DE69633393T2

DE69633393T2 - Mitteln zur behandlung von autoimmunkrankheiten

Info

Publication number: DE69633393T2
Application number: DE69633393T
Authority: DE
Inventors: Andrew Neil Axbridge WILLIAMS; Raymond Timothy Clevedon HIRST; Osman Toufic NASHAR
Original assignee: University of Bristol
Current assignee: TRIDENT PHARMACEUTICALS, INC., BOSTON, MASS., US
Priority date: 1995-07-05
Filing date: 1996-07-05
Publication date: 2005-11-10
Anticipated expiration: 2016-07-06
Also published as: CA2225788A1; RU2203088C2; ES2229276T3; CZ1298A3; JPH11508586A; NZ311762A; GB9513733D0; KR19990028578A; AU724516B2; CZ298670B6; DE69633393D1; PT841939E; PL324424A1; NO319747B1; DK0841939T3; NO980005D0; HU224248B1; EP0841939B1; HUP9900147A2; NO980005L

Description

Die Erfindung betrifft therapeutische Mittel für die Verwendung bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen beim Säuger, insbesondere beim Menschen. Die Erfindung betrifft auch therapeutische Mittel, die bei der Behandlung von humanen Leukämien mit einem T-Zell-Ursprung brauchbar sind, als sogenannte "Impfstoffträger" und als Mittel für die Verwendung bei der Verhinderung von Transplantatabstoßung beim Menschen und Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktion (GvHD).
In einem Artikel mit dem Titel "Morphologic and Functional Alterations of Mucosal T Cells by Cholera Toxin and its B subunit" von Charles O. Elson et al., The Journal of Immunology, 1995, 154, 1032–1040, ist offenbart, daß das Choleratoxin (Ctx) und die CtxB-Untereinheit CD8⁺- und CD4⁺-T-Zellen hemmen.
Es wird auch auf die Veröffentlichung mit dem Titel "Prevention of Acute Graft-Versus-Host Disease by Treatment with a Novel Immunosuppressant" von B. Yankelevich et al., The Journal of Immunology, 1995, 154: 3611–3617, Bezug genommen. Diese identifiziert CtxB als ein Mittel für die Verwendung in der Knochenmarkstransplantation zur Verhinderung von Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktion (GvHD).
Die WO 95/10301 offenbart ein immunologische Toleranz induzierendes Mittel, welches ein schleimhautbindendes Molekül umfaßt, das mit einem spezifischen Tolerogen verknüpft ist.
Wie er hierin verwendet wird, bezeichnet der Begriff "Ctx" das Choleratoxin und "CtxB" die B-Untereinheit des Choleratoxins. In anderen Texten können diese manchmal als "CT" oder "Ct" bzw. "CTB" oder "CtB" angegeben sein. Der Begriff "Etx" bedeutet hierin das E. coli hitzelabile Enterotoxin, und "EtxB" ist die B-Untereinheit von Etx. In anderen Texten können diese manchmal als "LT" oder "Lt" bzw. "LTB" oder "LtB" angegeben sein.
Die Grundlage für alle Gesichtspunkte der vorliegenden Erfindung ist die Erkenntnis, daß EtxB (die reine B-Untereinheit des E. coli hitzelabilen Enterotoxins) an GM1-Gangliosid-Rezeptoren bindet, welche man auf den Oberflächen von Säugerzellen findet, und daß diese Bindung verschiedene Effekte auf Lymphozytenpopulationen auslöst, einschließlich einer spezifischen Abreicherung von CD8⁺-T-Zellen und einer damit einhergehenden Aktivierung von B-Zellen. Diese Effekte sind nicht vorhanden, wenn ein mutantes EtxB-Protein, dem GM1-Bindungsaktivität fehlt, verwendet wird.
Autoimmunkrankheit
Autoimmunität ist der Begriff, der dazu verwendet wird, den Mechanismus zu beschreiben, durch welchen der Körper eine Immunreaktion auf Autoantigene erzeugt.
Gemäß einem ersten Gesichtspunkt der Erfindung wird folgendes bereitgestellt:
die Verwendung eines Mittels bei der Herstellung eines Medikaments für die Verwendung bei der Behandlung oder der Verhinderung einer Autoimmunkrankheit,
wobei das Mittel Etx (E. coli hitzelabiles Enterotoxin), EtxB (E. coli hitzelabiles Enterotoxin, Untereinheit B), Ctx (Choleratoxin) und/oder CtxB (Choleratoxin, Untereinheit B) ist und wobei, wenn das Mittel gemeinsam mit einer antigenen Determinante zu verabreichen ist, dann sind das Mittel und die antigene Determinante nicht so miteinander verknüpft, daß sie ein einzelnes aktives Mittel bilden.
Von Mitteln für eine Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß sie Lymphozytenpopulationen modulieren, was zu der Auslösung von Apoptose in CD8⁺-T-Zellen, der verstärkten Aktivierung von CD4⁺-Zellen und polyklonaler Aktivierung von B-Zellen führt. Es ist wahrscheinlich, daß diese Ereignisse die Immunreaktion in Richtung einer Induktion von mit Th2 einhergehenden Zytokinen verschieben. Diese Reaktionen auf selbst- oder kreuzreagierende Antigene werden dahingehend verstanden, daß sie einen Schutz für bestimmte Autoimmunkrankheiten vermitteln.
In einer ersten Ausführungsform dieses ersten Gesichtspunkts der vorliegenden Erfindung wird das Mittel in einem Verfahren der Behandlung einer Autoimmunerkrankung, welche im Voranschreiten ist, verwendet. In dieser Ausführungsform wird das Mittel einem Patienten mit oder ohne gleichzeitiger Verabreichung eines selbst- oder kreuzreagierenden Antigens verabreicht. Eine Verabreichung des Mittels gemäß dieser Ausführungsform des ersten Gesichtspunkts der Erfindung moduliert die Art der Immunreaktion in Richtung gegen das Autoantigen und weg von der Aktivierung von krankheitsverursachender Inflammation und schützt daher gegen Autoimmunkrankheit.
In einer zweiten Ausführungsform dieses ersten Gesichtspunkts der vorliegenden Erfindung wird das Mittel in einem Verfahren zur "Impfung" eines Säugersubjekts gegen eine Autoimmunerkrankung verwendet, wobei das Mittel mit der selbst- oder kreuzreagierenden antigenen Determinante (oder einer Kombination verschiedener selbst- oder kreuzreagierender antigener Determinanten), die mit der Krankheit einhergehen, gemeinsam verabreicht wird. Auf diese Art und Weise wird die Immunreaktion des Subjekts gegen das Autoantigen oder das kreuzreagierende Antigen von der Aktivierung von Pathogenese weggeführt, was daher gegen eine zukünftige Immunreaktion gegen das Autoantigen schützt.
In diesem ersten Gesichtspunkt der Erfindung werden das therapeutische Mittel und die selbst- oder kreuzreagierende antigene Determinante dem Subjekt gemeinsam verabreicht oder können gemeinsam verabreicht werden. Damit ist gemeint, daß der Ort und die Zeit der Verabreichung von sowohl dem therapeutischen Mittel als auch der antigenen Determinante so sind, daß die erforderliche Modulation des Immunsystems erzielt wird. Obwohl das therapeutische Mittel und die antigene Determinante zum gleichen Zeitpunkt und am gleichen Ort verabreicht werden können, können sich somit Vorteile ergeben, wenn das therapeutische Mittel zu einer anderen Zeit und an einen anderen Ort als die antigene Determinante verabreicht wird.
Obwohl einzelne Dosen des therapeutischen Mittels und der antigenen Determinante zufriedenstellend sein können, werden mehrfache Dosen innerhalb des Umfangs dieses Gesichtspunkts der Erfindung in Erwägung gezogen.
Getrennte Verabreichung, bei welcher das therapeutische Mittel und die antigene Determinante nicht unter Ausbildung eines einzelnen aktiven Mittels miteinander verknüpft sind, ist bevorzugt, weil dies eine getrennte Verabreichung der verschiedenen Reste ermöglicht.
Spezielle Autoimmunkrankheiten, welche mit solch einem Medikament behandelt werden können, sind die Autoimmunkrankheiten, bei denen eine Krankheitserscheinung mit zellvermittelter Immunität einhergeht, wie rheumatoide Arthritis, multiple Sklerose und Diabetes.
Es wird auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die ein Mittel zur Verwendung bei der Behandlung einer menschlichen Autoimmunerkrankung umfaßt, wobei das Mittel Etx (E. coli hitzelabiles Enterotoxin), EtxB (E. coli hitzelabiles Enterotoxin Untereinheit B), Ctx (Choleratoxin) und/oder CtxB (Choleratoxin, Untereinheit B) ist und wobei, wenn das Mittel gemeinsam mit einer antigenen Determinante zu verabreichen ist, dann sind das Mittel und die antigene Determinante nicht so miteinander verknüpft, daß sie ein einzelnes aktives Mittel bilden.
Die pharmazeutische Zusammensetzung dieses Gesichtspunkts der Erfindung kann so formuliert sein, daß sie über einen Schleimhautweg ausgeliefert wird, z. B. als ein Nasenspray, oder parenteral, wobei die Zusammensetzung in einer injizierbaren Form für eine Verabreichung über z. B. einen intravenösen, intramuskulären oder subkutanen Weg formuliert ist.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann zusammen mit dem geeigneten selbst- oder kreuzreagierenden Antigen formuliert sein. Alternativ kann ein Kit bereitgestellt werden, das getrennte Zusammensetzungen jeweils für das therapeutische Mittel und die antigene Determinante umfaßt.
Die Mittel für die Verwendung nach dem ersten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung sollten vorzugsweise im wesentlichen nicht toxisch sein, obwohl ein gewisses Maß an Toxizität in einer heftigen Therapie dieser Art toleriert werden kann.
Der erste Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von Etx- oder EtxB-Protein als ein therapeutisches Mittel in einem Medikament für die Behandlung einer humanen Autoimmunerkrankung. Die Verwendung des EtxB-Proteins (welches ein Pentamer von fünf identischen Untereinheiten ist) für solch eine Behandlung stellt eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar.
T-Lymphozyten-Leukämien
Gemäß einem zweiten Gesichtspunkt dieser Erfindung wird folgendes bereitgestellt:
die Verwendung eines Mittels bei der Herstellung eines Medikaments für die Verwendung bei der Behandlung menschlicher Leukämien mit T-Zell-Ursprung, wie menschliche Leukämien mit einem CD8⁺-T-Zell-Ursprung, wobei das Mittel Etx (E. coli hitzelabiles Enterotoxin), EtxB (E. coli hitzelabiles Enterotoxin, Untereinheit B), Ctx (Choleratoxin) und/oder CtxB (Choleratoxin, Untereinheit B) ist und wobei, wenn das Mittel gemeinsam mit einer antigenen Determinante zu verabreichen ist, dann sind das Mittel und die antigene Determinante nicht so miteinander verknüpft, daß sie ein einzelnes aktives Mittel bilden.
Die Mittel für die Verwendung nach dem zweiten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung sollten vorzugsweise im wesentlichen nicht toxisch sein, obwohl ein gewisses Maß an Toxizität in einer heftigen Therapie dieser Art toleriert werden kann.
Es wird auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die ein Mittel für die Verwendung in der Behandlung menschlicher Leukämien mit einem T-Zell-Ursprung umfassen, wobei das Mittel Etx (E. coli hitzelabiles Enterotoxin), EtxB (E. coli hitzelabiles Enterotoxin, Untereinheit B), Ctx (Choleratoxin) und/oder CtxB (Choleratoxin, Untereinheit B) ist und wobei, wenn das Mittel gemeinsam mit einer antigenen Determinante zu verabreichen ist, dann sind das Mittel und die antigene Determinante nicht so miteinander verknüpft, daß sie ein einzelnes aktives Mittel bilden.
Die pharmazeutische Zusammensetzung dieses Gesichtspunkts der Erfindung kann so formuliert sein, daß sie über einen Schleimhautweg verabreicht wird, z. B. als ein Nasenspray, oder parenteral, wobei die Zusammensetzung in einer injizierbaren Form für eine Verabreichung über z. B. einen intravenösen, intramuskulären oder subkutanen Weg formuliert ist.
Der zweite Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von Etx- oder EtxB-Protein als therapeutisches Mittel in einem Medikament für die Behandlung von humanen T-Zell-Leukämien. Die Verwendung des EtxB-Proteins für solch eine Behandlung stellt eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar.
Transplantatabstoßung und GvHD
Gemäß einem dritten Gesichtspunkt der Erfindung wird folgendes bereitgestellt:
die Verwendung eines therapeutischen Mittels bei der Herstellung eines Medikaments für die Verwendung bei der Verhinderung/Behandlung von Transplantatabstoßung oder GvHD, wobei das Mittel Etx (E. coli hitzelabiles Enterotoxin) oder EtxB (E. coli hitzelabiles Enterotoxin, Untereinheit B) ist und wobei, wenn das Mittel gemeinsam mit einer antigenen Determinante zu verabreichen ist, dann sind das Mittel und die antigene Determinante nicht so miteinander verknüpft, daß sie ein einzelnes aktives Mittel bilden.
In bevorzugten Ausführungsformen dieses Gesichtspunkts der Erfindung können die beschriebenen therapeutischen Mittel bei der Herstellung eines Medikaments für die Verwendung bei der Verhinderung der Abstoßung eines festen Organtransplantats, welches entweder allogen oder xenogen ist, verwendet werden. Sie können auch zur Verhinderung akuter Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktion (GvHD), z. B. bei einem Knochenmarkstransplantationsverfahren, verwendet werden.
In Ausführungsformen dieses Gesichtspunkts der Erfindung, bei denen der Patient vor einer Transplantation behandelt wird, würde man das therapeutische Mittel gemeinsam mit Alloantigen oder Xenoantigen verabreichen. In Ausführungsformen, bei welchen der Patient nach einer Transplantation behandelt wird, wird das therapeutische Mittel ohne eine gemeinsame Verabreichung von Antigen verwendet.
In der Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung, bei welcher dem Subjekt das therapeutische Mittel und eine allo- oder xenoantigene Determinante gemeinsam verabreicht werden, ist gemeint, daß der Ort und die Zeit der Verabreichung von sowohl dem therapeutischen Mittel als auch der antigenen Determinante so sind, daß die erforderliche Modulation des Immunsystems erzielt wird. Obwohl das therapeutische Mittel und die antigene Determinante zur gleichen Zeit und am gleichen Ort verabreicht werden können, können daher Vorteile bestehen, wenn das therapeutische Mittel zu einer anderen Zeit und an einen anderen Ort als die antigene Determinante verabreicht wird. Getrennte Verabreichung, bei welcher das therapeutische Mittel und die antigene Determinante nicht auf diese Weise miteinander verknüpft sind, ist bevorzugt, weil sie eine getrennte Verabreichung der verschiedenen Reste erlaubt.
Obwohl einzelne Dosen des therapeutischen Mittels und der antigenen Determinante zufriedenstellend sein können, werden mehrere Dosen innerhalb des Umfangs dieses Gesichtspunkts der Erfindung in Erwägung gezogen.
Bei diesem Gesichtspunkt der Erfindung, bei dem das Mittel bei der Verhinderung von GvHD eingesetzt wird, würde das Mittel normalerweise direkt auf die zu transplantierenden Zellen, z. B. Knochenmarkszellen, angewendet werden.
Das Mittel ist vorzugsweise nicht toxisch, obwohl ein gewisses Maß an Toxizität bei heftigen Therapien dieser Art toleriert werden kann.
Es wird auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die ein Mittel für die Verwendung bei der Behandlung von Transplantatabstoßung umfaßt, wobei das Mittel Etx (E. coli hitzelabiles Enterotoxin) oder EtxB (E. coli hitzelabiles Enterotoxin, Untereinheit B) ist und wobei, wenn das Mittel gemeinsam mit einer antigenen Determinante zu verabreichen ist, dann sind das Mittel und die antigene Determinante nicht so miteinander verknüpft, daß sie ein einzelnes aktives Mittel bilden.
Die pharmazeutische Zusammensetzung dieses Gesichtspunkts der Erfindung kann so formuliert sein, daß sie über einen Schleimhautweg verabreicht wird, z. B. als ein Nasenspray, oder parenteral, wobei die Zusammensetzung in einer injizierbaren Form für eine Verabreichung über z. B. einen intravenösen, intramuskulären oder subkutanen Weg formuliert ist.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann zusammen mit der geeigneten allo- oder xenoantigenen Determinante formuliert sein. Alternativ kann ein Kit bereitgestellt werden, welches getrennte Zusammensetzungen für jeweils das therapeutische Mittel und die antigene Determinante umfaßt.
Der dritte Gesichtspunkt der Erfindung betrifft die Verwendung von Etx- oder EtxB-Protein als ein therapeutisches Mittel in einem Medikament für die Behandlung einer Transplantatabstoßung. Die Verwendung des EtxB-Proteins (welches ein Pentamer von fünf identischen Untereinheiten ist) für solch eine Behandlung stellt eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar.
CtxB und EtxB wurden bereits als sogenannte "Impfstoffträger" vorgeschlagen. Es wurde nun herausgefunden, daß die Grundlage für diesen Effekt zum Teil die Fähigkeit von EtxB ist, Lymphozytenpopulationen durch Bindung an den GM1-Rezeptor zu modulieren (wie es oben diskutiert wird).
Das Mittel ist in der Lage, die Immunreaktion zu modulieren, wenn es mit einer nicht verwandten, fremden antigenen Determinante ausgeliefert wird. Wenn das Mittel parenteral ausgeliefert wird, ist diese Immunmodulation hinsichtlich der Immunreaktion in einer bestimmten gewünschten Richtung "gerichtet". Wenn das Mittel über die Schleimhaut mit einem nicht verwandten Antigen als einem sogenannten "Schleimhautadjuvans" ausgeliefert wird, ist das Mittel in der Lage, die Schleimhautimmunreaktion auf das nicht verwandte Antigen zu erleichtern. Das Antigen und das Mittel können gemeinsam als getrennte Reste ausgeliefert werden.
Das Mittel ist vorzugsweise nicht toxisch. Darüber hinaus, wenn das Mittel über die Schleimhaut durch die Magen-Darm-Schleimhaut verabreicht werden soll, sollte es in der Lage sein, während des Durchgangs durch den Magen-Darm-Trakt stabil zu bleiben; z. B. sollte es gegen proteolytischen Abbau beständig, bei saurem pH-Wert stabil und gegen die reinigenden Wirkungen von Galle beständig sein.
Wenn das therapeutische Mittel der Erfindung ein Protein ist, wie die EtxB-Untereinheit, kann es für die Verwendung nach allen Gesichtspunkten dieser Erfindung nach einem Verfahren hergestellt werden, bei welchem das Gen oder Gene, welches/welche die spezifische Polypeptidkette (oder die -ketten), aus welcher/welchen das Protein gebildet wird, codiert/codieren, in einen geeigneten Vektor eingesetzt und anschließend zum Transfizieren eines geeigneten Wirts verwendet wird/werden. Zum Beispiel kann das Gen, das die Polypeptidkette codiert, aus welcher das EtxB zusammengesetzt wird, z. B. in das Plasmid pMMB68 eingesetzt werden, welches dann zum Transfizieren von Wirtszellen, wie Vibrio sp. 60, verwendet wird. Das Protein wird in einer per se bekannten Art und Weise gereinigt und isoliert. Mutante Gene, welche aktives mutantes EtxB-Protein exprimieren, können dann nach bekannten Verfahren aus dem Wildtyp-Gen hergestellt werden.
Wie es zuvor ausgeführt wurde, können Mittel mit GM1-Bindungsaktivität, wie speziell ausgestaltete humanisierte monoklonale Antikörper, nach Verfahren, die auf dem Gebiet bekannt sind, entworfen und hergestellt werden, wie es oben erwähnt ist.
In allen Gesichtspunkten der Erfindung kann das Mittel mit GM1-Bindungsaktivität in der Lage sein, GM1-Rezeptoren zu vernetzen. EtxB ist solch ein Mittel, welches in der Lage ist, aufgrund seiner pentameren Form GM1-Rezeptoren zu vernetzen.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die anhängenden Figuren und die folgenden Beispiele erläutert.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 gibt eine Analyse physikochemischer Eigenschaften von EtxB und einer mutanten Form von EtxB (EtxB (G33D)) wieder;
2 zeigt, daß Rezeptorbindung durch EtxB für dessen starke Immunogenizität in vivo wesentlich ist;
3 zeigt die Kinetiken von Lymphozytenproliferation nach Injektion von Mäusen mit EtxB;
4 zeigt, daß EtxB eine verstärkte Aktivierung von B-Zellen verursacht;
5 zeigt, daß EtxB eine verstärkte Aktivierung von CD4⁺-T-Zellen und eine Abreicherung von CD8⁺-Zellen verursacht;
6 zeigt die selektive Abreicherung von auf OVA ansprechende CD8⁺-T-Zellen durch EtxB;
7 zeigt, daß Rezeptorbindung durch EtxB Veränderungen der Lymphozytenkernmorphologieeigenschaft von Zellen, die Apoptose eingehen, auslöst;
8 zeigt durch EtxB-Rezeptor vermittelte Apoptose von CD8⁺-T-Zellen, gemessen durch Zellzyklusanalyse;
9a und 9b zeigen die Ergebnisse von Experimenten, die durchgeführt wurden, um zu zeigen, daß GM1-Bindung durch EtxB die Entwicklung von kollageninduzierter Arthritis in einem Tiermodell hemmt;
10 zeigt die Ergebnisse eines Experiments, das durchgeführt wurde, um zu zeigen, daß EtxB, aber nicht EtxB (G33D) Apoptose in einer Population normaler humaner, peripherer, einkerniger Blutzellen induziert; und
11 zeigt die Ergebnisse eines Experiments, welches zeigt, daß Vernetzung von GM1 zu Apoptose in einem Anteil von Maus-CTLL-Zellen führt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1
Analyse von physikochemischen Eigenschaften von EtxB und EtxB (G33D)

(A) SDS-PAGE-Analyse von EtxB oder EtxB (G33D): 5 μg jedes Proteins wurden unter reduzierenden Bedingungen in der Gegenwart von β-Mercaptoethanol mit oder ohne vorheriges Erhitzen analysiert. Spur 1: Wildtyp-EtxB, nicht erhitzt. Spur 2: EtxB (G33D), nicht erhitzt. Spur 3: Wildtyp-EtxB, erhitzt auf 95°C. Spur 4: EtxB (G33D), erhitzt auf 95°C. Molekulargewichtsstandards (BioRad) sind auf der linken Seite des Feldes gezeigt.
(B) Bestimmung des scheinbaren Molekulargewichts von EtxB und EtxB (G33D) durch Gelfiltrationschromatographie: Eine Standardkurve (Kreise) wurde unter Verwendung von oben nach unten der folgenden hergestellt: Rinderserumalbumin (66 kDa), Hühnereialbumin (45 kDa), Erythrozytencarboanhydrase vom Rind (29 kDa) und Pferdeherzcytochrom c (12,4 kDa). EtxB und EtxB (G33D) eluierten mit scheinbaren Molekulargewichten von 36 kDa bzw. 38 kDa. Ve: Elutionsvolumen des Proteins; Vo: Hohlraumvolumen der Gelfiltrationssäule.
(C) ELISA hinsichtlich vergleichender Bindung von EtxB und EtxB (G33D) an Gangliosid-GM1: Platten wurden mit GM1 beschichtet, blockiert und mit 1 μg/ml von entweder EtxB oder EtxB (G33D), welches in Reihe (3-fach) von 1 μg/ml verdünnt wurde, inkubiert.

2
Rezeptorbindung durch EtxB ist für dessen starke Immunogenizität in vivo wesentlich
BALB/c-Mäuse (4 in jeder Gruppe) wurden entweder mit EtxB oder EtxB (G33D) in PBS s. c. injiziert oder ihnen wurden die Proteine oral in Bicarbonatpuffer gegeben. Seren wurden 10 Tage nach zwei s. c. Injektionen (A) oder 1 Woche nach 3 oralen Dosierungen (B) analysiert, und Darmsekrete wurden 1 Woche nach 3 oralen Dosierungen (C) analysiert. Es wurde keine Reaktion in Proben von Kontrollmäusen festgestellt (nicht gezeigt). Ergebnisse sind als mittlerer IgG-Antikörpertiter in Serum ausgedrückt, wogegen IgA in Darmsekret als "spezifische Aktivität" ausgedrückt ist, wie es nachfolgend beschrieben wird.
3
Kinetiken von Lymphozytenproliferation
Mäuse wurden i. p. mit 30 μg EtxB (G33D) in vollständigem Freund'schem Adjuvans injiziert. MLNs wurden 10 Tage später isoliert, und die Zellen wurden in der Abwesenheit von Antigen (leere Quadrate) oder in der Gegenwart von 80 μg/ml EtxB (ausgefüllte Dreiecke), EtxB (G33D) (leere Dreiecke) oder den auseinandergenommenen monomeren Formen von EtxB (ausgefüllte Kreise) und EtxB (G33D) (leere Kreise), die durch Erhitzen auf 95°C erzeugt wurden, inkubiert. In den letzten 6 Stunden an jedem Probentag wurden die Zellen mit 1 μCi (³H)-Thd gepulst. Die Daten geben mittlere Cpm und SEM von drei Probengefäßen wieder.
4
EtxB verursacht verstärkte Aktivierung von B-Zellen
Mäuse wurden mit EtxB (G33D) in CFA immunisiert. Zellen wurden 10 Tage später von MLN isoliert und in der Gegenwart von 80 μg/ml von entweder EtxB oder EtxB (G33D) oder eines Gemischs von 40 μg/ml von jedem Protein inkubiert. Die Zellen wurden mit biotinyliertem Anti-CD25 (7D4) und Phycoerythrin-(PE)Anti-B220 (Ra3-6D2) markiert. Streptavidin-FITC wurde als ein sekundäres Antikörperkonjugat verwendet. Kontrollen für die Antikörper waren ebenfalls eingeschlossen (nicht gezeigt). Doppelflußzytometrieanalyse wurde am Tag 4 der Proliferation durchgeführt.
5
EtxB verursacht verstärkte Aktivierung von CD4⁺-T-Zellen und Abreicherung von CD8⁺-T-Zellen
Das Immunisierungsverfahren, die Zellisolierung und die in vitro Reizsetzung wurden durchgeführt, wie es in der Beschreibung von 4 angegeben ist. Zur Feststellung von CD25 wurden biotinylierter Anti-CD25 (7D4) und Streptavidin-FITC verwendet. Zur Feststellung von CD4 und CD8 wurden FITC-markierter Anti-CD4 (RNRM4-5) und FITC-markierter Anti-CD8α (53-6.7) verwendet. Geeignete Kontrollen für die Antikörper waren eingeschlossen (nicht gezeigt).
6
Selektive Abreicherung von auf OVA ansprechende CD8⁺-T-Zellen durch EtxB
Kulturen von Zellen von MLN, die von mit OVA immunologisch aktivierten Mäusen genommen waren, wurden für 5 Tage in der Abwesenheit von Antigen oder in der Gegenwart von OVA + EtxB, OVA + Etx (G33D) oder OVA alleine mit 100 μg OVA und 40 μg/ml von jeweils EtxB oder EtxB (G33D) oder 100 μg OVA alleine etabliert. Die Zellen wurden mit den folgenden Rattenantikörpern markiert: FITC-Anti-CD4 oder FITC-Anti-CD8α und beide mit Biotin-Anti-CD25 (IL-2Rα), gefolgt von Streptavidin-Phycoerythrin. Nicht gefärbte Zellen oder Zellen, die mit dem zweiten Antikörper alleine gefärbt wurden, wurden ebenfalls als Kontrollen eingeschlossen. Die Zellen wurden mittels FACS (Becton Dickinson) analysiert. Die höhere Zunahme des Anteils an den gesamten Zellen, welche in Kulturen, die EtxB enthalten, im Vergleich zu anderen Behandlungen CD25+ sind, ist auf das Vorhandensein eines höheren Anteils an B-Zellen zurückzuführen, welche diesen Marker exprimieren (nicht gezeigt). Die Skala der Fluoreszenzintensität ist logarithmisch (log).
7
Rezeptorbindung durch EtxB induziert Veränderungen in der Lymphozytenkernmorphologiecharakteristik von Zellen, die Apoptose eingehen
MLNC, welche > 90% CD3⁺-T-Zellen umfassen und von Makrophagen abgereichert sind, wurden für 18 Stunden entweder mit 80 μg/ml EtxB oder 80 μg/ml EtxB (G33D) inkubiert und mit Acridin-Orange gefärbt. Die Zellen wurden unter einem herkömmlichen oder einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop untersucht (Leica TCS 4D). Ein repräsentatives Mikroskopfeld (× 540) für jede Behandlung ist gezeigt [EtxB, linkes Feld; EtxB (G33D), rechtes Feld]. Zellen, welche in der Abwesenheit von Antigen inkubiert wurden, lieferten ähnliche Ergebnisse wie solche, die mit EtxB (G33D) behandelt wurden (nicht gezeigt).
8
Durch EtxB-Rezeptor vermittelte Apoptose von CD8⁺-T-Zellen, gemessen durch Zellzyklusanalyse
Der Anteil an CD4⁺- und CD8⁺-SPLTC in der G₀/G₁-Unterstufe des Zellzyklus wurde mittels flußzytometrischer Analyse des DNA-Gehalts nach Färbung mit Propidiumiodid bestimmt. SPLTC wurden durch negative Selektion aus der Milz isoliert, wie es oben beschrieben ist. Die Zellen wurden für 18 Stunden mit (a) keinem Antigen, (b) 80 μg/ml EtxB (G33D) oder (c) 80 μg/ml EtxB behandelt und anschließend mit FITC-Ratte-Anti-CD4 oder FITC-Ratte-Anti-CD8α gefärbt. Die Zellen wurden anschließend mit Propidiumiodid gefärbt. Der Anteil an Zellen, die mit Propidiumiodid ebenfalls gefärbt wurden, wurde durch Ausblenden von Zellen, die entweder mit Anti-CD4- oder Anti-CD8-Antikörpern gefärbt wurden, bestimmt. Dieses Experiment wurde an Zellen durchgeführt, und die Ergebnisse davon sind auch in 7 und Tabelle 3 angegeben.
Beispiele
Beispiel 1
Dieses Beispiel erläutert das Erfordernis von GM1-Bindung für das Induzieren unterschiedlicher Wirkungen auf Lymphozytenpopulationen.
Materialien und Methoden
Erzeugung einer rezeptorbindenden Mutante von EtxB
Eine Gly-33-zu-Asp-Substitution wurde in die Rezeptorbindungsstelle von humanem EtxB unter Verwendung des Plasmids pTRH29, einem Derivat des Phagemid-Vektors pBluescript IIKS+, der die Gene für die A- und B-Untereinheiten von Etx enthält, eingebracht (Yu, J., Webb, H. & Hirst, T. R. (1992), Molec. Microbiol. 6, 1949–1958). Mutagenese wurde mit einem Kit für oligonukleotidgelenkte Mutagenese in vitro (Amersham International) unter Verwendung von einzelstrangigem pTRH29 als eine Matrize und einem synthetischen Oligonukleotid (5'-TCTCTTTTATCTGCCATCG-3') (von der mikroanalytischen Einrichtung, IAPGR, Cambridge Research Station, UK) als mutagener Primer durchgeführt. Die korrekte Mutation von Gly zu Asp wurde durch Didesoxy-Sequenzierung unter Verwendung von Sequenase II (United States Biochemical Corp.) bestätigt, und das erhaltene Plasmid wurde mit pTRH56 bezeichnet. Das mutante etxB-Gen von pTRH56 wurde unter Verwendung der Restriktionsenzyme EcoRI und SpeI ausgeschnitten und in pMMB68 (Sandkvist, M., Hirst, T. R. & Bagdasarian, M. (1987) J. Bacteriol. 169, 4570–4576) unter Erhalt eines Expressionsvektors für einen breiten Wirtsbereich, pTRH64, welcher EtxB (G33D) exprimiert, eingesetzt.
Antigene
Wildtyp-EtxB und EtxB (G33D) wurden aus Kulturüberständen von Vibrio sp. 60 (pMMB68) bzw. Vibrio sp. 60 (pTRH64) unter Verwendung einer Modifikation des von Amin und Hirst beschriebenen Verfahrens (Amin, T. & Hirst, T. R. (1994) Prot. Express. and Purif. 5, 198–204) gereinigt. Kurz gefaßt wurden Proteine durch Diafiltration und hydrophobe Wechselwirkungschromatographie gereinigt und durch Anionenaustauschchromatographie konzentriert. Die Proteinlösungen wurden an einer PD10-Säule (Pharmacia, UK), die mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS; 10 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,4) äquilibriert war, entsalzt und bei –30°C gelagert.
Die Reinheit von EtxB und EtxB (G33D) wurde durch SDS-Polyacrylamidgelelektroforese bestätigt. Die Molekulargewichte der einzelnen Monomere wurden durch Laserdesorptionsmassenspektrometrie bestätigt (Protein Science Facility, University of Kent).
Scheinbare Molekulargewichte von EtxB und EtxB (G33D) wurden durch Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung eines SMART-Systems (Pharmacia) bestimmt. Proteine wurden von einer Superdex 75 PC 3.2/30-Säule in PBS, pH 7,5, eluiert.
Irreversible Denaturierung von B-Untereinheit-Pentameren für die Verwendung in Lymphozytenproliferationstests (siehe unten) wurde durch Erhitzen der Proteine auf 95°C für 5 Minuten erreicht.
Tiere, Probennahme und Immunisierungsprotokolle
BALB/c-Mäuse (H-2^d; starke Responder auf EtxB) im Alter von 7–12 Wochen wurden von den Charles River Laboratorien erhalten und im Tierhaus der University of Kent gehalten. Antikörperreaktionen auf EtxB oder EtxB (G33D) wurden nach s. c. Injektion von Mäusen mit 30 μg Protein in PBS, gefolgt von Auffrischungsimpfung 10 Tage später, gemessen. Einer anderen Gruppe von Mäusen wurde die gleiche Proteindosis oral in Natriumbicarbonat (50 μg/ml) bei 3 Gelegenheiten und in Intervallen von einer Woche gegeben. Kontrollmäusen wurde PBS gegeben. Blut wurde 10 Tage nach der letzten s. c. Injektion oder eine Woche nach der letzten oralen Gabe genommen. Darmsekretionen von lebenden Mäusen wurden eine Woche nach der letzten Gabe in einer Proteaseinhibitorlösung isoliert, wie es zuvor beschrieben wurde (Elson, C. O., Ealding, W. & Lefkowitz, J. (1984) J. Immunol. Meth. 67, 101–108). Die Proben wurden anschließend ultraschallbehandelt und durch Zentrifugation (13.226 × g, 10 Min. bei 4°C) geklärt.
Für die proliferativen Tests wurden Mäuse i. p. mit 30 μg EtxB oder EtxB (G33D) in vollständigem Freund'schem Adjuvans (CFA) injiziert und die mesenterialen Lymphknoten 10 Tage später isoliert. Nicht immunisierte Kontrollmäuse wurden ebenfalls eingeschlossen und ihre Lymphknoten in einer ähnlichen Art und Weise isoliert.
Enzymgekoppelte Immunosorbenttests (ELISAs)
Die Bindung von EtxB oder EtxB (G33D) an GM1 wurde mittels eines GM1-ELISA untersucht (Amin, T. & Hirst, T. R. (1994) Prot. Express. and Purif. 5, 198–204).
Seren und Darmsekretionen wurden hinsichtlich des Vorhandenseins von Anti-B-Untereinheit-IgG- und -IgA-Antikörpern mittels ELISAs, in welchen Proben auf Mikrotiterplatten aufgebracht wurden (Immulon I, Dynateck, USA), welche mit 5 μg/ml von entweder EtxB oder EtxB (G33D) in PBS beschichtet waren, untersucht. Anti-B-Untereinheit-IgA-Antikörper in Darmsekretionsüberständen wurden anhand einer Standardkurve extrapoliert, die durch Beschichten von zwei Reihen von Näpfen auf jeder Platte mit 1 μg/ml Kaninchen-Anti-Maus-IgA (α-Ketten-spezifisch; Zymed Lab, USA) in PBS, gefolgt von der Zugabe von 1 μg/ml Maus-Myelom-IgA (MOPC 315, Sigma, USA) hergestellt wurden. Zum Messen von Gesamt-IgA wurden Näpfe mit Kaninchen-Anti-Maus-IgA beschichtet, gefolgt von der Zugabe von Darmsekretionsüberständen. Alle Proben wurden in Reihe verdünnt. Ziege-Anti-Maus-IgG-(Fc-Fragment-spezifisch; Jackson Lab., USA) oder Ziege-Anti-Maus-IgA-(a-Ketten-spezifisch; Sigma)Peroxidase-Konjugate wurden verdünnt und zu allen Näpfen hinzugefügt. Der Anti-B-Untereinheit-IgG-Titer, welcher eine A_450nm ≥ 0,2 lieferte, wurde bestimmt. Die IgA-Anti-B-Untereinheit-Reaktion wurde jeweils für EtxB und EtxB (G33D) in Darmsekretionen als "IgA-spezifische Aktivität" berechnet [Mittelwert der IgA-Anti-B-Untereinheit (μg/ml)/Gesamt-IgA (μg/ml)].
Es wurde ein ELISA-Verfahren zum Messen der Zytokinmengen von IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 und IFN-γ verwendet, wie es zuvor beschrieben wurde (Harper, H. M., Doktorarbeit, University of Bristol (1995)). Kurzgefaßt wurden Mikrotiterplatten mit Antikörpern der Ratte gegen Maus-IL-2, -IL- 4, -IL-5, -IL-10 und -IFN-γ beschichtet. Die Platten wurden mit 2% (w/v) Rinderserumalbumin blockiert. Überstände von Kulturmedien wurden zu den Näpfen hinzugefügt und verdünnt. Eine Reihe auf jeder Platte für jedes Zytokin enthielt eine Standardmenge an rekombinanten Zytokinen. Die Platten wurden dann mit 0,5 μg/ml biotinylierten monoklonalen Anti-Zytokin-Antikörpern inkubiert, gefolgt von der Zugabe von Avidin-Peroxidase und 3,3',5,5'-Tetramethylbenziden-(TMB-)Substrat, und bei A_405nm gelesen.
Lymphozytenproliferationstest
Mäuse wurden durch Zervixdislokation getötet, mesenteriale Lymphknoten wurden aseptisch herausgeschnitten und durch ein Edelstahlsieb in Hank'sche ausgeglichene Salzlösung (HBSS) (Flow Laboratories, Irvine, Renfrewshire, UK) zerkleinert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (500 × g, 10 Min., 4°C) in HBSS gewaschen und in modifiziertem Eagle-Medium (Flow), zu welchem 20 mM Hepes (Flow), 100 IU Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 4 mM L-Glutamin (Flow) und 2-Mercaptoethanol hinzugefügt worden waren (vollständiges Medium), resuspendiert. Frisches autologes, normales Mausserum von nicht immunisierten Mäusen wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,5% (v/v) hinzugefügt. Die Kulturen enthielten 2 × 10⁶ lebende Zellen/ml entweder in Volumina von 2 ml in 24-Napf-Platten oder Volumina von 8 ml in 25 cm³ Flaschen (Nunc A/S, Roskide, Dänemark) und wurden in der Gegenwart oder Abwesenheit von Antigenen etabliert, wie es in den Figurenbeschreibungen angegeben ist. Die Kulturen wurden bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO₂ und 95% Luft für 6 Tage inkubiert. Zu gewünschten Zeitpunkten wurden Proben von 0,1 ml von den Kulturen abgenommen und auf 96-Napf-Platten mit U-förmigem Boden (Nunc) überführt und mit 1 μCi/Napf von [³H]-Thd (Amersham, UK) für 6 Stunden gepulst, bevor sie geerntet (Mach III Harvesting 96 Tomtec, Organe, Conn., USA) und durch Standard-Flüssigszintillation (1450 Micro β plus, LKB-Wallac, Turku, Finnland) ausgezählt wurden. In ähnlicher Weise wurden 0,5 ml Überstand von Kulturen für die Zytokinanalyse als Proben genommen. Die Zellen wurden pelletiert und die Überstände bei –68°C gelagert, bis sie analysiert wurden.
Phänotypanalyse von kultivierten Zellen
Kultivierte Zellen, die am Tag 4 der Kultur geerntet wurden, wurden gewaschen, und lebende Zellen wurden an der Grenzfläche eines Gradienten von HBSS/18% Metrizamid- (Nyegaard und Co., Oslo, Norwegen) gewonnen, gefolgt von Zentrifugation bei 500 × g für 15 Min. bei 20°C. Die Zellen wurden zweimal gewaschen und in HBSS, welches 0,2% Natriumazid (Sigma) und 10% normales Rattenserum enthielt, resuspendiert. Die folgenden Antikörper der Ratte (Pharmingen, San Diego, USA) wurden verwendet: mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) markierte Anti-CD4 (RNRM4-5), mit FITC markierte Anti-CD8 (53-6.7), mit Biotin markierte Anti-CD25 (7D4) und mit Phycoerythrin (PE) markierte Anti-B220 (RA3-6D2). Zusätzlich wurde für die mit Biotin markierten Antikörper Streptavidin-PE oder Streptavidin-FITC (Serotech, UK) verwendet. Alle Antikörper wurden in HBSS, welches Azid enthielt, verdünnt und in vorher bestimmten Konzentrationen verwendet. 200 μl von 2 × 10⁶ Zellen und 200 μl von jedem der Antikörper wurden gemischt und auf Eis für 30 Min. inkubiert. Wenn sekundäre Streptavidin-PE- oder -FITC-Antikörper benötigt wurden, wurden die Zellen mit diesen Antikörpern für weitere 30 Min. inkubiert. Geeignete Kontrollen für FITC- und PE-Antikörper wurden ebenfalls eingeschlossen. Die Zellen wurden mit HBSS gewaschen und anschließend mittels Flußzytometrie analysiert (Becton Dickinson).
Ergebnisse
Erzeugung und Charakterisierung einer rezeptorbindenden Mutante von EtxB
Eine Substitution von Gly zu Asp wurde in die B-Untereinheit von E. coli hitzelabilem Enterotoxin durch oligonukleotidgesteuerte Mutagenese von EtxB eingebracht, um eine mutante B-Untereinheit zu erzeugen, die hinsichtlich Rezeptorerkennung defekt war. Das mutante Protein, welches als EtxB (G33D) bezeichnet wurde, und Wildtyp-EtxB wurden zur Homogenität gereinigt (siehe Materialien und Methoden). Die Molekulargewichte von gereinigtem EtxB und EtxB (G33D) wurden mittels Laserdesorptionsmassenspektrometrie bestimmt. Die Massen lagen innerhalb von 20 Da der theoretischen Massen von 11702 und 11760 Da für monomeres EtxB bzw. EtxB (G33D). Wenn sie mittels SDS-PAGE ohne vorheriges Erhitzen analysiert wurden, wanderten sowohl Wildtyp-EtxB als auch EtxB (G33D) als diskrete stabile Oligomere mit scheinbaren Molekulargewichten von 42 kDa bzw. 56 kDa (1A, Spur 1 bzw. Spur 2). Die beobachtete elektroforetische Mobilität und die SDS-Stabilität von EtxB ist eine charakteristische Eigenschaft des Pentamers der B-Untereinheit (siehe Sandkvist, M., Hirst, T. R. & Bagdasarian, M. (1987) J. Bacteriol. 169, 4570–4576). Die langsamere elektroforetische Mobilität von oligomerem EtxB (G33D) ist nicht auf einen Unterschied in der Anzahl an einzelnen Monomeren der B-Untereinheit zurückzuführen, da sowohl pentameres EtxB als auch EtxB (G33D) ähnliche Retentionszeiten zeigten, wenn sie mittels hochauflösender Gelfiltrationschromatographie analysiert wurden. Daher ist der Unterschied in der elektroforetischen Mobilität des EtxB(G33D)-Oligomers in Bezug auf Wildtyp-EtxB wahrscheinlich auf den eingebrachten negativ geladenen Asp-Rest zurückzuführen, welcher eine Verminderung der SDS-Bindung und eine anschließende langsamere Wanderung verursacht.
EtxB und EtxB (G33D) wurden auch hinsichtlich ihrer Stabilität in Puffern mit niedrigem pH-Wert, Beständigkeit gegen 1,0 mg/ml von entweder Trypsin oder Proteinase K und ihrer relativen Reaktivität gegenüber einer Reihe von monoklonalen und polyklonalen Anti-B-Untereinheit-Antikörpern verglichen. In jedem dieser Tests zeigte EtxB (G33D) identische Eigenschaften wie Wildtyp-EtxB. Es wird daher geschlußfolgert, daß eine Substitution von Gly zu Asp am Rest 33 in EtxB nicht die oligomere Konfiguration, die SDS-, pH-Wert- oder Protease-Stabilität oder die Antikörperreaktivität im Vergleich mit Wildtyp-EtxB verändert.
Die Fähigkeit von EtxB (G33D), an seinen Rezeptor GM1 zu binden, wurde unter Verwendung eines GM1-ELISA untersucht (1C). Dies zeigte eine hochgradig signifikante Verminderung in der Fähigkeit der Mutante, GM1 zu binden, verglichen mit dem Wildtyp-Protein (> 99% Reduzierung in dem A_450nm-Wert). Darüber hinaus versagte EtxB (G33D) im Gegensatz zu Wildtyp-EtxB dahingehend, an CHO-Zellen zu binden, wenn es mittels Immunfluoreszenz untersucht wurde. Es wird daraus geschlußfolgert, daß EtxB (G33D) in seiner Fähigkeit, GM1-Gangliosid in vitro und in situ zu binden, defekt ist.
Die starke Immunogenizität von EtxB in vivo ist von Rezeptorbindung abhängig
Die Bedeutung von Rezeptorbindung für die Immunogenizität von EtxB wurde in Mäusen nach entweder oraler Verabreichung oder s. c. Injektion von EtxB oder EtxB (G33D) in PBS bestimmt. Orale Verabreichung von EtxB führte zur Feststellung eines hohen IgG-Antikörpertiters im Serum und IgA-Antikörperaktivität in Darmsekretionen (2). Im Gegensatz dazu erzeugte eine ähnliche Vorschrift der oralen Immunisierung mit EtxB (G33D) keine feststellbare Antikörperaktivität. EtxB (G33D) induzierte eine Serumantikörperreaktion nach s. c. Injektion, obwohl die Reaktion beträchtlich niedriger war im Vergleich zu der Antikörperreaktion gegen Wildtyp-EtxB mit einer > 160-fachen Reduzierung des mittleren Antikörpertiters, 1050 gegenüber 171000. Es wird daraus geschlußfolgert, daß Rezeptorbindung durch EtxB für dessen starke Immunogenizität in vivo wesentlich ist.
Rezeptorbindung beeinflußt nicht das Ausmaß von Lymphozytenproliferation in der Gegenwart von EtxB oder EtxB (G33D)
Die Wirkung von EtxB oder EtxB (G33D) auf Lymphozytenproliferation in vitro wurde untersucht. Lymphozyten wurden aus den poplitealen und mesenterialen Lymphknoten (MLN) von Mäusen, die entweder mit EtxB oder EtxB (G33D) immunisiert waren, isoliert und in vitro mit jedem Protein oder mit einer hitzedenaturierten Präparation von EtxB oder EtxB (G33D) stimuliert. Die proliferative Reaktion von Lymphozyten, die von den poplitealen Lymphknoten oder den MLN erhalten wurde, war ähnlich. In jedem Fall nahm die Proliferation auf jede der Proteinpräparationen mit zunehmender B-Untereinheit-Konzentration zu. Ein repräsentativer Datensatz von einem Experiment, bei dem MLN verwendet wurden, ist in Tabelle 1 gezeigt. Die Höhe der Reaktion auf Wildtyp- und mutante Pentamere war vergleichbar wie auch diejenige in der Gegenwart von hitzedenaturierten Wildtyp- und mutanten Monomeren. 3 zeigt die Kinetiken der proliferativen Reaktionen, die in der Gegenwart von 80 μg/ml jeder der Proteinpräparationen erhalten wurden. Die Reaktivität war abhängig von der Gegenwart von Antigen und folgte einem ähnlichen Muster in der Gegenwart jedes Proteins. Die Reaktivität war deutlich am Tag 3 der Kultur, wobei die Aufnahme von [³H]-Thd ein Maximum am Tag 4 erreichte und danach abnahm. Die geringen Unterschiede im zeitlichen Verlauf der in 3 deutlichen Maximumantworten wurden in Wiederholungsexperimenten nicht beobachtet, was zeigt, daß die anamnestischen Eigenschaften der Reaktion auf EtxB und EtxB (G33D) vergleichbar sind. Es wird geschlußfolgert, daß die Höhe der Stimulation in der Gegenwart des nativen Proteins wahrscheinlich nicht von Rezeptorbindung oder der eingebrachten Mutation beeinflußt wird.
Toxinrezeptorbindung verursacht Immunmodulation von B-Zellen und Untergruppen von T-Zellen
Um zu untersuchen, ob Rezeptorbindung durch EtxB eine Wirkung auf die Populationen von Lymphoidzellen in vitro ausübt, wurden Lymphozyten von den MLN von Mäusen, die i. p. mit EtxB (G33D) immunologisch aktiviert worden waren, isoliert und anschließend entweder mit EtxB oder EtxB (G33D) oder einem Gemisch von beiden stimuliert. Zusätzlich wurde ein Parallelexperiment durchgeführt, bei dem von MLN hergeleitete Lymphozyten von Mäusen, die mit EtxB injiziert wurden, verwendet wurden, und dies führte zu im wesentlichen identischen Ergebnissen zu denjenigen, die von mit EtxB (G33D) immunologisch aktivierten Mäusen erhalten wurden.
(i) EtxB verursacht verstärkte Aktivierung von B-Zellen
Die Wirkung von EtxB auf B-Zellen wurde durch Expression des Aktivierungsmarkers CD25 (IL-2Rα) gemeinsam mit dem B-Zell-Marker B220 (CD45R) untersucht. Wie es in 4 gezeigt ist, betrug die Anzahl an B-Zellen in Kulturen, die mit EtxB stimuliert wurden, 62,9% der gesamten Zellen, von denen ein hoher Anteil (28,4%) den Zellaktivierungsmarker CD25 exprimierten. Im Gegensatz dazu war der Anteil an B-Zellen nach einer Stimulation in der Gegenwart von EtxB (G33D) weniger als die Hälfte derjenigen beim Wildtyp (22,26%) und es wurden weniger aktiviert (5,6%). Um festzustellen, ob die von EtxB ausgeübten Wirkungen dominant waren, wurden Zellen in der Gegenwart einer äquimolaren Konzentration von EtxB und EtxB (G33D) inkubiert. Die Flußzytometriedaten waren zu denjenigen ähnlich, die man nach einer Stimulation in der Gegenwart von Wildtyp-EtxB alleine erhielt (mit 60,6% B-Zellen, von denen 26% aktiviert wurden). Es wird geschlußfolgert, daß die Rezeptorbindungseigenschaft von EtxB eine verstärkte Aktivierung von B-Zellen in vitro vermittelt.
(ii) EtxB verursacht verstärkte Aktivierung von CD4⁺-T-Zellen und vollständige Abreicherung von CD8⁺-T-Zellen
Zur Untersuchung des Einflusses von B-Untereinheit-Rezeptorbindung an T-Zellen wurden Lymphozyten mit Antikörpern gegen CD4 oder gegen CD8 in Verbindung mit Antikörpern gegen CD25 markiert (5). Zusätzlich wurden einige Zellen getrennt mit Antikörpern gegen den CD3-Marker markiert (nicht gezeigt). Der Anteil an T-Zellen, die den CD4-Marker exprimierten, wenn sie in der Gegenwart von EtxB stimuliert wurden, betrug 36,7%, wovon ein hoher Anteil (32,7%) aktiviert war. Im Gegensatz dazu waren keine feststellbaren CD8⁺-T-Zellen in der Kultur, die EtxB enthielt, vorhanden.
Im Vergleich dazu waren sowohl CD4⁺- als auch CD8⁺-T-Zellen in der Kultur, die in der Gegenwart von EtxB (G33D) stimuliert wurden, vorhanden. Diese Kulturen enthielten einen großen Anteil an CD4⁺-T-Zellen (66,6%), aber nur 12% von diesen waren aktiviert. Der Anteil an CD8⁺-T-Zellen, welche in der Gegenwart von EtxB (G33D) festgestellt wurden, betrug 11,7% der Gesamtzahl an Zellen, aber sehr wenige von diesen waren aktiviert, was durch die Abwesenheit des CD25-Markers angezeigt wird. Darüber hinaus war in der Gegenwart eines Gemischs, das aus einer äqui molaren Konzentration von EtxB und EtxB (G33D) bestand, das Muster von reagierenden Zellen ähnlich zu demjenigen in der Gegenwart von Wildtyp-EtxB alleine mit 41,68% CD4⁺-T-Zellen (von denen 28,6% CD25+ waren) und keinen feststellbaren CD8⁺-T-Zellen (5). In allen diesen Analysen betrug der Anteil an Zellen, die mit CD3 färbten, etwa gleich der Summe von denjenigen, die CD4- und CD8-Marker exprimierten. Diese Daten zeigen, daß die Steigerung der Aktivierung von B- und CD4⁺-T-Zellen und die selektive Abreicherung von CD8⁺-T-Zellen durch Toxinrezeptorbesetzung vermittelt werden.
Herstellung von Zytokinen
Um zu untersuchen, ob die Wirkung von EtxB auf Lymphozytenpopulationen von einer Veränderung der Zytokinherstellung abhängig sein könnte, wurden Zellkulturen entweder mit EtxB oder EtxB (G33D) inkubiert und Überstände an den Tagen 2, 3, 4, 5 und 6 für eine Analyse abgenommen. Die Ergebnisse von Proben, die am Tag 5 genommen wurden, an dem die maximale Konzentration an Zytokinen festgestellt wurde, sind in Tabelle 2 gezeigt. Sowohl IFN-γ als auch IL-2 wurden in den Überständen von Kulturen, die in der Gegenwart von EtxB oder EtxB (G33D) stimuliert wurden, festgestellt, obwohl die relativen Mengen dieser Zytokine variierten. Das Medium von Zellen, die mit Wildtyp-EtxB inkubiert wurden, enthielt eine 3-fach höhere Konzentration an IL-2 und eine 1,5-fach niedrigere Menge an IFN-γ im Vergleich zu Überständen von Kulturen, die in der Gegenwart von EtxB (G33D) stimuliert wurden. Trotz der Beobachtung, daß andere proliferierende T-Zell-Kulturen, die auf andere Antigene reagierten, hohe Mengen an IL-4, IL-5 und IL-10 lieferten, wurde keines dieser Zytokine in Kulturen, die mit EtxB oder EtxB (G33D) stimuliert wurden, festgestellt. Die Zunahme der Menge an IL-2 und die Abnahme der Menge an IFN-γ nach Stimulation mit EtxB im Vergleich zu EtxB (G33D) spiegelt höchstwahrscheinlich den Aktivierungsstatus von B- und CD4⁺-T-Zellen wider. Dennoch zeigen die Ergebnisse, daß die starke Wirkung von Wildtyp-EtxB auf die CD8⁺-T-Zell-Population wahrscheinlich nicht von einer großen Verschiebung des Zytokinprofils als eine Folge von Rezeptorbesetzung vermittelt wird.
Diskussion
Diese Untersuchungen zeigen, daß die Einführung einer einzelnen Punktmutation (G33D) in die Rezeptorbindungsstelle von EtxB einen signifikanten Verlust der Fähigkeit, GM1 zu binden, verursachte. Wichtig ist, daß die Mutante EtxB (G33D) zu dem Wildtyp-EtxB identische physikochemische Eigenschaften in Bezug auf die Konformation, wie es durch Gelchromatographie aufgedeckt wurde, und die Stabilität in SDS, Säure und Proteasen aufwies. Wenn die spezifischen Antikörperreaktionen nach einer Immunisierung mit entweder EtxB oder EtxB (G33D) gemessen wurden, wurden deutliche Unterschiede festgestellt. Subkutane Injektion mit EtxB (G33D) in Mäuse führte zu einem hochgradig signifikanten Abfall des Antikörpertiters im Vergleich zum Wildtyp (ca. > 160-fach), wogegen keine Antikörperreaktion nach oraler Verabreichung festgestellt wurde. Es ist möglich, daß diese Unterschiede von einer Zerstörung eines dominanten Epitops, das entweder an der Erkennung des Moleküls durch Antikörper oder der Stimulation von effektiver T-Zell-Hilfe für eine Antikörperproduktion beteiligt ist. Es ist jedoch erwähnenswert, daß die Substitution von Gly zu Asp keine Wirkung auf die Erkennung der B-Untereinheit durch eine Reihe spezifischer polyklonaler und monoklonaler Antikörper hatte. Darüber hinaus waren die proliferativen Reaktionen, die erhalten wurden, wenn EtxB oder EtxB (G33D) zu Kulturen hinzugefügt wurden, vergleichbar, unabhängig davon, welches dieser Proteine für eine immunologische Aktivierung in vivo verwendet wurde, was zeigt, daß die T-Zell-Reaktivität nicht hinsichtlich eines dieser Moleküle spezifisch war. Es wird daher geschlußfolgert, daß Rezeptorbindung durch EtxB für dessen starke Immunogenizität in vivo wesentlich ist.
Die Bedeutung von Rezeptorbindung für die starke Immunogenizität von EtxB kann auf verschiedene Weisen erklärt werden. Erstens könnte die Bindung der B-Untereinheit von Etx und Ctx an GM1 die Effizienz der Aufnahme dieser Proteine erhöhen, was die für das Immunsystem verfügbare lokale Proteinkonzentration erhöht. Es wurde gefunden, daß andere Klassen von Proteinen, die in der Lage sind, an Schleimhautoberflächen zu binden, wirkungsvolle Immunogene sind (De Aizpura, H. J. & Russell-Jones, G. J. (1988) J. Exp. Med. 167, 440–451). Die beobachteten Unterschiede in der Immunogenizität von EtxB und dessen Mutante nach oraler Verabreichung können tatsächlich von einer effizienten Aufnahme von EtxB von dem Lumen des Darms herrühren. Jedoch lassen die deutlichen Unterschiede, die nach parenteraler Immunisierung festgestellt wurden (bei der Antigen lokal in hoher Konzentration ausgeliefert wird), andere Wirkungen vermuten. Zum Beispiel kann die Bindung von EtxB an GM1 die Effizienz der Aktivität von antigenpräsentierenden Zellen beeinflussen. Diese Bindung könnte eine Aktivierung von Klasse II-tragenden Zellen verursachen, insbesondere in Bezug auf deren Expression von wichtigen co-stimulierenden Molekülen, wie B7, was mit deren Erwerben von erhöhter antigenpräsentierender Aktivität einhergeht (Jenkins, M. K. & Johnson, J. G. (1993) Curr. Opin. Immunol. 5, 361–367). Alternativ könnte Rezeptorbindung direkte Wirkungen auf Unterpopulationen von Lymphozyten haben. Eine Anzahl von Beobachtungen in dieser Studie liefert starke Hinweise darauf, daß dies tatsächlich der Fall ist.
Die in vitro-Studien zeigten, daß EtxB in der Lage war, die Proliferation von immunologisch aktivierten Lymphknotenzellen zu induzieren. Diese Eigenschaft war nicht von Rezeptorbindung abhängig, da Reaktionen mit ähnlichen anamnestischen Eigenschaften unter Verwendung von entweder Wildtyp-EtxB, EtxB (G33D) oder hitzedenaturierten monomeren Formen dieser Proteine, welche GM1 nicht binden können, erhalten wurden. Diese Beobachtungen sind für sich selbst interessant, da weithin beschrieben wurde, daß handelsübliche Präparationen von Ctx und CtxB oder gereinigtes rekombinantes CtxB stark hemmend auf Lymphozytenproliferation in vitro wirken. Die scheinbare Diskrepanz kann von der Tatsache herrühren, daß frühere Experimente an gereinigten Lymphozyten durchgeführt wurden und weitestgehend mitogen stimulierte Lymphozytenkulturen verwendet hatten (was keine auf Klone beschränkte Reaktionen sind), wobei ein anderer Mechanismus beteiligt sein kann. Übereinstimmend damit war unsere Beobachtung, daß die Proliferation von Con-A-stimulierten Lymphozyten tatsächlich durch EtxB gehemmt wurde. Jedoch offenbarten die Analysen von Zellpopulationen in Kulturen von immunologisch aktivierten Lymphknotenzellen, die entweder mit EtxB oder EtxB (G33D) stimuliert wurden, bedeutende Unterschiede in Bezug auf B-Zellen sowie CD4- und CD8-tragende T-Zellen.
B-Zellen wurden nach 4 Tagen Kultur in der Gegenwart von entweder EtxB oder EtxB (G33D) festgestellt. Jedoch war im Vergleich zu EtxB (G33D) der relative Anteil an B-Zellen, die in Kulturen mit EtxB vorhanden waren, um etwa 100% erhöht. Diese Erhöhung ging einher mit der Expression von CD25 bei einem sehr großen Anteil der B-Zellen. In dem gezeigten Experiment waren die reagierenden Lymphozyten in vivo mit EtxB (G33D) immunologisch aktiviert worden. Ähnliche Experimente mit Zellen von mit EtxB immunisierten Mäusen offenbarten ähnliche Ergebnisse. Unabhängig von jeglichen in vivo-Effekten, die mit Rezeptorbindung einhergingen, enthielten somit Kulturen in der Gegenwart von EtxB einen größeren Anteil an B-Zellen im Vergleich mit solchen, die mit EtxB (G33D) stimuliert wurden. Diese Wirkungen auf B-Zellen scheinen auch zumindest zum Teil nicht von einer Regulation durch T-Zellen in vitro abhängig zu sein, da die Ergebnisse keine starke Verschiebung des Profils der festgestellten Zytokine nahelegt. Daher scheint Rezeptorbindung durch EtxB in vitro mit einer direkten Wirkung auf B-Zellen einherzugehen, was zu einer proportionalen Ausdehnung dieser Population sowie deren Aktivierung führt. Es ist auch erwähnenswert, daß von CtxB gezeigt wurde, daß es die Expression von MHC Klasse II an unberührten B-Zellen erhöht, eine Eigenschaft, die eine GM1-bindende Mutante CtxB (G33E) nicht zeigte (Francis, M. L., Ryan, J., Jobling, M. G., Holmes, R. K., Moss, J. & Mond, J. J. (1992) J. Immunol. 148, 1999–2005). Die Ergebnisse in diesen Experimenten legen das Vorhandensein von direkten mitogenen Wirkungen von EtxB auf mit Antigen immunologisch aktivierte B-Zellen nahe und zeigen, daß diese Wirkungen durch Rezeptorbindung vermittelt werden.
Zusätzlich zu den Wirkungen von EtxB auf B-Zellen in Kultur offenbaren flußzytometrische Analysen, daß dieses Toxoid die vollständige Abreicherung jeglicher feststellbarer CD8⁺-Zellen verursacht. Noch einmal, von diesem Effekt wurde gezeigt, daß er von Rezeptorbindung abhängig ist, da diese Population von T-Zellen in Kulturen, die EtxB (G33D) enthielten, nicht abgereichert wurden. Darüber hinaus wurde vollständige Abreicherung von CD8⁺-Zellen in Kulturen, die EtxB enthielten, von Mäusen, die mit Wildtyp-EtxB immunisiert wurden, beobachtet. Es gibt drei mögliche Mechanismen, durch welche solch ein Effekt vermittelt sein könnte. 1) Es ist bekannt, daß Bindung von Ctx oder CtxB an GM1 an Ratten-MLN-Zellen eine Abdeckungs- und Kappenbildung induziert (Craig, S. W. und Cuatrecasas, P. (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 72, Seiten 3844–3848). Es ist möglich, daß bei diesem Vorgang ExtB-GM1-Komplexe und andere Moleküle, einschließlich CD8, internalisiert werden. Solch ein Vorgang würde eine flußzytometrische Feststellung dieser Zellen unter Verwendung von CD8 als ein Marker verhindern und könnte zu deren Tod aufgrund des damit einhergehenden Verlusts des Oberflächen-TCR-Komplexes führen. Obwohl letztgenanntes die Abwesenheit von CD8⁺-T-Zellen in der Kultur begründen könnte, haben andere keinen Verlust des TCR-Komplexes von der Oberfläche der humanen Jarkat-T-Zellinie gefunden, wenn CtxB verwendet wurde (Imboden, J. B., Shoback, D. M., Pattison, G. & Stobo, J. D. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5673–5677). Das Fehlen von Wirkungen infolge von Kappenbildung wird durch die Erkenntnis gestützt, daß CD3- und CD4-Marker nicht beeinflußt wurden. 2) Ein alternativer Mechanismus würde Wirkungen umfassen, die von Zytokinen in Kultur ausgeübt werden. In dieser Studie wurden sowohl IL-2 als auch IFN-γ festgestellt. Die Ergebnisse legen jedoch keine starke Verschiebung des Zytokinprofils nahe, was solch einen dramatischen Effekt auf CD8⁺-T-Zellen erklären würde. 3) Das Fehlen von CD8⁺-T-Zellen könnte auf eine aktive Auslösung von Apoptose zurückzuführen sein. Das Sterben von Lymphozyten durch Apoptose könnte eine Kappenbildung umfassen, wie sie oben beschrieben ist, oder es könnte bei Fehlen von Kappenbildung durch Wirkungen auf die signalisierenden Ereignisse in der Zelle vermittelt werden. Durch Aktivierung eingeleiteter programmierter Tod ist von Ca²⁺ abhängig und involviert Phosphatasen und Kinasen. Von einer Bindung von CtxB an Lymphozyten wurde gezeigt, daß sie von Proteinkinase C abhängige Proliferation hemmt und eine verstärkte Erhöhung von intrazellulärem Ca²⁺ auslöste, Ereignisse, die nicht mit einer Erhöhung der CAMP-Menge einhergingen. Die Fähigkeit von EtxB, CD8⁺-, aber nicht CD4⁺-T-Zellen abzureichern, könnte auf unterschiedliche Wirkungen von Signalen, die mit dem CD4/CD8-TCR-Komplex einhergehen, zurückzuführen sein, welche aus einer Vernetzung von GM1 auf der Oberfläche dieser Untergruppe von Lymphozyten resultieren. Dies könnte eine Folge von unterschiedlicher Bindung des Toxoids an der Membran sein, wie es für CtxB beschrieben wurde, oder alternativ auf die verschiedenen Signalmechanismen in CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen zurückzuführen sein.
Bei der vollständigen Abwesenheit von feststellbaren CD8⁺-T-Zellen erhöhte EtxB den Anteil an CD4⁺-T-Zellen, welche aktiviert waren, im Vergleich zu der rezeptorbindenden Mutante. Das wesentliche Erfordernis von CD4⁺-T-Zellen als Reaktion auf Ctx wurde in vivo gezeigt. Der Grund für die verstärkte Aktivierung dieser T-Zell-Untergruppe ist jedoch unklar. Es ist erwähnenswert, daß für CtxB gezeigt wurde, daß es DNA-Synthese und Zellteilung in ruhenden, nicht transformierten Maus-3T3-Zellen stimuliert. Eine selektive mitogene Wirkung auf CD4⁺-T-Zellen wurde auch in der Gegenwart von Pflanzenlektinen, welche an Galβ-1-3-3GalNAc binden, die gleiche Komponente, die EtxB an GM1 bindet, gefunden. Es kann die Möglichkeit nicht ausgeschlossen werden, daß EtxB einen von GM1-Bindung abhängigen direkten Effekt auf CD4⁺-T-Zellen vermittelt, der ihre Aktivierung verursacht. Es ist jedoch auch möglich, daß die verstärkte Aktivierung von CD4⁺-T-Zellen in Kulturen, die EtxB enthalten, eine Folge von solchen Veränderungen der beschriebenen B-Zell- und CD8⁺-T-Zell-Populationen ist. Von B-Zell-Aktivierung ist bekannt, daß sie mit einer Erhöhung ihrer Kompetenz als antigenpräsentierende Zellen für CD4⁺-T-Zellen einhergeht. Darüber hinaus gehen CD8⁺-T-Zellen in breitem Maße mit einer regulatorischen Rolle in der Immunreaktivität sowohl in vivo als auch in vitro einher. Ihre Entfernung von T-Zell-proliferativen Kulturen war mit verlängerter und erhöhten Niveaus von CD4⁺-T-Zellteilung verbunden.
Zusammengenommen kann vorgeschlagen werden, daß die starke Immunogenizität von EtxB in vivo, wie sie in dieser Studie gezeigt wurde, als eine Folge von dessen Fähigkeit, die Aktivierung von B-Zellen zu erhöhen, welche durch wachstumsregulierende Effekte nach Bindung an GM1 ausgeübt wird, auftritt. Aktivierung von CD4⁺-T-Zellen und die Fähigkeit von EtxB, die Produktion von IL-2 in Kultur in vitro zu erhöhen, kann das notwendige Signal für eine weitere Ausdehnung von B-Zell-Klonen liefern. Abreicherung von CD8⁺-T-Zellen durch EtxB in vitro in dieser Studie könnte auch einen weiteren Mechanismus der Immunverstärkung in vivo nach systemischer oder oraler Verabreichung liefern, insbesondere in Anbetracht der Beteiligung dieser Untergruppe von Zellen an der Unterdrückung der Immunreaktion und an oraler Toleranz. In dieser Hinsicht haben sowohl Ctx als auch Etx gezeigt, daß sie die orale Toleranz gegenüber löslichen Proteinen aufheben, und andere Studien implizierten Ctx- und CtxB-Abreicherungseffekte auf intraepitheliale Lymphozyten im Darm oder in der Kuppel des Peyer'schen Haufens, um diesen Mechanismus zu erklären. Von hemmenden Wirkungen durch CtxB auf CD8⁺-T-Zellen in vitro wurde auch gezeigt, daß sie Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktion verhindert.
Zusammenfassend wurde das Vorhandensein starker immunmodulatorischer Wirkungen von EtxB auf die Antikörperreaktion in vivo und auf Populationen von Lymphozyten in vitro gezeigt. Darüber hinaus wurde gezeigt, daß diese Effekte durch Rezeptorbindung vermittelt werden. Unsere Erkenntnisse sind auch einschlägig für ein Verständnis der Fähigkeit von Etx und Ctx, als wirkungsvolle Adjuvanzien und als potentielle Proteinträger für andere Antigene zu wirken, und legen nahe, daß diese Eigenschaften auf den Fähigkeiten dieser Toxoide beruhen, Gangliosidrezeptoren an der Oberfläche von Lymphoidzellen zu binden.
Beispiel 2
Dieses Beispiel erläutert, daß die Wirkungen auf CD8⁺-Zellen unabhängig von Antigenerkennung sind und daß sie durch Apoptose vermittelt werden.
Rekombinante Präparationen von EtxB und EtxB (G33D) wurden wie in Beispiel 1 hergestellt. Beide Proteine waren hinsichtlich ihrer Bindung an GM1, ihre Bindung an eine Reihe monoklonaler und polyklonaler Antikörper und hinsichtlich verschiedener anderer physikochemischer Eigenschaften gut charakterisiert. Ovalbumin (OVA) wurde von Sigma (Poole, UK) bezogen. Mesenteriale Lymphknoten (MLN) wurden aus BALB/c-Mäusen im Alter von 8–10 Wochen [starker Responder-Stamm gegen EtxB (Nashar, T. O. und Hirst, T. R., 1995. Immunoregulatory rote of H-2 and intra-H-2 alleles on antibody responses to recombinant preparations of B-subunits of Escherichia coli heat-labile enterotoxin (rEtxB) and cholera toxin (rCtxB). Vaccine 13: 803.)] isoliert. Die Mäuse wurden i. p. mit 200 μg OVA (Sigma), das in unvollständigem Freund'schem Adjuvans (Sigma) emulgiert war, injiziert. MLN wurden 10 Tage nach der Injektion entnommen und durch ein Edelstahlsieb in HBSS (Flow, Irvine, UK) zerkleinert. Die gewonnenen Zellen wurden in HBSS durch Zentrifugation (500 × g, 10 Min., 4°C) gewaschen und in modifiziertem Eagle-Medium (Flow), welches 20 mM HEPES, 100 IU Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 4 mM L-Glutamin und 5 × 10^–5 M 2-Mercaptoethanol enthielt (vollständiges Medium), resuspendiert, zu welchem 0,5% (v/v) frisches autologes Mausserum hinzugefügt wurde. Kulturen enthielten 2 × 10⁶ lebende Zellen/ml in 2 ml Volumen in 24-Napf-Platten (Nunc, Roskide, Dänemark) und wurden in der Gegenwart von 100 μg/ml OVA (das ausgiebig in vollständigem Medium dialysiert worden war) entweder alleine oder mit 40 μg/ml EtxB oder EtxB (G33D) etabliert. Die Kulturen wurden bei 37°C in 5% CO₂ und 95% Luft für 5 Tage inkubiert. Zu gewünschten Zeitpunkten wurden Proben von 0,2 ml von den Kulturen abgenommen und auf 96-Napf-Platten mit U-Boden (Nunc) überführt und mit 1 μCi/Napf [³H]-Thymidin (Amersham, UK) für 6 Stunden gepulst, bevor sie geerntet (Mach III-Harvesting 96; Tomtec, Orange, CT) und durch Stan dard-Flüssigszintillation (1450 Micro b plus; LKB-Wallac, Turku, Finnland) ausgezählt wurden. Für flußzytometrische Analyse (Becton Dickinson, Erenbodegem-Aalst, Belgien) von T-Zellen wurden die Zellen mit den folgenden Ratten-Antikörpern (PharMingen, Cambridge, UK) gefärbt: FITC-markierter Anti-CD4 (RNRM4-5) oder FITC-Anti-CD8α (53-6.7) und mit Biotin markiertem Anti-CD25 (IL-2Rα) (7D4), gefolgt von Streptavidin-Phycoerythrin, gefärbt. Zusätzlich wurde für die mit Biotin markierten Antikörper FITC-markiertes Streptavidin verwendet. FACS-Analyse von gewonnenen Zellen wurde am Tag der maximalen Proliferation (Tag 4), was durch [³H]-Thymidin-Inkorporation bestimmt wurde, durchgeführt.
Für Apoptosetests wurden frische MLN-Zellen (MLNC) und T-Zellen der Milz (SPLTC) von BALB/c-Mäusen, die 8–10 Wochen alt waren, isoliert. MLNC, welche > 90% CD3⁺-T-Zellen umfaßten, was durch Flußzytometrieanalyse bestimmt wurde, wurden für 2 Stunden in Petrischalen (Costar, Cambridge, MA) in vollständigem Medium, das 10% FCS enthielt, bei 37°C in 5% CO₂ und 95% Luft zur Entfernung anhaftender Zellen inkubiert. Die nicht anhaftende Fraktion wurde anschließend abpipettiert, pelletiert und zweimal in HBSS gewaschen, bevor sie verwendet wurde. SPLTC wurden durch negative Selektion unter Verwendung von Glasperlen, die mit normalem Mausserum, gefolgt von Kaninchen-Anti-Maus-γ-Globulinen, beschichtet waren, gereinigt, wie es beschrieben ist (Wigzell, H. 1976. Specific affinity fractionation of lymphocytes using glass or plastic bead columns. Scand. J. Immunol. 5: (suppl. 5) 23.). Die selektierte Population von T-Zellen bestand aus > 90% CD3⁺, was durch Flußzytometrieanalyse bestimmt wurde.
CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen wurden wie folgt getrennt: Nicht anhaftende MLNC wurden mit Ratte-Phycoerythrin-Anti-Maus-CD4 (4708-02) oder FITC-Anti-Maus-CD8α (53-6.7) (PharMingen) markiert und anschließend mit MACS kolloidalen, superparamagnetischen Mikroperlen, die mit Ziege-Anti-Ratte-IgG-(H + L)F(ab')₂ (PharMingen) nach den Anweisungen des Herstellers inkubiert. Diese wurden auf Mini-MACS-Säulen (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland) aufgebracht, um sowohl positiv (> 99% rein) und negativ (> 90% rein) selektierte Populationen von CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen zu trennen, was durch Flußzytometrieanalyse bestimmt wurde.
Zwei Verfahren wurden zur Quantifizierung von Apoptose verwendet: i) Färbung von DNA mit Acridin-Orange zur Untersuchung der Kernmorphologie und ii) Zellzyklusanalyse nach Färbung von DNA mit Propidiumiodid und mit entweder Anti-CD4- oder Anti-CD8-Antikörpern. Kulturen von 2 × 10⁶/ml MLNC, SPLTC und fraktionierten MLNC wurden in vollständigem Medium, welches 10% FCS enthielt, in der Abwesenheit oder Gegenwart von 80 μg/ml von entweder EtxB oder EtxB (G33D) etabliert und 4–18 Stunden untersucht. Nach der Inkubation wurden die Zellen pelletiert, mit HBSS gewaschen und mit 5 μg/ml Acridin-Orange (Sigma) gefärbt. Thymozyten wurden isoliert und in der Abwesenheit oder in der Gegenwart von 10^–7 M Dexamethason behandelt und als Positivkontrolle für Zellen, die Apoptose eingehen, verwendet. Morphologische Veränderungen des Kerns in Lymphozyten wurden durch herkömmliche oder konfokale Fluoreszenzmikroskopie (Leica TCS 4D) untersucht. Der Anteil an CD4⁺- und CD8⁺-SPLTC in der Sub-G₀/G₁-Stufe des Zellzyklus wurde durch Flußzytometrieanalyse des DNA-Gehalts nach Färbung mit Propidiumiodid bestimmt, wie es beschrieben ist (O'Connor, P. M., Jackman, J., Jondle, D., Bhatia, K., Magrath, I. und Kohn, K. W. 1993. Role of p53 tumor suppressor gene in cell cycle arrest and radiosensitivity of Burkitt's lymphoma cell lines. Cancer Res. 53: 4776). Von 18-Stunden-Kulturen von SPLTC isolierte Zellen, die alleine oder mit 40 μg/ml EtxB oder EtxB (G33D) inkubiert worden waren, wurden mit FITC-Ratte-Anti-CD4 oder FITC-Anti-CD8α gefärbt. Gefärbte Zellen wurden auf 1 × 10⁶/ml in kaltem HBSS, welcher 20 mM HEPES und 0,5 mM EDTA enthielt, eingestellt und mit kaltem Ethanol, der tropfenweise hinzugegeben wurde, fixiert. Anschließend wurden 50 μg/ml Propidiumiodid und 40 μg/ml Ribonuklease A (DNase-frei) hinzugefügt, und die Zellen für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die relative Intensität der DNA-Färbung mit Propidiumiodid in CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen wurde durch Ausblenden von Zellen, die mit jedem mAB gemeinsam gefärbt waren, bestimmt.
Die Beobachtung in Beispiel 1, daß CD8⁺-T-Zellen von Kulturen von Lymphknotenzellen, die als Reaktion auf EtxB proliferierten, vollständig abgereichert werden, legte nahe, daß EtxB einen polyklonalen Effekt auf diese T-Zell-Untergruppe ausübt. Um zu untersuchen, ob diese Effekte von der Aktivierung von auf EtxB ansprechenden Zellen abhängig sind, wurden Kulturen von mit OVA immunologisch aktivierten Mäusen etabliert und mit OVA alleine oder mit OVA und entweder EtxB oder der Mutante EtxB (G33D) stimuliert. Ähnliche maximale Niveaus an Proliferation (in jedem Fall am Tag 4 der Kultur) wurden in der Gegenwart von OVA alleine, OVA und EtxB oder OVA und EtxB (G33D) erzielt (9734 ± 347, 12031 ± 135 bzw. 9305 ± 290 cpm). Jedoch gab es einen deutlichen Unterschied in der Verteilung von T-Zell-Untergruppen in diesen Kulturen nach 4 Tagen (6). Alle Kulturen enthielten CD4⁺-T-Zellen, von denen ähnliche Anteile den Aktivierungsmarker CD25 co-exprimierten. Jedoch waren CD8⁺-T-Zellen in Kulturen, die mit OVA und EtxB inkubiert worden waren, nicht feststellbar, aber sie waren deutlich vorhanden (obwohl sie nicht aktiviert waren, was durch CD25-Expression untersucht wurde) in Kulturen mit OVA und EtxB (G33D) oder OVA alleine. Dies bestätigt, daß EtxB die Abreicherung von CD8⁺-T-Zellen, die auf ein anderes Antigen als EtxB reagieren, induziert. Darüber hinaus zeigt die Abwesenheit solch einer Reaktion auf EtxB (G33D), daß die Abreicherung nach einer Toxoidrezeptorwechselwirkung ausgelöst wird. Es wurde auch festgestellt, daß das Vorhandensein von Wildtyp-EtxB eine signifikante Zunahme des Anteils an B-Zellen, von denen eine große Anzahl CD25⁺ waren (nicht gezeigt), verursachte, wie es zuvor für auf EtxB ansprechende Kulturen gefunden wurde (Beispiel 1). Es wird daher geschlußfolgert, daß Rezeptorbesetzung durch EtxB starke immunmodulatorische Wirkungen auf Lymphozyten unabhängig von ihrer Antigenspezifität ausübt.
Die Möglichkeit, daß CD8⁺-T-Zellen Apoptose eingehen, wenn sie in der Gegenwart von EtxB kultiviert werden, wurde untersucht. MLNC oder gereinigte SPLTC von nicht immunologisch aktivierten Mäusen wurden mit EtxB oder EtxB (G33D) inkubiert, und Veränderungen der Zellkernmorphologie wurden nach Färbung mit Acridin-Orange über einen Zeitraum von 4–18 Stunden aufgezeichnet (Tabelle 3 und 7). Zellmorphologische Veränderungen wurden durch das Vorhandensein von Kondensation von Chromatin, was zu dem lappenförmigen Erscheinungsbild des Kerns führt, charakterisiert (7). Andere Zelleigenschaften, wie das Blasenbilden der Plasmamembran und das Vorhandensein apoptotischer Körper, wurden ebenfalls beobachtet. Diese morphologischen Veränderungen traten in etwa einem Drittel jeder der Zellpräparationen auf, die mit EtxB behandelt worden waren, wogegen ein viel geringeres Auftreten in Zellen, die mit EtxB (G33D) oder ohne exogenes Antigen kultiviert worden waren, beobachtet wurde (Tabelle 3). Da CD8⁺-T-Zellen ~35–40% der MLNC- und SPLTC-Präparationen ausmachten, könnte eine Abreicherung dieser Zellen zu der beobachteten Apoptose beitragen. Um festzustellen, ob dies der Fall war, wurden Populationen von gereinigten CD8⁺- und CD4⁺-T-Zellen für 18 Stunden in der Gegenwart von Antigenen kultiviert (Tabelle 3). Ähnliche Prozentsätze morphologischer Veränderungen wurden in negativ selektierten Populationen von CD4⁺-T-Zellen (die > 90% CD4-tragende Zellen enthielten) bei Behandlung mit entweder EtxB, EtxB (G33D) oder keinem Antigen induziert werden, was anzeigt, daß eine Bindung von EtxB an seinen Rezeptor die Apoptose in dieser T-Zell-Untergruppe nicht auslöst. Im Gegensatz dazu zeigten > 70% der negativ selektierten CD8⁺-T-Zellen (> 90% rein) morphologische Veränderungen, wenn sie mit Wildtyp-EtxB kultiviert wurden, wogegen eine Inkubation mit entweder keinem Antigen oder EtxB (G33D) Veränderungen in jeweils nur 11–19% dieser T-Zell-Population verursachte. Weiterhin konnte das Vorhandensein niedriger Anzahlen kontaminierender Zellen in den verwendeten gereinigten Populationen (~10% in jedem Fall) nicht zu den beobachteten Effekten beitragen, da höher gereinigte Populationen, die > 99% CD8⁺- oder CD4⁺-T-Zellen enthielten (isoliert durch positive Selektion), auf EtxB in einer ähnlichen Art und Weise ansprachen (60% waren in der Gegenwart von EtxB apoptotisch im Vergleich zu 7% für Behandlungen ohne Antigen oder EtxB (G33D)) (Tabelle 3). Apoptose wurde in 40% bzw. 98% Thymozyten nach 18 Stunden Inkubation in der Abwesenheit oder in der Gegenwart von Dexamethason festgestellt.
Um zu zeigen, daß die morphologischen Veränderungen, die in unseren Kulturen beobachtet wurden, mit der Induktion von Apoptose konsistent waren, wurde das Erscheinungsbild von subdiploider DNA in Kulturen von SPLTC, die für 18 mit EtxB behandelt worden waren, bestimmt. Zellen wurden flußzytometrischen Analysen nach gemeinsamer Färbung mit Propidiumiodid und entweder Anti-CD8- oder Anti-CD4-Antikörpern unterzogen (8). Etwa 48% der CD8⁺-T-Zellen aus Kulturen, die mit EtxB inkubiert wurden, fielen unter den diploiden G₀/G₁-Peak der Propidiumiodidfärbung, was anzeigt, daß sie Apoptose eingingen (O'Connor, P. M. et al., supra). Ein geringer Anteil von CD4 exprimierenden Zellen in Kulturen mit EtxB zeigten auch unter den G₀/G₁-Niveaus liegende Mengen an DNA (~11%; was von dem Tod solch eines hohen Anteils an CD8⁺-T-Zellen herrühren kann). Im Gegensatz dazu war der größte Teil der CD4⁺- oder CD8⁺-T-Zellen, die ohne Antigen oder in der Gegenwart von EtxB (G33D) kultiviert wurden, in der G₀/G₁-Phase des Zellzyklus, wobei < 5% Apoptose zeigten. Wir schlußfolgern, daß die beobachteten kernmorphologischen Veränderungen und das Vorhandensein von unter den G₀/G₁-Niveaus liegenden Mengen an DNA in einem wesentlichen Anteil an CD8⁺-T-Zellen, die mit EtxB behandelt wurden, eine selektive Apoptose demonstrieren, die von dem Cholera ähnlichen Enterotoxoid ausgelöst wird. Das Versagen der rezeptorbindenden Mutante EtxB (G33D), ähnliche Effekte zu induzieren, zeigt, daß die Induktion von CD8⁺-T-Zell-Apoptose mit dessen Fähigkeit, an GM1-Gangliosid zu binden, verknüpft ist.
Beispiel 3
Gruppen von 8 männlichen DBA/1-Mäusen wurden entweder nicht gereizt (Gruppe A) oder jeweils mit 100 μg Rinderkollagen in CFA am Tag 0 durch intradermale (i. d.) Injektion in die Flanke injiziert. Mit Kollagen injizierte Mäuse wurden entweder unbehandelt belassen (Gruppe B; Positivkontrolle), oder es wurden Versuche unternommen, durch die Verabreichung i. d. an einer zu der Kollagenreizung benachbarten Stelle von 100 μg EtxB in IFA am Tag 0 (Gruppe C), 100 μg EtxB in IFA am Tag 14 (Gruppe D) oder 100 μg EtxB (G33D) in IFA am Tag 0 (Gruppe E) eine Krankheitsentwicklung zu verhindern. Alle Tiere, ausgenommen diejenigen in Gruppe A, erhielten eine Auffrischungsdosis an Kollagen in IFA i. d. am Tag 21, und die Krankheitsschwere wurde am Tag 45 durch Messung der Hinterlaufknöcheldicke (Experiment A) oder Auswertung einer Hinterlaufstelle hinsichtlich Schwellung (Skala von 0–3, wobei 0 = normale und 3 = maximale Schwellung bedeutet; Experiment B) untersucht.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in den 9a und 9b gezeigt. Diese zeigen, daß EtxB, aber nicht EtxB (G33D) Mäuse grundlegend vor der Entwicklung von durch Kollagen induzierter Arthritis schützt.
Beispiel 4a
Zwei separate menschliche Leukozytenfilmproben (erhalten von normalen menschlichen Blutspendern) wurden als eine Quelle für einkernige Zellen verwendet. Die Zellen wurden über Ficoll-Plaques isoliert und ausgiebig gewaschen, bevor sie in der Abwesenheit von Antigen oder mit 80 μg/ml von entweder EtxB oder EtxB (G33D) kultiviert wurden, wie es angegeben ist. Vor der Kultur umfaßten die Zellpopulationen 24% CD8+, 27% CD4+ bzw. 27% CD8+, 22,9% CD4+ für jede Probe. Nach der Kultivierung für 18 Stunden wurde das Auftreten von apoptotischen Zellen in Proben von Zellen, die mit Acridin-Orange gefärbt waren, untersucht (wie es ausführlich bei Beispiel 2 angegeben ist). Die erhaltenen Ergebnisse sind in 10 gezeigt; diese erläutern, daß EtxB, aber nicht EtxB (G33D) Apoptose in einer Population von normalen menschlichen peripheren Blutmonozytenzellen induziert.
Beispiel 4b
Die Maus-T-Zellinie CTLL-2 wurde bis zur Konfluenz kultiviert und die Zellen anschließend gewaschen, bevor sie erneut mit 1 × 10⁶ Zellen/ml in der Abwesenheit von Antigen oder mit 80 μg/ml von entweder EtxB oder EtxB (G33D) ausgesät wurden, wie es angegeben ist. Nach 18 Stunden wurden Proben abgenommen, und der Prozentsatz an Zellen, die Anzeichen für Apoptose zeigten, wurde unter Verwendung von Acridin-Orange untersucht (wie es ausführlich in Beispiel 2 angegeben ist). Die erhaltenen Ergebnisse sind in 11 erläutert. Sie zeigen, daß eine Vernetzung von GM1 zu Apoptose in einem Anteil von Maus-CTLL-Zellen führt.
Tabelle 1 – Lymphozytenproliferation in der Gegenwart von EtxB oder EtxB (G33D)
Mäuse wurden i. p. mit 30 μg EtxB (G33D) in vollständigem Freund'schem Adjuvans (CFA) injiziert. Mesenteriale Lymphknoten wurden 10 Tage später isoliert. Zellen wurden isoliert und für 4 Tage in der Gegenwart von EtxB, EtxB (G33D) oder auseinandergenommenen monomeren Formen dieser Proteine (*), die durch Erhitzen auf 95°C erzeugt worden waren, inkubiert. Proliferation wurde durch Zugabe von 1 μCi [³H]-dThd für die letzten 6 Stunden am Tag 4 bestimmt. Die Daten geben mittlere cpm und SEM von 3 Näpfen wieder. Zellen, die von nicht immunisierten Mäusen isoliert worden waren, lieferten < 1500 cpm (Dosis 160 μg/ml).
Tabelle 2 – Zytokinanalyse in der Gegenwart von EtxB oder EtxB (G33D)
Mäuse wurden mit EtxB (G33D) in CFA injiziert, und mesenteriale Lymphknotenzellen wurden 10 Tage später isoliert. Die Zellen wurden dann in vitro mit entweder EtxB oder EtxB (G33D) inkubiert, und Proben von Überständen wurden am Tag 5 der zellulären Proliferation hinsichtlich des Zytokingehalts analysiert.
Tabelle 3 – Durch EtxB-Rezeptor vermittelte Apoptose in fraktionierten Lymphozyten
Kernmorphologieveränderungen in fraktionierten CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen nach 4 oder 18 Stunden Inkubation in der Abwesenheit von Antigen oder mit 80 μg/ml EtxB oder EtxB (G33D) wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie nach Färbung mit Acridin-Orange untersucht. Gesamte MLN waren von anhaftenden Zellen abgereichert. SPLTC wurden durch negative Selektion in einer Säule mit Glasperlen, die mit Maus-γ-Globulinen und Kaninchen-Anti-Maus als einem sekundären Antikörper beschichtet waren, isoliert. Fraktionierte SPLTC wurden nach Markierung mit Ratte-Phycoerythrin-Anti-Maus-CD4 oder FITC-Anti-Maus-CD8α erhalten, welche anschließend mit MACS kolloidalen superparamagnetischen Mikroperlen, die mit Ziege-Anti-Ratte-IgG(H + L)-F(ab')₂ konjugiert waren, erhalten. Diese wurden unter Verwendung von Mini-MACS-Säulen unter Erhalt von sowohl der positiv (> 99% rein) und negativ (> 99% rein) selektierten Fraktionen von CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen getrennt. Kernmorphologische Veränderungen wurden von 4–18 Stunden in einer zufälligen Probe von 200 Zellen pro Behandlung untersucht, wie es in der Legende zu 7 beschrieben ist. Der maximale Prozentsatz an apoptotischen Zellen trat nach 18 Stunden auf. Die Daten in Klammern, wenn sie angegeben sind, sind Ergebnisse von einem anderen getrennten Experiment. Daten für MLN und SPLTC repräsentieren eine Gesamtzahl von vier Experimenten.

Claims

Verwendung eines Mittels bei der Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung und/oder Behandlung einer Autoimmunerkrankung oder humaner T-Zell-Leukämie, wobei (i) das Mittel Etx (E. coli hitzelabiles Enterotoxin), EtxB (E. coli hitzelabiles Enterotoxin, Untereinheit B), Ctx (Choleratoxin) und/oder CtxB (Choleratoxin, Untereinheit B) ist, (ii) wenn das Mittel gemeinsam mit einer antigenen Determinante zu verabreichen ist, dann sind das Mittel und die antigene Determinante nicht so miteinander verknüpft, daß sie ein einzelnes aktives Mittel bilden.
Verwendung nach Anspruch 1 zur Verhinderung und/oder Behandlung einer Autoimmunerkrankung.
Verwendung nach Anspruch 2 zur Verhinderung und/oder Behandlung von rheumatoider Arthritis, multipler Sklerose oder Diabetes.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Mittel EtxB ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Mittel ohne eine gemeinsame Verabreichung eines selbst- oder kreuzreagierenden Antigens zu verabreichen ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Mittel zur Verwendung bei der Verhinderung und/oder Behandlung einer Autoimmunerkrankung oder humaner T-Zell-Leukämie, wobei (i) das Mittel Etx (E. coli hitzelabiles Enterotoxin), EtxB (E. coli hitzelabiles Enterotoxin, Untereinheit B), Ctx (Choleratoxin) und/oder CtxB (Choleratoxin, Untereinheit B) ist, (ii) wenn das Mittel gemeinsam mit einer antigenen Determinante zu verabreichen ist, dann sind das Mittel und die antigene Determinante nicht so miteinander verknüpft, daß sie ein einzelnes aktives Mittel bilden.
Zusammensetzung nach Anspruch 6 zur Verhinderung und/oder Behandlung einer Autoimmunerkrankung.
Zusammensetzung nach Anspruch 6 oder 7 zur Verhinderung und/oder Behandlung von rheumatoider Arthritis, multipler Sklerose oder Diabetes.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei das Mittel EtxB ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei das Mittel ohne eine gemeinsame Verabreichung eines selbst- oder kreuzreagierenden Antigens zu verabreichen ist.
Kit, enthaltend eine pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 6 bis 9 und getrennt davon eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine selbst- oder kreuzreagierende antigene Determinante enthält.
Verwendung eines Mittels bei der Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung und/oder Behandlung von Transplantatabstoßung oder GVHD, wobei (i) das Mittel Etx (E. coli hitzelabiles Enterotoxin) oder EtxB (E. coli hitzelabiles Enterotoxin, Untereinheit B) ist, (ii) wenn das Mittel gemeinsam mit einer antigenen Determinante zu verabreichen ist, dann sind das Mittel und die antigene Determinante nicht so miteinander verknüpft, daß sie ein einzelnes aktives Mittel bilden.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Mittel zur Verwendung bei der Verhinderung und/oder Behandlung von Transplantatabstoßung oder GVHD, wobei (i) das Mittel Etx (E. coli hitzelabiles Enterotoxin) oder EtxB (E. coli hitzelabiles Enterotoxin, Untereinheit B) ist, (ii) wenn das Mittel gemeinsam mit einer antigenen Determinante zu verabreichen ist, dann sind das Mittel und die antigene Determinante nicht so miteinander verknüpft, daß sie ein einzelnes aktives Mittel bilden.