NO319747B1 - Anvendelse av et middel for fremstilling av et medikament for forebyggelse og/eller behandling av en autoimmun sykdom eller human T-celleleukemi samt transplantatavvisning eller GVDH, farmasoytisk preparat samt sett. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av et middel for fremstilling av et medikament for forebyggelse og/eller behandling av en autoimmun sykdom eller human T-celleleukemi samt transplan-tatawisning eller GVHD, farmasøytisk preparat samt sett.

I en artikkel med "Morphologic and Functional Alter-ations of Mucosal T cells by Cholera Toxin and its B subunit" av Charles O. Elson et al., The Journal of Immunology, 1995, 154; 1032-1040, er det beskrevet at koleratoksinet (Ctx) og CtxB-subenheten inhiberer CD8<+-> og CD4<+->T-celler.

Det refereres også til artikkelen med tittel "Preven-tion of Acute Graft-Versus-Host Disease by Treatment with a Novel Immunosuppressant" av B. Yankelevich et al., The Journal of Immunology, 1995, 154: 3611-3617. Denne identifiserer CtxB som et middel til anvendelse ved benmargstransplantasjon for forebyggelse av akutt graft-versus-host-sykdom {GVHD).

WO 95/10301 beskriver et immunologisk toleranse-induserende middel som omfatter et slimhinnebindende molekyl bundet til et spesifikt tolerogen.

Som anvendt heri refererer betegnelsen "Ctx" til koleratoksinet og "CtxB" til S-subenheten av koleratoksinet. I andre tekster kan disse noen ganger identifiseres som hhv. "CT" eller "Ct" og "CTB" eller "CtB". Betegnelsen "Etx" heri, betyr det E. coli-varmelabile enterotoksin og "EtxB" er 6-subenheten av Etx. I andre tekster kan disse noen ganger være identifisert som hhv. "LT" eller "Lt" og "LTB" eller "LtB".

Basis for alle aspekter av oppfinnelsen er det funn at EtxB (den rene B-subenhet av det E. coli-varmelabile enterotoksin) bindes til GMl-gangliosidreseptorer som finnes på overflatene av pattedyrceller og at denne binding induserer forskjellige effekter på lymfocyttpopulasjoner, inkludert en spesifikk uttynning av CD8<+->T-celler og en assosiert aktivering av B-celler. Disse effekter er fraværende når det benyttes et mutant EtxB-protein som mangler GM1-bindingsakti-vitet .

Auto immunsykdom

Autoimmunitet er betegnelsen anvendt for å beskrive mekanismen ved hvilken kroppen danner en immunrespons mot kroppens egne antigener.

I overensstemmelse med et første aspekt av oppfinnelsen omfatter oppfinnelsen anvendelse av et middel for fremstilling av et medikament for forebyggelse og/eller behandling av en autoimmun sykdom eller human T-celleleukemi, hvori: (i) middelet er Etx ( E. coli varmelabilt enterotoksin, EtxB ( E. coli varmelabilt enterotoksin, subenhet B), Ctx (koleratoksin) og/eller CtxB

(koleratoksin, subenhet B)

(ii) dersom middelet koadministreres med en antigendeterminant, er middelet og antigen-detereminanten ikke bundet på en slik måte at det dannes et enkelt, aktivt middel.

Anvendelse av et middel ifølge foreliggende oppfinnelse er blitt funnet å modulere lymfocyttpopulasjoner og fører til induksjon av apoptose i CD8<+->T-celler, forsterket aktivering av CD4<+->celler og polyklonal aktivering av B-celler. Disse tilfeller vil sannsynligvis forskyve immunresponsen mot induksjon av Th2-assosierte cytokiner. Slike responser mot kroppens egne antigener eller kryssreagerende antigener, er underforstått å formidle beskyttelse mot visse autoimmunsykdommer.

I en første utførelsesform av dette første aspekt av oppfinnelsen, anvendes midlet i en fremgangsmåte for behandling av en autoimmunsykdom som er under utvikling. I denne utførelsesform administreres midlet til en pasient med eller uten samtidig administrering av et kroppseget eller kryssreagerende antigen. Administrering av midlet i overensstemmelse med denne utførelsesform av det første aspekt av oppfinnelsen modulerer beskaffenheten av immunresponsen overfor det kroppsegne antigen bort fra aktivering av sykdomsfor-årsakende inflammasjon og beskytter således mot autoimmunsykdom .

I en andre utførelsesform av dette første aspekt av oppfinnelsen anvendes midlet ved en fremgangsmåte for "vaksinasjon" av et pattedyr mot en autoimmunsykdom, hvori midlet administreres sammen med den kroppsegne eller kryssreagerende antigene determinant (eller en kombinasjon av forskjellige kroppsegne eller kryssreagerende antigene determinanter) som er forbundet med sykdommen. På en slik måte blir individets immunrespons mot det kroppsegne antigen eller det kryssreagerende antigen dreid bort fra aktiveringen av patogenese, hvilket derfor beskytter mot en fremtidig autoimmun respons mot det kroppsegne antigen.

I dette første aspekt av oppfinnelsen vil, eller kan, det terapeutiske middel og den kroppsegne eller kryssreagerende antigene determinant, administreres sammen til individet. Ved dette er det ment at stedet og tiden for administrering av det terapeutiske middel og den antigene determinant er slik at den nødvendige modulering av immunsystemet oppnås. Selv om det terapeutiske middel og den antigene determinant således kan administreres på det samme tidspunkt og på det samme sted, kan det være fordeler ved å administrere det terapeutiske middel på et annet tidspunkt og et annet sted enn den antigene determinant .

Selv om enkle doser av det terapeutiske middel og den antigene determinant kan være tilfredsstillende, er administrering av mange doser betraktet som å ligge innenfor rammen for dette aspekt av oppfinnelsen.

Separat administrering der det terapeutiske middel og den antigene determinant ikke er sammenbundet, slik at det dannes et enkelt aktivt middel er foretrukket fordi det mulig-gjør separat administrering av de forskjellige komponenter.

Spesifikke autoimmunsykdommer som kan behandles ved hjelp av et slikt medikament, er autoimmunsykdommene hvor patologi er forbundet med celleformidlet immunitet, slik som reumatoid artritt, multippel sklerose og diabetes.

Det tilveiebringes også et farmasøytisk preparat, kjennetegnet ved at det omfatter et middel for anvendelse ved forebyggelse og/eller behandling av en autoimmun sykdom eller human T-celleleukemi, hvori:

(i) middelet er Etx ( E. coli varmelabilt enterotoksin), EtxB ( E. coli varmelabilt enterotoksin, subenhet B), Ctx (koleratoksin) og/eller CtxB (koleratoksin, subenhet B) (ii) dersom middelet skal koadministreres med en antigendeterminant, er middelet og antigendeterminanten ikke bundet på en slik måte at det dannes et enkelt, aktivt middel.

Det farmasøytiske preparat ifølge dette aspekt av oppfinnelsen kan formuleres for og utleveres gjennom slimhinnene, f.eks. som en nesespray, eller parenteralt der preparatet formuleres i en injiserbar form, for f.eks. utlevering intravenøst, intramuskulært eller subkutant.

Det farmasøytiske preparat kan formuleres sammen med det egnede kroppsegne eller kryssreagerende antigen. Det kan alternativt tilveiebringes et sett som omfatter atskilte preparater for det terapeutiske middel og den antigene determinant .

Midlene for anvendelse ved det første aspekt av oppfinnelsen bør fortrinnsvis være hovedsakelig ikke-toksiske, selv om noen grad av toksisitet kan tolereres i en alvorlig terapi av denne type.

Dette første aspekt av foreliggende oppfinnelse omfatter anvendelse av Etx- eller EtxB-protein som et terapeutisk middel i et medikament for behandling av en human autoimmunsykdom. Anvendelsen av EtxB-proteinet (som er en pentamer av fem identiske subenheter) ved en slik behandling, representerer en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen.

T- lymfocyttleukemier

I overensstemmelse med et andre aspekt av oppfinnelsen, tilveiebringes: Anvendelse av et middel for fremstilling av et medikament for anvendelse ved behandling av humane leukemier av en T-celleopprinnelse, slik som humane leukemier av en CD8-T-celleopprinnelse, hvori (i) middelet er Etx ( E. coli varmelabilt enterotoksin, EtxB ( E. coli varmelabilt enterotoksin, subenhet B), Ctx (koleratoksin) og/eller CtxB

(koleratoksin, subenhet B)

(ii) dersom middelet koadministreres med e nantigendeterminant, er middelet og antigen-detereminanten ikke bundet på en slik måte at det dannes et enkelt, aktivt middel.

Midlene for anvendelse i det andre aspekt av foreliggende oppfinnelse bør fortrinnsvis være vesentlig ikke-toksiske, selv om noen grad av toksisitet kan tolereres i en alvorlig terapi av denne type.

Det tilveiebringes også et farmasøytisk preparat for behandling av humane leukemier av en T-celleopprinnelse, hvori;

(i) middelet er Etx ( E. coli varmelabilt enterotoksin, EtxB ( E. coli varmelabilt enterotoksin, subenhet B), Ctx (koleratoksin) og/eller CtxB

(koleratoksin, subenhet B)

(ii) dersom middelet koadministreres med en antigendeterminant, er middelet og antigen-detereminanten ikke bundet på en slik måte at det dannes et enkelt, aktivt middel.

Det farmasøytiske preparat ifølge dette aspekt av oppfinnelsen kan formuleres til og utleveres via slimhinnene, f.eks. som en nesespray, eller parenteralt der preparatet formuleres i en injiserbar form, for utlevering, f.eks. intravenøst, intramuskulært eller subkutant.

Det andre aspekt av oppfinnelsen omfatter anvendelse av Etx eller EtxB-protein som terapeutiske midler i et medikament for behandling av humane T-celleleukemier. Anvendelse av EtxB-proteinet for en slik behandling, representerer en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse.

Transplantasjonsavstøtning og GVHD

I overensstemmelse med et tredje aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes anvendelse av et middel for fremstilling av et medikament for forebyggelse og/eller behandling av transplantatawisning eller GVHD, hvori: (i) middelet er Etx (E.coli varmelabilt enterotoksin) og/eller EtxB { E. coli varmelabilt enterotoksin, subenhet B) (ii) dersom middelet koadministreres med en antigendeterminant, er middelet og antigendeterminanten ikke bundet slik at det dannes et enkelt, aktivt middel.

I foretrukne utførelsesformer av dette aspekt av oppfinnelsen kan de beskrevne terapeutiske midler anvendes ved fremstilling av et medikament for anvendelse ved forebyggelse av transplantasjonsavstøtning av faste organer, enten allogene eller xenogene. De kan også benyttes ved forebyggelse av akutt "graft-versus-host"-sykdom (GVHD), f.eks. under benmargs-plantasjonsprosedyrer.

I utførelsesformer av dette aspekt av oppfinnelsen hvor pasienten behandles før en transplantasjon, vil det terapeutiske middel administreres sammen med alloantigen eller xenoantigen. I utførelsesformer hvori pasienten behandles etter transplantasjon, anvendes det terapeutiske middel uten samtidig administrering av antigen.

I utførelsesformen av dette aspekt av oppfinnelsen, hvor det terapeutiske middel og allo- eller xeno-antigendeterminant administreres sammen til individet, er det søker-ens oppfatning at stedet og tidspunktet for administrering av det terapeutiske middel og den antigene determinant er slik at den nødvendige modulering av immunsystemet oppnås. Selv om det terapeutiske middel og den antigene determinant kan administreres på det samme tidspunkt og det samme sted, kan det således være fordeler ved å administrere det terapeutiske middel på et tidspunkt og et sted som er forskjellig fra den antigene determinant. Separat administrering hvori det terapeutiske middel og den antigene determinant ikke er bundet på denne måte, er foretrukket fordi det muliggjør separat administrering av de forskjellige komponenter.

Selv om enkle doser av det terapeutiske middel og den antigene determinant kan være tilfredsstillende, betraktes administrering av mange doser å ligge innenfor rammen for dette aspekt av oppfinnelsen.

I dette aspekt av oppfinnelsen, hvor midlet anvendes for forebyggelse av GVHD, vil midlet vanligvis ikke administreres direkte til cellene, f.eks. benmargsceller, som skal transplanteres.

Midlet er fortrinnsvis hovedsakelig ikke-toksisk, selv om noen grad av toksisitet kan tolereres i alvorlige terapier av denne type.

Det tilveiebringes også et farmasøytisk preparat omfattende et middel for anvendelse ved behandling av transplantasjonsavstøtning, hvori: (i) middelet er Etx ( E. coli varmelabilt enterotoksin) og/eller EtxB ( E. coli varmelabilt enterotoksin, subenhet B) (ii) dersom middelet koadministreres med en antigendeterminant, er middelet og antigendeterminanten ikke bundet slik at det dannes et enkelt, aktivt middel.

Det farmasøytiske preparat ifølge dette aspekt av oppfinnelsen kan formuleres for og administreres via slimhinnene, f.eks. som en nesespray, eller parenteralt hvori preparatet formuleres i en injiserbar form, for utlevering f.eks. intravenøst, intramuskulært eller subkutant.

Det farmasøytiske preparat kan formuleres sammen med den passende allo- eller xeno-antigene determinant. Alternativt kan det tilveiebringes et sett som omfatter atskilte preparater for det terapeutiske middel og den antigene determinant .

Det tredje aspekt av oppfinnelsen omfatter anvendelse av Etx eller EtxB-protein som et terapeutisk middel i et middel for behandling av en transplantasjonsavstøtning. Anvendelsen av EtxB-proteinet (som er en pentamer av fem identiske subenheter) ved en slik behandling, representerer en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse.

Vaksinasjon

CtxB og EtxB er allerede blitt foreslått som såkalte "vaksinebærere". Det er nå oppdaget at grunnlaget for denne effekt er, delvis, evnen av EtxB til å modulere lymfocyttpopulasjoner (som diskutert ovenfor) ved binding til GM-l-re-septoren.

Midlet er i stand til å modulere immunresponsen når det utleveres sammen med en ubeslektet, fremmed antigendeterminant. Når midlet utleveres parenteralt, uttrykkes en slik immunmodulering slik at immunresponsen blir "dirigert" i en spesielt ønsket retning. Når midlet utleveres via slimhinnene sammen med et ubeslektet antigen, som et såkalt "slimhinne-adjuvans", er midlet i stand til å lette en immunrespons i slimhinnene mot det ubeslektede antigen. Antigenet og midlet kan utleveres sammen som separate komponenter.

Midlet er fortrinnsvis ikke-toksisk. Når dessuten midlet skal utleveres mukosalt gjennom

gastrointestinalslimhinnene, bør det være i stand til å forbli stabilt under gjennomgangen gjennom gastrointestinalkanalen,-det bør f.eks. være resistent mot proteolytisk nedbrytning, stabilt ved sur pH og resistens mot gallens detergerende effekter.

Når det terapeutiske middel ifølge oppfinnelsen er et protein, slik som EtxB-subenheten, kan det produseres for anvendelse i alle aspekter av oppfinnelsen, ved hjelp av en fremgangsmåte hvori genet eller genene som koder for den spesifikke polypeptidkjede (eller kjeder) som proteinet er dannet fra, innføyes i en egnet vektor som deretter anvendes for å transfektere en egnet vert. Genet som koder for f.eks. polypeptidkjeden fra hvilken EtxB sammensettes, kan f.eks. innføyes i plasmid pMMB68, som deretter anvendes for å transfektere vertceller, slik som Vibrio sp. 60. Proteinet renses og isoleres på kjent måte. Mutante gener som uttrykker aktivt, mutant EtxB-protein, kan deretter produseres ved hjelp av kjente metoder for villtypegenet.

Som angitt tidligere kan midler med GM-1-bindings-aktivitet, slik som spesielt utformede, humaniserte, monoklonale antistoffer, utformes og produseres som beskrevet ovenfor, ved hjelp av fremgangsmåter kjent i teknikken.

I alle aspekter av oppfinnelsen kan midlet med GM1-bindingsaktivitet også være i stand til å kryssbinde GM1-reseptorer. EtxB er ett slikt middel som er i stand til å kryssbinde GM1-reseptorer i kraft av dets pentamere form.

Foreliggende oppfinnelse vil i det etterfølgende bli illustrert med referanse til de medfølgende figurer og eksempler.

Kort beskrivelse av figurene

Fig. 1 representerer en analyse av fysisk-kjemiske egenskaper hos EtxB og en mutant form av EtxB [EtxB(G33D)]; Fig. 2 illustrerer at reseptorbinding av EtxB er essensiell for dens potente immunogene egenskaper in vivo; Fig. 3 illustrerer kinetikken for lymfocyttproliferasjon etter injeksjon av mus med EtxB; Fig. 4 illustrerer at EtxB forårsaker økt aktivering av B-celler; Fig. 5 illustrerer at EtxB forårsaker økt aktivering av CD4<+->T-celler og uttynning av CD8<+->celler. Fig. 6 viser den selektive uttynning av OVA-responderende CD8<+->T-celler ved hjelp av EtxB; Fig. 7 viser at reseptorbinding ved hjelp av EtxB induserer endringer i lymfocyttkjernemorfologi som er karakteristiske for celler som gjennomgår apoptose; Fig. 8 viser EtxB-reseptorformidlet apoptose av CD8<+->T-celler, som målt ved cellesyklusanalyse; Fig. 9a og 9b viser resultatene fra eksperimenter utført for å vise at GM-l-binding ved hjelp av EtxB, inhiberer utviklingen av kollagenindusert artritt i en dyremodell; Fig. 10 viser resultatene fra et eksperiment utført for å illustrere at EtxB, men ikke EtxB(G33D) induserer apoptose i en populasjon av normale, humane, perifere mononukleære blodceller; og Fig. 11 viser resultatene fra et eksperiment som viser at kryssbinding av GM1 fører til apoptose i en del av muse-CTLL-celler.

Detaljert beskrivelse av figurene

Figur 1

Analyse av fysisk- kjemiske egenskaper hos EtxB og EtxB( G33D)

(A) SDS-PAGE-analyse av EtxB eller EtxB(G33D): 5 ug av hvert protein ble analysert under reduserende betingelser i

nærvær av lS-merkaptoetanol med eller uten forhåndsoppvarming. Felt 1, villtype EtxB, uoppvarmet. Felt 2, EtxB(G33D), uopp-varraet. Felt 3; villtype EtxB, oppvarmet ved 95 °C. Felt 4, EtxB(G33D), oppvarmet ved 95 °C. Molekylvektsstandarder (Bio-Rad) er vist på venstre side av figuren.

(B) Bestemmelse av tilsynelatende molekylmasse av EtxB og EtxB(G33D) ved gelfiltreringskromatografi: standard-kurve (sirkler) ble dannet ved anvendelse av, fra øverst til nederst: bovint serumalbumin (66 kDa), hønseeggalbumin

(45 kDa), bovin erytrocytt-karbonanhydrase (29 kDA) og heste-hjerte-cytokrom c (12,4 kDa); EtxB og EtxB(G33D) eluerte med tilsynelatende molekylmasser på hhv. 36 kDa og 38 kDa; Ve = elueringsvolum for proteinet, Vo = "void"-volum for gel-filtreringskolonnen. (C) ELISA for sammenlignende binding av EtxB og EtxB(G33D) til gangliosid GM1: plater ble belagt med GM1,

blokkert og inkubert med 1 ug/ml av enten EtxB eller EtxB(G33D) seriefortynnet (3 ganger) fra 1 ug/ml.

Figur 2

Reseptorbinding av EtxB er essensiell for dens potente immunogene egenskaper in vivo

BALB/c-mus (4 i hver gruppe) ble enten injisert subkutant med EtxB eller EtxB(G33D) i PBS eller gitt proteinet oralt i bikarbonatbuffer. Sera ble analysert 10 dager etter to subkutane injeksjoner (A) eller 1 uke etter 3 orale doser (B), og tarmsekresjoner ble analysert 1 uke etter 3 orale doBer (C). Ingen reaksjon ble påvist i prøver fra kontrollmus (ikke vist). Resultater er uttrykt som gjennomsnittlige IgG-anti-stofftitere i serum, mens IgA i tarmsekresjon er uttrykt som "spesifikk aktivitet" som beskrevet nedenfor.

Figur 3

Kinetikk for lymfocyttproliferasjon

Mus ble injisert intraperitonealt med 30 ug EtxB(G33D) i komplett Preunds adjuvans. MLN ble isolert 10 dager senere og celler ble inkubert i fravær av antigen (åpent kvadrat) eller i nærvær av 80 ug/ml EtxB (fylte triangler) , EtxB(G33D) (åpne triangler) eller de ikke-sammensatte monomere former av EtxB (fylte sirkler) og EtxB(G33D) (åpne sirkler) dannet ved oppvarming ved 95 °C. De siste 6 timer på hver prøveuttaksdag ble cellene pulsert med 1 uCi (<3>H)Thd. Data representerer gjennomsnittlig cpm og SEM for tre brønner.

Figur 4

EtxB forårsaker økt aktivering av B- celler

Mus ble immunisert med EtxB(G33D) i CFA. Celler ble isolert fra MLN 10 dager senere og inkubert i nærvær av 80 ug/ml av enten EtxB eller EtxB(G33D) eller en blanding av 40 ug/ml av hvert protein. Celler ble merket med biotinylert anti-CD25 (7D4) og Phycoerythrin (PE) anti-B220 (Ra3-6D2). Streptavidin-FITC ble anvendt som et sekundært antistoff-konjugat. Kontroller for antistoffene ble også inkludert (ikke vist). Dobbelt strømningscytometrisk analyse ble utført på proli ferasj onsdag 4.

Figur 5

EtxB forårsaker økt aktivering av CD4+ T- celler og uttynning av CD8* T- celler

Immuniseringsprosedyren, celleisoleringen og ut-fordringen in vitro er som beskrevet i forklaringen til fig. 4. For å påvise CD25, ble det anvendt biotinylert anti-CD25 (7D4) og Streptavidin FITC. For å påvise CD4 og CD8, ble det anvendt FITC-merket anti-CD4 (RNRM4-5) og FITC-merket anti-CD8a (53-6,7). Egnede kontroller for antistoffene ble inkludert (ikke vist).

Figur 6

Selektiv uttynning av OVA- responderende CD8*- celler ved hjelp av EtxB

Kulturer av celler fra MLN tatt fra OVA-primede mus, ble etablert i 5 dager, i fravær av antigen eller i nærvær av

OVA + EtxB, OVA + EtxB(G33D) eller OVA alene, i mengder på 100

ug OVA og 40 ug/ml av hver av EtxB eller EtxB(G33D) eller 100

ug OVA alene. Celler ble merket med de følgende rotteantistoffer: FITC-anti-CD4 eller FITC-anti-CD8a og begge ble merket med biotin-anti-CD25 (IL-2Ra), etterfulgt av Streptavidin-phycoerythrin. Ikke-fargede celler eller celler farget med det andre antistoff alene, ble også inkludert som kontroller. Celler ble analysert ved hjelp av FACS (Becton Dickinson). Den høyere økning i andelen av totale celler som er CD25+ i kulturer som inneholder EtxB, sammenlignet med andre behandlinger, skyldes tilstedeværelsen av høyere andeler B-celler som uttrykker denne markør (ikke vist). Skalaen for fluorescensintensitet er log.

Fi gur 7

Reseptorbinding ved hjelp av EtxB induserer endringer i lymfocyttkjernemorfologi som er karakteristiske for celler som gjennomgår apoptose

MLNC omfattende >90 % CD3<+->T-celler og uttømt for makrofager, ble inkubert i 18 t med enten 80 ug/ml EtxB eller 80 ug/ml EtxB(G33D) og farget med akridinorange. Celler ble undersøkt ved konvensjonell eller konfokal fluorescensmikroskopi (Leica TCS 4D). Et representativt mikroskopisk om-råde (x 540) for hver behandling er vist [EtxB, venstre bilde; EtxB(G33D), høyre bilde]. Celler som ble inkubert i fravær av antigen, ga lignende resultater som celler behandlet med EtxB(G33D) (ikke vist).

Figur 8

EtxB- reseptor formidlet apoptose av CD8' f- T- celler, som målt ved cellesyklusanalyse

Mengdeandelen av CD4<+> og CD8<+> SPLTC i sub-G0/Gi-

stadiet av cellesyklusen, ble bestemt ved strømningscytomet-risk analyse av DNA-innholdet etter farging med propidium-

jodid. SPLTC ble isolert fra milten ved negativ seleksjon, som beskrevet ovenfor. Cellene ble behandlet i 18 t med: (a) intet antigen, (b) 80 ug/ml EtxB(G33D) eller (c) 80 ug/ml EtxB og deretter farget med FITC-rotte-anti-CD4 eller FITC-rotte-anti-

CD8a. Cellene ble deretter farget med propidiumjodid. Andelen av celler som ble farget med propidiumjodid ble bestemt ved signalutvelgelse på celler farget med enten anti-CD4- eller anti-CD8-antistoffer. Dette eksperiment er blitt utført på celler, fra hvilke resultatene også er rapportert i fig. 7 og tabell 3.

Eksempler

Eksempel 1

Dette eksempel illustrerer nødvendigheten av GM-1-binding for å indusere forskjellige effekter på lymfocyttpopulasjoner.

Materialer og metoder

Dannelse av en reseptorbindingsmutant av EtxB

En substitusjon fra Gly-33 til Asp ble innført i reseptorbindingssetet av humant EtxB ved anvendelse av plasmid pTRH29, et derivat av fagemidvektoren pBluescript IIKS+, som inneholder genene for A- og B-subenhetene av Etx {Yu, J., Webb, H. & Hirst, T. R. (1992), Molec. Microbiol. 6, 1949-1958). Mutagenese ble utført med et in vitro-oligonukleotid-rettet mutagenesesett (Amersham International) ved anvendelse av enkelttrådet pTRH29 som et templat og et syntetisk oligo-nukleotid (5■-TCTCTTTTATCTGCCATCG-3') (fra det mikroanalytiske anlegg, IAPGR, Cambridge Research Station, US) som den muta-gene primer. Den korrekte substitusjon fra Gly til Asp ble bekreftet ved dideoksysekvensering ved anvendelse av sekvenase II (United States Biochemical Corp.) og det resulterende plasmid ble betegnet pTRH56. Det mutante etxB-gen fra pTRH56 ble utkuttet ved anvendelse av EcoRI- og Spel-restriksjons-enzymer, og innføyd i pMMB68 (Sandkvist, M., Hirst, T. R. & Bagdasarian, M. (1987) J. Bacteriol., 169, 4570-4576) for å gi en bred vertsområde-ekspresjonsvektor, pTRH64, som uttrykker EtxB(G33D).

Antigener

Villtype-EtxB og EtxB(G33D) ble renset fra kultur-supernatanter fra hhv. Vibrio sp. 60 (pMMB68) og ViJbrio sp. 60

(pTRH64), ved anvendelse av en modifikasjon av metoden rapportert av Amin og Hirst [Amin, T., & Hirst, T. R. (1994) Prot. Express, og Purif., 5, 198-204]. Kort beskrevet ble proteiner renset ved diafiltrering og hydrofob interaksjonskromatografi og konsentrert ved hjelp av anionbytterkromatografi. Protein-løsningene ble avsaltet på en PD10-kolonne (Pharmacia, UK) ekvilibrert med fosfatbufret saltløsning (PBS; 10 mM natrium-fosfat, 150 mM NaCl, pH 7,4) og lagret ved -30 °C.

Renheten av EtxB og EtxB(G33D) ble bekreftet ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese. Molekylmassen av de individu-elle monomerer ble bekreftet ved laserdesorpsjonsmasse-spektrometri (Protein Science Facility, University of Kent).

Tilsynelatende molekylmasser for EtxB og EtxB(G33D) ble bestemt ved gelfiltreringskromatografi ved anvendelse av et SMART-system (Pharmacia). Proteiner ble eluert fra en Superdex 75 PC 3.2/30-kolonne i PBS, pH 7,5.

Irreversibel denaturering av B-subenhet-pentamerer for anvendelse i lymfocyttproliferasjonsanalyser (se nedenfor) , ble oppnådd ved å oppvarme proteinene ved 95 °C i 5 min.

Dyr, prøveoppsamling og immuniseringsprotokoller

BALB/c-mus (H-2d; høy respons på EtxB) med alder på 7-12 uker, ble innkjøpt fra Charles River Laboratories og opp-bevart ved dyreavdelingen på universitetet i Kent. Antistoffresponser på EtxB eller EtxB(G33D) ble målt etter subkutan injeksjon av mus med 30 ug protein i PBS, etterfulgt av for-sterkning 10 dager senere. En annen gruppe mus ble gitt den samme proteindose oralt i natriumbikarbonat (50 ug/ml) 3 ganger og med én ukes mellomrom. Kontrollmus ble gitt PBS. Blod ble oppsamlet 10 dager etter den siste subkutane injeksjon eller én uke etter den siste orale tilførsel. Tarmsekresjoner fra levende mus ble isolert i en proteaseinhibitoroppløsning, som beskrevet tidligere [Elson, C. 0., Ealding, W. & Lefko-witz, J. (1984), J. Immunol. Meth., 67, 101-108), én uke etter den siste tilførsel. Prøver ble deretter sonikert og klaret ved sentrifugering (13 226 x g, 10 min, ved 4 °C) .

For de proliferative analyser ble mus injisert intraperitonealt med 30 ug EtxB eller EtxB(G33D) i komplett Freunds adjuvans (CFA) og de mesenteriske lymfeknuter ble isolert 10 dager senere. Uimmuniserte kontrollmus ble også inkludert og deres lymfekjertler ble isolert på lignende måte.

Enzymbundne immunsorbentanalyser ( ELISA)

Binding av EtxB eller EtxB(G33D) til GM1 ble under-søkt ved hjelp av en GM1-ELISA [Amin, T., & Hirst, T. R.

(1994) Prot. Express, og Purif., 5, 198-204].

Sera og tarmsekresjoner ble undersøkt for tilstedeværelse av anti-B-subenhet IgG- og IgA-antistoffer ved hjelp av ELISA, hvori prøver ble applisert på mikrotiterplater (Immulon I, Dynateck, USA) belagt med 5 ug/ml av enten EtxB eller EtxB(G33D) i PBS. Anti-B-subenhet IgA-antistoffer i tarmsekresjonssupernatanter ble ekstrapolert fra en standard-kurve dannet ved å belegge 2 rekker av brønner på hver plate med 1 ug/ml kanin-anti-mus IgA (a-kjedespesifikt; Zymed Lab, USA) i PBS, etterfulgt av tilsetning av 1 ug/ml musemyelom-IgA (MOPC 315, Sigma, USA). For å måle totalt IgA, ble brønner belagt med kanin-antimus-IgA, etterfulgt av tilsetning av tarmsekresjonssupernatanter. Alle prøver ble seriefortynnede. Geit-antimus-IgG (Fc-fragmentspesifikt; Jackson Lab., USA) eller geit-antimus-IgA(a-kjedespesifikt; Sigma)-peroksidase-konjugåt ble fortynnet og tilsatt til alle brønner. Anti-B-subenhet-IgG-titeret med en A450 nm ^ 0,2, ble bestemt. IgA-anti-B-subenhetsresponsen for både EtxB og EtxB(G33D) i tarm-sekres joner ble bestemt som en "IgA-spesifikk aktivitet"

[gjennomsnittlig IgA-anti-B-subenhet (ug/ml)/totalt IgA (ug/ml)].

En ELISA-metode for måling av cytokinnivåer av IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 og IFN-Y ble anvendt, som beskrevet tidligere [Harper, H. M., PhD thesis, University of Bristol

(1995) ]. Kort beskrevet ble mikrotiterplater belagt med rotteantistoffer mot muse-IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 og IFN-y- Plater ble blokkert med 2 % (vekt/volum) bovint serumalbumin. Supernatanter fra kulturmediet ble tilsatt til brønnene og fortynnet ned. Én rekke på hver plate for hvert cytokin inneholdt en standardmengde av rekombinante cytokiner. Platene ble deretter inkubert med 0,5 ug/ml biotinylerte anticytokinmono-klonale antistoffer, etterfulgt av tilsetning av avidin-per-oksidase og 3,3<1>,5,5<1->tetrametylbenziden{TMB)-substrat og av-lest ved A405 nm-

Lymfocyttproliferasj onsanalyse

Mus ble avlivet ved halsdislokasjon, mesenteriske lymfeknuter ble utskåret aseptisk og findelt gjennom et trådnett av rustfritt stål ned i Hanks balanserte saltløsning (HBSS) {Flow Laboratories, Irvine, Renfrewshire, UK). Celler ble vasket ved sentrifugering (500 x g, 10 min, 4 °C) i HBSS og resuspendert i modifisert Eagles medium (Flow) som var tilsatt 20 mM Hepes (Flow), 100 IU penicillin, 100 ug/ml streptomycin, 4 mM L-glutamin (Flow) og 2-merkaptoetanol (komplett medium). Friskt autologt, normalt museserum fra uimmuniserte mus ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 0,5 % (volum/- volum). Kulturer inneholdt 2 x IO<6> levedyktige celler/ml i volumer på enten 2 ml i 24-brønners plater eller 8 ml i 25 cm<3 >flasker (Nunc A/S, Roskilde, Danmark) og ble etablert i nærvær og fravær av antigener som angitt i forklaringen til figurene. Kulturer ble inkubert ved 37 °C i en fuktet atmosfære med 5 % C02 og 95 % luft i 6 dager. På ønskede tidspunkter ble 0,1 ml prøver fjernet fra kulturene og overført til 96 brønners plater med U-bunn (Nunc) og pulsert med 1 uCi/brønn [3H] -Thd (Amersham, U.K.) i 6 t før innhøsting (Mach III hervestring 96 Tomtec, Orange, Conn. USA) og tellet ved hjelp av standard væskescintillasjon 1 450 mikro-6-pluss, LKB-Wallac, Turku, Finland. Det ble likeledes uttatt 0,5 ml supernatant fra kulturer for cytokinanalyse. Celler ble pelletert og supernatantene ble lagret ved -68 °C inntil de ble analysert.

Fenotypisk analyse av dyrkede celler

Dyrkede celler innhøstet på dyrkningsdag 4 ble vasket og levedyktige celler ble isolert på grenseflaten av en HBSS/18 % metrizamidgradient (Nyegaard og Co., Oslo, Norge), etter sentrifugering ved 500 x g i 15 min ved 20 °C. Celler ble vasket to ganger og resuspendert i HBSS inneholdende 0,2 % natriumazid (Sigma) og 10 % normalt rotteserum. De følgende rotteantistoffer (Pharmingen, San Diego, USA) ble anvendt: fluoresceinisotiocyanat(FITC)-merket anti-CD4 (RNRM4-5), FITC-merket anti-CD8 (53-6.7), biotinmerket anti-CD25 (7D4) og Phycoerythrin(PE)-merket anti-B220 (RA3-6D2). For de biotinmerkede antistoffer ble det dessuten anvendt streptavidin-PE eller streptavidin-FITC (Serotech, UK). Alle antistoffer ble fortynnet i HBSS inneholdende azid og anvendt i forutbestemte konsentrasjoner. 200 ul med 2 x 10s celler og 200 ul av hvert av antistoffene ble blandet og inkubert på is i 30 min. Når streptavidin-PE eller FITC-sekundære antistoffer var påkrevd, ble cellene inkubert med disse antistoffer i ytterligere 30 min. Passende kontroller for FITC- og PE-antistoffer ble også inkludert. Celler ble vasket med HBSS og deretter analysert ved hjelp av strømningscytometri (Becton Dickinson).

Resultater

Dannelse og karakterisering av en reseptorbindingsmutant av EtxB

En substitusjon fra Gly til Asp ble innført i B-subenheten av E. coli-varmelabilt enterotoksin ved oligonukleo-tiddirigert mutagenese av EtxB, for å danne en mutant B-subenhet med manglende reseptorgjenkjennelse. Det mutante protein betegnet EtxB(G33D), og villtype EtxB ble renset til homogenitet (se materialer og metoder). Molekylmassen av renset EtxB og EtxB(G33D) ble bestemt ved laserdesorpsjons-massespektrometri. Masser var innen 20 Da fra de teoretiske masser på 11 702 og 11 760 Da for hhv. monomer EtxB og EtxB(G33D). Ved analysering ved hjelp av SDS-PAGE uten forhåndsoppvarming, vandret både villtype EtxB og EtxB(G33D) som atskilte, stabile oligomerer med tilsynelatende molekylvekter på 42 kDa og 56 kDa (hhv. fig. IA, felt 1 og felt 2). Den observerte elektroforetiske mobilitet og SDS-stabilitet av EtxB er en karakteristisk egenskap hos B-subenhet-pentameren [se Sandkvist, M., Hirst, T. R. & Bagdasarian, M. (1987) J. Bacteriol. 169, 4570-4576]. Den langsommere elektroforetiske mobilitet av oligomer EtxB(G33D) skyldes ikke en forskjell i antallet inneholdte B-subenhetsmonomerer, fordi både pentamer EtxB og EtxB(G33D) oppviste lignende retensjonstider når de ble analysert ved hjelp av høyoppløsningsgelfiltrerings-kromatografi. Uoverensstemmelsen mellom den elektroforetiske mobilitet av EtxB(G33D)-oligomeren og vi11type-EtxB, skyldes således sannsynligvis den innførte negativt ladede Asp-rest som forårsaker en reduksjon av SDS-binding og en påfølgende langsommere vandring.

EtxB og EtxB(G33D) ble også sammenlignet med hensyn til deres stabilitet i buffere med lav pH, resistens mot 1,0 mg/ml av enten trypsin eller proteinase K og relativ reaktivitet overfor et panel av anti-B-subenhet-monoklonale og polyklonale antistoffer. I hver av disse tester oppviste EtxB-(G33D) identiske egenskaper med villtype-EtxB. Det konkluderes derfor at en substitusjon fra Gly til Asp i rest 33 i EtxB ikke endrer den oligomere konfigurasjon, SDS, pH eller prot-easestabilitet eller antistoffreaktivitet sammenlignet med villtype-EtxB.

Evnen hos EtxB(G33D) til å bindes til dens reseptor-GM1, ble evaluert ved anvendelse av en GM1-ELISA (fig. 1C). Denne viste en ytterst signifikant reduksjon av mutantens evne til å binde GM1, sammenlignet med villtypeproteinet (> 99 % reduksjon av A450 nm-avlesningen) . I motsetning til villtype-EtxB, ble dessuten EtxB(G33D) ikke bundet til CHO-celler ved undersøkelse ved hjelp av immunfluorescens. Det konkluderes med at EtxB(G33D) mangler evne til å binde GMl-gangliosid, in vi tro og in situ.

Den potente immunogene evne til EtxB in vivo er avhengig av reseptorbinding

Betydningen av reseptorbinding for den immunogene evne til EtxB ble evaluert i mus etter enten oral utlevering

eller subkutan injeksjon av EtxB eller EtxB(G33D) i PBS. Oral utlevering av EtxB resulterte i påvisning av et høyt IgG-antistofftiter i serum og IgA-antistoffaktivitet i tarmsekresjoner (fig. 2). I motsetning til dette ga et lignende regime med oral immunisering med EtxB(G33D), ingen dannelse av noe påvis-bar antistoffaktivitet. EtxB(G33D) induserte en serumanti-stoffrespons etter subkutan injeksjon, selv om responsen var

betydelig lavere sammenlignet med antistoffresponsen mot villtype -EtxB, med >160 gangers reduksjon av det gjennomsnittlige antistofftiter, hhv. 1 050 i forhold til 171 000. Det konklu-

deres med at reseptorbinding av EtxB er essensiell for dens potente immunogene evne in vivo.

Reseptorbinding påvirker ikke omfanget av lymfocyttproliferasjon i nærvær av EtxB eller EtxB( G33D)

Effekten av EtxB eller EtxB(G33D) på lymfocytt-prolif eras jon in vi tro ble undersøkt. Lymfocytter ble isolert fra de popliteale og mesenteriske lymfeknuter (MLN) hos mus som var immunisert med enten EtxB eller EtxB(G33D) og stimulert in vitro med enten protein, eller med et varmedenaturert preparat av EtxB eller EtxB(G33D). Den proliferative respons fra lymfocytter avledet fra de popliteale eller mesenteriske lymfeknuter var lignende. I hvert tilfelle økte proliferasjon overfor proteinpreparatene med økt B-subenhetskonsentrasjon. Et representativt sett av data fra et eksperiment ved anvendelse av MLN er vist i tabell 1. Størrelsen av responsen mot villtype og mutante pentamerer var sammenlignbare, hvilket også var tilfelle for responsen i nærvær av varmedenaturerte villtype- og mutante monomerer. Fig. 3 viser kinetikken for de proliferative responser oppnådd i nærvær av 80 ug/ml av hvert av proteinpreparatene. Reaktivitet var avhengig av tilstedeværelse av antigen og fulgte et lignende mønster i nærvær av hvert protein. Reaktivitet fremgikk tidlig på dyrkningsdag 3, inkorporering av [<3>H]-Thd nådde en topp på dag 4 og avtok deretter. De mindre forskjeller i timingen av toppresponser som fremgår fra fig. 3 ble ikke observert i gjentatte eksperimenter, hvilket viser at de anamnestiske karakteristika til responsene mot EtxB og EtxB(G33D) er sammenlignbare. Det konkluderes med at nivået for stimulering i nærvær av de native proteiner sannsynligvis ikke påvirkes av reseptorbinding eller den innførte mutasjon.

Toksinreseptorbinding forårsaker immunmodulering av B- celler og T- celleundersett

For å undersøke hvorvidt reseptorbinding av EtxB ut-øver noen virkning på populasjonene av lymfoidceller in vitro, ble lymfocytter isolert fra MLN fra mus som var primet intraperitonealt med EtxB(G33D) og deretter stimulert med enten EtxB eller EtxB(G33D) eller en blanding av begge. Det ble dessuten utført et parallelt eksperiment ved anvendelse av MLN-avledede lymfocytter fra mus som var injisert med EtxB, og dette resulterte i vesentlig identiske funn med de oppnådd fra EtxB(G33D)-primede mus.

(i) EtxB forårsaker økt aktivering av B- celler

Effekten av EtxB på B-celler ble undersøkt ved hjelp av ekspresjon av aktiveringsmarkøren CD25 (IL-2Ra) sammen med B-cellemarkøren B220 (CD45R). Som vist i fig. 4 var antallet B-celler i kulturer stimulert med EtxB, 62,9 % av totale celler, av hvilke en høy andel (28,4 %) uttrykte celleaktiver-ingsmarkøren CD25. I motsetning til dette var andelen av B-celler etter stimulering i nærvær av EtxB(G33D) mindre enn halvparten av andelen av villtypen (22,26 %) og færre ble aktivert (5,6 %). For å etablere hvorvidt effektene utvist av EtxB var dominerende, ble celler inkubert i nærvær av en ekvimolar konsentrasjon av EtxB og EtxB(G33D). De strømningscyto-metriske data lignende dataene oppnådd etter stimulering i nærvær av villtype-EtxB alene (med 60,6 % B-celler, av hvilke 26 % ble aktivert). Det konkluderes med at reseptorbindings-egenskapen hos EtxB formidler en økt aktivering av B-celler in vi tro.

(ii) EtxB forårsaker økt aktivering av CD4+- T- celler og fullstendig uttømming av CD8+- T- celler

For å undersøke innvirkningen av B-subenhetsreseptor-binding på T-celler, ble lymfocytter merket med antistoffer mot CD4 eller CD8 sammen med antistoffer mot CD25 (fig. 5). Noen celler ble dessuten separat merket med antistoffer mot CD3-markøren (ikke vist). Andelen av T-celler som uttrykker CD4-markøren når den stimuleres i nærvær av EtxB, var 36,7 %, hvorav en høy andel (32,7 %) ble aktivert. I motsetning til dette var ingen påvisbare CD8<+->T-celler til stede i kulturen inneholdende EtxB.

Som sammenligning var både CD4<+-> og CD8<+->T-celler til stede i kulturen stimulert i nærvær av EtxB(G33D). Slike kulturer inneholdt en stor andel CD4<+->T-celler (66,6 %) , men kun

12 % av disse ble aktivert. Andelen av CD8<+->T-celler som ble påvist i nærvær av EtxB(G33D) var 11,7 % av det totale antall celler, men meget få av disse ble aktivert, hvilket indikeres ved fraværet av CD25-markøren. I nærvær av en blanding som

bestod av en ekvimolar konsentrasjon av EtxB og EtxB(G33D) var dessuten mønsteret for responderende celler lignende mønsteret i nærvær av villtype EtxB alene; med 41,68 % CD4<+->T-celler (av hvilke 28,6 % var CD25+) og ingen påvisbare CD8<+->T-celler

(fig. 5). I alle disse analyser var andelen av celler som ble farget med CD3, tilnærmet like stor som summen av cellene som uttrykker CD4- og CD8-markører. Disse data viser at økningen i aktivering av B- og CD4<+->T-celler og den selektive uttømming av CD8<+->T-celler formidles ved okkupasjon av toksinreseptoren.

Produksjon av cytokiner

For å undersøke hvorvidt effekten av EtxB på lymfocyttpopulasjoner kunne være avhengig av en endring av cytokin-produksjon, ble cellekulturer inkubert med enten EtxB eller EtxB(G33D) og supernatanter ble fjernet på dag 2, 3, 4, 5 og 6 for analyse. Resultatene fra prøver oppsamlet på dag 5, er vist i tabell 2 som er det tidspunkt hvor den maksimale konsentrasjon av cytokiner ble påvist. Både IFN-y og IL-2 ble påvist i supernatantene fra kulturer stimulert i nærvær av EtxB eller EtxB(G33D), selv om de relative nivåer av disse cytokiner varierte. Mediet fra cellene inkubert med villtype-EtxB inneholdt en 3 ganger høyere konsentrasjon av IL-2 og et 1,5 ganger lavere nivå av IFN-y sammenlignet med supernatanter fra kulturer stimulert i nærvær av EtxB(G33D). Til tross for funnet at andre prolifererende T-cellekulturer som reagerer på andre antigener ga høye nivåer av IL-4, IL-5 og IL-10, ble ingen av disse cytokiner påvist i kulturer som var stimulert med EtxB eller EtxB(G33D). Økningen av nivået av IL-2 og re-duksjonen av nivået av IFN-y etter stimulering med EtxB, sammenlignet med EtxB(G33D), avspeiler mest sannsynlig aktiver-ingsstatusen for B- og CD4<+->T-celler. Resultatene indikerer allikevel at den uttalte effekt av villtype-EtxB på CD8<+->T-cellepopulasjonen sannsynligvis ikke formidles av en hoved-endring i cytokinprofilen, som en konsekvens av reseptor-

okkupasj on.

Diskusjon

Disse undersøkelser viser at innføringen av en enkeltpunktsmutasjon (G33D) i reseptorbindingssetet til EtxB forårsaket et betydelig tap av evnen til å binde GM1. Det er viktig at den mutante EtxB(G33D), oppviste identiske fysisk-kjemiske egenskaper med villtype-EtxB med hensyn til konforma-sjon, som påvist ved gelkromatografi, stabilitet i SDS, syre og proteaser. Når de spesifikke antistoffresponser ble målt etter immunisering med enten EtxB eller EtxB(G33D), ble det observert dramatiske forskjeller. Subkutan injeksjon med EtxB(G33D) i mus resulterte i en ytterst signifikant reduksjon av antistofftiteret sammenlignet med villtype (ca >160 ganger) , mens ingen antistoffrespons ble påvist etter oral administrering. Det er mulig at disse forskjeller resulterer fra nedbrytningen av en dominant epitop som enten er involvert i antistoffets gjenkjennelse av molekylet eller stimuleringen av effektive T-cellehjelp for antistoffproduksjon. Det er imidlertid bemerkelsesverdig at substitusjonen fra Gly til Asp ikke hadde noen virkning på gjenkjennelsen av B-subenheten av et panel av spesifikke polyklonale og monoklonale antistoffer. De proliferative antistoffer som ble oppnådd når EtxB eller EtxB(G33D) ble tilsatt til kulturer, var dessuten sammenlignbare uansett hvilke av proteinene som ble anvendt for in vivo-priming; hvilket viser at T-cellereaktiviteten ikke var spesifikk for noen av molekylene. Det konkluderes derfor med at reseptorbinding av EtxB er essensiell for dens potente immunogene egenskaper in vivo.

Betydningen av reseptorbinding for de potente immunogene egenskaper hos EtxB, kan forklares på mange måter. For det første kan binding av B-subenheten i Etx og Ctx til GM1 øke effektiviteten av opptak av disse proteiner, og øke den lokale proteinkonsentrasjon som er tilgjengelig for immunsystemet. Andre klasser av proteiner som er i stand til å bindes til slimhinneoverflater, er funnet å være effektive immunogener [De Aizpura, H. J. & Russell-Jones, G. J. (1988) J. Exp. Med. 167, 440-4 51]. De observerte forskjeller i de immunogene egenskaper hos EtxB og dens mutant etter oral administrering, kan da også skyldes effektivt opptak av EtxB fra tarmhulrommet. De dramatiske forskjeller observert etter par-enteral immunisering (hvor antigen utleveres lokalt i høy konsentrasjon) tyder imidlertid på andre virkninger. Binding av EtxB til GM1 kan f.eks. påvirke effektiviteten av antigen-presenterende celleaktivitet. En slik binding kan forårsake aktivering av klasse II-inneholdende celler, spesielt med hensyn til deres ekspresjon av essensielle kostimulerende molekyler, slik som B7, som er assosiert med den økte antigen-presenterende aktivitet de tilegner seg [Jenkins, M. K. & Johnson, J. G. (1993) Curr. Opin. Immunol. 5, 361-367]. Alternativt kan reseptorbinding ha direkte virkninger på sub-populasjoner av lymfocytter. Et antall observasjoner fra denne undersøkelse tilveiebringer sterkt bevis på at dette virkelig er tilfelle.

Undersøkelsene in vitro demonstrerte at EtxB var i stand til å indusere proliferasjonen av primede lymfeknuteceller. Denne egenskap var ikke avhengig av reseptorbinding fordi responser med lignende anamnestiske karakteristika ble oppnådd ved anvendelse av enten villtype-EtxB, EtxB(G33D) eller varmedenaturerte monomere former av disse proteiner som ikke kan binde GM1. Disse observasjoner er interessante i seg selv, fordi det er bredt rapportert at kommersielle preparater av Ctx og CtxB eller renset rekombinant CtxB er sterkt inhibitoriske av lymfocyttproliferasjon in vitro. Den tilsynelatende uoverensstemmelse kan ha oppstått fra det faktum at tidligere eksperimenter var blitt utført på rensede lymfocytter og hovedsakelig anvendt mitogenstimulerte lymfocyttkulturer (som ikke er klonalt begrensede responser), hvor en forskjellig mekanisme kan være involvert. Observasjonen at proliferasjonen av Con-A-stimulerte lymfocytter virkelig ble inhibert av EtxB, var overensstemmende med dette. Analysene av cellepopulasjoner i kulturer av primede lymfeknuteceller stimulert med enten EtxB eller EtxB(G33D), avslørte imidlertid viktige forskjeller med hensyn til B-celler, så vel som CD4- og CD8-inneholdende T-celler.

B-celler ble påvist etter dyrkning i 4 dager i nærvær av enten EtxB eller EtxB(G33D). Ved sammenligning med EtxB(G33D), ble imidlertid den relative andel av B-celler til-stede i kulturer med EtxB, økt med ca. 100 %. Denne økning var forbundet med ekspresjon av CD25 på en meget høy andel av B-cellene. I det viste eksperiment ble de responderende lymfocytter primet med EtxB(G33D) in vivo. Lignende eksperimenter med celler fra EtxB-immuniserte mus avslørte sammenlignbare resultater. Uansett eventuelle in vivo-effekter forbundet med reseptorbinding, inneholdt således kulturer i nærvær av EtxB en større andel B-celler sammenlignet med kulturer stimulert med EtxB(G33D). Disse effekter på B-celler synes heller ikke å være avhengige, idet minste delvis, av regulering av T-celler, in vitro, fordi resultatene ikke antyder et hovedskift i pro-filen av de påviste cytokiner. Reseptorbinding av EtxB synes derfor, in vitro, å være forbundet med en direkte effekt på B-celler, hvilket fører til proporsjonal ekspansjon av denne populasjon, så vel som deres aktivering. Det er også bemerkelsesverdig at CtxB er blitt vist å øke ekspresjon av MHC klasse II på native B-celler, en egenskap som ikke ble oppvist av en GMl-bindende mutant CtxB(G33E) [Francis, M. L., Ryan, J., Jobling, M. G., Holmes R. K., Moss, J, & Mond J. J. (1992) J. Immunol. 148, 1999-2005]. Resultatene i disse eksperimenter antyder tilstedeværelse av direkte mitogene effekter fra EtxB på antigen-primede B-celler og viser at slike effekter formidles av reseptorbinding.

I tillegg til effektene av EtxB på B-celler i kultur, avslører strømningscytometriske analyser at dette toksoid forårsaket den fullstendige utslettelse av alle påvisbare CD8<+->celler. På nytt ble denne effekt vist å være avhengig av reseptorbinding, fordi denne populasjon av T-celler ikke ble utslettet i kulturer inneholdende EtxB(G33D). Komplett utslettelse av CD8<+->celler i kulturer inneholdende EtxB, ble dessuten observert fra mus immunisert med vi11type-EtxB. Det foreligger tre mulige mekanismer ved hvilken slik effekt kan formidles. 1) Det er kjent at binding av Ctx eller CtxB til GM1 på rotte-MLN-celler induserer "patch"- og "cap"-dannelse [Craig S. W. og Cuatrecasas P. (1975), Proe. Nati. Acad. Sei. USA, Vol 72, a. 3844-3848]. Det er mulig at EtxB-GM1-kom-plekser og andre molekyler, inkludert CD8, blir overført til det indre i denne prosess. En slik prosess ville forhindre strømningscytometrisk påvisning av disse celler ved anvendelse av CD8 som en markør og kan føre til cellenes død pga. det assosierte tap av overflate-TCR-komplekset. Selv om det sist nevnte kan forklare fraværet av CD8<+->T-celler i kulturen, har andre ikke funnet noe tap av TCR-komplekset fra overflaten av human Jarkat T-cellelinje når CtxB ble anvendt [Imboden, J. B., Shoback, D. M., Pattison, G, & Stobo, J. D. (1986) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83, 5673-5677]. Mangel på virkninger som et resultat av "capping" understøttes av det funn at CD3- og CD4-markører ikke ble påvirket. 2) En alternativ mekanisme ville involvere effekter utvist av cytokiner i kultur. I denne undersøkelse ble det påvist både IL-2 og IFN-y- Resultatene antyder imidlertid ikke et hovedskift i cytokinprofilen som ville forklare en slik dramatisk effekt på CD8<+->T-celler. 3) Fravær av CD8<+->T-celler kan skyldes aktiv induksjon av apoptose. Lymfocyttdød ved apoptose kan involvere "capping" som beskrevet ovenfor eller kan formidles i fravær av "capping" ved effekter på signaliseringsforeteelser i cellen. Aktiver-ingsindusert programmert død er avhengig av Ca<2+> og involverer fosfataser og kinaser. Binding av CtxB til lymfocytter er blitt vist å inhibere proteinkinase C-avhengig proliferasjon og induserte en uttalt økning i intracellulært Ca<2+>, tildrag-elser som ikke var forbundet med en økning i CAMP-nivå. Evnen hos EtxB til å utslette CD8<+->, men ikke CD4<+->T-celler, kunne skyldes forskjellige virkninger av signaler forbundet med CD4/CD8-TCR-komplekset, som et resultat av kryssbinding av GM1 på overflaten av disse undersett av lymfocytter. Dette kunne være et resultat av differensiell binding av toksoidet på membranet, som rapportert for CtxB eller alternativt de diffe-rensielle signaleringsmekanismer i CD4<+-> og CD8<+->T-celler.

Ved fullstendig fravær av påvisbare CD8<+->T-celler, økte EtxB andelen av CD4<+->T-celler som ble aktivert, sammenlignet med reseptorbindingsmutanten. Den vesentlige nødvendig-het av CD4<+->T-celler ved respons til Ctx, er blitt vist in vivo. Årsaken til den økte aktivering av dette T-celleundersett er imidlertid uklar. Det er bemerkelsesverdig at CtxB er blitt vist å stimulere DNA-syntese og celledeling i hvilende ikke-transformerte muse-3T3-celler. En selektiv mitogen effekt på CD4<+->T-celler, ble også funnet i nærvær av plantelektiner som bindes til GalS-l-3-3GalNAc, den samme komponent som EtxB bindes til i GM1. Det kan ikke utelukkes muligheten for at EtxB formidler en GMl-bindingsavhengig, direkte effekt på CD4<+->T-celler og forårsaker deres aktivering. Det er imidlertid også mulig at den økte aktivering av CD4<+->T-celler i kulturer inneholdende EtxB er en konsekvens av de beskrevne endringer av B-cellepopulasjonene og CD8<+->T-cellepopulasjonene. B-celleaktivering er kjent å være forbundet med en forhøyelse av deres kompetanse som antigen-presenterende celler for CD4<+->T-celler. CD8<+->T-celler er dessuten bredt forbundet med en regulatorisk rolle i immunreaktivitet både in vivo og in vitro. Deres fjerning fra T-celleproliferative kulturer er blitt assosiert med forlengede og forhøyede nivåer av CD4<+->T-celledeling.

Som en samlet vurdering kan de potente immunogene egenskaper hos EtxB in vivo, som vist i denne undersøkelse, antydes å forekomme som et resultat av dens evne til å øke aktivering av B-celler som utøves ved hjelp av vekstreguler-ende effekter etter binding til GM1. Aktivering av CD4<+->T-celler og evnen hos EtxB til å øke produksjon av IL-2 i kultur in vitro, kan tilveiebringe det nødvendige signal for ytterligere ekspansjon av B-cellekloner. Utslettelse av CD8<+->T-celler ved hjelp av EtxB in vitro i denne undersøkelse, kan også tilveiebringe en annen mekanisme for immunpotensiering in vivo etter systemisk eller oral utlevering, spesielt i lys av involveringen av dette undersett av celler ved undertrykkelse av immunresponsen og ved oral toleranse. I dette henseende har både Ctx og Etx vist å oppheve oral toleranse overfor samtidig tilførte oppløselige proteiner, og andre undersøkelser impli-serte Ctx- og CtxB-utslettelseseffekter på intraepiteliale lymfocytter i tarmen eller "Peyer's patch" for å forklare denne mekanisme. CtxB-inhibitoriske effekter på CD8<+->T-celler in vitro er også vist å forhindre "graft-versus-host"-reaksjon.

Som konklusjon er det blitt vist tilstedeværelse av potente immunmodulerende effekter fra EtxB på antistoffresponsen in vivo og på populasjoner av lymfocytter in vitro. Det er videre blitt demonstrert at disse effekter formidles ved reseptorbinding. Disse funn er også relevante for en for-ståelse av evnen hos Etx og Ctx til å virke som potente adju-vanser og som potensielle proteinbærere for andre antigener og antyder at slike egenskaper avhenger av disse toksoiders evne til å binde gangliosidreseptorer på overflaten av lymfoidceller.

Eksempel 2

Dette eksempel illustrerer at virkningene på CD8-celler eksisterer uten hensyn til antigengjenkjennelse og formidles ved apoptose.

Rekombinante preparater av EtxB og EtxB(G33D) ble fremstilt som i eksempel 1. Begge proteiner var godt karakterisert med hensyn til binding til GM1, binding til et panel av monoklonale og polyklonale antistoffer og forskjellige andre fysisk-kjemiske egenskaper. Ovalbumin (OVA) ble innkjøpt fra Sigma (Poole, UK). Mesenteriske lymfeknuter (MLN) ble isolert fra BALB/c-mus [stamme med høy respons på EtxB (Nashar, T. 0. og Hirst, T. R., 1995. Immunregulatorisk rolle som H-2 og intra-H-2-alleler på antistoffresponser mot rekombinante preparater av B-subenheter av Escherichia coli-varmelabilt enterotoksin (rEtxB) og koleratoksin (rCtxB). Vaccine 13:803.)] 8-10 uker gamle. Mus ble injisert intraperitonealt med 200 ug OVA (Sigma) emulgert i ukomplett Freunds adjuvans (Sigma). MLN ble fjernet 10 dager etter injeksjon og findelt gjennom et trådnett av rustfritt stål ned i HBSS (Flow, Irvine, UK). De isolerte celler ble vasket i HBSS ved sentrifugering (500 g, 10 min, 4 °C) og resuspendert i modifisert Eagles medium (Flow) inneholdende 20 mM HEPES, 100 IU penicillin, 100 ug/ml streptomycin, 4 mM L-glutamin og 5 x 10"s M 2-merkaptoetanol (komplett medium) som ble tilsatt 0,5 %

(volum/volum) friskt autologt museserum. Kulturer inneholdt

2 x IO<6> levedyktige celler/ml i volumer på 2 ml i 24-brønners plater (Nunc, Roskilde, Danmark) og ble etablert i nærvær av 100 ug/ml OVA (omfattende dialysert i komplett medium), enten alene eller med 40 ug/ml EtxB eller EtxB(G33D). Kulturer ble inkubert ved 37 °C i 5 % C02 og 95 % luft i 5 dager. Ved ønskede tidspunkter ble prøver på 0,1 ml fjernet fra kulturene og overført til 96 brønners plate med U-formet bunn (Nunc) og pulsert med 1 uCi/brønn [3H] tymidin (Amersham, UK) i 6 t før innhøsting (Mach III innhøsting 96; Tomtec, Orange, CT) og telling ved hjelp av standard væskescintillasjon (1 450 mikro-S-pluss; LKB-Wallac, Turku, Finland). For strømningscytornet-risk analyse (Becton Dickinson, Erenbodegem-Aalst, Belgia) av T-celler, ble cellene farget med de følgende rotteantistoffer (PharMingen, Cambridge, UK): FITC-merket anti-CD4 (RNRM4-5) eller FITC-anti-CD8a (53-6.7) og med biotinmerket anti-CD25 (IL-2Ra) (7D4), etterfulgt av streptavidin-phycoerythrin. For de biotinmerkede antistoffer ble det dessuten benyttet FITC-merket streptavidin. FACS-analyse av isolerte celler ble ut-ført på toppdagen for proliferasjon (dag 4) som bestemt ved [3H] tymidininkorporering.

For apoptoseanalyser ble friske MLN-celler (MLNC) og milt-T-celler (SPLTC) isolert fra BALB/c-mus, 8-10 uker gamle. MLNC omfattende >90 % CD3<+->T-celler, som bestemt ved strøm-ningscytometrisk analyse, ble inkubert i 2 t i petriskåler (Costar, Cambridge, MA) i komplett medium inneholdende 10 % FCS ved 37 °C i 5 % COa og 95 % luft for å fjerne adherente celler. Den ikke-adherente fraksjon ble deretter pipettert fra, pelletert og vasket to ganger i HBSS før anvendelse. SPLTC ble renset ved negativ seleksjon ved anvendelse av glassperler belagt med normalt museserum, etterfulgt av kanin-antimus-Y-globuliner som beskrevet [Wigzell, H. 1976. Specific affinity fractionation of lymphocytes using glass or plastic bead columns. Scand. J. Immunol. 5: (suppl. 5) 23]. Den utvalgte populasjon av T-celler bestod av >90 % CD3<+>, som bestemt ved strømningscytornetrisk analyse.

CD4<+-> og CD8<+->T-celler ble separert som følger: ikke-adherente MLNC ble merket med rotte-phycoerythrin-antimus-CD4 (4708-02) eller FITC-antimus CD8a (53-6.7) (PharMingen) og ble deretter inkubert med MACS-kolloidale superparamagnetiske mikrokuler konjugert med geit-antirotte-IgG (H + L) F(ab')2

(PharMingen), i overensstemmelse med fabrikantens instruksjon-er. Disse ble applisert på mini-MACS-kolonner (Miltenyi Bio-tec, Bergisch Gladback, Tyskland) for å separere både positivt (>99 % rene) og negativt (>90 % rene) utvalgte populasjoner av CD4- og CD8+-T-celler, som bestemt ved strømningscytornetrisk analyse.

To metoder ble anvendt for kvantifisering av apoptose: i) farging av DNA med akridinorange for å undersøke kjernemorfologi og ii) cellesyklusanalyse etter farging av DNA med propidiumjodid og med enten anti-CD4- eller anti-CD8-anti-stof f er. Kulturer av 2 x 10<6>/ml MLNC, SPLTC og fraksjonerte MLNC ble etablert i komplett medium inneholdende 10 % FCS, i fravær eller nærvær av 80 ug/ml av enten EtxB eller EtxB(G33D) og undersøkt fra 4 til 18 t. Etter inkubasjon ble cellene pelletert, vasket med HBSS og farget med 5 ug/ml akridinorange (Sigma). Tymocytter ble isolert og behandlet i fravær eller nærvær av IO"<7> M deksametason og anvendt som en positiv kontroll for celler som gjennomgår apoptose. Kjernemorfologiske endringer i lymfocytter ble undersøkt ved hjelp av konvensjonell eller konfokal fluorescensmikroskopi (Leica TCS 4D). Andelen av CD4<+-> og CD8<+->SPLTC i sub-Go/Gi-stadiet av cellesyklusen ble bestemt ved strømningscytometrisk analyse av DNA-innholdet, etterfulgt av farging med propidiumjodid som beskrevet (0'Connor, P. M., Jackman, J., Jondle, D., Bhatia, K., Magrath, I. og Kohn, K. W. 1993. Role of p53 tumor suppressor gene i cell cycle arrest and radiosensitivity of Burkitfs lymphoma cell lines. Cancer. Res., 53: 4776). Celler isolert fra 18 t kulturer av SPLTC inkubert alene eller med 40 ug/ml EtxB eller EtxB(G33D), ble farget med FITC-rotte-anti-CD4 eller FITC-anti-CD8a. Fargede celler ble justert til 1 x 10<s>/ml i kald HBSS inneholdende 20 mM HEPES og 0,5 mM EDTA og ble fiksert med kald etanol som ble tilsatt dråpevis. 50 ug/ml propidiumjodid og 40 ug/ml ribonuklease A (fri for DNase) ble tilsatt og cellene ble inkubert ilt ved romtemperatur. Den relative intensitet av DNA-farging med propidiumjodid i CD4-og CD8<+->T-celler, ble bestemt ved signalutvelgelse på celler som samtidig var farget med hvert monoklonalt antistoff.

I eksempel 1 antydet observasjonen at CD8<+->T-celler er fullstendig utslettet fra kulturer av lymfeknuteceller som prolifererer som respons på EtxB, at EtxB utviser en polyklonal effekt på dette T-celle-undersett. For å undersøke hvorvidt slike effekter er avhengige av aktivering av EtxB-responderende celler, ble kulturer etablert fra OVA-primede mus og stimulert med OVA alene eller med OVA pluss enten EtxB eller den mutante EtxB(G33D). Lignende toppnivåer for proliferasjon (dyrkningsdag 4 i hvert tilfelle) ble oppnådd i nærvær av OVA alene, OVA pluss EtxB eller OVA pluss EtxB(G33D)

(hhv. 9734 ± 347, 12 031 ± 135 og 9305 ± 290 cpm.). Det var imidlertid en dramatisk forskjell mellom fordelingen av T-celleundersett i disse kulturer etter 4 dager (fig. 6). Alle kulturer inneholdt CD4<+->T-celler, av hvilke lignende andeler samtidig uttrykte aktiveringsmarkøren CD25. CD8<+->T-celler

kunne imidlertid ikke påvises i kulturer som var inkubert med OVA pluss EtxB, men var tydelig til stede (selv om de ikke var aktivert, som bestemt ved CD25-ekspresjon) i kulturer med OVA pluss EtxB(G33D) eller OVA alene. Dette viser at EtxB induserer utslettelse av CD8<+->T-celler som reagerer på et antigen foruten EtxB. Fraværet av en slik respons mot EtxB(G33D) indikerer dessuten at utslettelsen utløses etter toksoidreseptor-interaksjon. Det ble også observert at tilstedeværelsen av villtype EtxB forårsaket en betydelig økning av andelen av B-celler, av hvilke et stort antall var CD25<*> (ikke vist), hvilket var tidligere funnet for EtxB-responderende kulturer (eksempel 1). Det konkluderes derfor med at reseptorokkupasjon av EtxB utøver inngående immunmodulerende effekter på lymfocytter uansett deres antigenspesifisitet.

Muligheten for at CD8<*->T-celler gjennomgår apoptose når de dyrkes i nærvær av EtxB ble undersøkt. MLNC eller renset SPLTC, fra ikke-primede mus, ble inkubert med EtxB eller EtxB(G33D) og endringer i cellekjernemorfologi etter farging med akridinorange ble registrert i en periode på 4 til 18 t (tabell 3 og fig. 7). Cellemorfologiske endringer ble karakterisert ved tilstedeværelse av kondensasjon av kromatin som resulterer i det lobulære utseende av kjernen (fig. 7). Andre trekk ved cellene, slik som utposing av plasmamembranen og tilstedeværelse av apoptotiske legemer, ble også observert. Disse morfologiske endringer forekom i ca. 1/3 av hvert av cellepreparatene behandlet med EtxB, mens en mye lavere fore-komst ble observert hos celler dyrket med EtxB(G33D) eller uten eksogent antigen (tabell 3) . Fordi CD8<+->T-celler var an-svarlige for -35-40 % av MLNC- og SPLTC-preparatene, kunne uttømming av disse celler forklare den observerte apoptose. For å undersøke hvorvidt dette var tilfelle, ble populasjoner av rensede CD8- og CD4<+->T-celler dyrket i 18 t i nærvær av antigener (tabell 3). Lignende prosentmengder for morfologiske endringer ble indusert i negativt utvalgte populasjoner av CD4<+->T-celler (inneholdende >90 % CD4-inneholdende celler) ved behandling med enten EtxB, EtxB(G33D) eller intet antigen, hvilket indikerte at binding av EtxB til dens reseptor ikke utløser apoptose i dette T-celleundersett. I motsetning til dette oppviste >70 % av de negativt utvalgte CD8<+->T-celler (>90 % rene) morfologiske endringer når de ble dyrket med vi11type-EtxB; mens inkubasjon uten antigen eller med EtxB(G33D) kun forårsaket endringer i 11-19 % av denne T-cellepopulasjon. Tilstedeværelse av et lavt antall kontaminer-ende celler i de anvendte rensede populasjoner (-10 % i hvert tilfelle) kunne dessuten ikke forklare de observerte effekter, fordi mer høyrensede populasjoner inneholdende >99 % CD8-eller CD4<+->T-celler (isolert ved positiv seleksjon) reagerte på EtxB på lignende måte [60 % var apoptotiske i nærvær av EtxB, sammenlignet med 7 % for både behandlinger uten antigen og med EtxB(G33D)] (tabell 3). Apoptose ble påvist i 40 % og 98 % av tymocytter etter 18 t inkubasjon, hhv. i fravær eller nærvær av deksametason.

For å demonstrere at de observerte morfologiske endringer i kulturene var overensstemmende med induksjon av apoptose, ble forekomsten av subdiploid-DNA i kulturer av SPLTC behandlet i 18 t med EtxB, evaluert. Cellene ble under-kastet strømningscytornetrisk analyse etter farging med både propidiumjodid og enten anti-CD8- eller anti-CD4-antistoffer (fig. 8) . Ca. 48 % av CD8<+->T-cellene fra kulturer inkubert med EtxB falt under diploid G0/Gi-toppen for propidiumjodidfarging, hvilket indikerte at de gjennomgikk apoptose (0'Connor, P. M. et al., supra). En liten andel av celler som uttrykker CD4, i

kulturer med EtxB, oppviste også sub-G0/Gi-nivåer av DNA

(-11 %; som kan være et resultat av at en slik høy andel CD8<+->T-celler dør). I motsetning til dette forelå majoriteten av CD4- eller CD8<+->T-celler, dyrket uten antigen eller i nærvær av EtxB (G33D) i G0/Gi-fasen av cellesyklusen, hvor <5 % oppviste apoptose. Konklusjonen er at de observerte kjernemorfologiske endringer og tilstedeværelsen av sub-G0/Gi-nivåer av DNA, i en betydelig del av CD8<+->T-celler behandlet med EtxB, demonstrerer en selektiv apoptose utløst av det koleralignende enterotoksoid. Den manglende evne hos den reseptorbindende mutant, EtxB(G33D), til å indusere lignende effekter, viser at induksjonen av CD8<+->T-celleapoptose er forbundet med dens evne til å bindes til GMl-gangliosid.

Eksempel 3

Grupper på 8 DBA/1 hannmus ble enten ikke behandlet (gruppe A) eller ble injisert med 100 ug bovint kollagen i CPA på dag 0 ved intra-dermal (i.d.) injeksjon i flanken. Kolla-geninjiserte mus ble enten etterlatt ubeskyttet (gruppe B; positiv kontroll) eller det ble gjort forsøk på å forebygge sykdomsutvikling ved i.d. administrering på et sted nær kolla-geninjeksjonsstedet av; 100 ug EtxB i IFA på dag 0 (gruppe C), 100 ug EtxB i IFA på dag 14 (gruppe D) eller 100 ug EtxB(G33D) i IFA på dag 0 (gruppe E). Alle dyr, unntatt dyrene i gruppe A, mottok en forsterkningsdose av kollagen i IFA intradermalt på dag 21 og sykdomsalvorligneten ble vurdert på dag 45 ved å måle tykkelsen av ankelen på bakfoten (eksempel A) eller ved å vurdere svellingen av hver bakfot gjennom en tallskala (skala 0-3 hvor 0 = normal og 3 = maksimal svelling,- eksperiment B) .

De oppnådde resultater er illustrert i fig. 9a og 9b. Disse viser at EtxB, men ikke EtxB(G33D), dramatisk beskytter mus mot utvikling av kollagenindusert artritt.

Eksempel 4a

To separate, humane "buffy coat"-prøver (fra normale, humane bloddonorer) ble anvendt som en kilde for mononukleære celler. Celler ble isolert over Ficoll-pakk og vasket grundig før dyrkning i fravær av antigen eller med 80 ug/ml av enten EtxB eller EtxB(G33D), som angitt. Før dyrkning omfattet cellepopulasjonen hhv. 24 % CD8+, 27 % CD4+ og 27 % CD8+, 22,9 % CD4+, i hver prøve. Etter dyrkning i 18 t ble forekomsten av apoptotiske celler vurdert i prøver av celler farget med akridinorange (som beskrevet i detalj under eksempel 2). De oppnådde resultater er vist i fig. 10; disse illustrerer at EtxB, men ikke EtxB(G33D), induserer apoptose i en populasjon av normale, humane, perifere, mononukleære blodceller.

Eksempel 4b

Muse-T-cellelinjen, CTLL-2, ble dyrket til konfluens og deretter ble cellene vasket før de ble utsådd på nytt ved 1 x 10<6> celler/ml i fravær av antigen eller med 80 ug/ml av enten EtxB eller EtxB(G33D) som angitt. Etter 18 t ble prøver fjernet og prosentdelen av celler som viste tegn på apoptose, ble bestemt ved anvendelse av akridinorange (beskrevet i detalj under eksempel 2). De oppnådde resultater er illustrert i fig. 11. De viser at kryssbinding av GM1 fører til apoptose i en del av muse-CTLL-celler.

Mus ble injisert i.p. med 3 0 ug EtxB(G33D) i komplett Freunds adjuvans (CFA). Mesenteriske lymfeknuter ble isolert 10 dager senere. Celler ble isolert og inkubert i 4 dager i nærvær av EtxB, EtxB(G33D) eller demonterte monomere former av disse proteiner (*) , dannet ved oppvarming ved 95 °C. Proliferasjon ble bestemt ved tilsetning av 1 uCi (<3>H)dThd i de siste 6 t på dag 4. Data representerer gjennomsnittlig cpm og SEM for tre parallelle brønner. Celler isolert fra uimmuniserte mus ga <1 500 cpm (dose 160 ug/ml).

Mus ble injisert med EtxB(G33D) i CFA og mesenteriske lymfeknuteceller ble isolert 10 dager senere. Cellene ble deretter inkubert in vitro med enten EtxB eller EtxB(G33D) og prøver av supernatanter ble analysert for cytokininnhold på dag 5 for celleproliferasjon.

Kjernemorfologiske endringer i fraksjonerte CD4- og CD8<+->T-celler etter 4 eller 18 t inkubasjon i fravær av antigen eller med 80 ug/ml EtxB eller EtxB(G33D), ble undersøkt ved hjelp av fluorescensmikroskopi etter farging med akridinorange. Alle MLN var uttømt for adherente celler. SPLTC ble isolert ved negativ seleksjon i en glasskulekolonne belagt med muse-y-globuliner og kanin-anti-mus som et sekundært antistoff. Fraksjonerte SPLTC ble oppnådd etter merking med rotte-phycoerythrin-anti-mus-CD4 eller FITC-anti-mus-CD8a, som deretter ble inkubert med MACS-kolloidale superparamagnetiske mikrokuler konstruert med geit-antirotte-IgG (H + L) F (ab')a-Disse ble separert ved anvendelse av mini-MACS-kolonner for å oppnå både de positivt (>99 % rene) og negativt (>90 % rene) utvalgte fraksjoner av CD4 og CD8<+->T-celler. Kjernemorfologiske endringer ble undersøkt fra 4 til 18 t i en vilkårlig prøve av 200 celler pr. behandling, som beskrevet i forklaringen til fig. 7. Maksimal prosentmengde av apoptotiske celler forekom etter 18 t. Dataene i parenteser presenterer resultater fra et annet separat eksperiment. Data for MLN og SPLTC er representative for et totalt antall på fire eksperimenter.

<a>Prosentmengde apoptotiske celler.

Claims (13)

1. Anvendelse av et middel for fremstilling av et medikament for forebyggelse og/eller behandling av en autoimmun sykdom eller human T-celleleukemi, hvori: (i) middelet er Etx ( E. coli varmelabilt enterotoksin, EtxB ( E. coli varmelabilt enterotoksin, subenhet B), Ctx (koleratoksin) og/eller CtxB (koleratoksin, subenhet B) (ii) dersom middelet koadministreres med en antigendeterminant, er middelet og antigen-detereminanten ikke bundet på en slik måte at det dannes et enkelt, aktivt middel.

2. Anvendelse ifølge krav l, for forebyggelse og/eller behandling av en autoimmun sykdom.

3. Anvendelse ifølge krav 2, for forebyggelse og/eller behandling av reumatoid artritt, multippel sklerose eller diabetes.

4. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående krav, hvori middelet er EtxB.

5. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående krav, hvori middelet administreres uten koadministrering av et samme eller kryssreagerende antigen.

6. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter et middel for anvendelse ved forebyggelse og/eller behandling av en autoimmun sykdom eller human T-celleleukemi, hvori: (i) middelet er Etx ( E. coli varmelabilt enterotoksin), EtxB ( E. coli varmelabilt enterotoksin, subenhet B), Ctx (koleratoksin) og/eller CtxB (koleratoksin, subenhet B) (ii) dersom middelet skal koadministreres med en antigendeterminant, er middelet og antigendeterminanten ikke bundet på en slik måte at det dannes et enkelt, aktivt middel.

7. Preparat ifølge krav 6, for forebyggelse og/eller behandling av en autoimmun sykdom.

8. Preparat ifølge krav 6 eller 7, for forebyggelse og/eller behandling av reumatoid artritt, multippel sklerose eller diabetes.

9. Preparat ifølge ethvert av kravene 6 til 8, karakterisert ved at middelet er EtxB.

10. Preparat ifølge ethvert av kravene 6 til 9, karakterisert ved at middelet administreres uten koadministrering av det samme eller et kryssreagerende antigen.

11. Sett, karakterisert ved at det omfatter et farmasøytisk middel i overensstemmelse med ethvert av kravene 6 til 9, og separat fra dette, et farmasøytisk preparat omfattende det samme eller en kryssreagerende antigendeterminant .

12. Anvendelse av et middel for fremstilling av et medikament for forebyggelse og/eller behandling av transplantatawisning eller GVHD, hvori: (i) middelet er Etx { E. coli varmelabilt entero- - toksin) og/eller EtxB { E. coli varmelabilt enterotoksin, subenhet B) (ii) dersom middelet koadministreres med en antigendeterminant, er middelet og antigendeterminant en ikke bundet slik at det dannes et enkelt, aktivt middel.

13. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter et middel for anvendelse ved forebyggelse og/eller behandling av transplantatawisning eller GVHD, hvori: (i) middelet er Etx (E.coli varmelabilt enterotoksin) og/eller EtxB ( E. coli varmelabilt enterotoksin, subenhet B) (ii) dersom middelet koadministreres med en antigendeterminant, er middelet og antigendeterminanten ikke bundet slik at det dannes et enkelt, aktivt middel.