DE69427928T3

DE69427928T3 - Humane monoklonale anti-TNF alpha Antikörper

Info

Publication number: DE69427928T3
Application number: DE69427928T
Authority: DE
Inventors: Petra Boyle; Gayle D. Wetzel; Kenneth J. Lembach
Original assignee: Bayer Healthcare LLC
Current assignee: Bayer Healthcare LLC
Priority date: 1993-03-05
Filing date: 1994-02-21
Publication date: 2012-05-10
Anticipated expiration: 2014-02-22
Also published as: CA2116888A1; EP0614984A2; DK0614984T3; US5654407A; JP4225519B2; NL300421I1; JP2009046487A; ES2159529T3; DE122009000074I1; DE69427928T2; ATE204299T1; LU91661I2; DK0614984T4; EP0614984B2; EP0614984A3; NL300421I2; ES2159529T5; PT614984E; EP0614984B1; JPH06319587A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet
Die vorliegende Beschreibung betrifft ganz allgemein monoklonale Antikörper (mAb) und insbesondere den Gegenstand der Ansprüche.
Stand der Technik
TNFα ist ein pluripotentes und pleiotropes Cytokin. Er bzw. es werden ganz grundsätzlich durch aktivierte Makrophagen erzeugt, allerdings ist deren Synthese und Sekretion auch mit Granulocyten, Mandel-B-Zellen, B-Zellinien, natürlichen Killerzellen, T-Zellinien, primären chronischen malignen B-Zellisolaten und mit peripheralen Blut-T-Zellen beobachtet worden.
TNFα kann auch auf Zelloberfächen exprimiert werden, und zwar erkennbar in 2 Formen. Die eine ist ein Transmembran-Protein vom Integral-Typ 2 mit einem Molekulargewicht von 26 kd auf Monocyten, T-Zellen und einigen anderen Zellen. Die andere Form ist das sekretierte Produkt von 17 kd, das an seinen Rezeptor gebunden ist.
Unter den vielen Aktivitäten von sekretiertem TNFα sind Thymocyt-Wachstumsfaktor, B-Zellenwachstum und -reifungsfaktor, in vivo-Produktion von hämorrhager Nekrose, Gewichtsverlust, kardiovaskularer Kollaps und multiples Organversagen zu nennen. Selbstverständlich sind diese Aktivitäten bzw. Auswirkungen der Grund des klinischen Interesses an TNFα.
Bei septischem Schock sowie bei Entzündungen sind Synthese und Sekretion von TNFα, IL-1, IL-6 und IL-8 belegt worden. Somit sind die Immunsysteme von Individuen diesen Cytokinen chronisch ausgesetzt. Tatsächlich ist über Antikörper mit niedriger Affinität zu TNFα berichtet worden (A. Pomsgaard et al ”Auto-antibodies to Tumor Necrosis Factor α in Healthy Rumans and Patients with Inflammatory Diseases and Gram-Negative Bacterial Infections” Scand. J. Immunol. 30: 219–23, 1989; und K. Bendtzen et al ”Auto-antibodies to ZL-1α and TNFα in Normal Individuals and Infections and Immunoinflammatory Disorders” Prog. Leukocyte. Biol. 105: 447–52, 1990). Diese anti-TNFα-Autoantikörper können, allerdings, nicht spezifisch sein (H.-G. Leusch et al ”Failure to Demonstrate TNFα Specific Autoantibodies in Human Sera by ELISA and Western Blot” J. Immunol. Meth. 139: 145–147, 1991).
Ein besonderes Merkmal von menschlichem Serum sowie von Seren aus anderen Lebewesen ist deren Gehalt an natürlichen und sogenannten polyreaktiven Antikörpern. Diese sind gewöhnlich IgM-Antikörper, die an verschiedenen Autoantigene mit niedriger Affinität gebunden werden (A. B. Hartman et al ”Organ Reactive Autoantibodies from Non-Immunized Adult Balb/c Mice are Polyreactive and Express Non-Biased Vh Gene Usage” Molec. Immunol. 26: 359–70, 1989; und P. Casali et al ”CD5+ B Lymphocytes, Polyreactive Antibodies and the Human B cell Repertoire” Immunol. Today 10: 364–8, 1989). Somit könnte von der Autoantikörper-artigen Reaktivität zu Human-TNFα erwartet werden, dass sie niedrige Affinität aufweist und wahrscheinlich kreuz-reaktiv mit einigen anderen Antigenen ist.
Von einigen neutralisierenden Antikörpern mit hoher Affinität zu IL-1α ist in normalen Seren (N. Mae et al ”Identification of High-Affinity Anti-IL-1α Autoantibodies in Normal Human Serum as an Interfering Substance in a Sensitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for IL-1α” Lymphokine Cytokine and Research 10: (1)61–68, 1991) oder bei Patienten (H. Suzuki et al ”Demonstration of Neutralizing Autoantibodies Against IL-1α in Sera from Patients with Rheumatoid Arthritis” J. Immunol. 145: 2140–6, 1990) berichtet worden.
Trotz dieser Überlegungen und Betrachtungsweisen ist bisher kein monoklonaler menschlicher Antikörper offenbart worden, der spezifisch an TNFα gebunden wird, obgleich daran gedacht wird, dass solche Antikörper von signifikantem klinischen Wert sein könnten. Somit besteht und verbleibt ein Bedarf nach monospezifischen monoklonalen Antikörpern zu TNFα.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Erfindungsgemäß werden monoklonale menschliche Antikörper her- und bereitgestellt, die sowohl an Human- als auch an Maus-TNFα gebunden werden. Die Antikörper binden an rekombinanten menschlichen TNPα (rhTNFα) mit einem Titer, der, gemäss Test mit ELISA, vergleichbar mit drei neutralisierenden Maus-mAb hoher Affinität ist. Die am vollständigsten charakterisierten Antikörper sind vom IgM-Isotyp, obwohl erfindungsgemäß auch Antikörper des IgG-Isotyps her- und bereitgestellt werden. Gemäß Konkurrenz-Bindungsversuchen scheint der Antikörper an Epitope auf rhTNFα gebunden zu werden, die sich von denjenigen unterscheiden, die durch die bisher beschriebenen neutralisierenden Maus-mAb gebunden werden.
Spezifitätsanalysen zeigen an, dass der Human-IgM-Autoantikörper sowohl an rekombinanten Human- als auch an Maus-TNFα, aber nicht an andere Antigene gebunden wird, die gewöhnlich von polyreaktiven natürlichen IgM-Autoantikörpern erkannt werden. Der hohe Gehalt an Aminosäure-Identität zwischen den Human- und Maus-TNFα-Molekülen legt es nahe, dass der Antikörper monospezifisch für ein gegebenes Epitop ist, das sich diese zwei TNFα-Formen teilen.
Der B5-Antikörper bindet sich auch an Zelloberflächen-TNFα (csTNFα) auf menschlichen T-Zellen, B-Zellen, Monocyten, verschiedenen lymphoiden und monocyten Linierungszellinien menschlichen Ursprungs sowie auf Astrocytomen, einem Brustcarcinom und einem Melanom. Der Antikörper wird auch an Schimpansen-Lymphocyten und Maus-T-Lymphoma-Zellinien-csTNFα gebunden. Die Bindung des Antikörpers an cs'NFα ist spezifisch, weil sie durch TNFα, aber nicht durch TNFβ, einen neutralisierenden Maus-anti-TNFα-mAB, und auch nicht durch eine rekombinante Form der extrazellulären Domäne des p55-TNF-Rezeptors (TNFR) inhibiert werden kann. Eine durch LPS induzierte TNFα-Sekretion durch Zellen der menschlichen Monocyt-artigen Zellinie THP-1 vermag der B5-Autoantikörper zu inhibieren.
Einige monoklonale Maus-anti-Human-TNFα-Antikörper sind in der Literatur beschrieben worden. Allerdings werden keine gleichfalls auch an Maus-TNFα gebunden.
Die Spezifität, die Autoantikörper-Natur, die Bindung an die Zelloberfläche von TNFα und die Befähigung zur Inhibierung der TNFα-Sekretion machen den B5 zu einem neuen mAb (monoklonalen Antikörper).
Charakterisierung der Antikörper und deren Herstellung werden nun beschrieben.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1A und 1B zeigen, als Diagramm, einen Vergleich der Festphasen-ELISA-Format-Bindung an rhTNFα der monoklonalen B5-(Mensch) und A10G10-(Maus)-Antikörper. ELISA-Platten wurden mit verschiedenen Konzentrationen von TNF überzogen, und man ließt titrierte Dosismengen von mAb dann zur entsprechenden Bindung gelangen. Gezeigt werden die Bindungskurven für jeden Antikörper für die verschiedenen TNF-Überzugskonzentrationen.
2A und 2B zeigen, als Diagramm, das Fehlen einer Konkurrenz zur Bindung an TNFα zwischen Maus-mAb und dem B5-mAb. 2A zeigt die Bindung von 3 Maus-anti-TNF-mAb und die Vergleichs-C7F7-anti-rFVIII-mAb-Bindung an Festphasen-rhTNFα. 2B zeigt das Fehlen einer Inhibierung der B5-Bindung an Platten-gebundenen TNF, wenn man zuerst die Maus-Monoklone sich an TNF-Platten binden lässt und anschließend B5-Antikörper zugibt.
3 zeigt, als Balken-Diagramm, die Bindung von Human-IgM-anti-TNF-mAb an rhTNFα, eingefangen und dargestellt als ein Komplex durch die Kombination der Platten-gebundenen Maus-mAb A10G10, B6 und A6. ELISA-Platten wurden mit den drei Maus-mAb vorab überzogen und dann mit rhTNFα inkubiert. Die Platten wurden gewaschen, und man lies 20 μg/ml der angegebenen Human-IgM-mAb dann zur jeweiligen Bindung gelangen. Die vollen Balken zeigen die Bindung der Human-IgM-mAb an die drei Maus-mAb, die mit TNF inkubiert worden waren, und die gestrichelten Balken zeigen die Bindung der IgM-mAb, als die fixierten Maus-mAb einem TNF nicht ausgesetzt worden waren.
4A bis 4F zeigen, als Mehrfach-Diagramm, Analysenergebnisse der Bindungsspezifität verschiedener monoklonaler Antikörper. Es wurden Platten vorab mit entweder rekombinantem menschlichen TNFα (∎), rekombinantem menschlichen Lymphotoxin (♦), menschlichem Insulin (☐), Schweine-Thyroglobulin
BSA (O), dsDNA (∎), dsDNA (☐) oder mit menschlichen IgG-Fc-Fragmenten (Δ) überzogen. Der Maus-mAb A10G10 ist in Versuchsgruppe A angegeben. Die Human-IgM-mAb B5, 7T1, H5, 1A6B5F und F2.2.34 sind in den Versuchsgruppen B, C, D, B bzw. F zusammengefasst. Die Antikörper-Bindung wurde mit ELISA analysiert.
5 zeigt, als Diagramm, die Bindung von B5 an rekombinanten Maus-TNFα. Kundstoffplatten wurden vorab mit einem neutralisierenden monoklonalen Hamster-anti-Maus-TNFα-Antikörper mit 8 μg/ml (Quadrate), 4 μ g/ml (Dreiecke) und mit 2 μg/ml (Kreise) überzogen. Rekombinanter Maus-TNFα wurde dann mit 2 μg/ml (gefüllte Symbole) zugegeben, oder er wurde nicht zugegeben (offene Symbole). Man ließ dann den Human-mAb B5 bei den angegebenen Konzentrationen zur jeweiligen Bindung gelangen. Die Bindung wurde dann mit ELISA mit anti-Human-IgM-Antikörper analysiert.
6 zeigt, als Diagramm, einen Vergleich der Bindung des B5-mAb (Dreiecke) und des mAb A10G10 (Kreise) an löslichen rhTNFα. Die Antikörper wurden an Kunststoffplatten gebunden, die vorab mit anti-Human- oder anti-Maus-Antikörperüberzogen worden waren. Biotinylierter TNF wurde dann mit den Antikörpern inkubiert. Die Bindung von löslichem TNFα wurde mit Enzym-Avidin-Konjugaten nachgewiesen.
7 zeigt, als Diagramm, dass eingefangener B5-mAb löslichen TNFα bindet und dies nur schwach an A10G10-mAb zeigt. Man ließ B5-mAb-anti-TNFα oder 6F11 (Human-anti-LPS-IgM) als Vergleich zur Bindung an Platten gelangen, die mit anti-Human-IgM vorab überzogen worden waren. Löslichen TNFα liess man dann zur Bindung an die komplexierten Human-mAb gelangen. Der Maus-mAb A10G10 wurde zugefügt, und dessen Bindung an TNF, der an B5-mAb komplexiert war, wurde mit Enzym-gebundenem anti-Maus-Ig-Antikörper nachgewiesen.
8 zeigt, als Fotografie von Western Blots, die Bindung verschiedener Human-IgM-Antikörper an Maus-TNFα und die Bindung des menschlichen B5-mAb an menschlichen TNFα. Rekombinanter Maus-TNFα (Bahnen A-G) und rhu TNFα (Bahnen H und I) wurden elektrophoretisch unter reduzierenden Bedingungen analysiert und auf Nitrocellulose übertragen. Maus-TNFα wurde mit den folgenden monoklonalen Antikörpern befleckt (geblottet): 7T1 (Bahn A), B5 (Bahn B), 1A6B5F (Bahn C), 6F11 Bahn D), H5 (Bahn E), A8 (Bahn F) und mit keinem primären Antikörper (Bahn G). Human-TNFα wurde in den Bahnen H und I elektrophoretisch analysiert. Die Bahn H wurde dann mit B5-mAb und die Hahn I mit 6F11-mAb befleckt. Die Bahnen A bis F, H und I wurden dann biotinyliertem anti-Human-IgM ausgesetzt. Die Bahn F wurde biotinyliertem anti-Human-IgG ausgesetzt, weil A8 ein IgG-Antikörper ist. Alle Bahnen wurden dann mit dem Reagens aus mit Meerrettich-Peroxidase gekuppeltem Avidin entwickelt.
Molekulargewichtsstandards im Molekulargewichtsbereich von 211 bis 15,4 kd wurden parallel laufen gelassen, und deren Positionen sind angegeben.
9 zeigt, als Diagramm, die Neutralisation von rhTNFα mit dem Maus-mAb A10G10 sowie das Fehlen einer Neutralisation mit menschlichen mAb. WEHI 164-Zellen wurden mit einer zytotoxischen Dosis von rhTNFα in der Gegenwart titrierter Konzentrationen von mAb inkubiert. Die Lebensfähigkeit wurde anschließend analysiert.
10A bis 10B zeigen, als Histogramm, die Fluoreszenz-Färbungsprofile von 2 mit menschlichen IgM-anti-TNFα-mAb gefärbten Zellinien. 8B9-Zellen (10A, 10C, 10E, 10G) und THP-1-Zellen (10B, 10D, 10F, 10H) wurden mit keinen Antikörpern (10A, 10B), mit FL-F(ab)'₂-anti-Human-IgM (10C, 10D), B5-IgM-anti-TNFα + FL-anti-IgM (10E, 10F) und mit 6F11-anti-LPS + FL-anti-IgM (10G, 10B) gefärbt. Fluoreszenzintensititskanalzahlen, in beliebigen Einheiten, sind gegen die Zellen pro Kanal an der Ordinate aufgetragen. Für jede Probe wurden 5000 Zellen zusammengefasst. Die Prozentsätze von Zellen, die in die angezeigten Markierungen fallen, bewertet als Fluoreszenz-positiv, sind angegeben.
11A bis 11B zeigen, als Diagramm, den Nachweis der Zelloberflächen-Expression von TNFα auf THP-1- und U937-Zellen mit dem B5-anti-TNFα-mAb sowie den Anstieg der Exprimierung mit LPS und PMA. THP-1 (11A) und U937-(11B) Zellen wurden 3 h lang mit Medium (offene Kreisel, LPS (gefüllte Kreise) oder mit LPS + FMA (gefüllte Dreiecke) inkubiert.
12A bis 12D zeigen, als Diagramm, die Verschiebung der Färbungsintensität, wenn B5-anti-TNFα-IgM-mAb an Zellen gebunden wird, die mit F1-anti-IgM-Antikörper gefärbt werden. CD19-positive Splenocyten (Milzzellen) werden gezeigt. Diese wurden mit Phycoerythrin-konjugiertem anti-CD19 gefärbt, und nur positive Zellen wurden weiter bezüglich Fluorescein-konjugierter Antikörper-Färbung analysiert. 12A zeigt C19+-Splenocyten, die nicht mit FL-anti-IgM gefärbt wurden. 12B zeigt die Färbung dieser Zellen mit B5 + FL-anti-IgM, 12C zeigt die Färbung mit FL-anti-hIgM allein, und 12D zeigt die Färbung mit Vergleichs-6F11-anti-LPS-IgM + FL-anti-IgM. Die Prozentsätze von Zellen innerhalb der angezeigten Markierungen sind angegeben, was den Prozentsatz von Zellen aufzeigt, die mit dem Fluorescein-konjugierten Antikörper positiv gefärbt werden. Die mittleren Kanalzahlen für die positiven Populationen sind ebenfalls angegeben. Diese Zahlen reflektieren die Färbungsintensität, gemessen in beliebigen Einheiten, für die Fluoreszenz-positiven Populationen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Materialien und Verfahren
Reagenzien: Bayer A. G., Wuppertal, Deutschland, lieferte rhTNFα. Die rmTNFα und rhLT wurden von Genzyme bezogen. Human-IgG-Fc-Fragmente wurden von Chemicon bezogen. Insulin wurde von Novo Nordisk Labs und all die anderen in den ELISAs verwendeten Antigene wurden von Sigma bezogen. Der Staph. aureus Cowan-Stamm wurde von Calbiochem (San Diego, CA) bezogen. Die anti-Human-IgD-Dextran-Konjugate wurden von privater Seite erhalten. Phorbol-Myristinsäure, Maus-IgG₁, Staphylocaccen-Enterotoxin B (SEB) und Phytohämagglutinin (PHA) wurden von Sigma bezogen. A. coli-LPS wurden von privater Seite erhalten. Die verschiedenen fötalen Rinderseren (FBS) wurden von Hyclone bezogen.
Die in Tabelle 2 genannten Zellinien wurden alle von der American Type Culture Collection (ATCC) bezogen, ausgenommen die 8B9-EBV-transformierte menschliche B-Zellinie, die von Genetic Systems Corporation erhalten wurde.
Der TNF wurde mit Standardverfahren biotinyliert; kurz gesagt, wurde der N-Hydroxisuccinimidylester von Biotin zum TNF, gelöst in 50 mM NaHCO₃, pH = 8,5, 15 min lang gegeben, mit NH₄Cl abgeschreckt und dann dialysiert, um unreagiertes Biotin zu beseitigen.
Der mAb Maus-Al0G10-anti-TNFα-IgG_l wurde in Zusammenarbeit mit der Chiron Corporation erzeugt und hat die ATCC-Bezeichnungsnummer HB 9736, identifiziert als Hybridoma-Zellinie 2-2-3E3.
Die mAb A6- und B6-Maus-IgG_l wurden aus hyperimmunisierten Mäusen im Labor der Erfinder erzeugt. Alle drei Maus-mAb neutralisieren die TNF-Cytatoxizität und sind von Galloway et al in ”Monoclonal anti-Tumor Necrosis Factor (TNF) Antibodies Protect Mouse and Human Cells from TNF cytotoxicity”, J. Immunol. Meth. 140: 37–43 (1991) beschrieben worden, was durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird. Diese mAb wurden durch Affinitätschromatografie gereinigt.
Die polyreaktiven IgM-mAb 1A6B5F und F2.2.34 wurden hergestellt und charakterisiert von Kasaian et al ”Identification and Analysis of a Novel Human Surface CD5- B Lymphocyte Subset Producing Natural Antibodies” J. Immunol. 148: 2690–702 (1992). Der mAb 7T1-Human-IgM wurde von privater Seite hergestellt und in Ascites geliefert.
Die 6F11-E4 (6F11)-EBV-transformierte B-Zellen lymphoblastoidlinie mit der ATCC-Bezeichnungsnummer CRL 1869 erzeugt einen menschlichen Pseudomonas-LPS-spezifischen IgM-Antikörper vom anti-Fisher-Typ 2 und wurde von der Genetic Systems Corporation bezogen. Der monoklonale Antikörper aus dieser Zellinie wurde im Labor der Erfinder hergestellt. Er dient als ein Isotypbezogener Vergleichs-mAb für die menschlchen anti-rhTNFα-mAb. Der mPb C7F7 ist ein Maus-IgG_l-anti-hFVIII, der in Zusammenarbeit mit Genentech Inc. entwickelt wurde, und er wird als ein Isotyp-bezogener Vergleichs-mAb für die Maus-anti-rhTNFα-mAb verwendet.
Ziegen-anti-Maus-IgG und biotinyliertes Ziegen-anti-Human-IgG wurden von Jackson Labs. bezogen. Biotinyliertes Ziegen-anti-Maus IgG und biotinyliertes Maus-anti-Human-IgM wurden von Zymed bezogen. Avidingekuppelte HRP und Avidin-gekuppelte alkalische Phosphatase wurden von Zymed bezogen.
Phycoerythrin-konjugierte anti-CD3- und anti-CD19-Antikörper wurden von Dakopatts, Phycoerythrin-konjugiertes anti-LeuM3 von Becton Dickinson sowie Fluorescein(FL)-konjugierte F(ab)'₂-anti-Human-IgM-, FL-F(ab)'₂-anti-Human-IgG- und FL-F(ab)'₂-anti-Maus-IgG-Antikörper von Cappel bezogen.
ELISA-Verfahren: Antigene oder Einfang-Antikörper (anti-Immunoglobulin-Antikörper) wurden als Überzug auf Kunststoffplatten in Carbonat/Bicarrbonat-Puffer oder in PBS, enthaltend 20 μg/ml BSA, aufgebracht und über Nacht bei 4°C oder 3 h lang bei 37°C gehalten. Sekundärinkubationen wurden über Nacht bei 4°C oder bei Raumtemperatur 2 h lang oder weniger durchgeführt. Sekundäre Antikörper wurde biotinyliert, und deren Bindung wurde mit Avidin-gekuppelter HRP und Avidin-gekuppelter alkalischer Phosphatase aufgedeckt.
SPEZIFISCHE AUSGESCHTALTUNG
Hybrdoma-Herstellung: Die Human-IgM-mAb wurden durch Fusion mit dem Maus-P3X63Ag8.653 nicht-sekretierenden Myelom hergestellt. Peripherale einkernige Blutzellen aus einem CMV-positiven Donor wurden an Ficoll abzentrifugiert, mit L-Leucylleucinmethylester behandelt, in vitro mit Antigen inkubiert und anschließend mit EBV transformiert. Die Transformanten wurden in limitierenden Konzentrationen verteilt, und es wurden Zellen, die Antikörper-Bindung zu TNF erzeugen, fusioniert und anschließend subkloniert. Das B5-Hybridoma wurde mindestens 5mal subkloniert und bei der ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 USA, am 24. März 1993 als Hinterlegung CRL 11306 hinterlegt. Die Hybridoma F448-1D1-A8 und F80-1B9-F12 sind am 11. Mai 1993 als HB 11343 und HB 11 344 hinterlegt worden. Die mAb H5 und 7T1 wurden durch in vitro-Fusion immunisierter menschlicher Mandelzellen hergestellt. Die monoklonalen menschlichen IgM-Antikörper wurden mit Affinitätsstandardverfahren zum Einsatz in anschließenden Versuchen gereinigt.
Cytotoxizitäts-Assay: Zur Bewertung der TNF-Neutralisierfähigkeit verschiedener mAb wurde der von Galloway et al (oben zitiert) beschriebene Assay mit den folgenden geringfügigen Modifikationen angewandt. Kurz gesagt, wurden 20 pg/ml TNF über Nacht mit 60000 WEHI 164-Zellen und dem Test-mAb inkubiert. Die lebensfähigen Zellen wurden dann durch Färbung mit Kristallviolett nachgewiesen, und es wurde die optische Dichte bei 570 nm abgelesen.
Western Blotting: Rekombinanter huTNFα (100 μg/ml plus 100 μg/ml BSA) und rekombinanter mTNFα (5 μg/ml mit 100 μg/ml BSA) wurden einer Elektrophorese in der Gegenwart von β-Mercaptoethanol und SDS an 12%-igen Polyacrylamid-Gelen unterzogen. Proteine wurden dann auf Nitrocellulose transferiert, die dann mit BSA blockiert wurde. Man ließ die Test-mAb sich binden, worauf sie mit biotinylierten anti-Immunoglobulin-Reagenzien nachgewiesen wurden. Streptavidin-HRP wurde dann zugefügt, worauf Substrat zugegeben wurde.
Fluoreszenzanalysen: 1 Million Zellen wurden mit optimalen Konzentrationen von primärem Antikörper, gewöhnlich 2,5 bis 40 μg/ml, bei 4°C 1/2 h lang in PBS, enthaltend 1% FBS und 0,02% Natriumazid, gefärbt. Optimale Konzentrationen fluoreszenter sekundärer Antikörper wurden, nach 2 Zell-Waschvorgängen, eine ähnliche Zeit lang in ähnlichem Puffer zugefügt.
Nach waschen wurden die Zellen mit eines 2%-igen Paraformaldehyd-Lösung fixiert. Die Fluoreszenz der Zellen wurde dann an einem FACSCAN (Name des Geräts) analysiert.
Inhibierung der LPS-Stimulation einer TNFα-Sekretion:
1 Million THP-1-Zellen/ml wurden 4 h lang mit 1 μg/ml E. coli-LPS in Gegenwart oder Abwesenheit von 40 μg/ml Human-IgM-Antikörpern inkubiert.
Überstände wurden geerntet, zentrifugiert, filtriert und bezüglich der TNFα-Cytotoxizität im oben genannten WEHI 164-Assay analysiert. Die Überstände wurde titriert, und es wurde die Lebensfähigkeit gegen die Überstandsverdünnung aufgetragen. Diese Kurven wurden mit einer unter Verwendung von rhuTNFα erhaltenen Standardkurve verglichen, um die tatsächlichen Konzentrationen an TNFα zu bestimmen, die durch die Zellen erzeugt wurden.
ERGEBNISSE

Der monoklonale menschliche IgM-Antikörper B5 bindet an Festphasenrekombinanten menschlichen TNF (rhTNFα). Mehrere Hybridoma, die monoklonale anti-rhTNFα-Antikörper sekretieren, sind im Labor der Erfinder gewonnen und eingeführt worden. Eine Endpunkt-Titeranalyse wurde durchgeführt, wobei eine Versuchsgruppe von 6 menschlichen IgM-mAb und 3 menschlichen IgG-mAb mit den drei mit hoher Affinität neutralisierenden Maus-mAb A10G10, A6 und B6 verglichen wurde. ELISA-Platten wurden mit 2 μg/ml rhTNFα überzogen. Die angegebenen mAb wurden in titrierten (abgemessenen) Konzentrationen zugegehen, und es wurde deren Bindungsverhalten spektrofotometrisch bewertet. Die minimalen mAb-Konzentrationen, die eine nachweisbare rhTNFα-Bindung ergeben, sind aufgeführt. B5 und F12 (F80-1B9-F12) waren 2 der besten Human-IgM-mAb gemäß diesem Kriterium, mit Endpunktstitern im Subnanagramm/ml-Bereich. In der folgenden Tabelle 1 sind die Daten angegeben. Tabelle 1 Vergleich der Festphasen-ELISA-Format-rhTNFα-Bindung mit verschiedenen menschlichen monoklonalen Antikörpern (mAb)

mAb	Endpunktstiter (ng/ml)	Ig-Klasse
A1-G10	0,6	Maus-IgG
A6	0,15	[Maus-IgG
B6	0,08	Maus-IgG
F78-1A10-A1	0,3	Human-IgM
F78-1A10-B5	0,6	Human-IgM
F80-1B9-F12	0,15	Human-IgM
F81-4E3-D6	9,8	Human-IgM
F83-1D6-B6	625,0	Human-IgM
D83-1D6-F6	1250,0	Human-IgM
F83-1A7-G7	0,76	Human-IgG
F83-1G12-C1	1,5	Human-IgG
F83-4D3-D8	0,38	Human-IgG
F83-8D5-F10	0,76	Human-IgG
F84-6G9-D6	1563,0	Human-IgG

Es sollte angemerkt sein, dass die Bereiche und Endpunktstiter für die IgM- und die IgG-anti-TNFα-mAb ähnlich waren.
1 zeigt einen umfangreicheren Vergleich der Human-B5- und Maus-A10G10-mAb. Die Bindung beider mAb war konzentrationsabhängig, und zwar unabhängig von der TNF-Überzugskonzentration. Der B5-mAb wurde geringfügig besser als der A10G10 bei hohen TNF-Überzugskonzentrationen gebunden. Bei verringerter TNF-Überzugskonzentration sank die Bindung des B5 allerdings rascher als die des A10G10 ab. Dies stimmt damit überein, dass der B5 eine niedriger Affinität als der A10G10 für rhTNFα aufweist. Diese Daten belegen, dass der B5-mAb an Festphasen-rhTNFα gebunden wird.
Der B5-mAb wird an ein anderes Epitop auf rhTNFα als an diejenigen gebunden, an die die 3 Maus-anti-TNF-mAb gebunden werden. Kompetitive Bindungsversuche haben belegt, dass A10G10 und B6 ähnliche Epitope auf dem rhTNFα erkennen, wogegen der A6 ein anderes Epitop erkennt (wobei die entsprechenden Daten nicht angegeben sind). Zur Untersuchung der Epitop-Bindungsspezifität des B5 wurden kompetitive Bindungsversuche mit den Maus-mAb und dem B5 durchgeführt.
Die Maus-mAb wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen auf ELISA-Platten gegeben, die vorab mit TNFα überzogen wurden. Eine optimale Konzentration des B5-mAb wurde dann zugefügt, worauf dessen Bindung mit biotinyliertem anti-Human-IgM nachgewiesen wurde. Falls die Maus-mAb das gleiche Epitop wie der B5-mAb erkennen, sollten sie die B5-mAb-Bindung in konzentrationsabhängiger Weise inhibieren.
Wie in 2A gezeigt, ist die Bindung der Maus-mAb an Plattengebundenen rhTNFα konzentrationsabhängig. 2B belegt, dass keiner der Maus-mAb die rhTNFα-Bindung einer festgelegten Menge des B5-mAb störte, sogar bei Konzentrationen der Maus-mAb in deutlichem Überschuss zu den für eine maximale Bindung an die Platte erforderlichen Mengen. Diese Daten legen es nahe, dass der B5 ein Epitop auf den rhTNFα erkennt, das sich von denjenigen unterscheidet, die vom A10G10, A6 und B6 erkannt werden.
Zur Stützung dieser Erkenntnis wurde rhTNFα zu ELISA-Platten gegeben, die vorab mit der Kombination aus den A10G10-, B6- plus A6-mAb überzogen worden waren. Der B5-mAb wurde dann zugefügt, um zu testen, ob er an einen rhTNFα gebunden wurde, der mit den Maus-mAb komplexiert oder von diesen eingefangen worden war.
3 zeigt und belegt, dass der B5 und alle anderen Human-IgM-mAb, ausgenommen der 7T1, an mit den Maus-mAb-komplexierten rhTNFα gebunden wurde. Eine Bindung der menschlichen mAb wurde in der Abwesenheit von rhTNF α nicht beobachtet, was eine Spezifität für ein Epitop auf dem rhTNFα aufzeigt. Dass der 7T1-mAb nicht an einen komplexierten TNF gebunden wird, mag ganz einfach wegen dessen geringer Affinität so sein. Diese Ergebnisse stützen die Schlussfolgerung, dass die menschlichen IgM-mAb B5, F12, A1, B6 und D6 und die drei Maus-mAb unterschiedliche Epitope auf dem rhTNFα erkennen.
Der B5-mAb ist nicht polyreaktiv. Da der B5-mAb ein Human-IgM ist, der an Human-TNFα gebunden wird, und deshalb Eigenschaften aufweist, die ihn als einen Autoantikörper definieren, war es wichtig, die Qualität dieses mAb zu ermitteln und zu bestimmen und seine Polyreaktivität zu bewerten. Es wurde eine Versuchsgruppe menschlicher und nicht-menschlicher Antigene ausgesucht, die in typischer Weise eingesetzt werden, um die Polyreaktivität zu definieren. Es wurde die Bindung dieser Antigene mit dem B5-mAb, dem A10G10, den zwei polyreaktiven menschlichen Vergleichs-IgM-mAb 1A6B5F und F2.2.34 sowie mit 2 weiteren menschlichen IgM-anti-TNF-mAb untereinander verglichen. Die Ergebnisse sind für jeden Antikörper normalisiert worden, um einen direkten Vergleich zu ermöglichen.
In 4 sind die Daten aus einem von vier ähnlichen Versuchen dargestellt. Der Maus-mAb A10G10 wird spezifisch an den rhTNFα und an keines der anderen Antigene gebunden. Im Gegensatz dazu, bindet sich der polyreaktive mAb 1A6B5F eigentlich an alle der getesteten Antigene. Das gleiche galt für den weiteren polyreaktiven mAb F2.2.34, obwohl dessen Bindung an BSA und TNF viel stärker als die mit den weiteren Antigenen beobachtete war. Der B5-mAb zeigte und ergab eine Spezifität für rhTNFα. Es wurde weder eine Bindung des B5-mAb an rekombinantes Human-Lymphotoxin (rhTNFβ) noch an andere getestete Antigene beobachtet. Diese Daten belegen, dass der B5-mAb nicht polyreaktiv ist.
Im Gegensatz dazu, werden die 7T1- und H5-Human-IgM-mAb an menschliche Fc-Fragemente gebunden, was eine Rheumatoidfaktor-Natur anzeigt. Diese zwei Antikörper binden auch an Insulin, und 7T1 bindet BSA ebenfalls. Die polyreaktiven Vergleichs-mAb scheinen zwei Klassen von Polyreaktivität zu definieren; die eine ist sehr breit bezüglich der Spezifität, und die andere ist eingeschränkter bezüglich der erkannten Antigene. Die 7T1- und R5-mAb gehören zur eingeschränkteren Klasse polyreaktiver mAb. Der F12-anti-7NF-mAb wird an menschlichen TNFα gebunden, aber nur marginal an weitere Antigene.
Der B5-mAb bindet an rekombinanten Maus-TNFα. Im Laufe der Analyse der Spezifität des B5-mAb ist festgestellt worden, dass er auch an Maus-TNFα bindet. Um dies zu belegen, haben die Erfinder zuerst Maus-TNFα mit einem neutralisierenden monoklonalen Hamster-Antikörper eingefangen, und sie haben dann den B5 an diesen Komplex zur Bindung gelangen lassen. 5 zeigt die Ergebnisse dieses Versuchs. Die Bindung von B5 war sowohl von der Konzentration von vorhandenem B5 als auch von der Konzentration von Hamster-Antikörper abhängig, der zum Überziehen der Platten verwendet wurde. Es wurde keine Bindung beobachtet, als Maus-7NFα nicht zugefügt wurde, was die Spezifität der B5-Bindung in diesem System aufzeigt. Weitere Versuche, die nicht angegeben sind, ergaben eine Bindung an Maus-TNFα durch den F12-mAb.
Der B5-mAb bindet an löslichen rhTNFα mit nachweisbarer, aber niedriger Affinität. Als nächstes wurde die Befähigung des mAb zur Bindung an löslichen rhTNFα bewertet. ELISA-Platten wurden mit anti-Human-IgM überzogen, und der B5 wurde dann zugefügt. Die Befähigung des gebundenen B5-mAb zum Einfang von biotinyliertem rhTNFα wurde dann bestimmt und ermittelt.
In 6 sind die Befähigungen von A10G10 und B5, löslichen TNFα unter diesen Bedingungen zu binden, verglichen. Obwohl beide mAb löslichen rhTNFα binden, ist eine ca. 300-fach höhere Konzentration des B5-mAb für eine Bindung erforderlich, wie sie äquivalent zu der des A10G10 ist. Ferner war die Bindung des löslichen TNFα an immobilisierten B5 nicht mit den Konzentrationen des getesteten B5 gesättigt. Diese Ergebnisse stimmen mit einer niedrigen Affinitätsbindung von rhTNFα durch B5-mAb überein. Tatsächlich ergaben versuche zur Messung der Bindungskonstante von B5-mAb eine zu niedrige Affinität, um mit herkömmlichen Verfahren berechnet werden zu können (die Daten sind nicht angegeben).
Eine Bindung von löslichem rhTNFα durch B5 wurde auch belegt, wobei Platten mit anti-IgM überzogen, B5 eingefangen und dann unmodifiziertzer löslicher rhTNFα zugefügt wurden. A10G10 wurde dann zugegeben, und dessen Bindung an diese B5-komplexierte Form von rhTNFα wurde mit biotinyliertem anti-Maus-IgG nachgewiesen. In 7 sind die Befähigungen von B5 und dem Vergleichs-Human-IgM 6F11, löslichen rhTNFα einzufangen und dies zu zeigen, mit A10G10 verglichen. Obwohl etwas an nicht-spezifischer Bindung mit dem Vergleichs-mAb beobachtet wurde, band der B5-mAb ungefähr 4- bis 8-mal mehr rhTNFα in diesem Versuch. Diese Daten stimmen mit einer niedrigen Bindungskonstante des B5 überein und liefern eine weitere Stütze für das Konzept, das der B5- und der A10G10-mAb unterschiedliche Epitope auf dem rhTNFα erkennen.
Der B5-mAb erkennt rhTNFα in Western Blots. 8 zeigt die Ergebnisse eines Versuchs mit einem Western Blotting-Verfahren, um eine B5-Bindung an denaturierten TNFα zu belegen. Die Bilder sind der Klarheit wegen vergrößert worden. In den Bahnen A bis G wurde die Bindung an Maus TNFα und in den Bahnen H und I wurde die Bindung an menschlichen TNFα untersucht. Der 6F11-Antikörper wurde an keine TNFα-Species gebunden und liefert somit einen Spezifitätsvergleich. Alle menschlichen IgM-mAb, nämlich 7T1, H5, 1A6B5F und B5, binden an Maus-TNFα. Ferner bindet der B5-Antikörper auch an menschlichen TNFα unter diesen Bedingungen. Diese Ergebnisse legen es nahe, dass B5 ein lineares Epitop von rhTNFα erkennen kann.
Der B5-mAb neutralisiert die Cytotoxizität von rhTNFα nicht. Die TNF-empfindliche Zellinie WEHI 164 wurde verwendet, um die Befähigung des B5-mAb zur Neutralisierung der TNFα-Cytotoxizität zu bewerten. 9 zeigt, dass der A10G10 ganz klar den rhTNFα dosisabhängig neutralisiert, wie früher bereits von Galloway et al belegt (oben zitiert). Dagegen war bei keiner Konzentration von B5 eine Neutralisierung von rhTNFα zu beobachten. Das gleiche gilt für die drei weiteren menschlichen IgM-anti-TNFα-mAb B6, F12 und 7T1, die getestet wurden. Diese Daten liefern eine weitere stütze für die Idee, dass B5 und A10G10 unterschiedliche Epitope von TNF binden, und sie stimmen auch mit der Befähigung des B5-mAb überein, löslichen rhTNFα nur schwach zu binden.
Der B5-mAb-anti-rTNFα bindet sich an die Oberfläche verschiedener unterschiedlicher Zellinien. Da der B5-mAb spezifisch an rTNFα gebunden wird, wurden einige Zellinien ausgewählt, um zu testen, ob der mAb an deren Oberflächen gebunden werden würde oder nicht. 10 zeigt die Ergebnisse eines typischen Versuchs mit 2 Zellinien. Die EBV-transformierte menschliche B-Lymphoblastoid-Zellinie 8B9 und die menschliche Monocyt-Zellinie THP-1 wurden entweder mit dem B5-anti-TNFα- oder dem 6F11-anti-Pseudomonas-LPS-mAb und dann mit fluoreszenten anti-Human-IgM-F(ab)'₂-Fragmenten gefärbt.
Die 8B9-Zellen wurden gut mit dem B5-mAb gefärbt, wogegen keine signifikante Bindung an die Zelloberfläche mit dem Vergleichs-6F11-mAb beobachtet wurde. Eine Färbung des B5 wurde auch mit den THP-1-Zellen beobachtet. Allerdings wurden weniger Zellen in dieser Population gefärbt, und die beobachtete Färbung war irgendwie schwächer als diejenige mit den 8B9-Zellen. Dennoch exprimierten fast 1/3 der Zellen in der THP-1-Population Zelloberflächen (cell surface)-TNFα (csTNFα), wie mit dem B5-mAb nachgewiesen. Es ist unklar, ob diese Färbungsmenge eine gewisse Regulation der csTNFα-Expression reflektiert, oder ob dies wegen klonaler Variation innerhalb der Zellinie so ist.
Die Konzentrationsabhängigkeit der B5-Bindung an Zelloberflächen wurde noch näher mit den THP-1-Monocyt- und den U937-Histiocyt-Zellinien untersucht. Diese Zellen wurden mit titrierten Mengen von B5-Antikörper nach Inkubation über 3 h mit entweder keinem Stimulus, mit LPS oder mit LPS + PMA gefärbt. Die Ergebnisse sind in 11 gezeigt. In allen Fällen war die B5-Bindung an die Zellen dosisabhängig. Interessanterweise wurde mehr Bindung für beide Zellinien beobachtet, als sie mit LPS oder mit LPS + PMA vorinkubiert wurden. Dies war besonders erkennbar für die U937 Zellinie. Diese Steigerung stimmt mit der bekannten Befähigung dieser Mittel überein, die Sekretion von TNF durch Monocyt-Zellinien zu induzieren. Bei Stimulierung war die Bindung des B5 an die Zellen, sogar bei nur einigen hundert Nanogramm/ml Antikörper, erkennbar.

Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse von zwei versuchen, in denen die Bindung des B5-anti-TNFα-mAb verfolgt wurde. Zellen wurden mit den angegebenen primären Antikörpern und mit Fluorescein-markiertem anti-Human-IgM-(μ-spezifischem) Sekundär-Antikörper gefärbt. Die Prozentsätze positiv färbender Zellen sind gemäß Bestimmung an einem FACSCAN-Gerät angegeben. Tabelle 2 Bindung eines TNFα-spezifischen B5-Human-IgM-mAb an verschiedene Zellinien

		positive Prozent-Zellfärbung Primärer Antikörper
Versuchslinie	Phänotyp	keiner	B5	6F11
8B9-EBV	Human-B-Lymphoblast	1,1	86,9	4,7
1A2-EBV	Human-B-Lymphoblast	2,3	64,7	2,7
hpbl-EBV	Human-B-Lymphoblast	2,0	96,2	2,3
cpbl-EBV	Schimpansen-B-Lymphoblast	6,6	76,1	6,2
Mandel-EBV	Human-B-Lymphoblast	4,6	91,2	4,9
Jurkat	Human-T-Lymphom	0,7	17,9	1,2
LBRM33	Maus-T-Lympoam	3,1	72,7	3,8
DU4475	Human-Brustcarcinom	10,2	52,4	9,8
SW1088	Human-Astrocytom	11,2	15,3	10,9
U118MG	Human-Glicblastom	6,2	7,3	6,2
U373	Human-Glioblastom/Astrocytom	4,9	69,6	3,5
U937	Human-Histiocyt-Lymphom	0,9	63,1	1,5
THP-1	Human-Monocyt	1,7	25,2	2,0
1A2-EBV	Human-B-Lymphoblast	2,2	98,4	2,9
8B9-EBV	Human-B-Lymphoblast	4,7	98,8	5,4
A375	Human-Melanom	1,7	8,5	2,5

Eine Vielzahl von Zellinien wurden getestet, einschließlich derer mit Human-B- und T-Lymphocyt-, Brustcarcinom-, Astrocytom-, Glioblastom-, Monocyt-, Histiocyt-, Melanom- und mit Monoblast-Ursprung. Hin Maus-T-Zellen-Lymphom wurde ebenfalls getestet. Von den getesteten 16 Linien zeigte lediglich das Brustcarcinom U118MG keine Bindung durch B5. Die anderen ergaben einen Prozentsatzbereich der Zellen innerhalb jeder Population, die csTNFα exprimierten, von einem so niedrigen Wert von ca. 8% für das A375-Melanom bis über 90% für die EBV-transformierten B-Zellen. Die 6F11-anti-LPS-mAb entsprechende Klasse versagte, auch nur eine dieser Zellinien zu färben. Dies und die negative Zellinie zeigen an, dass die beobachtete B5-Färbung spezifisch und nicht das Ergebnis einer allgemeinen Affinität für alle Zellen war.
Fehlen einer neutralisierenden Maus-anti-TNFα-mAb-Bindung an cs-TNFα
ELISA-Versuche haben die TNF-Spezifität des B5-mAb gezeigt und dessen Bindung an ein Epitop auf TNFα belegt, das sich von demjenigen unterscheidet, das durch einen neutralisierenen Maus-mAb A10G10 gebunden wird. Als nächstes wurde untersucht, ob das durch den A10G10-mAb erkannte Epitop auf der Oberfläche von Zellen exprimiert wurde, an die B5 bindet.

Tabelle 3 zeigt Daten aus fünf entsprechenden Versuchen, in denen die U937- und THP-1-Zellinien verwendet wurden. Die Zellen wurden mit den angegebenen primären Antikörpern und mit Fluorescein-markierten axiti-Maus-IgG-(γ-spezifischen) oder anti-Human-IgK-(μ-spezifiscben) Sekundär-Antikörpern gefärbt. Der Stern (*) soll angeben, dass F(ab)'₂-Fragmente des A10G10-mAb verwendet wurden. Die Prozentsätze positiv färbender Zellen sind gemäß Bestimmung an einem FACSCAN-Gerät angegeben. ”Nicht bestimmt” ist mit nd bezeichnet. Tabelle 3 Bindung von Human-B5 und fehlende Bindung von Maus-A10G10-anti-TNFα-mAb an Zelloberflächen-TNF auf unstimulierten Monocyt- und Histiocyt-Zellinien.

Positive Prozent-Zellfärbung Primärer Antikörper
Versuch	Zell-Linie	keiner	A10G10	mIgG_l	keiner	B5	6F11
1	U937	0,3	0,4	nd	2,9	15,1	2,7
2	THP-1 U937	0,9 6,8	2,6 2,4	nd nd	2,3 2,7	24,8 99,1	2,8 2,8
3	THP-1 U937	3,1 1,6	2,7 1,9	nd nd	2,7 1,6	34,7 35,7	3,4 1,8
4	THP-1 11937	2,4 2,8	3,1 2,9	1,6 2,8	1,7 2,2	17,7 20,2	3,4 2,7
5	TFP-1 U937	4,7 1,5	6,0* 9,9*	6,7 2,3*	4,6 1,2	56,3 61,4	nd nd

In allen fünf Versuchen wurde der B5-mb an jede Zellinie gebunden. Dagegen wurde der A10G10-mAb in keinem beachtlichen Ausmass in vier der Versuche gebunden. In einem der fünf Versuche wurde eine kleine Menge von Bindung durch den A10G10 an die U937-Zellen beobachten. Alles in allem, legen es diese Daten nahe, dass TNFα auf der Oberfläche dieser Zellinien vorliegt, das durch A10G10 erkannte Epitop aber nur spärlich zur Bindung durch die mAb in Abwesenheit einer exogenen Stimulation verfügbar ist.
LPS-Induktion einer Zelloberflächen-TNFα-Expression

LPS ist ein allgemein verwendetes Mittel, die Sekretion von TNFα durch menschliche Monocyten zu induzieren. THP-1- und U937-Zellen wurden mit LPS inkubiert, um zu untersuchen, ob oder ob nicht die Expression von csTNFα gesteigert werden kann. Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse von drei Versuchen. Es erfolgte eine Stimulation durch Inkubation über 3 oder 4 h mit 100 ng/ml LPS. Die Zellen wurden mit den angegebenen primären Antikörpern und mit Fluorescein-markierten anti-Maus-IgG-(γ-spezifischen) oder anti-Human-IgM-μ-spezifischen) Sekundär-Antikörpern gefärbt. Der Stern (*) soll anzeigen, dass F(ab)'₂-Fragmente des A10G10-mAb verwendet wurden. Die Prozentsätze positiv färbender Zellen sind gemäß Bestimmung mit einem FACSCAN angegeben. ”Nicht bestimmt” ist mit nd bezeichnet. Tabelle 4 Analyse der Zelloberflächen-Expression von TNFα nach Inkubation mit Lipopo1ysaccharid (LPS)

PositiveProzent-Zellfärbung Primärer Antikörper
Versuch	Zell-Linie	LPS	keiner	A10G10	mIgG_l	keiner	85	6F11
1	THP-1	–	3,1	2,7	nd	2,7	34,7	3,4
		+	6,9	16,5	nd	3,7	43,8	3,6
	U937	–	1,6	1,9	nd	1,6	35,7	1,8
		+	3,9	12,7	nd	1,9	43,5	2,6
2	THP-1	–	2,4	3,1	1,6	1,7	17,7	3,4
		+	3,1	8,3	2,2	3,0	29,6	3,2
	U937	–	2,8	2,9	2,8	2,2	20,2	2,7
		+	3,6	11,8	2,4	2,4	28,4	3,2
3	THP-1	–	4,7	6,0*	6,7	4,6	56,3	nd
		+	8,1	4,9*	5,4	5,0	65,9	nd
	U937	–	1,5	9,9*	2,3	1,2	61,4	nd
		+	1,0	13,1*	3,7	0,7	49,3	nd

In allen drei Versuchen steigerte LPS die Menge der B5-Bindung an die THP-1-Zellen. Dies galt auch für die U937-Zellen in 2 der drei Versuche. Im Gegensatz zu nicht-induzierten Zellen, führte die Stimulation mit LPS für sowohl die THP-1- als auch die U937-Linien zu der Befähigung, durch den A10G10-mAb gefärbt zu werden. Allerdings waren die Prozentsätze von Zellen in beiden Linien, die von A10G10 erkannte TNFα-Epitope exprimierten, klein, verglichen mit denjenigen Prozentsätzen, die mit dem 5-mb beobachtet wurden. Diese Daten legen es nahe, dass csTNFα durch inkubation mit LPS gesteigert werden kann, und dass diese Steigerung mit den erworbenen TNFα-Epitopen korreliert, die von neutralisierenden Antikörpern erkannt werden.
Einfluss anderer Faktoren als durch LPS auf die csTNFα-Expression

Im Laufe der von den Erfindern durchgeführten Versuche verloren einige der untersuchten Zellinien ein wenig der spontanen csTNFα-Expression. Zur Untersuchung des Einflusses von fötalem Rinderserum (FBS) auf die csTNFα-Expression wurden THP-1-Zellen 4 Tage lang in den verschiedenen Losgruppen fötaler Rinderseren gezüchtet und bezüglich einer Zelloberflächen-TNFα-Expression analysiert. In Tabelle 5 sind typische Ergebnisse angegeben. Es sind die Prozentsätze von Zellen angegeben, die sich positiv mit den genannten primären und fluoreszenten sekundären färbendes Antikörpern färben. Die Endatoxin-Konzentrationen, in Limulos-Amebocyt-Lysat-Einheiten, für die FBS-Lose 1079, 1087, 2081 bzw. 1026 betragen 0,125, 0,250, 0,060 bzw. 0,750. Die Analysen wurden mit einem FACSCAN-Gerät durchgeführt. Tabelle 5 Einfluss von fötalem Rinderserum auf die Zelloberflächen-Expression von TNFα durch THP-1-Zellen

FBS--Los #
1. Ab	2. Ab	1079	1087	2081	1026
		positive %-Zellfärbung
keiner	keiner	0,2	0,3	0,1	0,2
keiner	FL-anti-IgM	2,2	3,5	1,6	2,6
B5	FL-anti-IgM	29,5	15,1	6,8	14,1
6F11	FL-anti-IgM	6,7	7,1	4,2	5,2

Die FBS-Lose hatten einen großen Einfluss auf die csTNFα-Expression durch THP-1-Zellen. Die Differenz bei der Exprimierung schwankte um einen Faktor von ca. 4, und zwar in Abhängigkeit von der besonderen angewandten FBS-Charge. Ein Vergleich der Endotoxin-Gehaltsmengen in diesen unterschiedlichen Losen ergab keine direkte Korrelation mit den csTNFα-Gehaltsmengen. Diese Daten legen es nahe, dass andere Faktoren als LPS die Exprimierung von csTNFα beeinflussen können.
Spezifität der B5-mAb-Bindung an csTNFα
In Tabelle 6 sind Daten angegeben, die die Spezifität der B5-mAb-Bindung an die THP-1-Zellen belegen. Der B5-mAb mit 10 μg/ml wurde mit den angegebenen Konzentrationen von Inibitoren inkubiert, bevor er LPS-stimulierten THP-1-Zellen ausgesetzt wurde. Seine Bindung wurde mit Fluorescein-konjugiertem F(ab)'₂-anti-Human-IgM-Antikörper nachgewiesen. LT ist rekombinantes menschliches Lymphotoxin, ECD55 ist die rekombinante extrazelluläre TNFα-Bindungsdomäne des p55-TNF-Rezeptors, und A10G10 ist der neutralisierende Maus-IgG_l-anti-TNFα-mAb. Die Analysen wurden mit einem FACSCAN-Gerät durchgeführt. Tabelle 6 Spezifität der B5-anti-TNFα-mAb-Bindung an die THP-1-Ze1loberfläche

Positive %-Zellfärbung

μg/ml Inhibitor

Inhibitor 0,0 0,03 0,30 3,0 30,0

TNFα 44,1 43,2 35,9 22,2 15,8

LT 44,1 39,8 40,0 40,0 29,7

A10G10 44,1 39,6 40,9 44,4 41,9
Vorinkubation des B5-IgM-mAb mit TNFα inhibierte dessen anschließende Zelloberflächenbindung, und zwar in dosisabhängigerweise, wogegen bei Vorinkubation mit Lymphotaxin dies nicht der Fall war, abgesehen von einem kleinen Effekt bei der höchsten Konzentration. Das Fehlen vollständiger Inhibierung mit den hohen Dosismengen von TNFα stimmt mit der früher dokumentierten niedrigen Affinität dieses mAb für löslichen TNFα überein.
Interessanterweise wurde durch Vorinkubation des B5-mAb mit A10G10 unter anschließender Zugabe der beiden die B5-Bindung nicht abgesenkt. Diese Daten legen es nahe, dass neutralisierender A10G10 nicht für das gleiche Epitop auf TNFα konkurriert, an das der B5-mAb bindet.
B5-Bindung an csTNFα auf frischen menschlichen Milzzellen
Die vorstehend dargelegten Abschnitte beschreiben und belegen eine B5-Bindung an csTNFα auf einigen unterschiedlichen Zellinien. Zur Bestimmung, ob B5 an untransformierte Zellen bindet oder nicht, wurden Versuche mit menschlichen Milzzellen (Splenocyten) durchgeführt.
Zur Analyse der B-Zell-Expression von csTNFα durch B5 wurde unkonjugiertes B5-IgM verwendet, da eine direkte Fluoresceinierung oder Biotinylierung dieses Antikörpers sehr ineffizient war oder dessen TNPα-Bindungsvermögen störte. Fluoreszente F(ab)'₂-Fragmente von anti-Human-IgM-Antikörpern wurde zum Nachweis der B5-Bindung herangezogen. Da viele normale B-Zellen sIgM als einen Antigen-Rezeptor schon exprimieren, war es nicht immer möglich, csTNFα als Steigerung im Prozentsatz von sIgM+-Zellen nachzuweisen. Der Nachweis von csTNFα gelingt allerdings durch Messung der Steigerung der Färbungsintensität mit dem fluoreszenten anti-IgM, wenn Zellen mit dem B5-mAb inkubiert werden, verglichen mit der Inkubation mit entweder Vergleichs-6F11-IgM-mAb oder mit überhaupt keinem Antikörper.
12 belegt diese Verschiebung bei der Fluoreszenzintensität, die beobachtet wird, wenn der B5-mAb sich an B-Zellen bindet. In 12A ist das Fluoreszenz-Histogramm von Zellen dargestellt, die mit anti-IgM-Antikörper allein gefärbt sind. In 12B ist ein Histogramm der selben Zellen dargestellt, wenn sie zuerst mit B5-mAb-anti-TNFα zur Reaktion gebracht und anschließend mit fluoreszentem anti-IgM-Antikörper erneut gefärbt werden. Die am besten geeignete Statistik zur Messung dieser Verschiebung ist der mittlere Kanal der Fluoreszenzintensität, oder ganz einfach der mittlere Kanal. Die mittleren Kanalzahlen sind in den folgenden Tabellen angegeben, wenn B-Zellen untersucht werden.
In Tabelle 7 sind die Daten aus zwei Versuchen mit Milz-Biopsie-Material angegeben. Die Expression von csTNFα auf Monocytea, T- und B-Zellen wurde mit 2 Farb-Immunofluoreszenzanalysen unter Verwendung Phycoerythrin-konjugierter anti-LeuM3, anti-CD3 bzw. anti-cD19 im Zusammenwirken mit Fluorescein-konjugiertem anti-Huma-IgM untersucht.

Menschliche Milzzellen, die 1 Tag nach der Biopsie erhalten wurden, wurden bezüglich Exprimierung einer Zelloberflächenfärbung mit den angegebenen monoklonalen Antikörpern analysiert. Kleine Lymphozyten wurden durch nach vorne und seitlich gerichtete Streueigenschaften zugeordnet und dann analysiert. T-Zellen, B-Zellen und Monocyten wurden mit Phycoerythrinkonjugierten anti-CD3-, anti-CD19- bzw. anti-LeuM3-Antikörpern gefärbt. 2 Farbanalysen wurden dann an diesen Populationen mit Fluorescin-markierten F(ab)'₂-anti-Human-IgM- und den angegebenen IgM-mAb durchgeführt. Die unterstrichenen Werte stellen diejenigen dar, die signifikante Steigerugen beim Prozentsatz positiv gefärbter Zellen oder eine größere als die doppelte Fluoreszenzintensität der entsprechenden Vergleichspopulation zeigen und ergeben. Die Analysen wurden mit einem FACSCAN-Gerät durchgeführt. Tabelle 7 Analyse der Zelloberflächen-TNFα-Expression an frischen menschlichen Milzzellen

Positive %-Zellfärbung (mittlerer Fluoreszenzintensitätskanal
Analysierte Zellen	1.Ab: 2.Ab:	keiner anti-IgM	B5 anti-IgM	7T1 anti-IgM	H5 anti-IgM	6F11 anti-IgM
Milz #1: Lymphozyten		37,9 (86)	60,0 (246)	44,6 (94)	48,0 (95)	37,5 (88)
Cd3+		4,8 (21)	28,9 (19)	10,5 (29)	10,6 (22)	3,9 (24)
LeuM3+		7,4 (125)	28,9 (76)	77,1 (106)	67,5 (124)	8,6 (84)
Milz #2: CD3+		8,8 (32)	88,3 (54)	25,5 (46)	3,7 (47)	7,1 (28)
CD19+		57,5 (125)	97,5 (910)	71,2 (145)	72,2 (138)	55,7 (124)
Leu-M3+		7,7 (196)	49,8 (163)	66,8 (2272)	58,9 (1604)	9,1 (173)

In beiden versuchen stellten Monocyten weniger als 5% der gesamten Milzzellenpopulationen dar. Von diesen wurde eine signifikante Fraktion in beiden Versuchen mit dem anti-TNFα-B5-mAb gefärbt. Dagegen wurden diese Zellen mit dem Vergleichs-6F11-Human-IgM-mAb nicht gefärbt. Diese Ergebnisse legen es nahe, dass einige Milzmonocyten cs3NFα exprimieren.
Die CD3+-T-Zellen zeigten und ergaben eine variable Exprimierung des csTNFα. Während die Prozentsätze von csTNFα-positiven T-Zellen in diesen Versuchen schwankten, war die Färbung mit dem B5-mAb viel schwächer als diejenige, die für B-Zellen und Monocyten beobachtet wurde. Die mittlere Fluoreszenzintensität für T-Zell-csTNFα war nicht einmal doppelt so groß wie diejenige für die Hintergrundvergleichsproben. Diese Ergebnisse legen es nahe, dass eine variable Anteilsmenge von Milz-T-Zellen kleine Mengen von csTNFα exprimieren.
Die Analyse der B-Zell-csTNFα-Expression zeigte und ergab eine ziemlich starke csTNFα-Expression. Wie in Milz Z gesehen, stieg der Prozentsatz von IgM+-B-Zellen nach Inkubation mit B5-mAb an. Ferner wurde die Färbungsintensität der gesamten B-Zellpopulation nahezu verdreifacht. Kein Anstieg der Färbung wurde mit den 6F11-Vergleichsantikörpern beobachtet, was die Spezifität der B5-Färbung auf B-Zellen anzeigt.
Die polyreaktiven mAb 7T1 und H5 wurden in diese Analysen eingeschlossen. Zusätzlich zur Bindung an TNFα reagieren diese Antikörper mit einigen anderen Antigenen. Somit ist die Spezifität deren Zelloberflächenbindung unbekannt. Sie wurden zu Vergleichszwecken eingeschlossen, und zwar nicht nur weil sie an TNF binden, sondern auch weil nur wenig Daten bezüglich der Bindung polyreaktiver mAb an unfixierte Zellen verfügbar sind. Diese Antikörper scheinen mit T- und B-Zellen zu reagieren, reagieren aber mit Monocytoberflächen viel besser. Zusätzlich zu den signifikanten Steigerungswerten bei den Prozentsätzen der Färbung von B- und T-Zellen mit diesen Antikörpern wurde eine Mehrheit von Monocyten in beiden Versuchen gefärbt.
Diese Daten legen es nahe, dass der B5-anti-TNFα-mAb mit Milzlymphozyten der B- und T-Linierungen reagieren kann und auch dazu befähigt ist, Milzmonocyten zu erkennen und zu binden.
B5-Bindung an csTNFα auf gezüchteten menschlichen Milzzellen

Milzzellen von einer Einzelperson, welche in Tabelle 7 bereits untersucht worden waren, wurden in vitro 3 Tage lang mit verschiedenen Stimuli gezüchtet und dann bezüglich der B5-mAb-Bindung analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 angegeben. Die Züchtung dieser Zellen führte zum Verlust von Monocyten, so dass Daten für Leu-M3+-Zellen nicht angegeben sind. Die Zellen wurden für CD3 oder CD19 mit Phycoerythrin-konjugierten Antikörpern gefärbt, um zwei Vergleichsanalysen mit Fluoresceinkonjugiertem F(ab)'₂-anti-Human-IgM- und den angegebenen Human-IgM-mAb zu ermöglichen. Alle Zellen wurden analysiert, als kein Aktivator in die Kultur eingeschlossen war, es wurden aber nur große aktivierte Zellen aus Kulturen analysiert, die Aktivatoren enthielten. Die unterstrichenen Werte stellen diejenigen dar, die signifikante Steigerungswerte der Prozentsätze positiver gefärbter Zellen oder mehr als die doppelte Fluoreszenzintensität der entsprechenden Vergleichspopulation zeigen und ergeben. Die Analysen wurden mit einem FACSCAN-Gerät durchgeführt. Tabelle 8 Analyse der Zelloberflächen-TNFα-Expression mit gezüchteten menschlichen Milzlymphozyten Positive %-Zellfärbung (mittlerer Fluoreszenzintensitätskanal)

Aktivator Zelle	1. AB: 2. AB:	–	–	B5	7T1	H5	6F11
Aktivator Zelle		–	+	+	+	+	+ μ
keiner CD3+		0,1 (154)	9,3 (48)	42,2 (17)	11,8(34)	16,6 (25)	10,0 (57)
CD19+		1,0 (22)	85,1 (54)	99,4 (294)	91,8 (56)	96,1 (96)	86,8 (52)
anti-δ-Dex plus Il-2 CD19+		4,0 (76)	96,0 (58)	100,0 (272)	99,5 (82)	99,9 (224)	97,4 (57)
SEB CD3+		9,1 (110)	24,4 (102)	66,4 (84)	44,8 (82)	53,8 (87)	26,1 (106)
SAC D19+		3,4 (42)	58,9 (60)	100,0 (452)	84,1 (93)	94,3 (183)	65,6 (62)

Die in Medium gezüchteten Zellen waren 55% CD19+ (B-Zellen) und 22% CD3+ (T-Zellen). Von den CD19+-Zellen waren 85% sIgM+ mit einer mittleren Kanalintensität von 54. Die Färbung mit dem B5-mAb erhöhte diese Intensität auf einen mittleren Kanalwert von 294 – fast um das 6-Fache höher. Diese Steigerung wurde mit den polyreaktiven oder den Vergleichs-IgM-mAb nicht beobachtet. Steigerungen bei den Prozentsätzen von CD3+-T-Zellen, die B5-mAb banden, wurden ebenfalls beobachtet, obwohl die Färbungsintensität niedrig war. Obwohl anti-IgM alleine eine gewisse T-Zellfärbung zeigte und ergab, führte die Zugabe von 6F11 zu diesen T-Zellen nicht zu einer erhöhten anti-IgM-Färbung, was die Spezifität der B5-Färbung zeigt und nahelegt, dass der B5-mAb nicht an die IgM-Rezeptoren gebunden wird, die auf aktivierten T-Zellen exprimiert werden. Diese Rezeptoren sind wahrscheinlich bereits besetzt und ergeben die Hintergrundfärbung, die mit dem anti-IgM-Sekundär-Antikörper beobachtet wird.
Eine Stimulation mit dem Superartigen Staphylococcal Enterotoxin B (SEE), das sowohl T- als auch B-Zellenaktiviert, ergab ca. 24% der T-Zellen, die den sekundären anti-Human-IgM-Antikörper binden. Allerdings banden ca. 66% der SEB-aktivierten T-Zellen B5-anti-TNFα-mAb. Keine Steigerung bei sIgM+-T-Zellen wurde mit dem 6F11-Vergleichs-mAb beobachtet.
Diese Daten zeigen eine Induktion der csTNFα-Expression an, wenn die T-Zellen aktiviert werden.
B-Zellen, die entweder durch anti-IgD-Dextran oder durch Staphylococcus aureus Cowan-Stamm I (SAC) aktiviert wurden, welche beide potente B-Zell-Mitogene sind, zeigten und ergaben eine Bindung durch B5-anti-TNFα-mAb. Die nach der SAC-Induktion beobachtete höhere B5-Fäungsfluoreszenzintensität legt einen höhere B-Zelloberflächengehalt der TNFα-Expression als denjenigen nahe, der auf anti-IgD-aktivierten B-Zellen oder B-Zellen beobachtet wird, die in Medium allein gezüchtet wurden. Diese Daten legen es nahe, dass sowohl aktivierte menschliche B- als auch T-Zellen csTNFα-Epitope exprimieren, die vom B5-mAb erkannt werden.
Bindung von B5-mAb an peripherale Blut-Lymphozyten des Menschen und Schimpansen

Zur Erweiterung der Erkenntnisse menschlicher Milzlymphozyt-Expression von csTNFα wurden peripherale Blut-Lymphozyten des Menschen und von Schimpansen untersucht. Tabelle 9 zeigt die Ergebnisse, die mit Blut von 2 Schimpasen und 1 Mensch erhalten wurden. Das Schimpansenblut wurde 1 Tag erhalten, nachdem es entnommen wurde, wogegen das menschliche Blut frisch war. Die Verzögerung beim Erhalt des Bluts schien zu einem Verlust von Monocyten aus dem Schimpansenblut zu führen. Peripherale einkernige Blutzellen wurden durch Abtrennung an Ficoll hergestellt und mit PE-derivatisierten anti-CD3, CD19 oder LeuM3 gefärbt. Für die Schimpansen 171 und 203 waren weniger als 2% bzw. 0,6% der Zellen LeuM3+. Etwa 20,2% der menschlichen Zellen waren LeuM3+. Die T-Zellen umfassten 62% und 54% der Schimpansen-Lymphozyten und 68% der menschlichen Lymphozyten. Die B-Zellen-Prozentsätze betrugen 2,8 und 5,4% für die Schimpansen und 16,4% für den Mensch. Die Zellen wurden mit den angegebenen IgM-Primär-Antikörpern inkubiert und anschließend mit dem Fluorescein-konjugierten F{ab)'₂-anti-Humar-IgM-Reagens gefärbt. Die Analysen wurden mit einem FACSCAM-Gerät durchgeführt. Die unterstrichenen Werte sind diejenigen, die signifikante Steigerungsmengen beim Prozentsatz positiv gefärbter Zellen oder eine mehr als doppelte Fluoreszenzintensität der entsprechenden Vergleichspopulation zeigen und ergeben. Tabelle 9 Analyse einer Schimpansen- und Menschen-Peripheralblut-T-Zellen- und B-Zellen-Expression von Zelloberflächen-TNFα %positive Zellen (mittlere Kanalintensität)

Primärer Ab	–	–	6F11	B5	7T1	H5
anti-IgM	–	+	+	+	+	+
Schimp 171 CD3+	0,1 (25)	14,4 (40)	14,8 (42)	31,9 (23)	182 (39)	21,5 (28)
CD19+	0,4 (10)	98,6 (196)	98,4 (196)	99,6 (704)	98,9 (230)	99,6 (312)
Schimp 203 CD3+	0,9 (13)	30,9 (26)	32,1 (27)	53,6 (27)	31,2 (25)	42,0 (24)
CD19+	0,6 (13)	92,3 (70)	90,1 (79)	99,4 (491)	95,1 (101)	98,0 (196)
Mensch CD3+	0,6 (17)	1,7 (24)	3,3 (22)	17,1 (15)	2,8 (19)	4,5 (16)
CD19+	1,3 (37)	83,5 (75)	84,6 (70)	99,4 (316)	91,5 (78)	96,1 (96)
LeuM3+	1,2 (26)	5,6 (9)	4,2 (84)	4,8 (106)	35,3 (74)	30,4 (82)

Im Gegensatz zu den vorherigen Ergebnissen mit der Milz vom Mensch, exprimierten die frischen peripheralen menschlichen Monocyten csTNFα nicht, wie vom B5-mAb gesehen. Eine signifikante Fraktion dieser Zellen band, jedoch, die polyreaktiven mAb 7T1 und H5.
Die frischen menschlichen T-Zellen exprimierten Oberfläche-IgM nicht, wogegen die 1 Tag früher entnommenen Schimpansen-T-Zellen dies taten. T-Zellen aus beiden Species exprimierten jedoch bescheidene Mengen an csTNFα, die durch den B5-mAb nachgewiesen wurden, Diese anti-TAFα-Färbung war allerdings sehr schwach und legt es nahe, dass nur niedrige Gehaltsmengen von csTNFα vorlagen. T-Zellen aus keiner der beiden Species wurden durch polyreaktiven 7T1 oder H5 erkannt.
Im Gegensatz zu den T-Zellen, ergaben die peripheralen Blut-B-Zellen aus sowohl den Schimpansen als auch dem Menschen hohe Gehaltsmengen an von B5-mAb gesehenem csTNFα. Diese Exprimierung war viel intensiver als die mit den T-Zellen gesehene. Diese Ergebnisse legen es nahe, dass normale menschliche peripherale Blut-Monocyten csTNFα nicht exprimieren, wogegen einige T-Lymphocyten und die meisten B-Lymphocyten aus beiden Species dieses Zelloberflächen-Cytokin exprimieren.
B5-anti-TNFα-mAb inhibiert die LPS-induzierte Sekretion von TNFα durch THP-1-Zellen

Zur Untersuchung, ob die Bindung von B5-mAb an csTNFα eine Funktionssignifikanz aufwies oder nicht, wurde die menschliche THP-1-Monocyt-Zellinie mit LPS in der Gegenwart von B5 oder weiteren menschlichen IgM-mAb stimuliert. Es wurde die Sekretion von biologisch aktivem TNFα durch Messung der Cytatoxizitätsaktivität der Überstände der TNFα-empfindlichen WEHI 164-Zellinie analysiert. Die Ergebnisse aus 2 von 4 solcher Versuche sind in Tabelle 10 angegeben. THP-1-Zellen werden 4 h lang mit 100 ng/ml E. coli-LPS in der Gegenwart von 40 μg/ml der angegebenen TNF nicht-neutralisierenden menschlichen IgM-mAb stimuliert. Die Überstände aus diesen Inkubationen wurden dann bezüglich der Cytotoxizität gegen die TNFα empfindliche WEHI 164-Zellinie getestet. Alle Überstands-Cytotoxizität war konzentrationsabhängig und wurde durch den mAb A10G10-anti-TNFα neutralisiert, was eine Cytotoxizität wegen TNFα anzeigt. Die Konzentrationen von sekretiertem TNFα wurde durch Vergleich mit einer Standardkurve bestimmt und ermittelt. Tabelle 10 Inhibierung von LPS-induzierter TNFα-Sekretion durch B5-mAb

Versuch	mAb	μg/ml	pg/ml TNFα	%-Inhibierung
1	keiner	0	1003	0
	6F11	40	990	1
	7T1	40	976	3
	B5	40	102	90
	B5	20	409	59
	B5	10	812	19
	B5	5	962	4
2	keiner	0	2057	0
	6F11	40	1992	3
	B5	40	143	93
	B5	20	783	62
	B5	10	1271	38
	B5	5	2276	–10

Stimulierte THP-1-Zellen sekretierten aktiven TNFα, und alles dieser cytotoxischen Aktivität wurde durch Einbringung von A10G10 in den Cytotoxizitäts-Assay inhibiert (die Daten sind nicht angegeben). Vorherige
Versuche mit B5-mAb im Cytotoxizitätsassay haben gezeigt, dass B5 den TNFα Dicht neutralisiert (9). Tabelle 10 zeigt, dass eine Cokultur der THP-1-Zellen mit B5-mAb die LPS-induzierte TNFα-Sekretion inhibiert. Diese Daten legen es nahe, dass eine Wechselwirkung des B5-mAb mit csTNFα die LPS-induzierte TNF-Sekretion zu inhibieren vermag.
DISKUSSION
Unseres Wissens nach, handelt es sich hier um den ersten Bericht über einen monoklonalen menschlichen Autoantikörper, der spezifisch für menschlichen und Maus-TNFα ist. Es ist unklar, ob der CMV-seropositive Donorursprung des B5-mAb signifikant ist oder nicht. Der Antikörper unterscheidet sich ganz klar von den Maus-mAb, die wir zu TNFα erzeugt haben, von denen alle neutralisierend sind, wie früher bereits von Galloway et al gezeigt (oben zitiert).
Drei Beweislinien legen es nahe, dass der B5-mAb ein Epitop erkennt, das sich von denjenigen unterscheidet, die von den beschriebenen Maus-mAb erkannt werden. Als erstes, gibt es keine Konkurrenz zwischen den menschlichen und den Maus-mAb zur Bindung an mit TNF überzogene Platten. Zweitens, kann TNF, der durch den menschlichen mAb gebunden ist, durch die Maus-mAb erkannt werden und umgekehrt. Schließlich, neutralisiert der B5-mAb einen rhTNFα nicht, wogegen die Maus-mAb dies tun. Man könnte argumentieren, dass TNFα ein Trimer ist und, als solches, TNFα, der an neutralisierende Maus-mAb gebunden ist, die ihrerseits wiederum an Platten fixiert sind, immer noch ein identisches Epitop aufweisen kann, das von dem mAb B5 erkannt werden soll. Das Fehlen einer Konkurrenz zwische den Maus mAb und dem mAb B5 für Platten-gebundenen TNFα ist ein starkes Argument gegen diese Möglichkeit. Die Konkurrenzdaten zusammen mit der fehlenden neutralisierenden Wirkamkeit des B5-mAb stützen die Interpretation einer unterschiedlichen Epitop-Erkennung durch die Maus- und menschlichen mAb. Die biologischen Effekte von TNFα, insbesondere dessen Befähigung zur Begüstigung einer Ig-Sekretion, mögen die Erzeugung einer hohen Affinität ausschließen, die menschlichen anti-TNFα-Autoantikörper durch die angewandten Verfahrensweisen neutralisiert. Diese Befähigung mag auch die unterschiedlichen Epitop-Spezifitäten des B5-mAb und der 3 neutralisierenden Maus-mAb erklären.
Die Basis des glockenförmigen trimeren TNFα-Moleküls, welche das Amino-Ende gegenüber dem Carboxy-Ende enthält, ist die Region des Moleküls, die an TNF-Rezeptoren bindet (M. J. Eck et al ”The Structure of Tumor Necrosis Factor-α at 2.6 Å Resolution, Implications for Receptor Binding” J. Biol. Chem. 264: 17595–605, 1989; und A. Corti et al ”Antigenic Regions of Tumor Necrosis Factor Alpha and Their Topographic Relationships with Structural/Functional Domains” Molec. Immunol. 29: 471–9, 1992). Da die in diesem Bericht angewandten Maus-mAb TNFα neutralisieren und sich erwiesen haben, die Bindung des TNFα an seine Rezeptoren zu blockieren, ist es wahrscheinlich, dass ein Epitop in der Basis des Trimer von diesen Antikörpern erkannt wird. Aus den in diesem Bericht dargelegten Daten könnte man spekulieren, dass der B5-mAb eine Region des TNFα-Moleküls sieht, die näher an der ”Spitze” des Trimer liegt.
Die schwache Bindung des B5-mAb an löslichen TNFα stimmt mit einer niedrigen Bindungskonstante des mAb für den Ligand überein. Dennoch kann die Valenz dieses IgM-mAb diesen Mangel überwiegen, so dass B5 an Festphasen-TNFα so gut wie oder gar besser als die getesteten, mit hoher Affinität neutralisierenden Maus-anti-TNFα-mAb binden kann. Offensichtlich lässt eine Vielpunkt-Bindung den mAb B5 stark an den TNFα haften, wenn eine hinreichende Antigendichte verfügbar, ist.
Obwohl der B5 mit nur niedriger Affinität zu binden scheint, ist von uns gezeigt worden, dass er spezifisch an TNFα bindet, und versagt, an einen der anderen getesteten Antigene zu binden. Dies steht im Gegensatz zur beobachteten Bindung von zwei weiteren polyreaktiven Vergleichs-mAb. Somit erweist sich B5 als monozspezifisch und nicht polyreaktiv. B5 scheint sich spezifisch an ein Epitop, am wahrscheinlichsten an ein lineares Epitop zu binden, welches von Maus- und menschlichem TNFα geteilt wird. Diese Eigenschaften klassifizieren B5 als einen Autoantikörper und unterscheiden ihn von den anderen bisher beschriebenen mAb.
Der menschliche B5-Autoantikörper bindet an Oberflächen-TNFα auf einem breiten Bereich menschlicher Zellinien und Lymphoidzellen. Es ist nicht überraschend, dass er Schimpansen-TNFα erkennt, da es keinen Unterschied bei der Aminosäuresequenz von TNFα aus einem Schimpansen und einem Menschen gibt. Es ist von uns ebenfalls gezeigt worden, dass B5 einen Maus-TNFα erkennt, der zu ca. 80% identisch mit menschlichem TNFα ist (D. Pennica et al ”Cloning and expression in Escherichia coli of the cDNA for Murine Tumor Necrosis Factor”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6060–4, 1985). Somit ist es nicht überraschend, dass B5 einen Maus-csTNFα erkennt.
Weitere Autoren haben die TNF-Produktion durch menschliche B-Zellen gesichert beschrieben (M. Jäätelä, ”Biology of Disease. Biologic Activities and Mechanisms of Action of Tumor Necrosis Factor-ä/Cachectin”, Lab. Invest. 64: 724–42, 1991; und Smeland et al ”Interleukin 4 Induces Selective Produktion of Interleukin 6 from Normal Human B Lymnhocytes”, J. Exp. Med. 170: 1463–68, 1989), sowie für T-Zellen (S.-S. J. Sung et al ”Produktion of Tumor Necrosis Factor/Cachectin by Human T Cell Lines and Peripheral Blood T Pymphocytes Stimulated by Phorbol Myristate Acetate and Anti-CD3 Antibody”, J. Exp. Med. 167: 937-, 1988), für Monocyten (Beutler et al ”The Biology of Cachectin TNFα: Primary Mediator of the Host Response”, Ann. Rev. Immunol. 7: 625–55, 1989), für B-Zellinien (S.-S. J. Sung et al ”Production of Tumor Necrosis Factor/Cachetin by Human T Cell Lines and Peripheral Blood T Lymphocytes Stimulated by Phorbol Myristate Acetate and Anti-CD3 Antibody”, J. Exp. Med. 167: 937-, 1988; und G. J. Jochems et al ”Heterogeneity in Both Cytokine Production and Responsiveness of a Panel of Monoclonal Human Epstein-Barr Virus-Transformed B-Cell Lines”, Hum. Antibod. Hybridomas 257–64, 1991), für Astrocyten (A. P. Liberman et al ”Production of Tumor necrosis Factor and other Cytokines by Astrocytes Stimulated with Lipopolysaccharide or a Neurotropic Virus”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 6348–52, 1989; und I. Y. Chung et al ”Tumor Necrosis Factor Alpha Production by Astrocytes: Induction by Lipopolysaccharide, IFN-gamma, and IL-1 beta”, J. Immunol. 144: 2999–3007, 1990; und K. Selmaj et al ”Identification of Lymphotoxin and Tumor necrosis Factor in Multiple Sclerosis Lesions”, J. Clin. Invest. 87: 949–54, 1991) sowie für einige TNF resistente Zellinien (B. Y. Rubin et al ”Nonhematopoietic Cells Selected for Resistance to Tumor Necrosis Factor Produce Tumor Necrosis Factor”, J. Exp. Med. 164: 1350–5, 1986). Wir erweitern diese Erkenntnisse, um mindestens ein metastatisches Brustcarcinom, nämlich DU4475, ein Melanom A375 und das U373-Astrocytom/Glioblastom einzuschließen. Wir belegen auch eine csTNFα-Expression auf menschlichen Milz-Lympboid-Zellen. Dies ist irgendwie überraschend, weil ein früherer Beleg von csTNFα durch andere die Tendenz ergab, aktivierte Zellen anzuwenden.
Obwohl wir kleine Lymphocyten untersuchten, gemäß Bestimmung durch die Lichtstreueigenschaften, ist es möglich, dass viele dieser Zellen partiell aktiviert wurden oder in einer Differentiationsstufe vorlagen, wobei sie dieses Zelloberflächenmolekül exprimieren konnten. Die kleineren Prozentsätze von T-Lymphocyten und Monocyten aus menschlichem peripheralen Blut, welche csTNFα exprimieren, stimmen mit dem verbleibenden Phänotyp dieser Zellen überein. Jedenfalls legt die Breite der csTNFα-Exprimierung es nahe, dass er eine wichtige Rolle in der Oberfläche vieler Zellen spielt.
Andere Autoren haben gezeigt, dass TNFα sowohl als integrales Transmembran-Protein als auch als reifes Protein vorliegen kann, das an seinen Rezeptor auf Zelloberflächen gebunden ist (B. Luettig et al ”Evidence for the Existence of Two Forms of Membrane Tumor Necrosis Factor: an Integral Protein and a Molecule Attached to its Receptor”, J. Immunol. 143: 4034–38, 1989). Einige Beobachtungen legen es nahe, dass der B5-mAb das integrale Transmembran-Protein erkennt. Die B5-Bindung wurde gesteigert, wenn die Zellen mit LPS oder PMA aktiviert wurden. Beide Mittel, besonders aber PMA, regulieren die TNF-Rezeptor-Exprimierung auf einer Vielzahl von Zelltypen herab (A. E. Ding et al ”Macrophages Rapidly Internalize their Tumor Necrosis Factor Receptors in Response to Bacterial Lipopolysaccharide”, J. Biol. Chem. 264: 3924–9, 1989; und B. A. Aggarwal et al ”Effect of Phorbol. Esters on Down-Regulation and Redistribution of Cell Surface Receptors for Tumor Necrosis Factor α”, J. Biol. Chem. 262: 16450–5, 1987).
Der B5 bindet sich an unstimulierte Zellinien, wogegen Zellinien normalerweise induziert werden missen, um TNF zu sekretieren. Somit wäre bei unstimulierten Zellinien zu erwarten, dass sie nur wenig Rezeptorgebundenen TNF ergeben. Wir zeigten, dass die Bindung von B5 an Zelloberflächen durch Vorinkubation mit TNFα, aber nicht mit dem anti-TNFα-mAb A10G10 inhibiert wurde. Dies zeigt und belegt die Spezifität des B5-Antikörpers.
TNFβ bindet sich an dieselben Rezeptoren wie TNFα und könnte so einigen Rezeptor-gebundenen TNFα auf Zelloberflächen verdrängen. Die Daten in Tabelle 6 mit hohen Dosismengen von TNFβ legen es nahe, dass dies auftrat, was auch durch ein Absinken bei der B5-Färbung nachgewiesen wurde. Aus diesen Gründen ist es wahrscheinlich, dass B5 die 26 kd Transmembran-Form von TNFα und möglicherweise Rezeptor-gebundenen TNF erkennt.
Ein verwirrendes Ergebnis dieser Untersuchungen ist es, dass der B5-mAb an csTNFα in vielen Situationen gebunden wird, in denen eine Bindung des A10G10 entweder nicht vorhanden oder geringer als die mit B5 gesehene ist. Klar ist es, dass diese beiden Antikörper nicht-überlappende Epitope sehen. Da A10G10 eine TNFα-Cytotoxizität neutralisiert und die Bindung von TNFα an seinen Rezeptor verhindert, bindet sich dieser Maus-mAb an TNFα nahe der Rezeptor-Bindungsdomäne.
Andere Autoren haben gezeigt, dass Aminosäuren von mAb, die das Amino-Ende 15 oder so binden, die TNFα-Cytotoxizität blockieren (S. H. Socher et al ”Antibodies Against Amino Acids 1–15 of Tumor Necrosis Factor Block Its Bindung to Cell-Surface Rezeptor” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8829–33, 1987). Somit ist es möglich, dass sich A10G10 an einige der N-terminalen Aminosäuren bindet, die am nächsten zur Membran auf der transmembranen Form von TNFα. liegen. Diese Region mag für den A10G10 zur Bindung nicht zugänglich sein, obwohl das TNF-Molekül selbst vorhanden ist und vom B5-mAb erkannt werden kann.
Western Slotting-Versuche legen es nahe, dass der A10G10 TNFα-Monomere nicht und wahrscheinlich ein Konformationsepitop erkennt (die Daten sind nicht angegeben). Falls Transmembran-TNFα in erster Linie monomer ist, können vom A10G10 erkannte Epitope nicht vorliegen und vorhanden sein. Weitere Versuche können dazu beitragen, zwischen diesen und anderen Möglichkeiten zu entscheiden.
Interessanterweise beobachteten wir eine A10G10-Zelloberflächenbindung, wenn die Zellen mit LPS aktiviert wurden. Diese Induktion verursacht eine Sekretion des biologisch aktiven TNFα-Trimer, das dann an verbleibende TNF-Rezeptoren gebunden werden kann. Da trimerer TNFα multivalent ist, kann er an einige Rezeptoren in einer Weise gebunden werden, die es einem oder gar zwei verbleibenden Rezeptor-Bindungsdomänen ermöglicht, frei zu bleiben. Es kann diese Form von csTNFα sein, die vom A10G10 erkannt wird. Tatsächlich haben andere Autoren gezeigt, dass eine Inkubierung unaktivierter Paraformaldehyd-fixierter menschlicher Monocyten mit TNFα zu TNFα fuhrt, der seine Rezeptoren bindet und diese Monocyten cytotoxisch macht. Ferner wird diese Cytotoxizität durch neutralisierende anti-TNF-Antikörper abgeschafft (A. Nii et al ”The Incubation of Human Blond Monocytes with Tumor Necrosis Factor-Alpha Leads to Lysis of Tumor Necrosis Factor-Sensitive but not Resistant Tumor Cells”, Lymphokine Res. 9: 113–24, 1990).
Ein Modell, das viele der Daten erklärt, beruht darauf, dass Transmembran-TNFα-Monomere vom B5-mAb erkannt werden. Wir haben die Erkennung von löslichem Monomer durch B5 aufgezeigt. Zelloberflächen-TNFα-Monomere könnten eine Gesamtkonformation aufweisen, die sich von derjenigen von trimerem TNF unterscheidet. Sie können immer noch TNF-Rezeptorbindungsdomänen freilegen und so befähigt sein, Cytotoxizität durch Zellkontakt zu vermitteln. Zellen, die viele Monomere exprimieren, könnten somit eine Vernetzung von TNF-Rezeptor auf Zielgruppenzellen verursachen. Ein Aktivierungssignal könnte die Polymerisation von TNF-Monomeren in der Zellmembran verursachen, was zu einer Konfirmationsänderung führt, die, ihrerseits, eine proteolytische Spaltungsstelle freilegen könnte, was dazu führt, dass reifer, biologisch aktiver trimerer TNFα freigesetzt wird. Auf die Freisetzung könnte eine Wechselwirkung mit TNF-Rezeptoren folgen, und eine Bindung des A10G10 ermöglicben, wie oben vorgeschlagen. B5 bindet sich offenbar an Membran-ferne TNF-Domänen und kann, dadurch, entweder die Polymerisation von csTNFα oder eine anschließende Konformationsänderung oder beides stören. B5 wird wahrscheinlich nicht an die proteolytische Spaltungsstelle gebunden, da er sich nicht an das reife trimere Molekül bindet. Dieses Modell würde die Zelloberflächenfärbungsergebnisse sowie auch die beobachtete Inhibierung der TNF-Sekretion nach LPS-Aktivierung der THP-1-Zellen erklären. Es sollte angemerkt sein, dass durch dieses Modell eine Rolle für die cytoplasmische Domäne bei der Polymerisation des csTNFα in Betracht gezogen wird. Dies stellt allerdings nur ein Arbeitsmodell dar und ist, als solches, zugegebenermassen hypothetisch.

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend einen menschlichen monoklonalen Antikörper, der an menschlichen Tumornekrosefaktor alpha bindet, und fähig ist, LPS- induzierte Sekretion von menschlichem Tumor-Nekrose-Faktor alpha durch menschliche Monazyten-Zellen zu inhibieren.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin der Antikörper ein Antikörper des IgM- oder IgG-Typs ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin der Antikörper geeignet ist für die intravenöse Verabreichung.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin der Antikörper von einer Zelllinie, die bei der ATCC unter der Bezeichnung CRL 11306 hinterlegt wurde, exprimiert wird.