetic parameters for each substrate were determined at the corresponding pH optimum by varying the concentrations (5-10 ⁇ M) in the standard test.
  • K m and V max values were determined directly from the Lineweaver Burk plot.
  • the K M and V max values are summarized in Table 3.
  • the K M value for nicotinic acid is 10 times higher than that of 6-methylnicotinic acid and quinoline-3-carboxylic acid.
  • the lineweaver burk plot is shown in FIG. 2.
  • Electron acceptors used by 6-methylnicotinic acid 2-dehydrogenase used by 6-methylnicotinic acid 2-dehydrogenase.
  • NAD electron acceptor nicotinamide adenine dinucleotide
  • NADP nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
  • the inactivation of the 6-methylnicotinic acid 2-dehydrogenase by inhibitors was investigated in buffer A containing 2.4 ⁇ M homogeneous enzyme. After adding the inhibitor, aliquots were taken at various intervals and analyzed in the standard test. The influence of arsenite on enzyme activity was measured in a concentration range of 1-10 mM at room temperature. Potassium cyanide was used in concentrations of 0.38 or 1 mM. The inactivation kinetics were determined at 0 ° C.
  • the enzyme is 90% inhibited by incubation for 2.5 minutes with 1 mM potassium cyanide at 0 ° C. No inactivation was observed in the presence of 10 mM sodium arsenite.
  • the incubation at 0 ° C in the presence of 0.375 mM potassium cyanide (•) and the incubation at 0 ° C in the presence of 1 mM potassium cyanide (O) are shown. 3.7 Metal and cofactor determination
  • the molybdenum, iron and zinc content was determined by induced coupled plasma mass spectrometry using 2 mg of purified protein. Acid-labile sulfur was determined according to Beinert (Anal. Biochem. 1983, 131, 373-378).
  • the isolated enzyme has a maximum at 274 nm, a double
  • 6-methylnicotinic acid 2-dehydrogenase The spectral properties of 6-methylnicotinic acid 2-dehydrogenase suggest that the enzyme has at least one iron / sulfur center.
  • the protein determination was carried out according to the method of Bradford (Anal. Biochem. 1976, 72, 248-254).
  • the nucleotides of 6-methylnicotinic acid 2-dehydrogenase were released from the purified enzyme by acid and heat treatment.
  • sulfuric acid 3% (v / v) was added to 1.2 mg protein in buffer A.
  • precipitated protein was removed by centrifugation.
  • the remaining supernatant was analyzed by HPLC (LiChrospher ® 300 RP18 column (250x4 mm) with a photodiode detector. Isocratic elution was carried out with 0.2 M ammonium sulfate solution (pH 4.0) containing 1% acetonitrile at a flow rate of 1 ml min ..
  • Cytosine monophosphate (CMP), guanosine monophosphate (GMP) and adenosine monophosphate (AMP) were used for the identification and quantitative determination of nucleotides contained in 6-methylnicotinic acid 2-dehydrogenase. The spectra of each nucleotide were recorded and with authentic Standards compared. FAD was extracted from the protein by acid extraction and subsequently analyzed by spectrometry. The protein contained 0.3 mol FAD / protomer.
  • reaction products formed from nicotinic acid and 6-methylnicotinic acid by homogeneous catalysis of 6-methylnicotinic acid 2-dehydrogenase were identified and quantified by UV absorption characteristics according to Tinschert et al. (Arch. Microbiol. 1997, 168, 355-361).
  • yeast extract strain alone cannot grow, the yeast extract addition will cause faster growth if the yeast extract is added to the medium in addition to 6-methylnicotinic acid or pyridine-2,5-dicarboxylic acid.
  • the growth in this medium was more than 30% faster than in the medium with 6-methylnicotinic acid.
  • pyridine-2,5-dicarboxylic acid as a substrate enables the biomass of the strain to be grown more quickly.
  • Ralstonia / Burkholderia KIE101 was aerobic in the medium according to Tinschert et al. (1997, ibid) with various heterocycles as the only source of carbon and energy at pH 7.2.
  • yeast extract 0.1% or a vitamin solution according to Pfennig (Int.
  • the cultures were cultivated with shaking (140 rpm) in Erlenmeyer flasks at 30 ° C. and the growth of the cells was observed by measuring the optical density at 650 nm (OD 6 5o).
  • the strain grew in the above-mentioned mineral salt medium with 6-methylnicotinic acid as the only source of carbon and energy with a doubling time of 13.5 hours. If additional yeast extract (0.1%) was added, the strain grew 1/3 faster than without adding yeast extract (doubling time 9 h). The same growth rate was achieved when yeast extract was replaced by "Nutrient Broth" (NB).
  • the media was the mineral salt medium according to Tinschert et al. (1997, ibid.) Containing vitamins ( ⁇ ), the same medium without vitamins ( ⁇ ), the same
  • Exponentially grown cells were harvested and washed twice with sodium phosphate buffer (50 mM, pH 7.2) and resuspended in the same buffer. Then the substrates listed in Table 5 were added such that the final concentration was 1-10 M.
  • the biotransformations were carried out in a shake flask (120 rpm) at 30 ° C.
  • the cell-free supernatants were sterile filtered and then concentrated to about 4 times the concentration.
  • the concentrate was acidified to pH 1.5 with sulfuric acid to precipitate the product.
  • the products were filtered off using a glass filter and then dried. Table 5
  • Genomic DNA was generated using a modified method by Chesney et al. (J. Mol. Biol. 1979, 130, 161-173).
  • Proteinase K and 400 ⁇ l of a 20 mg / ml pronase solution were then added and the cells were then incubated at 37 ° C. for 3 hours.
  • the mixture was supplemented with 8.6 g CsCl and then incubated at 65 ° C. After centrifugation at 22000xg for 30 min at 20 ° C, the supernatant was put into a tube . (Beckman Vti 65.2) and 500 ul of a 10 mg / ml ethidium bromide solution was added.
  • the suspension was centrifuged overnight using an ultracentrifuge at 240,000 ⁇ g at 20 ° C.
  • the genomic DNA was visualized under UV light.
  • the volume was brought to 4 ml with TE buffer.
  • Ethidium bromide was removed by extraction with n-butanol (3).
  • the concentration and the purity of the DNA was checked by means of UV light in the range between 260 and 280 nm.
  • the degenerate oligonucleotides K1 and K2 were derived from the amino acid sequence of the 6-methyl nicotinic acid 2-dehydrogenase N-terminal region of the 30,000 and 16,000 subunits.
  • the oligonucleotides were synthesized by Microsynth GmbH.
  • the N-terminal amino acid sequence of the 30,000 subunit K1 is shown both in SEQ ID No.ll and below and the N-terminal amino acid sequence of the 16,000 subunit K2 is shown both below and in SEQ ID No. 12 shown.
  • the mixed or degenerate nucleotide sequences Kl are below and in SEQ ID No. 9 and K2 shown below and in SEQ ID No 10.
  • Herring sperm DNA was supplemented.
  • the oligonucleotides K1 and K2 were used.
  • the oligonucleotides were treated with DIG "Oligonucleotide Tailing Kit ®” (Roche) labeled.
  • DIG "Oligonucleotide Tailing Kit ®” (Roche) labeled.
  • the membranes were 2 times for 5 min at 54 ° C in 2x SSC (3 M NaCl, 300 mM sodium citrate pH 7.0, containing 0.1% washed (w / v) SDS), then 2 times in 0, Ifach SSC containing 0, 1% SDS for 15 min at 54 ° C.
  • the detection was in accordance with DIG "Nucleic Acid detection Kit ®” (Roche) was performed.
  • a DNA fragment of approximately 7.5 kb showed a positive signal with the oligonucleotides K1 and K2.
  • the DNA of this size was ligated with the vector pBluescript-KS + (Stratagene). The ligation was carried out overnight at 14 ° C. in a final volume of 20 ⁇ l with 0.5 U T4 DNA ligase.
  • CaCl 2 -competent cells from E. coli XLl-Blue which were prepared according to Sambrook et al. (1989, ibid.), were transformed.
  • the recombinant cells were on a complex medium containing 100 ⁇ g ml ampicillin,
  • D-galactopyranoside selected.
  • the plasmid pKBl was first subcloned.
  • the plasmid pKB32 was obtained.
  • pKBl was digested with endonuclease EcoRI.
  • the isolated from 5.6 kb fragment was agarose gels using the "Gene-Clean ®" incidence rule (Biorad) isolated.
  • the EcoRI fragment was SK + (Stratagene) ligated into the vector pBluescript
  • Plasmid pRAl was constructed as follows: pKBl was digested with endonuclease SstI and then recycled with T4 DNA ligase (Fig. 9B).
  • sequences of the 5.6 kb EcoRI insert from plasmid pKB32 and the 2.5 kb Pstl-Sstl of plasmid pRAl were determined using the "DyeDeoxy terminator" sequence protocol with the sequences ABI 373A or 377 (Perkin-Elmer) Sequencing was carried out by Microsynth (Balgach, Switzerland). The restriction map is shown in Fig. 8. The genes of the 3 structural subunits of the 6-methylnicotinic acid 2-dehydrogenase ndhA, ndhB and ndhC are shown. Furthermore, two additional ORFs, designated ndhD and ndh E, were found which can code for polypeptides with as yet unknown function, which are translationally coupled to the structural genes.
  • P72224 QORL (quinoline-2-oxidoreductase) from Pseudomonas putida (Blaese et al., J. Biol. Chem. 1996, 271, 23068-23079).
  • RV0373C xanthine dehydrogenase
  • AE006902 (aldehyde oxidase) from Sulfolobus solfataricus (She et al., EMBL database).
  • the molybdopterin binding center was between amino acids 244 and 250 (Gly Gly Gly Phe Gly Ser Lys), between amino acids 485 and 488 (Gin Gly Gin Gly), between amino acids 523 and 527 (Gly Ala Phe Gly Ser) and between the Amino acids 720 and 725 (Ile Gly Glu Gly Val) in the NdhA subunit of SEQ ID No. 1 localized.
  • the 8.5 kb DNA fragment of pKBl was subcloned into the "shuttle vector" pBBRIMCS (Kovach et al., Biotech. 1994, 16, 800-802) under the control of P ⁇ ac .
  • 3 ⁇ g plasmid pKBl and 850 ng pBBRIMCS were digested with 10 U endonuclease PstI in a total volume of 20 ⁇ l for 2 h at 37 ° C.
  • the 8.5 kb DNA fragment was digested with the “Prep-A gene ® "system (biorad) extracted according to the manufacturer's instructions.
  • the vector was dephosphorylated with 1 U alkaline phosphatase in a total volume of 20 ul. After 1 hour incubation at 37 ° C of the vector with the QIAquick Spin ® system (Qiagen) according to the manufacturer was desalted and purified. The amount of DNA was quantified on the gel compared to the marker DNA. 300 ng of the insert were overnighted with 100 ng vector at 13 ° C. with 1 U T4 DNA ligase in a total volume of 20 ⁇ l. E.
  • coli XLl-Blue MRF '(Stratagene) was transformed according to the manufacturer's instructions using electroporation (1.7 kV, 200 ⁇ , 25 ⁇ F).
  • the recombinant cells were selected in a complex medium containing 30 ⁇ g / ml chloramphenicol, 0.4 mM ff TG and 30 ⁇ g / ml X-Gal.
  • the start codon ATG of ndhE, ndhD and ndhC was positioned on the promoter of the vector pBBRIMCS, taking into account natural Shine-Dalgarno sequences.
  • the EcoRV-Celll region of the 6-methylnicotinic acid 2-dehydrogenase EcoRI insert from plasmid pLM25 was removed so that the EcoRV restriction site belonged to the "multiple cloning site" of pBBRIMCS.
  • This deleted DNA fragment was deleted by a 6-methylnicotinic acid-2 -dehydrogenase Notl-Celll fragment or replaced by a BsmI-Celll fragment of pKBl, the blunt ends Notl and Bsml were replaced by 2 U Klenow polymerase and 3.5 to enable ligation nmol of the dNTPs to 20 ul reaction volume filled (overhanging ends). After 20 minutes
  • the electroporation mixture was transferred to an ice-cold electroporation cuvette (0.1 mm) and then pulsed at 2.0 kV, 200 ⁇ and 25 ⁇ F.
  • 900 ul ice-cold NYB medium (Nutrient Yeast Broth) was added to the transformation mixture, which was then incubated on ice for 10 min.
  • the cuvettes were then held at 30 ° C for 30 minutes.
  • the cells were transferred to tubes and then incubated for 90 min at 30 ° C with stirring.
  • the transformants were selected on NYA (Nutrient Yeast Agar) with 60 ⁇ g / ml chloramphenicol.
  • the 6-methylnicotinic acid 2-dehydrogenase operon was also cloned into vector pME6010, which has a neomycin promoter.
  • the 5.6 kb EcoRI fragment from plasmid pKBl was inserted into vector pME6010.
  • This construct was called pLM81.
  • the Xhol-Celll fragment of pLM81 was replaced by the Xhol-Cei ⁇ fragment of pLM25C, pLM25D and pLM25E.
  • the restrictions and ligations were performed as previously described.
  • the construction of the plasmids is shown in Fig. 9B).
  • the strains were treated with a mineral salt medium (25 ml) with vitamins according to Kulla et al. (Arch. Microbiol. 1983, 135, 1-7), additionally containing 0.01 g / l NaMoO 4 -2 H 2 O, 2 g / 1 sodium pyruvate, 30 ⁇ g / ml chloramphenicol and 3 mM 6-methylnicotinic acid. After 3 days of incubation at 30 ° C. and 140 rpm, 1 ml of the culture was centrifuged at 13000 rpm for 1 min.
  • the absorption spectrum of the control which was obtained from the Comamonas acidovorans D3 culture, showed the absorption maxima and absorption shoulders typical of 6-methylnicotinate.
  • the absorption spectrum which was obtained by cultivating Comamonas acidovorans D3 with the plasmids pLM25C, pLM25D and pLM25E, showed the spectrum typical for 2-hydroxy-6-methylnicotinate with an absorption maximum of 313 nm (FIG. 10). This means that the genes coding for 6-methylnicotinic acid 2-dehydrogenase were successfully expressed in the system. Expression was weak in pLM25, resulting in low activity (weak peak at 313 nm).
  • NdhD ( ⁇ ) and NdhE ( ⁇ ) The function of the translationally coupled polypeptides NdhD ( ⁇ ) and NdhE ( ⁇ ) has not yet been elucidated exactly. They may be involved as "chaperones" (proteins which are involved, for example, in the folding of other proteins) in the construction of the functional enzyme / polypeptide in He ⁇ faii ⁇ & sstam Ralstonia / Burkholderia.
  • Chaperones proteins which are involved, for example, in the folding of other proteins
  • the cultures were incubated with shaking (140 rpm) in Erlenmeyer flasks at 30 ° C.
  • the medium was NYB, containing 0.01 g / 1 NaMoO -2 H 2 O and 60 ⁇ g / ml chloramphenicol in the case of recombinant Comamonas acidovorans D3.
  • the growth was measured using the OD ⁇ oo.
  • concentrations of 6-methynicotinic acid and 2-hydroxy-6-methylnicotinic acid were measured using the molar extinction coefficient. The results are shown in Fig. 11.
  • the doubling time of the strain Comamonas acidovorans D3 containing plasmid pLM25 was 57 min and that of Comamonas acidovorans D3 was 53 min.
  • the doubling time from Ralstonia / Burkholderia KIE101 to 6-methylnicotinic acid under improved process conditions is 9 hours (cf. Example 5.2).
  • Trp Ile Glu Asp Arg Phe Glu His Met Gin Ala Thr Thr His Ser Arg 275 280 285

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Abstract

Beschrieben wird ein neues Enzym mit 6-Methylnicotinsäure-2-dehydrogenase-Aktivität, eine Nucleotidsequenz, die für dieses Enzym codiert, sowie neue Verfahren zur Herstellung von Hydroxy-Stickstoff-Heterocyclus-Carbonsäuren der allgemeinen Formeln (I), (II), (III) oder deren Salzen, worin R?1, R2, R3 und R4¿ gleich oder verschieden sind und ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine Alkylgruppe, eine Arylgruppe, eine Arylalkylgruppe, eine Heteroarylgruppe oder eine Carbonsäuregruppe bedeuten und X ein Stickstoffatom oder CR5, worin R5 ein Wasserstoff- oder Halogenatom ist, bedeutet, wobei als Substrat eine Stickstoff-Heterocyclus-Carbonsäure der allgemeinen Formeln (IV), (V), (VI) oder ein Salz davon, worin R?1, R2, R3 und R4¿ und X die genannte Bedeutung haben, eingesetzt wird. Das Verfahren wird mit dem isolierten Polypeptid/Enzym, mittels gentechnologisch veränderter Mikroorganismen, oder mittels 'Wildstämmen' der Gattung Ralstonia/Burkholderia durchgeführt.

Description

Biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von Hydroxy-Stickstoff-Heterocyclus-
Carbonsäuren
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Enzym mit 6-Methylnicotinsäure-2-dehydrogenase- Aktivität, Polypeptide, die die Untereinheiten dieses Enzyms bilden, DNA welche für dieses Enzym bzw. die Polypeptide codiert, Nektoren, in denen diese DNA inseriert ist, Mikroorganismen, die mit dieser DNA oder den Vektoren transformiert sind, sowie Verfahren zur Herstellung von Hydroxy-Stickstoff-Heterocyclus-Carbonsäuren der allgemeinen Formeln
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worin R1, R2, R3 und R4, die gleich oder verschieden sein können, jeweils ein Wasserstof atom, ein Halogenatom, eine Alkylgruppe, eine Alkoxygruppe, eine Arylgruppe, eine Arylalkylgruppe, eine Heteroarylgruppe oder eine Carbonsauregruppe bedeuten, und X ein Stickstoffatom oder CR5, worin R5 ein Wasserstoff- oder Halogenatom ist, bedeutet, entweder unter Verwendung des neuen Enzyms oder der Polypeptide oder unter Verwendung der entsprechenden gentechnologisch veränderten oder rekombinanten Mikroorganismen (Mikroorganismen, die mit der erfmdungsgemässen DNA transformiert wurden). Des weiteren betrifft die Erfindung auch die Verwendung von bereits bekannten Mikroorganismen der Gattung Ralstonia/Burkholderia, die im folgenden als „Wildstämme" bezeichnet werden, zur Herstellung von Hydroxy-Stickstoff- Heterocyclus-Carbonsäuren unter bestimmten Verfahrensparametern.
Unter Hydroxy-Stickstoff-Heterocyclus-Carbonsäuren werden auch deren Salze, insbesondere deren wasserlösliche Salze, beispielsweise die Alkali- oder Ammoniumsalze, verstanden. Das Enzym mit 6-Methylnicotinsäure-2-dehydrogenase- Aktivität besitzt auch
Nicotinsäuredehydrogenase- Aktivität.
Hydroxy-Stickstoff-Heterocyclus-Carbonsäure-Derivate, wie z. B. 2-Hydroxynicotinsäure, sind wichtige Zwischenprodukte in Wirkstoffsynthesen. Beispielsweise dient 2-Hydroxynicotinsäure als Ausgangsmaterial für 2-Chlornicotinsäure (US-A-4 081 451), welche ein wichtiges Zwischenprodukt zur Herstellung von Pharmazeutika darstellt (Ann. Pharm. Fr., 1980, 38(3), S. 243-252).
Ein Verfahren zur Herstellung von 2-Hydroxynicotinsäure ist in EP-A 0 559 116 beschrieben. Gemäss diesem Verfahren wird Nicotinsäure mittels Mikroorganismen, die eine spezifische Hydroxylase enthalten und derart selektioniert sind, dass sie 6-Methylnicotinsäure als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle über 2-Hydroxy-6-methylnicotinsäure verwerten, in 2-Hydroxynicotinsäure überführt. Diese Mikroorganismen haben jedoch den Nachteil, dass sie eine sehr lange Anzuchtzeit benötigen, da die Verdopplungszeit mit 6-Methylnicotinsäure lang ist. Daher ist das Verfahren nicht wirtschaftlich.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von Hydroxy-Stickstoff-Heterocyclus-Carbonsäuren, wie beispielsweise 2-Hydroxynicotinsäure, bereit zu stellen, bei dem der einzusetzende Biokatalysator entweder keine Anreicherungszeit benötigt oder schneller angezüchtet werden kann. Diese Aufgabe wird mit dem Enzym nach Anspruch 1 und den Polypeptiden nach Anspruch 3, der DNA nach den Ansprüchen 4 und 5, den Mikroorganismen nach Anspruch 9 und den Verfahren nach den Ansprüchen 12 und 13 gelöst.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind demnach ein Enzym mit 6-Methylnicotinsäure-2- dehydrogenase- Aktivität, Polypeptide, die die Untereinheiten dieses Enzyms bilden, DNA, die für das Enzym bzw. die Polypeptide codiert, sowie Mikroorganismen, die mit dieser DNA transformiert sind. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Hydroxy-Stickstoff-Heterocyclus-Carbonsäuren unter Verwendung des Enzyms oder der transformierten Mikroorganismen oder unter Verwendung der „Wildstämme" unter bestimmten Verfahrensparametern. Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Abbildungen näher erläutert.
Fig. 1 zeigt das SDS-PAGE der angereicherten/gereinigten 6-Methylnicotinsäure-2-dehydro- genase. Fig. 2 zeigt den Lineweaver-Burk-Plot.
Fig. 3 zeigt die Inhibition des Enzyms.
Fig. 4 zeigt das Absorptionsspektrum des Enzyms.
Fig. 5 zeigt die Anzucht der Mikroorganismen Ralstonia/Burkholderia.
Fig. 6 zeigt das Wachstum von Ralstonia/Burkholderia mit Pyridin-2,5-dicarbonsäure. Fig. 7 zeigt die relative Hydroxylierungsrate (%) mit Nicotinsäure als Edukt.
Fig. 8 zeigt die Restriktionskarte der DNA-Sequenz.
Fig. 9A und 9B zeigen die Konstruktion der Plasmide pLM25C, pLM25E und pLM25D sowie pLM81E, pLM81D und pLM81C.
Fig. 10 zeigt die Umsetzung von 6-Methylnicotinsäure. Fig. 11A, 1 IB und 1 IC zeigen das Wachstum von Comamonas acidovorans D3 mit oder ohne
Plasmid pLM25 oder pLM25E.
Es wurde überraschend gefunden, daß sich aus Mikroorganismen, die 6-Methylnicotinsäure als einzige Kohlenstoff-, Stickstoff- und Energiequelle verwerten können, ein Enzym mit 6-Methylnicotinsäure-2-dehydrogenase-Aktivität isolieren läßt. Besonders geeignet für diese Isolierung sind Mikroorganismen wie die „Wildstämme" Ralstonia/Burkholderia, insbesondere Ralstonia/Burkholderia KIE101 (DSM 6920), die bereits in der EP-A-0 559 116 detailliert beschrieben sind. Hierzu werden die Mikroorganismenzellen üblicherweise mit fachmännisch üblicher Methoden, wie beispielsweise mit der Ultraschall-, French Press- oder Lysozym- Methode, aufgeschlossen. Die Reinigung (Anreicherung) des erfindungsgemässen Enzyms erfolgt mit fachmännisch üblichen chromatographischen Methoden, vorzugsweise mittels Ionenaustauschchromatographie und/oder Gelfiltration und/oder hydrophober Wechselwirkungschromatographie. Insbesondere erfolgt die Reinigung in der Reihenfolge Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Gelfiltration, Ionenaus- tauschchromatographie und hydrophobe Wechselwirkungschromatographie. Das Enzym weist insbesondere folgende Eigenschaften auf:
a) ein pH-Optimum von 6,8 + 0,5 für Nicotinsäure, von 7,6 ± 0,5 für 6-Methylnicotinsäure und von 9,5 + 0,5 für Chinolin-3 -carbonsäure als Substrat b) ein Temperaturoptimum von 65 ± 5 °C c) eine spezifische Aktivität von 22,6 ± 1,0 U/mg für Nicotinsäure und 6-Methylnicotinsäure und von 20,4 ± 1,0 U/mg für Chinolin-3 -carbonsäure als Substrat d) einen KM-Wert für das Substrat Nicotinsäure von 1,54 + 0,5 mM, für das Substrat 6-Methylnicotinsäure von 0,14 + 0,05 mM und für das Substrat Chinolin-3 -carbonsäure von 0,14 ± 0,05mM e) einen Vmax-Wert für das Substrat Nicotinsäure von 17,0 + 5,0 U/mg, für die Substrate 6-Methylnicotinsäure und Chinolin-3 -carbonsäure von 21,5 ± 5,0 U/mg f) ein natives Molekulargewicht, gemessen mittels Gelfiltration, von 280 000 ± 40 000 D, vorzugsweise 280 000 ± 20 000 D.
Die erfindungsgemässe DNA bzw. die DNA-Fragmente, die für eine 6-Methylnicotinsäure-2- dehydrogenase und die Polypeptiduntereinheiten, codieren, sind durch die Restriktionskarte gemäss Fig. 8 und die Nucleotidsequenzen in SEQ ID No 2, 4 und 6. Die erfindungsgemässen Polypeptide sind durch die Aminosäuresequenzen SEQ ID No. 1, 3 und 5 charakterisiert.
Von der Erfindung umfasst sind auch die funktionell äquivalente genetische Varianten und Mutanten der oben genannten Nucleotidsequenzen, d. h. Gene, die sich von den Wildtyp- Organismen ableiten und deren Genprodukte in ihrer biologischen Funktion im wesentlichen unverändert sind. Die funktioneil äquivalenten genetischen Varianten und Mutanten umfassen somit beispielsweise Basenaustausche im Rahmen der bekannten Degeneration des genetischen Codes, wie sie z. B. künstlich erzeugt werden können, um die Gensequenz an die bevorzugte Codon- Verwertung eines bestimmten Mikroorganismus, in dem eine Expression erfolgen soll, anzupassen. Die genetischen Varianten und Mutanten umfassen auch Deletionen, Insertionen und Substitutionen von Basen oder Codons, soweit die Genprodukte derart veränderter Gene in ihrer biologischen Funktion im wesentlichen unverändert sind. Umfasst werden hierdurch z. B. Gensequenzen, die zu den Wildtypsequenzen eine relativ hohe Homologie aufweisen, wie beispielsweise höher als 60%, und unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit dem
Komplement der Wildtypsequenzen zur Hybridisierung in der Lage sind. Stringente
Hybridisierungsbedingungen sind z. B. Temperaturen zwischen 55 und 70 °C und bei 0,4 mM bis
1 M Salzanteil, insbesondere bei einer Temperatur von 65 °C und bei 750 mM Salzanteil.
Im folgenden wird die 6-Methylnicotinsäure-2-dehydrogenase als Ndh abgekürzt. Dieses Enzym umfaßt wenigstens drei nachgewiesene Strukturuntereinheiten, die im folgenden als NdhA-, NdhB, und NdhC bezeichnet werden. Dabei ist die Nucleotidsequenz von NdhA in SEQ ID No. 2, die entsprechende Aminosäuresequenz in SEQ ID No. 1, die Nucleotidsequenz von NdhB in SEQ ID No 4, die entsprechende Aminosäuresequenz in SEQ ID No. 3, die Nucleotidsequenz von NdhC in SEQ ID No. 6 und die entsprechende Aminosäuresequenz in SEQ ID No. 5 dargestellt. Das für Ndh codierende Operon enthält darüber hinaus zwei weitere offene Leserastern („Open reading frames" der „ORF"), die für weitere Proteine codieren, deren Funktion noch nicht geklärt ist. Die Nucleotidsequenz von ORF1, auch als ndhD bezeichnet, ist in SEQ ID No. 8 und die entsprechende Aminosäuresequenz in SEQ ID No. 7 dargestellt. Die Nucleotidsequenz von
ORF2, auch als ndhE bezeichnet, ist in SEQ ID 13 und die entsprechende Aminosäuresequenz in SEQ ID 14 dargestellt. Die gesamte Nucleotidsequenz des Ndh-Operons einschliesslich der Promotoren ist in SEQ ID 15 dargestellt.
Als Ausgangsmaterial zur Isolierung der erfindungsgemässen DNA können die bereits beschriebenen Wildstämme dienen, die auch als Ausgangsmaterial zur Isolation des erfindungsgemässen Enzyms bzw. der Polypeptide eingesetzt werden.
Die Isolierung der intakten Gene bzw. der intakten DNA-Fragmente kann nach bekannten Methoden ausgehend von einer Genbank eines geeigneten Mikroorganismus wie z. B. der Gattung Ralstonia/Burkholderia, insbesondere mit der Bezeichnung Ralstonia/Burkholderia KIE101 (DSM 6920), erfolgen, aus der die ndh-Gene oder Fragmente davon durch Hybridisierung mit markierten Oligonucleotiden, die Teilsequenzen der ndh-Gene enthalten, in bekannter Weise isoliert und kloniert werden.
Zur Verbesserung der Transkription werden die ndh-Gene zweckmässig unter die Kontrolle eines starken Promotors gestellt. Die Wahl des Promotors hängt von den gewünschten Expressions- bedingungen ab, beispielsweise davon, ob eine konstitutive oder induzierte Expression gewünscht wird, oder von dem Mikroorganismus, in dem die Expression erfolgen soll.
Geeignete Promotoren sind z. B. PL und PR des Phagen Lambda (vgl. Schauter et al., Gene 1987, 52, 279-283), der Ptrc-Promotor (A ann et al., Gene 1988, 69, 301-315), die Promotoren PNm, Psi (M. Labes et al., Gene 1990, 89, 37-46), der Püp-Promotor (Amann et al., Gene 1983, 25, 167-178), der Pιac-Promotor (Amann et al., Gene 1983, 25, 167-178) und der Ptac-Promotor, ein Hybrid aus den genannten Ptφ- und Pιac-Promotoren, der als konstitutiver oder induzierbarer Promotor eingesetzt werden kann (Rüssel und Bennet, Gene 1982, 20, 231-243). Insbesondere wird der Promotor Pιac eingesetzt.
Für die Produktion der Hydroxy-Heterocyclus-Carbonsäuren in einem geeigneten Produktionsstamm werden die rekombinanten ndh-Gene zweckmässig mit Hilfe bekannter Techniken in bekannte geeignete Vektoren, vorzugsweise in Expressionsvektoren eingebaut. Als Vektoren können autonom und selbstreplizierende Plasmide oder Integrationsvektoren verwendet werden.
Als Vektoren eignen sich sowohl Vektoren mit einem spezifischen Wirtsspektrum als auch Vektoren mit einem breiten Wirtsspektrum („broad host ränge").
Beispiele für Vektoren mit spezifischem Wirtsspektrum, z. B. für E. coli sind pBR322 (Bolivar et al., Gene, 2, 95-113), der handelsübliche pBLUESCRIPT-KS+®, pBLUESCRIPT-SK+® (Stratagene), pUC18/19 (Yannisch-Perron et al., Gene 1985, 33, 103-119), pK18/19 (Pridmore, Gene 1987, 56, 309-312), pRK290X (Alvarez-Morales et al., Nucleic Acids Research, 14, 4207- 4227), pGEM-T ® (Promega), pME285 (Haas und Itoh, Gene 1985, 36, 27-36) bzw. dessen Derivate und pRA95 (erhältlich von Nycomed Pharma AS, Huidove, Dänemark).
Als „broad host ränge" Vektoren können alle Vektoren eingesetzt werden, die für Gram-negative Bakterien geeignet sind. Beispiele für solche „broad host ränge" Vektoren sind pRK290 (Ditta et al., Proc. Nat. Acad. Sei. 1980, 77, 7347-7351) oder deren Derivate, pKT240 (Bagdasarian et al, Gene 1983, 26, 273-282) oder dessen Derivate, pGSS33 (Sharpe, Gene 1984, 29, 93-102), pVKIOO (Knauf und Nester, Plasmid 1982, 8, 45-54) bzw. dessen Derivate, pBBRIMCS (Kovach et al, Biotech. 1994, 16, 800-802) und die Vektoren pME6010, pME6012, pME6041, pME6031 bzw. deren Derivate (Haas et ., Mol. Plant Microbe Internet, 2000,73(2), 232-237).
Auf diese Weise wurden beispielsweise die Plasmide pLM25, pLM25C, pLM25D, pLM25E, pLM81 , pLM81 C, pLM8 ID und pLM81E bzw. deren Derivate und Subklone erhalten (Fig. 9A und 9B). Bevorzugt werden die Plasmide pLM25C und pLM25E eingesetzt.
Zur Herstellung der bevorzugtesten Produktionsstämme für die Fermentation der Hydroxy- Heterocyclus-Carbonsäuren sollten die ndh-Gen-Fragmente bzw. Vektoren in die gewünschten und zur Expression geeigneten Wirtsstämme eingebracht werden. Zweckmässig werden die Mikroorganismen hierzu in üblicher und an sich bekannter Weise mit den die ndh-DNA- Fragmente enthaltenden Vektoren transformiert. Die Mikroorganismen können das ndh-Gen- Fragment dann entweder auf einem Vektormolekül oder integriert in ihrem Chromosom enthalten.
Geeignete Wirtsstämme, vorzugsweise Stämme mit hoher Substrat- und Edukt-Toleranz, sind entweder Mikroorganismen, die die Gene für einen geeigneten Cofaktoren-Hintergrund bereits enthalten, oder Mikroorganismen, die mit gentechnischen Methodeen so verändert werden, daß sie die Gene für diesen Cofaktoren-Hintergrund zusammen mit den erfindungsgemässen Genen enthalten. Geeignete Cofaktoren sind Molybdän-Cofaktoren wie z. B. Molybdopterin, insbesondere Molybdopterin-Cytosin-Dinucleotid, Flavinnucleotid-Cofaktoren wie z. B. Flavin- Adenin-Dinucleotid (FAD) sowie Eisen Schwefel-Cofaktoren.
Beispiele für Mikroorganismen, die den geeigneten Cofaktoren-Hintergrund bereits enthalten sind Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas, Comamonas, Rhodococcus, Agrobacterium, Arthrobacter und Hydrogenophaga. Vorzugsweise geeignet sind die Mikroorganismen der
Spezies Comamonas acidovorans, Comamonas testosteroni wie z. B. Comamonas testosteroni 63, Pseudomonas putida, Pseudomonas carboxydovorans, Pseudomonas carboxydoflava, Pseudomonas diminuta, Rhodococcus sp. wie z. B. Rhodococcus sp. Bl, Agrobacterium sp. wie z. B. Agrobacterium sp. IB, Arthrobacter sp., Arthrobacter picolinophilus und Hydrogenophaga pseudoflora. Insbesondere geeignet sind die Stämme Comamonas acidovorans D3 und Comamonas testosteroni 63. Beispiele für Mikroorganismen, in die der geeignete Cofaktoren-Hintergrund zusammen mit den erfmdungsgemässen Genen einkloniert werden kann, sind Bacillus, Acinetobacter, Alcaligenes, Escherichia, Clostridium, Proteus und Rhodobacter. Vorzugsweise geeignet sind die Mikroorganismen der Spezies Bacillus niacini, Alkaligenes faecalis, Escherichia coli, Clostridium barkeri, Proteus vulgaris, Rhodobacter sphaeroides und Rhodobacter capsulatus.
Vorzugsweise wird das Verfahren mittels Mikroorganismen durchgeführt, die den geeigneten Cofaktoren-Hintergrund bereits enthalten.
Der Mikroorganismus Comamonas acidovorans D3, enthaltend Plasmid pLM25C, wurde am 31.05.2001 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, gemäss Budapester Vertrag unter der Nummer DSM 14326 hinterlegt.
Die erfmdungsgemässe Biotransformation kann entweder mittels der oben beschriebenen isolierten Polypeptide und Enzyme (immobilisiert oder nicht immobilisiert), mittels gentechnologisch veränderter Mikroorganismen, die mit der erfindungsgemässen DNA oder Fragmenten davon transformiert sind, oder mittels der „Wildstämme" der Gattung Ralstonia/Burkholderia erfolgen, die vor der eigentlichen Biotransformation entweder in Gegenwart eines induzierenden Wachstumssubstrates oder in Gegenwart eines geeigneten nicht induzierenden Wachstumssubstrates und eines Induktors angezüchtet wurden.
Unter einem immobilisierten Enzym wird ein an ein geeignetes Trägermaterial gebundenes oder ein adsorbiertes, das beispielsweise eingebettet in einem Polymer vorliegt, verstanden.
Als Substrate (Edukte) für die Biotransformation können Stickstoff-Heterocyclus-Carbonsauren der allgemeinen Formeln IV bis VI
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000011_0002
worin R1, R2, R3 und R4, die gleich oder verschieden sein können, jeweils ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine Alkylgruppe, eine Alkoxygruppe, eine Arylgruppe, eine Arylalkylgruppe, eine Heteroarylgruppe oder eine Carbonsauregruppe bedeuten und X ein Stickstoffatom oder CR5, worin R5 ein Wasserstoff- oder Halogenatom ist, bedeutet, verwendet werden
Alkyl, allein oder in Zusammensetzungen wie Arylalkyl, bedeutet hier und im folgenden lineares oder verzweigtes Alkyl, vorzugsweise Cι_ιo-Alkyl, insbesondere Cι-4-Alkyl Beispiele für Alkyl sind Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, tert-Butyl, Pentyl, Νeopentyl, Hexyl und seine Isomere
Alkoxy bedeutet dementsprehend hier und im folgenden lineares oder verzweigtes Alkoxy, vorzugsweise Cι-ιo-Alkoxy, insbesondere Cι- -Alkoxy Beispiele für Alkoxy sind Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropoxy, Butoxy, Isobutoxy, tert-Butoxy, Pentyloxy und seine Isomere und Hexyloxy und seine Isomere
Halogen bedeutet hier und im folgenden F, Cl, Br oder I
Eine Carbonsauregruppe ist die Gruppe -COOH Aryl, allein oder in Zusammensetzungen wie Arylalkyl, bedeutet Phenyl oder Naphthyl, substituiert oder unsubstituiert. Unter substituiertem Aryl wird hier und im folgenden ein mit ein oder mehreren Halogenatom und/oder Alkylgruppen substituiertes Aryl verstanden. Beispiele für substituiertes Aryl sind Bromphenyl, Chlorphenyl, Tolyl, Ethylnaphthyl und Chlornaphthyl.
Arylalkyl bedeutet vorzugsweise substituiertes oder unsubstituiertes Benzyl.
Heteroaryl bedeutet vorzugsweise Pyridyl, Chinolyl oder Isochinolyl.
Zweckmässige Substrate sind Nicotinsäure, 6-Fluornicotinsäure, 5,6-Difluornicotinsäure,
6-Chlornicotinsäure, 5,6-Dichlornicotinsäure, 6-Bromnicotinsäure, 6-Methylnicotinsäure, Pyrazin- 2-carbonsäure, 5-Chlorpyrazin-2-carbonsäure, 5-Methylpyrazin-2-carbonsäure, 6-Methoxynicotinsäure, Picolinsäure, Pyridin-3,5-dicarbonsäure und Chinolin-3 -carbonsäure.
Wird die Biotransformation mittels der „Wildstämme" bzw. mit deren funktioneil äquivalenten Narianten und Mutanten durchgeführt, werden die Mikroorganismen erfindungsgemäss vor der eigentüchen Biotransformation in Gegenwart eines induzierenden Wachstumssubstrates oder in Gegenwart eines geeigneten nicht induzierenden Wachstumssubstrates und eines Induktors angezüchtet. Die Mikroorganismen der Gattung Ralstonia/Burkholderia KIE101 sind bekannt und bereits in EP-A-0 559 116 beschrieben. Diese Mikroorganismen wurden bereits am
10.02.1992 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, gemäss Budapester Vertrag unter der Nummer DSM 6920 hinterlegt.
Unter „funktioneil äquivalenten Varianten und Mutanten" werden Mikroorganismen verstanden, die im wesentlichen dieselben Eigenschaften und Funktionen wie die Ursprungsmikroorganismen besitzen. Derartige Varianten und Mutanten können zufällig, z. B. durch UV-Bestrahlung, gebildet werden.
Unter einem „induzierenden Wachstumssubstrat" wird hier und im folgenden entweder ein Nährmedium, das einen Induktor enthält, oder eine Verbindung, die im Mikroorganismus das entsprechende Enzym aktiviert und mit der der Mikroorganismus wachsen kann, verstanden. Unter einem „Nährmedium" wird hier und im folgenden entweder ein „Vollmedium" wie beispielsweise Nutrient Broth (NB), Luria Broth (LB) oder ein Mineralsalzmedium wie z. B. gemäss Tinschert et al. (Arch. Microbiol. 1997, 168, 355-361) und Kulla et al. (Arch. Microbiol.
1983, 135, 1-1), enthaltend zusätzliche Energiequellen wie beispielsweise Hefeextrakt, Pepton,
Aminosäuren, verstanden.
Gegebenenfalls können die Mineralsalzmedien mit Vitaminen angereichert werden.
Als Vitamine können alle wasserlöslichen Vitamine verwendet werden wie beispielsweise p-Aminobenzoesäure, Biotin, Pantothenate, Thiamin, Pyridoxalhydrochlorid und Vitamine der Vitamin B12-Gruppe wie z. B. Cyanocobalamin.
Die zusätzliche Energiequelle wird zweckmässig in einer Menge von 0,01 bis 10 Gew.%, vorzugsweise in einer Menge von 0,1 bis 5 Gew.% zugegeben. Die Vitamine werden zweckmässig in einer Menge von 0,0001 bis 0,1 Gew.% zugegeben.
Unter einem „nicht induzierenden Wachstumssubstrat" werden Verbindungen verstanden, mit denen der Mikroorganismus wächst, das entsprechende Enzym im Mikroorganismus jedoch nicht aktiviert wird.
Wird die Anzucht mit einem nicht induzierenden Wachstumssubstrat in Gegenwart eines Induktors durchgeführt, wird zweckmässig eine wässrige Suspension eingesetzt. Unter einer wässrigen Suspension wird eine Mikroorganismen-Suspension verstanden, die in einem Puffer oder in einem Mineralsalzmedium kultiviert wird. Als Puffer wird vorzugsweise ein niedermolarer Phosphatpuffer eingesetzt. Als niedermolare Phosphatpuffer können 10-300 mM Kalium- oder Natriumphosphatpuffer eingesetzt werden.
Als geeignete nicht induzierende Wachstumssubstrate können Pyridinderivate oder Pyrazin- derivate eingesetzt werden. Als Pyridinderivat wird zweckmässig Pyridin-2,5-dicarbonsäure eingesetzt. Als Pyrazinderivat wird zweckmässig 5-Methylpyrazin-2-carbonsäure eingesetzt. Vorzugsweise wird als geeignetes nicht induzierendes Wachstumssubstrat Pyridin-2,5-dicarbon- säure verwendet. Als Induktoren sind 6-Alkylnicotinsäurederivate geeignet, wie beispielsweise 6-Methylnicotin- säure und 2-Hydroxy-6-methylnicotinsäure. Die Konzentration des Induktors liegt zweckmässig in einem Bereich von 0,01 bis 10 Gew.%, vorzugsweise in einem Bereich von 0,01 bis 5 Gew.%.
Bevorzugt werden die Mikroorganismen in Gegenwart eines induzierenden Wachstumssubstrates wie in einem Vollmedium enthaltend zusätzlich einen Induktor oder in einem Mineralsalzmedium enthaltend zusätzlich Induktor und Hefeextrakt angezüchtet.
Üblicherweise erfolgt die Anzucht und Selektion bei einer Temperatur von 5 bis 45 °C, vorzugs- weise bei einer Temperatur von 20 bis 35 °C und bei einem pH von 4 bis 10, vorzugsweise bei einem pH von 6 bis 9.
Die Biotransformation (sowohl die mit dem isolierten Enzym als auch die mittels der „Wildstämme" und der gentechnologisch veränderten Mikroorganismen) kann in fachmännisch üblichen Medien durchgeführt werden wie beispielsweise in niedermolaren Phosphatpuffera wie Natriumoder Kaliumphosphatpuffer, HEPES-Puffer, Citratpuffer, Tris-HCl, Carbonatpuffer wie Natriumoder Kaliumcarbonatpuffer, Boratpuffer oder Imidazolpuffer. Die niedermolaren Phosphatpuffer liegen zweckmässig im Konzentrationsbereich von 1-500 mM, vorzugsweise 1-200 mM. Wird eine neutralisierte Substratlösung eingesetzt, kann die Biotransformation auch in Wasser (ungepuffert) durchgeführt werden.
Zweckmässig wird die Biotransformation bei einer Temperatur von 15 bis 70 °C, vorzugsweise bei einer Temperatur von 20 bis 40 °C, durchgeführt. Der pH- Wert liegt üblicherweise in einem Bereich von 5 bis 10, vorzugsweise von 6 bis 9.
Zweckmässig wird die Biotransformation unter einmaliger oder kontinuierlicher Substratzugabe so durchgeführt, dass die Substratkonzentration 1000 mM, vorzugsweise 500 mM nicht übersteigt.
Wenn die Umsetzung mittels der beschriebenen „Wildstämme" durchgeführt wird, wird die Biotransformation zweckmässig unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Unter aeroben Bedingungen werden Kulturbedingungen verstanden, bei denen die Mikroorganismen mit Sauerstoff versorgt werden. Dies kann z. B. in Schüttelkultur durch Luftsauerstoff oder in Submerskultur durch Einblasen von molekularem Sauerstoff oder Luftsauerstoff erfolgen.
Sollen die Hydroxy-Stickstoff-Heterocyclus-Carbonsäuren der allgemeinen Formel I, in denen R1 ein Wasserstoffatom und R2 eine Cι_ι<r Alkylgruppe bedeuten, wie z. B. 2-Hydroxy-6-methyl- nicotinsäure, in hervorragender Ausbeute erhalten werden, wird die Biotransformation mit den „Wildstämmen" zweckmässig entweder unter Sauerstoff-limitierenden Bedingungen oder mit relativ hohen Konzentrationen des entsprechenden Substrates durchgeführt.
Unter „relativ hohen Substratkonzentrationen" werden zweckmässig Konzentrationen von mindestens 5 mM, vorzugsweise von mindestens 10 mM, verstanden.
Unter „Sauerstoff-limitierenden Bedingungen" wird verstanden, wenn nach Anzucht der Biomasse das Substrat für die Biotransformation hinzugefugt und dann die eigentliche Biotransformation ohne Schütteln und ohne Belüftung durchgeführt wird.
Nach der Biotransformation werden die erhaltenen Hydroxy-Stickstoff-Heterocyclus-Carbon- säuren auf fachmännisch übliche Weise, beispielsweise durch Ausfällen mittels einer Säure wie beispielsweise Schwefelsäure, erhalten.
Die bevorzugten Hydroxy-Stickstoff-Heterocyclus-Carbonsäuren sind 2-Hydroxy-6-methyl- nicotinsäure, 2-Hydroxynicotinsäure, 2-Hydroxy-6-chlornicotinsäure, 2-Hydroxy-5,6-dichlor- nicotinsäure, 2-Hydroxy-6-fluornicotinsäure, 2-Hydroxy-5,6-difluornicotinsäure, 2-Hydroxy- 6-methoxynicotinsäure, 6-Hydroxypicolinsäure, 3-Hydroxypyrazin-2-carbonsäure, 3-Hydroxy- 5-methylpyrazin-2-carbonsäure, 3-Hydroxy-5-chlorpyrazin-2-carbonsäure und 2-Hydroxy- chinolin-3-carbonsäure. Beispiel 1
Induktion der 6-Methylnicotinsäure-2-dehydrogenase in Ralstonia/Burkholderia
Ralstonia/Burkholderia KIE101 (DSM 6920) wurde aerob im Medium gemäss Tinschert et al. (Arch. Microbiol. 1997, 168, 355-361) mit a) 6-Methylnicotinsäure, b) 2-Hydroxy-6-methyl- nicotinsäure oder c) Pyridin-2,5-dicarbonsäure als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle angezüchtet.
Die Biomassen wurden jeweils durch Zentrifugation geerntet, in Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,2) gewaschen und danach im gleichen Phosphatpuffer so resuspendiert, dass die ODesonm = 2,5 resultierte. Anschliessend wurde die Aktivität der 6-Methylnicotinsäure-2-dehydrogenase der drei
Biomassen durch Zugabe von Nicotinsäure (10 mM) getestet.
Die Ergebnisse — die relativen Umsatzraten (%) der Biomasse für Nicotinsäure — sind in Fig. 7
(Induktion der 6-Methylnicotinsäure-2-dehydrogenase in Ralstonia/Burkholderia) dargestellt. Die
Ergebnisse belegen, dass das Enzym 6-Methylnicotinsäure-2-dehydrogenase in Ralstonia/Burkholderia sp. (DSM 6920) induzierbar ist: Die mit 6-Methylnicotinsäure oder
2-Hydroxy-6-methylnicotinsäure angezüchteten Biomassen zeigen gute Induktion des Enzyms und der Induktionslevel in diesen beiden Biomassen ist auf etwa gleichem, hohem Niveau (Fig. 7;
100% = 0,28
Figure imgf000016_0001
Mit Pyridin-2,5-dicarbonsäure angezogene Biomasse dagegen war nicht induziert.
Beispiel 2 Enzymreinigung
Für die Enzymreinigung wurden die Mikroorganismen mit der Bezeichnung
Ralstonia/Burkholderia KΣE101 (DSM 6920) entsprechend EP- A-0 559 116 angezüchtet.
2.1 Aktivitätsbestimmung des Enzyms aus Mikroorganismen mit der Bezeichnung Ralstonia/Burkholderia KDE 101
Die Standardtestmethode-Mischung enthielt 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6,8), 10 mM Nicotinsäure und 0,04% (w/v) Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT) in einem Endvolumen von 1 ml. Die Reaktion wurde durch die Zugabe des Enzyms bei 37 °C gestartet und die Aktivität wurde kontinuierlich durch den Anstieg der Absorption bei 535 nm (Extinktionskoeffizient:
18,3 m-M^cπf ) gemessen. 1 Unit (U) Aktivität wurde definiert als 1 μmol reduziertes NBT pro min. Die Substratspezifität der 6-Methylnicotinsäure-2-dehydrogenase wurde im Standardtest gemessen, indem die Nicotinsäure durch andere Substrate in derselben Konzentration ersetzt wurde.
2.2 Enzymreinigung mittels Chromatographie
Alle Reinigungsschritte wurden, wenn nicht anders angegeben, bei 4 °C durchgeführt. Die nassen Zellen wurden in 2fachem Volumen Puffer A (50 mM Tris-HCl, pH 7,5) suspendiert und nach Zugabe von 3 μl Benzonase pro 10 ml Suspension und 10 mM Phenylmethansulfonylfluorid wurden die Zellen 2mal mittels der French-Presse bei 110 MPa behandelt. Zelltrümmer und Membranen wurden durch Zentrifugation bei 30 000xg für 30 min und bei 100 000xg für 1 h entfernt. Der verbleibende Überstand wurde als Rohextrakt bezeichnet. Die während der Reinigung zu verwendende Chromatographie-Säulengrösse und die entsprechenden Durchflussraten wurden entsprechend dem Gesamtprotein-Gehalt eingesetzt. Der Rohextrakt wurde zuerst auf eine Q-Sepharose „Fast Flow" Säule aufgetragen, die mit Puffer A äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit Puffer A gewaschen und die gebundene 6-Methylnicotinsäure-2-dehydro- genase wurde mit einem linearen Puffer A-Gradienten enthaltend bis zu 1,0 M KC1 in Puffer A, eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und auf eine Endkonzentration von 1 M
Ammoniumsulfat gebracht, indem das Salz unter Rühren hinzugegeben wurde. Das präzipitierte Protein wurde durch Zentrifugation bei 30 000χg für 20 min entfernt. Der Überstand wurde auf eine Phenyl-Sepharose-Säule, die zuvor mit Puffer A enthaltend 1 M Ammoniumsulfat äquilibriert worden war, aufgetragen. Nach Waschen im gleichen Puffer wurde das gebundene Protein mit einem linearen Gradienten Puffer A enthaltend 1 M Ammoniumsulfat bis 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, eluiert. Die vereinigten Fraktionen wurden mittels Ultrafiltration konzentriert und auf eine Superdex 200 Säule, die zuvor mit Puffer A äquilibriert worden war, aufgetragen. Die Fraktionen mit 6-Methylnicotinsäure-2-dehydrogenase-Aktivität wurden vereinigt und die nachfolgende Chromatographie an einer Mono Q Säule wurde entsprechend der mittels Q-Sepharose durchgeführt. Nach Zugabe von 0,5 M Ammoniumsulfat zum erhaltenen „6-Methylnicotinsäure- 2-dehydrogenase-Pool" (enthaltend ungefähr 0,8 M KC1) wurde das präzipitierte Protein durch Zentrifugation entfernt. Der Überstand wurde auf eine Butyl-Sepharose-Säule, die mit Puffer A enthaltend 0,5 M Ammoniumsulfat äquilibriert worden war, aufgetragen. Die 6-Methylnicotin- säure-2-dehydrogenase wurde mit Puffer A enthaltend 0,5 M Ammoniumsulfat eluiert.
Das erhaltene Enzym wurde mittels einer G-25-Säule, die mit Puffer A äquilibriert worden war, entsalzt und das gereinigte Protein bei -20 °C aufbewahrt.
Wie aus Tabelle 1 ersichtlich, wurde das Enzym in 5 Schritten 134fach angereichert.
Tabelle 1
Reinigung der 6-Methylnicotinsäure-2-Dehydrogenase
Reinigungsschritt Gesamt- Gesamt- Spezifische Ausbeute Anreicherungs¬
Protein Aktivität Aktivität faktor
[mg] [U] [U/mg][%]
Rohextrakt 207 28,2 0,14 100 1
Q-Sepharose 51,0 28,0 0,55 100 4
Phenyl- S epharose 7,1 14,2 2,0 52 15
Superdex 200 1,8 12,2 6,8 42 50
Mono Q 1,1 8,0 7,3 28 54
Butyl-Sepharose 0,41 7,5 18,4 27 134
HPLC-Analysen zeigten, dass das Enzym kovalent Flavin gebunden hat, welches als FAD nachgewiesen wurde.
Die Metallanalyse durch „induziert gekoppelte Plasma-Massenspektroskopie" ergab, dass das gereinigte Enzym 0,8 mol Molybdän, 3,7 mol Eisen und 0,9 mol Zink pro mol Protomer von einem Molekulargewicht von 121 000 enthält. Es wurde auch ein Durchschnittswert von 4 mol säurelabilem Schwefel pro mol Protomer festgestellt. Wie aus Fig. 4 ersichtlich, weist das Enzym keine Häm-Struktur auf. Beispiel 3
Charakterisierung der 6-Methylnicotinsäure-2-dehydrogenase
3.1 Bestimmung des Molekulargewichts unter denaturierenden Bedingungen
Das zur Homogenität gereinigte Enzym wurde unter denaturierenden Bedingungen mittels SDS-PAGE (SDS = Natriumdodecylsulfat) gemäss Laemmli (Nature 1970, 227, 680-685) in 12,5-18% Polyacrylamid-Gelen analysiert. Die Proben wurden für 4 min bei 95 °C nach Zugabe des gleichen Volumens Denaturierungspuffer inkubiert. Die Elektrophorese wurde bei konstantem Strom bei 25 mA und bei maximaler Spannung durchgeführt. Die Gele wurden entweder mittels Coomassie Brilliant Blau oder mittels „silver stain" angefärbt.
Die Struktur der Untereinheiten wurden mittels SDS-PAGE ermittelt. Das Enzym besteht aus 3 verschiedenen nachgewiesenen Strukturuntereinheiten mit einem Molekulargewicht von 16 000 D, 30 000 D und 75 000 D. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 zusammengefasst. Die addierten Molekulargewichte ergaben eine Summe von 121 000 D, was für eine 1 : 1-Stöchiometrie spricht. Aus diesen Daten wird das Vorliegen eines Hexameren α2ß γ2 abgeleitet.
3.2 Bestimmung des nativen Molekulargewichts
Hierzu wurde die Gelfiltrationschromatographie oder eine native Gradienten-PAGE angewendet. Eine FPLC Superdex 200 Säule (300x 10 mm) wurde mit PufferA äquilibriert. Die 6-Methyl- nicotinsäure-2-dehydrogenase wurde auf die Säule mit einer Durchflussrate von 0,25 ml/min aufgetragen. Zusätzlich wurde noch eine Hiload Superdex 200 Säule (600x16 mm) unter den gleichen Bedingungen durchgeführt. Die native lineare PAGE mit 4-27,5 Polyacrylamid wurde gemäss Margolis & Kenrick (Nature 1967, 214, 1334-1336) durchgeführt. Das native Molekulargewicht betrug 280 000 ± 40 000 D. 3.3 pH-Optimum
Die pH-Optima der verschiedenen Substrate wurden in folgenden Pufferlösungen gemessen: 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 5,0-7,5), 50 mM Tris-HCl (pH 7,0-8,5) und 50 mM HEPES ([4-(2-Hydroxyethyl)piperazino]ethansulfonsäure; pH 7,5-9,5). Die pH-Optima für 3 verschiedene Substrate sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Tabelle 2 pH-Optima
Substrate Aktivität (U/mg) bestimmt bei pH 6,8 pH 7,6 pH 9,5
Nicotinsäure 22,6 18,1 0
6-Methylnicotinsäure 17,0 22,6 3,8
Chinolin-3 -carbonsäure 18,0 10,6 20,4
Pyridin-3,5-dicarbonsäure wurde auch schwach umgesetzt.
Die kinetischen Parameter für jedes Substrat wurden bei dem entsprechenden pH-Optimum durch Variieren der Konzentrationen (5-10 μM) im Standardtest bestimmt.
3.4 Bestimmung des KM und Vmax-Wertes
Die Km und Vmax-Werte wurden direkt aus dem Lineweaver-Burk-Plot ermittelt. Die KM und Vmax- Werte sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
Tabelle 3
KM und Vmax-Werte bei verschiedenen Substraten
Substrate KM Vma μM U/mg
Nicotinsäure 154 17,0
6-Methylnicotinsäure 14 21,5
Chinolin-3 -carbonsäure 14 21,5
Wie aus Tabelle 3 ersichtlich, ist der KM-Wert für Nicotinsäure im Vergleich zu 6-Methylnicotin- säure und Chinolin-3 -carbonsäure 10 mal höher.
Der Lineweaver-Burk-Plot ist in Fig 2 dargestellt.
3.5 Elektronenakzeptoren
Untersuchungen bezüglich der Spezifität von Elektronenakzeptoren, die durch die 6-Methyl- nicotinsäure-2-dehydrogenase reduziert werden, wurden ebenfalls unter Standardtestbedingungen durchgeführt mit Nicotinsäure als Elektronen-Donor. Die benutzten Konzentrationen (mM) und Absorptionskoeffizienten (mM-1 cm-1) waren 1 und E 20 = 1 für Ferricyanid, 0,1 und E578 = 14,4 für Methylenblau, 0,1 und E550 = 21,1 für Cytochrom C, 0,2/0,07 und E522 = 8,6 für 2,6- Dichlorphenol/Indophenol/Phenazinethosulfat. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefasst.
Tabelle 4
Elektronenakzeptoren, die von der 6-Methylnicotinsäure-2-dehydrogenase verwendet werden.
Elektronenakzeptoren Relative Aktivität
(mM) %
Nitroblautetrazoliumchlorid (1,8) 100
Dichlorphenolindophenol + Phenazinethosulfat (0,2 + 0,07) 74 Methylenblau (0,1) 73
Cytochrom C (0,l) 3
Ferricyanid (1) 0
Keine Aktivität wurde mit dem Elektronenakzeptor Nicotinsäureamid-Adenin-Dinucleotid (NAD) oder mit Nicotinsäureamid-Adenin-Dinucleotidphosphat (NADP) festgestellt.
3.6 Inhibitoren
Die Inaktivierung der 6-Methylnicotinsäure-2-dehydrogenase durch Inhibitoren wurde Puffer A, enthaltend 2,4 μM homogenes Enzym untersucht. Nach Zugabe des Inhibitors wurden Aliquots zu verschiedenen Intervallen entnommen und im Standardtest analysiert. Der Einfluss von Arsenit auf die Enzymaktivität wurde in einem Konzentrationsbereich von 1-10 mM bei Raumtemperatur gemessen. Kaliumcyanid wurde in Konzentrationen von 0,38 oder 1 mM eingesetzt. Die Inaktivierungskinetiken wurden bei 0 °C bestimmt.
Wie in Fig. 3 gezeigt, wird das Enzym zu 90% durch 2,5minütige Inkubation mit 1 mM Kaliumcyanid bei 0 °C gehemmt. Keine Inaktivierung wurde in Gegenwart von 10 mM Natriumarsenit beobachtet. Gezeigt ist die Inkubation bei 0 °C in Gegenwart von 0,375 mM Kaliumcyanid (•) und die Inkubation bei 0 °C in Gegenwart von 1 mM Kaliumcyanid (O). 3.7 Metall- und Cofaktoren-Bestimmung
Der Molybdän-, Eisen- und Zink-Gehalt wurde durch induzierte gekoppelte Plasma-Massen- spektrometrie unter Verwendung von 2 mg gereinigtem Protein bestimmt. Säure-labiler Schwefel wurde nach Beinert (Anal. Biochem. 1983, 131, 373-378) bestimmt.
3.8 Spektralbestimmungen und Proteinbestimmung
Die „steady-state" Kinetik und das UV Absorptionsspektrum (Fig. 4) wurden mit einem Uvikon® 930 Spektrophotometer (Kontron) bei 30 °C gemessen. Die Spektralanalyse wurde mit homogenem Enzym (14,7 μM) in Puffer A durchgeführt. Das Spektrum des reduzierten Proteins wurde nach Zugabe von 2 mM Nicotinsäure erhalten.
Wie aus Fig. 4 ersichtlich, weist das isolierte Enzym ein Maximum bei 274 nm, einen doppelten
Peak bei 434 und 465 nm und eine Schulter bei 317 und 550 nm auf.
Die Spektraleigenschaften der 6-Methylnicotinsäure-2-dehydrogenase lassen darauf schliessen, dass das Enzym mindestens ein Eisen/Schwefel-Zentrum besitzt.
Die Proteinbestimmung wurde nach der Methode von Bradford (Anal. Biochem. 1976, 72, 248- 254) durchgeführt.
3.9 Nucleotide
Die Nucleotide der 6-Methylnicotinsäure-2-dehydrogenase wurden vom gereinigten Enzym durch Säure und Hitzebehandlung freigesetzt. Hierzu wurde Schwefelsäure 3% (v/v) zu 1,2 mg Protein in Puffer A hinzugegeben. Nach 10-minütigem Abkochen wurde präzipitiertes Protein mittels Zentrifugation entfernt. Der verbleibende Überstand wurde mittels HPLC (LiChrospher® 300 RP18 Säule (250x4 mm) mit einem Photodiode-Detektor analysiert. Isokratische Elution wurde mit 0,2 M Ammoniumsulfat-Lösung (pH 4,0), enthaltend 1% Acetonitril bei einer Durchflussrate von 1 ml min durchgeführt. Cytosinmonophosphat (CMP), Guanosinmonophosphat (GMP) und Adenosinmonophosphat (AMP) wurden für die Identifizierung und die quantitative Bestimmung von in der 6-Methylnicotinsäure-2-dehydrogenase enthaltenen Nucleotiden eingesetzt. Die Spektren von jedem Nucleotid wurden aufgezeichnet und mit authentischen Standards verglichen. FAD wurde vom Protein durch Säureextraktion extrahiert und nachfolgend durch Spektrometrie analysiert. Das Protein enthielt 0,3 mol FAD/Protomer.
Nach Säurebehandlung des gereinigten Enzyms wurde der Überstand mittels HPLC analysiert. Dabei wurde CMP identifiziert. Insgesamt wurden 0,4 mol CMP pro mol Enzymprotomer ermittelt. Ebenso wurde AMP als Hydrolyseprodukt von FAD ermittelt.
Beispiel 4 Bildung von 2-Hydroxynicotinsäure mittels gereinigter 6-Methylnicotinsäure-2-dehydro- genase
Die Reaktionsprodukte, die ausgehend von Nicotinsäure und 6-Methylnicotinsäure durch homogene Katalyse der 6-Methylnicotinsäure-2-dehydrogenase gebildet wurden, wurden identifiziert und quantifiziert durch UV-Absorption-Charakteristika entsprechend Tinschert et al. (Arch. Microbiol. 1997, 168, 355-361).
Die Hydroxylierung von 6-Methylnicotinsäure ergab einen „shift" im Absorptionsmaximum von 265 nm zu 312 nm. Ein ähnlicher „shift" von 262 zu 305 nm wurde nach der Hydroxylierung von Nicotinsäure beobachtet. Die molaren Extinktionskoeffizienten wurden mit authentischen Standards entsprechend Tinschert et al. (1997, ibid.) bestimmt. Die Identifizierung und quantitative Bestimmung der Produkte (Tabelle 5) erfolgte durch deren Isolierung und mittels 1H NMR, 13C NMR, Massenspektroskopie und UV-Spektroskopie sowie Vergleich mit authentischen Standards.
Beispiel 5
Herstellung von Hydroxy-Stickstoff-Heterocyclus-Carbonsäuren mittels Mikroorganismen
(enthaltend eine 6-Methylnicotinsäure-2-dehydrogenase)
5.1 Verbesserung des Wachstums durch Verwendung von Pyridin-2,5-dicarbonsäure
Ralstonia/Burkholderia KIE101 (DSM 6920) wurde aerob im Medium gemäss Tinschert et al. (1997, ibid.) mit Pyridin-2,5-dicarbonsäure (10 mM) als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle getestet. Parallel dazu wurde zum Vergleich das Wachstum mit 6-Methylnicotinsäure (10 mM) als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle getestet. Die Wachstumsgeschwindigkeit in der exponentiellen Wachstumsphase war mit Pyridin-2,5-dicarbonsäure (Verdopplungszeit ta = 8,2 h) wesentlich schneller als mit 6-Methylnicotinsäure (ta = 10,7 h). Die Ergebnisse sind in Fig. 6 dargestellt. Eine weitere Reduktion der Anzuchtzeit Hess sich durch zusätzliche Gabe von 0, 1 % Hefeextrakt (0, 1 % YE) erzielen. Obwohl der Stamm mit Hefeextrakt alleine nicht zu wachsen vermag, bewirkt der Hefeextrakt-Zusatz ein schnelleres Wachstum, wenn der Hefeextrakt zusätzlich zu 6-Methylnicotinsäure oder Pyridin-2,5-dicarbonsäure dem Medium hinzugefügt wurde. Das schnellste Wachstum erfolgte mit 10 mM Pyridin-2,5-dicarbonsäure plus 0,1 % Hefeextrakt (Verdopplungszeit ta = 7,3 h). In diesem Medium war das Wachstum um mehr als 30 % schneller als im Medium mit 6-Methylnicotinsäure.
Die Verwendung von Pyridin-2,5-dicarbonsäure als Substrat ermöglicht eine schnellere Anzucht von Biomasse des Stammes.
5.2 Kulturbedingungen und Wachstumsexperimente
Ralstonia/Burkholderia KIE101 (DSM 6920) wurde aerob in dem Medium gemäss Tinschert et al. (1997, ibid) mit verschiedenen Heterocyclen als einzige C- und Energiequelle bei pH 7,2 kultiviert. In einigen Experimenten wurde Hefeextrakt (0, 1%) oder eine Vitaminlösung gemäss Pfennig (Int.
J. Syst. Bacteriol. 1978, 28, 283-288) hinzugefügt. Die Vitaminlösung setzte sich folgendermassen zusammen: ?-Aminobenzoesäure 0,04 mg/1
D-(+)-Biotin 0,01 mg/1 Calcium-D-(+)-pantothenat 0,10 mg/1
Pyridoxalhydrochlorid 0,15 mg/1
Thiamin 0,10 mg/1
Cyanocobalamin (Vitamin Bχ2) 0,05 mg/1
Die Kulturen wurden unter Schütteln (140 Upm) in Erlenmeyerkolben bei 30 °C kultiviert und das Wachstum der Zellen wurde durch Messung der optischen Dichte bei 650 nm (OD65o) beobachtet.
Wie aus Fig. 5 ersichtlich, wuchs der Stamm in dem oben genannten Mineralsalzmedium mit 6-Methylnicotinsäure als einziger C- und Energiequelle mit einer Verdopplungszeit von 13,5 h. Wenn zusätzlich Hefeextrakt (0,1%) hinzugefugt wurde, wuchs der Stamm um 1/3 schneller als ohne Hefeextrakt-Zugabe (Verdopplungszeit 9 h). Die gleiche Wachstumsgeschwindigkeit wurde erreicht, wenn Hefeextrakt durch „Nutrient Broth" (NB) ausgetauscht wurde.
Fig. 5 zeigt die Wachstumskurve von Ralstonia/Burkholderia KIE101 (DSM 6920) in
Flüssigkultur ( Dβso) während des Wachstums mit 6-Methylnicotinsäure (10 mM) in drei verschiedenen Medien bei 140 Upm. Die Medien waren das Mineralsalzmedium gemäss Tinschert et al. (1997, ibid.) enthaltend Vitamine (■), das gleiche Medium ohne Vitamine (□), das gleiche
Medium enthaltend Vitamine und 0,1% Hefeextrakt (♦). Des weiteren wurde das Wachstum in dem Medium gemäss Tinschert et al. (1997, ibid.) ohne Schütteln durchgeführt (Δ).
5.3 Biotransformationen
Exponentiell gewachsene Zellen wurden geerntet und 2mal mit Natriumphosphatpuffer (50 mM, pH 7,2) gewaschen und in dem gleichen Puffer resuspendiert. Dann wurden die in der Tabelle 5 aufgeführten Substrate derart hinzugegeben, dass die Endkonzentration 1-10 M betrug.
Für präparative Biotransformationen wurde ein Aliquot der resuspendierten Zellen in den
Substrat-enthaltenen Phosphatpuffer so hinzugegeben, dass das Endvolumen 25 ml und die
Substratkonzentration 0,3-1,23%) (siehe Tabelle 5) betrug.
Für Induktionsexperimente wurde die Biotransformation durch die Zellen nach Induktion wie oben beschrieben behandelt, jedoch bei einer OD650nm = 2,5 mit Nicotinsäure (10 mM) als
Substrat.
Die Biotransformationen wurden in einem Schüttelkolben (120 Upm) bei 30 °C durchgeführt.
Um die Biotransformationen zu verfolgen, wurden 100 μl- Aliquots zu verschieden Zeitpunkten entnommen, die Zellen durch Zentrifugation entfernt und die entsprechenden Überstände im UV- Spektrum zwischen 200 und 400 nm analysiert.
Um das entsprechende Produkt zu isolieren, wurden die zellfreien Überstände steril filtriert und dann auf etwa 4fache Konzentration eingeengt. Das Konzentrat wurde auf pH 1,5 mit Schwefelsäure angesäuert, um das Produkt auszufällen. Die Produkte wurden mittels eines Glasfilters abfiltriert und anschliessend getrocknet. Tabelle 5
Biotransformation mit verschiedenen Heterocyclen
Figure imgf000027_0001
Beispiel 6
Klonieren der für 6-Methylnicotinsäure-2-dehydrogenase codierenden Gene von Burkholderia/Ralstonia KIE101 (DSM 6920).
6.1 Präparation der genomischen DNA
Genomische DNA wurde nach einer modifizierten Methode von Chesney et al. (J. Mol. Biol. 1979, 130, 161-173) extrahiert. Die Zellen wurden in 100 ml Minimalmedium (Tinschert et al., 1997, ibid.) kultiviert. Nach der Inkubation wurden sie geerntet (7000 Upm, 10 min, 4 °C) und in 2,25 ml eines 50 mM Tris-HCl-Puffers (pH = 8,0) enthaltend 10 Gew.% Saccharose resuspendiert. Nach Hinzufügen von 375 μl einer Lysozym-Lösung (10 mg/ml Lysozym in 250 mM Tris- HCl (pH = 8,0)) und 900 μl 0, 1 M EDTA (pH = 8,0) wurde die Zellsuspension auf Eis für 10 min inkubiert. Dann wurden 450 μl einer 5 Gew.%igen SDS-Lösung und 50 μl einer 10 mg/ml
Ribonuclease-Lösung hinzugefügt. Die Zellen wurden dann für 45 min bei 37 °C inkubiert. Etwas
Proteinase K und 400 μl einer 20 mg/ml Pronase-Lösung wurden dann hinzugefügt und anschliessend die Zellen 3 h lang bei 37 °C inkubiert. Das Zellvolumen wurde mit TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH = 8,0) auf 8,8 ml eingestellt. Die Mischung wurde mit 8,6 g CsCl supplementiert und dann bei 65 °C inkubiert. Nach Zentrifügieren bei 22000x g für 30 min bei 20 °C wurde der Überstand in ein Röhrchen .(Beckman Vti 65,2) überfuhrt und 500 μl einer 10 mg/ml Ethidiumbromid-Lösung wurde hinzugefügt. Die Suspension wurde über Nacht mittels Ultrazentrifuge bei 240000χ g bei 20 °C zentrifugiert. Die genomische DNA wurde unter UV- Licht sichtbar gemacht. Das Volumen wurde mit TE-Puffer auf 4 ml gebracht. Ethidiumbromid wurde durch Extraktion mit n-Butanol (3 ) entfernt. Die DNA wurde mit 0,1 Volumen 3 M Natriumacetatpuffer (pH = 5,2) und 0,6 Volumen Isopropanol präzipitiert, dann mit 70% Ethanol gewaschen und schliesslich in 100 μl TE-Puffer resuspendiert. Die Konzentration und die Reinheit der DNA wurde mittels UV-Licht im Bereich zwischen 260 und 280 nm überprüft.
6.2 Konstruktion von Oligonucleotiden die zur N-terminalen Region der 6-Methylnicotin- säure-2-dehydrogenase komplementär sind.
Die degenerierten Oligonucleotide Kl und K2 wurden von der Aminosäuresequenz der 6-Methyl- nicotinsäure-2-dehydrogenase N-terminalen Region der 30 000 und 16 000 Untereinheiten abgeleitet. Die Oligonucleotide wurden von Microsynth GmbH synthetisiert. Die N-terminale Aminosäuresequenz der 30 000 Untereinheit Kl ist sowohl in SEQ ID No.ll als auch nachfolgend dargestellt und die N-terminale Aminosäuresequenz der 16 000 Untereinheit K2 ist sowohl unten als auch im SEQ ID No. 12 dargestellt. Die gemischten oder degenerierten Nucleotidsequenzen Kl sind unten und im SEQ ID No. 9 und K2 unten und in SEQ ID No 10 dargestellt.
Met Lys Pro Ala Pro Phe Glu Leu His Arg Pro Asp Ser Leu Ala Glu Ala Leu Ala Leu
5 ' -ATG AAA CCG GCC CCG TTC GAA CT-3 ' G T T T T G A A C G C
Kl Met Lys Val Cys Cys Trp Val Asn Gly Val Gin Val Glu Asp Asp Val Glu Pro
5'-CAG GTC GAG GAC GAC GTG GAG CC-3'
A T A T T C A
A A
G T
K2
6.3 Restriktion der Ralstonia/Burkholderia KIE101 genomischen DNA und Isolation des DNA-Fragmentes
20 μg der genomischen DNA von Ralstonia/Burkholderia KIE101 wurden in einem Endvolumen von 120 μl 8 h lang bei 37 °C mit 80 U der Restriktionsendonuclease PstI verdaut. Die Fragmente wurden mittels Agarose-Gel-Elektrophorese aufgetrennt. 3 Bereiche von Fragmentgrössen (>7,5. kb, 6,5-7,5 kb und 4,5-6,5 kb) wurden auf DEAE Cellulose-Membran
O-[2-(Diethylamino)ethyl]cellulose; NA-45, Schleicher & Schuell) wie beschrieben von Sambrook et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual 1989) aufgetragen. Die DNA-Fragmente wurden in 20 mM Tris-HCl enthaltend 1 mM EDTA und 1,5 M NaCl (pH = 7,5) 1 h bei 65 °C eluiert. Die Fragmente wurden mit Isopropanol präzipitiert und in 20 μl Wasser resuspendiert. 1 μl der DNA von jeder Fraktion wurde dann auf positiv geladene Nylon-Membran transferiert. Die Membran wurde 20 min bei 120 °C inkubiert. Dann wurden die Membranen 40 min bei 68 °C in QuickHyb® Puffer (Stratagene) prähybridisiert. Die Hybridisierung wurde 1 h bei 54 °C in dem gleichen Puffer, der mit 333 μg/ml
Heringspermien-DNA supplementiert war, durchgeführt. Die Oligonucleotide Kl und K2 wurden verwendet. Die Oligonucleotide wurden mit DIG „Oligonucleotide Tailing Kit®" (Röche) markiert. Nach dem Hybridisieren wurden die Membranen 2mal für 5 min bei 54 °C in 2fach SSC ( 3 MNaCl, 300 mM Natriumeitrat pH 7,0, enthaltend 0,1% (w/v) SDS) gewaschen, dann 2mal in 0, Ifach SSC enthaltend 0, 1 % SDS für 15 min bei 54 °C. Die Detektion wurde gemäss DIG „Nucleic Acid Detection Kit®" (Röche) durchgeführt.
Ein DNA-Fragment mit ca. 7,5 kb zeigte ein positives Signal mit den Oligonucleotiden Kl und K2. Nach Extraktion auf dem Vergleichsgel wurde die DNA dieser Grosse mit dem Vektor pBluescript-KS+ (Stratagene) ligiert. Die Ligation wurde über Nacht bei 14 °C in einem Endvolumen von 20 μl mit 0,5 U T4 DNA Ligase durchgeführt. CaCl2-kompetente Zellen von E. coli XLl-Blue, die gemäss Sambrook et al.(1989, ibid.) präpariert waren, wurden transformiert.
Die rekombinanten Zellen wurden auf einem Komplexmedium enthaltend 100 μg ml Ampicillin,
0,5 mM IPTG (Isopropyl-ß-D-thiogalactosid) und 30 μg/ml X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-ß-
D-galactopyranosid) selektiert.
Weisse Kolonien wurden auf positiv geladene Nylon-Membran transferiert. Die Koloniehybridisierung wurde mit dem Oligonucleotid K2 durchgeführt. 2% dieser Kolonien zeigten ein positives Hybridisierungssignal. Der KlonE. coli XLl-Blue/pKBl, dessen Plasmid ein PstI Insert von 8,5 kb Grosse enthält, wurde isoliert.
Beispiel 7
Sequenzierung und genetische Analyse der 6-Methylnicotinsäure-2-dehydrogenase
7.1 Subklonieren des 8,5 kb PstI Fragmentes von Ralstonia/Burkholderia KIE101
Um das Sequenzieren zu erleichtern, wurde zunächst das Plasmid pKBl subkloniert. Es wurde das Plasmid pKB32 erhalten. Hierzu wurde pKBl mit Endonuclease EcoRI verdaut. Das daraus isolierte 5,6 kb grosse Fragment wurde von Agarose-Gelen mittels der „Gen-Clean®"-Vorschrift (Biorad) isoliert. Das EcoRI Fragment wurde in den Vektor pBluescript SK+ (Stratagene) ligiert
(Fig. 9A).
Plasmid pRAl wurde wie folgt konstruiert: pKBl wurde mit Endonuclease SstI verdaut und dann mit T4 DNA Ligase rezyklisiert (Fig. 9B).
CaCl2-kompetente E. coli XLl-Blue Zellen wurden transformiert. Die rekombinanten Zellen wurden wie in Beispiel 6.3 beschrieben in einem Komplexmedium mit Ampicillin, IPTG und X-
Gal selektioniert.
7.2 Sequenzanalyse
Die Sequenzen des 5,6 kb grossen EcoRI Inserts von Plasmid pKB32 und das 2,5 kb grosse Pstl- Sstl des Plasmids pRAl wurden mittels des „DyeDeoxy terminator"-Sequenzprotokolls mit den Sequenzen ABI 373A oder 377 (Perkin-Elmer) bestimmt. Die Sequenzierung wurde durch Microsynth (Balgach, Schweiz) durchgeführt. Die Restriktionskarte ist in Fig. 8 dargestellt. Gezeigt sind die Gene der 3 Strukturuntereinheiten der 6-Methylnicotinsäure-2-dehydrogenase ndhA, ndhB und ndhC. Des weiteren wurde zwei zusätzliche ORFs, bezeichnet als ndhD und ndh E, gefunden, die für Polypeptide mit noch unbekannter Funktion codieren können, diese translationell an die Strukturgene gekoppelt sind.
7.3 Homologie- ergleiche
Nach dem Homologie- Vergleich mit bekannten DNA-Sequenzen war es möglich, die
Lokalisierung des Molybdopterins, FAD und der Eisen-Schwefel-Zentren nachzuweisen. Als Beispiel gilt das Protein NdhA mit dem Molybdopterin-Zentrum.
Die bekannten DNA-Sequenzen waren:
Q51325, CODH (Kohlenmonoxiddehydrogenase) von Pseudomonas carboxydovorans (Schuebel et al., J Bacteriol. 1995, 117, 2197).
P72224, QORL (Chinolin-2-oxidoreductase) von Pseudomonas putida (Blaese et al., J. Biol. Chem. 1996, 271, 23068-23079).
Q9Y9S2, APE2216 (Xanthindehydrogenase) von Aeropyrum pernix (Kawarabayasi et al., DNA
Res. 1999, 6, 83-101).
O53708, RV0373C (Xanthindehydrogenase) von Mycobacterium tuberculosis (Cole et al.,
Nature 1998, 393, 537-544). Q59129, NDHC (Nicotindehydrogenase) von Arthrobacter nicotinovorans (Grether-Beck et al.,
Mol. Microbiol. 1994, 13, 929-936).
Q52590, CUT A (Kohlenmonoxiddehydrogenase) von Pseudomonas thermocarboxydovorans
(Pearson et al., Biochim. Biophys. Acta 1994, 1188, 432-438).
AE006902, (Aldehydoxidase) von Sulfolobus solfataricus (She et al., EMBL-Datenbank).
Das Molybdopterin-Bindungszentrum wurde zwischen den Aminosäuren 244 und 250 (Gly Gly Gly Phe Gly Ser Lys), zwischen den Aminosäuren 485 und 488 (Gin Gly Gin Gly), zwischen den Aminosäuren 523 und 527 (Gly Ala Phe Gly Ser) und zwischen den Aminosäuren 720 und 725 (Ile Gly Glu Gly Val) in der NdhA Untereinheit von SEQ ID No. 1 lokalisiert. Beispiel 8
Konstruktion eines rekombinanten Stammes mit 6-Methylnicotinsäure-2-dehydrogenase- Aktivität
8.1 Subklonieren der 6-Methylnicotinsäure-2-dehydrogenase in Vektoren mit breitem Wirtsspektrum.
Um das Plasmid pLM25 zu konstruieren, wurde das 8,5 kb DNA Fragment von pKBl in den „Shuttle vector" pBBRIMCS (Kovach et al., Biotech. 1994, 16, 800-802) unter der Kontrolle von Pιac subkloniert. 1,3 μg Plasmid pKBl und 850 ng pBBRIMCS wurden 2 h bei 37 °C mit 10 U Endonuclease PstI in einem Gesamtvolumen von 20 μl verdaut. Nach Agarose-Gel- Elektrophorese wurde das 8,5 kb DNA Fragment mit dem „Prep-A-Gene®"-System (Biorad) nach den Angaben des Herstellers extrahiert. Die DNA wurde mittels 10 μl 10 mM Tris-HCl-Puffers (pH = 8,5) eluiert. Der Vektor wurde mit 1 U alkalischer Phosphatase in einem Gesamtvolumen von 20 μl dephosphoryliert. Nach 1 stündiger Inkubation bei 37 °C wurde der Vektor mit dem QIAquick Spin®-System (Qiagen) gemäss den Angaben des Herstellers entsalzt und gereinigt. Die DNA-Mengen wurde auf dem Gel im Vergleich zur Marker-DNA quantifiziert. 300 ng des Inserts wurden über Nacht mit 100 ng Vektor bei 13 °C mit 1 U T4 DNA Ligase in einem Gesamtvolumen von 20 μl ügiert. E. coli XLl-Blue MRF' (Stratagene) wurde nach den Angaben des Herstellers mittels Elektroporation transformiert (1,7 kV, 200 Ω, 25 μF). Die rekombinanten Zellen wurden in einem Komplexmedium enthaltend 30 μg/ml Chloramphenicol, 0,4 mM ff TG und 30 μg/ml X-Gal selektioniert.
Um einen aktiven rekombinanten Stamm zu erhalten, wurde das Startcodon ATG von ndhE, ndhD und ndhC unter Berücksichtigung natürlicher Shine-Dalgarno- Sequenzen am Promotor des Vektors pBBRIMCS positioniert. Hierfür wurde die EcoRV-Celll-Region des 6- Methylnicotinsäure-2-dehydrogenase EcoRI Inserts von Plasmid pLM25 entfernt, so dass die EcoRV Restriktionsschnittstelle zur „multiple cloning site" des pBBRIMCS gehörte. Dieses deletierte DNA Fragment wurde durch ein 6-Methylnicotinsäure-2-dehydrogenase Notl-Celll- Fragment oder durch ein BsmI-Celll-Fragment von pKBl ersetzt. Um die Ligation zu ermöglichen, wurden die stumpfen Enden Notl und Bsml durch 2 U Klenowpolymerase und 3,5 nmol der dNTPs zu 20 μl Reaktionsvolumen aufgefüllt (überhängende Enden). Nach 20minütiger
Inkubation bei 30 °C wurde die Reaktion durch 15minütige Inkubation bei 65 °C gestoppt. Die neuen Konstrukte wurden als pLM25D (Notl) und pLM25E (Bsml) bezeichnet. In Plasmid pLM25C liegt die NdhC-Untereinheit direkt am pBBRIMCS Promotor. Von Plasmid pLM25 wurde ein EcoRV-NruI Fragment entfernt und schliesslich wieder mit T4 DNA Ligase rezyklisiert. Die enzymatischen Reaktionen wurden wie bereits beschrieben durchgeführt.
8.2 Transformation von Comamonas acidovorans D3
Da E.coli nicht die erforderlichen Cofaktoren besitzt, wurden die Plasmide pLM25, pLM25C, pLM25E und pLM25D in Comamonas acidovorans D3 Moniert. Elektrokompetente Comamonas acidovorans D3 Zellen wurden wie folgt hergestellt: 25 ml einer Kultur in der mittleren logarithmischen Wachstumsphase (OD65o = 0,5-1,0) wurden zentrifügiert und in 4 ml eiskaltem SMEB-Puffer (1 mM HEPES, 300 mM Saccharose, 1 mMMgCl2, pH = 7,0) resuspendiert. Die Zellen wurden dann wieder zentrifügiert und sukzessiv in 1,3 ml und 1 ml Elektroporationspuffer (1 mM HEPES, 15 % (w/v) Glycerin, pH = 7,0) resuspendiert. Nach nochmaligem Zentrifügieren wurde der Niederschlag in Elektroporationspuffer resuspendiert, um 3- 109 Zellen pro 100 μl zu erhalten. 200 ng der rekombinanten Plasmide wurden mit 50 μl elektrokompetenter Zellen vermischt und das Gesamtvolumen wurde mit H2O auf 70 μl gebracht. Die Zellen wurden 10 min lang auf Eis inkubiert. Die Elektroporationsmischung wurde in eine eiskalte Elektro- porationsküvette (0,1 mm) überführt und dann mit 2,0 kV, 200 Ω und 25 μF gepulst. 900 μl eiskaltes NYB-Medium (Nutrient Yeast Broth) wurde zur Transformationsmischung hinzugegeben, die dann 10 min auf Eis inkubiert wurde. Die Küvetten wurden dann 30 min bei 30 °C gehalten. Die Zellen wurden in Röhrchen überführt und dann 90 min bei 30 °C unter Rühren inkubiert. Die Transformanten wurde auf NYA (Nutrient Yeast Agar) mit 60 μg/ml Chlor- amphenicol selektioniert.
Das 6-Methylnicotinsäure-2-dehydrogenase Operon wurde ebenfalls in Vektor pME6010, der einen Neomycin-Promotor besitzt, umkloniert. Das 5,6 kb grosse EcoRI-fragment von Plasmid pKBl wurde in Vektor pME6010 eingefügt. Dieses Konstrukt wurde als pLM81 bezeichnet. Um die ORF's zu positionieren wurde das Xhol-Celll Fragment von pLM81 durch das Xhol-Ceiπ Fragment von pLM25C, pLM25D und pLM25E ersetzt. Die Restriktionen und Ligationen wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt. Die Konstruktion der Plasmide ist in Fig. 9B) dargestellt.
8.3 6-MethyInicotinsäure-2-dehydrogenase-Aktivität des rekombinanten Systems
Hierzu wurden die Stämme mit einem Mineralsalzmedium (25 ml) mit Vitaminen nach Kulla et al. (Arch. Microbiol. 1983, 135, 1-7), enthaltend zusätzlich 0,01 g/l NaMoO4-2 H2O, 2 g/1 Natriumpyruvat, 30 μg/ml Chloramphenicol und 3 mM 6-Methylnicotinsäure inkubiert. Nach 3tägiger Inkubation bei 30 °C und 140 Upm wurde 1 ml der Kultur bei 13000 Upm 1 min zentrifügiert. Der Überstand wurde um das lOfache mit 10 mM Kaliumphosphatpuffer (pH = 7,0) verdünnt und die UV-Absorption zwischen 200 und 400 nm bestimmt. Das Absorptionsspektrum der Kontrolle, das von der Comamonas acidovorans D3 Kultur erhalten wurde, zeigte die für 6- Methylnicotinat typischen Absorptionsmaxima und Absorptionsschultern. Das Absorptionsspektrum, das durch Kultivieren von Comamonas acidovorans D3 mit den Plasmiden pLM25C, pLM25D und pLM25E zeigte das für 2-Hydroxy-6-methylnicotinat typische Spektrum mit einem Absorptionsmaximum von 313 nm (Fig. 10). Das bedeutet, dass die für 6- Methylnicotinsäure-2-dehydrogenase codierenden Gene erfolgreich in dem System exprimiert wurden. In pLM25 war die Expression schwach, woraus eine geringe Aktivität folgt (schwacher Peak bei 313 nm).
Die Funktion der translationell gekoppelten Polypeptide NdhD (δ) und NdhE (ε) ist noch nicht exakt aufgeklärt. Möglicherweise sind sie als „Chaperone" (Proteine, die z. B. an der Faltung anderer Proteine beteiligt sind) am Aufbau des funktionsfähigen Enzyms/Polypeptids im HeτfaiiΛ&sstam Ralstonia/Burkholderia beteiligt. Für eine aktive Expression in z. B. Comamonas acidovorans D3, welcher einen geeigneten Molybdopterin-Cofaktor-Hintergrund bereitstellt, scheinen diese ORFs unnötig zu sein. 8.4 Wachstum von Comamonas acidovorans D3 mit oder ohne Plasmid pLM25 oder pLM25E
Die Kulturen wurden unter Schütteln (140 Upm) in Erlenmeyerkolben bei 30 °C inkubiert. Das Medium war NYB, enthaltend 0,01 g/1 NaMoO -2 H2O und 60 μg/ml Chloramphenicol im Falle von rekombinantem Comamonas acidovorans D3. Das Wachstum wurde mittels der ODβoo gemessen. Um die Aktivität von 6-Methylnicotinsäure-2-dehydrogenase nachzuweisen, wurden die Konzentrationen von 6-Methynicotinsäure und 2-Hydroxy-6-methylnicotinsäure mittels des molaren Extinktionskoeffizienten gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 11 dargestellt. Die Verdopplungszeit des Stammes Comamonas acidovorans D3 enthaltend Plasmid pLM25 betrug 57 min und die von Comamonas acidovorans D3 betrug 53 min. Im Vergleich dazu ist die Verdopplungszeit von Ralstonia/Burkholderia KIE101 auf 6-Methylnicotinsäure unter verbesserten Verfahrensbedingungen 9 h (vgl. Beispiel 5.2).
SEQUENZPROTOKOLL
<110> Lonza AG <120> Verfahren zur Herstellung von
Hydroxy-Stickstoff-Heterocyclus-Carbonsäuren
<130> NA06/01 <140> <141>
<160> 14 <170> Patentin Ver. 2.1
<210> 1
<211> 776
<212> PRT <213> Ralstonia/Burkholderia
<400> 1
Met Asn Ala Pro Ile His Ser Thr Ser Ile Leu Arg Lys Glu Asp Gly 1 5 10 15
Arg Leu Leu Ala Gly Lys Ala Ser Phe Thr Asp Asp Ile His Leu Asp 20 25 30
Gly Met Leu His Gly Val Phe Val Arg Ser Pro Met Ala His Ala Lys 35 40 45
Val Leu Gly Ile Asp Ala Ser Ala Ala Leu Ala Ala Gly Ala Leu Leu 50 55 60 Val Leu Thr Ala Ala Asp Leu Pro Phe Ala Asn Arg Asn Phe Ile Leu 65 70 75 80
Arg Tyr Ala Asn Pro Asn Ile Arg Gly Gly Leu Pro Thr Phe Leu Ala
85 90 . 95
Gly Glu His Val Arg Phe Val Gly Glu Pro Ile Ala Phe Leu Val Ala 100 105 110
Pro Asp Arg Tyr Ile Ala Glu Asp Leu Ala Ala Leu Val Glu Ile Glu 115 120 125
Leu Asp Pro Leu Pro Ala Val Ala Asn Ala His Asp Ala Met Gin Pro 130 135 140 Gly Ala Ala Arg Leu His Ala Ser Trp Glu Asn Asn Val Ala Ala Thr 145 150 155 160
Phe Glu Arg Val Lys Gly Glu Pro Arg Asp Ala Leu Ala Arg Cys Glu
165 170 175
Arg Ser Ile Thr Arg Arg Phe Arg Phe Gly Arg Gin Leu Pro Gin Pro 180 185 190
Leu Glu Thr Arg Gly Cys Val Ala Asp Phe Asp Ala Arg Arg Asn Ala 195 200 205 Leu Cys Leu Trp Val Ser Thr Gin Thr His Tyr Ser Val Arg Gin Asn 210 215 220
Leu Ser Ala Met Leu Asp Leu Pro Glu Ser Ser Ile Arg Val Val Ala 225 230 235 240
Glu Tyr Val Gly Gly Gly Phe Gly Ser Lys Ser Arg Pro Tyr Val Glu
245 250 255
Glu Ile Val Val Ser His Ala Ser Arg Val Leu Arg Arg Pro Val Lys 260 265 270
Trp Ile Glu Asp Arg Phe Glu His Met Gin Ala Thr Thr His Ser Arg 275 280 285
Ala Ile Asp Thr Asp Leu Thr Ile Gly Phe Asp Ala Asp Gly Arg Ile
290 295 300 Gin Ala Phe Ser Ala Arg Leu Val Ala Asp Ile Gly Ala Tyr Val Phe
305 310 315 320
Thr Ser Gly Ile Ile Thr Thr Glu Val Ala Ala Ser Met Leu Thr Gly
325 330 335
Pro Tyr Arg Val Pro His Ala Arg Val Glu Val Leu Cys Val Gly Thr 340 345 350
Asn Lys Thr Pro Leu Ala Thr Tyr Arg Gly Ala Gly Gin Pro Glu Met 355 360 365
Ser Phe Ala Leu Glu Asn Met Met Asp Leu Val Ala Lys Glu Val Gly 370 375 380 Val Thr Pro Tyr Glu Ile Arg Arg Arg Asn Met Val Arg Pro Asp Asp 385 390 395 400
Tyr Pro Tyr Pro Val Trp Val Pro Gly Gly Ala Ala Asp Gly Glu Leu
405 410 415
Glu Ser Gly Asp Tyr Pro Gly Met Leu Leu Gin Thr Val Glu Gin Ser 420 425 430
Gly Tyr Thr Arg Ala Val Glu Val Leu Pro Ser Gly Glu Val Ala Ala 435 440 445
Trp Gly Leu Ala Cys Gly Leu Glu Leu Thr Gly Phe Ile Asn Phe Glu 450 455 460
Ser Ala Arg Ile Arg Ile Glu Pro Thr Gly Glu Ile Arg Val Trp Ser 465 470 475 480
Gly Met Thr Ser Gin Gly Gin Gly Gin Phe Thr Thr Tyr Ala Gin Val 485 490 495
Cys Ala Glu Ile Leu Gly Ala Asp Val Asp Met Val Thr Val His Leu 500 505 510 Gly Asp Thr Asp Leu Leu Pro Phe Gly Arg Gly Ala Phe Gly Ser Arg 515 520 525
Gly Ala Val Met Gly Ala Asn Ala Val Ala Gly Ala Ala Gly Leu Leu 530 535 540
Arg Asp Lys Val Leu Ala His Ala Ala Arg Leu Leu Glu Cys Asp Pro 545 550 555 560 Gly His Leu Thr Val Val Gin Gly Ser Val Cys Arg Met Asp Gly Lys
565 570 575
Pro Gly Ala Leu Ser Leu Ala Glu Val Ala Gin Ala Val Cys Pro Gly 580 585 590
Gly Lys Leu Phe Ala Gly Glu Pro Ala Leu Glu Ser Gin Tyr Val Tyr 595 600 605
Asp Ser Lys Asn Lys Leu Thr Phe Ala Leu Ser Val His Ala Ala Arg 610 615 620
Val Ala Val Asp Pro Arg Ala Gly Phe Val Arg Val Leu Asp Tyr Phe 625 630 635 640 Leu Val His Asp Ala Gly Lys Thr Leu Asn Ser Leu Val Val Asp Gly
645 650 655
Gin Val Val Gly Gly Val Ala Glu Gly Ile Thr Cys Thr Leu Phe Ala 660 665 670
Glu Ala Val Tyr Asp Ala Glu Gly Gin Pro Gin Met Gly Thr Leu Ala 675 680 685
Asp Tyr Leu Val Ala Thr Ala Pro Glu Val Pro Arg Ile Arg Leu Gly 690 695 700
His Met Gin Ser Ile Pro Thr Thr Asn Pro Leu Gly Val Arg Gly Ile
705 710 715 720 Gly Glu Gly Gly Val Ile Ala Val Ala Pro Ala Ile Val Ser Ala Ile
725 730 . 735
Ala His Ala Ile Ala Pro Asp Gly Lys Gly His Glu Asp Ala Leu Tyr 740 745 750
Thr Leu Pro Val Arg Pro Pro Met Val Leu Lys Ala Ile Arg Arg Ala 755 760 765
Arg Glu Ile Gly Gly Ser Gin Gly 770 775 <210> 2
<211> 2331
<212> DNA
<213> Ralstonia/Burkholderia
<400> 2 atgaacgcgc ccatccattc cacatccata ttgcgcaagg aggatggccg cctgctggcg 60 gggaaggcat ccttcaccga cgacatccac ctggacggca tgctgcacgg cgtcttcgtc 120 cgcagcccga tggcgcatgc gaaagtcctg ggcatcgacg ccagcgccgc gctcgcagcc 180 ggcgccttgc tggtcctgac cgccgccgac ctgccgttcg ccaatcgcaa cttcatcctg 240 cgctacgcca atccgaacat ccgcggcggc ttgccgacct tcctggccgg ggagcacgtg 300 cgtttcgtcg gcgagccgat cgccttcctg gtggctcccg accgctatat cgccgaagac 360 ctggccgccc tggtggagat cgagctcgat cccttgccgg cggtggcgaa cgcgcacgac 420 gccatgcagc ccggcgcggc caggctgcac gcgagctggg aaaacaacgt cgccgcgacc 480 ttcgagcgcg tcaagggtga gccgcgggat gcgctggcgc gctgcgagcg cagcatcacg 540 cggcgctttc gtttcggccg gcaattgccg cagccgttgg agacgcgcgg ctgcgtggcg 600 gatttcgatg cgcgccgcaa cgcgctgtgc ctgtgggtat cgacccaaac ccactacagc 660 gtgcgccaga acctgtccgc catgctcgac ctgcccgaat ccagcatccg cgtcgtggcc 720 gaatacgtag gcggcggctt cggctccaag tcgcgcccct acgtcgagga aatcgtggtc 780 agccacgcca gccgggtgct gcgccggccg gtgaagtgga tcgaggaccg cttcgagcac 840 atgcaggcca ccacgcattc gcgcgccatc gacaccgacc tgaccatcgg cttcgacgcc 900 gacggccgca tccaggcctt ctcggcgcgg ctggtggccg acatcggcgc ctacgtattc 960 accagcggca tcatcaccac cgaggtggcg gcatccatgc tgaccggccc gtatcgcgtc
1020 ccgcacgcgc gggtcgaagt gctttgcgtg ggcaccaaca agacgccgct ggccacctat
1080 cggggcgcgg ggcagccgga aatgagcttc gccctggaga acatgatgga tctggtggcc
1140 aaggaggtcg gcgtcacgcc ctacgagatc aggcgccgca acatggtgcg cccggacgac 1200 tacccgtatc cggtgtgggt gccgggcggc gcggcggacg gcgaactgga aagcggggac
1260 tatcccggca tgctcttgca gaccgtggag cagtccggct atacgcgcgc ggtcgaggtg
1320 ctgccgtccg gcgaggtggc cgcctggggc ctggcgtgcg ggctggagct gaccgggttc
1380 atcaatttcg aatcggccag gatccgcatc gagcccaccg gcgagatccg cgtctggtcg
1440 ggcatgactt cccagggcca gggccagttc accacctacg cccaggtatg cgccgagatt 1500 ctcggcgccg acgtggacat ggtgacggtg cacctgggag acaccgacct gctgccgttc
1560 gggcgcggcg ccttcggcag ccgcggcgcg gtgatgggcg cgaacgccgt ggccggcgca
1620 gccgggctgc tgcgggacaa ggtgctggcc catgccgcgc gcctgctcga atgcgatccc
1680 gggcatttga cggtggtcca gggcagcgtc tgccggatgg acggcaagcc gggcgccctg
1740 agcctggccg aggtggcgca ggcggtctgc cccggcggca agctgttcgc cggcgagccg 1800 gcgctggaaa gccagtacgt ctacgacagc aagaacaagc tgaccttcgc gctatcggtg
1860 catgcggccc gcgtcgccgt cgatccgcgc gccggcttcg tgcgcgtgct cgattacttc
1920 ctggtgcacg acgccggcaa gaccctcaat tccctggtgg tggatggcca ggtggtgggc
1980 ggcgtggccg agggaatcac ctgcacgctg ttcgccgagg cggtgtacga cgcggaaggg
2040 cagccgcaga tgggaacgct ggccgactat ctggtggcga cggccccgga ggtgccgcgc 2100 atccgcctgg gccatatgca gtcgatcccg accaccaatc ccctgggcgt gcgcggcatc
2160 ggcgagggcg gggtgatcgc ggtcgcgccg gccatcgtca gcgccatcgc ccacgcgatc
2220 gctcccgacg gcaaggggca cgaggacgcg ctgtacacgc tcccggtgcg gccgccgatg
2280 gtgttgaagg cgatccggcg cgcgcgcgag atcggcggat cgcagggata g
2331
<210> 3
<211> 284
<212> PRT
<213> Ralstonia/Burkholderia
<400> 3
Met Lys Pro Ala Pro Phe Glu Leu His Arg Pro Asp Ser Leu Ala Glu 1 5 10 15 Ala Leu Ala Leu Leu His Glu His Gly Ala Glu Ala Arg Leu Ile Ala
20 25 30
Gly Gly Gin Ser Leu Met Pro Met Met Asn Leu Arg Leu Val Ser Phe 35 40 45
Ser His Leu Val Asp Leu Asn Arg Val Pro Gly Leu Ala Gly Ile Arg 50 55 60
Gin Glu Asp Gly Met Leu Arg Ile Gly Ala Met Thr Arg Gin Gin Asp 65 70 75 80
Ile Ala Arg His Pro Leu Val Ala Arg His Ala Pro Leu Leu Ala Ala
85 90 95 Ala Leu Pro Tyr Ile Gly His Ile Gin Thr Arg Ser Arg Gly Thr Met
100 105 110
Gly Gly Ser Leu Ala His Ala Asp Pro Ser Ala Glu Leu Pro Leu Thr 115 120 125
Ala Val Val Leu Asn Ala Arg Leu Thr Ile Gin Ser His Glu Gly Arg 130 135 140
Arg Glu Val Asp Ala Arg Asp Phe Phe Arg Asp Met Leu Ser Thr Asp 145 150 155 160
Leu Ala Pro Asp Glu Ile Leu Thr Glu Ile Ser Ile Pro Ala Ala Pro
165 170 175 Pro Gly Thr Arg Val Ser Phe Arg Glu Tyr Ala Arg Arg Arg Gly Asp
180 185 190
Phe Ala Leu Ala Ala Ala Ala Ala Gin Tyr Val Glu Ser Pro Ala Gly 195 200 205
Asn Thr Leu Ala Val Gly Leu Gly Gly Val Asn Pro Ala Pro Tyr Tyr 210 215 220
Cys Ala Gin Leu Ser Gin Ser Leu Ser Gly Ala Ala Ala Gly Asp Arg 225 230 235 240 Ala Ala Leu Glu Pro Leu Ile Arg Ala Glu Leu Glu Asn Leu Gin Pro
245 250 255 Leu Ser Asp Thr Glu Ala Asp Gin Asp Tyr Arg Arg Thr Leu Ala Arg 260 265 270
Ile Leu Leu Glu Asp Cys Ile Arg Glu Val Leu Gin 275 280
<210> 4 <211> 855 <212> DNA <213> Ralstonia/Burkholderia
<400> 4 atgaaaccgg ccccgttcga actccaccgc cccgacagcc tggccgaggc gctggcgctg 60 ctgcacgagc acggcgcgga ggcgcgcctg atcgccggcg ggcagagcct gatgcccatg 120 atgaacctgc gcctggtgag cttttcccat ctggtcgacc tcaaccgcgt gccgggcctg 180 gcgggaatac ggcaggagga cggcatgctc cgcatcggcg ccatgacgcg ccagcaggac 240 atcgcccggc atcccctggt cgcgcgccac gcgccgctgc tggccgcggc cttgccctac 300 atcggccata tccaaacgcg cagccgcggc acgatgggcg gcagcctggc ccatgccgat 360 ccttccgccg agctgccgct gaccgcggtg gtgctgaacg cgcgcctgac catccaaagc 420 catgaggggc ggcgcgaagt cgacgcgcgc gatttcttcc gcgacatgct gagcaccgac 480 ctggcgcccg acgagatact cacggaaatc tccattccgg cggcgccgcc gggaacccgg 540 gtttccttcc gtgaatatgc gcgccggcgc ggcgacttcg ccctggccgc ggcggcggcc 600 cagtatgtcg aaagccccgc gggcaacacc ctcgcggtcg ggctgggcgg cgtcaacccg 660 gcaccgtatt actgcgcgca gctatcgcaa tcgctgtcgg gcgccgcggc cggcgaccgc 720 gccgcgctgg aaccactgat ccgggcagag ctggaaaacc tccagcccct gtccgatacc 780 gaagccgacc aggattaccg ccgcacgctc gcgcggatcc tgctggaaga ctgcatacgc 840 gaggtgctgc aatga 855
<210> 5
<211> 159
<212> PRT
<213> Ralstonia/Burkholderia <400> 5
Met Lys Val Cys Cys Trp Val Asn Gly Val Gin Val Glu Asp Asp Val 1 5 10 15
Glu Pro Arg Leu Leu Leu Ser Asp Phe Ile Arg His Arg Leu Lys Leu 20 25 30
Thr Gly Thr His Val Gly Cys Glu Met Gly Ala Cys Gly Ala Cys Thr 35 40 45 Val Ile Ile Asp Gly Ser Pro Ala Arg Ser Cys Leu Thr Leu Ala Ala 50 55 60
Gin Val Asp Ala Cys Lys Val Thr Thr Val Glu Ala Leu Gly Glu Ser 65 70 75 80
Ala Leu Gly Arg Gin Leu Leu Glu Ala Phe Arg Gin His His Gly Leu
85 90 95
Gin Cys Gly Tyr Cys Thr Pro Gly Ile Leu Thr Thr Val Ala Ser Val 100 105 110 Met Gin Lys Gly Glu Leu Pro Gin Ser Glu Glu Glu Val Arg Asp Leu 115 120 125 Leu Ser Gly Asn Ile Cys Arg Cys Thr Gly Tyr Gin Gly Ile Val Asp 130 135 140
Ala Val Leu Ala Leu Ala Gly Asp Ala Gin Ala Gly Arg Ala Ala 145 150 155
<210> 6 <211> 480 <212> DNA <213> Ralstonia/Burkholderia
<400> 6 atgaaagtgt gctgctgggt caacggtgtt caggtcgagg acgacgtgga gccgcgcctg 60 ctgttgtccg atttcatacg ccaccggctg aagctgaccg gcacccacgt gggctgcgaa 120 atgggcgcct gcggcgcctg caccgtcatc atcgacggca gcccggcgcg ttcttgcctg 180 accctggcgg cccaggtcga tgcctgcaag gtgaccacgg tcgaggccct gggcgaatca 240 gcgctcggca ggcagctgct ggaagccttc cggcagcacc acggcctgca atgcggctac 300 tgcacgccgg gaatcctgac taccgtagcc agcgtgatgc aaaagggcga actgccgcaa 360 tccgaggagg aggtgcgcga tctgctctcc ggcaacatct gccgatgtac cggctaccag 420 ggcatcgtcg acgcggtcct ggcgctcgcc ggggatgcgc aggcgggaag ggcggcatga 480
<210> 7
<211> 117 <212> PRT
<213> Ralstonia/Burkholderia
<400> 7
Met Asn Arg Thr Met Pro Lys Arg Ser Pro Gly Ala Lys Pro Cys Ala 1 5 10 15
Pro Arg Ser Arg Arg Trp Arg Arg His Ala Thr Gly Ser Ser Ala Trp 20 25 30 Leu Arg Pro Asp Pro Pro Ala Ser Asp Trp Lys Arg Pro Ala Ala Gly 35 40 45
Arg Phe Arg Ser Pro Gly Pro Trp Trp Ala Arg Pro Ala Phe Pro Cys 50 55 60
Arg Cys Cys Gly Met Ala Arg Phe Arg Trp Ala Cys Asn Ser Trp Val 65 70 75 80
Ser Arg Ser Ala Thr Arg Arg Arg Ser Pro Met Arg Pro Gly Ser Met
85 90 95
Arg Ser Trp Asp Arg Cys Gly Ala Arg Met Pro Glu Val Phe Asp Arg 100 105 110 Phe Trp Glu Ser Ser 115 <210> 8
<211> 354
<212> DNA
<213> Ralstonia/Burkholderia
<400> 8 atgaacagga ctatgcccaa gcggtcgcct ggcgcgaagc cttgcgcgcc caggtcgcgg 60 cgctggcgcc ggcatgcgac gggttcgtca gcctggcttc gtccggaccc gccggcgtcg 120 gactggaaga gaccggcagc cggacgtttc cggtcgcctg gaccctggtg ggcgcgccca 180 gcttttccct gccggtgttg cggcatggcg cgcttccgct gggcctgcaa ttcatgggtt 240 tcgcgaagcg cgacgcgcag gcgttcgccc atgcggcctg gctcgatgcg cagctgggac 300 cgctgcggcg cgcgcatgcc tgaggtattc gatagatttt gggagagctc atga 354
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Ralstonia/Burkholderia
<400> 9 atgaaaccgg ccccgttcga act 23
<210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Ralstonia/Burkholderia <400> 10 caggtcgagg acgacgtgga gcc 23
<210> 11 <211> 20 <212> PRT <213> Ralstonia/Burkholderia
<400> 11 Met Lys Pro Ala Pro Phe Glu Leu His Arg Pro Asp Ser Leu Ala Glu 1 5 10 15
Ala Leu Ala Leu 20
<210> 12
<211> 18
<212> PRT
<213> Ralstonia/Burkholderia
<400> 12
Met Lys Val Cys Cys Trp Val Asn Gly Val Gin Val Glu Asp Asp Val 1 5 10 15
Glu Pro <210> 13
<211> 102
<212> DNA
<213> Ralstonia/Burkholderia
<400> 13 atgggcgctg cgcgcctacg gcgaatgcgt cgaggaatac ggcgaggagg cgctgggccg 60 gcgcgtgcgg gacttgatcg ccttggccgc gcgcatggat ga 102
<210> 14
<211> 33
<212> PRT
<213> Ralstonia/Burkholderia
<400> 14
Met Ala Ala Ala Arg Leu Arg Arg Met Arg Arg Gly Ile Arg Arg Gly 1 5 10 15 Gly Ala Gly Pro Ala Arg Ala Gly Leu Asp Arg Leu Gly Arg Ala His
20 25 30
Gly
<210> 15
<211> 7127
<212> DNA
<213> Ralstonia/Burkholderia
<400> 15 ctgcagaacg gggcgacctc ggccaactat gtgccggggc gcctgtcgac gctggaaagc 60 ggcatccacc acgtgctcaa cgactacctg gcgaaaatcc gcggggacgc cagggccggc 120 gcatgattcg cgtcgccatc ctcgacgact accagggcgt cgcctgcgac atggcggact 180 ggaacgcgct cggcgccggc gtgcgcacga ccagcttccg caagccgttc tccggcgtcg 240 ccgaagcggc cgaaacgctc gccgatttcg acgtggtgtg cctgatgcgc gaacgcatgg 300 cttttccgcg cgccctgttc gagcgcctgc cgcggctgcg cctgctgctg ttcagcgggc 360 tcgggcacaa gggcgtggac ttgcgggccg cgcacgagcg cggcgtggtg gtctgtcata 420 cccgaggggg tgaaacccag cactgcaccg ccgaactgac ctgggcgctg atcctggcgg 480 cggcgcgcca catcgccctg gaagaccgcg tcatgcgtcg gggcggctgg cagagcagcg 540 tcggcaccac cctgtacggc aagaccctgg gcatcctggg cctgggccgg ctggggacca 600 aggtcgcggc cattgccgcc gccttcggca tgccggtcct ggcatggagc ccgaccctgg 660 acgaccgccg tgcggaggcc gccggcgccc gccgcgccga cctcgatacg ctgctggcgc 720 aaagcgacgt cgtcagcatc cacctggcat cgacgcccga aacccggggg ttcctgggcg 780 cggcgcagct gcgcgccatg cgcccctcgg ccatcctggt caacaccgcc cgcggcgaga 840 tcgtggacga agcggcgctg gtgctggcgc tgcgcgagcg ctggatcgcc ggcgcggcgc 900 tggacgtgtt cgaacgcgag ccgatcccgg ccggacacgg gctgctggac ctggacaacg 960 tggtgctgtc gccgcacctg ggctatgtga cgcatgaaac ctaccggatc tttttccacg 1020 acatggtgga aaacatcgcc gctttcctga aaggcgctcc catgcgcgtc gtacaagcga 1080 gtccggcctc gtgagcgctc ccatgcccga cgccgttccc ttccatgcgc gggtcgcgga 1140 cttccgcgcc ggcgccgaca cgcccagcga ctacctggag cgctgcctgg cgcggatcgc 1200 cgagtgcgaa ccccaggtgc gcgccttcgt ccacctggac cgggacgcgg cgcggcgcca 1260 ggccgaggcg gcaaccgcgc gctaccggcg cggggcgccg ctctcgccca tagacggcat 1320 gccggtgggg gtgaaggaca tcatcgaaac gcgcgccatg ccgacccaga tgaacagccc
1380 cttgttcaac gggttccagc cgcgccgcga cgccgcctgc gtggtggcgc tgaagcgcgc
1440 gggcgcggtc atcgtcggca agacggtgac cacggaattc gcctgcggcc gctccgggcc
1500 cacccgcaat ccccgcgacc tggcgcgcac cccgggcggc tcttccagcg gctcggcggc
1560 cgcggtggct gccggcatgc tgcccgcggc cctcggcacc cagacccagg cttccattat 1620 ccgcccggcc tcgtactgcg gcgtggtcgg cgtcaagccg accctgggcg cgctctgcta
1680 cgaaggcata gcgcggctgg cgccgaccct ggaccatctc ggcgtgctgg ccgccgacct
1740 ggaagacgcg cgcgcggtcg ccgcggccat tgccgccgtc gggccggatt actccggatc
1800 ccggatcggg ttcgagccgg ctgcgccgac cccggtgcgc cggctggcgc gcctggacag
1860 cgccggctgg agcgagctgg acgcggcttc cgggcaggcg ttcgagcagg ccatggacgc 1920 gctcggcaag agcggcgtgg aaatcctgga ccggcgcgac gcgcgcatcg gcgcgctcga
1980 agagtcactg gcggccgcgc cccaggccgc gctggaaatc ttcgcctggg aagcgcaatg
2040 gccgctgcgc gcctacggcg aatgcgtcga ggaatacggc gaggaggcgc tgggccggcg
2100 cgtgcgggac ttgatcgcct tggccgcgcg catggatgaa caggactatg cccaagcggt
2160 cgcctggcgc gaagccttgc gcgcccaggt cgcggcgctg gcgccggcat gcgacgggtt 2220 cgtcagcctg gcttcgtccg gacccgccgg cgtcggactg gaagagaccg gcagccggac
2280 gtttccggtc gcctggaccc tggtgggcgc gcccagcttt tccctgccgg tgttgcggca
2340 tggcgcgctt ccgctgggcc tgcaattcat gggtttcgcg aagcgcgacg cgcaggcgtt
2400 cgcccatgcg gcctggctcg atgcgcagct gggaccgctg cggcgcgcgc atgcctgagg
2460 tattcgatag attttgggag agctcatgaa agtgtgctgc tgggtcaacg gtgttcaggt 2520 cgaggacgac gtggagccgc gcctgctgtt gtccgatttc atacgccacc ggctgaagct
2580 gaccggcacc cacgtgggct gcgaaatggg cgcctgcggc gcctgcaccg tcatcatcga
2640 cggcagcccg gcgcgttctt gcctgaccct ggcggcccag gtcgatgcct gcaaggtgac
2700 cacggtcgag gccctgggcg aatcagcgct cggcaggcag ctgctggaag ccttccggca
2760 gcaccacggc ctgcaatgcg gctactgcac gccgggaatc ctgactaccg tagccagcgt 2820 gatgcaaaag ggcgaactgc cgcaatccga ggaggaggtg cgcgatctgc tctccggcaa
2880 catctgccga tgtaccggct accagggcat cgtcgacgcg gtcctggcgc tcgccgggga
2940 tgcgcaggcg ggaagggcgg catgaaaccg gccccgttcg aactccaccg ccccgacagc
3000 ctggccgagg cgctggcgct gctgcacgag cacggcgcgg aggcgcgcct gatcgccggc
3060 gggcagagcc tgatgcccat gatgaacctg cgcctggtga gcttttccca tctggtcgac 3120 ctcaaccgcg tgccgggcct ggcgggaata cggcaggagg acggcatgct ccgcatcggc
3180 gccatgacgc gccagcagga catcgcccgg catcccctgg tcgcgcgcca cgcgccgctg
3240 ctggccgcgg ccttgcccta catcggccat atccaaacgc gcagccgcgg cacgatgggc
3300 ggcagcctgg cccatgccga tccttccgcc gagctgccgc tgaccgcggt ggtgctgaac
3360 gcgcgcctga ccatccaaag ccatgagggg cggcgcgaag tcgacgcgcg cgatttcttc 3420 cgcgacatgc tgagcaccga cctggcgccc gacgagatac tcacggaaat ctccattccg
3480 gcggcgccgc cgggaacccg ggtttccttc cgtgaatatg cgcgccggcg cggcgacttc
3540 gccctggccg cggcggcggc ccagtatgtc gaaagccccg cgggcaacac cctcgcggtc
3600 gggctgggcg gcgtcaaccc ggcaccgtat tactgcgcgc agctatcgca atcgctgtcg
3660 ggcgccgcgg ccggcgaccg cgccgcgctg gaaccactga tccgggcaga gctggaaaac 3720 ctccagcccc tgtccgatac cgaagccgac caggattacc gccgcacgct cgcgcggatc
3780 ctgctggaag actgcatacg cgaggtgctg caatgaacgc gcccatccat tccacatcca
3840 tattgcgcaa ggaggatggc cgcctgctgg cggggaaggc atccttcacc gacgacatcc
3900 acctggacgg catgctgcac ggcgtcttcg tccgcagccc gatggcgcat gcgaaagtcc
3960 tgggcatcga cgccagcgcc gcgctcgcag ccggcgcctt gctggtcctg accgccgccg 4020 acctgccgtt cgccaatcgc aacttcatcc tgcgctacgc caatccgaac atccgcggcg
4080 gcttgccgac cttcctggcc ggggagcacg tgcgtttcgt cggcgagccg atcgccttcc
4140 tggtggctcc cgaccgctat atcgccgaag acctggccgc cctggtggag atcgagctcg
4200 atcccttgcc ggcggtggcg aacgcgcacg acgccatgca gcccggcgcg gccaggctgc
4260 acgcgagctg ggaaaacaac gtcgccgcga ccttcgagcg cgtcaagggt gagccgcggg 4320 atgcgctggc gcgctgcgag cgcagcatca cgcggcgctt tcgtttcggc cggcaattgc
4380 cgcagccgtt ggagacgcgc ggctgcgtgg cggatttcga tgcgcgccgc aacgcgctgt
4440 gcctgtgggt atcgacccaa acccactaca gcgtgcgcca gaacctgtcc gccatgctcg
4500 acctgcccga atccagcatc cgcgtcgtgg ccgaatacgt aggcggcggc ttcggctcca
4560 agtcgcgccc ctacgtcgag gaaatcgtgg tcagccacgc cagccgggtg ctgcgccggc 4620 cggtgaagtg gatcgaggac cgcttcgagc acatgcaggc caccacgcat tcgcgcgcca
4680 tcgacaccga cctgaccatc ggcttcgacg ccgacggccg catccaggcc ttctcggcgc
4740 ggctggtggc cgacatcggc gcctacgtat tcaccagcgg catcatcacc accgaggtgg
4800 cggcatccat gctgaccggc ccgtatcgcg tcccgcacgc gcgggtcgaa gtgctttgcg
4860 tgggcaccaa caagacgccg ctggccacct atcggggcgc ggggcagccg gaaatgagct 4920 tcgccctgga gaacatgatg gatctggtgg ccaaggaggt cggcgtcacg ccctacgaga
4980 tcaggcgccg caacatggtg cgcccggacg actacccgta tccggtgtgg gtgccgggcg
5040 gcgcggcgga cggcgaactg gaaagcgggg actatcccgg catgctcttg cagaccgtgg
5100 agcagtccgg ctatacgcgc gcggtcgagg tgctgccgtc cggcgaggtg gccgcctggg
5160 gcctggcgtg cgggctggag ctgaccgggt tcatcaattt cgaatcggcc aggatccgca 5220 tcgagcccac cggcgagatc cgcgtctggt cgggcatgac ttcccagggc cagggccagt
5280 tcaccaccta cgcccaggta tgcgccgaga ttctcggcgc cgacgtggac atggtgacgg
5340 tgcacctggg agacaccgac ctgctgccgt tcgggcgcgg cgccttcggc agccgcggcg
5400 cggtgatggg cgcgaacgcc gtggccggcg cagccgggct gctgcgggac aaggtgctgg
5460 cccatgccgc gcgcctgctc gaatgcgatc ccgggcattt gacggtggtc cagggcagcg 5520 tctgccggat ggacggcaag ccgggcgccc tgagcctggc cgaggtggcg caggcggtct
5580 gccccggcgg caagctgttc gccggcgagc cggcgctgga aagccagtac gtctacgaca
5640 gcaagaacaa gctgaccttc gcgctatcgg tgcatgcggc ccgcgtcgcc gtcgatccgc
5700 gcgccggctt cgtgcgcgtg ctcgattact tcctggtgca cgacgccggc aagaccctca
5760 attccctggt ggtggatggc caggtggtgg gcggcgtggc cgagggaatc acctgcacgc 5820 tgttcgccga ggcggtgtac gacgcggaag ggcagccgca gatgggaacg ctggccgact
5880 atctggtggc gacggccccg gaggtgccgc gcatccgcct gggccatatg cagtcgatcc
5940 cgaccaccaa tcccctgggc gtgcgcggca tcggcgaggg cggggtgatc gcggtcgcgc
6000 cggccatcgt cagcgccatc gcccacgcga tcgctcccga cggcaagggg cacgaggacg
6060 cgctgtacac gctcccggtg cggccgccga tggtgttgaa ggcgatccgg cgcgcgcgcg 6120 agatcggcgg atcgcaggga taggccagga cagaaaaaca atcggaggag gagagggagg
6180 atgaacgaaa cccatggttt tccgggcagg gtgcggcgat gacgtggcat atggtggcgc
6240 aatcggagga gctggaagac gacgtcgctt tcgcggtgga cgtggaggaa gaagccatcg
6300 cgctgtaccg ggtgggcggg aagctgtacg ccaccgggaa tatctgcacc caccagcatg
6360 cctacatgac ggacggctat ctggacggcg attgcatcga atgccccttg catgggggca 6420 ggttcagcat tgaaacggga gagccttgcg gcgggcccgt cgaaataccc ttgaaaatct
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6540 tccaatacgc cctcggcaag cagccgcggt cgacatcaaa ggagcttgaa atgaaatcag
6600 gtcatgtttt tgcaagcctc gccctggccc ttgccgcagc cggcatggga ttgactgcaa
6660 gcgcgcaagg caccaagggc gtgctcaaga tcggcgagat caacagctac aagtcccagg 6720 ccgcgttcct gggaccgtac aaaaaaggga tggatctggc ggtcgagcag atcaacgcct
6780 cgggcggcct gctcgggaaa aaggtcgaac tggtcacgcg cgacgacaac gccaacccgg
6840 gcgacgccgt gcgcctggcg gaagagctca tttcgcggga aaaggtggac gtgctgaccg
6900 gcagctttct gtcccacatc ggcctggccc tgaccgactt cgccggccag aaaaagacct
6960 tcttcctggc ctccgaaccg ctgaccgaca agatcgtctg ggacaacggc aacccctaca 7020 ccttccggct gcgcccgtcg acgtacatgc atgcggccat gctggtgccg caggcggccg
7080 cgctcaagaa gaagcgctgg gccttcatct atcccaacta tgaattc
7127

Claims

Patentansprüche
1. Enzym mit 6-Methylnicotinsäure-2-dehydrogenase- Aktivität, umfassend die Polypeptiduntereinheiten mit den in SEQ ID No. 1, 3 und 5 dargestellten Aminosäuresequenzen oder funktionell äquivalente Fragmente oder Derivate dieser
Polypeptiduntereinheiten mit Aminosäuredeletionen, -Substitutionen, -insertionen, - inversionen, -additionen und/oder -austauschen.
2. Enzym nach Anspruch 1, erhältlich aus Mikroorganismen der Gattung Ralstonia/Burkholderia.
3. Polypeptiduntereinheit des Enzyms mit 6-Methylnicotinsäure-2-dehydrogenase- Aktivität gemäß Anspruch 1, umfassend eine der in SEQ ID No. 1, 3 und 5 dargestellten Aminosäuresequenzen, oder funktioneil äquivalente Derivate oder Fragment dieser Sequenzen mit Aminosäuredeletionen, -Substitutionen, -insertionen, -inversionen, -additionen und/oder - austauschen.
4. DNA-Sequenz, codierend für ein Enzym nach Anspruch 1 oder ein Polypeptid nach Anspruch 2, charakterisiert durch die Restriktionskarte gemäss Fig. 8 oder funktionell äquivalente genetische Varianten und Mutanten davon.
5. DNA-Sequenz für die Expression eines Enzyms oder eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in einem Wirt, umfassend eine DNA-Sequenz ausgewählt aus a) DNA mit der in SEQ ID No. 2, 4 und/oder 6 dargestellten Sequenz, Fragmenten davon und komplementären Sequenzen hierzu, b) DNA-Sequenzen, die mit den codierenden Regionen der unter a) definierten Sequenzen hybridisieren, oder Fragmente davon, und c) DNA-Sequenzen, die aufgrund des degenerierten genetischen Codes mit den unter a) und b) definierten Sequenzen hybridisieren.
6. DNA-Sequenz nach Anspruch 5 mit der in SEQ ID No. 15 dargestellten Sequenz und komplementäre Sequenzen hierzu
7. Rekombinantes DNA-Molekül oder Vektor, enthaltend eine DNA-Sequenz nach einem der
Ansprüche 4 bis 6.
8. Rekombmantes DNA-Molekül nach Anspruch 7, nämlich Plasmid pLM25C.
9. Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, dass er mit einem rekombinanten DNA-Molekül oder einen Vektor nach einem der Ansprüche 7 oder 8 transformiert ist.
10. Mikroorganismus nach Anspruch 9, ausgewählt aus Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas, Comamonas, Rhodococcus, Agrobacterium, Arthrobacter, Hydrogenophaga,
Bacillus, Acinetobacter, Clostridium, Escherichia, Proteus und Rhodobacter.
11. Mikroorganismus Comamonas acidovorans, dadurch gekennzeichnet, dass er das Plasmid pLM25C enthält.
12. Verfahren zur Herstellung von Hydroxy-Stickstoff-Heterocyclus-Carbonsäuren der allgemeinen Formeln
Figure imgf000050_0001
Figure imgf000050_0002
oder deren Salzen, worin R1, R2, R3 und R4 gleich oder verschieden sind und ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine Alkylgruppe, eine Alkoxygruppe, eine Heteroarylgruppe, eine Arylgruppe, eine Arylalkylgruppe oder eine Carbonsauregruppe bedeuten und X ein Stickstoffatom oder CR5, worin R5 ein Wasserstoff- oder Halogenatom ist, bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass eine entsprechende StickstofF-Heterocyclus-Carbonsäure der allgemeinen Formeln
Figure imgf000051_0001
Figure imgf000051_0002
oder eines ihrer Salze, worin R1, R2, R3, R4 und X die genannte Bedeutung haben, als Substrat mittels des Enzyms oder der Polypeptide nach Anspruch 1 bis 3 oder mittels der Mikroorganismen nach den Ansprüchen 9 bis 11 in das Produkt der Formel I, II oder III überführt wird.
13. Verfahren zur Herstellung von Hydroxy-Stickstoff-Heterocyclus-Carbonsäuren der allgemeinen Formeln
Figure imgf000051_0003
Figure imgf000051_0004
oder deren Salzen, worin R1, R2, R3 und R4 gleich oder verschieden sind und ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine Alkylgruppe, eine Alkoxygruppe, eine Heteroarylgruppe, eine Arylgruppe, eine Arylalkylgruppe oder eine Carbonsauregruppe bedeuten und X ein Stickstoffatom oder
CR5, worin R5 ein Wasserstoff- oder Halogenatom ist, bedeutet, durch Umsetzen einer
Stickstoff-Heterocyclus-Carbonsäure der allgemeinen Formeln
Figure imgf000052_0001
Figure imgf000052_0002
oder eines ihrer Salze, worin R1, R2, R3 und R4 und X die genannte Bedeutung haben, als Substrat, mittels 6-Methyl- nicotinsäure-verwertender Mikroorganismen der Gattung Ralstonia/Burkholderia zum entsprechenden Produkt der Formeln I, II oder III, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen vor der eigentlichen Biotransformation entweder in Gegenwart eines induzierenden Wachstumssubstrates oder in Gegenwart eines geeigneten nicht induzierenden
Wachstumssubstrates und eines Induktors angezüchtet werden.
14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung bei einer Temperatur von 15 bis 70 °C und einem pH-Wert von 5 bis 10 durchgeführt wird.
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