DE3486147T2 - Verfahren zur Herstellung von L-Isoleucin. - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von L-Isoleucin.

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Description

  • Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Isoleucin durch ein neues Verfahren zur Expression eines Gens. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von L-Isoleucin durch Transformation eines zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehörenden Wirts-Mikroorganismus mit einem rekombinanten Vektor, der ein das Threonin-Operon von Escherichia coli enthaltendes DNA-Fragment umfaßt, Züchtung der Transformanten in einem Nährmedium, Akkumulation des L-Isoleucins im Nährmedium und seine Gewinnung daraus.
  • Zur direkten Herstellung von Aminosäuren durch Fermentation sind Verfahren unter Verwendung von Wildtypstämmen oder mutierten Stämmen, wie auxotrophen Stämmen und gegenüber Aminosäure-Analogen resistenten Stämmen, der Bakterien, die zur Gattung Corynebacterium, Brevibacterium, Serratia und ähnlichen gehören, bekannt.
  • Die Herstellung von Histidin zum Beispiel unter Verwendung eines gegen Histidin-Analoge resistenten Stammes (japanische Patentveröffentlichung Nr. 8596/81), die Herstellung von Tryptophan unter Verwendung eines gegen Tryptophan-Anologe resistenten Stammes (japanische Patentveröffentlichungen mit den Nrn. 4505/72 und 19037/76), die Herstellung von Isoleucin unter Verwendung eines gegen Isoleucin-Anologe resistenten Stammes (japanische Patentveröffentlichungen mit den Nrn. 38995/72, 6237/76 und 32070/79), die Herstellung von Phenylalanin unter Verwendung eines gegen Phenylalanin-Anologe resistenten Stammes (japanische Patentveröffentlichung Nr. 10035/81), die Herstellung von Tyrosin unter Verwendung eines Phenylalanin für sein Wachstum benötigenden oder gegen Tyrosin resistenten Stammes [Agr. Chem. Soc., Japan 50 (1) R79-R87 (1976)], die Herstellung von Arginin unter Verwendung eines gegen L-Arginin-Analoge resistenten Stammes [Agr. Biol. Chem. 36 (1972), 1675-1684, japanische Patentveröffentlichungen mit den Nrn. 37235/79 und 150381/82] und ähnliches ist bekannt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von L-Isoleucin zum Zweck einer verbesserten L-Isoleucin- Produktivität durch rekombinante DNA-Technologie, die sich von dem üblichen Mutationszüchtungsverfahren unterscheidet, unter Verwendung eines zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehörenden Mikroorganismus.
  • Die hier genannten Erfinder konstruierten Plasmidvektoren, die in einem zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehörenden Mikroorganismus autonom replizieren und die selektierbare Marker und geeignete Clonierungsstellen aufweisen, und entwickelten ein sehr wirksames Transformationssystem (Japanese Published Unexamined Patent Application Nrn. 183799/82, 186492/82 und 186489/82). Die hier genannten Erfinder erkannten ferner den Nutzen des Plasmidvektoren zur Expression eines Fremdgens in einem Wirts-Mikroorganismus und Erhöhung der Aminosäureproduktivität durch eine den Verfahren der rekombinanten DNA-Technologie (Methods in Enzymology 68, Recombinant DNA, herausgegeben von Ray Wu, Academic Press 1979, US-Patent Nr. 4,237,224) entsprechende Ligierung eines DNA-Fragmentes, das ein an der Biosynthese von Aminosäuren, zum Beispiel Glutaminsäure und Lysin, beteiligtes Fremdgen enthielt, an die Plasmidvektoren und die Transformation von Corynebacterium glutamicum L-22 oder seiner Abkömmlinge unter Verwendung der von den hier genannten Erfindern entwickelten Transformationsverfahren (Japanese Published Unexamined Patent Application Nr. 126789/83).
  • Die hier genannten Erfinder haben festgestellt, daß die durch das vorstehend beschriebene Verfahren erzeugten Mikroorganismen eine erhöhte Isoleucin-Produktivität erwerben.
  • Es gibt keinen Bericht über ein Beispiel eines zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehörenden Wirts-Mikroorganismus, in dem ein gewünschtes Gen exprimiert und die Produktivität von L-Isoleucin erhöht wird, wobei eine das gewünschte Gen und den Vektor, von denen eine(s)r für den Wirts-Mikroorganismus fremd ist, enthaltende rekombinante DNA in einem solchen Wirts-Mikroorganismus eingeführt worden ist.
  • Die vorliegende Erfindung wird nachstehend im einzelnen erläutert.
  • Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Herstellung von L-Isoleucin durch Züchtung einer Transformante, die durch Transformation eines zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehörenden Mikroorganismus mit einem rekombinanten Vektor erhalten wurde, der ein das Threonin-Operon von Escherichia coli enthaltendes DNA-Fragment umfaßt, in einem Medium, Akkumulation von L-Isoleucin im Kulturmedium und seine Gewinnung daraus.
  • Als bevorzugte Quelle des Threonin-Operons von Escherichia coli wird das rekombinante Plasmid pEthr1, das die Threonin-Operon-DNA von Escherichia coli K-12 enthält, verwendet.
  • Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Vektor sollte in Zellen des Wirts-Mikroorganismus autonom replizieren. Es werden vorzugsweise Plasmide beschrieben, die von den hier genannten Erfindern von den zur Gattung Corynebacterium gehörenden Mikroorganismen isoliert wurden, oder Abkömmlinge davon, wie pCGl (Japanese Published Unexamined Patent Application Nr. 134500/82), pCG2 (Japanese Published Unexamined Patent Application Nr. 35197/83), pCG4 (Japanese Published Unexamined Patent Application Nr. 183799/82), pCE51, pCE52 (Japanese Published Unexamined Patent Application Nr. 126789/83), pCE53 (Japanese Published Unexamined Patent Application Nr. 25398/83), pCE54, pCG11, pCB100 (Japanese Published Unexamined Patent Application Nr. 105999/83) und ähnliche.
  • Diese Plasmide tragende Mikroorganismen sind unter den nachstehend aufgeführten Hinterlegungsnummern beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, und bei der American Type Culture Collection, USA, hinterlegt worden. Plasmid Ferm P- ATCC
  • Die Plasmide pCE51, 52, 53 und 54 können, wie nachstehend beschrieben, aus den vorstehend aufgeführten Plasmiden entwickelt werden.
  • pCE51 wird zum Beispiel wie nachstehend beschrieben hergestellt.
  • pCG1 wird aus gezüchteten Zellen von Corynebacterium glutamicum 225-57 (Ferm P-5865, ATCC 31808) durch das in der Beschreibung der Japanese Published Unexamined Patent Application Nr. 134500/82 beschriebene Verfahren isoliert. pGA22 wird durch ein übliches Verfahren aus den gezüchteten, das Plasmid tragenden Escherichia coli-Zellen isoliert [An, G. et al., J. Bacteriol. 140 (1979), 400]. Das Plasmid pCG1 wird mit der Restriktionsendonuclease BglII linearisiert und ein mit BamHI gespaltenes und das Kanamycin-Resistenz-(KmR)- Gen enthaltende Fragment von pGA22 wird unter Verwendung der gleichen überstehenden Enden beider Plasmide an das linearisierte pCG1 ligiert. Die Isolierung von pCE51 aus dem ligierten DNA-Gemisch wird durch Selektion der Transformanten, die zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehören und die von pGA22 stammende KmR enthalten, und durch eine Analyse des Plasmids in der Transformante erreicht.
  • pCE51 weist ein Molekulargewicht von etwa 6 kBp und Spaltstellen für HincII, HindIII, SmaI, XhoI und EcoRI auf und zeigt einen KmR-Phänotyp pCE52 und pCE53 werden, wie nachstehend beschrieben, hergestellt.
  • Das Plasmid pCG1 wird aus den gezüchteten Zellen von Corynebacterium glutamicum 225-57 (FERN P-5865, ATCC 31808) durch das in der vorstehenden Anmeldung beschriebene Verfahren isoliert und das Plasmid pGA22 wird durch ein übliches Verfahren aus den gezüchteten, das Plasmid tragenden Escherichia coli-Zellen isoliert. pCG1 mit einer einzigen BglII-Stelle wird mit dem Restriktionsenzym BglII linearisiert und pGA22 mit zwei BamHI-Stellen mit BamHI partiell gespalten. Die überstehenden Enden beider Plasmide werden aneinandergelagert und zur Herstellung eines zusammenhängenden Moleküls mit T4-Phagen-DNA-Ligase ligiert. Die Selektion der rekombinanten Plasmide im Ligierungsgemisch erfolgt durch Isolierung der Transformanten der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium aufgrund der von pGA22 stammenden Arzneimittelresistenzen und durch eine anschließende Analyse der Plasmide in den Transformanten.
  • pCE52 und pCE53 weisen ein Molekulargewicht von etwa 10,9 kBp und Spaltstellen für EcoRI, SalI, SmaI und XhoI auf. Während pCE52 einen Phänotyp mit Chloramphenicolresistenz (CmR) und KmR zeigt, verleiht pCE53 einen Phänotyp mit Tetracyclinresistenz (TcR), CmR und KmR. Die Lage der Spaltstelle für XhoI im KmR-Gen ermöglicht eine Selektion durch Insertions-Inaktivierung (Verhinderung der Genexpression durch Insertion eines DNA-Fragmentes in das Gen).
  • Die Transformation durch das ligierte DNA-Gemisch wird unter Verwendung von Protoplasten der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium und den in den Japanese Published Unexamined Patent Application Nrn. 186492/82 und 186489/82 beschriebenen Verfahren durchgeführt.
  • Abgesehen von dem durch Insertion inaktivierten Gen, werden die Gene, die die von pGA22 stammende Arzneimittelresistenz verleihen, zur Selektion verwendet. Im System ohne DNA-Zusatz werden die Transformanten als Kolonie gewonnen, die auf einem hypertonischen, üblicherweise 0,4-1,6 ug/ml Tc, 2,5-5 u/ml Cm, 100-800 ug/ml Km, 100-400 ug/ml Sm oder 200-1000 ug/ml Spec enthaltenden Agarmedium regeneriert wird, das den nicht mit dem Ligierungsgemisch behandelten Empfänger-Protoplasten die Reversion in normale Zellen nicht gestattet. In einer anderen Ausführungsform werden Transformanten auf einem Regenerationsmedium nicht-selektiv regeneriert und die erhaltenen Zellen abgeschabt und resuspendiert. Im Anschluß daran werden diejenigen Zellen isoliert, die auf einem Agarmedium wachsen, das ein Arzneimittel in einer Konzentration enthält, bei der die normalen Zellen des Empfängers nicht wachsen können, das heißt, 0,5-4 ug/ml Tc, 2-15 ug/ml Cm, 2-25 ug/ml Km, 5-50 ug/ml Sm oder 50-500 ug/ml Spec. Einige der mit TcR, CmR oder KmR selektierten Transformanten sind gleichzeitig mit weiteren, vom Plasmid pGA22 stammenden Arzneimittelresistenzen ausgestattet.
  • Die Plasmid-DNA-Moleküle in diesen Transformanten können nach den in den Japanese Published Unexamined Patent Application Nrn. 134500/82 und 186489/82 beschriebenen Verfahren aus den gezüchteten Zellen der Transformanten isoliert und gereinigt werden. Die Strukturen der DNA-Moleküle können durch Spaltung mit verschiedenen Restriktionsendonucleasen und Analyse der DNA-Fragmente durch Agarose-Gelelektrophorese bestimmt werden. Die aus den Transformanten isolierten Plasmide sind pCE51, pCE52 und pCE53. Die Gewinnung der Plasmide aus den Stämmen wird nach den in den Japanese Published Unexamined Patent Application Nrn. 134500/82, 183799/82 und 35197/83 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Herstellung einer rekombinanten DNA von einer Vektor-DNA mit einem ein Gen enthaltenden DNA-Fragment wird durch die übliche rekombinante in vitro-DNA-Technologie durchgeführt.
  • Die rekombinante in vitro-DNA-Technologie wird durch Spaltung und Ligierung einer ein gewünschtes Gen enthaltenden Donor-DNA an eine Vektor-DNA durchgeführt (vgl. die Japanese Published Unexamined Patent Application Nrn. 126789/83, USP 4,237,224).
  • Die Ligasereaktion liefert rekombinante Moleküle, die andere Gene als das gewünschte Gen enthalten. Die gewünschte rekombinante DNA kann durch direkte Transformation eines Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium mit dem ligierten DNA-Gemisch, Selektion der Transformanten, die den vom gewünschten Gen stammenden Phänotyp aufweisen, und Isolierung der gewünschten rekombinanten DNA aus den gezüchteten Zellen der Transformanten erhalten werden. Anstelle der direkten Clonierung des gewünschten Gens in einen Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium kann das gewünschte Gen durch Verwendung eines anderen Wirt-Vektor-Systems, zum Beispiel Escherichia coli, cloniert werden. Es wird dann in einen Vektor der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium zur Transformation dieser Mikroorganismen in vitro umcloniert, und die das gewünschte rekombinante Plasmid enthaltenden Transformanten werden, wie vorstehend beschrieben, selektiert.
  • Das Verfahren zur Clonierung eines Gens in einen Wirts-Mikroorganismus von Escherichia coli wird, zum Beispiel, in Ray Wu (Hrsg.), Methods in Enzymology 68 (1979), Academic Press, New York, beschrieben.
  • Die nachstehend angegebenen Verweise sind bei der Konstruktion von rekombinanter DNA hilfreich:
  • Cohen, S. N. et al., U. S. P. Nr. 4,237,224; Idenshi Sosa Jikkenho, herausgegeben von Yasuyuki Takagi, gedruckt von Kodansha Scientific (1980); Methods in Enzymology 68, Recombinant DNA, herausgegeben von Ray Wu, Academic Press, 1979; Japanese Published Unexamined Patent Application Nr. 126789/83.
  • Mikroorganismen, die zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehören und zur Aufnahme von DNA-Molekülen kompetent sind, können in der vorliegenden Erfindung als Wirts-Mikroorganismen verwendet werden. Nachstehend sind Beispiele eines geeigneten Wirts-Mikroorganismus aufgeführt. Hinterlegungsnummer Ferm P- ATCC Corynebacterium glutamicum Corynebacterium glutamicum L-15 Corynebacterium glutamicum LA-105 Corynebacterium glutamicum K-38 Corynebacterium glutamicum K-43 Corynebacterium herculis Corynebacterium herculis L-103 Corynebacterium acetoacidophilum Corynebacterium lilium Brevibacterium divaricatum Brevibacterium divaricatum L-204 Brevibacterium lactofermentum Brevibacterium lactofermentum L-312 Brevibacterium flavum Brevibacterium immariophilium Brevibacterium thiognitalis
  • Die Transformation der Wirts-Mikroorganismen mit rekombinanten DNA-Molekülen wird in den nachstehend beschriebenen Schritten durchgeführt:
  • 1) Herstellung von Protoplasten aus gezüchteten Zellen;
  • 2) Transformation der Protoplasten durch eine rekombinante DNA;
  • 3) Regeneration der Protoplasten zu normalen Zellen und Selektion einer Transformante.
  • Diese Schritte sind nachstehend im einzelnen beschrieben.
    • 1. Herstellung von Protoplasten aus den gezüchteten Zellen
  • Die Herstellung von Protoplasten wird durch Züchtung eines Mikroorganismus unter eine Empfindlichkeit gegen Lysozym, einem lytischen Enzym, erzeugenden Bedingungen und durch Behandlung der gezüchteten Zellen mit Lysozym zur Entfernung der Zellwände in einer hypertonischen Lösung durchgeführt. Zur Erzeugung Lysozym-empfindlicher mikrobieller Zellen werden die Synthese bakterieller Zellwände verhindernde Reagenzien verwendet. Lysozym-empfindliche mikrobielle Zellen werden, zum Beispiel, durch eine während der logarithmischen Wachstumsphase zugesetzte, das Wachstum nicht verhindernde oder behindernde Menge Penicillin und durch eine nachfolgende, über mehrere Generationen fortgesetzte Züchtung erhalten.
  • Zur Züchtung kann jedes Medium, in dem der Mikroorganismus wachsen kann, verwendet werden. Es werden zum Beispiel ein Nährmedium NB (pH-Wert 7,2), das aus 20 g/l pulverförmiger Bouillon und 5 g/l Hefeextrakt besteht, und ein halbsynthetisches Medium SSM (pH-Wert 7,2), das aus 10 g/l Glucose, 4 g/l NH&sub4;Cl, 2 g/l Harnstoff, 1 g/l Hefeextrakt, 1 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 3 g/l K&sub2;HPO&sub4;, 0,4 g/l MgCl&sub2;·6 H&sub2;O, 10 mg/l FeSO&sub4;·7 H&sub2;O, 0,2 mg/l MnSO&sub4;·(4-6) H&sub2;O, 0,9 mg/l ZnSO&sub4;· 7 H&sub2;O, 0,4 mg/l CuSO&sub4;·5 H&sub2;O, 0,09 mg/l Na&sub2;B&sub4;O&sub7;·10 H&sub2;O, 0,04 mg/l (NH&sub4;)&sub6;Mo&sub7;0&sub2;&sub4;·4 H&sub2;O, 30 ug/l Biotin und 1 mg/l Thiaminhydrochlorid besteht, verwendet.
  • Das Medium wird mit mikrobiellen Zellen geimpft, und die Züchtung wird unter Schütteln durchgeführt.
  • Die optische Dichte (OD) des Kulturmediums bei 660 nm wird mit einem Colorimeter überwacht, und es wird Penicillin, zum Beispiel Penicillin G, im Anfangsstadium der logarithmischen Wachstumsphase (OD: 0,1-0,4) in einer Konzentration von 0,1 bis 2,0 E/ml zugesetzt. Die Züchtung wird bis zu einem OD-Wert von 0,3-0,5 fortgesetzt, und anschließend werden die Zellen geerntet und mit SSM-Medium gewaschen. Die gewaschenen Zellen werden in einem geeigneten hypertonischen Medium, wie PFM-Medium (pH-Wert 7,0-8,5), in dem 0,4 M Sucrose und 0,01 M MgCl&sub2;·6 H&sub2;O einem zweifach verdünnten SSM-Medium zugesetzt werden, und RCG-Medium (pH-Wert 7,0- 8,5), das aus 5 g/l Glucose, 5 g/l Caseinhydrolysat, 2,5 g/l Hefeextrakt, 3,5 g/l K&sub2;HPO&sub4;, 1,5 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 0,41 g/l MgCl&sub2; ·6 H&sub2;O, 10 mg/l FeSO&sub4;·7 H&sub2;O, 2 mg/l MnSO&sub4; x (4-6) H&sub2;O, 0,9 mg/l ZnSO&sub4;·7 H&sub2;O, 0,4 mg/l CuSO&sub4;·5 H&sub2;O, 0,09 mg/l Na&sub2;B&sub4;O&sub7;·10 H&sub2;O, 0,04 mg/l (NH&sub4;)&sub6;Mo&sub7;O&sub2;&sub4;·4 H&sub2;O, 30 ug/l Biotin, 2 mg/l Thiaminhydrochlorid und 135 g/l Natriumsuccinat besteht, oder RCGP-Medium, das aus RCG-Medium und 3% Polyvinylpyrrolidon besteht, resuspendiert. Der Zusatz von Lysozym zur Zellsuspension erfolgt zu einer Endkonzentration von 0,2 bis 10 mg/ml, und das Gemisch wird bei einer Temperatur von 30 bis 37ºC umgesetzt. Die Bildung der Protoplasten entwickelt sich mit der Zeit und wird mit einem optischen Mikroskop überwacht. Der erforderliche Zeitraum zur Umwandlung der meisten Zellen in Protoplasten hängt von den Konzentrationen des zur Lysozym-Sensibilisierung verwendeten Penicillins und der verwendeten Lysozymmenge ab. Der Zeitraum beträgt unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen 3-24 Stunden.
  • Da die gebildeten Protoplasten unter hypotonischen Bedingungen zerstört werden, wird die Menge der gebildeten Protoplasten indirekt aus der Zahl der die hypotonischen Bedingungen überlebenden normalen Zellen bestimmt. Üblicherweise hält man das Verhältnis der überlebenden normalen Zellen unterhalb von 10&supmin;&sup4; pro Lysozym-behandelter normaler Zelle.
  • Die vorstehend hergestellten Protoplasten sind auf einem geeigneten hypertonischen Agarmedium fähig, Kolonien zu bilden (zu regenerieren). Als Agarmedium wird vorzugsweise ein Nährmedium, ein halbsynthetisches Medium oder ein verschiedene Aminosäuren enthaltendes synthetisches Medium, das 0,3 bis 0,8 M Natriumsuccinat und 0,5 bis 6 % Polyvinylpyrrolidon mit einem Molekulargewicht von 10000 oder 40000 enthält, verwendet. Üblicherweise wird ein halbsynthetisches Medium RCGP (pH-Wert 7,2), in dem 1,4 % Agar zum RCGP-Agarmedium zugesetzt wird, verwendet. Die Regeneration wird bei einer Temperatur von 25 bis 35ºC durchgeführt. Die zur Regeneration von Protoplasten erforderliche Züchtungszeit hängt vom verwendeten Stamm ab, und Kolonien können üblicherweise nach 10 bis 14 Tagen entnommen werden. Die Wirksamkeit der Regeneration von Protoplasten auf RCGP-Medium hängt auch von dem verwendeten Stamm, den während der Züchtung zugesetzten Penicillin-Konzentrationen und der verwendeten Lysozym-Konzentration ab. Die Wirksamkeit liegt üblicherweise bei 10&supmin;²-10&supmin; Zellen pro normaler, mit Lysozym behandelter Zelle.
    • 2. Transformation der Protoplasten mit einer rekombinanten DNA:
  • Die Einführung einer rekombinanten DNA in den Protoplasten wird durch Mischung des Protoplasten und der DNA in einer die Protoplasten schützenden hypertonischen Lösung und durch Zusatz von Polyethylenglycol (PEG, durchschnittliches Molekulargewicht: 1540-6000) oder Polyvinylalkohol (PVA, Polymerisationsgrad: 500-1500) und einem zweiwertigen Metallkation, das die Aufnahme von DNA stimuliert, zu dem Gemisch durchgeführt. Üblicherweise zum Schutz der Protoplasten von anderen Mikroorganismen verwendete Wirkstoffe zur Stabilisierung der hypertonischen Bedingungen, wie Sucrose und Natriumsuccinat, werden auch verwendet. PEG und PVA können in einer Endkonzentration von 5 bis 60 % bzw. 1 bis 20 % verwendet werden. Zweiwertige Metallkationen, wie Ca&spplus;&spplus;, Mg&spplus;&spplus;, Mn&spplus;&spplus;, Ba&spplus;&spplus; und Sr&spplus;&spplus;, werden separat oder kombiniert bei einer Endkonzentration von 1 bis 100 mM wirksam verwendet. Die Transformation wird zufriedenstellend bei 0 bis 25ºC durchgeführt.
    • 3. Die Regeneration der Protoplasten zu normalen Zellen und die Selektion eines Transformanten:
  • Die Regeneration des mit einer rekombinanten DNA transformierten Protoplasten wird in derselben, vorstehend beschriebenen Weise durch Verteilung des Protoplasten auf einem hypertonischen Agarmedium, wie Natriumsuccinat und Polyvinylpyrrolidon enthaltendem RCGP-Medium, und Inkubation bei einer für das Wachstum normaler Zellen erforderlichen Temperatur, üblicherweise 25 bis 35ºC, durchgeführt. Transformanten werden durch Selektion der von Donor-DNA-Molekülen stammenden Phänotypen erhalten. Die Selektion für einen verliehenen charakteristischen Phänotyp kann gleichzeitig mit der Regeneration auf einem hypertonischen Agarmedium oder auf einem hypotonischen Agarmedium nach einer nicht-selektiven Reversion in normale Zellen auf einem hypertonischen Agarmedium durchgeführt werden.
  • Bei Verwendung der als bevorzugte Wirts-Mikroorganismen beschriebenen Lysozym-empfindlichen Stämme kann die Transformation, abgesehen von der direkten Behandlung der gezüchteten Zellen mit Lysozym, ohne eine vorherige Behandlung mit Penicillin in Schritt (1), in den unter (1) bis (3) beschriebenen Schritten durchgeführt werden. Unter diesen Umständen werden Transformanten mit einer Effizienz von 10&supmin;² bis 10&supmin;&sup4; pro regenerierter Zelle erhalten.
  • Die nachstehend beschriebenen Stämme sind Beispiele von Transformanten, die durch die vorliegende Erfindung erhalten werden.
  • Isoleucin-produzierende Stämme
  • Corynebacterium glutamicum K41, FERN P-7161
  • Brevibacterium flavum K42, FERN BP-355
  • Die Expression des Phänotyps der rekombinanten DNA wird durch Züchtung der Transformanten in einem üblichen Nährmedium durchgeführt. Geeignete Reagenzien, entsprechend dem von der Gen- oder Vektor-DNA auf der rekombinanten DNA erwarteten Phänotyp, können dem Medium zugesetzt werden.
  • Die so erhaltene Transformante wird in einer üblichen, in der Produktion von Aminosäuren durch Fermentation verwendeten Weise gezüchtet. Das heißt, die Transformante wird in einem üblichen Medium, das Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Stoffe, Aminosäuren, Vitamine etc. enthält, unter aeroben Bedingungen bei einer eingestellten Temperatur und einem eingestellten pH-Wert gezüchtet. Die so im Medium angereicherten Aminosäuren werden gewonnen.
  • Als Kohlenstoffquelle können verschiedene Kohlehydrate, wie Glucose, Glycerin, Fructose, Sucrose, Maltose, Mannose, Stärke, Stärkehydrolysat und Molassen, Polyalkohole und verschiedene organische Säuren, wie Brenztraubensäure, Fumarsäure, Milchsäure und Essigsäure, verwendet werden. Entsprechend der Assimilationsfähigkeit des verwendeten Mikroorganismenstammes werden Kohlehydrate und Alkohole verwendet. Insbesondere werden likörartige Molassen verwendet.
  • Als Stickstoffquelle sind Ammoniak, verschiedene anorganische oder organische Ammoniumsalze, wie Amoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumacetat, Harnstoff und stickstoffhaltige organische Stoffe, wie Peptone, NZ-Amin, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Caseinhydrolysat, Fischmehl oder seine Abbauprodukte, fettlose Sojabohnen oder ihre Abbauprodukte und Chrysalishydrolysat geeignet.
  • Als anorganische Stoffe können Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisensulfat, Mangansulfat und Calciumcarbonat verwendet werden. Der Zusatz der für das Wachstum der Mikroorganismen erforderlichen Vitamine und Aminosäuren kann unterbleiben, sofern sie mit den anderen, vorstehend beschriebenen Komponenten zugesetzt werden.
  • Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, wobei geschüttelt oder zur Luftzufuhr gerührt wird. Die Züchtungstemperatur beträgt vorzugsweise 20 bis 40ºC. Der pH-Wert des Mediums wird bei der Züchtung etwa auf dem Neutralpunkt gehalten. Die Züchtung wird bis zur Anreicherung einer beträchtlichen Menge einer Aminosäure fortgesetzt, üblicherweise 1 bis 5 Tage.
  • Nach Abschluß der Züchtung werden die Zellen entfernt und die Aminosäure wird in üblicher Weise, zum Beispiel durch Behandlung mit Aktivkohle oder Ionenaustauscherharz, aus der Kulturflüssigkeit gewonnen.
  • Trotz ihrer sehr ähnlichen microbiologischen Eigenschaften werden sogenannte Glutaminsäure-produzierende Mikroorganismen, die Glutaminsäure in großen Mengen produzieren, wahrscheinlich aufgrund ihrer industriellen Bedeutung in verschiedene Arten und sogar in verschiedene Gattungen, wie Corynebakterium und Brevibakterium, eingeteilt. Es ist jedoch darauf hingewiesen worden, daß diese Mikroorganismen aufgrund der beinahe gleichen Aminosäurezusammensetzung in der Zellwand und der Basenzusammensetzung der DNA-Moleküle zu einer Art gehören sollten. Es ist vor kurzem berichtet worden, daß diese Mikroorganismen bei der DNA-DNA-Hybridisierung mindestens zu 70 bis 80 % homolog sind, ein Hinweis auf die enge Verwandtschaft dieser Mikroorganismen. Vgl. z. B., Komatsu, Y., Report of the Fermentation Research Institute 55 (1980), 1, und Suzuki, K., Kaneko, T. und Komagata, K., Int. J. yst. Bacteriol. 31 (1981), 131.
  • Unter Berücksichtigung der vorstehend beschriebenen Tatsachen liegt die Vermutung nahe, daß der Nutzen der vorliegenden Erfindung für sämtliche Glutaminsäure-produzierenden Mikroorganismen gilt. Für den stabilen Erhalt der rekombinanten DNA-Moleküle und die Expression der DNA in diesen Arten können geringfügig unterschiedliche Eigenschaften der Wirts-Mikroorganismen, wie in der Homologie der DNA, vernachlässigt werden, und es genügt, daß die Wirts-Mikroorganismen die autonome Replikation von Plasmiden und die Expression der darauf enthaltenen Gene ermöglichen. Die Existenz derart befähigter Mikroorganismen geht aus der Tatsache hervor, daß das von Corynebacterium glutamicum 225-250 (Japanese Published Unexamined Patent Application Nr. 183799/82) isolierte und ein Streptomycin- und/oder Spectinomycin-Resistenzgen aufweisende Plasmid pCG4 in Glutaminsäure-produzierenden Mikroorganismen, die zum Beispiel zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehören, repliziert und das für die Resistenz verantwortliche Gen exprimiert werden konnte (Japanese Published Unexamined Patent Application Nr. 186492/82). Ferner liegt es nach der Beschreibung der erfindungsgemäßen Histidin-Produktion nahe, daß das in Corynebacterium glutamicum exprimierte Gen in einem breiten Spektrum von Wirts-Mikroorganismen der Gattungen Corynebacterium, Brevibacterium und ähnlichen exprimiert werden kann. Daher sind sämtliche Glutaminsäure-produzierenden Mikroorganismen, einschließlich der zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium, sowie die zur Art Corynebacterium glutamicum gehörigen, kompetente Wirts-Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung.
  • Für die Stämme, die in der vorliegenden genauen Beschreibung erscheinen, lauten die Hinterlegungsnummern, das Hinterlegungsdatum und das Transferdatum der Hinterlegungen gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags zur internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck von Patentverfahren, wie nachstehend angegeben. Hinterlegungsdatum Ferm P (Transferdatum ATCC (BP) Jahr/Monat/Tag Corynebacterium glutamicum Corynebacterium herculis Brevibacterium divaricatum Brevibacterium lactofermentum Brevibacterium fluvum Brevibacterium lactofermentum Corynebacterium glutamicum Corynebacterium herculis
  • Fig. 1 zeigt eine Restriktionskartierung von pGH2 mit Restriktionsendonucleasen.
  • Fig. 2 stellt das Verfahren zur Konstruktion von pEthr1 und die mit Restriktionsendonucleasen ermittelte Restriktionskarte von pEthr1 dar, in der "BglII/BamHI" mit einer gestrichelten Linie eine Rekombinationsstelle an denselben überstehenden Enden zeigt, die durch Spaltung mit beiden Restriktionsendonucleasen gebildet wurden. Die bei der Herstellung der Restriktionskarte verwendeten Restriktionsendonucleasen sind PstI, EcoRI und XhoI. Das Molekulargewicht des Plasmids wird in Kilobasenpaaren angegeben (kBp).
    • Beispiel 1 Herstellung von pCG11-Plasmid-DNA
  • Das als Vektorplasmid verwendete pCG11 wurde aus Corynebacterium glutamicum LA 103/pCG11, ATCC 39022, das ein Abkömmling von Corynebacterium glutamicum L-22 ist und pCG11 enthält, in der nachstehend beschriebenen Weise hergestellt.
  • Der Stamm wurde unter Schütteln bei 30ºC in 400 ml NB-Medium bis zu einem OD-Wert von etwa 0,7 gezüchtet. Die Zellen wurden geerntet und mit TES-Puffer gewaschen. Die Zellen wurden in 10 ml der vorstehend beschriebenen Lysozymlösung suspendiert, und die Umsetzung wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Anschließend wurden nacheinander 2,4 ml 5 M Nacl, 0,6 ml 0,5 M EDTA (pH-Wert 8,5) und 4,4 ml einer Lösung, die aus 4 % Natriumlaurylsulfat und 0,7 M NaCl bestand, zugesetzt. Das Gemisch wurde langsam gerührt und 15 Stunden auf einem Eiswasserbad gekühlt.
  • Das gesamte Lysat wurde 60 Minuten bei 4ºC mit 69400 ·g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde gewonnen und 10 Gew. -% Polyethylenglycol (PEG) 6000 (Produkt der Nakarai Kagaku Yakuhin Co.) zugesetzt. Das Gemisch wurde zur vollständigen Auflösung langsam gerührt und anschließend auf einem Eiswasserbad gekühlt. Nach 10 Stunden wurde das Gemisch zur Gewinnung eines Pellets 10 Minuten bei 1500·g zentrifugiert. Das Pellet wurde erneut vorsichtig in 5 ml TES-Puffer gelöst, und 2,0 ml 1,5 mg/ml Ethidiumbromid wurden zugesetzt. Zur Einstellung der Dichte des Gemisches auf 1,580 wurde anschließend Cäsiumchlorid zugesetzt. Die Lösung wurde 48 Stunden bei 18ºC und 105000·g zentrifugiert. Im Anschluß an die Dichtegradientenzentrifugation wurde unter UV-Bestrahlung eine kovalent-geschlossene zirkuläre DNA als eine im unteren Teil des Zentrifugenröhrchens befindliche Bande mit hoher Dichte nachgewiesen. Die Bande wurde zum Erhalt einer Fraktion, die pCG11-DNA enthielt, von der Seite des Röhrchens mit einer Injektionsnadel entnommen. Zur Entfernung von Ethidiumbromid wurde die Fraktion fünfmal mit einer gleichen Menge mit Cäsiumchlorid gesättigter Isopropylalkohollösung, die aus 90 Volumen-% Isopropylalkohol und 10 % TES-Pufferlösung bestand, behandelt. Im Anschluß daran wurde der Rückstand zum Erhalt von pCG11-Plasmid-DNA gegen TES-Pufferlösung dialysiert.
    • Beispiel 2 (1) Clonierung eines DNA-Fragmentes, das das Escherichia coli-Threonin-Operon enthält
  • Die Clonierung wurde unter Verwendung eines Wirt-Vektor-Systems von Escherichia coli durchgeführt. Das als Vektor verwendete Plasmid pGA22 wurde aus den gezüchteten Zellen eines Abkömmlings von Escherichia coli K12, der das vorliegende Plasmid trägt gemäß dem Verfahren von An isoliert [An, G. et al., J. Bacteriol. 140 (1979), 400]. Die als Donor-DNA verwendete chromosomale DNA wurde aus gezüchteten Zellen von Escherichia coli K12 Hfr (ATCC 23740) durch das Phenol-Extraktionsverfahren von Smith isoliert [Smith, M. G., Methods in Enzymology 12, Teil A, (1967), 545].
  • Anschließend wurden 0,4 Einheiten HindIII (16 Einheiten/ul) zu 60 ul einer HindIII-Reaktionslösung (pH-Wert 7,5) zugesetzt, die aus 10 mM Tris, 7 mM MgCl&sub2; und 60 mM NaCl (die gleiche HindIII-Reaktionslösung wurde hier nachstehend verwendet) bestand und 4 ug pGA22-Plasmid-DNA enthielt. Das Gemisch reagierte 30 Minuten bei 37ºC, und es wurde zum Abbruch der Umsetzung 10 Minuten auf 65ºC erhitzt. Das zwei HindIII-Spaltstellen aufweisende pGA22 wurde unter den gleichen Bedingungen mit HindIII gespalten und eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt. Es wurde bestätigt, daß eine der beiden, auf pGA22 vorhandenen HindIII-Spaltstellen gespalten worden war. 4 Einheiten HindIII wurden gesondert zu 140 il der HindIII-Reaktionslösung, die 8 g der chromosomalen DNA enthielt, zugesetzt. Das Gemisch wurde 60 Minuten bei 37ºC umgesetzt und zum Abbruch der Umsetzung 10 Minuten auf 65ºC erhitzt. Im Anschluß daran wurden 40 ul der T4-Ligase-Pufferlösung II, 40 ul 5 mM ATP, 0,3 ul T4-Ligase und 120 ul H&sub2;O einem Gemisch der vorstehend beschriebenen Spaltprodukte zugesetzt, und die Umsetzung wurde 16 Stunden bei 12ºC durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde zweimal mit 400 ul mit TES-Pufferlösung gesättigtem Phenol extrahiert und zur Entfernung des Phenols gegen eine TES-Pufferlösung dialysiert.
  • Das Ligase-Reaktionsgemisch wurde zur Transformation von Escherichia coli K12, GT-3 (J. Bacteriol. 117 (1974), 133), das eine Mutante mit einem Defekt bei drei Aspartat- Kinasen ist und die Homoserin und Diaminopimelinsäure benötigt, verwendet. Kompetente Zellen vom GT-3-Stamm wurden nach dem Verfahren von Dagert, M. et al., Gene 6 (1979), 23, hergestellt. Das heißt, der Stamm wurde in 50 ml L-Medium (pH-Wert 7,2) überimpft, das aus 10 g/l Bactotrypton, 5 g/l Hefeextrakt, 1 g/l Glucose und 5 g/l Natriumchlorid bestand und 100 ug/ml Diaminopimelinsäure enthielt, und bei 37ºC bis zu einem optischen Dichtewert (OD) von 0,5 bei 660 nm gezüchtet. Die Kultur wurde mit Eiswasser 10 Minuten gekühlt, und die Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen. Die Zellen wurden in 20 ml gekühltem 0,1 M Calciumchlorid suspendiert. Man ließ die Suspension 20 Minuten bei 0ºC stehen, und anschließend wurde sie zur Gewinnung der Zellen zentrifugiert. Die Zellen wurden in 0,5 ml 0,1 M Calciumchlorid suspendiert, und man ließ sie 18 Stunden bei 0ºC stehen. Im Anschluß daran wurden 200 ul des vorstehend beschriebenen Ligase-Reaktionsgemisches zu 400 ul der mit Calciumchlorid behandelten Zellsuspension zugesetzt. Man ließ das Gemisch 10 Minuten bei 0ºC stehen und erhitzte es anschließend 5 Minuten auf 37ºC. Danach wurden 9 ml L-Medium zugesetzt und das Gemisch 2 Stunden bei 37ºC unter Schütteln inkubiert.
  • Die Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen und zweimal mit einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen. Die Zellen wurden auf einem M9-Agar-Minmalmedium (pH-Wert 7,2) verteilt, das aus 2 g/l Glucose, 1 g/l NH&sub4;Cl, 6 g/l Na&sub2;HPO&sub4;, 3 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 0,1 g/l MgSO&sub4;·7 H&sub2;O, 15 mg/l CaCl&sub2; ·2 H&sub2;O, 4 mg/l Thiaminhydrochlorid und 15 g/l Agar bestand und 12,5 ug/ml Kanamycin enthielt (das gleiche M9-Agar-Minimalmedium wurde hier nachstehend verwendet). Die Züchtung wurde 3 Tage bei 37ºC durchgeführt. Es wurde nur eine Kolonie gebildet, und die Zellen dieser Kolonie konnten auch auf einem Agarmedium wachsen, das 25 ug/ml Ampicillin, 25 ug/ml Chloramphenicol oder 25 ug/ml Kanamycin als einen Selektionsmarker von pGA22 enthielt.
  • Eine Plasmid-DNA wurde durch dasselbe Verfahren, wie bei der Isolation von pGA22, aus gezüchteten Zellen der Transformanten isoliert. Die Plasmid-DNA wurde mit Restriktionsendonucleasen gespalten und durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Die Plasmid-DNA besaß die in Fig. 1 als pGH2 dargestellte Struktur. Da das in pGA22 inserierte DNA- Fragment die gleichen Spaltstellen für Restriktionsendonucleasen wie das clonierte DNA-Fragment besaß, das das Escherichia coli-Operon enthielt, (Cossart, P. et al., Molec. Gen. Genet. 175 (1979), 39), wird damit bestätigt, daß pGH2 das Threonin-Operon enthielt.
    • (2) In vitro-Rekombination von pCG11 und pGH2
  • 2 Einheiten BglII (6 Einheiten/ul) wurden zu 100 ul BglII-Reaktionspufferlösung zugesetzt, die 2 ug pCG11-Plasmid-DNA enthielt, die nach denselben Verfahren, wie in Beispiel 1 beschrieben, erhalten wurden. Man ließ das Gemisch 60 Minuten bei 37ºC reagieren. 2 Einheiten BamHI (6 Einheiten/ul) wurden gesondert zu 100 ul BamHI-Reaktionspufferlösung, die 2 ug pGH2-Plasmid-DNA enthielt, zugesetzt. Man ließ das Gemisch 60 Minuten bei 37ºC reagieren. Beide Lösungen der Spaltprodukte wurden 10 Minuten bei 65ºC erhitzt und gemischt. Im Anschluß daran wurden 40 ul T4-Ligase-Pufferlösung II, 40 ul 5 mM ATP, 0,2 ul T4-Ligase und 120 ul H&sub2;O zum vereinigten Gemisch der beiden Lösungen der Spaltprodukte zugesetzt. Die Umsetzung wurde 16 Stunden bei 12ºC durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde zweimal mit 400 ul TES-Pufferlösung gesättigtem Phenol extrahiert und zur Entfernung des Phenols gegen TES-Pufferlösung dialysiert.
    • (3) Gewinnung des Plasmids pEthr1
  • Protoplasten von Corynebacterium glutamicum LA201, der Homoserin und Leucin erfordert, wurden zur Transformation verwendet. Eine Saatkultur von Corynebacterium glutamicum LA201 wurde in NB-Medium überimpft und bei 30ºC unter Schütteln gezüchtet. Die gezüchteten Zellen wurden bei einem OD-Wert von 0,6 gesammelt und in einem RCGP-Medium (pH- Wert 7,6), das 1 mg/ml Lysozym bei einer Konzentration von etwa 10&sup9; Zellen/ml enthielt, suspendiert. Die Suspension wurde in ein L-Röhrchen gegeben, und es wurde zur Herstellung von Protoplasten 5 Stunden bei 30ºC unter sanftem Schütteln eine Reaktion durchgeführt.
  • Anschließend wurden 0,5 ml der Protoplastensuspension in ein kleines Röhrchen gegeben und zum Erhalt von Pellets 5 Minuten bei 2500·g zentrifugiert. Die Pellets wurden in 1 ml TSMC-Pufferlösung resuspendiert, zentrifugiert und gewaschen. Die Protoplasten wurden in 0,1 ml TSMC-Pufferlösung resuspendiert. Im Anschluß daran wurden 100 ul eines Gemisches aus einer zweifach konzentrierten TSMC-Pufferlösung und aus dem vorstehend beschriebenen, mit Ligase behandelten DNA-Gemisch (1 : 1) der Suspension zugesetzt, und 0,8 ml einer 20 % PEG 6000 enthaltenden TSMC-Pufferlösung wurden zugesetzt. Nach 3 Minuten wurden 2 ml des RCGP-Mediums (pH- Wert 7,2) zugesetzt, und das Gemisch wurde 5 Minuten bei 2500·g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt, und die ausgefällten Protoplasten wurden in 1 ml RCGP-Medium suspendiert. Die Suspension wurde langsam 2 Stunden bei 30ºC geschüttelt. Anschließend wurden 0,1 ml der Suspension auf 400 ug/ml Kanamycin enthaltendem RCGP-Agarmedium verteilt, und die Züchtung wurde 6 Tage bei 30ºC durchgeführt.
  • Kanamycin-resistente Transformanten, die die gesamte Oberfläche des Agarmediums überwachsen hatten, wurden abgeschabt, mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und zentrifugiert. Die Zellen wurden auf einem 50 ug/ml Leucin enthaltenden M1-Agar-Minimalmedium verteilt. Die Züchtung wurde 3 Tage bei 30ºC durchgeführt. Unter den sich entwickelnden Kolonien wurden diejenigen entnommen, die zum Wachstum auf NB-Agarmedium fähig waren, das 20 ug/ml Kanamycin und 100 ug/ml Spectinomycin enthielt.
  • Drei nach dem Zufallsprinzip ausgewählte Stämme wurden in 400 ml NB-Medium bis zu einem OD-Wert von etwa 0,8 gezüchtet. Die Zellen wurden geerntet und die Plasmide durch die in Beispiel 1 beschriebene Ethidiumbromid-Cäsiumchlorid- Dichtegradienten-Zentrifugation isoliert, bei der 40 bis 55 ug Plasmid-DNA von jedem Stamm gewonnen wurden.
  • Diese Plasmid-DNA-Moleküle wurden mit Restriktionsendonucleasen gespalten und durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert, um die Molekulargewichte und Spaltstellen für PstI, EcoRI und XhoI zu bestimmen. Das von einem Stamm erhaltene Plasmid erhielt die Bezeichnung pEthr1, und die Struktur ist in Fig. 2 dargestellt. Es wurde bestätigt, daß pEthr1 die Struktur aufweist, in der ein das pGH2-Threonin- Operon enthaltende BamHI-Fragment in pCG11 in dessen BglII- Stelle inseriert ist. Einer der verbleibenden Stämme enthält ein dem pEthr1 entsprechendes Plasmid und der andere trägt ein Plasmid, in dem ein das pGH2-Threonin-Operon enthaltendes BamHI-Fragment in der entgegengesetzten Orientierung inseriert ist.
  • Der Stamm Corynebacterium glutamicum LA201 wurde mit diesen Plasmid-DNA-Molekülen erneut in der vorstehend beschriebenen Weise transformiert. Als Ergebnis wurden Stämme, die kein Homoserin benötigen, mit großer Häufigkeit, etwa 10&supmin;³ Zellen/regenerierter Zelle, erhalten. Alle besitzen den Phänotyp einer Kanamycin- und Spectinomycin-Resistenz und weisen das gleiche, dem Donor-Plasmid entsprechende, durch das Spaltungsmuster für verschiedene Restriktionsendonucleasen charakterisierte Plasmid auf.
    • (4) Produktion von L-Isoleucin durch den pEthr1-tragenden Stamm
  • Die Protoplasten von Corynebacterium glutamicum K40 und Brevibacterium flavum ATCC 14067 wurden mit pEthr1 transformiert. Corynebacterium glutamicum K40 (FERN P-7160, FERN BP-455) und Brevibacterium flavum ATCC 14067 wurden 16 Stunden bei 30ºC in NB-Medium unter Schütteln gezüchtet, und 0,1 ml der Saatkultur wurden in 10 ml SSM-Medium in einem L- Röhrchen inokkuliert. Die Züchtung wurde bei 30ºC in einem Kulturbad vom Monod-Typ durchgeführt, und Penicillin G wurde bei einem OD-Wert von 0,15 zu einer Konzentration von 0,5 Einheiten/ml zugesetzt. Die Züchtung wurde bis zu einem OD- Wert von etwa 0,6 fortgesetzt. Die Zellen wurden geerntet und in 2 ml 1 mg/ml Lysozym-enthaltendem RCGP-Medium (pH- Wert 7,6) suspendiert. Die Suspension wurde in ein L-Röhrchen gegeben und zum Erhalt der Protoplasten 14 Stunden bei 30ºC langsam gerührt.
  • Anschließend wurde 1 ml der Protoplastensuspension in ein kleines Teströhrchen gegeben und 15 Minuten bei 2500·g zentrifugiert. Die Protoplasten wurden in 1 ml TSMC-Puffer resuspendiert und bei 2500·g zentrifugiert. Die gewaschenen Protoplasten wurden in 0,1 ml TSMC-Pufferlösung resuspendiert. Einhundert Microliter eines Gemisches (1 : 1 nach Volumen) eines zweifach konzentrierten TSMC-Puffers und der vorstehend isolierten pEthr1-DNA-Lösung wurden der Suspension der Protoplasten zugesetzt. Die Transformation wurde unter Verwendung von PEG 6000 durch dasselbe, in Beispiel 1 zur Expression des gewünschten Gens beschriebene Verfahren durchgeführt. Anschließend wurden 0,1 ml des Gemisches auf 400 ug/ml Spectinomycin enthaltendem RCGP-Agar-Medium verteilt und 10 Tage bei 30ºC inkubiert. Von den sich entwickelnden Kolonien wurden die Transformanten entnommen, die auf NB-Agar-Medium wachsen, das 100 ug/ml Spectinomycin und 20 ug/ml Kanamycin enthielt. Die gegen Spectinomycin und Kanamycin resistenten Stämme wurden in 400 ml SSM-Medium unter Schütteln gezüchtet, und Penicillin G wurde bei einem OD-Wert von 0,15 zu einer Konzentration von 0,5 Einheiten/ml zugesetzt. Die Züchtung wurde bis zu einem OD-Wert von 0,65 fortgesetzt, und die Zellen wurden geerntet. Aus den Zellen wurden Plasmide durch dasselbe Verfahren, wie das Isolierungsverfahren von pCG11 in Beispiel 1, isoliert. Diese Plasmide wurden mit Restriktionsendonucleasen gespalten und durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Die Analyse zeigte bei einigen Plasmiden diesselbe physikalische Struktur wie die von pEthr1, die durch das Spaltungsmuster für verschiedene Restriktionsendonucleasen charakterisiert wurde. Derartige Transformanten sind Corynebacterium glutamicum K41 (FERN P-7161, FERN BP-456) und Brevibacterium flavum K42 (FERN BP-355).
  • Corynebacterium glutamicum K40, Brevibacterium flavum ATCC 14067 und ihre pEthr1-tragenden Stämme wurden in der nachstehend beschriebenen Weise auf die Produktion von L- Isoleucin getestet. Der Stamm wurde 16 Stunden bei 30ºC unter Schütteln in NB-Medium gezüchtet, und 0,5 ml der Saatkultur wurden in ein auf einen pH-Wert von 7,2 eingestelltes Produktionsmedium, das aus 100 g/l Glucose, 20 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,5 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 0,5 g/l K&sub2;HPO&sub4;, 1 g/l MgSO&sub4;·7 H&sub2;O, 10 mg/l FeSO&sub4;·7 H&sub2;O, 10 mg/l MnSO&sub4;· (4-6) H&sub2;O, 100 ug/l Biotin und 30 g/l CaCO&sub3; bestand, in einem Teströhrchen überimpft. Die Züchtung wurde 72 Stunden bei 30ºC unter Schütteln durchgeführt. Mit dem Kulturfiltrat wurde eine Papierchromatographie und eine Farbreaktion mit Ninhydrin durchgeführt. Die Menge an erzeugtem L-Isoleucin wurde kolorimetrisch bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I dargestellt. Tabelle I Gattung Menge an L-Isoleucin Corynebacterium glutamicum Brevibacterium flavum

Claims (4)

1. Verfahren zur Herstellung von L-Isoleucin, dadurch gekennzeichnet, daß in einem Medium ein Mikroorganismus kultiviert wird, der durch das Transformieren eines zu der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehörenden Wirts-Mikroorganismus mit einem rekombinanten Vektor erhältlich ist, wobei der Vektor ein das Threonin-Operon von Escherichia coli enthaltendes DNA-Fragment umfaßt, L-Isoleucin in dem Kulturmedium akkumuliert wird und L- Isoleucin daraus gewonnen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die rekombinante DNA das Plasmid pEthr1 (FERN BP-456 oder FERN BP-355) ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus Corynebacteriu:a glutamicum K41, FERN BP-456 oder Brevibacterium flavum K42, FERN BP-355 ist.
4. Biologisch reine Kultur von Corynebacterium glutamicum K41, FERN BP-456 oder Brevibacterium flavum K42, FERN BP-355.
DE89108164T 1983-02-17 1984-02-16 Verfahren zur Herstellung von L-Isoleucin. Expired - Fee Related DE3486147T2 (de)

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