DE68924227T2

DE68924227T2 - DNA-Fragment.

Info

Publication number: DE68924227T2
Application number: DE68924227T
Authority: DE
Inventors: Bernd Dr Bachmann; Joern Dr Kalinowski; Yves Lemoine; Pierre Lepage; Mike Dr O'reagan; Alfred Prof Dr Puehler; Georg Dr Thierbach; Jean-Francois Viret
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 1988-09-12
Filing date: 1989-08-08
Publication date: 1996-02-01
Anticipated expiration: 2009-08-09
Also published as: DE68924227D1; JPH02291276A; GB8821319D0; EP0358940B1; GB2223754A; GB2223754B; EP0358940A1

Description

Der Erfindung vorausgehender Stand der Technik

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein aus einem für PEPC codierenden C. Glutamicum-Stamm isoliertes DNA-Fragment und auf das besagte Fragment tragende rekombinante DNA, die rekoinbinante DNA tragende Stämme und die Methode zur Herstellung von L-Aminosäuren mit Hilfe der besagten Stämme.

Beschreibung des Standes der Technik:

Das Enzym Phosphoenolpyruvat-Carboxylase (EC 4.1.1.3.1 ; PEPC) ist im Zusammenhang mit dem Stoffwechsel von Aminosäuren von besonderem Interesse, da es an einer sogenannten anaplerotischen Funktion teilnimmt, die konstante Versorgung der Zelle mit Oxalacetat gewährleistet.
Oxalacetat spielt seinerseits in Zusammenhang mit dem Stoffwechsel von Aminosäuren eine zentrale Rolle, und zwar sowohl als das unmittelbare Vorprodukt von L-Aspartat und als ein Mitglied des Tricarbonsäurezyklus (TCA-Zyklus). In der Tat leiten sich Aminosäuren wie L-Lysin, L-Methionin, L-Threonin und L-Isoleucin über eine Reihe von verzweigten und in hohem Maße untereinander geregelten biosynthetischen Wegen von L-Aspartat ab, während sich Aminosäuren wie L-Glutamat, L-Glutamin, L-Prolin, L-Arginin, L-Citrullin, L-Ornithin usw. von Zwischenprodukten des TCA-Zyklus ableiten.
An der Biosynthese aller vorstehend erwähnten Aminosäuren ist somit PEPC-Aktivität beteiligt.
Aus den vorstehenden Erwägungen geht hervor, daß die biosynthetischen Pegel von Aminosäuren wie L-Lysin je nach den intracytoplasmischen spezifischen Aktivitäten von Enzymen wie PEPC variieren könnten.
Angesichts der wichtigen im Zusammenhang mit der Biosynthese von Aminosäuren gespielten Rolle des PEPC ist es schon immer wünschenswert gewesen, nach verbesserten Methoden zur Herstellung von Aminosäuren durch Erhöhung der PEPC-Aktivität zu streben.
Die europäische Patentanmeldung EP-A-0 143 195 offenbart z.B. das Klonieren des aus Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 isolierten ppc-Gens und die Transformation von Bakterien der Corynebacterium-Gattungen mit einem rekombinanten Plasmid, das zwecks Produktion von L-Lysin oder Threonin das besagte Gen trägt.
Der Stand der Technik hat auch Corynebacterium melassecola- Stämme beschrieben, die mit einer das ppc-Gen von C.melassecola tragenden DNA von rekombinantem Plasmid transformiert wurden.
Diese Stämme weisen eine erhöhte PEPC-Aktivität auf, doch liegen keine Beweise für eine Erhöhung der Aminosäureproduktion vor (FR-A-2 581 653).
In diesen Veröffentlichungen deutet nichts auf Erhöhung der fermentativen Produktion von Aminosäuren, insbesondere von L-Lysin, durch Klonieren des aus Corynebacterium glutamicum isolierten ppc-Gens hin.

Zusammenfassung der Erfindung:

Die Erfinder haben festgestellt, daß bei Einführung der genetischen Informationscodierung für PEPC in einen entsprechenden zur Replikation in Corynebacteria oder Brevibacteria geeigneten Überträger und Replizieren des erzielten, die besagte genetische Information tragenden hybriden Überträgers in einem entsprechenden Corynebacterium- oder Brevibacterium-Wirt oder -Rezipienten der transformierte Mikroorganismus ein ausgezeichneter Produzent von L-Lysin, L-Threonin und L-Isoleucin aber vor allem von L-Lysin ist.
Diese Erfindung ist von besonderem Interesse, da zahlreiche Stämme der Brevibacterium- und Corynebacterium-Gattungen, die große Mengen der vorstehend genannten L-Aminosäuren erzeugen, als Wirte in Frage kommen.
Die Erfindung bezieht sich somit auf ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren und auf die verschiedenen genetischen und mikrobiologischen Elemente, die an dem besagten Verfahren beteiligt sind. Die Erfindung bezieht sich z.B. auf die isolierte Form des Gens für PEPC, auf verschiedene das besagte Gen enthaltende Überträger, wobei die besagten Überträger in den vorstehend genannten Bakterien repliziert werden können, auf verschiedene Mikroben der besagten solche Überträger enthaltenden Mikroorganismen und auf verschiedene Fermentationsverfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen:

Das DNA-Fragment besteht im wesentlichen aus 3422 Basenpaaren, weist an seinen Enden Sal I- Restriktionsstellen auf und codiert für die Produktion von PEPC, wobei die N-terminale Aminosäuresequenz Thr¹ - Asp - Phe - Leu - Arg&sup5; - Asp - Asp - Ile - - Arg - Phe¹&sup0; - Leu - Gly - Gin - Ile - Leu¹&sup5; ist.
Die strukturelle Gencodierung für PEPC umfaßt 2757 Basenpaare.
Das erhebliche PEPC wird durch Acetyl CoA nicht stimuliert.
Eine rekombinante DNA, die ein aus dem ppc-Gen bestehendes DNA-Fragment enthält, kann nach herkömmlichen Methoden konstruiert werden, z.B. durch Verdauen von chromosomaler DNA und Vektorplasmid mit einem Restriktionsenzym, worauf Behandlung mit einer DNA-Ligase oder durch Verdauen von chromosomaler DNA und Verktorplasmid mit einem Restriktionsenzym und danach Behandlung gespaltener Enden mit Terminaltransferase, DNA-Polymerase usw. und anschließende Behandlung mit einer DNA-Ligase usw. folgt (Methods in Enzymology 68 (1979)).
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Plasmid pDM6, eingeführt in C.glutamicum DM58-1, das bei der DSM unter der Nummer DSM 4697 hinterlegt und dadurch charakterisiert ist, daß es eine genetische Sequenz enthält, die eine Informationscodierung zur Produktion eines Proteins mit der Aktivität von Phosphoenolpyruvat-Carboxylase (PEPC) umfaßt, wobei das besagte Plasmid eine Länge von 7,9 kb aufweist und eine Restriktionskarte hat, wie sie in Fig. 7 dargestellt ist.
Zwecks Isolierung des ppc-Gens wurde in dem Plasmid pUC18, einem allgemein zum Klonieren in dem grammnegativen Bacterium E.coli benutzten Vektor, eine genomische Bank von C.glutamicum ATCC 13032 konstruiert. Das ppc-Gen wurde durch in den entsprechenden Genen durchgeführte Komplementation bekannter Mutantenstämme des E. coli isoliert. In Frage kommende Klone wurden analysiert, und es wurde sowohl auf genetischem als auch auf enzymatischen Wege erwiesen, daß sie das angestrebte Gen enthaltende Insertionen tragen.
Das ppc-Gen wurde später auf sogenannte Plasmid- Pendelvektoren (Überträger) subkloniert, was seine Vermehrung in sowohl E. coli und dem ursprünglichen Corynebacterium-Wirt oder einem Glutamat erzeugenden Stamm jeder Art gestattete, um ein Molekül von rekombinanter DNA zu erzielen, das das neue in einen zur Replikation in einem glutamaterzeugenden Stamm fähigen Vektor inserierte DNA- Fragment enthielt.
Von besonderem Interesse sind die Vektoren pZ1 und pCV 22.
Plasmid pZ1 umfaßt eine zur Vermehrung in coryneformer Glutaminsäure erzeugenden Bakterien und E.coli geeignete Treibeinheitsregion, die mindestens eine Region zum Exprimieren von Resistenz gegenüber einer Droge aufweist.
pZ1 ist in der deutschen Patentanmeldung 37 37 729.9 offenbart.
pCV 22 ist ein im wesentlichen reines Plasmid, das durch eine Länge von 4,5 kb und ein in Fig. 6 dargestelltes Spaltungsdiagramm für Restriktionsendonuclease charakterisiert ist.
Die Vektoren können aus den Zellen von hinterlegten Mikroorganismen durch Lysieren der Zellen im Einklang mit dem Stand der Technik gewonnen werden.
Die das ppc-Gen von wildem oder mutantem Typ enthaltende rekombinante DNA kann nach bekannten Transformationsmethoden in bevorzugte Mikroorganismen des Genus Corynebacterium bzw. Brevibacterium eingeführt werden.
Zur Replikation in den besagten Mikroorganismen fähige Überträger sind die Plasmide pDM 2 bzw. pDM 6 (siehe Restriktionskarten in Fig. 5 und Fig. 7).
Als Rezipienten bzw. Wirte werden C.glutamicum, C.melassecola, B. lactofermentum und B. flavum, insbesondere bereits für die Produktion von Aminosäuren bekannte Bakterien, bevorzugt.
Für die Expression des ppc-Gens in den transformierten Stämmen kann jeder als in Corynebacterium bzw. Brevibacterium wirksam bekannte Promotor benutzt werden. Es können dies endogene Promotoren dieser Stämme sein, d.h. Promotoren, die die Expression von ursprünglich zu dem Stamm gehörenden Genen steuern. Es können auch exogene Promotoren sein, zu denen u.a. die Promotoren ptac, plac, ptrp, PR und PL des Phagens λ zählen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in einem Verfahren zur Produktion einer eigens aus der Gruppe L-Lysin, L-Threonin, L-Isoleucin aber vor allem L-Lysin ausgewählten Aminosäure.
Die Methoden des Kultivierens der auf diese Weise gewonnenen L-Aminosäure produzierenden Stämme sind herkömmlich und ähnlicher Art wie die Methoden der Kultivierung bekannter L-Aminosäure produzierender Mikroorganismen.
Das zum Einsatz gelangende Kulturmedium kann ein herkömmliches Medium sein, das Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und organische Ionen enthält, sowie gegebenfalls geringere Anteile organischer Nährstoffe wie Vitamine und Aminosäuren. Zu den Beispielen geeigneter Kohlenstoffquellen zählen Glucose, Saccharose, Lactose, Stärke-Hydrolysat und Melasse. Als Stickstoffquelle kommen auch Ammoniakgas, wässeriges Ammoniak, Ammoniaksalze und andere Stickstoff enthaltende Stoffe in Frage.
Die transformierten, den den ppc-Gen tragenden Überträger enthaltenden Organismen werden unter aeroben Bedingungen kultiviert, in denen der pH-Wert und die Temperatur des Mediums auf entsprechende Pegel eingestellt und auf diesen Pegeln erhalten werden, bis keine L-Aminosäure mehr gebildet wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird von einem transformierten Corynebacterium Glutamicum Gebrauch gemacht, das aus der Gruppe der Stämme ausgewählt wurde, die die Kennzeichen des unter der Nummer DSM 4697 aufgrund der Bestimmungen des Budapester Vertrags vom 8. Juli 1988 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) hinterlegten Corynebacterium Glutamicum aufweisen.
Von Interesse ist auch ein Brevibacterium-Stamm, der aus der Gruppe der Stämme mit den Kennzeichen von B.flavum DSM 5399 ausgewählt wurde.
Die sich in dem Kulturmedium ansammelnden Aminosäuren können nach herkömmlichen Verfahren wiedergewonnen werden. Nach den erfindungsgemäßen Methoden lassen sich die vorstehend genannten L-Aminosäuren, vor allem L-Lysin, mit höheren Ausbeuten herstellen als dies nach zuvor bekannten Methoden, bei denen von künstlichen Brevibacterium- und Corynebacterium-Mutanten Gebrauch gemacht wurde, möglich war.
Im Anschluß an diese allgemeine Beschreibung der Erfindung läßt sich eine weitere Einsicht durch Bezugnahme auf gewisse spezifische Beispiele erzielen, die in dieser Urkunde für rein illustrative Zwecke geboten werden und, wenn nicht anders angeführt, nicht als einschränkend zu erachten sind.

1. Isolierung des ppc-Gens aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032.

1.1 Konstruktion einer genomischen Bank von C.glutamicum ATCC13032.

Die gesamte DNA aus C. glutamicum ATCC13032 wurde, wie von Chater et al (Curr. Topics Microb. Immunol. 96, 69 pp (1982)) beschrieben, isoliert und partiell mit Sau3AI verdaut. Fragmente der Größenspanne von 4-20 kb wurden von Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt gereinigt. Die DNA- Lösung wurde gegen 2 L TE-Puffer (Tris 10 mM, EDTA 1 mM) dialysiert. 2 ug von größenmäßig fraktionierter chromosomaler DNA wurde mit Hilfe von T4 DNA-Ligase mit 1 ug Plasmid pUC18 (Yanish-Perron, C. et al. (1985) Gene 33 103 pp), das mit BamHI verdaut und mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war, ligiert.
E. coli NM522 (Gough, J.A. and Murray, N.E. (1983) J. Mol. Biol. 166, 1 pp) wurde im Einklang mit Hanahans Methode (J. Mol. Biol., 166, 557 pp (1983)) mit dem Ligationsgemisch transformiert, und Transformanten wurden bei 37ºC auf Ampicillin (100 ug/ml) und 5-Bromo-4-Chloro- Indolyl-β-D-Galactopyranosid (X-gal, 50 ug/ml) enthaltenden LB-Agarplatten (Davis, R.W. et al. (1980) Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory) selektioniert. 80 % der Klone waren auf X-Gal-Platten farblos, was auf die Anwesenheit von inserierter DNA hindeutete. Zwecks genauerer Schätzung des Wirkungsgrades der Klonierung wurde Plasmid-DNA aus 46 farblosen Klonen durch Restriktionsenzymverdauung untersucht: 7 % der Klone enthielten keine Insertionen; 41 % der Klone enthielten kleine Insertionen mit einer durchschnittlichen Größe von 0,5 kb; 52 % der Klone enthielten Insertionen der Größenspanne von 1,35 kb bis 8,5 kb bei einer durchschnittlichen Größe von 5 kb.
Insgesamt wurden 10&sup4; Klone nach Transformation des Stammes NM522 erzielt. Diese Klone wurden in 4 Gruppen (CgSA, CgSB, CgSC und CgSD) vereinigt, und Plasmid-DNA wurde durch CsCl- EtBr-Dichtegradientzentrifugation präpariert.

1.2 Klonierung des ppc-Gens

Kompetente Zellen von E. coli XH11 (Mountain, A. et al. (1984) Mol. Gen. Genet 197, 82 pp) wurden mit 5 x 200 ng jeder der Gruppen der C. glutamicum-Genenbank transformiert. Transformationsgemische wurden auf M9-Agar (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory) mit Arginin (50 ug/ml) und Ampicillin (100 ug/ml) sowie auf LB mit Ampicillin (100 ug/ml) aufgetragen. Auf LB mit Ampicillin wurde eine Transformationsfrequenz von 10&sup4;/ug erzielt. Nach der Transformation mit der Gruppe CgSD wurden 108 Klone auf Arginin und Ampicillin enthaltendem M9-Agar isoliert. Restriktionsenzymverdauung von isolierter DNA deutete darauf hin, daß alle Klone das gleiche plasmid enthielten. Das Plasmid (pTG1200) bestand aus pUC18 sowie einer Insertion von etwa 5 kb Länge. Eine Restriktionskarte der Insertion von pTG1200 ist in Fig. 1 dargestellt. Retransformation von XH11 durch pTG1200 führte zu Komplementation der ppc-Mutation. Southern Hybridisierung (Maniatis, T. et al. (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory) bestätigte, daß in pTG1200 chromosomale DNA aus C.glutamicum ATCC13032 kloniert worden war.

1.3 Lokalisierung des ppc-Gens auf dem klonierten DNA- Fragment.

Zwecks besserer Lokalisierung des ppc-Gens wurden Subklonierversuche ausgeführt. Verdauung von pTG1200 mit SAlI ergibt ein internes Fragment von 3,5 kb (Fig. 1). Mit SAlI verdautes pTG1200 wurde mit durch SAlI gespaltenem pBR322 ligiert (Bolivar, F. et al. (1974) Gene 2, 95 pp).
Um religierte pTG1200-Moleküle auszuschalten, wurde das Ligationsgemisch mit XbaI verdaut. E. coli XH11 wurde mit dem Ligationsgemisch transformiert und auf Arginin und Ampicillin enthaltendes M9-Agar ausplattiert. Plasmid-DNA aus komplementierten Klonen wurde untersucht, wobei es sich erwies, daß sie aus pBR322 sowie dem 3,5 kb SalI-Fragment von pTG1200 bestand. Das konstruierte Plasmid erhielt die Bezeichnung pTG1201 (Fig. 2) und der entsprechende Stamm erhielt die Bezeichnung XH11/pTG1201.

1.4 Messung der Enzymaktivität in C.glutamicum ATCC13032- und in E. coli-Klonen, die ein rekombinantes Plasmid trugen, das das DNA-Fragment mit dem ppc-Gen aus C. glutamicum enthielt.

Phosphoenolpyruvat-Carboxylase-Aktivität wurde in c. glutamicum ATCC13032 und in dem E. coli-Stamm XH11/pTG1201 geprüft. Als positive Kontrolle wurde von dem E. coli-Stamm MM294 (Hanahan, D. (1983) J. Mol. Biol. 166, 557 pp) Gebrauch gemacht, und als negative Kontrolle von dem Stamm XH11. C. glutamicum ATCC13032 wurde in MMYE- Medium (Katsumata, R. et al. (1984) J. Bact. 159, 306 pp), und E. coli-Stämme in M9-Medium, das mit Arginin (50 ug/ml) und im Falle von XH11/pTG1201 mit Ampicillin (100 ug/ml), im Falle von MM294 mit Thiamin (200 ug/ml) und im Falle von XH11 mit Natriumsuccinat (5 g/l) und Arginin (50 ug/ml) supplementiert war. Die Wachstumsbedingungen waren 37ºC und 150 Upm bei E. coli-Stämmen und 30ºC und 150 Upm bei C. glutamicum.
Die Kulturen wurden durch Zentrifugation zu Beginn der stationären Wachstumsphase geerntet und dreimal mit einem aus 100 mm Tris/Cl pH 7,5 und 1 mM DTT bestehenden Puffer gewaschen. Für den Aufschluß der Zellen wurde eine Glaskugelmühle benutzt (MSK-Homogenisator; B. Braun, Melsungen, BRD). PEP-Carboxylase-Aktivität in den klaren Überständen wurde nach eingehender Dialyse gegen 100 mm Tris/HCl pH 7,5; 0,8 M (NH&sub4;/SO&sub4;; 1 mM) DTT bestimmt. Es wurde von dem modifizierten Malat-Dehydrogenase-gekoppelten Analysegemisch (Ozaki, H. and Shiio, J. (1969) J. Biochemistry 66, 297 pp) Gebrauch gemacht, und NADH- Schwund wurde bei 340 nm photometrisch verfolgt. Das Analysegemisch enthielt die folgenden Bestandteile: 6 mM PEP; 10 mM NaHCO&sub3;; 100 mM Tris/HCl pH 7,5; 0,15 mM NADH; 2 E/ml Malat-Dehydrogenase (Schweineherz); 3,3 mM MnSO&sub4; und PEP-Carboxylase-Präparation in einer Endmenge von 1 ml. Unspezifischer NADH-Abbau wurde vor Beginn der Reaktion durch Zusatz von Mn&spplus;&spplus; gemessen. Die Proteinkonzentration wurde nach den Methoden von Lowry et al. (Lowry, O.H. et al. (1951) J. Biol. Chem. 193, 265 pp) bzw. Bradford et al. (Bradford, M.M. (1976) Analyt. Biochem. 72. 248 pp) bestimmt.
Die in Tafel 1 angeführten Daten bestätigen, daß das in Plasmid pTG1201 enthaltene aus C. glutamicum ATCC13032 klonierte 3,5 kb SalI DNA-Fragment das Phosphoenolpyruvat- Carboxylase Gen codiert.
Insbesondere wurde die Wirkung von Acetyl-CoA, das bekanntlich Phosphoenolpyruvat-Carboxylase aus E. coli stimuliert (Izui. K. et al. (1981) J. Biochem. 90, 1321 pp) und aus Brevibacterium flavum (Ozaki, H. et al. (1989) J. Biochem. 66, 297 pp) untersucht. Die in Tafel 1 angeführten Ergebnisse erweisen, daß Phosphoenolpyruvat- Carboxylase aus C. glutamicum ATCC13022, das entweder in seinem ursprünglichen Wirt oder infolge des Klonierens in E. coli zwecks Bildung des Stammes XH11/pTG1201 erzeugt wurde, unter den vorstehend beschriebenen Analysebedingungen nicht stimuliert wird. Tafel 1: Phosphoenolpyruvat-Carboxylase-Aktivität in dialysierten aus C. glutamicum und aus verschiedenen E. coli-Stämmen gewonnenen Homogenaten. Stämme Phosphoenolpyruvat-Carboxylase-Aktivität (E/mg Protein) ohne Acetyl-CoA in Anwesenheit von 0,2 mM Acetyl-CoA C. glutamicum ATCC13032 E. coli MM294 E. coli XH11/pTG1201 E. coli XH11

2. Bestimmung der Nucleotidsequenz des ppc-Gens aus C. glutamicum ATCC13032.

Die Nucleotidsequenz der gesamten 5 kb Insertion von pTG1200 wurde nach einem "shot gun"-Verfahren (Messing, J. et al. (1981) Nuclei Acids Res. 9, 309 pp) sequenziert. Die SmaI-Stelle von pTG1200 wurde mittels Klonierung eines stumpfendigen (blunt ended) Oligomeren (GTGTCTACAGTG) durch eine XbaI-Stelle ersetzt, um ein neues als pTG1202 bezeichnetes Plasmid zu erzeugen. 10 ug der 5,0 kb XbaI- Insertion von pTG1202 wurde von Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt gereinigt. Das Fragment wurde mit Hilfe von T4 DNA-Ligase rezirkularisiert, durch Schallwellenapplikation willkürlich fragmentiert und schließlich mit Hilfe von Klenow-Polymerase in Anwesenheit von dATP, dGTP, dCTP und dTTP - jeweils 2 mM - stumpfendig gemacht. Fragmente der Größenspanne von 300-800 bp wurden von Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt isoliert und mit durch SmaI verdaute M13mp8-Phage ligiert (Messing, J. und Vieira, J. (1982), Gene 19, 269-276). 160 Klone wurden nach der Kettenterminationsmethode (Sanger, F. et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 pp) sequenziert und überlappende Klone wurden durch rechnergestützte Analyse identifiziert (DNASTAR, Inc., 1801 University Ave, Madison, W153705, USA). Die gesamte Sequenz des inserierten DNA- Fragments, das in pTG1202 mit dem ppc-Gen aus C. glutamicum ATCC13032 enthalten war, ist in Fig. 3 dargestellt.
Die gesamte Sequenz, die bestimmt wurde, hatte eine Länge von 4885 bp. Eine Suche nach etwaigen Proteincodierregionen hat einen langen offenen Leseraster (ORF) aufgezeigt, der sich als ppc-Gen-Sequenzen aus E. coli (Fujita, N. et al. (1984) J Biochem. 95, 909 pp) und anderen Organismen (Katagiri, F. et al. (1985) Gene 38, 265 pp und Izui, K. et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14, 1615 pp) gegenüber als homolog erwiesen, was darauf hindeutet, daß diese ORF das PEP-Carboxylase-Gen codiert. Dieser ORF ist innerhalb des in pTG1201 klonierten 3,5 kb SalI DNA-Fragments, und zwar zwischen den Koordinaten 652 und 4077, enthalten. Sequenzanalyse ergab zwei mögliche Ausgangsstellen der Translation (Koordinaten 921 und 906), was einem Proteinprodukt mit 919 bzw. 924 Aminosäuren entspricht.

2.1 Bestimmung der N-terminalen Sequenz des PEP- Carboxylase-Proteins.

Zwecks genauer Identifizierung des Initiatorcodons des ppc- Gen-Produkts, wurde die N-terminale Aminosäuresequenz des PEP-Carboxylase-Proteins bestimmt.
Nach Aufschluß der Zellen mit Hilfe eines Glaskugel-MSK- Homogenisators wurde PEP-Carboxylase aus C. glutamicum ATCC13032 gereinigt. Nach Fällung von Nucleinsäuren mit Hilfe von 0-3 % Streptomycinsulfat wurde eine fraktionierte (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;-Fällung (0-50 % und 50-70 %) durchgeführt. Das wiederaufgelöste Pellet von der 50-70 % (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;-Fällung wurde gegen Startbuffer (20 mM Tris/HCl pH 7,5; 100 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;; 1 mM DTT) dialysiert und durch Ionenaustauschchromatographie auf Q Sepharose fast flow weitergereinigt. Dann wurden die konzentrierten PEP- Carboxylase-Fraktionen eine Gelfiltration auf Sephacryl S300 superfine unterzogen: zur Elution diente Stabilisierpuffer (100 mm Tris/HCl pH 7,5; 800 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;; 1 mM DTT). Schließlich wurden Proben mittels einer Affinitätschromatographiestufe auf Blue Sepharose verarbeitet, unter Einsatz von L-Aspartat (70 mM) eluiert und zwecks Beseitigung von Aspartat gegen Stabilisierpuffer dialysiert. Die homogenen PEP-Carboxylase-Fraktionen wurden dann, wie von SDS-PAGE bewiesen, um den Faktor von etwa 4 konzentriert, wobei von einem bei 5ºC arbeitenden Speedvac-Konzentrator Gebrauch gemacht wurde.
Das Entsalzen von Enzymfraktionen (1 ml enthielt etwa 25 ug Protein) wurde durch Verdünnung mit 5 ml TRIS/HCl 100 mM pH 7,5 bewirkt. Proben wurden dann mit Hilfe eines 8400 Amicon-Konzentrators auf ein Endvolumen von 1,5 konzentriert, wofür von einer YM30-Membran (Durchmesser 2,5 cm) Gebrauch gemacht wurde. Dieser Vorgang wurde zweimal wiederholt. Die konzentrierte Lösung wurde in drei 2 ml-Eppendorf-Röhrchen verteilt. Dann wurde nach Zusatz von Äthanol (2 ml) in jedes Eppendorf-Röhrchen 48 Stunden lang Proteinfällung bei -80ºC durchgeführt. Die Pellets wurden vereinigt und zweimal mit einem auf -80ºC gekühlten Gemisch von Äthanol und Wasser (80/20 Vol/Vol) gewaschen. Die Proben wurden auf ein Vorzyklusfilter zum Sequenzieren nach Solubilisation in Ameisensäure aufgebracht. Zum Sequenzieren wurde ein Applied Biosystem 470A- Proteinsequenziergerät mit einem On-Line 120A PTH- Analysator benutzt.
Die erzielte Sequenz ist wie folgt:
Thr¹-Asp-Phe-Leu-Arg&sup5;-Asp-Asp-Ile-Arg-Phe-¹&sup0;-Leu-Gly-Gln- Ile-Leu¹&sup5;
Dieses Ergebnis erweist, daß PEP-Carboxylase durch den ORF von 919 Aminosäuren codiert wird, die sich zwischen dem ATG-Codon in Position 921 und dem TAG-Codon in Position 3678 erstrecken. Das Initiatorcodon befindet sich etwa 14 Basenpaare nach einer vermuteten Shine-Dalgarno-Sequenz (Koordinaten 900-908, Fig. 3).

3. Klonierung und Expression des ppc-Gens aus C. glutamicum ATCC13032 in C. glutamicum ATCC13032.

3.1 Konstruktion des Pendelvektors pZ1 aus C. glutamicum/E. coli.

Die Struktur des Plasmid-Pendelvektors pZ1 ist in Fig. 4 gezeigt. Es wurde aus dem E. coli-Vektor pACYC177 (Chang, A.C.Y. und Cohen, S.N. (1978) J. Bact. 134, 1141 pp) und aus C. glutamicum-plasmid pHM1519 (Miwa, K. et al. (1984) Agric. Biol. Chem. 48, 2901 pp) konstruiert, wie dies in der deutschen Patentanmeldung 3737729.9 offenbart ist. Der Plasmidvektor pZ1 enthaltende E. coli-Stamm DM272-3 wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Nummer DSM4242 hinterlegt.

3.2 Klonierung des ppc-Gens auf den Pendelvektor pZ1 aus C. glutamicum/E. coli.

Plasmid pTG1200 wurde aus E. coli XH11/pTG1200 isoliert und partiell mit Sau3A verdaut, und aus DM272-3 (= DSM4242) isoliertes Plasmid pZ1 wurde mit Hilfe von BglII linearisiert. Beide DNAs wurden gemischt, mit T4 DNA-Ligase ligiert, und das Ligationsgemisch wurde zum Transformieren von E. coli XH11 benutzt. Transformanten wurden auf Arginin (50 ug/ml) und Kanamycin (10 ug/ml) enthaltendem M9-Agar selektioniert. Plasmid-DNA aus einem der Transformanten mit der Bezeichnung XH11/pDM2 wurde isoliert und durch Restriktionskartierung charakterisiert. Die Struktur des pDM2 ist in Fig. 5 ersichtlich. Enzymmessungen erwiesen, daß der Stamm XH11/pDM2 eine Phosphoenolpyruvat- Carboxylase-Aktivität aufwies, die zum Unterschied von dem Stamm XH11/pTG1201 gemäß Tafel 1 nicht durch Acetyl-CoA stimuliert wurde (Tafel 2). Tafel 2: Phosphoenolpyruvat-Carboxylase-Aktivität in aus C. glutamicum ATCC13032 und aus E. coli-Stämmen XH11 und XH11/pDM2 gewonnenen dialysierten Homogenaten Stämme Phosphoenolypyruvat-Carboxylase-Aktivität (E/mg Protein) ohne Acetyl-CoA in Anwesenheit von 0,2 mM Acetyl-CoA C. glutamicum ATCC13032 E. coli XH11 E. coli XH11/pDM2

3.3 Konstruktion des Vektors pCV22 aus C. glutamicum.

Plasmid pHM1519 (Miwa, K. et al. (1984) Agric. Biol. Chem. 48, 2901 pp) das aus C. glutamicum ATCC 13058 isoliert wurde, wurde mit Hilfe von BglII gespalten und mit dem pUC8 (Vieira, J. und Messing, J. (1982) Gene 19, 259 pp)-Derivat pSVB21 (Arnold, W. et al. Gene (1988) 70, 171 pp), das mit Hilfe von BamHI gespalten war, ligiert. Das Ligationsgemisch wurde zum Transformieren von E. coli Stamm JM83 (Vieira, J. und Messing, J. (1982) Gene 19, 259 pp) benutzt, und Transformanten wurden auf Ampicillin enthaltendem LB-Agar selektioniert. Plasmid-DNA wurde aus einem der Transformanten isoliert und erhielt der Bezeichnung pECS100.
Das Kanamycin-Resistenzqen von Tn5 (Jorgensen, R.A. et al. (1979) Mol. Gen. Gen. 177, 65 pp) wurde als ein Tn5 tragendes XhoI-SAlI DNA-Fragment aus einem pACYC184 (Chang, A.C.Y. und Cohen, S.N. (1978) J. Bact. 134, 1141 pp)- Derivat isoliert und in die SalI-Stelle von pECS 100 inseriert, um pECS300 zu bilden, das an C. glutamicum ATCC13032 durch Transformation transferiert wurde (Yoshihama, M. et al. (1985) J. Bact. 162, 591 pp).
Plasmid pECS300 wurde aus mit SmaI verdautem Stamm ATCC13032/pECS300 isoliert, religiert und zum Transformieren von C. glutamicum ATCC13032 verwendet. Plasmid wurde aus einer der Transformanten isoliert, durch Restriktionskartierung charakterisiert und mit der Bezeichnung pECS330 versehen.
Das E. coli-Replikon einschließlich des β-Lactamase- Resistenzgens wurde durch Verdauung mit HindIII, Religation und Transformation zwecks Bildung des C. glutamicum-Vektors pCV20 aus pECS330 gelöscht.
Plasmid pCV20 wurde mit SmaI verdaut und mit dem 0,322 kb PvuII-Fragment von dem den E. coli-lacZ-Promotor und die multiple Klonierstelle tragenden pUC19 legiert (Yanisch- Perron, C. et al. (1985) Gene 33, 103 pp). C. glutamicum ATCC13032 wurde mit dem Ligationsgemisch transformiert. Plasmid-DNA wurde aus einer der Transformanten isoliert und erhielt die Bezeichnung pCV22, und seine Struktur wurde durch Restriktionskartierung bestätigt. Die Struktur von pCV22 einschließlich seiner Konstruktion wie vorstehend beschrieben ist in Fig. 6 ersichtlich.

3.4 Klonierung der ppc-Gens auf den C. glutamicum-Vektor pCV22.

Plasmid pDM2 wurde aus E. coli-Stamm XH11/pDM2 durch Ethidiumbromid-CsCl-Dichtegradientzentrifugation isoliert und zum Transformieren von C. glutamicum ATCC13032 verwendet, wie dies von Yoshihama et al. (J. Bact. 162, 591 pp (1985)) beschrieben wurde. Plasmid-DNA wurde aus einer der Transformanten isoliert, und es wurde erwiesen, daß sie die Struktur von pDM2 hatte.
Plasmid pCV22 wurde aus mit SAlI gespaltenem ATCC13032/pCV22 isoliert und mit alkalischer, aus Kalbseingeweiden gewonnener Phosphatase behandelt. Plasmid pDM2 wurde mit SalI und SmaI gespalten. Beide DNAs wurden gemischt und mit T4 DNA-Ligase ligiert, und das Ligationsgemisch wurde zum Transformieren von C. glutamicum ATCC13032 (Yoshihama, M. et al. (1985) J. Bact. 162, 591 pp) verwendet. Plasmid-DNA mit der Bezeichnung pDM6 wurde aus einer der Transformanten isoliert und durch Restriktionskartierung charakterisiert. Die Struktur von pDM6 ist in Fig. 7 ersichtlich.

3.5 Messung der Enzymaktivität in C. glutamicum-Klonen, die ein das DNA-Fragment mit dem ppc-Gen enthaltendes rekombinantes Plasmid trugen.

Phosphoenolpyruvat-Carboxylase wurde in C. glutamicum- Stämmen ATCC13032/pCV22, ATCC13032/pDM2 und ATCC13032/pDM6 gemessen. Das Ergebnis ist in Tafel 3 dargestellt. Tafel 3: Phosphoenolpyruvat-Carboxylase-Aktivität in aus verschiedenen C. glutamicum-Stämmen erhaltenen dialysierten Homogenaten. C. glutamicum-Stämme Phosphoenolypyruvat-Carboxylase-Aktivität (E/mg Protein) in Abwesenheit von Acetyl-CoA ATCC13032/pCV22 ATCC13032/pDM2 ATCC13032/pDM6

4. Wirkung von Plasmid pDM6 auf PEP-Carboxylase- Aktivität und auf die Lysinausscheidung des Lysin ausscheidenden Stammes C. glutamicum DM58-1.

C. glutamicum Stamm DM58-1 ist ein Derivat von Stamm ATCC13032, der 50 mM des nach herkömmlicher N-Methyl-N'- Nitro-N-Nitrosoguanidin-Mutagenese gewonnenen L-Lysin- Analogs S-2-Aminoethyl-DL-Cysteins gegenüber resistent ist.
Plasmid pDM6 und Plasmid pCV22 als Kontrolle wurden in C. glutamicum DM58-1 eingeführt, um die Stämme DM58-1/pDM6 und DM58-1/pCV22 zu erzielen. Stamm DM58-1/pDM6 wurde unter der Nummer DSM4697 bei der Deutschen Stammsammlung von Mikroorganismen hinterlegt. Die durch Messen der spezifischen PEP-Carboxylase-Aktivität und der Konzentration von ausgeschiedenem Lysin sowie des Saccharoseverbrauchs erzielten Ergebnisse sind in Tafel 4 angeführt.
Die stimulierende Wirkung des erhöhten PEP-Carboxylase- Pegels, die von dem klonierten ppc-Gen des Plasmids pDM6 auf die Konzentration ausgeschiedenen Lysins und insbesondere auf die Ausbeute, d.h. den je Menge verbrauchter Saccharose gebildeten Lysinanteil, ausgeübt wird, liegt auf der Hand. Tafel 4: Wirkung eines erhöhten PEP-Carboxylase-Pegels auf die Lysinausscheidung durch C. glutamicum. Stämme PEP-Carboxylase-Aktivität (E/mg Protein) Konzentration von ausgeschiedenem L-Lysin (g/l) Ausbeute g L-Lysin g Saccharose C. glutamicum DM58-1 C. glutamicum DM58-1/pCV22 C. glutamicum DM58-1/pDM6
Die Kultivierung wurde in mit Einkerbungen versehenen 100 ml Kolben ausgeführt, die 10 ml eines aus 12 g/l Ammoniumsulphat, 240 g/l Melasse, 60 ml/l Sojabohnenproteinhydrolysat und 10 g/l CaCO&sub3; bestehenden Mediums enthielten. In Falle der Stämme DM58-1/pCV22 und DM58-1/pDM6 enthielt das Medium 20 ug/ml Kanamycin. Die Inkubationsdauer war 48 h bei 30ºC und 300 Upm. Nach Abschluß der Kultivierung wurde in dem Kulturüberstand enthaltenes Lysin mit Hilfe von Aminosäureanalysatoren quantitativ bestimmt, wobei von Ionenaustauschchromatographie und Nachweis von Ninhydrin Gebrauch gemacht wurde. Saccharose wurde quantitativ nach einem enzymatischen Analyseverfahren bestimmt, wobei von mit Hexokinase und Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase gekoppelter Invertase Gebrauch gemacht wurde (Technicon Application Note AAII: Saccharose and Glucose).

5. Wirkung von Plasmid pDM6 auf die Threonin- und Isoleucin-Ausscheidung von Stamm B. flavum DM368-2.

B. flavum Stamm DM368-2 ist ein Derivat von Stamm ATCC14067, das 4 mg/ml des nach herkömmlicher N-Methyl-N'- Nitro-N-Nitrosoguanidin-Mutagenese gewonnenen Threoninanalogs α-Amino-β-Hydroxy-Baldriansäure gegenüber resistent ist.
Plasmid pDM6 wurde aus C. glutamicum DM58-1/pDM6 (= DSM4697) isoliert und in B. flavum DM368-2 eingeführt, um den Stamm DM368-2/pDM6 zu erzielen. Der Stamm DM368-2 wurde unter der Nummer DSM 5399 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen hinterlegt. Tafel 5 zeigt die Wirkung von Plasmid pDM6 auf die Konzentration ausgeschiedenen L-Threonins und L-Isoleucins sowie den Saccharoseverbrauch.
Die stimulierende Wirkung des in Plasmid pDM6 enthaltenen klonierten ppc-Gens auf die Konzentration von ausgeschiedenem Threonin und Isoleucin und insbesondere auf die Ausbeute, d.h. den je Menge verbrauchter Saccharose gebildeten Anteil von Aminosäure liegt auf der Hand. Tafel 5: Wirkung von pDM6 auf die Threonin- und Isoleucinausscheidung durch B. flavum. Stämme ausgeschiedene Aminosäure Konzentration ausgeschiedener Aminosäure (g/l) Ausbeute g Aminosäure g Saccharose B. flavum DM368-2 B. flavum DM368-2/pDM6 L-Threonin L-Isoleucin
Die Kultivation wurde wie unter 4 beschrieben ausgeführt.
Fig. 1: Restriktionskarte der Insertion von pTG1200.
Fig. 2: Restriktionskarte von pTG1201.
Fig. 3: Nucleotidsequenz des in das das ppc-Gen enthaltende pTG1200 inserierten DNA-Fragments.
Fig. 4: Restriktionskarte von pZ1.
Fig. 5: Restriktionskarte von pDM2.
Fig. 6: Konstruktion und Restriktionskarte von pCV22.
Fig. 7: Restriktionskarte von pDM6.

Claims

1. Plasmid pDM6, eingeführt in C.glutamicum DM58-1, das unter der Nummer DSM 4697 bei der DSM hinterlegt ist, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Informationscodierung für die Herstellung eines Proteins mit der Aktivität von Phosphoenolpyruvat- Carboxylase (PEPC) umfassende genetische Sequenz enthält, wobei das besagte Plasmid, dessen Restriktionskarte in Bild 7 dargestellt ist, eine Länge von 7,9 kb hat.

2. Ein Wirtsbacterium des Genus Corynebacterium oder Brevibacterium, das das eine aus der Gruppe L-Lysin, L-Threonin und L-Isoleucin ausgewählte L-Aminosäure erzeugende Plasmid nach Anspruch 1 enthält.

3. Ein Corynebacterium nach Anspruch 2, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die die Kennzeichen von DSM 4697 aufweisen.

4. Ein Brevibacterium nach Anspruch 2, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die die Kennzeichen von DSM 5399 aufweisen.

5. Ein Verfahren zur Herstellung von aus der Gruppe L-Lysin, L-Threonin und L-Isoleucin ausgewählten L-Aminosäure durch Fermentation, wobei sich das besagte Verfahren auf Kultivierung in einem entsprechenden Medium eines Bacteriums nach den Ansprüchen 2, 3 oder 4 und Gewinnung der L-Aminosäure aus dem besagten Medium erstreckt.