DE3486229T2

DE3486229T2 - Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin.

Info

Publication number: DE3486229T2
Application number: DE89108165T
Authority: DE
Inventors: Masako Hara; Ryoichi Katsumata; Toru Mizukami; Tetsuo Oka; Akio Ozaki; Haruhiko Yokoi
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1983-02-17
Filing date: 1984-02-16
Publication date: 1994-03-31
Anticipated expiration: 2004-02-17
Also published as: DE3484378D1; WO1984003301A1; DE3486188T2; EP0334391B1; EP0332233A1; EP0336452A1; EP0136359A4; AU2572184A; DE3486147D1; DE3486147T2; EP0334391A1; AU568340B2; EP0332233B1; EP0332234B1; DE3486232D1; DE3486232T2; EP0136359A1; DE3486229D1; EP0336452B1; EP0332234A1

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin durch ein neues Verfahren zur Expression eines Gens. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin durch Transformation eines zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehörenden Wirts-Mikroorganismus mit einer rekombinanten DNA eines DNA-Fragments, das das die Chorismatmutase und Prephenatdehydratase codierende Gen und eine Vektor-DNA enthält, die Züchtung der Transformante in einem Nährmedium, die Anhäufung des L-Phenylalanins im Nährmedium und seine Gewinnung daraus.
Zur direkten Herstellung von Aminosäuren durch Fermentation sind Verfahren unter Verwendung von Wildtypstämmen oder mutierten Stämmen, wie auxotrophen Stämmen und gegenüber Aminosäure-Analogen resistenten Stämmen, der Bakterien bekannt, die zur Gattung Corynebacterium, Brevibacterium, Serratia und ähnlichen gehören.
Die Herstellung von Histidin beispielsweise unter Verwendung eines gegen Histidin-Analoge resistenten Stammes (japanische Patentveröffentlichung Nr. 8596/81), die Herstellung von Tryptophan unter Verwendung eines gegen Tryptophan-Analoge resistenten Stammes (japanische Patentveröffentlichungen mit den Nrn. 4505/72 und 19037/76), die Herstellung von Isoleucin unter Verwendung eines gegen Isoleucin-Analoge resistenten Stammes (japanische Patentveröffentlichungen mit den Nrn. 38995/72, 6237/76 und 32070/79), die Herstellung von Phenylalanin unter Verwendung eines gegen Phenylalanin-Analoge resistenten Stammes (japanische Patentveröffentlichung Nr. 10035/81), die Herstellung von Tyrosin unter Verwendung eines Stammes, der Phenylalanin für sein Wachstum benötigt oder gegen Tyrosin resistent ist [Agr. Chem. Soc., Japan 50 (1) (1976), R79-R87], die Herstellung von Arginin unter Verwendung eines gegen L-Arginin-Analoge resistenten Stammes [Agr. Biol. Chem. 36 (1972), 1675-1684, japanische Patentveröffentlichungen mit den Nrn. 37235/79 und 150381/82] und ähnliches ist bekannt.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von L-Phenylalanin zum Zweck einer verbesserten L-Phenylalanin-Produktivität durch rekombinante DNA-Technologie, die sich von dem üblichen Mutationszüchtungsverfahren unterscheidet, unter Verwendung eines zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehörenden Mikroorganismus.
Die hier genannten Erfinder konstruierten Plasmidvektoren, die in einem zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehörenden Mikroorganismus autonom replizieren und die selektierbare Marker und geeignete Clonierungsstellen aufweisen, und entwickelten ein sehr wirksames Transformationssystem (japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldungen mit den Nrn. 183799/82, 186492/82 und 186489/82). Die hier genannten Erfinder stellten ferner fest, daß Plasmidvektoren zur Expression eines Fremdgens in einem Wirts-Mikroorganismus und zur Erhöhung der Aminosäureproduktivität nützlich sind durch eine den Verfahren der rekombinanten DNA-Technologie (Methods in Enzymology 68, Recombinant DNA, herausgegeben von Ray Wu, Academic Press 1979, US-Patent Nr. 4,237,224) entsprechende Ligierung eines DNA-Fragments, das ein an der Biosynthese von Aminosäuren, beispielsweise Glutaminsäure und Lysin, beteiligtes Fremdgen enthält, mit den Plasmidvektoren und die Transformation von Corynebacterium glutamicum L-22 oder seiner Abkömmlinge unter Verwendung der von den hier genannten Erfindern entwickelten Transformationsverfahren (japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung mit der Nr. 126789/83).
Die hier genannten Erfinder haben festgestellt, daß die durch das vorstehend beschriebene Verfahren erzeugten Mikroorganismen eine erhöhte Phenylalanin-Produktivität erwerben.
Es gibt keinen Bericht über ein Beispiel eines zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehörenden Wirts-Mikroorganismus, in dem ein gewünschtes Gen exprimiert und die Produktivität von L-Phenylalanin erhöht wird, wobei eine das gewünschte Gen und den Vektor, von denen eine(s)r für den Wirts-Mikroorganismus fremd ist, enthaltende rekombinante DNA in einen solchen Wirts-Mikroorganismus eingeführt worden ist.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend im einzelnen erläutert.
Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin durch Züchtung einer Transformante, die durch Transformation eines zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehörenden Mikroorganismus mit einer rekombinanten DNA eines DNA-Fragments erhalten wurde, das ein die Chorismatmutase und Prephenat-dehydratase codierendes Gen und eine Vektor-DNA enthielt, in einem Medium.
Als DNA-Fragment, das das in der vorliegenden Erfindung verwendete, die Chorismatmutase und Prephenatdehydratase codierende Gen enthält, wird das DNA-Fragment verwendet, das das an der Biosynthese von L-Phenylalanin beteiligte und von Eukaryoten, Prokaryoten, Viren, Bacteriophagen oder Plasmiden stammende Gen enthält. Als von Prokaryoten stammendes Gen wird vorzugsweise das Gen verwendet, das von einem Bacterium stammt, das zur Gattung Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium, Bacillus, Staphylococcus, Streptococcus oder Serratia gehört, und an der Biosynthese von erfindungsgemäßem L-Phenylalanin oder am Metabolismus, der die Biosynthese betrifft, beteiligt ist.
Als besonders bevorzugte Quelle für das Gen werden Aminosäure-produzierende Stämme und gegen Aminosäure-Analoge resistente, von den vorstehend beschriebenen Bakterien abgeleitete Stämme verwendet. Die Resistenz gegen Aminosäure- Analoge kann nach der Clonierung auf einem Plasmid übertragen werden.
Als Gen, das am Metabolismus beteiligt ist, der die Biosynthese von Phenylalanin betrifft, werden die Gene beschrieben, die die Chorismatmutase und die Prephenatdehydratase codieren. Ferner werden die vorstehend beschriebenen Gene verwendet, auf denen der gegen Phenylalanin, Tyrosin oder deren Analoge, beispielsweise Parafluorphenylalanin (PFP), resistente Phänotyp übertragen wird. Als Quelle für ein derartiges Gen wird Corynebacterium glutamicum K38, das gegen PFP resistent ist, erwähnt.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Vektor sollte in Zellen des Wirts-Mikroorganismus autonom replizieren. Es werden vorzugsweise Plasmide beschrieben, die von den hier genannten Erfindern aus den zur Gattung Corynebacterium gehörenden Mikroorganismen isoliert wurden, oder Abkömmlinge davon, wie pCG1 (japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung mit der Nr. 134500/82), pCG2 (japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung mit der Nr. 35197/83), pCG4 (japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung mit der Nr. 183799/82), pCE51, pCE52 (japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung mit der Nr. 126789/83), pCE53 (japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung mit der Nr. 25398/83), pCE54, pCG11, pCB100 (japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung mit der Nr. 105999/83) und ähnlichen.
Diese Plasmide tragende Mikroorganismen sind unter den nachstehend aufgeführten Hinterlegungsnummern beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, und bei der American Type Culture Collection, USA, hinterlegt worden. Plasmid Ferm P- ATCC
Die Plasmide pCE51, 52, 53 und 54 können, wie nachstehend beschrieben, aus den vorstehend aufgeführten Plasmiden entwickelt werden.
pCE51 wird beispielsweise wie nachstehend beschrieben hergestellt.
pCG1 wird aus gezüchteten Zellen von Corynebacterium glutamicum 225-57 (Ferm P-5865, ATCC 31808) durch das in der Beschreibung der japanischen, veröffentlichten, nicht-geprüften Patentanmeldung mit der Nr. 134500/82 beschriebene Verfahren isoliert. pGA22 wird durch ein übliches Verfahren aus den gezüchteten, das Plasmid tragenden Escherichia coli- Zellen isoliert [An, G. et al., J. Bacteriol. 140 (1979), 400]. Das Plasmid pCG1 wird mit der Restriktionsendonuclease BglII linearisiert und ein mit BamHI gespaltenes und das Kanamycin-Resistenz-(KmR)-Gen enthaltende Fragment von pGA22 unter Verwendung der gleichen überstehenden Enden beider Plasmide mit dem linearisierten pCG1 ligiert. Die Isolierung von pCE51 aus dem ligierten DNA-Gemisch wird durch Selektion der Transformanten, die zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehören und die von pGA22 stammende KmR enthalten, und durch eine Analyse des Plasmids in der Transformante erreicht.
pCE51 weist ein Molekulargewicht von etwa 6 kb und Spaltstellen für HincII, HindIII, SmaI, XhoI und EcoRI auf und zeigt einen KmR-Phänotyp.
pCE52 und pCE53 werden wie nachstehend beschrieben hergestellt.
Das Plasmid pCG1 wird aus den gezüchteten Zellen von Corynebacterium glutamicum 225-57 (FERM P-5865, ATCC 31808) durch das in der vorstehenden Anmeldung beschriebene Verfahren und das Plasmid pGA22 durch ein übliches Verfahren aus den gezüchteten, das Plasmid tragenden Escherichia coli- Zellen isoliert. pCG1 mit einer einzigen BglII-Stelle wird mit dem Restriktionsenzym BglII linearisiert und pGA22 mit zwei BamHI-Stellen mit BamHI partiell gespalten. Die überstehenden Enden beider Plasmide werden aneinandergelagert und zur Herstellung eines zusammengesetzten Moleküls mit T4- Phagen-DNA-Ligase ligiert. Die Selektion der rekombinanten Plasmide im Ligierungsgemisch erfolgt durch Isolierung der Transformanten der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium aufgrund der von pGA22 stammenden Arzneimittel-Resistenzen und durch eine anschließende Analyse der Plasmide in den Transformanten.
pCE52 und pCE53 weisen ein Molekulargewicht von etwa 10,9 kb und Spaltstellen für EcoRI, SalI, SmaI und XhoI auf. Während pCE52 einen Phänotyp mit Chloramphenicolresistenz (CmR) und KmR zeigt, verleiht pCE53 einen Phänotyp mit Tetracyclinresistenz (TcR), CmR und KmR. Die Lage der Spaltstelle für XhoI im KmR-Gen ermöglicht eine Selektion durch Insertions- Inaktivierung (Verhinderung der Genexpression durch Insertion eines DNA-Fragmentes in das Gen).
Die Transformation durch das ligierte DNA-Gemisch wird unter Verwendung von Protoplasten der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium und den in den japanischen, veröffentlichten, nicht-geprüften Patentanmeldungen mit den Nrn. 186492/82 und 186489/82 beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Abgesehen von dem durch Insertion inaktivierten Resistenzgen, werden die Gene, die die von pGA22 stammende Arzneimittel-Resistenz verleihen, zur Selektion verwendet. Im System ohne DNA-Zusatz werden die Transformanten als Kolonie gewonnen, die auf einem hypertonischen, üblicherweise 0,4§-1,6 ug/ml Tc, 2,5-5 ug/ml Cm, 100-800 ug/ml Km, 100-400 ug/ml Sm oder 200-1000 ug/ml Spec enthaltenden Agarmedium regeneriert wird, das den nicht mit dem Ligierungsgemisch behandelten Empfänger-Protoplasten die Reversion in normale Zellen nicht gestattet. In einer anderen Ausführungsform werden Transformanten auf einem Regenerationsmedium nichtselektiv regeneriert und die erhaltenen Zellen abgeschabt und resuspendiert, worauf diejenigen Zellen isoliert werden, die auf einem Agarmedium wachsen, das ein Arzneimittel in einer Konzentration enthält, bei der die normalen Zellen des Empfängers nicht wachsen können, das heißt, üblicherweise 0,5-4 ug/ml Tc, 2-15 ug/ml Cm, 2-25 ug/ml Km, 5-50 ug/ml Sm oder 50-500 ug/ml Spec. Einige der mit TcR, CmR oder KmR selektierten Transformanten sind gleichzeitig mit weiteren, vom Plasmid pGA22 stammenden Arzneimittel-Resistenzen ausgestattet.
Die Plasmid-DNA-Moleküle in diesen Transformanten können nach den in den japanischen, veröffentlichten, nichtgeprüften Patentanmeldungen mit den Nrn. 134500/82 und 186489/82 beschriebenen Verfahren aus den gezüchteten Zellen der Transformanten isoliert und gereinigt werden. Die Strukturen der DNA-Moleküle können durch Spaltung mit verschiedenen Restriktionsendonucleasen und Analyse der DNA- Fragmente durch Agarose-Gelelektrophorese bestimmt werden. Die aus den Transformanten isolierten Plasmide sind pCE51, pCE52 und pCE53. Die Gewinnung der Plasmide aus den Stämmen wird nach den in den japanischen, veröffentlichten, nichtgeprüften Patentanmeldungen mit den Nrn. 134500/82, 183799/82 und 35197/83 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Herstellung einer rekombinanten DNA von einer Vektor-DNA mit einem ein Gen enthaltenden DNA-Fragment wird durch die übliche rekombinante in vitro-DNA-Technologie durchgeführt.
Die rekombinante in vitro-DNA-Technologie wird durch Spaltung und Ligierung einer ein gewünschtes Gen enthaltenden Donor-DNA mit einer Vektor-DNA durchgeführt (vgl. die japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte, Patentanmeldung mit der Nr. 126789/83, und US-Patent Nr. 4,237,224).
Die Ligasereaktion liefert rekombinante Moleküle, die andere Gene als das gewünschte Gen enthalten. Die gewünschte rekombinante DNA kann durch direkte Transformation eines Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium mit dem ligierten DNA-Gemisch, Selektion der Transformanten, die den vom gewünschten Gen stammenden Phänotyp aufweisen, und Isolierung der gewünschten rekombinanten DNA aus den gezüchteten Zellen der Transformanten erhalten werden. Anstelle der direkten Clonierung des gewünschten Gens in einen Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium kann das gewünschte Gen durch Verwendung eines anderen Wirt-Vektor-Systems, beispielsweise Escherichia coli, cloniert werden. Es wird dann in einen Vektor der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium zur Transformation dieser Mikroorganismen in vitro umcloniert, und die das gewünschte rekombinante Plasmid enthaltenden Transformanten werden, wie vorstehend beschrieben, selektiert.
Das Verfahren zur Clonierung eines Gens in einen Wirts-Mikroorganismus von Escherichia coli wird beispielsweise in Methods in Enzymology 68 (1979), Ray Wu (Hrsg.), Academic Press, New York, beschrieben.
Die nachstehend angegebenen Verweise sind bei der Konstruktion von rekombinanter DNA hilfreich:
Cohen, S. N. et al., U. S. P. Nr. 4,237,224;
Idenshi Sosa Jikkenho, herausgegeben von Yasuyuki Takagi, gedruckt von Kodansha Scientific (1980);
Methods in Enzymology 68, Recombinant DNA, herausgegeben von Ray Wu, Academic Press, 1979;
Japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung mit der Nr. 126789/83.
Mikroorganismen, die zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehören und zur Aufnahme von DNA-Molekülen kompetent sind, können in der vorliegenden Erfindung als Wirts-Mikroorganismen verwendet werden. Nachstehend sind Beispiele für geeignete Wirts-Mikroorganismen aufgeführt. Hinterlegungsnummer Ferm P- ATCC Corynebacterium glutamicum Corynebacterium herculis Corynebacterium acetoacidophilum Corynebacterium lilium Brevibacterium divaricatum Brevibacterium lactofermentum Brevibacterium flavum Brevibacterium immariophilium Brevibacterium thiogenitalis
Die Transformation der Wirts-Mikroorganismen mit rekombinanten DNA-Molekülen wird in den nachstehend beschriebenen Schritten durchgeführt:
1) Herstellung von Protoplasten aus gezüchteten Zellen;
2) Transformation der Protoplasten durch eine rekombinante DNA;
3) Regeneration der Protoplasten zu normalen Zellen und Selektion einer Transformante.
Diese Schritte sind nachstehend im einzelnen beschrieben.
1. Herstellung von Protoplasten aus den gezüchteten Zellen:
Die Herstellung von Protoplasten wird durch Züchtung eines Mikroorganismus unter eine Empfindlichkeit gegen Lysozym, einem lytischen Enzym, erzeugenden Bedingungen und durch Behandlung der gezüchteten Zellen mit Lysozym in einer hypertonischen Lösung zur Entfernung der Zellwände durchgeführt. Zur Erzeugung Lysozym-empfindlicher mikrobieller Zellen werden die Synthese bakterieller Zellwände hemmende Reagenzien verwendet. Lysozym-empfindliche mikrobielle Zellen werden beispielsweise durch eine während der logarithmischen Wachstumsphase zugesetzte, das Wachstum nicht hemmende oder behindernde Menge Penicillin und durch eine nachfolgende, über mehrere Generationen fortgesetzte Züchtung erhalten.
Zur Züchtung kann jedes Medium, in dem der Mikroorganismus wachsen kann, verwendet werden. Es werden zum Beispiel ein Nährmedium NB (pH-Wert 7,2), das aus 20 g/l pulverförmiger Bouillon und 5 g/l Hefeextrakt besteht, und ein halbsynthetisches Medium SSM (pH-Wert 7,2), das aus 10 g/l Glucose, 4 g/l NH&sub4;Cl, 2 g/l Harnstoff, 1 g/l Hefeextrakt, 1 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 3 g/l K&sub2;HPO&sub4;, 0,4 g/l MgCl&sub2;·6 H&sub2;O, 10 mg/l FeSO&sub4;·7 H&sub2;O, 0,2 mg/l MnSO&sub4;·(4-6) H&sub2;O, 0,9 mg/l ZnSO&sub4;· 7 H&sub2;O, 0,4 mg/l CuSO&sub4;·5 H&sub2;O, 0,09 mg/l Na&sub2;B&sub4;O&sub7;·10 H&sub2;O, 0,04 mg/l (NH&sub4;)&sub6;Mo&sub7;O&sub2;&sub4;·4 H&sub2;O, 30 ug/l Biotin und 1 mg/l Thiaminhydrochlorid besteht, verwendet.
Das Medium wird mit mikrobiellen Zellen geimpft und die Züchtung unter Schütteln durchgeführt.
Die optische Dichte (OD) des Kulturmediums bei 660 nm wird mit einem Kolorimeter überwacht und Penicillin, beispielsweise Penicillin G, im Anfangsstadium der logarithmischen Wachstumsphase (OD: 0,1-0,4) in einer Konzentration von 0,1 bis 2,0 E/ml zugesetzt. Die Züchtung wird bis zu einem OD-Wert von 0,3-0,5 fortgesetzt, und anschließend werden die Zellen geerntet und mit SSM-Medium gewaschen. Die gewaschenen Zellen werden in einem geeigneten hypertonischen Medium, wie PFM-Medium (pH-Wert 7,0-8,5), in dem 0,4 M Saccharose und 0,01 M MgCl&sub2;·6 H&sub2;O einem zweifach verdünnten SSM-Medium zugesetzt werden, und RCG-Medium (pH- Wert 7,0-8,5), das aus 5 g/l Glucose, 5 g/l Caseinhydrolysat, 2,5 g/l Hefeextrakt, 3,5 g/l K&sub2;HPO&sub4;, 1,5 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 0,41 g/l MgCl&sub2;·6 H&sub2;O, 10 mg/l FeSO&sub4;·7 H&sub2;O, 2 mg/l MnSO&sub4;·(4-6) H&sub2;O, 0,9 mg/l ZnSO&sub4;·7 H&sub2;O, 0,4 mg/l CuSO&sub4;·5 H&sub2;O, 0,09 mg/l Na&sub2;B&sub4;O&sub7;·10 H&sub2;O, 0,04 mg/l (NH&sub4;)&sub6;Mo&sub7;O&sub2;&sub4;·4 H&sub2;O, 30 ug/l Biotin, 2 mg/l Thiaminhydrochlorid und 135 g/l Natriumsuccinat besteht, oder RCGP-Medium, das aus RCG-Medium und 3% Polyvinylpyrrolidon besteht, resuspendiert. Zur Zellsuspension erfolgt der Zusatz von Lysozym zu einer Endkonzentration von 0,2 bis 10 mg/ml, und das Gemisch wird bei einer Temperatur von 30 bis 37ºC umgesetzt. Die Bildung der Protoplasten entwickelt sich mit der Zeit und wird mit einem optischen Mikroskop überwacht. Der erforderliche Zeitraum zur Umwandlung der meisten Zellen in Protoplasten hängt von den Konzentrationen des zur Lysozym-Sensibilisierung verwendeten Penicillins und der verwendeten Lysozymmenge ab. Der Zeitraum beträgt unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen 3-24 Stunden.
Da die gebildeten Protoplasten unter hypotonischen Bedingungen zerstört werden, wird die Menge der gebildeten Protoplasten indirekt aus der Zahl der die hypotonischen Bedingungen überlebenden normalen Zellen bestimmt. Üblicherweise hält man das Verhältnis der überlebenden normalen Zellen unterhalb von 10&supmin;&sup4; pro Lysozym-behandelter normaler Zelle.
Die vorstehend hergestellten Protoplasten sind auf einem geeigneten hypertonischen Agarmedium fähig, Kolonien zu bilden (zu regenerieren). Als Agarmedium wird vorzugsweise ein Nährmedium, ein halbsynthetisches Medium oder ein verschiedene Aminosäuren enthaltendes synthetisches Medium, das 0,3 bis 0,8 M Natriumsuccinat und 0,5 bis 6% Polyvinylpyrrolidon mit einem Molekulargewicht von 10 000 oder 40 000 enthält, verwendet. Üblicherweise wird ein halbsynthetisches Medium RCGP (pH-Wert 7,2), in dem 1,4% Agar dem RCGP-Agarmedium zugesetzt wird, verwendet. Die Regeneration wird bei einer Temperatur von 25 bis 35ºC durchgeführt. Die zur Regeneration von Protoplasten erforderliche Züchtungszeit hängt vom verwendeten Stamm ab, und Kolonien können üblicherweise nach 10 bis 14 Tagen entnommen werden. Die Effizienz der Regeneration von Protoplasten auf RCGP-Medium hängt auch von dem verwendeten Stamm, den während der Züchtung zugesetzten Penicillin-Konzentrationen und der verwendeten Lysozym-Konzentration ab. Die Effizienz liegt üblicherweise bei 10&supmin;² bis 10&supmin;&sup4; Zellen pro normaler, mit Lysozym behandelter Zelle.
2. Transformation der Protoplasten mit einer rekombinanten DNA:
Die Einführung einer rekombinanten DNA in den Protoplasten wird durch Mischung des Protoplasten und der DNA in einer die Protoplasten schützenden hypertonischen Lösung und durch Zusatz von Polyethylenglycol (PEG, durchschnittliches Molekulargewicht: 1540-6000) oder Polyvinylalkohol (PVA, Polymerisationsgrad: 500-1500) und einem zweiwertigen Metallkation, das die Aufnahme von DNA stimuliert, zu dem Gemisch durchgeführt. Üblicherweise zum Schutz der Protoplasten von anderen Mikroorganismen verwendete Wirkstoffe zur Stabilisierung der hypertonischen Bedingungen, wie Saccharose und Natriumsuccinat, werden auch verwendet. PEG und PVA können in einer Endkonzentration von 5 bis 60% bzw. 1 bis 20% verwendet werden. Zweiwertige Metallkationen, wie Ca&spplus;&spplus;, Mg&spplus;&spplus;, Mn&spplus;&spplus;, Ba&spplus;&spplus; und Sr&spplus;&spplus;, werden separat oder kombiniert bei einer Endkonzentration von 1 bis 100 mM wirksam verwendet. Die Transformation wird zufriedenstellend bei 0 bis 25ºC durchgeführt.
3. Regeneration der Protoplasten zu normalen Zellen und Selektion einer Transformante:
Die Regeneration des mit einer rekombinanten DNA transformierten Protoplasten wird in derselben, vorstehend beschriebenen Weise durch Verteilung des Protoplasten auf einem hypertonischen Agarmedium, wie Natriumsuccinat und Polyvinylpyrrolidon enthaltendem RCGP-Medium, und Inkubation bei einer für das Wachstum normaler Zellen erforderlichen Temperatur, üblicherweise 25 bis 35ºC, durchgeführt. Transformanten werden durch Selektion auf die von Donor-DNA- Molekülen stammenden Phänotypen erhalten. Die Selektion auf einen verliehenen charakteristischen Phänotyp kann gleichzeitig mit der Regeneration auf einem hypertonischen Agarmedium oder auf einem hypotonischen Agarmedium nach einer nicht-selektiven Reversion in normale Zellen auf einem hypertonischen Agarmedium durchgeführt werden.
Bei Verwendung der als bevorzugte Wirts-Mikroorganismen beschriebenen Lysozym-empfindlichen Stämme kann die Transformation in den unter (1) bis (3) beschriebenen Schritten durchgeführt werden, außer daß die Behandlung der gezüchteten Zellen mit Lysozym direkt, ohne eine vorherige Behandlung mit Penicillin in Schritt (1) erfolgt. Unter diesen Umständen werden Transformanten mit einer Effizienz von 10&supmin;² bis 10&supmin;&sup4; pro regenerierter Zelle erhalten.
Die nachstehend beschriebenen Stämme sind Beispiele von Transformanten, die durch die vorliegende Erfindung erhalten werden.
Die Expression des Phänotyps der rekombinanten DNA wird durch Züchtung der Transformanten in einem üblichen Nährmedium durchgeführt. Geeignete Reagenzien, entsprechend dem von der Gen- oder Vektor-DNA auf der rekombinanten DNA erwarteten Phänotyp, können dem Medium zugesetzt werden.
Die so erhaltene Transformante wird in einer üblichen, in der Produktion von Aminosäuren durch Fermentation verwendeten Weise gezüchtet. Das heißt, die Transformante wird in einem üblichen Medium, das Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Stoffe, Aminosäuren und Vitamine enthält, unter aeroben Bedingungen bei einer eingestellten Temperatur und einem eingestellten pH-Wert gezüchtet. Die so im Medium angereicherten Aminosäuren werden gewonnen.
Als Kohlenstoffquelle können verschiedene Kohlehydrate, wie Glucose, Glycerin, Fructose, Saccharose, Maltose, Mannose, Stärke, Stärkehydrolysat und Melasse, Polyalkohole und verschiedene organische Säuren, wie Brenztraubensäure, Fumarsäure, Milchsäure und Essigsäure, verwendet werden.
Entsprechend der Assimilationsfähigkeit des verwendeten Mikroorganismenstammes werden Kohlehydrate und Alkohole verwendet. Insbesondere wird Endmelasse verwendet.
Als Stickstoffquelle sind Ammoniak, verschiedene anorganische oder organische Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumacetat, Harnstoff und stickstoffhaltige organische Stoffe, wie Pepton, NZ-Amin, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Caseinhydrolysat, Fischmehl oder seine Abbauprodukte, entfettete Sojabohnen oder ihre Aufschlußprodukte und Chrysalidenhydrolysat geeignet.
Als anorganische Stoffe können Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisensulfat, Mangansulfat und Calciumcarbonat verwendet werden. Der Zusatz der für das Wachstum der Mikroorganismen erforderlichen Vitamine und Aminosäuren kann unterbleiben, sofern sie mit den anderen, vorstehend beschriebenen Komponenten zugesetzt werden.
Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, wobei geschüttelt oder zur Luftzufuhr gerührt wird. Die Züchtungstemperatur beträgt vorzugsweise 20 bis 40ºC. Der pH-Wert des Mediums wird bei der Züchtung etwa auf dem Neutralpunkt gehalten. Die Züchtung wird bis zur Anhäufung einer beträchtlichen Menge einer Aminosäure fortgesetzt, üblicherweise 1 bis 5 Tage.
Nach Abschluß der Züchtung werden die Zellen entfernt und die Aminosäure wird in üblicher Weise, beispielsweise durch Behandlung mit Aktivkohle oder Ionenaustauscherharz, aus der Kulturflüssigkeit gewonnen.
Trotz ihrer sehr ähnlichen mikrobiologischen Eigenschaften werden sogenannte Glutaminsäure-produzierende Mikroorganismen, die Glutaminsäure in großen Mengen produzieren, wahrscheinlich aufgrund ihrer industriellen Bedeutung in verschiedene Arten und sogar in verschiedene Gattungen, wie Corynebakterium und Brevibakterium, eingeteilt. Es ist jedoch darauf hingewiesen worden, daß diese Mikroorganismen aufgrund der beinahe gleichen Aminosäurezusammensetzung in der Zellwand und der Basenzusammensetzung der DNA-Moleküle zu einer Art gehören sollten. Es ist vor kurzem berichtet worden, daß diese Mikroorganismen bei der DNA-DNA-Hybridisierung mindestens zu 70 bis 80% homolog sind, ein Hinweis auf die enge Verwandtschaft dieser Mikroorganismen. Vgl. z. B., Komatsu, Y., Report of the Fermentation Research Institute 55 (1980), 1, und Suzuki, K., Kaneko, T. und Komagata, K., Int. J. Syst. Bacteriol. 31 (1981), 131.
Unter Berücksichtigung der vorstehend beschriebenen Tatsachen liegt die Vermutung nahe, daß der Nutzen der vorliegenden Erfindung für sämtliche Glutaminsäure-produzierenden Mikroorganismen gilt. Für den stabilen Erhalt der rekombinanten DNA-Moleküle und die Expression der DNA in diesen Arten können geringfügig unterschiedliche Eigenschaften der Wirts-Mikroorganismen, wie Homologie der DNA, vernachlässigt werden, und es genügt, daß die Wirts-Mikroorganismen die autonome Replikation von Plasmiden und die Expression der darauf enthaltenden Gene ermöglichen. Daß diese Mikroorganismen solche Fähigkeiten besitzen geht aus der Tatsache hervor, daß das aus Corynebacterium glutamicum 225-250 (japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung mit der Nr. 183799/82) isolierte und ein Streptomycin- und/oder Spectinomycin-Resistenzgen aufweisende Plasmid pCG4 in Glutaminsäure-produzierenden Mikroorganismen, die beispielsweise zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehören, replizieren konnte und das für die Resistenz verantwortliche Gen exprimiert werden konnte (japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung mit der Nr. 186492/82). Ferner ist es nach der Beschreibung der erfindungsgemäßen Histidin-Produktion klar, daß das in Corynebacterium glutamicum exprimierte Gen in einem breiten Spektrum von Wirts-Mikroorganismen der Gattungen Corynebacterium, Brevibacterium und ähnlichen exprimiert werden kann. Daher sind sämtliche Glutaminsäure-produzierenden Mikroorganismen, einschließlich der zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium, sowie die zur Art Corynebacterium glutamicum gehörigen, kompetente Wirts-Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung.
Für die Stämme, die in der vorliegenden Beschreibung erscheinen, lauten die Hinterlegungsnummern, das Hinterlegungsdatum und das Transferdatum der Hinterlegungen gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags zur internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck von Patentverfahren, wie nachstehend angegeben. Hinterlegungsdatum Ferm P (Transferdatum) ATCC (BP) Tag/Monat/Jahr Corynebacterium glutamicum Corynebacterium herculis Brevibacterium divaricatum Brevibacterium lactofermentum Brevibacterium fluvum Brevibacterium lactofermentum Corynebacterium glutamicum Corynebacterium herculis

Beispiel 1

Herstellung von pCG11-Plasmid-DNA

Das als Vektorplasmid verwendete pCG11 wurde aus Corynebacterium glutamicum LA 103/pCG11, ATCC 39022, das ein Abkömmling von Corynebacterium glutamicum L-22 ist und pCG11 enthält, in der nachstehend beschriebenen Weise hergestellt.
Der Stamm wurde unter Schütteln bei 30ºC in 400 ml NB-Medium bis zu einem OD-Wert von etwa 0,7 gezüchtet. Die Zellen wurden geerntet und mit TES-Puffer gewaschen. Die Zellen wurden in 10 ml der vorstehend beschriebenen Lysozymlösung suspendiert, und die Umsetzung wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Anschließend wurden nacheinander 2,4 ml 5 M NaCl, 0,6 ml 0,5 M EDTA (pH-Wert 8,5) und 4,4 ml einer Lösung, die aus 4% Natriumlaurylsulfat und 0,7 M NaCl bestand, zugesetzt. Das Gemisch wurde langsam gerührt und 15 Stunden auf einem Eiswasserbad stehen gelassen.
Das gesamte Lysat wurde 60 Minuten bei 4ºC mit 69 400 · g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde gewonnen und 10 Gew.-% Polyethylenglycol (PEG) 6000 (Nakarai Kagaku Yakuhin Co.) zugesetzt. Das Gemisch wurde bis zur vollständigen Auflösung langsam gerührt und anschließend auf einem Eiswasserbad gekühlt. Nach 10 Stunden wurde das Gemisch zur Gewinnung eines Pellets 10 Minuten bei 1500 · g zentrifugiert. Das Pellet wurde erneut vorsichtig in 5 ml TES-Puffer gelöst, und 2,0 ml 1,5 mg/ml Ethidiumbromid wurden zugesetzt. Zur Einstellung der Dichte des Gemisches auf 1,580 wurde anschließend Cäsiumchlorid zugesetzt. Die Lösung wurde 48 Stunden bei 18ºC mit 105 000 · g zentrifugiert. Im Anschluß an die Dichtegradientenzentrifugation wurde unter UV-Bestrahlung eine kovalent-geschlossene zirkuläre DNA als eine im unteren Teil des Zentrifugenröhrchens befindliche Bande mit hoher Dichte nachgewiesen. Die Bande wurde zum Erhalt einer Fraktion, die pCG11-DNA enthielt, von der Seite des Röhrchens mit einer Injektionsnadel entnommen. Zur Entfernung von Ethidiumbromid wurde die Fraktion fünfmal mit einer gleichen Menge mit Cäsiumchlorid gesättigter Isopropylalkohollösung, die aus 90 Volumen-% Isopropylalkohol und 10% TES-Pufferlösung bestand, behandelt. Im Anschluß daran wurde der Rückstand zum Erhalt von pCG11-Plasmid-DNA gegen TES-Pufferlösung dialysiert.

Beispiel 2

Clonierung des vom Stamm Corynebacterium glutamicum K38 stammenden Gens, das Chorismatmutase und Prephenatdehydratase codiert, und Herstellung von Phenylalanin durch die Expression des Gens in Corynebacterium glutamicum

(1) Herstellung der chromosomalen DNA und des Plasmids pCG11:
Die chromosomale DNA von Corynebacterium glutamicum K38 FERM P-7087 wurde durch das nachstehend beschriebene Verfahren hergestellt.
Eine Impfkultur wurde in 400 ml SSM geimpft. Die Züchtung erfolgte unter Schütteln bei 30ºC. Das NB-Medium wurde als Impfkultur verwendet. Die optische Dichte (OD) wurde bei 660 nm mit einem Tokyo Koden-Kolorimeter überwacht und Penicillin G bei einem OD-Wert von 0,2 zu einer Konzentration von 0,5 Einheiten/ml zugesetzt. Die Züchtung wurde bis zu einem OD-Wert von etwa 0,6 fortgesetzt.
Die Zellen wurden aus der Kulturbrühe geerntet und mit TES-Puffer gewaschen. Die Zellen wurden in einer Lysozym-Lösung (pH-Wert 8,0) suspendiert, die aus 25% Saccharose, 0,1 M NaCl, 0,05 M Tris und 0,8 mg/ml Lysozym bestand (die gleiche Lysozym-Lösung wurde hier nachstehend verwendet), zur Herstellung von 10 ml einer Suspension, die man sich 4 Stunden bei 37ºC umsetzen ließ. Hochmolekulare chromosomale DNA-Moleküle wurden durch das Verfahren von Saito et al. aus den Zellen isoliert.
Gesondert wurde das als Vektor verwendete pCG11 durch das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren hergestellt.
(2) Clonierung des für den para-Fluorphenylalanin-(PFP)resistenten Phänotyp verantwortlichen Gens:
In diesem Schritt wurden jeweils 5 Einheiten des Restriktionsenzyms BglII zu 100 ul einer 3 ug pCG11-Plasmid- DNA enthaltenden BglII-Reaktionslösung zugesetzt und 5 Einheiten BamHI zu 100 ul einer Reaktionslösung (pH-Wert 8,0) des Restriktionsenzyms BamHI zugesetzt, die aus 10 mM Tris, 7 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl, 2 mM Mercaptoethanol P und 0,01% Rinderserumalbumin (die gleiche BamHI-Reaktionslösung wurde nachstehend verwendet) bestand und 9 ug der chromosomalen DNA enthielt. Man ließ die Gemische 60 Minuten bei 37ºC reagieren und zum Abbruch der Umsetzung wurde 10 Minuten auf 65ºC erhitzt. Die Reaktionsgemische wurden miteinander vermischt. Anschließend wurden 40 ul einer T4- Ligase-Pufferlösung II, 40 ul 5 mM ATP, 0,4 ul T4-Ligase und 120 ul H&sub2;O zugesetzt. Man ließ das Gemisch 16 Stunden bei 12ºC reagieren.
3) Transformation mit rekombinanten Plasmiden:
Das vorstehend beschriebene Ligierungsgemisch wurde zur nachstehend beschriebenen Transformation bereitgestellt. Als Empfänger in der Transformation wurde Corynebacterium glutamicum L-15 ATCC 31834 verwendet. Die Impfkultur des L- 15-Stammes wurde in ein NB-Medium geimpft und die Züchtung unter Schütteln bei 30ºC durchgeführt. Die Zellen wurden bei einem OD-Wert von 0,6 geerntet. Die Zellen wurden mit etwa 109 Zellen/ml in einem 1 mg/ml Lysozym enthaltenden RCGP- Medium (pH-Wert 7,6) suspendiert. Die Suspension wurde in ein L-Röhrchen gegeben und zum Erhalt von Protoplasten 5 Stunden bei 30ºC langsam geschüttelt.
Anschließend wurden 0,5 ml der Protoplastensuspension in ein kleines Teströhrchen gegeben und 5 Minuten bei 2500 · g zentrifugiert. Die Protoplasten wurden in 1 ml TSMC-Puffer resuspendiert und erneut zentrifugiert und gewaschen. Die gewaschenen Protoplasten wurden in 0,1 ml TSMC-Pufferlösung resuspendiert. Es wurden der Protoplasten-Suspension 100 ul eines Gemisches (1 : 1 nach Volumen) aus einem zweifach konzentrierten TSMC-Puffer und dem vorstehend beschriebenen, ligierten DNA-Gemisch zugesetzt. Anschließend wurden dem Gemisch 0,8 ml einer Lösung, die 20% PEG 6000 in TSMC-Pufferlösung enthielt, zugesetzt. Nach 3 Minuten wurden 2 ml des RCGP-Mediums (pH-Wert 7,2) zugesetzt und das Gemisch 5 Minuten bei 2500 · g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt, und die Protoplasten wurden in 1 ml RCGP-Medium suspendiert. Anschließend wurden 0,2 ml der Suspension auf 200 ug/ml Spectinomycin enthaltendem RCGP-Agarmedium verteilt und 7 Tage bei 30ºC inkubiert.
Sämtliche auf der Selektionsplatte gebildeten, Spectinomycin-resistenten Kolonien wurden abgeschabt, mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und zweimal zentrifugiert. Die Zellen wurden auf einem Agar-Minimalmedium M1, das 100 ug/ml Spectinomycin und 0,5 mg/ml PFP enthielt, verteilt und 2 Tage bei 30ºC inkubiert. Die gegen Spectinomycin und PFP resistenten Transformanten wurden aus den gebildeten Kolonien erhalten.
Die Plasmid-DNA-Moleküle wurden aus den Zellen dieser Transformanten isoliert. Das aus einer dieser Transformanten gewonnene Plasmid pCS-CM1 wurde durch Spaltung mit verschiedenen Restriktionsendonucleasen und durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Die Analyse zeigte, daß ein BamHI- DNA-Fragment von etwa 9,4 kb in die einzige BglII-Spaltstelle von pCG11 in pCS-CM1 inseriert worden war.
Ferner wurde das gleiche Ligierungsgemisch zur Transformation eines Corynebacterium glutamicum-Stammes, der Phenylalanin und Tyrosin für sein Wachstum benötigt (defekte Chorismatmutase und Prephenatdehydratase), nach dem gleichen vorstehend beschriebenen Verfahren verwendet. Die Transformanten, die Spectinomycin-resistent waren und kein Phenylalanin und Tyrosin benötigten, wurden ausgewählt.
Die Plasmid-DNA-Moleküle wurden, wie vorstehend beschrieben, aus diesen Transformanten isoliert. Ein aus einer der Transformanten gewonnenes Plasmid pCS-CM2 wurde mit Restriktionsendonucleasen gespalten und durch Agarose- Gelelektrophorese analysiert. Die Analyse zeigte, daß ein BamHI-DNA-Fragment von etwa 9,4 kb in die einzige BglII- Spaltstelle von pCG11 in pCS-CM2 inseriert worden war.
Ferner ergaben Spaltungen mit verschiedenen Restriktionsendonucleasen, beispielsweise mit EcoRI, SalI, HindIII und ähnlichen, in pCS-CM1 und pCS-CM2 die gleichen Spaltmuster, wodurch gezeigt wurde, daß beide Plasmide die gleiche physikalische Struktur, wie nachstehend dargestellt, aufwiesen. BamHI HindIII EcoRI SalI etwa
Wenn ein Corynebacterium glutamicum-Stamm, der Phenylalanin und Tyrosin benötigt, durch das gleiche vorstehend beschriebene Verfahren mit pCS-CM1 und pCS-CM2 transformiert worden war, wiesen sämtliche erhaltenen Transformanten, die auf einem jeweils 100 ug/ml Phenylalanin und Tyrosin und 200 ug/ml Spectinomycin enthaltenden RCGP-Agarmedium gezüchtet worden waren, eine Phenylalanin- und Tyrosin-Prototrophie und eine PFP-Resistenz auf und trugen die gleichen Plasmide wie pCS-CM1 und pCS-CM2.
Diese Ergebnisse zeigen, daß das in pCS-CM1 und pCS- CM2 clonierte BamHI-DNA-Fragment von etwa 9,4 kb die Gene enthält, die die Chorismatmutase und Prephenatdehydratase von Corynebacterium glutamicum K38 codieren, und daß das DNA-Fragment die para-Fluorphenylalanin-Resistenz auf Corynebacterium glutamicum übertragen kann.
(4) Produktion von Phenylalanin durch die Transformante:
Corynebacterium glutamin K38 (FERM P-7087, FERM BP- 454), das Phenylalanin produziert, wurde, wie vorstehend beschrieben, mit pCS-CM2 transformiert. Die so erhaltene Transformante ist als Corynebacterium glutamicum K39, FERM P-7088 (FERM BP-459) beim Fermentation Research Institute hinterlegt worden.
Corynebacterium glutamicum K39, das pCS-CM2 trägt, wurde, wie nachstehend beschrieben, auf L-Phenylalanin-Produktion getestet.
Der Stamm wurde 16 Stunden bei 30ºC in NB-Medium gezüchtet, und 0,5 ml der Kulturflüssigkeit wurden in 5 ml eines P4-Produktionsmediums (pH-Wert 7,2), bestehend aus 100 g/l Melasse, 20 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,5 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 0,5 g/l K&sub2;HPO&sub4;, 0,25 g/l MgSO&sub4;·7 H&sub2;O und 20 g/l CaCO&sub3;, überimpft. Es wurde 96 Stunden bei 30ºC gezüchtet. Mit dem Kulturfiltrat wurde eine Papierchromatographie und eine Farbreaktion mit Ninhydrin durchgeführt. Die Menge an gebildetem L- Phenylalanin wurde kolorimetrisch bestimmt. Als Kontrolle wurde Corynebacterium glutamicum K38, wie vorstehend beschrieben, behandelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I dargestellt.

Tabelle I

Stamm Menge an L- Phenylalanin (mg/ml) Corynebacterium glutamicum K38 6,0
Corynebacterium glutamicum K39 9,6

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin, umfassend die Züchtung eines Mikroorganismus, der erhalten wurde durch Transformation eines zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehörenden Wirtsmikroorganismus mit einer rekombinanten DNA, in der ein das die Chorismatmutase und Prephenatdehydratase codierende Gen enthaltendes DNA-Fragment in eine Vektor-DNA eingefügt ist, die Anhäufung von L-Phenylalanin im Medium und seine Gewinnung daraus.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die rekombinante DNA das Plasmid pCS-CM2 (FERM BP459) ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus Corynebacterium glutamicum K39, FERM BP-459 ist.

4. Biologisch reine Kultur von Corynebacterium glutamicum K39, FERM BP-459.