DE3826041C2

DE3826041C2 -

Info

Publication number: DE3826041C2
Application number: DE19883826041
Authority: DE
Inventors: Albrecht Dr. 4300 Essen De Laeufer; Hans-Guenter Prof. Dr. 6100 Darmstadt De Gassen; Ralf Dr. 7303 Neuhausen De Flachmann; Norbert Dipl.-Ing. 6087 Buettelborn De Kunz; Jochen Dipl.-Ing. 6120 Michelstadt De Seifert
Original assignee: Ruetgerswerke AG
Current assignee: Ruetgers Germany GmbH
Priority date: 1988-07-30
Filing date: 1988-07-30
Publication date: 1993-04-29
Also published as: DE3826041A1

Description

Die Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene Verfahren zur Herstellung von Chinolinsäure (Pyridin-2,3-dicarbonsäure) mit Hilfe gentechnisch modifizierter Mikroorganismen sowie nach Anspruch 2 Mikroorganismen zur Herstellung von Chinolinsäure.

Chinolinsäure ist ein wichtiges Zwischenprodukt für zahlreiche Pharmazeutika und Pflanzenschutzmittel. Sie wird großtechnisch hergestellt durch Oxidationsverfahren von Chinolin oder Chinolinderivaten gemäß z. B. EP-B 82 542 oder EP-A 1 49 857. Ein Nachteil dieser Verfahren ist es, daß die verfügbare Rohstoffmenge nicht ausreicht, um den stetig wachsenden Bedarf an Chinolinsäure zu decken.

Es ist daher Aufgabe vorliegender Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von Chinolinsäure bereitzustellen, bei dem diese aus völlig anderen unbegrenzt verfügbaren Rohstoffen in einem einfachen, kostengünstigen und umweltfreundlichen Verfahren gewonnen wird.

Aus einer älteren Anmeldung der Anmelderin (DE 37 03 255.A1) ist ein Verfahren zur Herstellung von Chinolinsäure mit Hilfe gentechnisch modifizierter Mikroorganismen bekannt. Dabei wird der folgende Metabolismus benutzt:

Im Stoffwechsel von Mikroorganismen erfolgt die Chinolinsäuresynthese in zwei Reaktionsschritten:

Diese Reaktion wird durch L-Aspartatoxidase katalysiert. Die Cyclisierung von Iminoaspartat mit Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) zu Chinolinsäure wird durch das Enzym Chinolinsäuresynthase katalysiert.

Nach dem in DE 37 03 255.A1 beschriebenen Verfahren werden zur genetischen Modifizierung aus Mikroorganismen, die die Chinolinsäuresynthese als Teil des Stoffwechsels durchführen, DNA-Sequenzen gewonnen, die für die Enzyme Chinolinsäuresynthase (nadA) und L-Aspartatoxidase (nadB) codieren.

Die Isolierung kann z. B. aus folgenden Mikroorganismen erfolgen:

Escherichia coli
Salmonella typhimurium
Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium bovis
Bacillus subtilis
Saccharomyces cerevisiae

In der Literatur sind nadA- und nadB-Mutanten von E. coli K 12 beschrieben. Mutanten dieser Spezies wurden auch von der Anmelderin zur Isolierung entsprechender DNA-Sequenzen nadA und nadB verwendet.

Zur Modifikation geeigneter Mikroorganismen werden folgende Schritte durchgeführt:

- Identifizierung, Isolierung und Sequenzierung der DNA-Sequenz nadB, die für das Enzym L-Aspartatoxidase codiert
- Identifizierung, Isolierung und Sequenzierung der DNA-Sequenz nadA, die für das Enzym Chinolinsäuresynthase codiert
- Einbau der DNA-Sequenzen nadA und nadB in Plasmide, so daß jede DNA-Sequenz mit einer Expressions-Kontroll-Sequenz verbunden ist
- Einbringen der so hergestellten modifizierten Plasmide in einen transformierbaren Wirtsorganismus.

Die so hergestellten Mikroorganismen produzieren in einem Nährmedium mit organischer C-Quelle und anorganischer oder organischer N-Quelle Chinolinsäure, die nicht mehr dem ursprünglichen Metabolismus gemäß umgesetzt, sondern bevorzugt ausgeschieden wird.

Nach dem in DE 37 03 255.A1 beschriebenen Verfahren wurden Plasmide konstruiert, die DNA-Sequenzen nadB mit der folgenden Nukleotidsequenz enthalten:

Diese Nukleotidssequenz ist für die Bildung von L-Aspartatoxidase verantwortlich.

In der gleichen Anmeldung ist weiterhin ein Verfahren beschrieben zur Konstruktion von Plasmiden, die DNA-Sequenzen nadA mit folgender Nukleotidsequenz enthalten:

Diese Nukleotidsequenz ist für die Bildung von Chinolinsäuresynthase verantwortlich.

Die isolierten DNA-Sequenzen nadA und nadB haben als Expressions-Kontroll-Sequenzen genomische Regulationssequenzen.

Die mitunter als rekombinante Expressionsplasmide benannten Expressionsvektoren werden als Plasmide bezeichnet. Sie werden in bekannter Weise erhalten durch Ligation der einzelnen DNA-Fragmente und Insertion der DNA-Fragmente in Plasmide.

Die erhaltenen Plasmide werden in üblicher Weise in einen transformierbaren Wirtsorganismus, z. B. ein E. coli-Bakterium, eingebracht. Anschließend werden die mit einem oder mehreren Plasmiden transformierten Mikroorganismen in bekannter Weise in einem geeigneten Nährmedium kultiviert.

Die Produktion und Gewinnung von Chinolinsäure erfolgt in bekannter Weise durch die mit den entsprechenden DNA-Sequenzen transformierten Mikroorganismen unter geeigneten Bedingungen, wie Batch-, Fed-batch- oder kontinuierliche Fermentation in Rühr- oder Airlift oder ähnlichen Bioreaktoren, wobei einem Mikroorganismus in einem Nährmedium eine organische Kohlenstoffquelle und eine anorganische oder organische Stickstoffquelle unter Wachstumsbedingungen zur Verfügung gestellt werden.

Wie aus den Beispielen der DE 37 03 255.A1 zu ersehen ist, wird durch die genetische Modifikation der Mikroorganismen bei allen durchgeführten Versuchen eine erhöhte Chinolinsäureausscheidung erzielt. Nachteilig sind jedoch die noch sehr geringen Ausbeuten.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von Chinolinsäure durch gentechnisch modifizierte Mikroorganismen bereitzustellen, bei dem bei verschiedenen, analogen Ansätzen hohe reproduzierbare Ausscheidungsmengen erzielt werden können.

Die Lösung der Aufgabe erfolgt durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 sowie durch dazu notwendige Mikroorganismen gemäß Anspruch 2.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß die von den modifizierten Mikroorganismen ausgeschiedene Menge beeinflußt werden kann durch die Wahl der verwendeten Plasmide, in die die DNA-Sequenzen nadA und nadB eingefügt wurden. Nicht durch Plasmide, die die nadA und nadB-Sequenzen gemeinsam tragen, werden die höchsten Ausscheidungsraten erzielt, sondern durch jeweils nur nadA bzw. nadB tragende Plasmide, die gemeinsam in die Zelle eingebracht werden.

In der Bakterienzelle haben Plasmide die Eigenschaft, sich selbst auf eine bestimmte Kopienzahl zu regulieren, Tabelle 1 zeigt für einige Plasmide charakteristische Kopienzahlen:

Tabelle 1

Für Plasmide charakteristische Kopienzahlen

Eine reproduzierbare Steigerung der Chinolinsäuresynthese kann, wie bereits dargelegt, dann erreicht werden, wenn die zur Modifizierung verwendeten Gen-Sequenzen auf unterschiedliche, zu verschiedenen Kopienzahlen führende, miteinander in der Zelle und mit dem Mikroorganismenstamm kompatible Basisvektoren etabliert werden. Die Wahl der verwendeten Plasmide wird neben der Kopienzahl in der Zelle durch die Antibiotikaresistenz bestimmt, durch die sie gegeneinander selektiert werden können.

Es wurde nun gefunden, daß die Ausscheidungsrate von Chinolinsäure erhöht wird, wenn in einem Mikroorganismus nadA und nadB tragende Plasmide mit einem Verhältnis der Kopienzahl von 8 : 50, 8 : 200 oder 50 : 200 etabliert werden. Durch die Etablierung nadA und nadB-tragender Plasmide in einem Verhältnis von 50 : 200 kann die Chinolinsäureausscheidungsrate gegenüber derjenigen nicht modifizierter Mikroorganismen von durchschnittlich 10 mg/l OD auf durchschnittlich 27 mg/l × OD erhöht werden.

Bei einem Verhältnis von nadA- zu nadB-tragender Plasmide von 8 : 50 wird eine Ausscheidungsmenge von durchschnittlich 53 mg/l OD erzielt. Durchschnittlich 95 mg/l × OD werden erzielt bei einem Kopienverhältnis von 8 : 200.

Offensichtlich werden durch die Wahl der verwendeten Plasmide optimale nadA- und nadB-Plasmid-Verhältnisse in den Wirtszellen eingestellt, die zu einer erhöhten Chinolinsäureausscheidung führen.

Verwendete Abkürzungen:

Ap
Ampicillin
DNA	Desoxyribonukleinsäure
E. coli	Escherichia coli
HPLC	High Performance Liquid Chromatography
kb	Kilobasenpaare
Kn	Kanamycin
LB	Luria-Bertani
Tc	Tetracyclin

Zusammensetzung der verwendeten Lösungen:

LB-Medium
10 g Caseinhydrolysat oder Pepton
	5 g Hefeextrakt
	5 g NaCl
	ad 1000 ml H₂O, pH 7,4
LB/Ap-Medium	LB mit 100 mg/l Ap
LB/Tc-Medium	LB mit 2 mg/l Tetracyclin
LB/Km-Medium	LB mit 25 mg/l Kanamycin

Beispiel 1 Klonierung genomischer nadB-Sequenzen

30 mikro g nach Beispiel 1 der DE 37 03 255-A1 isolierter chromosomaler DNA werden 18 h bei 50°C mit der Restriktionsendonuclease HindIII hydrolysiert und anschließend auf einem 3,5% Polyacrylamidgel in TBE-Puffer 20 h bei 30 mA elektrophoretisch aufgetrennt.

Die DNA-Fragmente mit Größen zwischen 6 und 8 kbp wurden aus dem Gel elektroeluiert, über eine Anionenaustauschersäule (DE52 Diethylaminoethyl-Cellulose) gereinigt und mit Ethanol gefällt. 1 mikro g Fragment-DNA und 1 mikro g HindIII-hydrolysierte und dephosphorylierte pBR322-DNA werden in 20 mikro l Ligasepuffer mit 10 Units T4-DNA-Ligase zur Ligation eingesetzt.

Transformation in die nadB-Mutante E. coli NK6042 (nadB::Tn10) und Selektion auf YP/Ap-Medium auf Komplementation des nadB-Mangels ergibt 7 Klone, die alle ein Plasmid der ungefähren Größe 13 kbp enthalten. Wiederholte Retransformation dieses Plasmids in NK6042 bestätigen die Komplementation des nadB-Mangels. Das Plasmid wird mit pQA_B510 bezeichnet und wie bei Maniatis beschrieben auf Restriktionsschnittstellen analysiert.

Subklonierung eines ca. 3,2 kbp großen HindIII-NruI-Fragments in mit HindIII und NruI hydrolysierten pBR322 ergibt ein weiteres Plasmid pQA_B520, welches nadB-Mangel in NK6042 komplementiert.

Weitere Subklonierung eines 2,5 kbp SspI-NruI-Fragmentes aus pQA_B520 in den Vektor pUC18, der mit dem Restriktionsenzymen HincII linearisiert worden ist, ergibt Plasmid pQA_B203. Excision des 2,5 hbp großen, nadB-tragenden Fragments aus diesem Plasmid mit den Enzymen PstI und BanmHI und Klonierung in den Vektor phT 234, der mit den Enzymen BamHI und PstI hydrolysiert wird, ergeben das Plasmid pQA_B104.

Beispiel 2 Konstruktion der Plasmide pQA_A169 und pQA_A170

75 mikro g chromosomaler DNA aus E. coli (Beispiel 1) werden mit 300 Units der Restriktionsendonuclease BamHI bei 37°C 2 h hydrolysiert und mit 10 mikro g des ebenfalls mit 10 Units BamHI hydrolysierten Plasmids pLG339 zur Ligation eingesetzt. Es erfolgt Transformation in den neu konstruierten Stamm E. coli RF1 und Selektion auf YP/Ap-Medium auf Komplementation des nadA-Mangels. Es wird ein Klon isoliert, der ein Plasmid (pQA_A12) mit einem ca. 12 kbp großen Insert enthält. Retransformation in die nadA-Mutante E. coli 431 bestätigt nadA-Komplementation.

Das Plasmid pQA_A 12 wird einer partiellen Hydrolyse mit der Restriktionsendonuclease AluI unterworfen. Das Hydrolysat wird in das mit HincII hydrolysierte Plasmid pUC18 ligiert. Es folgt Transformation in den Stamm 431 und Selektion auf YP/Ap-Medium. Es wird ein Plasmid (pQA_A166) mit einem 1,4 kbp großen Insert isoliert. Durch Hydrolyse mit den Restriktionsendonukleasen BamHI und PstI wird das 1,4 kbp-Insert aus pQA_A166 gewonnen.

Das nadA-tragende PstI/EcoRI-Fragment aus pQA_A166 wurde in pBR322 (PstI und EcoRI hydrolysiert) zu Plasmid pQA_A169 subkloniert.

Zur Konstruktion eines weiteren Plasmids pQA_A170 wurde das nadA-Gen als SmaI/HindIII-Fragment aus pQA_A166 in den "low-copy-number" Vektor pLG339 (SmaI und HindIII hydrolysiert und dephosphoryliert) kloniert.

Beispiel 4 Konstruktion der 2-Plasmid-Systeme

Kompetente Zellen der nadC-Mutante W4546 wurden mit den Plasmiden pQA_B104 bzw. pQA_B520 transformiert. Von dem Stamm W 4546/pQA_B104 wurden kompetente Zellen hergestellt und diese sowohl mit pQA_A170 als auch mit pQA_A169 transformiert. Die Stämme W 4546/pQA_B104 + pQA_A170 und W4546/pQA_B104 + pQA_A169 wurden auf LB-Km-Tc-Platten ausplattiert und selektioniert.

Analog wurde aus dem Stamm W4546/pQA_B520 ein weiteres 2-Plasmid-System mit pQA_A170 konstruiert. Dieser Stamm wächst auf LB-Ap-Tc-Medium.

Beispiel 5 Mikrobielle Erzeugung von Chinolinsäure

Die in Beispiel 4 beschriebenen Stämme wurden in einem Medium, enthaltend 5 g/l Glycerin, 0,5 g/l Na-citrat, 5 g/l Casaminosäuren, 1 g/l NH₄NO₃, 0,4 g/l MgSO₄ × 7 H₂O, 7 g/l K₂HPO₄, 2 g/l KH₂PO₄, 10^-6 Mol/l Nicotinsäure sowie die erforderlichen Antibiotika (vergl. Tabelle), 24 h bei 37°C unter Schütteln kultiviert. Danach wurde zur Bestimmung der Zellmasse die optische Dichte bei 578 nm bestimmt, sodann die Zellen durch Zentrifugation sedimentiert.

Die im klaren Überstand befindliche Chinolinsäure wurde mittels HPLC quantitativ bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.

Tabelle 2

Spezifische Chinolinsäureproduktion mit transformierten Zellen

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Chinolinsäure durch genetisch modifizierte Mikroorganismen, die nadA- und nadB-DNA-Sequenzen tragende Plasmide enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen für nadA und nadB codierende Plasmide im Verhältnis 50 : 200, 8 : 50 oder 8 : 200 enthalten, wobei jeweils nur nadA bzw. nadB tragende Plasmide gemeinsam in die Zelle eingebracht werden.

2. Mikroorganismen zur Herstellung von Chinolinsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie für Chinolinsäuresynthase und für L-Aspartatoxidase codierende DNA-Sequenzen nadA und nadB tragende Plasmide enthalten, die sich mit einem Kopienverhältnis von 50 : 200, 8 : 50 oder 8 : 200 in der Zelle etablieren, wobei jeweils nur nadA bzw. nadB tragende Plasmide gemeinsam in die Zelle eingebracht werden.