KR20090005315A - 항체 정제 - Google Patents

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민 더블유. 완
조지 애브지니노스
그레고리 자비스-파파스토잇시스
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애보트 바이오테크놀로지 리미티드
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Abstract

본 발명은 항체와 하나 이상의 숙주 세포 단백질(HCP)을 포함하는 혼합물로부터 HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법으로서, 상기 혼합물을 1차 이온 교환 물질로 처리하는 이온 교환 분리 단계를 포함하여, HCP 감소된 항체 제조물을 수득하는 방법을 제공한다.
항체 정제, 숙주 세포 단백질(HCP), 이온 교환 수지, 단백질 A 캡처(protein A capture), 바이러스 불활성화, 프로카텝신, 아달리무맙(adalimumab)

Description

항체 정제{Antibody purification}
관련 출원
본 출원은 2006년 4월 5일에 출원한 미국 임시출원 제60/789,725호 및 2006년 4월 6일에 출원한 미국 임시출원 제60/790,414호에 대해 우선권을 주장하고, 각 출원의 내용은 전문이 본원에 참고 인용된다.
단백질의 경제적인 대규모 정제는 생명공학 산업에서 점점 더 중요한 문제가 되고 있다. 일반적으로, 단백질은 당해 단백질의 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 삽입하여 당해 관심대상의 단백질을 생산하도록 조작된 포유동물 또는 세균 세포주를 사용하여 세포 배양에 의해 생산한다. 사용되는 세포주는 살아있는 유기체이므로, 통상적으로 동물 혈청의 제조물로부터 공급되는, 당, 아미노산 및 성장 인자를 포함하는 복합 성장 배지의 공급을 받아야 한다. 상기 세포에 공급된 화합물의 혼합물 및 세포 자신의 부산물로부터 목적하는 단백질을, 사람 치료제로서 사용하기에 충분한 순도로 분리하는 데에는 많은 문제가 존재한다.
발명의 개요
따라서, 프로카텝신(procathepsin) L을 포함하는 숙주 세포 단백질의 양이 감소된 항체 제조물을 수득하는 개선된 방법이 필요하다. 본 발명은 숙주 세포 발현 시스템에서 발현된 항체를 정제하는 방법으로서, 생성된 항체 제조물이 프로카텝신 L을 포함하는 숙주 세포 단백질의 감소된 양을 포함하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 개선된 방법은 숙주 세포 단백질을 정확하게 검출하는 재현가능한 방법의 개발, 및 속도론적 검정도 포함한다.
본 발명은 항체 및 하나 이상의 숙주 세포 단백질(HCP)을 포함하는 혼합물로부터 HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법으로서, 상기 혼합물을 1차 이온 교환 물질로 처리하는 이온 교환 분리 단계를 포함하여, HCP 감소된 항체 제조물을 수득하는 하는 방법을 제공한다. 한가지 양태에서, 이온 교환 분리 단계는 상기 혼합물을 1차 이온 교환 물질 위로 통과시켜 HCP의 수준이 감소된 1차 용출액이 수득되도록 하는 단계를 포함한다. 한가지 양태에서, 본 발명의 방법은 상기 1차 용출액을 2차 이온 교환 물질로 처리하여, HCP 수준이 감소된 1차 관류물(flowthrough)을 생산하는 2차 이온 교환 분리 단계를 추가로 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명의 방법은 소수성 상호작용 분리 단계를 추가로 포함하며, 여기서 1차 관류물을 1차 소수성 상호작용 물질로 처리하여 HCP 수준이 감소된 2차 용출액을 수득한다.
본 발명의 한가지 양태에서, 이온 교환 분리 단계는 혼합물을 1차 이온 교환 물질을 포함하는 칼럼 위에 로딩(loading)하여, HCP 수준이 감소된 1차 용출액을 생산하는 1차 이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함한다. 한가지 양태에서, 본 발명은 상기 1차 용출액을 2차 이온 교환 물질을 포함하는 칼럼 위에 로딩하여 1차 관류물을 수득하는 2차 이온 교환 크로마토그래피 단계를 추가로 포함한다.
한가지 양태에서, 본 발명은 상기 1차 관류물을 1차 소수성 상호작용 물질을 포함하는 칼럼 위에 로딩하여, 2차 용출액을 수득하는 것을 포함하는 소수성 상호작용 분리 단계를 추가로 포함한다. 한가지 양태에서, 소수성 상호작용 분리 단계는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함한다. 한가지 양태에서, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 페닐 세파로스 크로마토그래피이다. 또 다른 양태에서, 소수성 상호작용 물질 위에 로딩되는 항체의 양은 소수성 상호작용 물질 1리터당 항체 약 20 내지 약 40g의 범위이다. 또 다른 양태에서, 소수성 상호작용 물질 위에 로딩되는 항체의 양은 소수성 상호작용 물질 1리터당 항체 약 30 내지 약 36g의 범위이다.
한가지 양태에서, 이온 교환 크로마토그래피 단계는 양이온 교환 크로마토그래피이다. 다른 양태에서, 양이온 교환 크로마토그래피는 설포네이트 그룹에 부착된 합성 메타크릴레이트계 중합체 수지이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 다수의 세척 단계로 이온 교환 물질을 세척함을 추가로 포함한다. 한가지 양태에서, 다수의 세척 단계는 전도도의 증가를 포함한다. 한가지 양태에서, 이온 교환 물질을 약 40 내지 50%의 용출 완충액과 약 50 내지 60%의 물 (예: 주사용수(WFI))을 포함하는 세척으로 세척한다. 한가지 양태에서, 용출 완충액은 20mM Na2PO4, 150mM 염화나트륨, pH 7이다.
한가지 양태에서, 1차 용출액을 1차 이온 교환 크로마토그래피 단계 이전에 바이러스 불활성화 처리한다. 한가지 양태에서, 바이러스 불활성화는 pH 바이러스 불활성화 (예: 1차 용출액의 pH를 감소시켜 바이러스를 불활성화시킴)를 통해 달성된다.
본 발명의 한가지 양태에서, 2차 이온 교환 크로마토그래피 단계는 음이온 교환 크로마토그래피이다. 한가지 양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 Q 세파로스 크로마토그래피이다.
또한, 본 발명은 항체와 하나 이상의 숙주 새포 단백질(HCP)을 포함하는 혼합물로부터 HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법으로서, 1차 용출액의 pH 및 전도도가 2차 이온 교환 물질의 pH 및 전도도와 상당히 유사하도록 1차 용출액의 pH 및 전도도를 변화시켜 HCP의 감소된 수준을 달성하는 방법을 제공한다. 한가지 양태에서, 2차 이온 교환 물질의 pH는 약 7.7 내지 약 8.3의 범위이다. 또 다른 양태에서, 1차 용출액의 pH를 약 7.7 내지 약 8.3의 범위로 변화시킨다. 또 다른 양태에서, 1차 용출액의 pH를 약 8.0으로 변화시킨다. 한가지 양태에서, 2차 이온 교환 물질의 전도도는 약 3.5 mS/cm 내지 약 5.2 mS/cm의 범위, 또는 약 3.5 mS/cm 내지 약 4.9 mS/cm의 범위이다. 한가지 양태에서, 1차 용출액의 전도도를 약 3.5 mS/cm 내지 약 5.2 mS/cm의 범위 또는 약 3.5 mS/cm 내지 약 4.9 mS/cm의 범위로 변화시킨다.
본 발명의 한가지 양태에서, HCP ELISA로 측정했을 때, 1차 용출액은 혼합물보다 약 90 내지 약 100배 더 적은 범위의 HCP를 포함한다. 다른 양태에서, HCP ELISA로 측정했을 때, 1차 관류물은 1차 용출액보다 약 840 내지 약 850배 더 적은 범위의 HCP를 포함한다. 또 다른 양태에서, HCP ELISA로 측정했을 때, 2차 용출액 은 1차 관류물보다 약 3 내지 약 5배 더 적은 범위의 HCP를 포함한다.
본 발명은 항체와 프로카텝신 L을 포함하는 혼합물로부터 프로카텝신 L 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법으로서, 상기 혼합물을 1차 이온 교환 물질로 처리하는 이온 교환 분리 단계를 포함하여, 프로카텝신 L 감소된 항체 제조물을 수득하는 방법을 제공한다.
한가지 양태에서, 이온 교환 분리 단계는 프로카텝신 L의 수준이 감소된 1차 용출액이 수득되도록 1차 이온 교환 물질 위로 상기 혼합물을 통과시킴을 포함한다. 한가지 양태에서, 이온 교환 분리 단계는 1차 이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함하고, 여기서, 1차 이온 교환 물질을 포함하는 칼럼 위에 혼합물을 로딩하여, 프로카텝신 L의 수준이 감소된 1차 용출액을 수득한다.
한가지 양태에서, 본 발명은 상기 1차 용출액을 2차 이온 교환 물질로 처리하여, 프로카텝신 L의 수준이 감소된 1차 관류물을 수득하는 2차 이온 교환 분리 단계를 추가로 포함한다. 한가지 양태에서, 본 발명은 상기 1차 용출액을 2차 이온 교환 물질을 포함하는 칼럼 위에 로딩하여 1차 관류물을 수득하는 2차 이온 교환 크로마토그래피 단계를 추가로 포함한다.
한가지 양태에서, 본 발명은 소수성 상호작용 분리 단계를 추가로 포함하며, 여기서 1차 관류물을 1차 소수성 상호작용 물질로 처리하여 프로카텝신 L의 수준이 감소된 2차 용출액을 수득한다. 다른 양태에서, 본 발명은 상기 1차 관류물을 1차 소수성 상호작용 물질을 포함하는 칼럼 위에 로딩하여, 2차 용출액을 수득하는 것을 포함하는 소수성 상호작용 분리 단계를 추가로 포함한다.
한가지 양태에서, 이온 교환 크로마토그래피 단계는 설포네이트 그룹에 부착된 합성 메타크릴레이트계 중합체 수지를 포함하는 비제한적인, 양이온 교환 크로마토그래피이다.
다른 양태에서, 이온 교환 크로마토그래피 단계는 다수의 세척 단계로 이온 교환 물질을 세척함을 추가로 포함한다. 한가지 양태에서, 다수의 세척 단계는 전도도의 증가를 포함한다. 한가지 양태에서, 이온 교환 물질을 약 40 내지 50%의 용출 완충액과 약 50 내지 60%의 물 (예: 주사용수(WFI))을 포함하는 세척 완충액으로 세척한다. 또 다른 양태에서, 용출 완충액은 20mM Na2PO4, 150mM 염화나트륨, pH 7이다.
본 발명의 한가지 양태에서, 1차 용출액을 1차 이온 교환 크로마토그래피 단계 이전에 바이러스 불활성화로 처리한다. 한가지 양태에서, 바이러스 불활성화는 pH 바이러스 불활성화 (예: 1차 용출액의 pH를 감소시켜 바이러스를 불활성화시킴)를 통해 달성된다.
한가지 양태에서, 이온 교환 크로마토그래피 단계는 음이온 교환 크로마토그래피를 포함한다. 한가지 양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 Q 세파로스 크로마토그래피이다.
또한, 본 발명은 1차 용출액의 pH 및 전도도가 2차 이온 교환 물질의 pH 및 전도도와 상당히 유사하도록 1차 용출액의 pH 및 전도도를 변화시켜, 프로카텝신 L의 감소된 수준을 달성하는 방법을 기술한다. 한가지 양태에서, 2차 이온 교환 물질의 pH는 약 7.7 내지 약 8.3의 범위이다. 다른 양태에서, 1차 용출액의 pH를 약 7.7 내지 약 8.3의 범위로 변화시킨다. 또 다른 양태에서, 1차 용출액의 pH를 약 8.0으로 변화시킨다. 또 다른 양태에서, 2차 이온 교환 물질의 전도도는 약 3.5 mS/cm 내지 약 5.2 mS/cm의 범위, 또는 약 3.5 mS/cm 내지 약 4.9 mS/cm의 범위이다. 한가지 양태에서, 1차 용출액의 전도도를 약 3.5 mS/cm 내지 약 5.2 mS/cm의 범위 또는 약 3.5 mS/cm 내지 약 4.9 mS/cm의 범위로 변화시킨다.
본 발명의 한가지 양태에서, 소수성 상호작용 분리 단계는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함한다. 한가지 양태에서, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 페닐 세파로스 크로마토그래피이다. 또 다른 양태에서, 소수성 상호작용 물질 위에 로딩되는 항체의 양은 소수성 상호작용 물질 1리터당 항체 약 20 내지 약 40g의 범위이다. 또 다른 양태에서, 소수성 상호작용 물질 위에 로딩되는 항체의 양은 소수성 상호작용 물질 1리터당 항체 약 30 내지 약 36g의 범위이다.
한가지 양태에서, 카텝신 L 속도론적 검정으로 측정했을 때, 1차 용출액은 약 25 내지 약 60 RFU/s/항체mg 범위의 카텝신 L 활성을 포함한다.
다른 양태에서, 카텝신 L 속도론적 검정으로 측정했을 때, 1차 관류물은 약 0.4 내지 약 4 RFU/s/항체m 범위의 카텝신 L 활성을 포함한다.
또 다른 양태에서, 카텝신 L 속도론적 검정으로 측정했을 때, 2차 용출액은 약 0.5 내지 약 1.5 RFU/s/항체mg 범위의 카텝신 L 활성을 포함한다.
본 발명의 한가지 양태에서, 프로카텝신 L의 수준은 재현가능하게 낮다.
특히 바람직한 양상에서, 본 발명은 많은 양의 항체-HCP혼합물을 이온 교환 수지 위에 로딩하여 혼합물 중의 HCP를 감소시킬 수 있는 항체 정제 방법을 제공한 다. 당해 방법론은 항체-HCP 혼합물을 이온 교환 수지에 공급하기 전에 단백질 A 캡처(protein A capture)로 처리하지 않은 항체-HCP 혼합물의 경우 사용할 수 있다는 장점이 있다. 항체는 단백질 A에 결합하고 HCP는 관류되도록 단백질 A 칼럼에 항체-HCP 혼합물을 공급하는 단백질 A 캡처는 HCP를 제거하는 수단으로서 항체 정제 과정의 초기 정제 단계로서 일반적으로 사용된다. 따라서, 본 발명의 방법은 초기 단계로서 단백질 A 크로마토그래피를 수행할 필요 없이 많은 항체-HCP 혼합물 로딩량을 정제하는데 유용하다.
따라서, 한가지 양태로서, 본 발명은 항체와 하나 이상의 숙주 세포 단백질(HCP)을 포함하는 혼합물로부터 HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법으로서,
(a) 평형 완충액 중의 1차 이온 교환 수지에 상기 혼합물을 공급하되, 수지 1리터당 30g 초과의 항체를 공급하는 단계;
(b) 다수의 세척 단계로 상기 수지로부터 HCP를 세척하는 단계; 및
(c) 용출 완충액으로 상기 수지로부터 항체를 용출시켜 1차 용출액을 형성하여, HCP 감소된 항체 제조물을 수득하는 단계를 포함하여,
HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 수지 1리터당 약 35 내지 70g의 항체를 공급한다. 또 다른 양태에서, 수지 1리터당 약 70g의 항체를 공급한다. 바람직한 양태에서, 항체와 하나 이상의 HCP를 포함하는 혼합물을 1차 이온 교환 수지에 공급하기 전에 상기 혼합물을 단백질 A 캡처로 처리하지 않는다 (예: 단백질 A 칼럼에 공급하지 않는다).
다수의 세척 단계는 적어도 1차 세척 및 2차 세척을 포함하고, 여기서 1차 세척에서 2차 세척으로 갈수록 전도도가 증가하는 것이 바람직하다. 1차 세척은 평형 완충액으로 수행하고, 2차 세척은 용출 완충액과 물(예: WFI)의 혼합물로 수행하는 것이 보다 바람직하다. 예를 들어, 용출 완충액과 물의 혼합물은 약 40 내지 50% 용출 완충액과 약 50 내지 60% 물을 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 용출 완충액과 물의 혼합물은 약 45% 용출 완충액과 약 55% 물을 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 용출 완충액은 20mM 인산나트륨과 150mM 염화나트륨을 포함한다. 이러한 경우에, 용출 완충액이 45%이고 물이 약 55%인 용출 완충액과 물의 혼합물은 인산나트륨이 9mM이고 염화나트륨이 68mM이다. 바람직한 양태에서, 1차 세척은 20mM 인산염, 25mM 염화나트륨을 포함하는 평형 완충액으로 수행하고, 2차 세척은 9mM 인산염, 68mM 염화나트륨 (45% 용출 완충액, 55% 물)을 포함하는 완충액으로 수행하며, 용출 완충액은 20mM 인산나트륨과 150mM 염화나트륨을 포함한다.
한가지 양태에서, 1차 이온 교환 수지를 사용한 방법은 pH 7에서 수행한다. 다른 양태에서, 1차 이온 교환 수지를 사용한 방법은 pH 5에서 수행한다. 또 다른 양태에서, 1차 이온 교환 수지를 사용한 방법은 약 pH 5 내지 약 pH 7의 범위, 또는 pH 5 내지 pH 7의 범위의 pH에서 수행한다. pH 7을 사용하는 경우, 수지 1리터당 약 35g의 항체를 공급하는 것이 바람직하다. pH 5를 사용하는 경우, 수지 1리터당 약 70g의 항체를 공급하는 것이 바람직하다. 약 pH 5 내지 약 pH 7 범위의 pH (예: pH 5 내지 pH 7)를 사용하는 경우, 수지 1리터당 약 35 내지 약 70g의 항체 (예: 수지 1리터당 35 내지 70g의 항체)를 공급하는 것이 바람직하다.
바람직한 양태에서, 항체-HCP 혼합물로부터 더욱 우수한 HCP 제거는 수지 위 에 로딩되는 항체 양이 적을 때 (예: 수지 1리터당 약 30g의 항체)보다 수지 위에 로딩되는 항체 양이 많을 때 (예: 수지 1리터당 약 70g의 항체) 달성된다 (예: pH 5에서). 이것은, 수지에 대한 항체의 결합친화성이 수지에 대한 HCP의 결합친화성보다 상당히 높은 조건을 사용하는 경우, 수지로부터 HCP가 항체에 의해 치환되는 결과인 것으로 생각된다.
1차 이온 교환 수지는 양이온 교환 수지인 것이 바람직하다. 양이온 교환 수지를 칼럼 속에 형성하고, 항체와 하나 이상의 HCP를 포함하는 혼합물을 상기 칼럼에 공급하는 것이 바람직하다. 양이온 교환 수지는 설포네이트 그룹에 부착된 합성 메타크릴레이트계 중합체 수지 (예: 프락토겔(Fractogel) S)를 포함하는 것이 바람직하다. 대안으로, 양이온 교환 수지는, 예를 들면, 메타크릴레이트 또는 폴리스티렌계 합성 중합체, 실리카, 덱스트란 표면 확장제를 보유한 고도로 가교된 아가로스, 알릴 덱스트란의 가교 공중합체 및 설포늄 이온 또는 설포에틸과 같은 설포네이트 그룹에 부착된 N,N-메틸렌 비스아크릴라 수지를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양상에서, 상기한 1차 이온 교환 수지를 사용하는 방법을 수행한 후, 당해 방법은 1차 용출액을 바이러스 불활성화 단계로 처리함을 추가로 포함한다. 예를 들면, 바이러스 불활성화를 pH 바이러스 불활성화에 의해 달성하여, 바이러스 불활성화된 제조물을 형성할 수 있다 (예: 1차 용출액을 낮은 pH 조건, 예를 들면 약 3.5의 pH로 처리하여, 바이러스를 불활성화시킨다). 바이러스 불활성화된 제조물을 2차 이온 교환 수지에 공급하고, 이러한 2차 이온 교환 수지에 바이러스 불활성화된 제조물을 공급하기 전에, 바이러스 불활성화된 제조물의 pH 및 전 도도를 2차 이온 교환 수지의 pH 및 전도도와 상당히 유사하도록 조정하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 2차 이온 교환 수지의 pH는 약 pH 7.7 내지 약 pH 8.3의 범위일 수 있고, 바이러스 불활성화된 제조물의 pH가 약 pH 7.7 내지 약 8.3의 범위가 되도록 조정한다. 다른 양태에서, 2차 이온 교환 수지의 pH는 약 pH 7.8 내지 약 pH 8.2의 범위일 수 있고, 바이러스 불활성화된 제조물의 pH가 약 pH 7.8 내지 약 8.2의 범위가 되도록 조정한다. 보다 바람직하게는, 2차 이온 교환 수지의 pH는 약 pH 8.0이고, 바이러스 불활성화된 제조물의 pH를 약 pH 8.0으로 조정한다. 또한, 2차 이온 교환 수지의 전도도는 약 3.5 mS/cm 내지 약 5.2 mS/cm의 범위일 수 있고, 바이러스 불활성화된 제조물의 전도도가 약 3.5 mS/cm 내지 약 5.2 mS/cm의 범위가 되도록 조정한다. 바람직하게는, 2차 이온 교환 수지의 전도도는 약 5.0 mS/cm이고, 바이러스 불활성화된 제조물의 전도도가 약 5.0 mS/cm가 되도록 조정한다.
바람직한 양태에서, 2차 이온 교환 수지는 음이온 교환 수지이다. 예를 들어, 음이온 교환 수지는 Q 세파로스 수지이다. 바람직하게는, 2차 이온 교환 수지를 칼럼 속에 형성하고, 바이러스 불활성화된 제조물을 상기 칼럼에 공급하여, 1차 관류물을 수득한다.
본 발명의 다른 양상에서, 2차 이온 교환 수지로부터 1차 관류물을 수득한 후, 상기 1차 관류물을 소수성 상호작용 칼럼에 공급하여, 2차 용출액을 수득할 수 있다. 바람직한 양태에서, 소수성 상호작용 칼럼은 페닐 세파로스 칼럼이다. 한가지 양태에서, 소수성 상호작용 칼럼에 공급되는 1차 관류물은 소수성 상호작용 칼 럼 물질 1리터당 약 20 내지 약 40g의 항체를 포함한다. 다른 양태에서, 소수성 상호작용 칼럼에 공급되는 1차 관류물은 소수성 상호작용 칼럼 물질 1리터당 약 30 내지 약 36g의 항체를 포함한다. 정제 방법에서 이전 단계들의 효율성으로 인하여, 소수성 상호작용 칼럼으로부터 수득된 2차 용출액을 산물 피크 분분획화(product peak fractionation) 처리할 필요가 없다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 한가지 양태에서, 2차 용출액을 산물 피크 분획화 처리하지 않는다.
특히 바람직한 양태에서, 항체와 하나 이상의 숙주 세포 단백질(HCP)을 포함하는 혼합물로부터 HCP 감소된 항체 제조물을 생산하기 위한 본 발명의 방법은,
(a) 상기 혼합물을 평형 완충액 중의 양이온 교환 수지에 공급하되, 상기 양이온 교환 수지에 공급하기 전에 상기 혼합물을 단백질 A 캡처로 처리하지 않으며 수지 1리터당 30g 초과의 항체를 공급하는 단계;
(b) 다수의 세척 단계로 상기 양이온 교환 수지로부터 HCP를 세척하는 단계;
(c) 용출 완충액을 사용하여 상기 양이온 교환 수지로부터 항체를 용출시켜 1차 용출액을 수득하는 단계;
(d) 상기 1차 용출액을 바이러스 불활성화 단계로 처리하는 단계;
(e) 상기 바이러스 불활성화된 제조물을 음이온 교환 수지에 공급하여 1차 관류물을 수득하는 단계; 및
(f) 상기 1차 관류물을 소수성 상호작용 칼럼에 공급하여 2차 용출액을 수득하여, HCP 감소된 항체 제조물을 수득하는 단계를 포함한다.
한가지 양태에서, 양이온 교환 수지는 pH 7이고 수지 1리터당 약 35g의 항체 를 공급한다. 다른 양태에서, 양이온 교환 수지는 pH 5이고 수지 1리터당 약 70g의 항체를 공급한다. 또 다른 양태에서, pH는 약 pH 5 내지 약 pH 7의 범위 (예: pH 5 내지 pH 7)이고 수지 1리터당 약 35 내지 약 70g의 항체 (예: 수지 1리터당 35 내지 70g의 항체)를 공급한다.
바람직하게는, 다수의 세척 단계는 평형 완충액을 사용하는 1차 세척 및 용출 완충액과 물의 혼합물을 사용하는 2차 세척으로 수지를 세척함을 포함한다. 예를 들어, 용출 완충액과 물의 혼합물은 약 40 내지 50% 용출 완충액과 약 50 내지 60% 물 (예: WFI), 보다 바람직하게는 약 45% 용출 완충액과 약 55% 물(예: WFI)을 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 용출 완충액은 20mM 인산나트륨과 150mM 염화나트륨을 포함한다. 이러한 경우에, 용출 완충액이 45%이고 물이 약 55%인 용출 완충액과 물의 혼합물은 인산나트륨이 9mM이고 염화나트륨이 68mM이다. 바람직한 양태에서, 1차 세척은 인산염 20mM과 염화나트륨 25mM을 포함하는 평형 완충액으로 수행하고, 2차 세척은 인산염 9mM과 염화나트륨 68mM (45% 용출 완충액, 55% 물)을 포함하는 완충액으로 수행하며, 용출 완충액은 20mM 인산나트륨과 150mM 염화나트륨을 포함한다.
(a) 내지 (f) 단계의 상기한 방법에서, 바이러스 불활성화된 제조물을 음이온 교환 수지에 공급하기 전에 (즉, (d) 단계와 (e) 단계의 사이), 바이러스 불활성화된 제조물의 pH 및 전도도를 음이온 교환 수지의 pH 및 전도도와 상당히 유사하도록 조정하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 2차 이온 교환 수지의 pH는 약 pH 7.7 내지 약 pH 8.3의 범위일 수 있고, 바이러스 불활성화된 제조물의 pH가 약 pH 7.7 내지 약 pH 8.3의 범위가 되도록 조정한다. 다른 양태에서, 2차 이온 교환 수지의 pH는 약 pH 7.8 내지 약 pH 8.2의 범위일 수 있고, 바이러스 불활성화된 제조물의 pH가 약 pH 7.8 내지 약 8.2의 범위가 되도록 조정한다. 보다 바람직하게는, 2차 이온 교환 수지의 pH는 약 pH 8.0이고, 바이러스 불활성화된 제조물의 pH가 약 pH 8.0이 되도록 조정한다. 또한, 2차 이온 교환 수지의 전도도는 약 3.5 mS/cm 내지 약 5.2 mS/cm의 범위일 수 있고, 바이러스 불활성화된 제조물의 전도도가 약 3.5 mS/cm 내지 약 5.2 mS/cm의 범위가 되도록 조정한다. 바람직하게는, 2차 이온 교환 수지의 전도도는 약 5.0 mS/cm이고, 바이러스 불활성화된 제조물의 전도도가 약 5.0 mS/cm가 되도록 조정한다.
(a) 내지 (f) 단계의 상기 방법에서, 양이온 교환 수지는 설포네이트 그룹에 부착된 합성 메타크릴레이트계 중합체 수지 (예: 프락토겔)이고, 음이온 교환 수지는 Q 세파로스 수지이며, 소수성 상호작용 칼럼은 페닐 세파로스 칼럼인 것이 바람직하다.
HCP ELISA로 측정했을 때, 1차 용출액은 혼합물보다 약 90 내지 약 100배 더 적은 범위의 HCP를 포함하는 것이 바람직하다. HCP ELISA로 측정했을 때, 1차 관류물은 1차 용출액보다 약 840 내지 약 850배 더 적은 범위의 HCP를 포함하는 것이 바람직하다. HCP ELISA로 측정했을 때, 2차 용출액은 1차 관류물보다 약 3 내지 5배 더 적은 범위의 HCP를 포함하는 것이 바람직하다.
특히 바람직한 양태에서, 항체와 하나 이상의 숙주 세포 단백질(HCP)을 포함하는 혼합물로부터 HCP 감소된 항체 제조물을 생산하기 위한 본 발명의 방법은,
(a) 상기 혼합물을 평형 완충액 중의 양이온 교환 수지에 공급하되, 상기 양이온 교환 수지의 pH가 7이고 수지 1리터당 약 35g의 항체를 공급하거나, 또는 상기 양이온 교환 수지의 pH가 pH 5 내지 pH 7의 범위이고 수지 1리터당 약 35 내지 약 70g의 항체를 공급하거나, 또는 양이온 교환 수지의 pH가 5이고 수지 1리터당 약 70g의 항체를 공급하는 단계;
(b) 평형 완충액을 사용하는 1차 세척 및 용출 완충액과 물의 혼합물을 사용하는 2차 세척을 포함하는 세척 단계로 상기 양이온 교환 수지로부터 HCP를 세척하는 단계;
(c) 용출 완충액을 사용하여 상기 양이온 교환 수지로부터 항체를 용출시켜 1차 용출액을 수득하는 단계;
(d) 상기 1차 용출액을 바이러스 불활성화 단계로 처리하되, 바이러스 불활성화를 pH 바이러스 불활성화에 의해 달성하여 바이러스 불활성화된 제조물을 형성하는 단계;
(e) 상기 바이러스 불활성화된 제조물을 음이온 교환 수지에 공급하되, 바이러스 불활성화된 제조물을 음이온 교환 수지에 공급하기 전에 바이러스 불활성화된 제조물의 pH 및 전도도를 음이온 교환 수지의 pH 및 전도도와 상당히 유사하게 조정하여 1차 관류물을 수득하는 단계; 및
(f) 상기 1차 관류물을 소수성 상호작용 칼럼에 공급하여 2차 용출액을 수득하여, HCP 감소된 항체 제조물을 수득하는 단계를 포함한다.
항체 혼합물은 양이온 교환 수지에 공급하기 전에 단백질 A 캡처로 처리하지 않는 것이 바람직하다. 용출 완충액과 물의 혼합물은 약 40 내지 50% 용출 완충액과 약 50 내지 60% 물, 보다 바람직하게는 약 45% 용출 완충액과 약 55% 물(예: WFI)을 포함하는 것이 바람직하다. 바람직한 양태에서, 용출 완충액은 20mM 인산나트륨과 150mM 염화나트륨을 포함한다. 이러한 경우에, 45% 용출 완충액과 약 55% 물인 용출 완충액과 물의 혼합물은 인산나트륨이 9mM이고 염화나트륨이 68mM이다. 바람직한 양태에서, 1차 세척은 인산염 20mM과 염화나트륨 25mM을 포함하는 평형 완충액으로 수행하고, 2차 세척은 인산염 9mM과 염화나트륨 68mM (45% 용출 완충액, 55% 물)을 포함하는 완충액으로 수행하며, 용출 완충액은 20mM 인산나트륨과 150mM 염화나트륨을 포함한다. HCP ELISA로 측정했을 때, 1차 용출액은 혼합물보다 약 90 내지 약 100배 더 적은 범위의 HCP를 포함하는 것이 바람직하다. HCP ELISA로 측정했을 때, 1차 관류물은 1차 용출액보다 약 840 내지 약 850배 더 적은 범위의 HCP를 포함하는 것이 바람직하다. HCP ELISA로 측정했을 때, 2차 용출액은 1차 관류물보다 약 3 내지 약 5배 더 적은 범위의 HCP를 포함하는 것이 바람직하다.
상기한 임의의 정제 방법의 바람직한 양상에서, HCP는 프로카텝신 L을 포함하여, 프로카텝신 L 감소된 항체 제조물을 수득한다. 카텝신 L 속도론적 검정으로 측정했을 때, 용출액은 약 25 내지 약 60 RFU/s/항체mg 범위의 카텝신 L 활성을 포함하는 것이 바람직하다. 카텝신 L 속도론적 검정으로 측정했을 때, 1차 관류물은 약 0.4 내지 약 4 RFU/s/항체mg 범위의 카텝신 L 활성을 포함하는 것이 바람직하다. 카텝신 L 속도론적 검정으로 측정했을 때, 2차 용출액은 약 0.5 내지 약 1.5 RFU/s/항체mg 범위의 카텝신 L 활성을 포함하는 것이 바람직하다. 프로카텝신 L의 수준은 재현가능하게 낮은 것이 바람직하다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 항체와 하나 이상의 숙주 세포 단백질(HCP)을 포함하는 혼합물로부터 HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법으로서,
(a) 상기 혼합물을 양이온 교환 수지에 공급하여 1차 용출액을 수득하는 단계;
(b) 상기 1차 용출액을 음이온 교환 수지에 공급하여 1차 관류물을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 1차 관류물을 소수성 상호작용 칼럼에 공급하여 2차 용출액을 수득하여, HCP 감소된 항체 제조물을 수득하는 단계를 포함하여,
HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법에 관한 것이다.
상기 항체와 하나 이상의 HCP를 포함하는 혼합물을 1차 이온 교환 수지에 공급하기 전에 단백질 A 캡처로 처리하지 않는 것이 바람직하다. 상기 방법은 1차 용출액을 음이온 교환 수지에 공급하기 전에 1차 용출액을 바이러스 불활성화 단계로 처리함을 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 바이러스 불활성화를 pH 바이러스 불활성화에 의해 달성할 수 있다.
양이온 교환 수지는 설포네이트 그룹에 부착된 합성 메타크릴레이트계 중합체 수지를 포함하는 것이 바람직하다 (예: 양이온 교환 수지는 프락토겔 S 칼럼일 수 있다). 예를 들어, 프락토겔 S 칼럼을 20mM 인산나트륨, 25mM 염화나트륨을 포함하는 평형 완충액으로 평형화시킬 수 있고, 혼합물을 상기 칼럼에 공급할 수 있으며, 상기 칼럼을 평형 완충액으로 1회 이상 세척할 수 있고, 20mM 인산나트륨, 150mM 염화나트륨을 포함하는 용출 완충액으로 용출시켜 1차 용출액을 수득할 수 있다.
음이온 교환 수지는 Q 세파로스 칼럼인 것이 바람직하다. 예를 들어, Q 세파로스 칼럼을 25mM 트롤아민, 40mM 염화나트륨을 포함하는 평형 완충액(pH 7.6)으로 평형화시킬 수 있다.
소수성 상호작용 칼럼은 페닐 세파로스 칼럼인 것이 바람직하다. 예를 들어, 페닐 세파로스 칼럼을 20mM 인산나트륨, 1.1M (NH4)2SO4를 포함하는 평형 완충액(pH 7)으로 평형화시킬 수 있고, 상기 칼럼에 1차 관류물을 공급할 수 있으며, 상기 칼럼을 평형 완충액으로 1회 이상 세척할 수 있고, 11mM 인산나트륨, 0.625M (NH4)2SO4 (pH 7.0)까지 염 단계구배를 수행하여 2차 용출액을 수득할 수 있다.
pH 바이러스 불활성화는 1차 용출액의 pH를 약 1시간 동안 3.5로 유지시킴으로써 달성하는 것이 바람직하다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 아달리무맙(adalimumab)과 하나 이상의 숙주 세포 단백질(HCP)을 포함하는 혼합물로부터 HCP 감소된 아달리무맙 제조물을 생산하는 방법으로서,
(a) 1차 이온 교환 수지에 공급하기 전에 단백질 A 캡처로 처리하지 않은 상기 혼합물을 양이온 교환 수지에 공급하여 1차 용출액을 수득하는 단계;
(b) 상기 1차 용출액을 pH 바이러스 불활성화로 처리하여 바이러스 불활성화된 제조물을 수득하는 단계;
(c) 상기 바이러스 불활성화된 제조물을 음이온 교환 수지에 공급하여 1차 관류물을 수득하는 단계; 및
(d) 상기 1차 관류물을 소수성 상호작용 칼럼에 공급하여 2차 용출액을 수득하여, HCP 감소된 아달리무맙 제조물을 수득하는 단계를 포함하여,
HCP 감소된 아달리무맙 제조물을 생산하는 방법에 관한 것이다.
양이온 교환 수지는 프락토겔 S 칼럼이고, 음이온 교환 수지는 Q 세파로스 칼럼이며 소수성 상호작용 칼럼은 페닐 세파로스 칼럼인 것이 바람직하다. 예를 들어, 프락토겔 S 칼럼을 20mM 인산나트륨, 25mM 염화나트륨을 포함하는 평형 완충액으로 평형화시킬 수 있고, 상기 칼럼에 혼합물을 공급할 수 있으며, 상기 칼럼을 평형 완충액으로 1회 이상 세척될 수 있고, 20mM 인산나트륨, 150mM 염화나트륨을 포함하는 용출 완충액으로 용출시켜 1차 용출액을 수득할 수 있다. 또한, 예를 들어, Q 세파로스 칼럼을 25mM 트롤아민, 40mM 염화나트륨을 포함하는 평형 완충액(pH 7.6)으로 평형화시킬 수 있다. 또한, 예를 들어, 페닐 세파로스 칼럼을 20mM 인산나트륨, 1.1M (NH4)2SO4를 포함하는 평형 완충액(pH 7)으로 평형화시킬 수 있고, 상기 칼럼에 1차 관류물을 공급할 수 있으며, 상기 칼럼을 평형 완충액으로 1회 이상 세척할 수 있고, 11mM 인산나트륨, 0.625M (NH4)2SO4 (pH 7.0)까지 염 단계구배를 수행하여 2차 용출액을 수득할 수 있다. 또한, 예를 들면, pH 바이러스 불활성화는 1차 용출액을 pH 3.5에서 약 1시간 동안 유지시켜 달성할 수 있다.
상기한 모든 정제 방법과 관련하여, 본 발명의 바람직한 양태에서, 항체는 항-종양 괴사 인자-알파(TNFα) 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 한가지 양태에서, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 키메릭(chimeric) 항체, 사람화된 항체 또는 다가(multivalent) 항체이다. 한가지 양태에서, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 인플릭시맙(infliximab) 또는 골리무맙(golimumab)이다.
다른 양태에서, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 사람 항체이다. 한가지 양태에서, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합 부분은, 표면 플라스몬 공명으로 측정했을 때, 1 x 10-8 M 이하의 Kd 및 1 x 10-3 s-1 이하의 Koff 속도 상수로 사람 TNFα로부터 해리되고, 표준 시험관내 L929 검정에서 1 x 10-7 M 이하의 IC50으로 사람 TNFα 세포독성을 중화시키는 분리된 사람 항체이다.
다른 양태에서, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합 부분은,
a) 표면 플라즈몬 공명으로 측정했을 때, 1 x 10-3 s-1 이하의 Koff 속도 상수로 사람 TNFα로부터 해리되고;
b) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나, 위치 1, 4, 5, 7 또는 8번에서의 단일 알라닌 치환 또는 위치 1, 3, 4, 6, 7, 8 및/또는 9번에서의 1개 내지 5개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호 3으로부터 변형된, 경쇄 CDR3 도메인을 보유하며;
c) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나, 위치 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 또는 11번에서의 단일 알라닌 치환 또는 위치 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 및/ 또는 12번에서의 1개 내지 5개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호 4로부터 변형된, 중쇄 CDR3 도메인을 보유하는 특징을 갖는 분리된 사람 항체이다.
또 다른 양태에서, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역(LCVR) 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역(HCVR)을 보유하는 분리된 사람 항체이다.
또 다른 양태에서, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 아달리무맙이다.
본 발명은 본 발명의 임의의 방법에 의해 생산된, HCP ELISA로 측정했을 때 HCP가 실질적으로 부재하는 항체 제조물을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 임의의 방법에 의해 생산된 HCP 감소된 항체 제조물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 HCP 감소된 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서, HCP ELISA로 측정했을 때 HCP의 수준이 항체 1mg당 약 70ng 이하의 HCP를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 한가지 양태에서, HCP ELISA로 측정했을 때 HCP의 수준은 항체 1mg당 약 13ng 이하의 HCP를 포함한다. 다른 양태에서, HCP ELISA로 측정했을 때 HCP의 수준은 항체 1mg당 약 5ng 이하의 HCP를 포함한다.
본 발명은 HCP ELISA 분석으로 측정했을 때 검출가능한 수준의 HCP가 없는, 항체를 포함하는 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본원에서 기술된 임의의 방법에 의해 생산된, 프로카텝신 L 이 실질적으로 부재하는 항체 제조물을 제공한다. 또한, 본 발명은 본원에서 기술된 임의의 방법에 의해 생산된 프로카텝신 L 감소된 항체 제조물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물도 포함한다.
본 발명은 프로카텝신 L 감소된 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하되, 프로카텝신 L의 수준이 약 3.0 RFU/s/항체mg의 카텝신 활성 이하인 약제학적 조성물을 제공한다.
상기한 모든 항체 제조물 및 약제학적 조성물과 관련하여, 항체는 항-종양 괴사 인자-알파(TNFα) 항체 또는 이의 항원 결합 부분인 것이 바람직하다. 한가지 양태에서, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 사람화된 항체, 키메릭 항체 또는 다가 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항체이다. 한가지 양태에서, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 인플릭시맙 또는 골리무맙이다.
다른 양태에서, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 사람 항체이다. 한가지 양태에서, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 표면 플라즈몬 공명으로 측정했을 때, 1 x 10-8 M 이하의 Kd 및 1 x 103 s-1 이하의 Koff 속도 상수로 사람 TNFα로부터 해리되고, 표준 시험관내 L929 검정에서 1 x 10-7 M 이하의 IC50으로 사람 TNFα 세포독성을 중화하는 분리된 사람 항체이다.
다른 양태에서, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합 부분은,
a) 표면 플라즈몬 공명으로 측정했을 때, 1 x 10-3 s-1 이하의 Koff 속도 상수 로 사람 TNFα로부터 해리되고;
b) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나, 위치 1, 4, 5, 7 또는 8번에서의 단일 알라닌 치환 또는 위치 1, 3, 4, 6, 7, 8 및/또는 9번에서의 1개 내지 5개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호 3으로부터 변형된, 경쇄 CDR3 도메인을 보유하며;
c) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나, 위치 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 또는 11번에서의 단일 알라닌 치환 또는 위치 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 및/또는 12번에서의 1개 내지 5개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호 4로부터 변형된 중쇄 CDR3 도메인을 보유하는 특징을 갖는 분리된 사람 항체이다.
또 다른 양태에서, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역(LCVR) 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역(HCVR)을 보유하는 분리된 사람 항체이다.
또 다른 양태에서, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 아달리무맙이다.
본 발명은 TNFα 활성이 유해한 장애를 치료하는 방법으로서, 본 발명의 임의의 방법에 의해 수득된 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 사람 피험체에게 투여함을 포함하는 방법을 제공한다. 한가지 양태에서, 제조물을 장기간에 걸쳐 사람 피험체에게 투여한다. 한가지 양태에서, 장기간은 적어도 약 3개월, 적어도 약 4개월 또는 적어도 약 5개월을 포함한다.
한가지 양태에서, TNFα 활성이 유해한 장애는 자가면역 장애, 장 장애 및 피부 질병으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한가지 양태에서, 자가면역 장애는 류마티스 관절염, 류마티스 척추염, 골관절염, 통풍 관절염, 알러지, 다발성 경화증, 건선 관절염, 자가면역 당뇨병, 자가면역 포도막염, 신증후군 및 소아 류마티스 관절염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 다른 양태에서, 장 장애는 크론병(Crohn's disease)이다. 또 다른 양태에서, 피부 질병은 건선이다.
한가지 양태에서, 약제학적 조성물은 추가적인 치료제와 함께 투여된다. 한가지 양태에서, 추가적인 치료제는 메토트렉세이트이다.
본 발명은 TNFα 활성이 유해한 장애를 치료하는 방법으로서, 본 발명의 임의의 방법에 의해 수득된 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 사람 피험체에게 투여함을 포함하는 방법을 포함한다. 한가지 양태에서, 제조물을 장기간에 걸쳐 사람 피험체에게 투여한다. 한가지 양태에서, 장기간은 적어도 약 3개월, 적어도 약 4개월 또는 적어도 약 5개월을 포함한다. 한가지 양태에서, TNFα 활성이 유해한 장애는 자가면역 장애, 장 장애 및 피부 질병으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한가지 양태에서, 자가면역 장애는 류마티스 관절염, 류마티스 척추염, 골관절염, 통풍 관절염, 알러지, 다발성 경화증, 건선 관절염, 자가면역 당뇨병, 자가면역 포도막염, 신증후군 및 소아 류마티스 관절염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한가지 양태에서, 장 장애는 크론병이다. 한가지 양태에서, 피부 질병은 건선이다.
한가지 양태에서, 약제학적 조성물은 추가적인 치료제와 함께 투여된다. 한가지 양태에서, 추가적인 치료제는 메토트렉세이트이다.
본 발명은 포장 재료 및 아달리무맙을 포함하고, 아달리무맙 제형이 아달리 무맙 1mg당 약 70ng 이하의 HCP를 포함한다는 것을 표시하는 라벨 또는 포장 삽입물이 상기 포장 재료 내에 포함된 제조품을 제공한다. 한가지 양태에서, 아달리무맙 1mg당 약 70ng의 HCP는 HCP ELISA에 의해 측정된다.
또한, 본 발명은 포장 재료 및 아달리무맙을 포함하고, 아달리무맙 제형이 아달리무맙 1mg당 약 13ng 이하의 HCP를 포함한다는 것을 표시하는 라벨 또는 포장 삽입물이 상기 포장 재료 내에 포함된 제조품을 제공한다. 한가지 양태에서, 아달리무맙 1mg당 약 13ng의 HCP는 HCP ELISA에 의해 측정된다.
또한, 본 발명은 포장 재료 및 아달리무맙을 포함하고, 아달리무맙 제형이 아달리무맙 1mg당 약 5ng 이하의 HCP를 포함한다는 것을 표시하는 라벨 또는 포장 삽입물이 상기 포장 재료 내에 포함된 제조품을 제공한다. 한가지 양태에서, 아달리무맙 1mg당 약 5ng의 HCP는 HCP ELISA에 의해 측정된다.
본 발명은 포장 재료 및 아달리무맙을 포함하고, 아달리무맙 제형이 약 3.0 RFU/s/아달리무맙mg의 카텝신 L 활성으로 표시되는 수준 이하의 프로카텝신 L의 수준을 포함한다는 것을 표시하는 라벨 또는 포장 삽입물이 상기 포장 재료 내에 포함된 제조품을 제공한다. 한가지 양태에서, 카텝신 L 활성은 카텝신 L 속도론적 검정에 의해 측정된다.
또한, 본 발명은 포유동물 세포 발현 시스템으로부터 유래된 물질 중의 프로카텝신 L의 양을 측정하는 속도론적 검정으로서, 포유동물 세포 발현 시스템으로부터 유래된 물질을 효소와 접촉시켜 프로카텝신 L을 활성 카텝신 L 형태로 가공하여 카텝신 L 샘플을 수득하는 단계; 상기 카텝신 L 샘플을 카텝신 L에 대한 기질과 접 촉시키는 단계; 및 상기 카텝신 L 샘플 중의 카텝신 L 활성을, 포유동물 세포 발현 시스템으로부터 유래된 물질 중에 존재하는 프로카텝신 L 양의 지표로서 측정하는 단계를 포함하는 검정을 제공한다. 한가지 양태에서, 포유동물 세포 발현 시스템은 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다. 다른 양태에서, 프로카텝신 L을 가공하는 효소는 엔도펩티다제이다. 또 다른 양태에서, 카텝신 L에 대한 기질은 표지를 포함한다. 또 다른 양태에서, 표지는 형광 제제이다. 한가지 양태에서, 형광 제제는 형광 7-아미노-4-메틸 쿠마린(AMC) 그룹을 포함한다. 한가지 양태에서, 카텝신 L에 대한 기질은 Z-류신-아르기닌을 포함한다. 또 다른 양태에서, Z-류신-아르기닌은 AMC 그룹을 포함한다.
도 1A 및 도 1B는 본 발명의 공정 B (도 1A) 및 공정 A (도 1B)를 포함하는 각 공정에서 프락토겔 S 크로마토그래피 단계의 통상적인 용출 프로파일을 도시한 것이다.
도 2A 및 도 2B는 본 발명의 공정 B (도 2A) 및 공정 A (도 2B)를 포함하여, Q 세파로스 FF 크로마토그래피 단계의 관류 세척 프로파일을 비교 도시한 것이다.
도 3A 및 도 3B는 본 발명의 공정 B (도 3A) 및 공정 A (도 3B)를 포함하여, 페닐 세파로스 HP 크로마토그래피 단계의 용출 프로파일을 비교 도시한 것이다.
도 4는 평균 공정 B (마름모 표시) 및 평균 공정 A (정사각형 표시)에서 프로카텝신 L의 단계적 감소를 도시한 그래프이다.
도 5는 평균 공정 B (마름모 표시) 및 평균 공정 A (정사각형 표시)에서 HCP의 단계적 감소를 도시한 그래프이다.
도 6은 반응 시간 대 형광 시그날의 선형 관계를 나타내는, 활성화된 가공중의 샘플의 속도론적 판독값을 도시한 것이다.
I. 정의
본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위하여 먼저 특정 용어를 정의한다.
본 명세서에 사용된 "혼합물"이란 용어는 존재할 수도 있는 다른 물질들로부터 정제하고자 하는 관심대상의 하나 이상의 항체를 포함하는, 점도가 있는 정제될 물질을 말한다. 혼합물은, 예를 들면, 수용액, 유기용매계, 또는 수성/유기용매 혼합물 또는 용액일 수 있다. 혼합물은 종종 많은 생물학적 분자 (예를 들면, 단백질, 항체, 호르몬 및 바이러스), 소분자 (예를 들면, 염, 당, 지질 등) 및 심지어 미립자를 포함하는 복합 혼합물 또는 용액이다. 생물 기원의 통상적인 혼합물은 수성 용액 또는 현탁액으로 시작할 수 있지만, 용매 침전, 추출 등과 같은 초기 분리 단계에서 사용된 유기 용매를 포함할 수도 있다. 본 발명의 다양한 양태에 의해 정제될 수 있는 유용한 생물학적 물질을 함유할 수 있는 혼합물의 예에는, 생물반응기로부터의 배양 상청액, 균질화된 세포 현탁액, 혈장, 혈장 분획 및 밀크(milk)가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
항체와 하나 이상의 물질을 포함하는 혼합물로부터 항체를 "정제하는"이란, 조성물로부터 하나 이상의 물질을 (완전하게 또는 부분적으로) 제거하여 혼합물 중의 항체의 순도를 증가시키는 것을 의미한다. 상기 물질은 숙주 세포 단백질(HCP)과 같은 비제한적인 불순물 또는 오염물일 수 있다.
"숙주 세포 단백질(들)" 또는 "HCP(들)"이란 용어는 당해 항체와 상이하고, 통상적으로 항체 생산의 급원으로부터 유래하는 혼합물 중의 단백질을 의미한다. HCP는 최종 항체 제제로부터 배제되는 것이 바람직하다.
"감소된"이란 용어는 물질의 양을 저하 또는 저감시키는 것을 의미한다. 감소된 제조물은 HCP 또는 프로카텝신 L과 같은 물질이 초기 양에 비해 적은 제조물을 포함한다. 한가지 양태에서, 물질은 불순물 또는 오염물이다. 한가지 양태에서, "감소된"이란 용어는 물질이 상당히 더 적은 것을 의미한다. 다른 양태에서, "감소된"이란 용어는 물질의 양이 부재하는 것을 의미한다. 한가지 양태에서, 물질의 양이 없는 이란, 본 명세서에 기술된 검정을 사용하여 "검출가능한 양이 부재하는" 것을 포함한다.
"실질적으로 부재하는"이란 용어는 물질의 양이 부재하는 것이지만, 최소량의 물질을 포함할 수도 있다. 한가지 양태에서, 물질의 양이 부재하는 이란, 본 명세서에 기술된 검정을 사용하여 "검출가능한 양이 부재하는" 것을 포함한다.
"숙주 세포 단백질(HCP) 감소된"이란 용어는 하나 이상의 정제 단계 후 저하 또는 저감된 양의 HCP(들) 및 항체를 포함하는 용출액, 제조물, 관류물을 비롯하여, 이에 국한되지 않는 조성물을 말한다. 한가지 양태에서, "HCP 감소된"이란 항체를 포함하는 조성물 중의 상당히 더 적은 HCP(들)를 의미한다. 다른 양태에서, "HCP 감소된"이란 용어는 항체를 포함하는 조성물에 존재하는 HCP(들)의 양이 부재하는 것을 의미한다. 한가지 양태에서, "HCP 감소된"이란 용어는 항체를 포함하는 조성물에서, 본 명세서에 기술된 검정을 사용하여 검출할 수 있는 양이 부재하는 것을 의미한다.
"프로카텝신 L 감소된"이란 용어는 하나 이상의 정제 단계 후 저하 또는 저감된 양의 프로카텝신 L을 포함하는 용출액, 제조물, 관류물을 비롯하여, 이에 국한되지 않는 조성물을 의미한다. 한가지 양태에서, "프로카텝신 L 감소된"이란, 항체를 포함하는 조성물 중의 상당히 더 적은 HCP(들)를 의미한다. 다른 양태에서, "프로카텝신 L 감소된"이란 용어는 항체를 포함하는 조성물에 존재하는 HCP(들)의 양이 부재하는 것을 의미한다. 한가지 양태에서, "프로카텝신 L 감소된"이란 용어는 항체를 포함하는 조성물에서, 본 명세서에 기술된 검정을 사용하여 검출할 수 있는 양이 부재하는 것을 의미한다.
"재현가능하게 낮은"이란 용어는 저하 또는 저감된 양을 일정하게 달성하는 능력, 예를 들면 저하 또는 저감된 양을 시간의 80% 이상 동안, 보다 바람직하게는 시간의 90% 이상 동안, 보다 바람직하게는 시간의 95% 이상 동안, 보다 더 바람직하게는 시간의 98% 이상 동안 달성하는 능력을 의미한다.
"이온 교환 분리 단계"란 용어는 바람직하지 않은 물질 또는 불순물, 예를 들면, HCP 또는 프로카텝신 L을, 하전된 물질을 보유하는 바람직하지 않은 물질과 관심대상의 항체의 이온 상호작용의 차이를 바탕으로 하여 당해 항체로부터 분리시키는 단계를 말한다. 이온 교환 분리 단계의 예에는, 이온 교환 크로마토그래피, 예를 들면 음이온 교환 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
"이온 교환 물질"은, 바람직하지 않은 물질 또는 불순물, 예를 들면, HCP 또는 프로카텝신 L을 항체로부터 분리하는데 기본으로 사용되는 이온 물질을 의미한다. 이온 교환 물질의 예에는 음이온 수지 및 양이온 수지가 포함된다.
"양이온 교환 물질"은, 음하전 리간드가 공유결합되어 있는 이온 교환 수지를 말하며, 상기 수지가 접촉하는 용액 중의 양이온과의 교환을 위한 유리 양이온을 갖는다. 다양한 양이온 교환 수지가 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면, 공유결합된 그룹이 카르복실레이트 또는 설포네이트인 것이 있다. 시판되는 양이온 교환 수지에는 CMC-셀룰로스, SP-Sephadex™ 및 Fast S-Sepharose™(후자 2개는 파마시아(Pharmacia)로부터 시판된다)가 포함된다.
"음이온 교환 물질"은 4급 아미노 그룹과 같은 양하전 그룹이 공유결합되어 있는 이온 교환 수지를 말한다. 시판되는 음이온 교환 수지에는 DEAE 셀룰로스, TMAE, QAE Sephadex™ 및 Fast Q Sepharose™(후자 2개는 파마시아로부터 시판된다)가 포함된다.
분자를 이온 교환 물질에 "결합하는" 이란, 분자를 적당한 조건(pH/전도도) 하에서 이온 교환 물질에 노출시켜, 상기 분자와 이온 교환 물질의 하전된 그룹 또는 하전된 그룹들 간의 이온성 상호작용을 통해 이온 교환 물질 내에 또는 위에 가역적으로 고정되게 하는 것을 의미한다.
"소수성 상호작용 단계"란 용어는 바람직하지 않은 물질, 예를 들면, HCP 또는 프로카텝신 L을 관심대상의 항체로부터, 소수성 물질을 보유하는 바람직하지 않은 물질과 관심대상의 항체의 소수성 상호작용의 차이를 바탕으로 분리하는 단계를 말한다.
"소수성 상호작용 물질"이란 용어는 바람직하지 않은 물질, 예를 들면, HCP 또는 프로카텝신 L과 항체를 분리하기 위한 바탕으로 사용되는 소수성 물질을 말한다. 소수성 상호작용 물질의 예에는 소수성 리간드, 예를 들면 탄소수 약 2 내지 약 8의 알킬 그룹, 또는 페닐과 같은 아릴 그룹이 포함된다.
"세척하는" 또는 "세척 단계"란 용어는 주어진 물질, 예를 들면, 이온 교환 물질 또는 소수성 상호작용 물질을 통해 또는 그 위에 적당한 완충액을 통과시키는 것을 포함한다.
"다수의 세척 단계"란 용어는 1회 이상의 세척 단계를 포함한다. 후속 완충액은 이온 교환 물질 또는 소수성 상호작용 물질과 같은 주어진 물질과 비특이적으로 결합되어 있는 다양한 종류의 불순물을 해리 및 제거하도록 설계된, pH, 전도도, 용매 농도 등과 같은 성질이 상이한 것일 수 있다. 한가지 양태에서, 다수의 세척 단계는 약 40 내지 50% 용출 완충액을 추가로 포함하는 중간 세척을 포함한다.
물질로부터 분자 (예: 항체 또는 오염 물질)를 "용출"시키는 이란, 물질 주위의 완충액을 변화시켜, 분자와 물질의 상호작용을 감소시킴으로써 분자를 물질로부터 제거하는 것을 의미한다. 한가지 양태에서, 항체는 이온 교환 물질 상의 하전된 부위에 대해 완충액이 항체와 경쟁하는 이온 교환칼럼으로부터 용출된다.
"용출액"이란 용어는 크로마토그래피 물질에 관심대상의 항체를 결합시킨 후, 항체 해리를 위해 용출 완충액을 첨가한 다음 수득되는, 분자 (예: 항체 또는 오염 물질)를 포함하는 액체를 의미한다. 용출액은 정제 방법 중의 단계와 관련하여 언급될 수 있다. 예를 들어, "1차 용출액"이란 용어는 1차 크로마토그래피 단계로부터의 용출액을 말하고, "2차 용출액"이란 용어는 2차 크로마토그래피 단계로부터의 용출액을 말하며, 그 이상의 용출액도 이와 같이 언급될 수 있다.
"관류물"이란 용어는 분자가 결합없이 크로마토그래피 물질을 거쳐 통과하도록 크로마토그래피 물질을 통해, 분자를 포함하는 혼합물을 통과시켜 수득한, 분자 (예: 항체 또는 불순물)를 포함하는 액체를 말한다.
"완충액"은 용액 중에 존재 시, pH의 단위 변화를 일으키도록 첨가되어야 하는 산 또는 알칼리의 양을 증가시키는 물질을 말한다. 완충 용액은 산-염기 짝성분의 작용에 의해 pH의 변화에 내성이 있다. 생물 시약에 사용되는 완충 용액은 일반적으로 용액의 pH가 생리적 범위 이내이도록 일정한 수소 이온 농도를 유지할 수 있다. 통상적인 완충액 성분에는 유기 및 무기 염, 산 및 염기가 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 생물 분자(예: 항체)의 정제에 사용되는 대표적인 완충액에는 쯔비터이온성(zwitterionic) 또는 "굳(Good)" 완충액이 포함된다[참조: Good et al. (1966) Biochemistry 5:467 및 Good and Izawa (1972) Methods Enzymol. 24:62]. 대표적인 완충액에는 TES, MES, PIPES, HEPES, MOPS, MOPSO, TRICINE 및 BICINE이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 "세척 완충액"은 모두, 항체가 결합하는 이온 교환 물질 또는 소수성 상호작용 물질과 같은 주어진 물질로부터 불순물을 쓸어내는데 사용되는 물질을 말한다.
"용출 완충액"은 하나 이상의 세척 물질로 세척된 다음 이온 교환 물질 또는 소수성 상호작용 물질과 같은 주어진 물질로부터 항체를 해리시키는 데 사용되는 물질을 말한다. 용출 완충액은 항체를 해리시키는 작용을 한다. 통상적인 용출 물질은 당업계에 익히 공지되어 있고, 고농도의 염, 유리 친화성 리간드 또는 유사체, 또는 주어진 물질로부터 항체와 같은 표적 물질의 해리를 촉진하는 다른 물질을 가질 수 있다. 용출 완충액의 전도도 및/또는 pH는 이온 교환 물질 또는 소수성 상호작용 물질로부터 항체가 용출되게 하는 전도도 및/또는 pH이다.
"전도도"란 용어는 두 전극 사이에 전류를 전도하는 수용액의 능력을 말한다. 용액에서, 전류는 이온 수송에 의해서 흐른다. 따라서, 수용액에 존재하는 이온의 양을 증가시키면 용액의 전도도는 더 높아질 것이다. 전도도의 측정 단위는 mmhos(mS/cm)이며, 오리온(Orion) 등에서 판매하는 전도도 계량기를 사용하여 측정할 수 있다. 용액의 전도도는 용액 중의 이온의 농도를 변화시켜 변경시킬 수 있다. 예를 들어, 용액 중의 완충제의 농도 및/또는 염 (예: NaCl 또는 KCl)의 농도를 바람직한 전도도가 달성되도록 변화시킬 수 있다. 한가지 양태에서, 세척 완충액 또는 크로마토그래피에 사용된 임의의 다른 수용액의 염 농도는 바람직한 전도도를 달성하도록 변형된다.
항체와 같은 폴리펩타이드의 "pI" 또는 "등전점"은 폴리펩타이드의 양하전이 이의 음하전과 평형을 이루는 pH를 말한다. pI는 폴리펩타이드의 아미노산 잔기들의 총 하전으로부터 계산할 수 있고, 또는 등전 초점(isoelectric focusing)에 의해 측정될 수 있다.
"바이러스 불활성화"란 용어는 혼합물에 함유된 바이러스가 비기능성이 되게 하거나, 정제될 혼합물로부터 바이러스를 제거하는 것을 포함한다. 바이러스는 항체 생산의 급원, 하류 처리 단계 또는 제조 조건으로부터 유래될 수 있다. 바이러스를 비기능성이 되게 하거나 바이러스를 제거하는 방법에는 열 활성화, pH 불활성화, 화학적 불활성화제 등이 포함된다. "pH 바이러스 불활성화"란 용어에는 바이러스를 비기능성이 되도록 하기에 충분한 pH로 바이러스를 처리하는 것이 포함된다.
본 명세서에 사용된 "사람 TNFα"(본 명세서에서 hTNFα, 또는 간단히 hTNF로 약칭함)는 17kD 분비 형태 및 26kD 막 결합 형태로서 존재하고, 이의 생물학적 활성 형태가 비공유결합된 17kD 분자의 삼량체로 이루어져 있는 사람 사이토카인을 의미한다. hTNFα의 구조는, 예를 들면, 문헌[참조: Pennica, D., et al. (1984) Nature 312:724-729; Davis, J.M., et al. (1987) Biochemistry 26:1322-1326; 및 Jones, E.Y., et al. (1989) Nature 338: 225-228]에 보다 상세히 기술되어 있다. 사람 TNFα란 용어는 표준 재조합 발현법으로 제조할 수 있거나, 시판되는 (R & D Systems, Catalog No. 210-TA, Minneapolis, MN) 재조합 사람 TNFα(rhTNFα)를 포함하는 의미이다. TNFα는 TNF라고도 한다.
본 명세서에 사용된 "항체"란 용어는 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)가 이황화 결합에 의해 상호결합된 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 면역글로불린 분자를 의미한다. 각 중쇄는 중쇄 가변영역 (HCVR 또는 VH로도 약칭됨) 및 중쇄 불변영역을 포함한다. 중쇄 불변영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각 경쇄는 경쇄 가변영역 (LCVR 또는 VL로도 약칭됨) 및 경쇄 불변영역을 포함한다. 경쇄 불변영역은 하나의 도메인 CL을 포함한다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 초가변(hypervariability) 영역, 여기에 산재되어 있는, 프레임워크 영역(FR)으로 지칭되는 더욱 보존적인 영역으로 더욱 세분될 수 있다. 각 VH 및 VL은 아미노 말단에서부터 카르복시 말단쪽으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR을 포함한다. 본 발명의 항체는 각각 전문이 참고인용된 미국특허 제6,090,382호; 제6,258,562호; 및 제6,509,015호에 더 상세히 기술되어 있다. 한가지 양태에서, 본 발명의 항체는 TNFα 활성을 방해하는 항-TNFα이다. 항-TNFα 항체의 예에는 항-TNFα 사람 항체 및 본 명세서에 기술된 항체 부분 및 본 발명에 각각 참고인용되는 미국특허 제6,090,382호; 제6,258,562호; 제6,509,015호 및 미국특허출원 제09/801185호 및 제10/302356호에 기술된 것이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 한가지 양태에서, 본 발명에 사용되는 TNFα 억제제는 항-TNFα 항체 또는 이의 단편, 예를 들면 인플릭시맙(Remicade®　, Johnson and Johnson; 본원에 참고인용된 미국특허 제5,656,272호에 기술되어 있다), CDP571(사람화된 모노클로날 항-TNFα IgG4 항체), CDP870(사람화된 모노클로날 항-TNFα 항체 단편), 항-TNF dAb(Peptech), CNTO 148(골리무맙; Medarex and Centocor), WO 02/12502에 기술된 항체, 및 아달리무맙(Humira®　 Abbott Laboratories, 미국특허 제6,090,382호에 D2E7으로 기술된 사람 항-TNF mAb)이다. 본 발명에 사용될 수 있는 추가 항체 또는 이의 단편은 본 발명에 참고인용된 미국특허 제6,593,458호; 제6,498,237호; 제6,451,983호; 및 제6,448,380호에 기술되어 있다. 이 용어는 본 발명의 공정의 표적인 항체인, "관심대상의 항체"를 포함한다.
본 명세서에 사용된 항체의 "항원 결합 부분"(또는 간단히 "항체 부분")란 용어는 항원(예: hTNF)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 말한다. 항체의 항원결합 기능은 전체 길이 항체의 단편들에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀져 있다. 항체의 "항원 결합 부분"이란 용어 내에 포함되는 결합 단편의 예에는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 일가(monovalent) 단편인 Fab 단편; (ii) 2개의 Fab 단편이 힌지(hinge) 영역에서 이황화 가교에 의해 결합되어 있는 이가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편[참조: Ward et al. (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR)이 포함된다. 또한, Fv 단편의 두 도메인, VL 및 VH는 분리된 유전자에 의해 암호화되지만, 재조합 방법을 통해 합성 링커에 의해 결합될 수 있고, 이 링커로 인해 VL 및 VH 영역은 쌍을 이루어 일가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 제조될 수 있다 (단일쇄 Fv(scFv)로 공지되어 있다; 참조: Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]. 이러한 단일쇄 항체도 역시 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어에 속하는 것으로 간주되어야 한다. 단일쇄 항체의 다른 형태, 예를 들면 디아바디diabody)도 포함된다. 디아바디는 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩타이드 쇄에서 발현되지만, 너무 짧은 링커의 사용으로 동일한 사슬 상의 두 도메인 사이에서 결합이 이루어지고, 이로써 상기 도메인을 다른 사슬의 상보성 도메인과 결합을 이루게 하여, 2개의 항원 결합 부위를 형성한다 [참조: Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2:1121-1123]. 본 발명의 항체 부분은 각각 본 발명에 전문이 참고인용된 미국특허 제6,090,382호, 제6,258,562호, 제6,509,015호에 더 상세하게 설명되어 있다.
결합 단편은 재조합 DNA 기술로 생산하거나, 또는 완전한 면역글로불린을 효소 또는 화학적 절단하여 생산한다. 결합 단편에는 Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv, 단일쇄 및 단일쇄 항체가 포함된다. "이특이적(bispecific)" 또는 "이기능성(bifunctional)" 면역글로불린 또는 항체와는 달리, 면역글로불린 또는 항체는 각 결합 부위가 동일한 것으로 이해되고 있다. "이특이적" 또는 "이기능성 항체"는 2개의 다른 중쇄/경쇄 쌍과 2개의 다른 결합 부위를 보유하는 인공 하이브리드 항체이다. 이특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 결합을 포함하는 다양한 방법으로 생산할 수 있다[참조: Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321(1990); Kostelny et al., J. Immnunol. 148, 1547-1553(1992)].
본 명세서에 사용된 "보존적 아미노산 치환"은 하나의 아미노산 잔기가, 측쇄가 유사한 다른 아미노산 잔기로 치환되는 것이다. 측쇄가 유사한 아미노산 잔기의 계열은 당업계에서 정의되어 있고, 염기성 측쇄 (예: 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예: 아스파르트산, 글루탐산), 무하전 극성 측쇄 (예: 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예: 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타 분지형 측쇄 (예: 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예: 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)가 포함된다.
"키메릭 항체"는 중쇄 및 경쇄의 각 아미노산 서열의 일부가 특정 종으로부터 유래된 항체 또는 특정 클래스에 속하는 항체에 존재하는 상응하는 서열에 대해 상동이지만, 그 사슬의 나머지 단편은 다른 종으로부터의 상응하는 서열에 대해 상동인 항체를 말한다. 한가지 양태에서, 본 발명은 경쇄 및 중쇄의 가변 영역이 포유동물의 한 종에서 유래하는 항체의 가변 영역을 모방하고 있지만, 불변부는 다른 종에서 유래하는 항체의 서열과 상동성인 키메릭 항체 또는 항원결합단편을 특징으로 한다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 키메릭 항체는 마우스 항체 유래의 CDR을 사람 항체의 프레임워크 영역에 접목시켜 제조한다.
"사람화된 항체"는 실질적으로 사람 항체 사슬(어셉터 면역글로불린 또는 항체라고도 함) 유래의 가변 영역 프레임워크 잔기를 포함하는 하나 이상의 사슬과 실질적으로 비사람 항체(예: 마우스) 유래의 하나 이상의 상보성결정영역(CDR)을 포함하는 항체를 의미한다. CDR 접목 외에, 사람화된 항체는 일반적으로 친화성 및/또는 면역원성 향상을 위해 추가 변경되기도 한다.
"다가 항체"란 용어는 항원인식부위가 하나보다 많은 항체를 의미한다. 예를 들어, "이가" 항체는 항원인식부위가 2개이고, "사가" 항체는 항원인식부위가 4개이다. "일특이적", "이특이적", "삼특이적", "사특이적" 등과 같은 용어는 다가 항체에 존재하는 다른 항원인식부위 특이성의 수(항원인식부위의 수와 대비된다)를 의미한다. 예를 들어, "일특이적" 항체의 항원인식부위는 모두 동일한 에피토프에 결합한다. "이특이적" 또는 "이중 특이적" 항체는 제1 에피토프에 결합하는 하나 이상의 항원 결합 부위와 상기 제1 에피토프와 다른 제2 에피토프에 결합하는 하나 이상의 항원인식부위를 보유한다. "다가 일특이적" 항체는 각각 동일한 에피토프에 결합하는 다수의 항원인식부위를 보유한다. "다가 이특이적" 항체는 다수의 항원인식부위를 보유하되, 이 부위의 일부는 제1 에피토프에 결합하고 나머지 일부는 상기 제1 에피토프와 다른 제2 에피토프에 결합한다.
본 명세서에 사용된 "사람 항체"란 용어는 사람 생식계열(germline) 면역글로불린 서열 유래의 가변 및 불변 영역을 보유하는 항체를 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 사람 항체는 CDR 및 특히 CDR3과 같은 사람 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화된 것이 아닌 아미노산 잔기 (예: 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 하지만, 본 명세서에 사용된 "사람 항체"란 용어는 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 생식계열에서 유래하는 CDR 서열을 사람 프레임워크 서열에 접목시킨 항체를 포함하는 것을 의미하는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 "재조합 사람 항체"란 용어는, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생산 또는 분리된 모든 사람 항체를 포함하는 것으로서, 예를 들면 숙주 세포를 형질감염시킨 재조합 발현 벡터에 의해 발현된 항체(이하에 더 상세히 설명됨), 재조합 조합 사람 항체 라이브러리에서 분리된 항체(이하에 더 상세히 설명됨), 사람 면역글로불린 유전자에 대해 돌연변이성인 동물(예: 마우스)에서 분리된 항체[참조: Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287) 또는 다른 DNA 서열에 사람 면역글로불린 유전자 서열의 연결을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생산 또는 분리된 항체를 포함하는 것을 의미한다. 이러한 재조합 사람 항체는 사람 생식계열 면역글로불린 서열 유래의 가변 및 불변 영역을 보유한다. 하지만, 특정 양태에서, 이러한 재조합 사람 항체는 시험관내 돌연변이유발 처리되고 (또는, 사람 Ig 서열에 대해 돌연변이성인 동물이 사용된 경우에는 생체내 체세포 돌연변이유발 처리되고), 이에 따르면 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 사람 생식계열 VH 및 VL 서열에서 유래되고 관련이 있기는 하지만, 생체내 사람 항체 생식계열 목록 내에는 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다.
이러한 키메릭 항체, 사람화된 항체, 사람 항체 및 이중 특이적 항체는 당업계에 공지된 재조합 DNA 기술, 예를 들면 다음 문헌에 기술된 방법을 사용하여 생산할 수 있다[참조: PCT 국제출원 제PCT/US86/02269호; 유럽특허출원 제184,187호; 유럽특허출원 제171,496호; 유럽특허출원 제173,494호; PCT 국제공개 제WO 86/01533호; 미국특허 제4,816,567호; 유럽특허출원 제125,023호; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison (1985) Science 229: 1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; 미국특허 제5,225,539호; Jones et al. (1986) Nature 321 :552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; 및 Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060, Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989), 미국특허 제5,530,101호, 제5,585,089호, 제5,693,761호, 제5,693,762호, Selick et al, WO 90/07861, 및 Winter, 미국특허 제5,225,539호].
본 명세서에 사용된 "분리된 항체"는, 항원 특이성이 상이한 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 의미하는 것이다 (예: hTNFα에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 hTNFα 외에 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 하지만, hTNFα에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 종 유래의 TNFα 분자와 같은 다른 항원에 대해 교차 반응성을 나타낼 수 있다. 또한, 분리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없는 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 "중화 항체"(또는 hTNFα 활성을 중화시킨 항체")는, hTNFα에 대한 결합이 hTNFα의 생물학적 활성을 억제하는 항체를 의미하는 것이다. 이러한 hTNFα의 생물학적 활성의 억제는 hTNFα 유도 세포독성(시험관내 또는 생체내), hTNFα 유도 세포 활성화 및 hTNFα 수용체에 대한 hTNFα 결합과 같은 hTNFα 생물학적 활성의 하나 이상의 지시인자를 측정하여 평가할 수 있다. hTNFα 생물학적 활성의 상기 지시인자는 당업계에 공지된 하나 이상의 여러 표준 시험관내 또는 생체내 분석법을 통해 평가될 수 있다(미국특허 제6,090,382호 참조). hTNFα 활성을 중화시키는 항체의 능력은 L929 세포의 hTNFα 유도 세포독성의 억제를 통해 평가하는 것이 바람직하다. hTNFα 활성의 추가 또는 대안적인 파라미터로서, hTNFα 유도 세포 활성화의 척도로서 HUVEC에서 ELAM-1의 hTNFα 유도 발현을 억제하는 항체의 능력을 평가할 수도 있다.
본 명세서에 사용된 "표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)"이란 용어는 바이오센서 매트릭스 내에서 단백질 농도의 변경을 검출하여 실시간 생물특이적 상호작용을, 예를 들면BIAcore 시스템(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway NJ) 등을 사용하여 분석할 수 있게 하는 광학 현상을 의미한다. 더 상세한 설명은 미국특허 제6,258,562호의 실시예 1 및 문헌[참조: Jonsson et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19; Jonsson et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125; 및 Johnnson et al. (1991 Anal.Biochem. 198: 268]을 참조한다.
본 명세서에 사용된 "Koff"란 용어는 항체/항원 복합체로부터 항체가 해리되는 해리(off rate) 상수를 의미한다.
본 명세서에 사용된 "Kd"란 용어는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 의미한다.
본 명세서에 사용된 "IC50"이란 용어는 세포독성 활성을 중화시키는 등의 관심대상의 생물학적 종말점을 억제하는데 필요한 억제제의 농도를 의미한다.
본 명세서에 사용된 "핵산 분자"란 용어는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하는 것을 의미한다. 핵산 분자는 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있으나, 이본쇄 DNA인 것이 바람직하다.
hTNFα에 결합하는 항체 또는 항체 부분(예: VH, VL, CDR3)을 암호화하는 핵산과 관련하여 본 명세서에 사용된 "분리된 핵산 분자"란 용어는 상기 항체 또는 항체 부분을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에, 사람 게놈 DNA에서 상기 핵산에 본래 인접한 것일 수 있으나, hTNFα 외에 다른 항원에 결합하는 항체 또는 항체 부분을 암호화하는 다른 뉴클레오타이드 서열이 없는 핵산 분자를 의미하는 것이다. 따라서, 예를 들면 항-hTNFα 항체의 VH 영역을 암호화하는 본 발명의 분리된 핵산은 hTNFα 외에 다른 항원에 결합하는 다른 VH 영역을 암호화하는 다른 서열을 전혀 포함하지 않는다.
본 명세서에 사용된 "벡터"란 용어는 결합된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미하는 것이다. 벡터의 한 종류는, 추가적인 DNA 단편이 연결될 수 있는 환상의 이본쇄 DNA 루프를 의미하는 "플라스미드"이다. 벡터의 다른 종류는 다른 DNA 단편이 바이러스 게놈에 연결될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 이것이 도입되는 숙주 세포 내에서 자율 복제할 수 있다 (예: 세균의 복제 오리진 및 에피솜성 포유동물 벡터를 보유하는 세균 벡터). 다른 벡터 (예: 비에피솜성 포유동물 벡터)는 숙주 세포에 도입 시 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 따라 숙주 세놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 작동적으로 결합된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터를 본원에서 "제조합 발현 벡터" (또는 간단히 "발현 벡터")라고 한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터 형태인 바, 호환 사용할 수 있다. 하지만, 본 발명은 동등한 기능을 하는 바이러스 벡터 (예: 복제 결손성 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노관련 바이러스)와 같은 발현 벡터의 다른 형태도 포함하고자 한다.
본 명세서에 사용된 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")란 용어는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 의미하는 것이다. 이러한 용어는 특정 피험체 세포뿐만 아니라 이 세포의 자손도 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 하지만, 돌연변이 또는 환경 영향으로 인해 후속 세대에서는 특정 변형이 일어날 수 있기 때문에, 사실상 자손은 모 세포와 동일할 수는 없지만, 본 명세서에서 사용된 "숙주 세포"란 용어의 범위에 포함되는 것이다.
본 명세서에 사용된 "키트"란 용어는 각 성분을 포함하는 포장 제품 또는 제조물품을 의미한다. 키트는 이 키트의 성분을 담는 박스 또는 용기를 포함하는 것이 바람직하다. 이 박스 또는 용기에는 라벨이나 FDA(Food and Drug Administration) 승인을 받은 프로토콜이 부착되어 있다. 박스 또는 용기는 본 발명의 성분을 플라스틱, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 에틸렌 또는 프로필렌 용기에 담아서 보유하는 것이 바람직하다. 용기는 캡이 있는 튜브 또는 병일 수 있다. 키트는 또한 본 발명의 TNFα 항체 투여를 위한 지침서를 포함할 수도 있다. 한가지 양태에서, 본 발명의 키트는 PCT/IB03/04502 및 미국출원 제10/222140호에 기술된 바와 같은 사람 항체 D2E7을 포함하는 제형을 포함한다.
본 발명의 다양한 양상은 본원에서 더 상세히 기술된다.
II. 항체 생산
본 발명은 항체와 하나 이상의 HCP를 포함하는 혼합물로부터 항체를 정제하는 방법을 제공한다. 초기 혼합물은 일반적으로 항체의 재조합 생산에서 수득되는 것이다. 또는, 초기 혼합물은 펩타이드 합성(또는 다른 합성 수단)에 의한 항체 생산에서 수득되거나, 또는 항체의 자연 급원으로부터 정제될 수도 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 부분의 발현을 위해, 부분 또는 전체 길이의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA는 이 유전자가 전사 및 해독 조절 서열에 작동적으로 결합되도록 발현 벡터에 삽입한다. 여기서, "작동적으로 결합된"이란 용어는 벡터 내에 전사 및 해독 조절 서열이 항체 유전자의 전사 및 해독을 조절하는 계획된 기능을 제공하도록 벡터 내에 연결된 것을 의미한다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 사용된 발현 숙주 세포에 적합한 것으로 선택한다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 다른 벡터에 삽입될 수 있으나, 동일한 발현 벡터에 함께 삽입되는 것이 더 일반적이다. 항체 유전자는 표준 방법 (예: 항체 유전자 단편 및 벡터에 상보성 제한 부위의 연결 또는 제한 부위가 존재하지 않는다면 평활말단 연결)을 통해 발현 벡터에 삽입된다. 항체 또는 항체 관련 경쇄 또는 중쇄 서열을 삽입하기 전에, 발현 벡터는 이미 항체 불변영역 서열을 보유할 수 있다. 예를 들어, 아달리무맙 또는 아달리무맙 관련 VH 및 VL 서열을 전체 길이 항체 유전자로 변환시키는 1가지 시도는, VH 단편은 벡터 내의 CH 단편(들)에 작동적으로 결합하고 VL 단편은 벡터 내의 CL 단편에 작동적으로 결합하도록 상기 서열들을 이미 중쇄 불변 및 경쇄 불변 영역을 각각 암호화하는 발현 벡터 내로 삽입하는 것이다. 다시 또는 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 사슬의 분비를 촉진하는 시그날 펩타이드를 암호화할 수 있다. 항체 사슬 유전자는 시그날 펩타이드가 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 프레임내(in-frame) 결합되도록 벡터에 클로닝될 수 있다. 시그날 펩타이드는 면역글로불린 시그날 펩타이드 또는 이종 시그날 펩타이드(즉, 비면역글로불린 단백질 유래의 시그날 펩타이드)일 수 있다.
항체 사슬 유전자 외에, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포 내에서 항체 사슬 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 보유한다. "조절 서열"이란 용어는 프로모터, 인핸서(enhancer) 및 항체 사슬 유전자의 전사 또는 해독을 조절하는 다른 발현 조절 인자(예: 폴리아데닐화 시그날)를 포함하는 것을 의미한다. 이러한 조절 서열에 대해서는 예를 들면 문헌[참조: Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990)]에 기술되어 있다. 조절 서열의 선택을 포함하는 발현 벡터의 설계는 형질전환되어야 하는 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 정도 등과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다는 것을 당업자라면 잘 알고 있을 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현에 바람직한 조절 서열에는 포유동물 세포에서 높은 단백질 발현 수준을 유도하는 바이러스 인자, 예를 들면 사이토메갈로바이러스(CMV) 유래의 프로모터 및/또는 인핸서(예를 들면, CMV 프로모터/인핸서), 시미안 바이러스 40(SV40) 유래의 프로모터 및/또는 인핸서(예를 들면, SV 40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스 유래 프로모터 및/또는 인핸서(예: 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP)) 및 폴리오마 유래 프로모터 및/또는 인핸서가 포함된다. 바이러스 조절 인자 및 이의 서열에 대한 더 상세한 설명은 문헌[참조: 미국특허 제5,168,062호(Stinski), 미국특허 제4,510,245호(Bell et al.) 및 미국특허 제4,968,615호(Schaffner et al.)]에 기술되어 있다.
항체 사슬 유전자 및 조절 서열 외에도, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가 서열, 예를 들면 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예: 복제 오리진) 및 선별가능 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선별가능 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다[참조: 미국특허 제4,399,216호, 제4,634,665호 및 제5,179,017호(모두 Axel et al.)]. 예를 들어, 일반적으로 선별가능 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선별가능 마커 유전자에는 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선택/증폭과 함께 dhfr- 숙주 세포에 사용) 및 neo 유전자(G418 선택용)를 포함한다.
경쇄 및 중쇄 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 벡터(들)는 표준 기술에 의해 숙주 세포를 형질감염시킨다. "형질감염"이란 용어의 다양한 형태는 일반적으로 외인성 DNA를 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포 내로 도입시키는데 사용되는 광범위한 기술, 예를 들면 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함하는 것을 의미한다. 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 본 발명의 항체를 발현하는 것은 이론적으로 가능하지만, 진핵생물 세포, 가장 바람직하게는 포유동물 숙주 세포에서의 항체의 발현은, 이러한 진핵생물 세포, 특히 포유동물 세포가 원핵생물 세포보다 적당히 폴딩되고 면역학적으로 할성인 항체를 조립 및 분비할 가능성이 크기 때문에 가장 바람직하다. 항체 유전자의 원핵생물 발현은 활성 항체를 고수율로 생산하는 데에는 비효과적인 것으로 보고된 바 있다[참조: Boss and Wood (1985) Immunology Today 6:12-13].
본 발명에서 벡터 내의 DNA를 클로닝 또는 발현시키기에 적당한 숙주 세포는 상기한 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포이다. 이러한 목적에 적당한 원핵생물에는 진정세균, 예를 들면 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들면, 엔테로박테리아시에(Enterobacteriaceae), 예를 들면 이.콜라이(E. coli)와 같은 에세리치아(Escherichia), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 크렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들면 살모넬라 티피뮤리엄(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들면 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 및 시겔라(Shigella), 뿐만 아니라 바실러스(Bacillus), 예를 들면 비.서브틸리스(B. subtilis) 및 비.리케니포미스(B. licheniformis) (예: 1989년 4월 12일에 공개된 DD 266,710에 개시된 비.리케니포미스 41P), 슈도모나스(Pseudomonas), 예를 들면 피.아에루기노사(P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)가 포함된다. 바람직한 이.콜라이 클로닝 숙주 중의 하나는 이.콜라이 294(ATCC 31,446)이지만, 이.콜라이 B, 이.콜라이 X1776(ATCC 31,537) 및 이.콜라이 W3110(ATCC 27,325)과 같은 다른 균주도 적당하다. 이러한 예는 제한하기 보다는 예시하는 것이다.
원핵생물 외에, 사상 진균 또는 효모와 같은 진핵생물 미생물이 폴리펩타이드 암호화 벡터의 적당한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 일반적으로 빵효모는 하등 진핵생물 숙주 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용된다. 하지만, 많은 다른 속, 종 및 균주도 시판되고 있고, 본 발명에 유용하며, 그 예로는 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주, 예를 들면 케이.락티스(K. lactis), 케이. 프라질리스(K. fragilis)(ATCC 12,424), 케이.불가리쿠스(K. bulgaricus)(ATCC 16,045), 케이.위커라미(K. wickeramii)(ATCC 24,178), 케이.월티(K. waltii)(ATCC 56,500), 케이.드로소필라럼(K. drosophilarum)(ATCC 36,906), 케이.써모톨러란스(K. thermotolerans), 및 케이.마르시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia)(EP 402,226); 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)(EP 183,070); 칸디다(Candida); 트리코데르마 레에시아(Trichoderraa reesia)(EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 쉬와니오마이세스(Schwanniomyces), 예를 들면 쉬와니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 사상 진균, 예를 들면 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 숙주, 예를 들면 에이.니듈란스(A. nidulans) 및 에이.나이거(A. niger)가 있다.
글리코실화된 항체를 발현시키기에 적당한 숙주 세포는 다세포 유기체에서 유래한다. 무척추생물 세포의 예에는 식물 및 곤충 세포가 있다. 다수의 바큘로바이러스 균주 및 변형체, 및 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(쐐기벌레), 아에데스 아에집티(Aedes aegypti)(모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus)(모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)(과일파리), 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)와 같은 숙주 유래의 대응하는 허용성 곤충 숙주 세포가 동정되어 있다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주도 공개적으로 구할 수 있고, 그 예에는 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변형체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 있으며, 이러한 바이러스는 본 발명에 따라 본 발명 중의 바이러스로서, 특히 스포돕테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 사용될 수 있다. 또한, 면, 옥수수, 감자, 대두, 페투니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물도 숙주로서 사용할 수 있다.
본 발명의 재조합 항체를 발현시키기에 바람직한 포유동물 숙주 세포에는 중국 햄스터 난소(CHO 세포)[예를 들면, DHFR 선별가능 마커, 예를 들면, 문헌(참조: Kaufman and Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621)에 기술된 것과 함께 사용되는 문헌(참조: Urlaub and Chasin (1980) PNAS USA 77:4216-4220)에 기술된 dhfr- CHO 세포], NS0 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포가 포함된다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포에 도입되면, 이 숙주 세포에서 항체가 발현하기에 충분한 시간 기간 동안 숙주 세포를 배양하거나, 보다 바람직하게는 숙주 세포가 증식된 배양 배지로 항체가 분비되기에 충분한 시간 기간 동안 숙주 세포를 배양하여 생산한다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예에는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 사람 배아 신장 세포주(현탁 배양으로 증식시키기 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, 참조: Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59(1977)); 어린햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 중국햄스터 난소세포/-DHFR(CHO, 참조: Urlaub, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 77:4216(1980)); 마우스 세르톨리 세포(TM4, 참조: Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251(1980)); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 사람 경부암종세포(HELA, ATCC CCL2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 사람 폐세포(W138, ATCC CCL 75); 사람 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방암(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포[참조: Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68(1982)]; MRC 5 세포; FS4 세포; 및 사람 간암 세포주(Hep G2)가 있다.
숙주 세포는 항체 생산을 위한 상기한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시킨 다음, 프로모터 유도, 형질전환체 선별 또는 원하는 서열을 암호화하는 유전자의 증폭에 적당한 것처럼 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양한다.
항체를 생산하는데 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양할 수 있다. 시판 배지인 Ham's F10(Sigma), 최소필수배지(MEM)(Sigma), RPMI-1640(Sigma) 및 둘베코 변형 이글 배지(DMEM, Sigma) 등은 숙주 배지의 배양에 적당하다. 또한, 문헌[참조: Ham et al., Meth. Enz. 58:44(1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255(1980), 미국특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국특허 재발행 제30,985호에 기술된 임의의 배지는 상기 숙주 세포의 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이러한 임의의 배지는 필요하다면 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예: 인슐린, 트란스페린 또는 표피성장 인자), 염(예: 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충액(예: HEPES), 뉴클레오타이드(예: 아데노신 및 티미딘), 항생제(예: 젠타마이신 약물), 미량 원소(보통 최종 농도가 마이크로몰 범위인 무기 화합물로서 정의된다) 및 글루코스 또는 등가의 에너지원으로 보충될 수 있다. 또한, 임의의 다른 필수 보충물도 당업자에게 공지되어 있는 적당한 농도로 포함할 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선별한 숙주 세포에서 종래 사용되었던 조건이며, 이는 당업자라면 잘 알고 있을 것이다.
또한, 숙주 세포는 완전한 항체의 부분, 예를 들면 Fab 단편 또는 scFv 분자를 생산하는 데에도 사용될 수 있다. 상기한 절차의 변형도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 이해해야 한다. 예를 들어, 숙주 세포는 본 발명에 따른 항체의 경쇄 또는 중쇄(둘 모두는 아니다)를 암호화하는 DNA로 형질감염되는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 재조합 DNA 기술을 사용하여, hTNFα에 결합하는데 필요하지 않은 경쇄 및 중쇄 중 어느 하나 또는 둘 모두를 암호화하는 DNA의 일부 또는 전체를 제거할 수도 있다. 이러한 절두된 DNA 분자로부터 발현된 분자도 역시 본 발명의 항체에 속하는 것이다. 또한, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄가 본 발명의 항체이고 다른 중쇄 및 경쇄가 hTNFα 외에 다른 항원에 특이적인 이기능성 항체는 본 발명의 항체를 표준 화학적 가교 방법에 의해 제2 항체에 가교시킴으로써 생산할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 재조합 발현시키기에 바람직한 시스템에 따르면, 항체 중쇄 및 항체 경쇄를 모두 암호화하는 재조합 발현 벡터는 인산칼슘 매개의 형질감염에 의해 dhfr-CHO 세포 내로 도입된다. 재조합 발현 벡터 내에서 항체 중쇄와 경쇄 유전자는 각각 이 유전자의 높은 전사 수준을 유도하는 CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 인자에 작동적으로 결합되어 있다. 재조합 발현 벡터는 또한 DHFR 유전자를 보유하여, 메토트렉세이트 선별/증폭을 통해 그 벡터로 형질감염된 CHO 세포를 선별할 수 있게 한다. 선별된 형질전환된 숙주 세포는 항체 중쇄 및 경쇄가 발현되도록 배양하고, 이 배양 배지로부터 완전한 항체를 회수한다. 재조합 발현 벡터의 제조, 숙주 세포의 형질감염, 형질전환체의 선별, 숙주 세포 배양 및 배양 배지로부터 항체의 회수에는 표준 분자생물학 기술을 사용한다.
본 발명의 재조합 사람 항체, 예를 들면 아달리무맙 또는 이의 항원 결합 부분, 또는 본 명세서에 개시된 아달리무맙 관련 항체는 사람 림프구 유래의 mRNA로부터 제조된 사람 VL 및 VH cDNA를 사용하여 작제된 재조합 조합 항체 라이브러리, 바람직하게는 scFv 파지 디스플레이 라이브러리의 선별을 통해 분리할 수 있다. 이러한 라이브러리를 제조 및 선별하기 위한 방법론은 당업계에 공지되어 있다. 파지 디스플레이 라이브러리를 생산하기 위한 시판 키트(예: Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, 카탈로그 번호 27-9400-01; 및 Stratagene SurfZAP™ 파지 디스플레이 키트, 카탈로그 번호 240612) 외에도, 항체 디스플레이 라이브러리를 생산 및 선별하는데 특히 사용하기 적당한 방법 및 시약의 예는 문헌[참조: Ladner et al. 미국특허 제5,223,409호; Kang et al. PCT 공개번호 WO 92/18619; Dower et al. PCT 공개번호 WO 91/17271; Winter et al. PCT 공개번호 WO 92/20791; Markland et al. PCT 공개번호 WO 92/15679; Breitling et al. PCT 공개번호 WO 93/01288; McCafferty et al. PCT 공개번호 WO 92/01047; Garrard et al. PCT 공개번호 WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al, Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrard et al.(1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc. Acid Res 19:4133-4137; 및 Barbas et al (1991) PNAS 88:7978-7982]에 예시되어 있다.
재조합 기술을 사용할 때, 항체는 세포내 생산되거나, 세포주강 내에 생산되거나 또는 배지 내로 바로 분비될 수 있다. 항체가 세포내 생산되는 경우, 1단계로서 미립자 파편인 숙주 세포 또는 용균 세포(예를 들면, 균질화로부터 생산)를 원심분리 또는 한외여과 등을 통해 제거한다. 항체가 배지로 분비되는 경우에는 상기 발현 시스템 유래의 상청액을 먼저 시판 단백질 농축 필터, 예를 들면 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 장치로 농축시키는 것이 일반적이다.
본 발명의 방법 전에, 먼저 세포 파편으로부터 항체를 정제하는 절차는 항체의 발현 부위에 따라 달라진다. 일부 항체는 세포로부터 주위 성장 배지 내로 바로 분비되게 할 수 있고; 세포내 제조되는 항체도 있다. 후자의 항체인 경우, 정제 방법의 제1 단계는 기계적 전단, 삼투쇼크 또는 효소 처리를 포함하는 다양한 방법에 의해 이루어질 수 있는 세포의 용균을 수반한다. 이러한 붕괴는 세포의 전체 함유물을 파쇄액으로 방출시키고, 크기가 작아서 제거하기 어려운 세포하(subcellular) 단편도 생산한다. 이 단편은 일반적으로 차등 원심분리 또는 여과로 제거한다. 항체가 배지내로 분비되는 것인 경우에는 이러한 발현 시스템 유래의 상청액을 일반적으로 먼저 시판 단백질 농축 필터, 예를 들면 아미콘 또는 밀리포어 펠리콘 한외여과 장치를 사용하여 농축한다. 항체가 배지로 분비되는 경우, 재조합 숙주 세포도 접선류 여과 등을 통해 세포 배양배지로부터 분리할 수 있다. 항체는 또한 본 발명의 항체 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
한가지 양태에서, 본 발명의 방법은 사람 TNFα에 높은 친화도 및 낮은 해리 속도로 결합하고, 높은 중화능이 있는 사람 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함한다. 사람 항체는 재조합 중화 사람 항-hTNFα 항체인 것이 바람직하다. 본 발명의 방법에 사용되는 가장 바람직한 재조합 중화 항체는 아달리무맙, Humira®　 및 D2E7로도 불리는 아달리무맙으로 지칭되는 것이다 (D2E7 VL 영역의 아미노산 서열은 서열번호 1에; D2E7 VH 영역의 아미노산 서열은 서열번호 2에 제시했다). D2E7 (아달리무맙; Humira®)의 성질은 본 발명에 각각 참고인용된 미국특허 제6,090,382호, 제6,258,562호 및 제6,509,015호(Salfeld et al.)에 기술되어 있다. TNFα 항체의 다른 예에는 류마티스 관절염 치료용으로 임상 시험을 거친 키메릭성 및 사람화된 쥐 항-hTNFα 항체가 포함된다[참조: Elliott et al. (1994) Lancet 344:1125-1127; Elliot et al. (1994) Lancet 344:1105-1110; Rankin et al. (1995) Br. J. Rheumatol. 34:334-342]. 다른 양태에서, 본 발명에 사용된 TNFα 항체는 인플릭시맙[Remicade®, Johnson and Johnson; 본원에 참고인용된 미국특허 제5,656,272호 참조], CDP571(사람화된 모노클로날 항-TNFα IgG4 항체), CDP 870(사람화된 모노클로날 항-TNFα 항체 단편), 항-TNF dAb(Peptech) 및 CNTO 148(골리무맙; Medarex and Centocor, WO 02/12502도 참조)이다.
한가지 양태에서, 본 발명의 방법은 아달리무맙 항체 및 항체 부분, 아달리무맙 관련 항체 및 항체 부분, 및 아달리무맙과 동등한 성질을 보유하는, 예를 들면 hTNFα에 대한 높은 친화성 결합과 낮은 해리 속도론 및 높은 중화능 등을 보유하는 다른 사람 항체 및 항체 부분을 포함한다. 한가지 양태에서, 본 발명은, 표면 플라스몬 공명으로 각각 측정했을 때 1 x 10-8 M 이하의 Kd 및 1 x 10-3 s-1 이하의 Koff 속도 상수로 사람 TNFα로부터 해리되고, 표준 시험관내 L929 검정에서 1 x 10-7 M 이하의 IC50으로 사람 TNFα 세포독성을 중화시키는, 분리된 사람 항체 또는 이의 항원 결합 부분으로의 치료를 포함한다. 보다 바람직하게는, 분리된 사람 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 5 x10-4 s-1 이하의 Koff, 보다 더 바람직하게는 1x10-4s-1 이하의 Koff 속도로 사람 TNFα로부터 해리된다. 보다 바람직하게는, 분리된 사람 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 표준 시험관내 L929 검정에서 1 x 10-8 M 이하, 보다 더 바람직하게는 1 x 10-9 M 이하, 보다 바람직하게는 1 x 10-10 M 이하의 IC50으로 사람 TNFα 세포독성을 중화한다. 바람직한 양태에서, 항체는 분리된 사람 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다.
항체 중쇄 및 경쇄 CDR3 도메인은 항원에 대한 항체의 결합 특이성/친화성에 중요한 역할을 한다는 것을 당업계에 공지된 사실이다. 따라서, 다른 관점으로서, 본 발명은 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 사람 항체를 투여하여 류마티스 관절염을 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 항체는 hTNFα와의 결합에서 느린 해리 반응속도론을 갖고 아달리무맙과 구조적으로 동일하거나 관련 있는 경쇄 및 중쇄 CDR3 도메인을 보유한다. 아달리무맙 VL CDR3의 위치 9번에는 Koff에 실질적으로 영향을 미침이 없이 Ala 또는 Thr이 위치할 수 있다. 따라서, 아달리무맙 VL CDR3의 컨센서스 모티프(consensus motif)는 아미노산 서열 Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A)(서열번호 3)을 포함한다. 또한, 아달리무맙 VH CDR3의 위치 12에는 Koff에 실질적으로 영향을 미침이 없이 Tyr 또는 Asn이 위치할 수 있다. 따라서, 아달리무맙 VH CDR3의 컨센서스 모티프는 아미노산 서열: V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-E-(Y/N)(서열번호 4)을 포함한다. 더욱이, 미국특허 제6,090,382호의 실시예 2에서 증명되어 있듯이, 아달리무맙 중쇄 및 경쇄의 CDR3 도메인은 Koff에 실질적으로 영향을 미침이 없이 단일 알라닌 잔기로 치환될 수 있다(VL CDR3 내의 위치 1, 4, 5, 7 또는 8번, 또는 VH CDR3 내의 위치 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 또는 11번). 또한, 당업자는, 아달리무맙 VL 및 VH CDR3 도메인이 알라닌으로 치환되기 쉽다면, CDR3 도메인 내의 다른 아미노산도, 항체의 낮은 해리 상수를 유지하면서 치환될 수 있을 것이며, 특히 보존적 아미노산 치환이 가능할 것이라는 것을 인식할 것이다. 아달리무맙 VL 및/또는 VH CDR3 도메인 내에는 1 이하부터 5개의 보존적 아미노산 치환이 이루어진 것이 바람직하다. 아달리무맙 VL 및/또는 VH CDR3 도메인 내에는 1개 내지 5개 이하의 보존적 아미노산 치환이 이루어진 것이 보다 바람직하다. 또한, 보존적 아미노산 치환은 hTNFα에 대한 결합에 중요한 아미노산 위치에서는 이루어지지 않아야 한다. 아달리무맙 VL CDR3의 위치 2 및 5번, 아달리무맙 VH CDR3의 위치 1 및 7번은 hTNFα와의 상호작용에 중요한 것으로 보이며, 이에 따라 이들 위치에서는 보존적 아미노산 치환이 이루어지지 않는 것이 바람직하다(아달리무맙 VL CDR3의 위치 5번에서의 알라닌 치환은 상기한 바와 같이 허용될지라도)(미국특허 제6,090,382호 참조).
따라서, 다른 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 다음과 같은 특징을 포함하는 것이 바람직하다:
a) 표면 플라스몬 공명으로 측정했을 때 1 x 10-3 s-1 이하의 Koff 속도 상수로 사람 TNFα로부터 해리되고;
b) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나, 위치 1, 4, 5, 7 또는 8번에서의 단일 알라닌 치환 또는 위치 1, 3, 4, 6, 7, 8 및/또는 9번에서의 1개 내지 5개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호 3으로부터 변형된, 경쇄 CDR3 도메인을 보유하며;
c) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 4로부터 위치 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 또는 11번에서의 단일 알라닌 치환 또는 위치 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 및/또는 12번에서의 1개 내지 5개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호 4로부터 변형된 중쇄 CDR3 도메인을 보유한다.
상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 5 x 10-4 s-1 이하의 Koff로 사람 TNFα로부터 해리되는 것이 보다 바람직하다. 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 1 x 10-4 s-1 이하의 Koff로 사람 TNFα로부터 해리되는 것이 보다 더 바람직하다.
또 다른 양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 3으로부터 위치 1, 4, 5, 7 또는 8번에서 단일 알라닌 치환에 의해 변형된 CDR3 도메인을 보유하는 경쇄 가변영역(LCVR), 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 4로부터 위치 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 또는 11번에서 단일 알라닌 치환에 의해 변형된 CDR3 도메인을 보유하는 중쇄 가변영역(HCVR)을 포함하는 것이 바람직하다. LCVR은 추가로 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인(즉, 아달리무맙 VL CDR2)을 보유하고, HCVR은 추가로 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인(즉, 아달리무맙 VH CDR2)을 보유하는 것이 바람직하다. LCVR은 추가로 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인(즉, 아달리무맙 VL CDR1)을 보유하고, HCVR은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인(즉, 아달리무맙 VH CDR1)을 보유하는 것이 보다 더 바람직하다. VL의 프레임워크 영역은 바람직하게는 VκI 사람 생식계열로부터의 것이고, 보다 바람직하게는 A20 사람 생식계열 Vk 유전자에서 유래하는 것이며, 가장 바람직하게는 미국특허 제6,090,382호의 도 1A 및 1B에 제시된 아달리무맙 VL 프레임워크 서열에서 유래하는 것이다. VH의 프레임워크 영역은 바람직하게는 VH3 사람 생식계열로부터 유래하는 것이고, 보다 바람직하게는 DP31 사람 생식계열 VH 유전자에서 유래하는 것이며, 가장 바람직하게는 미국특허 제6,090,382호의 도 2A 및 도 2B에 제시된 아달리무맙 VH 프레임워크 서열에서 유래하는 것이다.
따라서, 다른 양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역(LCVR)(즉, 아달리무맙 VL) 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역(HCVR)(즉, 아달리무맙 VH)을 포함하는 것이 바람직하다. 특정 양태에서, 항체는 중쇄 불변 영역, 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변영역을 포함한다. 중쇄 불변영역은 IgG1 중쇄 불변 영역 또는 IgG4 중쇄 불변 영역인 것이 바람직하다. 더욱이, 항체는 카파 경쇄 불변 영역 또는 람다 경쇄 불변 영역인 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 항체는 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는 것이 바람직하다. 또는, 항체 부분은 예를 들면 Fab 단편 또는 단일쇄 Fv 단편일 수 있다.
또 다른 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 아달리무맙 관련 VL 및 VH CDR3 도메인을 포함하는 것이 바람직하고, 그 예로는 서열번호 3, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 보유하는 경쇄 가변 영역(LCVR), 또는 서열번호 4, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34 및 서열번호 35로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 보유하는 중쇄 가변 영역(HCVR)을 보유하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 있다.
본 발명에 사용된 TNFα 항체는 변형될 수 있다. 일부 양태에서, TNFα 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 바람직한 효과를 제공하기 위해 화학적으로 변형된다. 예를 들어, 본 발명의 항체 및 항체 단편의 페길화는 당업계에 공지된 임의의 페길화 반응으로, 예를 들면 다음과 같은 문헌에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다[참조: Focus on Growth Factors 3:4-10(1992); EP 0 154 316; 및 EP 0 401 384 (각 문헌은 전문이 본 발명에 참고인용됨)]. 페길화는 반응성 폴리에틸렌 글리콜 분자(또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행되는 것이 바람직하다. 본 발명의 항체 및 항체 단편을 페길화하는데 바람직한 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. 본 명세서에 사용된 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질의 유도체화에 사용되었던 PEG의 임의의 형태, 예를 들면 모노(Cl-ClO)알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 등도 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 페길화된 항체 및 항체 단편의 제조 방법은 일반적으로 (a) 항체 또는 항체 단편 및 폴리에틸렌 글리콜, 예를 들면 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데하이드 유도체를, 그 항체 또는 항체 단편이 하나 이상의 PEG 그룹에 부착되도록 하는 조건 하에서 반응시키는 단계, 및 (b) 반응 산물을 수득하는 단계를 포함할 것이다. 공지된 파라미터 및 원하는 결과를 바탕으로 최적의 반응 조건 또는 아실화 반응을 선택하는 것은 당업자에게 용이한 일이다.
페길화된 항체 및 항체 단편은 일반적으로 본 명세서에 기술된 TNFα 항체 및 항체 단편을 투여하여 본 발명의 TNFα 관련 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 페길화된 항체 및 항체 단편은 비-페길화된 항체 및 항체 단편에 비해 증가된 반감기를 나타낸다. 페길화된 항체 및 항체 단편은 단독으로 사용되거나, 함께 사용되거나, 또는 다른 약제 조성물과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, TNFα 항체 또는 이의 단편은 항체의 불변 영역이 변형되어 비변형된 항체에 비해 적어도 하나의 불변영역 매개의 생물학적 효과인자(effector) 기능을 감소시키도록 변경될 수 있다. Fc 수용체에 대한 결합 감소를 나타내도록 본 발명의 항체를 변형하기 위해, 항체의 면역글로불린 불변 영역 단편의 돌연변이는 Fc 수용체(FcR)에 필요한 특정 영역에서 이루어질 수 있다[참조: Canfield and Morrison (1991) J. Exp. Med. 173:1483-1491; 및 Lund et al. (1991) J. of Immunol. 147:2657-2662]. 항체의 FcR 결합능의 감소는 또한 FcR 상호작용에 의존적인 다른 효과인자 기능, 예를 들면 옵소닌화(opsonization) 및 포식작용, 및 항원 의존적 세포의 세포독성 등을 감소시킬 수도 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 부분은 유도체화되거나 또는 다른 기능성 분자 (예: 다른 펩타이드 또는 단백질)에 결합될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 및 항체 부분은 면역부착 분자를 비롯하여, 본 명세서에 기술된 사람 항-hTNFα 항체의 유도체화된 형태 및 다른 방식으로 변형된 형태를 포함하는 것이다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항체 부분은 하나 이상의 다른 분자 실체, 예를 들면 다른 항체(예: 이특이성 항체 또는 디아바디), 검출가능한 제제, 세포독성제, 약제 및/또는 다른 분자와 항체 또는 항체 부분의 결합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩타이드(예: 스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그)에 기능적으로 결합될 수 있다(화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유결합 등에 의해).
유도체화된 항체의 1가지 종류는 2 이상의 항체(동일한 종류 또는 다른 종류의 항체, 예를 들면 이특이성 항체 생산을 위해)를 가교시켜 생산한 것이다. 적당한 가교제에는 2개의 상이한 반응성 기가 적당한 스페이서에 의해 분리된 이종이기능성인 것(예: m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스테르) 또는 동종이기능성인 것(예: 디석신이미딜 수베레이트)이 있다. 이러한 링커는 판매원[Pierce Chemical Company, Rockford, IL]으로부터 구할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 부분이 유도체화될 수 있는 유용한 검출가능한 제제에는 형광 화합물이 있다. 검출가능한 형광 제제의 예에는 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 5-디메틸아민-1-나프탈렌설포닐 클로라이드, 피코에리트린 등이 포함된다. 또한, 항체는 검출가능한 효소, 예를 들면 알칼리성 포스파타제, 양고추냉이 퍼옥시다제, 글루코스 옥시다제 등에 의해 유도체화될 수 있다. 항체가 검출가능한 효소로 유도체화될 때, 검출가능한 반응 산물을 생산하기 위해 효소가 사용하는 추가 시약을 첨가하여 검출한다. 예를 들어, 검출가능한 제제인 양고추냉이 퍼옥시다제가 존재할 때, 과산화수소 및 디아미노벤지딘의 첨가는 검출가능한 유색 반응 산물을 유도한다. 항체는 또한 비오틴으로 유도체화될 수 있고, 아비딘 또는 스트렙타비딘 결합의 간접 측정을 통해 검출할 수도 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 부분은 숙주 세포에서 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 유전자의 재조합 발현을 통해 제조할 수 있다. 재조합적 항체 발현을 위해, 숙주 세포는 항체의 면역글로불린 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA 단편을 보유하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터로 형질감염시켜, 이 숙주 세포에서 경쇄 및 중쇄가 발현되도록 하고, 바람직하게는 숙주 세포가 배양되는 배지로 분비되어, 이 배지로부터 항체를 회수할 수 있게 한다. 표준 재조합 DNA 방법을 사용하여 항체 중쇄 및 경쇄 유전자를 수득하고, 이 유전자를 재조합 발현 벡터에 혼입시킨 뒤, 이 벡터를 숙주 세포에 도입시킨다[참조: Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) 및 미국특허 제4,816,397호(Boss et al.)].
아달리무맙 또는 아달리무맙 관련 항체를 발현시키기 위해, 먼저 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 암호화하는 DNA 단편을 수득한다. 이러한 DNA는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용한 생식계열 경쇄 및 중쇄 가변 서열의 증폭 및 변형을 통해 수득할 수 있다. 사람 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자의 생식계열 DNA 서열은 당업계에 공지되어 있다[참조: "Vbase" 사람 생식계열 서열 데이터베이스; Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson et al (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; 및 Cox et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line V78 Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836; 각 문헌의 내용은 본 발명에 참고인용된 것이 분명하다]. 아달리무맙 또는 아달리무맙 관련 항체의 중쇄 가변 영역을 암호화하는 DNA 단편을 수득하기 위해, 사람 생식계열 VH 유전자의 VH3 계열의 구성원은 PCR로 증폭시킨다. DP-31 VH 생식계열 서열을 증폭시키는 것이 가장 바람직하다. 아달리무맙 또는 아달리무맙 관련 항체의 경쇄 가변 영역을 암호화하는 DNA 단편을 수득하기 위해, 사람 생식계열 VL 유전자의 VκI 계열의 구성원을 표준 PCR로 증폭시킨다. A20 VL 생식계열 서열을 증폭시키는 것이 가장 바람직하다. DP-31 생식계열 VH 및 A20 생식계열 VL 서열의 증폭에 사용하기에 적당한 PCR 프라이머는 표준 방법을 사용하여, 상기 인용된 참고문헌에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 기초로 하여 설계할 수 있다.
생식계열 VH 및 VL 단편이 수득되면, 이 서열들을 본 명세서에 개시된 아달리무맙 또는 아달리무맙 관련 아미노산 서열을 암호화하도록 돌연변이시킬 수 있다. 생식계열 VH 및 VL DNA 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열은 먼저 아달리무맙 또는 아달리무맙 관련 VH 및 VL 아미노산 서열과 비교하여, 생식계열과 다른 아달리무맙 또는 아달리무맙 관련 서열에 존재하는 아미노산 잔기를 확인한다. 그 다음, 생식계열 DNA 서열의 적당한 뉴클레오타이드는 돌연변이된 생식계열 서열이 아달리무맙 또는 아달리무맙 관련 아미노산 서열을 암호화하도록 유전자 코드를 사용하여 돌연변이시켜, 변화가 이루어져야 하는 뉴클레오타이드를 측정한다. 생식계열 서열의 돌연변이유발은 표준 방법, 예를 들면 PCR 매개 돌연변이유발(PCR 산물이 돌연변이를 포함하도록 PCR 프라이머 내에 돌연변이된 뉴클레오타이드를 포함시키는 방법) 또는 부위 지시된 돌연변이유발 등을 통해 수행한다.
일단 아달리무맙 또는 아달리무맙 관련 VH 및 VL 단편을 암호화하는 DNA 단편이 수득되면(상기한 바와 같이 생식계열 VH 및 VL 유전자의 증폭 및 돌연변이유발을 통해), 이 DNA 단편을 표준 재조합 DNA 기술로 추가 조작하여, 예를 들면 가변 영역 유전자를 전체 길이의 항체 사슬 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 변환시킨다. 이러한 조작에서, VL 또는 VH를 암호화하는 DNA 단편은 다른 단백질을 암호화하는 다른 DNA 단편, 예를 들면 항체 불변영역 또는 유연한(flexible) 링커에 작동적으로 결합시킨다. 이러한 상황에서 사용된 "작동적으로 결합된"이란 용어는 2개의 DNA 단편이 암호화한 아미노산 서열이 프레임내에 존재하도록 결합시킨다는 것을 의미한다.
VH 영역을 암호화하는 분리된 DNA는 VH 암호화 DNA를 중쇄 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3)을 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동적으로 결합시킴으로써 전체 길이의 중쇄 유전자로 변환될 수 있다. 사람 중쇄 불변 영역 유전자 서열은 당업계에 공지되어 있고[참조: Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242], 이 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있으나, IgG1 또는 IgG4 불변 영역이 가장 바람직하다. Fab 단편 중쇄 유전자를 위해, VH 암호화 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만을 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동적으로 결합될 수 있다.
VL 영역을 암호화하는 분리된 DNA는 VL 암호화 DNA를 경쇄 불변 영역 CL을 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동적으로 결합시켜 전체 길이의 경쇄 유전자(뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 변환시킬 수 있다. 사람 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고[참조: Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242], 이 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있으나, 카파 불변 영역인 것이 가장 바람직하다.
scFv 유전자를 생산하기 위해, VH 및 VL 암호화 DNA 단편은 유연한 링커, 예를 들면 아미노산 서열 (Gly4-Ser)3을 암호화하는 다른 단편에 작동적으로 결합시켜, VH 및 VL 서열이 상기 유연한 링커에 의해 결합되어 연속적인 단일쇄 단백질로서 발현될 수 있도록 한다[참조: Bird et al (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al, Nature (1990) 348:552-554].
본 발명의 항체 EH는 항체 부분을 발현시키기 위해, 상기한 바와 같이 수득한 부분 또는 전체 길이의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA를 이 유전자가 전사 및 해독 조절 서열에 작동적으로 결합되도록 발현 벡터에 삽입한다. 이와 관련하여, "작동적으로 결합된"이란 용어는 벡터 내의 전사 및 해독 조절 서열이 항체 유전자의 전사 및 해독을 조절하는 계획된 기능을 수행하도록 벡터 내에 연결된다는 것을 의미하는 것이다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 사용된 발현 숙주 세포에 적합한 것으로 선택한다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 다른 벡터에 삽입할 수도 있으나, 두 유전자를 동일한 발현 벡터에 삽입하는 것이 더욱 일반적이다. 항체 유전자는 표준 방법(예를 들면, 항체 유전자 단편 및 벡터의 상보성 제한 부위에 연결 또는 제한 부위가 존재하지 않는다면 평활말단 연결)에 의해 발현 벡터 내로 삽입한다. 아달리무맙 또는 아달리무맙 관련 경쇄 또는 중쇄 서열을 삽입하기 전에, 발현 벡터는 이미 항체 불변영역 서열을 보유할 수 있다. 예를 들어, 아달리무맙 또는 아달리무맙 관련 VH 및 VL 서열을 전체 길이 항체 유전자로 변환시키는 1가지 시도는, VH 단편은 벡터 내의 CH 단편(들)에 작동적으로 결합하고 VL 단편은 벡터 내의 CL 단편에 작동적으로 결합하도록 상기 서열들을 이미 중쇄 불변 및 경쇄 불변 영역을 각각 암호화하고 있는 발현 벡터 내로 삽입하는 것이다. 다시 또는 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 사슬의 분비를 촉진하는 시그날 펩타이드를 암호화할 수 있다. 항체 사슬 유전자는 시그날 펩타이드가 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 프레임내(in-frame) 결합되도록 벡터에 클로닝될 수 있다. 시그날 펩타이드는 면역글로불린 시그날 펩타이드 또는 이종 시그날 펩타이드(즉, 비면역글로불린 단백질 유래의 시그날 펩타이드)일 수 있다.
항체 사슬 유전자 외에, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포 내에서 항체 사슬 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 보유한다. "조절 서열"이란 용어는 프로모터, 인핸서 및 항체 사슬 유전자의 전사 또는 해독을 조절하는 다른 발현 조절 인자(예: 폴리아데닐화 시그날)를 포함하는 것을 의미한다. 이러한 조절 서열에 대해서는 예를 들면 문헌[참조: Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990)]에 기술되어 있다. 조절 서열의 선택을 포함하는 발현 벡터의 설계는 형질전환되어야 하는 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 정도 등과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다는 것을 당업자라면 잘 알고 있을 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현에 바람직한 조절 서열에는 포유동물 세포에서 높은 단백질 발현 수준을 유도하는 바이러스 인자, 예를 들면 사이토메갈로바이러스(CMV) 유래의 프로모터 및/또는 인핸서(예를 들면, CMV 프로모터/인핸서), 시미안 바이러스 40(SV40) 유래의 프로모터 및/또는 인핸서(예를 들면, SV 40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스 유래 프로모터 및/또는 인핸서 (예: 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP)) 및 폴리오마 유래 프로모터 및/또는 인핸서가 있다. 바이러스 조절 인자 및 이의 서열에 대한 더 상세한 설명은 문헌[참조: 미국특허 제5,168,062호(Stinski), 미국특허 제4,510,245호(Bell et al.) 및 미국특허 제4,968,615호(Schaffner et al.)]에 기술되어 있다.
항체 사슬 유전자 및 조절 서열 외에도, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가 서열, 예를 들면 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예: 복제 오리진) 및 선별가능 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선별가능 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다[참조: 미국특허 제4,399,216호, 제4,634,665호 및 제5,179,017호(모두 Axel et al.)]. 예를 들어, 일반적으로 선별가능 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선별가능 마커 유전자에는 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선택/증폭과 함께 dhfr- 숙주 세포에 사용) 및 neo 유전자(G418 선택용)가 포함된다.
경쇄 및 중쇄 발현을 위하여, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 벡터(들)를 표준 기술에 의해 숙주 세포 속으로 형질감염시킨다. "형질감염"이란 용어의 다양한 형태는 일반적으로 외인성 DNA를 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포 속으로 도입시키는데 사용되는 광범위한 기술, 예를 들면 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함하는 의미이다. 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 본 발명의 항체를 발현하는 것은 이론적으로 가능하지만, 진핵생물 세포, 가장 바람직하게는 포유동물 숙주 세포에서의 항체의 발현은, 이러한 진핵생물 세포, 특히 포유동물 세포가 원핵생물 세포보다 적당히 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 어셈블리하여 분비할 가능성이 크기 때문에 가장 바람직하다. 항체 유전자의 원핵생물 발현은 활성 항체를 고수율로 생산하는 데에는 비효과적인 것으로 보고되었다[참조: Boss and Wood (1985) Immunology Today 6: 12-13].
본 발명의 재조합 항체를 발현시키기에 바람직한 포유동물 숙주 세포에는 중국 햄스터 난소(CHO 세포)[예를 들면, DHFR 선별가능 마커, 예를 들면, 문헌(참조: Kaufman and Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621)에 기술된 것과 함께 사용되는 문헌(참조: Urlaub and Chasin (1980) PNAS USA 77:4216-4220)에 기술된 dhfr- CHO 세포], NS0 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포가 포함된다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포에 도입되면, 이 숙주 세포에서 항체가 발현하기에 충분한 시간 기간 동안 숙주 세포를 배양하거나, 보다 바람직하게는 숙주 세포가 증식된 배양 배지로 항체가 분비되기에 충분한 시간 기간 동안 숙주 세포를 배양하여 생산한다. 항체는 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
숙주 세포는 Fab 단편 또는 scFv 분자와 같이 완전 항체의 부분을 생산하는 데에도 사용될 수 있다. 상기한 절차의 변형도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 이해하여야 한다. 예를 들어, 숙주 세포를 본 발명에 따른 항체의 경쇄 또는 중쇄(둘 모두는 아니다)를 암호화하는 DNA로 형질감염시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 재조합 DNA 기술을 사용하여, hTNFα에 결합하는데 필요하지 않은 경쇄 및 중쇄 중 어느 하나 또는 둘 모두를 암호화하는 DNA의 일부 또는 전체를 제거할 수도 있다. 이러한 절두된 DNA 분자로부터 발현된 분자도 역시 본 발명의 항체에 속하는 것이다. 또한, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄가 본 발명의 항체이고 다른 중쇄 및 경쇄가 hTNFα 외에 다른 항원에 특이적인 이기능성 항체는 본 발명의 항체를 표준 화학적 가교 방법에 의해 제2 항체에 가교시킴으로써 생산할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 재조합 발현시키기에 바람직한 시스템에서, 항체 중쇄 및 항체 경쇄를 모두 암호화하는 재조합 발현 벡터를 인산칼슘 매개의 형질감염에 의해 dhfr-CHO 세포 속으로 도입시킨다. 재조합 발현 벡터 내에서 항체 중쇄와 경쇄 유전자는 각각 이 유전자의 높은 전사 수준을 유도하는 CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 인자에 작동적으로 결합되어 있다. 재조합 발현 벡터는 또한 DHFR 유전자를 보유하여, 메토트렉세이트 선별/증폭을 통해 그 벡터로 형질감염된 CHO 세포를 선별할 수 있게 한다. 선별된 형질전환된 숙주 세포를 항체 중쇄 및 경쇄가 발현되도록 배양하고, 이 배양 배지로부터 완전한 항체를 회수한다. 재조합 발현 벡터의 제조, 숙주 세포의 형질감염, 형질전환체의 선별, 숙주 세포 배양 및 배양 배지로부터 항체의 회수에는 표준 분자생물학 기술을 사용한다.
아달리무맙 또는 이의 항원 결합 부분, 또는 본 명세서에 개시된 아달리무맙 관련 항체뿐만 아니라 본 발명의 재조합 사람 항체는 사람 림프구 유래의 mRNA로부터 제조된 사람 VL 및 VH cDNA를 사용하여 작제된 재조합 조합 항체 라이브러리, 바람직하게는 scFv 파지 디스플레이 라이브러리의 선별을 통해 분리할 수 있다. 이러한 라이브러리를 제조 및 선별하기 위한 방법론은 당업계에 공지되어 있다. 파지 디스플레이 라이브러리를 생산하기 위한 시판 키트 (예: Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, 카탈로그 번호 27-9400-01; 및 Stratagene SurfZAP™ 파지 디스플레이 키트, 카탈로그 번호 240612) 외에도, 항체 디스플레이 라이브러리를 생산 및 선별하는데 특히 사용하기 적당한 방법 및 시약의 예는, 예를 들면, 문헌[참조: Ladner et al. 미국특허 제5,223,409호; Kang et al. PCT 공개번호 WO 92/18619; Dower et al. PCT 공개번호 WO 91/17271; Winter et al. PCT 공개번호 WO 92/20791; Markland et al. PCT 공개번호 WO 92/15679; Breitling et al. PCT 공개번호 WO 93/01288; McCafferty et al. PCT 공개번호 WO 92/01047; Garrard et al. PCT 공개번호 WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al, Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrard et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc. Acid Res 19:4133-4137; 및 Barbas et al (1991) PNAS 88:7978-7982]에서 찾을 수 있다.
바람직한 양태에서, hTNFα에 대해 높은 친화성과 낮은 해리상수를 보유하는 사람 항체를 분리하기 위하여, 먼저 hTNFα에 대해 높은 친화성과 낮은 해리상수를 가진 쥐 항-hTNFα 항체 (예: MAK195, 이의 하이브리도마의 수탁번호 : ECACC 87 050801)를 사용하여, PCT 공개번호 WO 93/06213(Hoogenboom et al.)에 기술된 에피토프 임프린팅(imprinting) 방법을 통해, hTNFα에 대한 결합 활성이 유사한 사람 중쇄 및 경쇄 서열을 선별한다. 이 방법에 사용되는 항체 라이브러리는 문헌[참조: McCafferty et al., PCT 공개번호 WO 92/01047, McCafferty et al. Nature(1990) 348: 552-554; 및 Griffiths et al.(1993) EMBO J 12: 725-734]에 기술된 바와 같이 제조 및 선별된 scFv 라이브러리인 것이 바람직하다. scFv 항체 라이브러리는 항원으로서 재조합 사람 TNFα를 사용하여 선별하는 것이 바람직하다.
1차 사람 VL 및 VH 단편이 선택되면, 1차 선택된 VL 및 VH 단편의 여러 쌍을 hTNFα 결합에 대해서 선별하는 "믹스 앤드 매치(mix and match)" 실험을 수행하여, 바람직한 VL/VH 쌍 조합을 선택한다. 또한, hTNFα 결합의 친화성을 더욱 증가시키고/시키거나 해리 상수를 더 낮추기 위해, 추가로 바람직한 VL/VH 쌍(들)의 VL 및 VH 단편을, 바람직하게는 VH 및/또는 VL의 CDR3 영역 내를 자연 면역반응 동안 항체의 친화성 성숙을 초래하는 생체내 체세포 돌연변이 방법과 유사한 방법에 따라 무작위 돌연변이시킬 수 있다. 이러한 시험관내 친화성 성숙은 VH CDR3 또는 VL CDR3에 각각 상보적인 PCR 프라이머를 사용하여 VH 및 VL 영역을 증폭시켜 달성할 수 있으며, 이 프라이머들은 VH 및/또는 VL CDR3 영역 내에 무작위 돌연변이가 도입되어 있는 VH 및 VL 단편을 최종 PCR 산물이 암호화하도록 특정 위치에서 4개의 뉴클레오타이드 염기의 무작위 혼합물로 "스파이크(spike)" 처리되어 있다. 이러한 무작위 돌연변이된 VH 및 VL 단편은 hTNFα에 대한 결합에 대해 재선별할 수 있고, hTNFα에 대해 높은 친화성과 낮은 해리속도를 나타내는 서열을 선택할 수 있다.
재조합 면역글로불린 디스플레이 라이브러리로부터 본 발명의 항-hTNFα 항체를 선별 및 분리한 후, 선택된 항체를 암호화하는 핵산을 디스플레이 패키지(예를 들면, 파지 게놈 유래)로부터 회수할 수 있고 표준 재조합 DNA 기술을 통해 다른 발현 벡터 내로 서브클로닝할 수 있다. 필요하다면, 핵산은 본 발명의 다른 항체 형태(예를 들면, 다른 불변 영역과 같은 다른 면역글로불린 도메인을 암호화하는 핵산과 결합된 형태)를 만들기 위해 추가로 조작될 수 있다. 조합 라이브러리의 선별로 분리된 재조합 사람 항체를 발현시키기 위해서는, 앞에서 상세히 설명한 바와 같이 항체를 암호화하는 DNA를 재조합 발현 벡터 내로 클로닝하여, 포유동물 숙주 세포 내로 도입시킨다.
hTNFα에 대한 높은 친화성과 낮은 해리상수를 보유하는 사람 항체를 분리하는 방법은 또한 본 발명에 각각 참고인용된 미국특허 제6,090,382호, 제6,258,562호 및 제6,509,015호에 기술되어 있다.
III. 항체 정제
본 발명은 항체와 하나 이상의 HCP를 포함하는 혼합물로부터 HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 항체와 하나 이상의 프로카텝신 L을 포함하는 혼합물로부터 프로카텝신 L 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법도 제공한다. 본 발명의 정제 방법은 상기 II 항목에서 설명된 방법 및 당업계에 통상적인 방법으로 항체가 생산되었을 때 분리 단계부터 시작한다. 통상적으로, 당업계에서는 항체-HCP 혼합물을 1차 정제 단계로서 단백질 A 캡처(예: 단백질 A 칼럼)으로 처리하는데, 그 이유는 상기 항체는 단백질 A에 결합하지만 HCP는 관류 배출되기 때문이다. 본 발명의 정제 방법은 1차 단계로서 또는 본 정제 방법 중에 임의의 단계로서, 항체와 하나 이상의 HCP를 포함하는 혼합물을 단백질 A 캡처(예: 단백질 A 칼럼)로 처리할 필요가 없다는 장점이 있다.
일단 항체를 포함하는 청징화된 용액 또는 혼합물이 수득되면, HCP와 같이 세포에 의해 생산된 다른 단백질로부터 항체의 분리는 이온 교환 분리단계(들) 및 소수성 상호작용 분리단계(들)를 포함하는 여러 정제 기술의 조합을 사용하여 수행한다. 이러한 분리 단계는 단백질 혼합물을 이들의 하전, 소수성 정도 및/또는 크기를 기초로 하여 분리한다. 본 발명의 한가지 양태에서, 분리는 양이온, 음이온 및 소수성 크로마토그래피를 포함하는 크로마토그래피를 사용하여 수행한다. 이러한 각 기술에는 여러 다른 크로마토그래피 수지를 사용할 수 있고, 따라서 수반된 특정 단백질에 맞는 정제 계획을 정확하게 세울 수 있다. 각 분리 방법의 본질은 단백질들을 긴 칼럼 아래로 상이한 속도 이동할 수 있게 하여 칼럼 아래로 흐를 때 증가하는 물리적 분리를 달성하거나, 또는 분리 매체에 선택적으로 부착시킨 다음 다른 용매로 차등 용출시키는 것이다. 몇몇 경우에, 불순물이 칼럼에 특이적으로 부착하고 항체가 존재하지 않을 때, 즉 항체가 관류물에 존재할 때에도 항체가 불순물로부터 분리된다.
바람직하지 않은 단백질로부터 항체를 정제하는 방법은 이하, 예를 들면 공정 A에 제시한다. 한가지 양태에서, 본 발명은 이하 공정 A에 기술된 단백질을 개별적으로 포함하거나 함께 포함한다. 공정 A는 항체를 포함하는 혼합물을 이온 교환 분리(양이온 교환 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피) 및 소수성 상호작용 분리를 통해 정제하여, 약제학적 조성물용으로 적합한 항체 제조물을 수득하는 방법을 제공한다. 공정 A는 항체 정제의 최초 단계로서 단백질 A 캡처를 수행할 필요 없이 진행될 수 있다는 장점이 있다. 한가지 양태에서, 공정 A를 사용하여 정제한 항체는 아달리무맙이다. 공정 A는 일반적으로 다음과 같은 단계를 포함한다:
항체와 불순물, 예를 들면 HCP(들)를 포함하는 혼합물을 양이온 교환칼럼과 같은 이온 교환칼럼 위에 로딩한다. 이 혼합물은 1 사이클당 약 30g 항체/L 이하의 로딩량으로 로딩될 수 있다. 양이온 칼럼 위에 로딩된 혼합물은 이어서 세척 완충액(평형 완충액)으로 세척한다. 이어서, 항체를 칼럼으로부터 용출시켜 1차 용출액을 수득한다.
1차 용출액은 그 다음 종종 바이러스 불활성화 처리하고, 음이온 교환 크로마토그래피를 위한 준비로 pH를 조정한다. 1차 용출액은 용출 완충액(IIIC 항목에서 더 상세히 설명됨)에 비해 pH가 낮도록 pH를 조정하여 바이러스 불활성화 처리한다. 이어서, 바이러스 불활성화된 용출액의 pH를 하나 이상의 단계를 통해, 후속되는 음이온 교환 칼럼의 pH인 약 7.6의 최종 pH로 조정한다.
바이러스 불활성화 후, 1차 용출액은 종종 2차 이온 교환 분리 단계로 처리되며, 이 때 1차 용출액은 음이온 교환 칼럼(예: Q 세파로스 칼럼) 위에 로딩한다. 이 칼럼을 세척 완충액으로 세척하여, 항체를 포함하는 1차 관류물을 수득한다.
이 관류물을 다시 소수성 상호작용 칼럼(페닐 세파로스) 위에 로딩하여 정제한다. 이 칼럼을 세척하고, 칼럼으로부터 항체를 용출시켜 2차 용출액을 수득한다.
이하에 설명되는 공정 B는 항체를 포함하는 혼합물로부터 숙주 세포 단백질(HCP) 감소된 항체 제조물을 생산하는 개선된 방법을 제공한다. HCP 또는 프로카텝신 L과 관련하여 언급할 때, "감소된"이란 용어는 공정 A의 비슷한 시점에서 HCP 또는 프로카텝신 L의 수준, 예를 들면 농도 또는 활성보다 향상된 것을 포함한다. 한가지 양태에서, 공정 B의 1차 용출액은 공정 A의 1차 용출액에 비해 감소된 HCP 또는 프로카텝신 L의 수준을 포함한다. 한가지 양태에서, 공정 B의 1차 관류물은 공정 A의 1차 관류물에 비해 감소된 HCP 또는 프로카텝신 L 수준을 포함한다. 한가지 양태에서, 공정 B의 2차 용출액은 공정 A의 2차 용출액에 비해 감소된 HCP 또는 프로카텝신 L의 수준을 포함한다. 다른 양태에서, 공정 B 유래의 항체 제조물은 공정 A 유래의 항체 제조물에 비해 감소된 HCP 또는 프로카텝신 L의 수준을 포함한다.
공정 B는 일반적으로 다음을 포함한다:
항체와 불순물, 예를 들면 HCP(들)를 포함하는 혼합물을 양이온 교환칼럼과 같은 이온 교환칼럼 위에 로딩한다. 이 혼합물은 pH 7에서 사이클당 약 35g/L 이하의 항체 로딩량, 또는 pH 5에서 사이클당 약 70g/L 이하의 항체 로딩량으로 로딩할 수 있다. 양이온 칼럼 위에 로딩된 혼합물은 이어서 세척 완충액(평형 완충액)으로 세척한다. 평형 세척 완충액 후, 중간 세척 단계를 수행하여, 용출 완충액과 전도도가 유사한 중간 완충액으로 칼럼을 세척한다. 이 중간 세척 단계는 공정 관련 불순물의 제거를 개선시킨다. 이어서, 항체를 용출 완충액을 사용하여 칼럼으로부터 용출시켜 1차 용출액을 수득한다.
이어서, 1차 용출액을 바이러스 불활성화 처리하고, 음이온 교환 크로마토그래피를 위한 준비로 pH를 조정한다. 1차 용출액은 용출 완충액에 비해 pH가 낮도록 pH를 조정하여 바이러스 불활성화 처리한다. 이어서, 바이러스 불활성화된 용출액의 pH 및 전도도를 하나의 단계에서, 후속되는 평형화된 음이온 교환 칼럼의 pH인 약 7.8-8.2의 최종 pH로 조정한다.
바이러스 불활성화 후, 1차 용출액은 2차 이온 교환 분리 단계로 처리하며, 이 때 1차 용출액은 음이온 교환 칼럼(예: Q 세파로스 칼럼) 위에 로딩한다. 이 칼럼을 세척 완충액으로 세척하여, 항체를 포함하는 1차 관류물을 수득한다.
이 관류물을 다시 소수성 상호작용 칼럼(페닐 세파로스) 위에 로딩하여 정제한다. 이 칼럼을 세척하고, 칼럼으로부터 항체를 용출시켜 2차 용출액을 수득한다. 공정 B의 결과는 프로카텝신 L을 포함하는 HCP가 감소된 제조물이다. 공정 B의 또 다른 결과에는 HCP 제거물을 당해 공정의 초반부로 이동시킴으로써 세포 배양물 증량으로 창출되는 더 높은 생산성과 같은 공정 병목(bottleneck)의 제거 및 항체 수율의 전반적인 개선이 포함된다. 본 발명의 개선된 방법에 관한 더 상세한 사항은 이하에 제시한다.
III.A. 이온 교환 분리
본 발명은 항체와 하나 이상의 HCP를 포함하는 혼합물로부터 HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법으로서, 상기 혼합물을 하나 이상의 이온 교환 분리 단계로 처리하여 항체를 포함하는 1차 용출액을 수득하는 단계를 포함한다. 이온 교환 분리는 2가지 물질을 각각의 이온 하전의 차이를 기초로 하여 분리하는 임의의 방법을 포함한다.
분리를 수행하는데 있어서, 항체 혼합물은 회분식 정제 기술이나 크로마토그래피 등을 사용하여 이온 교환 물질과 접촉시킬 수 있다. 예를 들어, 회분식 정제에서 이온 교환 물질은 바람직한 출발 완충액으로 평형화 시키거나 그 완충액 중에 제조한다. 이온 교환 물질의 슬러리를 수득한다. 이 슬러리와 상기 항체 용액을 접촉시켜, 분리될 항체를 이온 교환 물질에 흡착시킨다. 이온 교환 물질에 결합하지 않는 HCP(들)를 포함하는 용액은 슬러리를 침강시키고 상청액을 제거하는 등에 의해 슬러리로부터 분리시킨다. 이 슬러리는 하나 이상의 세척 단계로 처리할 수 있다. 경우에 따라, 슬러리를 전도도가 더 높은 용액과 접촉시켜, 이온 교환 물질에 결합된 HCP를 탈착시킨다. 결합된 폴리펩타이드를 용출시키기 위해, 염 농도를 증가시킬 수 있다.
또한, 이온 교환 분리 기술로서 이온 교환 크로마토그래피를 사용할 수 있다. 이온 교환 크로마토그래피는 분자의 총 하전 간의 차이를 바탕으로 하여 분자를 분리한다. 항체의 정제를 위해, 항체는 결합하기 위해 수지와 같은 이온 교환 물질에 부착된 관능그룹의 하전과 반대 하전을 띤 것이어야 한다. 예를 들어, 항체의 pH보다 낮은 완충액 pH에서 일반적으로 총 양하전을 띠는 항체는, 음하전을 띤 관능그룹을 포함하는 양이온 교환 물질에 잘 결합할 것이다.
이온 교환 크로마토그래피에서, 용질 표면 위의 하전을 띤 패치는 주위 완충액이 이온 농도가 낮다면, 크로마토그래피 매트릭스에 부착된 반대 하전에 의해 유인된다. 용출은 일반적으로 이온 교환 매트릭스의 하전 부위에 대해 용질과 경쟁하는 완충액의 이온 농도(즉, 전도도)를 증가시켜 달성한다. pH 변화 및 이에 따른 용질의 하전 변경은 용질을 용출시키는 다른 방법이다. 전도도 또는 pH의 변화는 점차적(구배 용출) 또는 단계적(단계 용출)일 수 있다.
음이온 또는 양이온 치환체는 크로마토그래피의 음이온 또는 양이온 지지체를 형성하기 위해 매트릭스에 부착될 수 있다. 음이온 교환 치환체에는 디에틸아미노에틸(DEAE), 4급 아미노에틸(QAE) 및 4급 아민(Q) 기가 있다. 양이온 치환체에는 카르복시메틸(CM), 설포에틸(SE), 설포프로필(SP), 포스페이트(P) 및 설포네이트(S)가 있다. DE23, DE32, DE52, CM-23, CM-32 및 CM-52와 같은 셀룰로스 이온 교환 수지는 판매원[Whatman Ltd. Maidstone, Kent, U.K]으로부터 구할 수 있다. SEPHADEX®계 및 가교된 이온 교환제도 알려져 있다. 예를 들어, DEAE-, QAE-, CM- 및 SP-SEPHADEX®　 및 DEAE-, Q-, CM- 및 S-SEPHAROSE®　 및 SEPHAROSE®　 Fast Flow는 모두 판매원[Pharmacia AB]으로부터 구할 수 있다. 또한, TOYOPEARL DEAE-650S 또는 M 및 TOYOPEARL CM-650S 또는 M과 같은 DEAE 및 CM 유도체화된 에틸렌 글리콜-메타크릴레이트 공중합체는 모두 판매원[Toso Haas Co., Philadelphia, PA]으로부터 구할 수 있다.
본 발명의 한가지 양태에서, 항체와 하나 이상의 HCP를 포함하는 혼합물을 양이온 교환(CEX) 크로마토그래피 칼럼 위에 로딩한다. 이 혼합물은 칼럼의 평형화에 사용된 평형 완충액과 동일할 수 있는 로딩 완충액 중에서 CEX 칼럼 위에 로딩된다. HCP 포함 혼합물을 CEX 칼럼 상으로 통과시키면, 표적 단백질은 CEX 수지에 흡착되고, 다양한 HCP (예를 들면, 재조합 숙주 세포에서 생산된 숙주 세포 단백질 또는 다른 방법 유래의 불순물)는 관류 배출되거나 또는 CEX 수지에 약하게 또는 비특이적으로 결합한다. 다양한 양태에서, CEX 수지는 설포네이트 그룹에 부착된 합성 메타크릴레이트계 중합체 수지(프락토겔 SO3(프락토겔 S))이다. 한가지 양태에서, 평형 완충액은 20mM Na2PO4, 25mM NaCl을 포함한다 (pH 6.8). 다른 적당한 평형 완충액은 생리적 농도, 예를 들면 약 0.5mM 내지 약 100mM 범위 (예: 10mM, 20mM, 50mM 등)의 농도의 BIS 및 HEPES, 및 생리적 염 농도 (예: 약 0.15mM NaCl)를 pH 5.0 내지 9.0 하에 포함한다.
대표적인 양태에서, CEX 크로마토그래피는 프락토겔 S 칼럼이다. 한가지 양태에서, 수지 1리터당 약 30g의 항체 내지 수지 1L당 약 40g의 항체가 프락토겔 S 칼럼 위에 로딩된다. 다른 양태에서, 수지 1L당 약 35g의 항체가 프락토겔 S 칼럼(pH 7) 위에 로딩된다. pH 7에서 수지 1L당 약 35g의 항체 로딩 양은 HCP(들) 및 프로카텝신 L과 같은 불순물의 제거를 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 방법에서 사용되는 프락토겔 S 칼럼의 허용되는 작업 범위를 아래의 표 1에 기술한다.
pH 7에서 프락토겔 S 크로마토그래피에 허용되는 작업 범위
작업 파라미터 AOR
수지 용량 ≤35g 단백질/L 수지
로딩 샘플 pH 6.5 내지 7.5
유효 로딩 희석율 1:1 내지 1:2
세척 2 용출 완충액 농축물 대 WFI 비 1:3 내지 1:4
선형 속도 75 내지 300cm/hr
또한, 칼럼의 로딩 용량은 pH 5에서 크로마토그래피를 수행할 때 증가될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 특히, pH 5에서 수지 1L당 항체 약 70g의 로딩 양이 HCP(들) 및 프로카텝신 L과 같은 불순물의 제거를 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 약 pH 5 내지 약 pH 7의 pH 범위에서는 수지 1L당 항체 약 35g 내지 약 70g의 로딩 양이 사용될 수 있다.
칼럼 위에 항체 혼합물의 로딩 이후, CEX 수지는 그 다음 세척 완충액으로 세척한다. 특히, 여러 세척 완충액을 사용한 다수의 세척 단계는 더욱 HCP 감소된 항체 제조물을 제공하는 것이 밝혀졌다. 구체적으로, 프로카텝신 L 수준은 세척 완충액 및 중간 세척 완충액을 각각 사용하는 1차 세척 단계 및 중간 세척 단계를 사용함으로써 감소될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 한가지 양태에서, CEX 수지는 먼저 평형 완충액과 동일한 세척 완충액으로 세척한다. 특정 양태에서, 세척 완충액은 20mM Na2PO4, 25mM NaCl (pH 6.8)이다. 다른 적당한 세척 완충액은, 예를 들면 생리적 농도의 BIS 및 HEPES, 예를 들면 약 0.5mM 내지 약 100mM의 농도 (예: 10mM, 20mM, 50mM 등) 및 생리적 염 농도 (예: 약 0.15mM NaCl)를 pH 5.0 내지 9.0 하에 포함한다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 중간 세척 단계가 수행된다. 일반적으로 HCP 및 특히 프로카텝신 L의 감소된 수준은 CEX 용출 완충액과 동일한 완충액을 일부 포함하는 중간 세척 완충액을 사용하여 달성할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 일반적으로 HCP, 특히 프로카텝신 L의 개선된 감소는 부분적으로 중간 세척 완충액의 전도도 증가로 인한 결과이다. 중간 세척 완충액의 전도도 증가는 pI가 항체에 비해 낮은 HCP(들)의 하전 치환을 유발하며, 이로 인해 더 약한 결합의 HCP(들)는 칼럼을 통해 세척되어진다. 더 약한 결합의 불순물인 프로카텝신 L을 포함하는 HCP(들)의 제거 증가는 결국 항체와 같은 표적 물질의 결합 면적을 넓히게 된다. 다른 양태에서, 중간 세척 완충액은 약 40% 내지 약 50% 용출 완충액과 약 50% 내지 약 60% 주사용수를 포함한다. 또 다른 양태에서, 중간 세척 완충액은 45% 용출 완충액과 55% 주사용수를 포함한다. 한가지 양태에서, 중간 세척에 사용된 세척 완충액은 20mM Na2PO4, 150mM 염화나트륨 (pH 7)이다.
다수의 세척 후, 항체를 1차 양이온 교환 물질로부터 용출시켜, HCP의 수준이 감소된 1차 용출액을 수득한다. 1차 용출액은 중간 세척 단계로 인해 감소된 프로카텝신 L의 수준도 나타낸다. 한가지 양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 1차 용출액은 공정 A의 유사한 단계에 비해 약 3 내지 약 5배 감소된 HCP 수준을 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 1차 용출액은 공정 A의 유사한 단계에 비해 약 2 내지 약 3배 감소된 카텝신 L 활성을 포함한다. 한가지 양태에서, 1차 용출액은 HCP ELISA로 측정했을 때, 혼합물보다 약 90 내지 약 100배 더 적은 범위의 HCP를 포함한다. 다른 양태에서, 1차 용출액은 카텝신 L 속도론적 검정으로 측정했을 때, 약 25 내지 약 60 RFU/s/항체mg 범위의 카텝신 L 활성을 포함한다.
바람직한 양태에서, 항체를 포함하는 1차 용출액을 2차 IE 물질 위로 통과시켜, 더욱 감소된 HCP 수준을 포함하는 관류물을 수득한다. 일부 양태에서, 2차 IE 단계는 이후 기술되는 회분식 정제일 수 있다. 다른 양태에서, 2차 IE 단계는 1차 용출액을 2차 이온 교환 크로마토그래피 칼럼 위에 로딩하는 단계, 상기 칼럼을 세척하는 단계 및 1차 관류물을 수득하는 단계를 포함한다. 2차 IE 물질은 음이온 교환(AEX) 수지, 예를 들면 Q 세파로스 칼럼일 수 있다. 일부 양태에서, 수지 1L당 약 30g의 항체 내지 수지 1L당 약 40g의 항체를 음이온 교환칼럼에 로딩한다. 수지 1L당 약 40g의 항체 내지 수지 1L당 약 50g의 항체로 로딩 양을 증가시키면, HCP(들) 등의 불순물 제거율이 감소할 수 있다. HCP 포함 혼합물을 AEX 칼럼 위로 통과시키면, 다양한 HCP(들)가 AEX 수지에 결합하고, 항체는 관류 배출되거나 AEX 수지에 비특이적으로 결합한다. 특정 양태에서, 음이온 교환 수지는 Q 세파로스이다.
종종, 정제될 항체 혼합물이 이전 정제 단계 유래의 완충액에 존재할 것이다. 많은 완충액이 사용가능하며, 통상적인 실험을 통해 선택할 수 있다. 예를 들어, 25mM 트롤아민, 40mM NaCl의 평형 완충액(pH 8)을 사용할 수 있다. 한가지 양태에서, 1차 용출액을 2차 IE 물질 위로 통과시키기 전에, 2차 IE 물질을 평형 완충액으로 평형화시킬 수 있다. 이것은, 예를 들어 1차 용출액의 pH와 전도도가 평형화된 2차 IE 물질의 pH 및 전도도와 상당히 유사하거나 상응하도록 1차 용출액의 pH 및 전도도를 변화시켜, 즉 평형화된 2차 이온 교환 물질의 pH 및 전도도에 상응하도록 1차 용출액의 pH 및 전도도를 변화시켜 수행할 수 있다. 일부 양태에서, AEX 물질(예: Q 세파로스)의 pH는 평형 완충액으로 약 7.8 내지 약 8.3의 범위로 조정된다. 또 다른 양태에서, CEX 용출액(예를 들면, 1차 용출액)의 pH는 약 7.7 내지 약 8.3의 범위로 조정된다. 특정 양태에서, AEX 물질과 1차 용출액 모두의 pH는 약 8이다. 일부 양태에서, AEX 물질의 전도도는 약 3.5 mS/cm 내지 약 4.9 mS/cm의 범위이다. 또 다른 양태에서, 1차 용출액의 전도도는 약 3.5 mS/cm 내지 약 4.9 mS/cm의 범위이다. 2차 이온 교환 물질의 pH 및 전도도로의 로딩 전도도 및 pH의 조정은 불순물 제거율을 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 공정 A와 관련하여, 1차 용출액 및/또는 평형화된 2차 이온 교환 물질의 전체적인 전도도 감소 및/또는 pH 증가는 HCP(들) 제거율을 증가시키는 것으로 밝혀졌다.
항체 혼합물을 칼럼 위에 로딩한 후, AEX 수지를 그 다음 세척 완충액으로 세척한다. 세척 완충액은 평형 완충액과 동일한 것일 수 있으며, 예를 들면 25mM 트롤아민, 40mM NaCl (pH 8)이다. 한가지 양태에서, 세척물을 관류물과 풀링(pooling)하여, 항체를 포함하고 HCP의 감소된 수준을 보유하는 1차 관류물을 수한된다. 다른 양태에서, 1차 관류물은 프로카텝신 L의 감소된 수준을 보유한다. 한가지 양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 1차 관류물은 공정 A의 비슷한 단계에 비해 HCP가 약 7배 내지 약 700배 감소된 수준을 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 1차 관류물은 공정 A의 비슷한 단계에 비해 약 6배 내지 약 25배 감소된 카텝신 L 활성을 포함한다. 다른 양태에서, 1차 관류물은 HCP ELISA로 측정했을 때, 1차 용출액보다 약 840배 내지 약 850배 더 적은 범위의 HCP를 포함한다. 또 다른 양태에서, 1차 관류물은 카텝신 L 속도론적 검정으로 측정했을 때, 항체 1mg당 약 0.4 내지 약 4 RFU/s 범위의 카텝신 L 활성을 포함한다.
본 발명의 방법에서 사용될 Q 세파로스 크로마토그래피에 허용되는 작업 범위를 아래의 표 2에 기술한다:
Q 세파로스 FF 크로마토그래피에 허용되는 작업 범위
파라미터 AOR
로딩 전도도 4.0 내지 5.5 mS/cm
로딩 pH 7.8 내지 8.2
칼럼 로딩 ≤40g/L
선형 속도 150 내지 300cm/hr
양이온 교환 물질 대 음이온 교환 물질의 사용은 앞에서 논한 바와 같은 단백질의 총 하전을 바탕으로 한다. 따라서, 양이온 교환 물질의 사용 전에 음이온 교환 물질을 사용하는 것은 본 발명의 범위 내에 있다. 또한, 양이온 교환 물질 또는 음이온 교환 물질을 단독으로 사용하는 것도 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명의 방법은 경우에 따라 추가 정제 단계를 포함할 수 있다. 이온 교환 크로마토그래피 방법 전에, 또는 그 방법 동안에, 또는 그 방법 후에 수행될 수 있는 추가 정제 과정의 예에는 소수성 상호작용 크로마토그래피 상에서의 (예: 페닐 세파로스 상에서의) 분별, 에탄올 침전, 등전 초점, SES-PAGE, 황산암모늄 침전, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피 (예: 캡처 시약으로서 단백질 A, 단백질 G, 항체, 특이적인 기질, 리간드 또는 항원 사용)가 포함된다.
III.B. 소수성 상호작용 분리
또한, 본 발명은 1차 관류물을 1차 소수성 상호작용 물질로 처리하여 HCP 수준이 감소된 2차 용출액을 수득하는 소수성 상호작용 분리 단계를 추가로 포함하는, 항체와 하나 이상의 HCP를 포함하는 혼합물로부터 HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법을 특징으로 한다.
분리를 수행하는 데 있어서, 폴리펩타이드 혼합물은 회분식 정제 기술을 사용하거나 또는 칼럼을 사용하여 HIC 물질과 접촉시킬 수 있다. HIC 정제 전에 상기 혼합물을 예비칼럼을 통해 통과시키는 등에 의해 임의의 카오트로픽제(chaotropic agent) 또는 극소수성 물질을 제거하는 것이 바람직할 수 있다.
예를 들어, 회분석 정제에서 HIC 물질은 바람직한 평형 완충액 내에 제조되거나 그 평형 완충액으로 평형화된다. HIC 물질의 슬러리가 수득된다. 이 슬러리를 항체 용액과 접촉시켜, 분리될 항체를 HIC 물질에 흡착시킨다. HIC 물질에 결합하지 않는 HCP를 포함하는 용액은, 예를 들면 슬러리를 침강시킨 후 상청액을 제거하여, 슬러리로부터 분리한다. 이 슬러리는 1회 이상의 세척 단계로 처리될 수 있다. 경우에 따라, 슬러리는 HIC 물질에 결합된 항체를 탈착시키기 위해 전도도가 더 낮은 용액과 접촉시킬 수 있다. 결합된 항체를 용출하기 위해 염 농도를 저하시킬 수 있다.
다른 양태에서, 소수성 상호작용 분리 단계는 1차 소수성 상호작용 물질을 포함하는 칼럼에 1차 관류물을 로딩하는 단계 및 1차 소수성 상호작용 물질을 세척하여 2차 용출액을 수득하는 단계를 포함한다.
소수성 상호작용 분리 단계는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계를 포함할 수 있다. 이온 교환 크로마토그래피는 항체와 같은 단백질을 분리하기 위해 이 단백질의 하전에 의존적인 반면, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 항체와 같은 일부 단백질의 소수성 성질을 사용한다. 항체 상의 소수성 그룹은 칼럼 상의 친수성 그룹에 결합한다. 따라서, 소수성이 더 큰 단백질일수록, 칼럼에 더 강하게 결합할 것이다. HIC 단계는 예를 들어 숙주 세포 유래의 불순물 (예: DNA 및 다른 고분자량 및 저분자량 산물 관련 종)을 제거한다.
소수성 상호작용은 높은 이온 농도에서 가장 강하며, 따라서 이러한 분리 형태는 염 침전 또는 이온 교환 절차 후 수행되는 것이 적당하다. HIC 칼럼에 항체의 흡착은 높은 염 농도가 유리한 영향을 미치지만, 실제 농도는 항체의 본질 및 선택된 특정 HIC 리간드에 따라 다양하게 변화될 수 있다. 다양한 이온들은 이들이 소수성 상호작용을 촉진하거나(염석 효과) 또는 물의 구조를 붕괴시켜(카오트로픽 효과) 소수성 상호작용의 약화를 유도하는지의 여부에 따라 소위 솔루포빅(soluphobic) 순서대로 배열될 수 있다. 염석 효과를 증가시키는 점에서 양이온은 다음과 같이 정렬될 수 있고: Ba++<; Ca++<; Mg++<; Li+<; Cs+<; Na+<; K+<; Rb+<; NH4 +, 음이온은 카오트로픽 효과를 증가시키는 점에서 다음과 같이 정렬될 수 있다: PO-<; SO4 -<; CHCOOO-<; Cl-<; Br-<; NO3 -<; ClO4 -<; I-<; SCN-.
일반적으로, Na, K 또는 NH4 황산염들은 HIC에서 리간드-단백질 상호작용을 효과적으로 촉진한다. 상호작용의 강도에 영향을 미치는, 다음과 같은 관계의 염이 제조될 수 있다: (NH4)2SO4>; Na2SO4>; NaCl>; NH4Cl>; NaBr>; NaSCN. 일반적으로, 약 0.75 내지 약 2M 황산암모늄 또는 약 1 내지 4M NaCl의 염 농도가 유용하다.
HIC 칼럼은 일반적으로 소수성 리간드 (예: 알킬 또는 아릴 그룹)가 연결되는 기본 매트릭스 (예: 가교된 아가로스 또는 합성 공중합체 물질)를 포함한다. 바람직한 HIC 칼럼은 페닐 그룹으로 치환된 아가로스 수지 (예: Phenyl Sepharose™ 칼럼)를 포함한다. 많은 HIC 칼럼은 시판된다. 그 예에는, 치환도가 낮거나 높은 Phenyl Sepharose™ 6 Fast Flow 칼럼[판매원: Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Sweden]; Phenyl Sepharose™ High Performance 칼럼[판매원: Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Sweden]; Octyl Sepharose™ High Performance 칼럼[판매원: Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Sweden]; Fractogel™ EMD Propyl 또는 Fractogel™ EMD Phenyl 칼럼[판매원: E. Merck, Germany]; Macro-Prep™ Mehyl 또는 Macro-Prep™ t-Butyl Supports[판매원: Bio-Rad, California]; WP HI-Propyl(C.sub.3)™ 칼럼[판매원: J. T. Baker, New Jersey]; 및 Toyopearl™ 에테르, 페닐 또는 부틸 칼럼[판매원: TosoHaas, PA]이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후, 당해의 항체와 HCP(들)를 포함하는 혼합물은 HIC로 처리할 수 있다. 종종, 정제될 항체 조성물은 이전 정제 단계 유래의 완충액에 존재할 것이다. 하지만, HIC 단계 전의 항체 조성물에는 완충액을 첨가하는 것이 필수적일 수 있다. 많은 완충액이 사용될 수 있고, 통상적인 실험으로 선택할 수 있다. 한가지 양태에서, 정제될 항체와 하나 이상의 HCP를 로딩 완충액 중에 포함하는 혼합물의 pH는 초기 pH에 따라 산이나 염기를 사용하여 약 7의 pH와 약 136 내지 약 158 mS/cm의 전도도로 조정한다. 한가지 양태에서, 항체 혼합물은 40mM 인산나트륨, 2.2M (NH4)2SO4 (pH 7)을 포함하는 완충액으로 희석한다.
항체 혼합물을 로딩하기 전에, 칼럼을 평형 완충액으로 평형화시킬 수 있다. 일부 양태에서, 평형 완충액은 20mM 인산나트륨, 1.1M (NH4)2SO4 (pH 7)이다.
한가지 양태에서, 혼합물, 예를 들면 항체를 포함하는 1차 관류물은 페닐 세파로스 HIC 칼럼 위에 로딩한다. 특정 양태에서, 이 단백질에서 로딩되는 단백질 양은 수지 1L당 단백질 약 20 내지 약 40g의 범위이다. 다른 양태에서, 이 단계의 단백질 로딩 양은 수지 1L당 약 35g이다. 일부 양태에서, 유용한 물질의 전체 양을 처리하기 위해 2 내지 3회의 크로마토그래피 사이클을 필요로 할 수도 있다.
단백질을 소수성 상호작용 칼럼에 결합시킨 후, 칼럼은 평형 완충액, 예를 들면 1.1M (NH4)2SO4 (pH 7)과 동일할 수 있는 세척 완충액으로 세척할 수 있다.
항체는 용출 완충액을 사용하여 칼럼으로부터 용출시켜 2차 용출액을 수득한다. 이 용출 완충액은 통상적인 실험으로 선택할 수 있다. 용출 완충액의 pH는 약 6 내지 약 8의 범위이고, 저농도의 황산암모늄을 보유한다 (즉, 약 1M 미만의 (NH4)2SO4). 용출 완충액의 전도도는 약 87 내지 약 101 mS/cm의 범위이다. 한가지 양태에서, 용출 완충액은 11mM 인산나트륨, 0.625M (NH4)2SO4 (pH 7)을 포함한다. 염 농도가 낮을수록 수지에 대한 더 적은 아달리무맙 결합이 관찰되었다. 항체는 HCP 수준이 감소된 2차 용출액이 수득되도록 2차 이온 교환 물질로부터 용출된다. 2차 용출액은 또한 감소된 프로카텝신 L의 수준을 보유한다. 한가지 양태에서, 본 발명의 방법에 의해 수득된 2차 용출액은 공정 A의 비슷한 단계에 비해 약 10배 내지 약 96배 감소된 HCP 수준을 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명의 방법에 의해 수득된 2차 용출액은 공정 A의 비슷한 단계에 비해 약 5 내지 약 15배 감소된 카텝신 L 활성을 포함한다. 한가지 양태에서, 2차 용출액은 HCL ELISA로 측정했을 때, 1차 관류뮬보다 약 3 내지 약 5배 더 적은 범위의 HCP를 포함한다. 다른 양태에서, 2차 용출액은 카텝신 L 속도론적 검정으로 측정했을 때 항체 1mg당 약 0.5 내지 약 1.5 RFU/s 범위의 카텝신 L 활성을 포함한다.
본 발명의 방법에서 사용된 페닐 세파로스 크로마토그래피 칼럼에 허용되는 작업 범위를 아래의 표 3에 제시한다.
페닐 세파로스 HP 크로마토그래피에 허용되는 작업 범위
파라미터 AOR
칼럼 로딩 20 내지 40 g/L
로딩 샘플 희석율 0.9:1 내지 1.1:1
선형 속도 25 내지 125cm/hr
추가 정제 단계는 본 명세서에 설명된 바와 같은 나노여과, 한외여과 및/또는 투석여과 단계뿐만 아니라 바이러스 제거 단계를 포함할 수 있다.
III.C. 바이러스 불활성화
안전성의 여지를 마련하기 위해, 검출되지 않은 잠재적 바이러스는 정제 방법 동안 불활성화 처리한다. 바이러스 불활성화 방법은 당업계에 공지되어 있고, 그 예에는 열 불활성화(저온살균), pH 불활성화, 용매/세정제 처리, UV 및 감마선 조사 및 미국특허 제4,534,972호 등에서와 같은 카파 페난트롤린 또는 β-프로피오락톤과 같은 특정 화학 불활성화제의 첨가가 있다. 일부 양태에서, 혼합물의 바이러스 불활성화 처리는 pH 바이러스 불활성화를 포함할 수 있다. pH 바이러스 불활성화 기술의 방법은 역시 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 바이러스 불활성화의 통상적인 방법은 낮은 pH에서 일정 시간 동안 혼합물을 항온처리하고, 이어서 pH를 중화시킨 뒤, 미립물을 여과 제거하는 것을 포함한다. pH 수준의 선택은 주로 항체 산물의 안정성 프로파일 및 완충액 성분에 따라 달라진다. 낮은 pH 바이러스 불활성화 동안 표적 항체의 품질에는 pH 및 낮은 pH 항온처리 기간이 영향을 미친다. 바이러스 불활성화는 이러한 파라미터뿐 아니라 단백질 농도에 따라서 좌우되며, 고농도는 불활성화를 감소시킬 수 있다. 따라서, 단백질 농도, pH 및 불활성화 기간의 적당한 파라미터는 통상적인 실험을 통해 선택할 수 있다.
혼합물의 pH는 시트르산, 아세트산, 카프릴산 또는 다른 적당한 산을 포함하는 비제한적인, 임의의 적당한 산에 의해 저하될 수 있다. 바람직한 양태에서, 혼합물의 pH는 1M 시트르산으로 조정된다.
일부 양태에서, 혼합물은 약 2.9 내지 약 3.9의 pH에서 약 15분 내지 약 180분 동안 항온처리한다. 다른 양태에서, 혼합물은 약 pH3/5에서 약 60분 내지 약 120분 동안 항온처리한다. 또 다른 양태에서, 혼합물은 약 pH 3.5에서 약 60분 내지 약 180분 동안 항온처리한다.
한가지 양태에서, 항체와 HCP를 포함하는 혼합물은 IE 분리전에 바이러스 불활성화 처리된다. 다른 양태에서는, 1차 용출액이 IE 분리 전에 바이러스 불활성화 처리된다. 특정 양태에서, 1차 용출액은 음이온 교환 크로마토그래피 전에 바이러스 불활성화 처리된다.
바이러스 불활성화 후, 혼합물은 추가 정제 단계를 위해 필요에 따라 조정한다. 예를 들어, pH 조정된 풀(pool)을 여과 처리할 수 있다. 한가지 양태에서, 낮은 pH 바이러스 불활성화 및/또는 여과 후, 혼합물의 pH는 더욱 중성인 pH, 예를 들면 약 6.5 내지 약 8.5로 조정된다. 예를 들어, 혼합물은 바람직한 pH를 수득하기 위해 주사용수(WFI)로 플러싱(flushing)될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용된 낮은 pH 바이러스 불활성화 파라미터를 아래의 표 4에 제시한다.
낮은 pH 바이러스 불활성화에 허용되는 작업 파라미터
작업 파라미터 AOR
항온처리 pH 3.0 내지 3.7
항온처리 시간 60 내지 180분
단백질 농도 ≤33g/L
본 발명은 이온 교환칼럼 유래의 1차 용출액이 2차 이온 교환 크로마토그래피 단계 전에 바이러스 불활성화 처리되는 방법을 포함한다. 한가지 양태에서, 바이러스 불활성화는 pH 바이러스 불활성화를 통해 수행된다.
IV. 숙주 세포 단백질(HCP) 수준을 측정하는 방법
본 발명은 정제된 항체 조성물에서 숙주 세포 단백질(HCP) 농도의 잔류 수준을 측정하는 방법을 제공한다. 상기한 바와 같이, HCP는 최종 표적 물질 산물, 예를 들면 항체로부터 제거되는 것이 바람직하다. HCP의 예에는 항체 생산의 급원에서 유래하는 단백질이 있다. 표적 항체로부터 HCP를 확인하여 충분히 제거하지 못하면, 효능 감소 및/또는 환자에게 부작용을 유도할 수 있다.
본 명세서에 사용된, "HCP ELISA"란 용어는 분석에 사용된 2차 항체가 아달리무맙과 같은 항체 생산에 사용된 CHO 세포와 같은 세포로부터 생산된 HCP에 특이적인 ELISA를 의미한다. 2차 항체는 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 따라 생산할 수 있다. 예를 들어, 2차 항체는 허위 생산 및 정제 실험을 통해 수득된 HCP를 사용하여 생산할 수 있으며, 즉 당해 항체를 생산하기 위해 사용된 동일한 세포주를 사용하지만, 이 세포주는 항체 DNA로 형질감염시키지 않는다. 예시적 양태에서, 2차 항체는 표적 항체의 생산에 사용된 세포 발현 시스템와 같은 최적의 세포 발현 시스템에서 발현된 HPC와 유사한 HPC를 사용하여 생산한다.
일반적으로, HCP ELISA는 HCP를 포함하는 액체 샘플을 2층의 항체, 즉 1차 항체와 2차 항체 사이에 적층시키는 것을 포함한다. 이러한 샘플을 항온처리하고, 그 동안 샘플 중의 HCP는 1차 항체, 예를 들면 염소 항CHO 친화성 정제물(Cygnus)에 의해 포획된다. 항체를 생산하는데 사용한 세포로부터 생산된 HCP에 특이적인 표지된 2차 항체, 예를 들면 항CHO HCP 비오틴화물을 첨가하여, 샘플 내의 HCP에 결합시킨다. 샘플에 함유된 HCP의 양은 2차 항체의 표지에 근거하여 적당한 검사로 측정한다.
HCP ELISA는 상기 III 항목에서 기술된 방법에 의해 수득된 용출액 또는 관류물과 같은 항체 조성물에 존재하는 HCP의 수준을 측정하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 항체를 포함하는 조성물로서, HCP 효소 결합된 면역흡착 분석("ELISA")로 측정했을 때 검출가능한 수준의 HCP가 없는 조성물을 제공한다. 한가지 양태에서, 2차 용출액은 약 1.0 내지 약 0.0ng/mg의 HCP를 포함한다.
V. 프로카텝신 L 수준을 측정하는 방법
본 발명은 샘플에 존재하는 프로카텝신 L의 양을 측정하는 속도론적 검정(또는 카텝신 L 속도론적 검정)을 제공한다. 프로카텝신 L은 특정 발현 시스템에서 유래된 숙주 세포 단백질이며, 카텝신 L의 활성화 시 아달리무맙과 같은 항체를 포함하는 단백질의 단편화를 일으키는 것으로 알려져 있다. 연구를 통해 불활성 자이모겐(zymogen)으로서 프로카텝신 L이 합성되고 이후 가공을 통해 활성 카텝신 L 형태가 생산된다는 것이 입증되었다. 프로카텝신 L의 활성화는 카텝신 D와 같은 다른 프로테아제 또는 리소좀의 산성 조건 내에서의 자가촉매적 활성화를 통한 N 말단 프로펩타이드 영역의 단백분해 제거로 일어난다[참조: Turk et al. (1999) Eur J Biochem 259: 929]. 또한, 문헌[참조: Mason et al.(1992) Biochem. Biophysical Res Comm 189: 1659]에는 카텝신 L의 활성화가 낮은 pH 조건에서 황산덱스트란과 같은 음하전 분자의 첨가에 의해 pH 5.5에서 더 많이 달성될 수 있음을 보고되어 있다.
프로카텝신 L(또는 활성 형태인 카텝신 L)의 수준을 검출하는 종래 방법은 약 음이온 교환 크로마토그래피와 같은 분석 방법을 포함한다. 하지만, 이러한 방법은 방법 중의 샘플, 즉 상기 III 항목에서 설명한 방법에서 수득된 샘플을 검사할 때, 완충액 시스템 방해 및 매트릭스 효과로 인해 제한된다. 따라서, 본 발명은 방법의 모니터링 등을 목적으로, 프로카텝신 L을 더욱 잘 모니터하기 위한 고처리량 형광 효소적 방법을 제공한다.
본 발명의 속도론적 검정은 표준 종말점 분석법으로 쉽게 검출할 수 있는 수준의 프로카텝신 L을 측정하는 방법을 제공한다. 또한, 속도론적 검정은 프로카텝신 L의 수준이 재현가능하게 낮은지를 측정하는 방법을 제공한다. 한가지 양태에서, 샘플은 프로카텝신 L의 수준이 전체 방법에서 감소되고 있는지를 확인하거나 측정하기 위해, III 항목에서 기술된 방법 중의 임의의 시점에서 수득할 수 있다. 프로카텝신 L은 이 단백질로부터 아미노 말단을 제거함으로써 활성화된다. 한가지 양태에서, 활성화는 카텝신 D와 같은 비제한적인 펩티다제에 의해 이루어진다. 활성화되면, 카텝신 L은 기질을 선택적으로 가수분해할 수 있다. 기질을 샘플과 접촉시키고, 기질에 대한 변화를 기초로 하여 카텝신 L 활성을 모니터할 수 있다.
바람직한 양태에서, 카텝신 L의 기질은 표지를 포함한다. 표지는 카텝신 활성이 측정될 수 있게 하는 임의의 제제를 포함할 수 있다. 카텝신 L이 선택적으로 가수분해할 수 있는 표지화된 기질의 예에는 Z-류신-아르기닌-AMC[판매원: R&D Systems]와 같은 합성 기질이 있다. 펩타이드 기질은 AMC의 아미노 기와 아르기닌의 카르복시 기 사이에 아미드 결합에 의해 반응정지되는 형광성 7-아미노-4-메틸 쿠마린(AMC)을 포함할 수 있다. 이 아미드 결합이 카텝신 L에 의해 절단되면, 방출된 AMC 기는 형광성이어서, 각각 380nm와 460nm의 여기 및 방출 파장으로 측정할 수 있다. 이러한 여기는 측정하여 카텝신 L 활성의 수준을 측정하는데 사용될 수 있다. 기질 전환 속도는 샘플에 존재하는 카텝신 L의 양과 정비례한다. 이러한 측정은 공지된 카텝신 L 활성과 공지 양의 카텝신 L을 보유하는 참조 샘플와 함께 사용된다. 이어서, 샘플 중의 카텝신 L 활성은 샘플에 존재하는 항체의 양과 상관짓는다. 한가지 양태에서, 1차 용출액은 약 25 내지 약 60 RFU/s/mg항체 범위의 카텝신 L 활성을 포함한다. 다른 양태에서, 1차 관류물은 약 0.4 내지 약 4 RFU/s/mg 항체 범위의 카텝신 L 활성을 포함한다. 한가지 양태에서, 2차 용출액은 약 0.5 내지 약 1.5 RFU/s/mg 항체 범위의 카텝신 L 활성을 포함한다.
한가지 양태에서, 속도론적 검정은 카텝신 L 샘플이 수득되도록 프로카텝신 L을 활성 카텝신 L 형태로 처리하는 효소와 포유동물 세포 발현 시스템 유래의 물질을 접촉시켜, 이 물질에 존재하는 프로카텝신 L의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 활성화되는 즉시, 카텝신 L은 Z-류신-아르기닌-AMC와 같은 합성 기질을 포함하는 기질을 선택적으로 가수분해할 수 있다. 기질은 그 다음 AMC의 아미노 기와 아르기닌의 카르복시 기 사이에 아미드 결합에 의해 반응정지되는 형광성 7-아미노-4-메틸 쿠마린(AMC) 기를 포함하는, Z-류신-아르기닌-AMC 등을 포함하는 샘플에 첨가된다. 이 아미드 결합이 카텝신 L에 의해 절단되면, 방출된 AMC 기는 형광성이어서, 각각 380nm와 460nm의 여기 및 방출 파장으로 측정할 수 있다. 측정된 카텝신 L 활성은 중국 햄스터 난소(CHO) 세포와 같은 포유동물 세포 발현 시스템 유래의 물질에 존재하는 프로카텝신 L 양의 지표로서 사용된다.
한가지 양태에서, 1차 용출액은 약 25 내지 약 60 RFU/s/mg 항체 범위의 카텝신 L활성을 포함한다. 다른 양태에서, 1차 관류물은 약 0.4 내지 약 4 RFU/s/mg 항체 범위의 카텝신 L 활성을 포함한다. 한가지 양태에서, 2차 용출액은 약 0.5 내지 약 1.5 RFU/s/mg 항체 범위의 카텝신 L 활성을 포함한다.
또한, 본 발명은 앞에서 언급한 양의 중간 범위도 본 발명의 일부로 간주되어야 한다는 것을 포함한다. 예를 들어, 앞에서 언급한 임의의 값을 상한 및/또는 하한으로 조합한 범위 값도 포함될 뿐만 아니라, 상기한 범위 사이의 임의의 수도 포함되어야 한다.
본 발명은 상기한 임의의 변형을 단독으로 또는 서로 조합하여 포함한다.
VI . 약제학적 조성물
본 발명의 방법을 사용하여 수득한 항체는 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 통상적으로, 약제학적 조성물은 항체 또는 이의 항원 결합 부분, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 명세서에 사용된 "약제학적으로 허용되는 담체"는 생리적으로 상용성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균, 항진균제, 등장제, 흡수지연제 등을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예에는 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 중 하나 이상뿐만 아니라 이의 혼합물도 있다. 많은 경우에 당, 만니톨, 소르비톨과 같은 폴리알콜 또는 염화나트륨과 같은 등장제를 조성물에 포함하는 것이 바람직하다. 약제학적으로 허용되는 담체는 추가로 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 저장수명 또는 효과를 증강시키는 습윤화제 또는 유화제, 보존제 또는 완충액과 같은 보조 물질을 소량으로 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 정제된 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 약제학적 조성물은 다양한 형태로 사용될 수 있다. 그 예에는 액체, 반고체 및 고체 투약 형태, 예를 들면 액체 용액제 (예: 주사성 및 주입성 용액제), 분산액제 또는 현탁액제, 정제, 환제, 산제, 리포좀제 및 좌제가 포함된다. 바람직한 형태는 의도한 투여 방식 및 치료 용도에 따라 달라진다. 통상적인 바람직한 조성물은 주사성 또는 주입성 용액 형태, 예를 들면 다른 항체 또는 다른 TNFα 억제제를 사용하여 사람의 수동 면역화에 사용했던 것과 유사한 조성물이다. 바람직한 투여 방식은 비경구(예: 정맥내, 피하, 복강내, 근육내) 투여이다. 바람직한 양태에서, 항체는 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 다른 바람직한 양태에서, 항체는 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여된다.
치료 조성물은 일반적으로 멸균성이고 제조 및 보관 조건 하에서 안정해야 한다. 이 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀 또는 고농도의 약물에 적합한 다른 규칙 구조로 조제될 수 있다. 멸균 주사성 용액은 필요한 양의 활성 화합물(즉, 항체 또는 이의 항원 결합 부분)을, 필요한 경우 앞에서 열거한 성분 중 하나 또는 그 배합물과 함께 적당한 용매에 혼입시킨 다음, 여과 멸균하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 위에서 열거한 성분과 다른 필요 성분을 기본적인 분산 매질과 함께 포함하는 멸균 매개제에 활성 화합물을 혼입시켜 제조한다. 멸균 주사성 용액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 이전 멸균 여과된 용액으로부터 활성성분과 임의의 다른 바람직한 성분의 분말을 생산하는 진공 건조 및 동결 건조이다. 용액의 적당한 유동성은 레시틴과 같은 코팅제의 사용, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용 등을 통해 유지할 수 있다. 주사성 조성물의 지속적 흡수는 모노스테아레이트 염 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 제제를 조성물에 첨가하여 야기할 수 있다.
또한, 보조 활성 화합물을 조성물에 혼입할 수도 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 하나 이상의 추가 치료제와 함께 공동조제되고/되거나 공동투여할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항-hTNFα 항체 또는 항체 부분은 하나 이상의 DMARD 또는 하나 이상의 NSAID 또는 다른 표적에 결합하는 하나 이상의 추가 항체 (예: 다른 사이토카인에 결합하거나 세포 표면 분자에 결합하는 항체), 하나 이상의 사이토카인, 용해성 TNFα 수용체[참조: PCT 공개번호 제WO 94/06476호] 및/또는 hTNFα 생산 또는 활성을 억제하는 하나 이상의 화학 제제 (예: PCT 공개번호 제WO 93/19751에 기술된 바와 같은 사이클로헥산-일리덴 유도체) 또는 이의 임의의 배합물과 함께 공동조제 및/또는 공동투여할 수 있다. 또한, 본 발명의 하나 이상의 항체는 앞의 하나 이상의 치료제와 함께 사용될 수 있다. 이러한 병용 치료는 투여된 치료제의 낮은 투약량을 유리하게 사용할 수 있게 하여, 다양한 단독요법과 관련하여 환자에서 나타나는 부작용, 합병증 또는 낮은 반응 수준의 가능성을 피할 수 있다.
한가지 양태에서, 본 발명은 TNFα 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 TNFα 항체의 유효량이 TNFα 관련 장애, 예를 들면 크론병의 치료에 효과적일 수 있는 약제학적 조성물을 포함한다. 한가지 양태에서, 상기 항체 또는 항체 부분은 본 발명에 참고인용된 PCT/IB03/04502 및 미국출원 제10/222140호에 기술된 약학 제형에 혼입된다. 이러한 제형은 50mg/ml 농도의 항체 아달리무맙을 포함하며, 사전충전된 주사기 하나에는 피하 주사용 항체 40mg을 함유한다.
본 발명의 방법을 사용하여 수득한 항체 또는 항체 부분은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 투여할 수 있지만, 많은 치료 용도들에서 바람직한 투여 경로/방식은 피하 주사이다. 다른 양태에서, 투여는 정맥내 주사 또는 주입이다. 당업자라면 잘 알고 있듯이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 특정 양태에서, 활성 화합물은 신속 방출이 이루어지지 않게 하는 담체로 제조될 수 있고, 그 예에는 임플란트, 경피 패치 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 조절방출 제형이 있다. 생체분해성, 생체융화성 중합체인 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산 등이 사용될 수 있다. 이러한 제형을 제조하는 많은 방법은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있거나 특허되어 있다[참조: Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978].
본 발명의 방법을 사용하여 수득한 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 또한 단백질 결정의 배합물이 중합체 담체 내에 캡슐화되어 형성된 코팅된 입자를 포함하는 단백질 결정 제형의 형태로 투여될 수도 있다. 이러한 단백질 결정 제형의 코팅된 입자는 형태가 구상이고 직경이 500마이크로미터 이하인 미소구(microsphere)이거나, 또는 약간 다른 형태의 마이크로입자일 수 있다. 단백질 결정의 증가된 농도는 본 발명의 항체가 피하 전달될 수 있게 한다. 한가지 양태에서, 본 발명의 항체는 단백질 전달 시스템을 통해 전달되며, 하나 이상의 단백질 결정 제형 또는 조성물은 TNFα 관련 장애를 가진 피험체에게 투여된다. 전체 항체 결정 또는 항체 단편 결정의 안정된 제형을 제조하는 방법 및 조성물은 또한 본 발명에 참고인용된 WO 02/072636에 기술되어 있다. 한가지 양태에서, 본 발명에 참고인용된 PCT/IB03/04502 및 미국출원 제10/222140호에 기술된 결정화된 항체 단편을 포함하는 제형은 본 발명의 다회 가변 용량 방법을 사용하여 TNFα 관련 장애를 치료하는데 사용된다.
특정 양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 불활성 희석제 또는 동화성 식용 담체 등에 의해 경구 투여될 수 있다. 또한, 화합물 (및, 경우에 따라, 다른 성분)은 경질 또는 연질 외피 젤라틴 캡슐에 봉입되어, 정제로 압착되거나 피험체의 식이에 직접 혼입될 수도 있다. 경구 치료 투여 시, 화합물은 부형제와 혼입될 수 있고, 섭취성 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여 외에 다른 경로로 본 발명의 화합물을 투여하고자 하는 경우, 화합물의 불활성화를 방지하기 위한 물질로 화합물을 코팅하거나 화합물과 함께 공동투여하는 것이 필요한 경우도 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 "치료학적 유효량" 또는 "예방학적 유효량"을 포함할 수 있다. "치료학적 유효량"은 원하는 치료 결과를 달성하기 위한 투약량에서 필요한 시간 기간 동안 효과적인 양을 의미한다. 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 치료학적 유효량은 개인의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체 중에서 원하는 반응을 유도해내는 항체, 항체 부분, 다른 TNFα 억제제의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 또한, 치료학적 유효량은 임의의 치료적 유익 효과가 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 임의의 독성 또는 유해 효과를 능가하는 것이다. "예방학적 유효량"은 원하는 예방적 결과를 달성하기 위한 투약량에서 필요한 시간 기간 동안 효과적인 양을 의미한다. 일반적으로, 예방적 용량은 질병의 초기 단계이거나 그 단계 전인 피험체에게 사용되는 바, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 적을 것이다.
투여 방법은 최적의 바람직한 반응(예: 치료적 또는 예방적 반응)을 제공하기 위해 조정될 수 있다. 예를 들어, 1회용 환괴를 투여하거나, 여러 분할 용량을 경시적으로 투여하거나, 또는 치료 상황의 위급에 따라 용량을 비례적으로 감소 또는 증가시킬 수 있다. 특히, 투여 용이성 및 투약량의 균일성 측면에서 투약량 단위 형태의 비경구 조성물을 조제하는 것이 유리하다. 본 명세서에 사용된 투약량 단위 형태란, 치료받는 포유동물 피험체을 위해 단위 투약량으로서 맞춰진 물리적으로 분리된 단위를 의미하고; 각 단는 필요한 약학적 담체와 함께 원하는 치료적 효과적을 산출하도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 포함한다. 본 발명의 투약량 단위 형태의 세부사항은 (a) 활성 화합물의 고유의 특징과 달성하고자 하는 특정 치료적 또는 예방적 효과, 및 (b) 개체에 맞는 민감한 치료를 위한 상기 활성 화합물을 배합하는 기술에 고유한 제한에 따라 규정되고 직접 좌우된다.
항체 또는 이의 항원 결합 부분의 치료적 또는 예방학적 유효량의 비제한적인 예시적 범위는 10 내지 200mg, 보다 바람직하게는 20 내지 160mg, 보다 바람직하게는 40 내지 80mg, 가장 바람직하게는 80mg이다. 한가지 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 치료학적 유효량은 약 20mg이다. 다른 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 치료학적 유효량은 약 40mg이다. 또 다른 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 치료학적 유효량은 약 80mg이다. 한가지 양태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 치료학적 유효량은 약 120mg이다. 또 다른 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 치료학적 유효량은 약 160mg이다. 앞에서 언급한 투약량의 중간 범위, 예를 들면 약 78.5 내지 약 81.5; 약 15 내지 약 25; 약 30 내지 약 50; 약 60 내지 약 100; 약 90 내지 약 150; 약 120 내지 약 200도 본 발명의 일부로 간주되어야 한다. 예를 들어, 앞에서 언급한 임의의 값을 상한 및/또는 하한으로 조합한 값의 범위도 본 발명에 포함되는 것으로 간주되어야 한다.
투약량 값은 경감되어야 하는 상태의 종류 및 병도에 따라 달라질 수 있음을 유념해야 한다. 또한, 임의의 특정 피험체마다 특정 투여 방법이 개인의 요구 및 조성물을 투여하거나 투여를 감독하는 사람의 전문적 판단에 따라 조정되어야 하고, 본 명세서에 제시된 투약량 범위는 단지 예시적인 것일 뿐이며, 청구하는 조성물의 범위 또는 실행을 제한하고자 하는 것이 아님을 유념해야 한다.
본 발명의 방법을 사용하여 수득한 항체 또는 이의 항체 부분은 본 발명에 각각 참고인용된 WO 02/100330에 기술된 격주 투여 섭생, WO 04/037205에 기술된 저용량 섭생, 및 WO 05/110452에 기술된 다회 가변 용량 섭생으로 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 포장된 약제학적 조성물, 제조물품, 또는 키트에 관한 것이다. 제조물품은 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 항체 또는 이의 항원 결합 부분 및 포장재료를 포함할 수 있다. 제조물품은 또한 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 제형 또는 조성물이 HCP 및/또는 프로카텝신 L의 감소된 수준을 보유하고 있음을 나타내는 라벨 또는 포장 삽입물(package insert)을 포함할 수 있다. 제조물품은 아달리무맙 제형이 약 70ng/mg 이하의 HCP를 포함함을 나타내는 포장 재료 안에 담긴 표지 또는 포장제품 지침서를 포함하거나 또는 아달리무맙 제형이 약 13ng/ml 이하임을 나타내는, 포장 재료 내에 담긴 라벨 또는 포장상품 지침서를 포함할 수 있다. 제조물품은 아달리무맙 제형이 약 5ng HCP/mg 아달리무맙 이하를 포함함을 나타내는, 포장 재료 안에 담긴 표지 또는 포장제품 지침서를 포함할 수 있다. 제조물품은 또한 아달리무맙 제형이 약 3.0 RFU/s/mg 아달리무맙의 카텝신 L 활성으로 나타나는 것보다 크지 않은 프로카텝신 L을 포함함을 나타내는 포장 재료를 포함할 수 있다.
VII. 치료 방법
본 발명은 TNFα 활성이 유해한 장애를 앓고 있는 피험체의 TNFα 활성을 억제하는데 사용될 수 있는 HCP 또는 프로카텝신 L 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법을 제공한다. TNFα는 매우 다양한 장애의 병태생리학과 관련이 있다[참조: Moeller, A., et al. (1990) Cytokine 2:162-169; U.S. Patent No. 5,231,024 to Moeller et al; European Patent Publication No. 260610 Bl by Moeller, A.]. TNFα는 매우 다양한 TNFα 관련 장애, 예를 들면 패혈증, 감염증, 자가면역질환, 이식거부 및 이식편대숙주 질환의 병태생리학과 관련이 있다[참조: Moeller, A., et al. (1990) Cytokine 2:162-169; 미국특허 5,231,024, Moeller et al. 유럽 특허 공개번호 260 610 Bl by Moeller, A., et al., Vasilli, P. (1992) Annu. Rev. Immunol. 10:411-452; Tracey, K.J. and Cerami, A. (1994) Annu. Rev. Med.45:491-503]. 본 발명은 TNFα 관련 장애를 앓고 있는 피험체의 TNFα 활성을 억제하는 유익한 HCP 또는 프로카텝신 L 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법으로서, 피험체에게 1차 유도 용량을 투여하고, 이어서 항체 또는 이의 항원결합 단편의 치료 용량을 투여하여 TNFα 활성이 억제되게 하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. TNFα는 사람 TNFα이고, 피험체는 사람 피험체인 것이 바람직하다. 한가지 양태에서, TNFα 억제제는 HUMIRA®　(D2E7)로도 불리는 아달리무맙이다.
본 명세서에 사용된 "TNFα 활성이 유해한 장애"란 용어는 이 장애를 앓고 있는 피험체 내에 TNFα의 존재가 그 장애의 병태생리에 원인이거나 그 장애의 악화에 기여하는 요인인 것으로 확인되거나, 원인인 것으로 의심되는 질환 및 다른 장애를 포함하는 것을 의미한다. 따라서, TNFα 활성이 유해한 장애는 TNFα 활성의 억제가 그 장애의 증후군 및/또는 진행을 경감시킬 것으로 예상되는 장애이다. 이러한 장애는 앞에서 설명한 항-TNFα 항체 등을 사용하여 검출할 수 있는, 장애를 앓고 있는 피험체의 생물학적 유체 내에 존재하는 TNFα의 농도 증가(예를 들면, 피험체의 혈청, 혈장, 윤활액 등에 존재하는 TNFα의 농도 증가) 등으로 확인할 수 있다. TNFα 활성이 유해한 장애의 예에는 다수가 있다. 특정 장애의 치료를 위해 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 TNFα 항체 및 항체 부분의 사용은 이하에 더 상세히 논의된다:
A. 패혈증
종양 괴사 인자는 저혈압, 심근억제, 혈관 누출 증후군, 기관 괴사, 독성 2차 매개인자의 방출 자극 및 응고 캐스캐이드의 활성화를 포함하는 생물학적 효과가 있는 패혈증의 병태생리에 입증된 역할을 갖고 있다[예를 들면, Moeller, A., et al. (1990) Cytokine 2:162-169; 미국특허 5,231,024 to Moeller et al; 유럽 특허 공보 260 610 Bl by Moeller, A.; Tracey, KJ. and Cerami, A. (1994) Annu. Rev. Med. 45:491-503; Russell, D and Thompson, R.C. (1993) Curr. Opin. Biotech. 4:714-721). 본 발명의 다회 가변 투여 방법은 패혈쇼크, 내독성 쇼크, 그람 음성 패혈증 및 독성 쇼크 증후군을 포함하는 임의의 임상적 환경의 패혈증을 치료하는데 사용될 수 있다.
또한, 패혈증의 치료를 위해, 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 항-hTNFα 항체 또는 항체 부분은 패혈증을 더욱 경감시킬 수 있는, 인터루킨-1 억제제(예를 들면, PCT 공개번호 WO 92/16221 및 WO 92/17583에 기술된 것), 사이토카틴 인터루킨-6(예를 들면, PCT 공개번호 WO 93/11793) 또는 혈소판 활성화 인자의 길항물질(예를 들면, 유럽 특허출원 공개 EP 374 510)과 같은 하나 이상의 다른 치료제와 함께 공동투여될 수 있다. 바람직한 양태에서, 항-TNFα 항체 또는 항체 부분은 IL-6의 혈청 또는 혈장 농도가 500pg/ml 이상, 보다 바람직하게는 1000pg/ml인 패혈증 환자의 서브그룹에 속하는 사람 피험체에게 치료 시에 투여한다(PCT 공개번호 WO 95/20978, Daum, L., et al. 참조).
B. 자가면역 질환
종양 괴사 인자는 다양한 자가면역 질환의 병태생리에 역할을 하는 것으로 연루되어 있다. 예를 들어, TNFα는 류마티스 관절염에서 조직 염증의 활성화 및 관절 파괴를 유발하는데 연루되어 있다[예를 들면, Moeller, A., et al (1990) Cytokine 2:162-169; 미국특허 5,231,024 to Moeller et al; 유럽 특허 공보 260610 Bl by Moeller, A.; Tracey and Cerami, 상기 문헌 참조; Arend, W.P. and Dayer, J-M. (1995) Arth. Rheum.38:151-160; Fava, R.A., et al. (1993) Clin. Exp. Immunol. 94:261-266]. TNFα는 또한 당뇨병에서 섬 세포의 사망을 촉진하고 인슐린 내성을 매개하는데 연루되어 있다(예를 들면, Tracey and Cerami, 상기 문헌 참조; PCT 공개번호 WO 94/08609 참조). TNFα는 또한 다발성 경화증에서 희소돌기아교세포에 대한 세포독성 및 염증성 플라크의 유도를 매개하는데 연루되어 있다(예를 들면, Tracey and Cerami, 상기 문헌 참조). 키메릭성 및 사람화된 쥐 항-hTNFα 항체는 류마티스 관절염 치료에 대한 임상 시험을 받은 바 있다(예를 들면, Elliott, M.J., et al. (1994) Lancet 344:1125-1127; Elliot, M.J., etal. (1994) Lancet 344: 1105-1110; Rankin, E.C., et al (1995) Br. J. Rheumatol. 34:334-342).
아달리무맙과 같은 TNFα 항체는 자가면역질환, 특히 염증과 관련된 자가면역질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 이러한 자가면역 질환의 예에는 류마티스 관절염, 류마티스 척추염, 골관절염 및 통풍 관절염, 알러지, 다발성 경화증, 자가면역 당뇨병, 자가면역 포도막염 및 신장증후군이 있다. 자가면역 질환의 다른 예에는 다발적 자가면역 질환 및 자가면역 청력 상실이 있다.
통상적으로, 항체 또는 항체 부분은 전신 투여되지만, 특정 장애에서는 염증 부위에 항체 또는 항체 부분의 국소 투여가 유리할 수 있다(예를 들면, 류마티스 관절염에서 관절에 국소 투여 또는 당뇨병성 궤양에 대한 국소 적용 단독 처치 또는 PCT 공개 WO 93/19751에 기술된 바와 같은 사이클로헥산-일리덴 유도체와의 병용 처치). 또한, 사람 항체, 및 항체 부분, 예를 들면 D2E7을 포함하는 TNFα 억제제는 이하에 더 상세히 논의되는 자가면역 질환의 다회 가변 용량 치료에 유용한 하나 이상의 추가 치료제와 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 한가지 양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 TNFα 항체는 루푸스와 같은 자가면역 장애를 치료하는데 사용된다. 루푸스는 TNF 활성과 관련이 있는 것으로 밝혀져 있다(Shvidel et al. (2002) Hematol J. 3:32; Studnicka-Benke et al. (1996) Br J Rheumatol. 35:1067). 본 명세서에 사용된 "루푸스"란 용어는 피부, 관절 및 장관 기관을 포함하는 많은 기관계에 영향을 미칠 수 있는 루푸스홍반이라 불리는 만성 염증성 자가면역 장애를 의미한다. 루푸스는 일반적인 용어로서, 많은 특정 형태의 루푸스, 예를 들면 전신루푸스, 루푸스신장염 및 루푸스 뇌염을 포함한다. 전신 루푸스(SLE)에서, 신체의 자연 방어는 신체에 대항하고, 나쁜 면역 세포는 체조직을 공격한다. 따라서, 신체의 혈액 세포, 기관 및 조직에 대항하여 반응할 수 있는 항체가 생산될 수 있다. 이 반응은 환부계를 공격하는 면역 세포를 유도하여 만성 질환을 초래한다. 루푸스 사구체 질환으로도 불리는 루푸스 신장염은 일반적으로 SLE의 합병증이고 사구체에 대한 손상 및 신장 기능의 점진적 상실을 특징으로 하는 신장 장애이다. 루푸스 뇌염은 뇌 및/또는 중추신경계의 염증인 SLE의 다른 합병증을 의미한다.
TNFα 항체를 사용하여 치료할 수 있는 다른 자가면역 질환은, 이하 장관 장애 항목에서 더 상세히 설명되는 크론병이다.
C. 감염 질환
종양 괴사 인자는 다양한 감염질환에서 관찰되는 생물학적 효과를 매개하는데 연루되어 있다. 예를 들어, TNFα는 말라리아에서 뇌염증 및 모세혈관 혈전증 및 경색을 매개하는데 연루되어 있다. TNFα는 또한 수막염에서 뇌염증의 매개, 혈액-뇌 장벽의 파괴, 패혈쇼크 증후군의 유발 및 정맥 경색의 활성화에 연루되어 있다. 또한, TNFα는 후천적 면역결핍증후군(AIDS)에서 악액질 유도, 바이러스 증식 자극 및 중추신경계 손상 매개에 연루되어 있다. 따라서, TNF에 대해 지향적인 항체 및 항체 부분은 세균 수막염(예를 들면, 유럽특허출원공개 EP 585 705), 뇌말라리아, AIDS 및 AIDS 관련 복합체(ARC)(예를 들면, 유럽특허출원공개 EP 230 574), 뿐만 아니라 이식 후의 사이토메갈로바이러스 감염(예를 들면, Fietze et al.(1994) Transplantation 58: 675)을 포함하는 감염 질환의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 항체 및 항체 부분은 또한 감염 질환과 관련된 증후군, 예를 들면 감염으로 인한 열 및 근육통(예: 인플루엔자) 및 감염에 이차적인(예를 들면, AIDS 또는 ARC에 이차적인) 악액질을 경감시키는데 사용될 수 있다.
D. 이식
종양 괴사 인자는 T 세포 수용체 CD3 복합체에 대해 유도된 래트 항체 OKT3이 신장 이식의 거부를 억제하는데 사용될 때 관찰된 부작용을 매개하고 동종이식거부 및 이식편대숙주 질환(GVHD)의 주요 매개인자로 연루되어 있다(예를 들면, Eason et al. (1995) Transplantation 59:300; Suthanthiran and Strom (1994) New Engl. J. Med. 331 :365). 따라서, 본 발명의 항체 및 항체 부분은 동종이식 및 이종이식 거부를 포함하는 이식 거부를 다회 가변 용량 치료를 통해 억제하고, GVHD를 억제하는데 사용될 수 있다. 항체 또는 항체 부분은 단독 사용되기도 하지만, 동종이식에 대한 면역반응을 억제하거나 GVHD를 억제하는 하나 이상의 다른 제제와 함께 사용되는 것이 보다 바람직하다. 예를 들어, 한가지 양태에서 본 발명의 항체 또는 항체 부분은 OKT3과 함께 OKT3 유도 반응을 억제하는데 사용된다. 다른 양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 부분은 면역반응을 조절하는데 관련된 다른 표적들, 예를 들면 세포표면분자 CD25(인터루킨-2 수용체-α), CD11a(LFA-1), CD54(ICAM-1), CD4, CD45, CD28/CTLA4, CD80(B7-1) 및/또는 CD86(B7-2) 등에 대해 유도된 하나 이상의 항체와 함께 사용된다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 부분은 사이클로스포린 A 또는 FK506과 같은 하나 이상의 일반 면역억제제와 함께 사용된다.
E. 암
종양 괴사 인자는 암에서 악액질 유도, 종양 성장 자극, 전이 잠재성 증가 및 세포독성 매개에 연루되어 있다. 따라서, TNF에 대해 유도된 항체 및 항체 부분은 암 치료에 사용될 수 있고, 이 치료는 종양 성장 또는 전이를 억제하고(하거나) 암에 이차적인 악액질을 경감시킨다. 항체 또는 항체 부분은 전신 투여되거나 또는 종양 부위에 국소 투여될 수 있다.
F. 폐 장애
종양 괴사 인자는 성인호흡곤란증후군(ARDS)의 병태생리, 예를 들면 백혈구 내피세포 활성화 자극, 폐포세포에 대한 세포독성 유도 및 혈관 누출 증후군 유도 등에 연루되어 있다. 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 항체는 다양한 폐 장애, 예를 들면 성인호흡곤란증후군(예: PCT 공개번호 WO 91/04054), 쇼크 폐, 만성 폐염증 질환, 폐 사르코이드증, 폐섬유증 및 규폐증 등을 치료하는데 사용될 수 있다. 항체 또는 항체 부분은 에어로졸 등으로 폐표면에 국소 투여되거나 전신 투여될 수 있다. 항체 또는 항체 부분은 이하에 더 자세히 논의되듯이 폐 장애의 치료에 유용한 하나 이상의 추가 치료제와 함께 투여될 수도 있다.
TNFα가 병태생리에 연루되어 있는 폐장애의 다른 예에는 특발성 간질성 폐질환 및 만성 폐쇄성 기도 장애가 있다(예를 들면, Piquet et al (1989) J Exp Med. 170:655; Whyte et al. (2000) Am J Respir Crit Care Med. 162:755; Anticevich et al. (1995) Eur J Pharmacol. 284 :221). 본 발명은 또한 상기 폐장애를 앓고 있는 피험체의 TNFα 활성을 치료하는 방법으로서, 항체 또는 항체 부분을 피험체에게 투여하여, 특발성 간질성 폐질환 또는 만성 폐쇄성 기도 장애를 앓고 있는 피험체의 TNFα 활성이 억제되게 하는 방법을 제공한다. TNFα 활성이 유해한 특발성 간질성 폐질환 및 만성 폐쇄성 기도 장애의 예는 이하에 더 상세히 논의된다.
1. 특발성 간질성 폐질환
한가지 양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 TNFα 항체는 특발성 간질성 폐질환이 있는 피험체를 치료하는데 사용된다. "특발성 폐 섬유증" 또는 "IPF"라는 용어는 염증, 사실상 심재성 폐 조직의 흉터형성을 특징으로 하며 호흡곤란을 유도하는 장애 그룹을 의미한다. IPF 내에 폐포(기낭) 및 이의 지지 구조(간질성)의 상처형성은 사실상 기능 폐포 단위의 상실과 공기로부터 혈액으로 산소 전달의 감소를 유도한다. IPF는 또한 광범위 실질 폐질환; 폐포염; 잠재 섬유성 폐포염(CFA); 특발성 폐 폐렴(IPP); 및 일반 간질성 폐렴(UIP)이라고도 불린다. IPF는 종종 UIP와 동의어로 사용되는데("IPF/UIP"), 이는 UIP가 IPF의 병리학적 진단에서 관찰되는 가장 일반적인 세포 패턴이기 때문이다.
특발성 간질성 폐 질환은 3가지 방식으로 폐에 영향을 미친다: 첫째, 폐조직은 일부 공지 또는 미지의 방식으로 손상된다; 둘째, 폐내 기포의 벽은 염증을 일으키기 시작한다; 마지막으로, 간질성(또는 기포 사이의 조직)에서 상처형성(또는 섬유증)이 시작되어 폐가 경직되기 시작한다. 특발성 간질성 폐질환의 예에는 특발성 폐섬유증(IPF)이 있다. 종양 괴사 인자는 특발성 폐섬유증(IPF)의 병태생리에 연루되어 있다(Piquet et al., (1989) J Exp Med. 170:655; Whyte et al (2000) Am J Respir Crit Care Med 162:755 Corbett et al. (2002) Am J Respir Crit Care Med. 165:690 참조). 예를 들어, IPF 환자는 대식세포 및 타입 II 표피 세포에서 TNF 발현의 수준을 증가시키는 것으로 밝혀져 있다(Piquet et al. (1993) Am J Pathol 143:651; Nash et al (1993) Histopathology 22:343; Zhang et al (1993) J Immunol 150:4188). 또한, 특정 유전자 다형태증은 TNF 발현 증가와 관련이 있고, IPF 및 규폐증에서의 역할에 연루되어 있다(Whyte et al., 상기 문헌 참조; Corbett et al., 상기 문헌 참조).
IPF 환자는 종종 마른기침, 흉통 및/또는 호흡곤란을 포함하는 특정 증후군을 나타낸다. IPF의 치료에 일반적으로 사용되는 약물은 프레드니손 및 사이톡산이지만, 환자 중 일부만이 이 약물의 지속 사용으로 호전된다(American Thoracic Society (2000) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 161 :646). 산소 투입 및 폐의 이식은 다른 치료 선택사항이다. 한가지 양태에서, 본 발명의 방법을 통해 수득한 항체는 특발성 폐 섬유증의 치료 등을 위해 다른 치료제와 함께 사용될 수 있다.
특발성 간질성 폐 질환 및 만성 폐쇄성 기도 장애를 연구하는데 사용된 동물 모델의 예에는 오브알부민(OVA) 유도 알러지 천식 마우스 및 궐련 연기 유도 만성 폐쇄성 폐 질환 마우스가 있다(Hessel et al (1995) Eur J Pharmacol. 293:401; Keast et al. (1981) J. Pathol. 135:249 참조).
2. 만성 폐쇄성 기도 장애
한가지 양태에서, TNFα 항체는 만성 폐쇄 기류 장애가 있는 피험체를 치료하는데 사용된다. 이러한 질환에서, 기류 폐쇄는 만성 및 지속성이거나, 우발성 및 재발성일 수 있다. 기류 폐쇄는 일반적으로 최대 날숨 동안의 시간에 대해 발산된 부피를 기록하는 강제 날숨 폐활량측정법으로 측정한다. 기류가 폐쇄되지 않은 피험체에서, 완전 강제 날숨에는 보통 3 내지 4초가 소요된다. 기류가 폐쇄되어 있는 만성 폐쇄 기류 장애 환자의 경우에는 보통 15 내지 20초 이하가 소요되고, 호흡중지시간에 의해 제한될 수 있다. 날숨 1초 동안의 정상적인 강제 날숨 부피(FEV1)는 쉽게 측정되고, 연령, 성별 및 신장을 기초로 하여 정확하게 예측된다. FEV1 대 강제 폐활량(FEV1/FVC)의 비는 일반적으로 0.75를 초과한다. 또한, 강제 날숨 및 후속 강제 들숨 동안의 부피에 대한 기류 기록(유량기량 루프)도 주로 상기도 협착을 하기도 협착과 구별하는데 유용하다. 만성 폐쇄성 기도 장애의 예는 이하에 기술된다.
a. 천식
종양 괴사 인자는 천식의 병태생리에 연루되어 있다(Anticevich et al. (1995) Eur J Pharmacol. 284:221; Thomas et al 1995. Am J Respir Crit Care Med. 152:76; Thomas and Heywood (2002) Thorax. 57:774). 예를 들어, 급성 천식 공격은 폐 호중구증가증 및 BAL TNF 수준 상승과 연관이 있는 것으로 밝혀져 있다(Ordonez et al. (2000) Am J Respir Crit Care Med 161:1185). 천식 증후군의 병도는 집먼지에서 내독소 수준과 상관성이 있는 것으로 밝혀져 있다. 래트의 경우, 항-TNF 항체는 내독소 유도된 기도 변화를 저하시켰다(Kips et al (1992) Am Rev Respir Dis 145:332).
본 명세서에 사용된 "천식"이란 용어는 기도 염증이 폐내 및 폐외로의 기류를 제한되게 하는 장애를 의미한다. 또한, 천식은 기관지 천식, 운동 유도 천식 - 기관지 및 반응성 기도 질환(RAD)으로 불리기도 한다. 일부 경우에, 천식은 알러지 및/또는 가족력과 관련이 있다. 천식은 단시간 동안 기관지 기도의 직경 또는 구경의 광범위한 변동을 특징으로 하여 폐 기능의 변화를 초래하는 상태를 포함한다. 그 결과 초래되는 기류에 대한 내성 증가는 병에 걸린 환자의 증후군, 예를 들면 무호흡증(호흡곤란), 흉부 협착 또는 "긴장", 및 쌕쌕거림을 초래한다.
천식이 있는 환자는 NIH 안내서에 따라 특성화되어, 약한 간헐성, 약한 지속성, 중간 지속성 및 심한 지속성으로 표현한다(NAEPP Expert Panel Report Guidelines for the Diagnosis and Management of Asthma-Update on Selected Topics 2002. JACI 2002; 110: S141-S209; Guidelines for the Diagnosis and Management of Asthma. NEH Publication 97-4051, July 1997). 중간 지속성 천식으로 진단된 환자는 종종 코르티코이드의 흡입으로 치료된다. 심한 지속성 천식으로 진단된 환자는 종종 고용량 흡입 코르티코이드 및 경구(p.o.) 코르티코이드로 치료된다.
b. 만성 폐쇄성 폐 질환( COPD )
종양 괴사 인자는 만성 폐쇄성 폐 질환의 병태생리에 연루되어 있다(Keatings (2000) Chest. 118:971; Sakao et al. (2001) Am JRespir Crit Care Med. 163:420; Sakao et al. (2002) Chest. 122:416). 본 명세서에서 서로 호환 사용되는 "만성 폐쇄성 폐 질환" 또는 "COPD"란 용어는 다양한 기포 확대 정도 및 폐 조직 파괴와 함께 제한적 기류를 특징으로 하는 폐 질환의 그룹을 의미한다. COPD란 용어에는 만성 기관지염(술잔 세포 점막하샘 과다형성에 의한 점액 과다분비), 만성 폐쇄 기관지염 또는 폐기종(기도 실질의 파괴) 또는 이 증상들의 복합증이 포함된다. 폐기종 및 만성 기관지염이 만성 폐쇄성 폐 질환의 가장 일반적인 형태이다. COPD는 비가역성 기류 폐쇄에 의해 정의된다.
COPD에서, 만성 염증은 소기도의 고정 협착 및 폐 실질 및 폐포 벽 파괴(폐기종)을 유도한다. 이것은 폐포 대식세포, 호중구 및 세포독성 T 림프구의 수 증가, 및 다발성 염증 매개인자(지질, 케모카인, 사이토카인, 성장 인자)의 방출을 특징으로 한다. 이 염증은 소기도 협착 및 폐 실질 파괴를 나타내는 섬유증을 유도한다. 또한, 이 염증을 증폭시킬 수 있는 산화 스트레스 수준도 높다.
G. 장관 장애
종양 괴사 인자는 크론병을 포함하는 염증성장질환의 병태생리에 연루되어 있다(예를 들면, Tracy et al.(1986) Science 234: 470; Sun et al.(1988) J.Clin.Invest. 81: 1328; MacDonald et al.(1990) Clin.Exp.Immunol. 81: 301). 키메릭성 쥐 항-hTNFα 항체는 크론병 치료용으로 임상 시험을 받은 바 있다(van Dullemen et al.(1995) Gastroenterology 109: 129). 본 발명은 특발성 염증성 장질환과 같은 장관 장애를 사람 항체 또는 이의 항원결합 단편으로 치료하기 위해 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 TNFα 항체를 투여하는 것을 포함하는 치료 방법을 포함한다. 특발성 염증 장 질환은 2가지 증후군, 즉 크론병 및 궤양성결장염이 있다. 한가지 양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 항체는 또한 IBD 및 크론병과 종종 관련이 있는 장애를 치료하는데 사용된다. 본 명세서에 호환 사용되고 있는 "염증성 장질환(IBD) 관련 장애" 또는 "크론병 관련 장애"란 용어는 IBD 및 크론병과 일반적으로 관련 있는 증상 및 합병증을 나타내는데 사용된다.
본 발명은 크론병의 치료를 위해 TNFα 항체를 투여하는 것을 포함하는 다회 가변 용량 섭생을 포함한다. 크론병의 치료는 질환의 위치, 범위 및 병도를 바탕으로 한다. 약리학적 시술에는 소염제(아미노살리실레이트 및 코르티코스테로이드) 및 면역조절제(아자티오프린 및 6-머캅토퓨린[6-MP], 사이클로스포린, 메토트렉세이트[MTX], 항생제 및 생물학적 제제)가 있다. C-반응성 단백질(CRP) 및 적혈구침강속도(ESR) 수준은 비특이적 금성기 반응을 반영한다. 내시경검사는 크론병을 진단하는 1차적 수단이다. 바륨 검사로 관찰되는 크론병의 방사선 특징에는 점막 부종, 아프타성 및 선형 궤양, 비대칭 협착 및 장간막 비대로 인한 인접 장관의 분리가 있다. 이상은 국소적이며 비대칭적이다. 1차 조직 병터는 아프타 궤양이다. 크론병이 있는 피험체는, 이 병의 병도를 측정하는 표준 방법인 크론병 활성지수(CDAI)를 통해 평가할 수 있고, 점수가 높을수록 더욱 심각한 질병 활성을 나타낸다.
본 발명의 방법을 사용하여 치료할 수 있는 크론병 관련 장애의 예에는 방광, 질 및 피부의 샛길; 장폐쇄; 농양; 영양결핍; 코르티코스테로이드 사용의 합병증; 관절 염증; 결절홍반; 괴저농피증; 및 눈의 병변이 있다. 크론병과 일반적으로 관련이 있는 다른 장애에는 크론병 관련 관절통, 누공성 크론병, 미정 결장염 및 낭염이 있다.
H. 심장 장애
본 발명의 방법을 사용하여 수득한 항체 또는 이의 항원결합 단편은 또한 심장 허혈(예: 유럽특허출원공개번호 EP 453 898) 및 심부전(심근 허약)(예: PCT 공개번호 WO 94/20139 참조)을 비롯하여 다양한 심장 또는 관상 장애의 치료에 사용될 수 있다. 또한, TNFα는 재협착증의 병태생리에도 연루되어 있다(예를 들면, Clausell et al.(1994), 상기 문헌 참조: Medall et al.(1997) Heart 78: 273).
본 명세서에 사용된 "TNFα 활성이 유해한 심장 장애"란 용어는 이 장애를 앓고 있는 피험체 중에 TNFα의 존재가 재협착증과 같은 심장혈관 장애를 포함하는 장애의 병태생리에 원인이거나 그 장애의 악화에 기여하는 요인인 것으로 확인되거나 의심되는 관상 및 심장혈관 질환을 포함하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 호환 사용된 "심장혈관 장애" 또는 "관상 장애"란 용어는 심장, 혈관 및/또는 혈액과 같은 심장혈관계를 수반하는 임의의 질환, 장애 또는 상태를 의미하는 것이다. 관상 장애는 일반적으로 심장(관상 동맥)으로 혈액과 산소를 공급하는 혈관의 협착을 특징으로 한다. 관상 질환은 지방 물질 및 플라크의 축적으로부터 초래될 수 있다. 관상동맥이 협착되면, 심장으로의 혈액의 흐름은 지연되거나 멈출 수 있다. 본 발명의 관상 장애는 구조적, 조직학적, 생화학적 또는 임의의 다른 이상인지 여부에 관계없이 동맥의 임의의 이상에 적용할 수 있다. 관상심장 질환의 예는 재협착증이다. 한가지 양태에서, 관상 장애는 심장 허혈 및 심부전을 제외한 심혈관계와 관련된 임의의 질환, 장애 또는 상태를 의미한다.
TNFα 활성이 유해한 관상 장애는 종종 동맥의 차단으로부터 초래한다. 이러한 차단은 죽상동맥경화증과 일반적으로 관련된 변화로부터 이미 협착되어 있는 관상 동맥에서 일반적으로 형성되는 응고물에 의해 일어날 수 있다. 예를 들어, 동맥 벽 내의 죽상동맥경화성 플라크가 균열을 일으키면, 이것은 혈전 또는 응고물의 형성을 야기할 수 있다. 이러한 장애는, 예를 들면 이러한 장애를 앓고 있는 피험체의 체액에 존재하는 TNFα의 농도를 증가(예를 들면, 피험체의 혈청, 혈장, 윤활액 등에 존재하는 TNFα의 농도 증가)시켜, 예를 들면 상기한 항-TNFα 항체로 검출함으로써 확인할 수 있다. 관상 장애는 또한 동맥압의 불균형, 심장 기능장애 또는 혈관 폐쇄, 예를 들면 혈전에 의한 폐쇄로 인해 일어날 수도 있다. 관상 장애는 관상동맥 질환 및 말초혈관 질환을 모두 포함한다.
재협착증을 포함하는 TNFα 활성이 유해한 심장 장애의 예에는 다수가 있다. 특정 관상 장애를 치료하기 위한 항체, 항체 부분의 사용은 이하에 더 상세하게 논의된다. 특정 양태에서, 항체, 항체 부분은 이하에 기술되는 다른 치료제와 함께 피험체에게 투여된다.
본 발명의 방법을 사용하여 수득한 항체는 또한 심장 장애를 앓고 있는 피험체의 TNFα 활성을 억제하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 관장동맥 장애가 있는 피험체의 TNFα 활성을 억제하거나 감소시키는 방법으로서, 피험체에게 본 발명의 항체 또는 항체 부분 또는 다른 TNFα 억제제를 투여하여, 피험체의 TNFα 활성이 억제되거나 감소되게 하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. TNFα는 사람 TNFα이고, 피험체는 사람 피험체인 것이 바람직하다. 또는, 피험체는 본 발명의 항체가 교차반응하는 TNFα를 발현하는 포유동물일 수 있다. 또한, 피험체는 hTNFα가 도입된(예를 들면, hTNFα의 투여 또는 hTNFα 돌연변이유전자의 발현을 통해) 포유동물일 수 있다. 본 발명의 항체는 사람 피험체에게 치료목적으로 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 항체는 수의학적 목적 또는 사람 질환의 동물 모델로서, 이 항체가 교차반응하는 TNFα를 발현하는 비사람 포유동물(예를 들면, 영장류, 돼지 또는 마우스)에게 투여할 수 있다. 동물 모델과 관련하여, 이러한 동물 모델은 다회 가변 용량 치료 효능을 평가하는데(예를 들면, 투약량 및 투여 시간 과정을 검사하는데) 유용할 수 있다. 재협착증을 포함하는 관상 장애를 연구하는데 일반적으로 사용되는 동물 모델에는 래트 또는 마우스 경동맥 연결 모델 및 경동맥 손상 모델이 있다(Ferns et al. (1991) Science 253:1129; Clowes et al. (1983) Lab. Invest. 49:208; Lindner et al. (1993) Circ Res. 73:792). 경동맥 연결 모델에서, 동맥 혈류는 원위 분기 부근에서 혈관의 연결로 중단된다. 클로웨스 등의 문헌에 기술된 바와 같이, 경동맥 손상 모델은 풍선 카테터의 관내 삽입을 외측 경동맥을 통해 도입시켜 공통 경동맥의 내피가 벗겨지도록 수행한다. 2주째, 경동맥은 평활근세포 수축으로 인해 현저히 협착되어 있고, 2 내지 12주 사이에는 내막 두께가 배가되어 관 크기가 감소되어 있다. 이러한 임의의 모델은 사람의 재협착증의 예방 및 치료에 있어서 본 발명의 TNFα 항체가 나타내는 잠재적인 치료 작용을 측정하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 TNFα 활성이 유해한 심혈관 장애의 치료방법으로서, TNFα 활성의 억제가 관상 질환의 증후군 및/또는 진행을 경감시키거나 관상 질환을 예방하는 것으로 예상되는 치료방법을 제공한다. 관상 장애를 앓고 있거나 발생 위험이 있는 피험체는 임상 증후군을 통해 식별할 수 있다. 관상 질환의 임상 증후군에는 종종 흉통, 호흡곤란, 허약, 기절발작, 의식 변화, 사지 통증, 발작야간호흡곤란, 일과성허혈발작 및 환자가 경험하는 이러한 다른 현상이 있다. 관상 질환의 다른 징후로서, 또한 EKG 이상, 말초맥박 변성, 동맥잡음, 심장소리, 박동수 및 천명 이상, 경정맥 팽창, 신경 변성 및 임상의에 의해 식별된 기타 소견도 포함할 수 있다. 또한, 관상 장애는 예를 들어 이 장애를 앓고 있는 피험체의 생물학적 유체에 존재하는 TNFα 농도의 증가(예를 들면, 피험체의 혈청, 혈장, 윤활액 등에 존재하는 TNFα 농도의 증가)를 통해 증명될 수 있다.
심혈관 장애의 예에는 관상 동맥 질환, 협심증, 심근경색, 심장정지에 의해 유발된 심혈관 조직 손상, 심장 바이패스에 의해 유발된 심혈관 조직 손상, 심장성 쇼크 및 고혈압, 죽상동맥경화증, 관상 동맥 연축, 관상 동맥 질환, 판막 질환, 부정맥 및 심근병증이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 특정 심혈관 질환의 치료에 항체 또는 항체 부분의 사용에 대해서는 이하에 더 상세히 논의된다. 특정 양태에서, 항체, 항체 부분은 이하에 설명되는 바와 같은 다른 치료제와 함께 피험체에 투여된다.
1. 재협착증
본 명세서에 사용된 "재협착증"이란 용어는 동맥의 협착 또는 수축인 협착증의 재발을 의미한다. 재협착증은 종종 혈관 환부에 재건 시술 후 발생하는 전폐쇄 병변(preocculsive lesion)으로 나타난다. 이 용어는 기존 협착증의 재발뿐만 아니라 혈관 바이패스 후 부분 폐쇄되기 시작하는 이전 정상 혈관에도 적용된다. 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명을 사용하여 수득한 항체 또는 이의 항원 결합 부분을, 재협착증을 보유하거나 발생 위험이 있는 피험체에게 투여하는 것을 포함하는 재협착증의 치료방법을 제공한다.
TNFα는 재협착증의 병태생리에 연루되어 있다(Zhou et al.,(2002) Atherosclerosis 161: 153; Javed et al.(2002) Exp and Mol Pathol 73: 104). 예를 들어, 쥐 와이어 경동맥 모델에서 TNF -/- 마우스는 야생형 마우스에 비해 7배 감소된 초기 과다형성을 나타냈다(Zimmerman et al.(2002) Am J Phsiol Integr Comp Physiol 283: R505). 재협착증은 관상 혈관구조에서든지 또는 말초에서든지 간에, 혈관 재건의 임의의 형태의 결과로서 나타날 수 있다(Colburn and Moore(1998) Myointimal Hyperplasia pp. 690-709 in Vascular Surgery: A Comprehensive Review Philadelphia: Saunders). 예를 들어, 연구에 따르면, 관상동맥 혈관성형술 후 증후성 재협착률은 30 내지 50%인 것으로 보고되었다(Berk and Harris (1995) Adv. Intern. Med. 40: 455). 또 다른 예로서, 경동맥 동맥내막절제술 후, 연구된 환자의 20%는 50% 초과의 관강내 협착을 나타냈다(Clagett et al.(1986) J.Vasc.Surg. 3: 10). 재협착증은 관련된 혈관의 본성, 잔류 질환의 정도 및 국소 혈류역학을 포함하는 복합 요인들로 인해 다른 해부학적 위치에서 전폐쇄 병변을 동반하는 증상의 다른 정도로서 입증되어진다.
본 명세서에 사용된 "협착증"은 폐쇄 장애 또는 재협착증에서 관찰되는 동맥의 협착을 의미한다. 협착증은 협착된 동맥 단편 이후 혈류 감소를 반영하는 증후군들을 동반할 수 있고, 이 경우 협착증을 유발하는 장애를 질환(즉, 폐쇄 질환 또는 재협착 질환)이라 부른다. 협착증은 혈관에서 무증후성으로 존재할 수 있어, 혈관조영술이나 혈관 실험실 연구와 같은 진단 중재에 의해서만 검출되어진다.
본 발명의 방법을 사용하여 수득한 항체는 재협착증을 앓고 있거나 재협착증의 발생 위험이 있는 피험체를 치료하는데 사용될 수 있다. 재협착증의 발생 위험이 있는 피험체에는 PTCA를 겪고 있는 피험체를 포함한다. 이 피험체는 또한 재협착증을 방지하기 위해 스텐트를 삽입한 피험체일 수도 있다. TNFα 항체는 단독 사용할 수도 있고, 또는 심장혈관 질환을 앓고 있는 피험체에서 협착증의 재발을 방지하기 위한 스텐트와 함께 사용될 수도 있다.
2. 울혈성 심부전
TNFα는 울혈성 심부전의 병태생리에 연루되어 있다(Zhou et al.(2002) Atherosclerosis 161: 153 참조). 울혈성 심부전 환자에서 TNFα의 혈청 수준은 이 질환의 병도에 정비례하는 방식으로 상승한다(Levine et al.(1990) N 뚜히 J Med 323: 236; Torre-Amione et al.(1996) J Am Coll Cardiol 27: 1201). 또한, TNFα의 억제제는 울혈성 심부전 증후군을 호전시키는 것으로 밝혀져 있다(Chung et al.(2003) Circulation 107: 3133).
본 명세서에 사용된, "울혈성 심부전"이란 용어는 신체의 산소 수요를 공급하는 심장 용량의 감소를 특징으로 하는 상태를 포함한다. 울혈성 심부전의 증후군 및 징후에는 신체의 다양한 조직으로의 혈류 감소, 다양한 기관에 과다 혈액의 축적(예를 들면, 심장이 대정맥에 의해 심장으로 돌아온 혈액을 배출시킬 수 없을 때), 운동시 호흡곤란, 피로 및/또는 말초 부종, 예를 들면 좌심실 기능이상에서 초래되는 말초 부종이 있다. 울혈성 심부전은 급성 또는 만성일 수 있다. 울혈성 심부전의 증상은 일반적으로 심장 기능의 일시 또는 영구 상실을 공유하는 다양한 심장 또는 전신 장애에 이차적으로 일어난다. 이러한 장애의 예에는 고혈압, 관상동맥질환, 판상질환, 및 비후성, 확장성 또는 제한적 심근병증관 같은 심근병증이 있다.
"울혈성 심부전을 앓고 있거나 또는 보유하는 피험체"는 대사 조직의 요구에 알맞은 혈액을 심장이 펌핑할 수 없거나, 또는 상승된 혈액 회류량만으로도 그럴 수 있는 심장 펌핑 장애의 일반적인 공통요소에 의해 연계된 다양한 병인의 임상 증후군을 수반하는 장애를 보유하는 피험체이다. "울혈성 심부전의 발생 위험이 있는 피험체"는 피험체의 심혈관계에 영향을 미치는 특정 요인으로 인해 울혈성 심부전을 발생시킬 경향이 있는 피험체이다. 이러한 섬체의 울혈성 심부전의 발생을 예방하거나 또는 발생 위험을 저하시키는 것이 바람직하다. "울혈성 심부전을 보유하는"이란 문구는 아직은 그 증상을 앓고 있지 않을 수도 있지만, 위험 요인을 나타냄으로 인해 일반 개체에 비해 그 증상을 앓을 위험이 있는 환자를 포함한다. 예를 들어, 미치료된 고혈압 환자는 울혈성 심부전을 앓고 있지 않을 수 있지만, 환자의 고혈압 증상으로 인해 울혈성 심부전의 위험이 있다. 본 발명의 한가지 양태에서, 항체 아달리무맙은 울혈성 심부전의 발생 위험이 있는 피험체를 치료하는데 사용된다.
3. 급성 관상 증후군
TNFα는 급성 관상 증후군의 병태생리에 연루되어 있다(Libby(1995) Circulation 91: 2844). 급성 관상 증후군은 혈류 제한으로 인해 심장에 도달하는 산소가 충분하지 않아서 피험체가 통증을 느끼는 장애를 포함한다. 연구 결과, TNFα는 급성 관상 증후군에 역할을 하는 것으로 밝혀져 있다. 예를 들어, 하류 혈역학적 효과의 부재 하에 심근 경색을 유도할 수 있는 신규 래트 종속영향성 심장 이식-관상 연결 모델에서, 키메릭성 용해성 TNF 수용체(sTNFR)의 투여는 일과성 LV 재형성 및 기능이상을 제거했다(Nakamura, et al.,(2003) J.Cardiol. 41:41). 또한, 심근에 sTNFR 발현 플라스미드를 직접 주사한 결과, 급성 심근 경색(AMI) 실험 래트에서 경색 크기가 감소하는 것으로 관찰되었다(Sugano et al.(2002) FASEB J 16: 1421).
한가지 양태에서, TNFα 항체는 급성 관상 증후군이 심근 경색 또는 협심증인 피험체의 급성 관상 증후군의 치료 또는 예방에 사용된다.
본 명세서에 사용된 "심근 경색" 또는 "MI"란 요엉는 심장발작을 의미한다. 심근경색은 심장 부위에 산소의 부적당한 공급으로 인한 심장 부위의 괴사 또는 영구적인 손상을 수반한다. 이러한 괴사는 일반적으로 죽상동맥경화증 또는 색전증으로 인한 관상 동맥의 폐쇄로 일어난다. 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 TNFα 항체로 치료되는 MI에는 Q파 및 비Q파 심근 경색이 있다. 대부분의 심장 공격은 관상 동맥 중 하나(혈액과 산소를 심근으로 유도하는 혈관)를 차단하는 응고에 의해 일어난다. 예를 들어, 관상 동맥 중의 응고는 심근으로 혈액과 산소의 흐름을 방해하여, 이 부위에 심장 세포를 치사시킨다. 손상된 심근은 영구적으로 수축능을 상실하고, 나머지 심근은 이를 보충해야 한다. MI는 또한 개인의 과도한 스트레스로 인해 일어날 수도 있다.
"협심증"이란 용어는 연축, 기도폐색, 또는 질식성 통증을 의미하며, 특히 대부분 심근의 무산소증으로 인한 발작성 흉통인 협심증을 나타내는 것이다. 협심증에는 이형협심증 및 운동협심증이 있다. 협심증이 있는 피험체는 종종 왼쪽 어깨에서 왼쪽 팔을 따라 나아가는 급작스런 심한 압박 흉골하의 통증으로 나타나는 허혈성 심장병을 보유한다. TNFα는 TNFα 수준이 MI 환자 및 안정한 협심증 환자 모두에서 상승조절되는 바, 협심증에 연루되어 있다(Balbay et al.(2001) Angiology 52109).
4. 죽상동맥경화증
본 명세서에 사용된 "죽상동맥경화증"은 지방 물질이 동맥 벽을 따라 침착되어 있는 증상을 의미한다. 이 지방물질은 두꺼워지고, 딱딱해져, 결국에는 동맥을 차단할 수 있다. 죽상동맥경화증은 동맥을 경화시키고 동맥 플라크 축적을 일으키는 동맥경화증으로 불리기도 한다. TNFα에 대해 지향성인 폴리클로날 항체는 토끼 죽상동맥경화증 모델에서 염증 및 재협착증을 초래하는 TNFα 활성을 중화시키는데 효과적인 것으로 밝혀져 있다(Zhou et al. 상기 문헌 참조). 따라서, TNFα 항체는 죽상동맥경화증에 걸려 있거나 걸릴 위험이 있는 피험체의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
5. 심근병증
본 명세서에 사용된 "심근병증"이란 용어는 심장 근육 또는 심근이 허약하여, 일반적으로 부적당한 심장 펌핑을 초래하는 심근의 질환을 정의하는데 사용된다. 심근병증은 바이러스 감염, 심장발작, 알콜중독, 장기간의 심한 고혈압(높은 혈압)으로 인해 또는 자가면역 원인에 의해 유발될 수 있다.
심장발작 환자의 약 75 내지 80%에서, 관상 동맥 질환은 심근병증의 기본적인 원인이어서, "허혈성 심근병증"이라 지칭된다. 허혈성 심근병증은 심장발작에 의해 일어나고, 심장 근육 또는 심근에 흉터를 남긴다. 이러한 이환된 심근은 심장 펌핑 기능에 기여할 수 없다. 흉터가 클수록 또는 심장발작의 횟수가 많을수록, 허혈성 심근병증의 발생 기회가 높아진다.
기본적인 관상 동맥 질환이 원인이 아닌 심근병증은 "비허혈성 심근병증"이라 지칭한다. 비허혈성 심근병증에는, 특발성 심근병증, 비후성 심근병증, 알콜성 심근병증, 확장성 심근병증, 분만전후 심근병증 및 제한적 심근병증이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
I. 척추관절병증
TNFα는 척추관절병증과 같은 염증 질환을 포함하는 다양한 장애의 병태생리에 연루되어 있다(예를 들면, Moeller et al.(1990) Cytokine 2: 162: 미국특허 5,231,024; 유럽특허공개번호 260 610). 본 발명은 척추관절병증을 앓고 있는 피험체의 TNFα 활성을 억제하는 다회 가변 용량 방법으로서, 척추관절병증을 앓고 있는 피험체의 TNFα 활성이 억제되도록 항체 또는 항체 부분을 피험체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 사용된, "척추관절병증" 또는 "척추관절병증들"이란 용어는 공통된 임상, 방사선적 및 조직학적 특징을 공유하는, 척추 관절에 영향을 미치는 여러 질환 중 어느 하나를 의미하는데 사용된다. 많은 척추관절병증은 유전자적 특징을 공유하며, 즉 HLA-B27 대립유전자와 연관되어 있다. 한가지 양태에서, 척추관절병증은 강직성 척추염을 제외한, 공통된 임상, 방사선적 및 조직학적 특징을 공유하는 척추 관절에 영향을 미치는 여러 질환 중의 어느 하나를 의미하는 것이다. 척추관절병증의 예에는 강직성 척추염, 건선 관절염/척추염, 장병성 관절염, 반응성 관절염 또는 라이터 증후군(Reiter's syndrome), 및 미분화 척추관절병증이 있다. 척추관절병증을 연구하는데 사용된 동물 모델의 예에는 ank/ank 돌연변이 마우스 HLA-B27 돌연변이 래트가 있다(Taurog et al.(1998) The Spondylarthritides. Oxford: Oxford University Press).
또한, 본 발명의 다회 가변 용량 방법은 다회 가변 용량 방법을 사용하여 척추관절병증의 발생 위험이 있는 피험체를 치료하는데 사용될 수 있다. 척추관절병증의 보유 위험이 있는 피험체의 예에는 관절염을 앓고 있는 사람이 포함된다. 척추관절병증은 관절염의 다른 형태인 류마티스 관절염 등과 연관이 있을 수 있다. 본 발명의 한가지 양태에서, 항체는 류마티스 관절염과 연관이 있는 척추관절병증을 앓고 있는 피험체를 치료하는 다회 가변 용량 방법에 사용된다. TNFα 항체로 치료할 수 있는 척추관절병증의 예는 이하에 설명된다:
1. 강직성 척추염( AS )
종양 괴사 인자는 강직성 척추염의 병태생리에 연루되어 있다(Verjans et al.(1991) Arthritis Rheum. 34: 486; Verjans et al.(1994) Clin. Exp Immunol. 97: 45; Kaijtzel et al.(1999) Hum Immnol. 60: 140). 강직성 척추염(AS)은 하나 이상의 척추뼈에 염증을 수반하는 염증 장애이다. AS는 척추의 척추뼈와 엉치엉덩관절 사이의 관절 및 척추와 골반 사이의 관절을 비롯하여, 중축성골격 및/또는 말초 관절에 영향을 미치는 만성 염증 질환이다. AS는 종국에는 이환된 척추뼈가 함께 융합 또는 성장하도록 할 수 있다. AS를 포함하는 척추관절병증은 건선 관절염(PsA) 및/또는 염증성 장질환(IBD), 예를 들면 궤양결장염 및 크론병과 연관이 있을 수 있다.
AS의 초기 증상은 방사선 검사, 예를 들면 CT 스캔 및 MRI 스캔 등에 의해 측정될 수 있다. AS의 초기 증상에는 종종 미란과 경화증이 후속되는 연골하 뼈의 피질 변연의 흔들림(blurring)으로 인해 입증되는, 엉치엉덩관절의 변화 및 엉치엉덩관절염을 포함한다. 또한, 피로도 역시 AS의 일반적인 증후군으로 확인되었다(Duffy et al.(2002) ACR 66th Annual Scientific Meeting Abstract). 따라서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합단편을 투여하는 것을 포함하는 다회 가변 용량 방법은 AS를 치료하는데 사용될 수 있다.
한가지 양태에서, 본 발명의 다회 가변 용량 방법은 AS를 비롯하여, IBD와 연관이 있는 척추관절병증의 치료에 사용된다. AS는 종종 비스테로이드성 항염증 약제(NSAID), 예를 들면 아스피린 및 인도메타신으로 치료되기도 한다. 따라서, 본 발명의 다회 가변 용량 방법에 사용되는 TNFα 항체는 또한 강직성 척추염과 일반적으로 연관이 있는 염증 및 통증을 저하시키는데 일반적으로 사용되는 제제와 함께 투여될 수도 있다.
2. 건선관절염
종양 괴사 인자는 건선관절염(PsA)의 병태생리에 연루되어 있다(Partsch et al.(1998) Ann Rheum Dis. 57: 691; Ritchlin et al.(1998) J. Rheumatol. 25: 1544). 본 명세서에 언급된 바와 같이, 건선관절염 또는 피부와 연관된 건선은, 신체에 붉은 반점을 유발하는 일반적인 만성 피부 증상인 건선과 연관이 있느 s만성 염증 관절염을 의미한다. 건선이 있는 개체 20명 중 약 1명은 피부 상태에 따라 관절염을 발생하며, 약 75%의 증례에서 관절염 전에 건선이 나타난다. PsA는 다양한 방식으로 나타나, 약한 관절염 내지 심한 관절염이 되며, 이러한 관절염은 보통 손가락과 척추에 영향을 미친다. 척추에 이환될 때, 증후군은 상기한 바와 같은 강직성 척추염의 증후군과 유사하다. 본 발명을 사용하여 수득한 TNFα 항체 또는 이의 항원결합단편은 PsA의 치료에 사용될 수 있다.
PsA는 때로 절단관절염과 관련이 있다. 절단관절염은 과도한 뼈 미란으로 관절을 절단시키는 거대한 미란성 변형이 초래되는 것을 특징으로 하는 장애를 의미한다. 한가지 양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 항체는 절단관절염을 치료하는데 사용된다.
3. 반응성 관절염/라이터 증후군
종양 괴사 인자는 라이터증후군으로 불리기도 하는 반응성 관절염의 병태생리에 연루되어 있다(Braun et al.(1999) Arthritis Rheum. 42(10): 2039). 반응성 관절염(ReA)은 종종 장 감염 또는 비뇨생식 감염 후에 신체의 기타 부위에서 감염을 악화시키는 관절염을 의미한다. ReA는 종종 특정 임상 증후군, 예를 들면 관절의 염증(관절염), 요도염, 결막염 및 피부와 점막의 병변 등을 특징으로 한다. 또한, ReA는 성매개질환 또는 이질성 감염, 예를 들면 클라미디아, 캄필로박터, 살모넬라 또는 예르시니아 등으로의 감염 후에 나타날 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 항체는 ReA를 치료하는데 사용될 수 있다.
4. 미분류된 척추관절병증
한가지 양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 항체는 미분류된 척추관절병증을 앓고 있는 피험체를 치료하는데 사용된다(Zeidler et al.(1992) Rheum Dis Clin North Am. 18: 187 참조). 미분류된 척추관절병증을 표현하는데 사용되는 다른 용어에는 혈청검사음성 빈발성관절염 및 미분류된 빈발성관절염이 있다. 본 명세서에 사용된 미분류된 척추관절병증은, 피험체가 척추관절병증과 연관 있는 증후군의 일부만을 나타내는 장애를 의미한다. 이 증상은 보통 IBD, 건선 또는 AS의 고전적 증후군 또는 라이터 증후군을 보유하지 않는 청소년에서 관찰된다. 일부 경우에, 미분류된 척추관절병증은 AS의 초기 징조일 수 있다. 한가지 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 TNFα 항체 또는 이의 항원결합단편을 미분류된 척추관절병증을 치료하기 위해 투여하는 것을 포함한다.
J. 대사 장애
TNFα는 다양한 장애, 예를 들면 당뇨 및 비만과 같은 대사 장애 등의 병태생리에 연루되어 있다(Spiegelman and Hotamisligil(1993) Cell 73: 625; Chu et al.(2000) Int J Obes Relat Metab Disord. 24: 1085; Ishii et al.(2000) Metabolism. 49: 1616). 본 명세서에 사용된 "대사 장애"란 용어는 생리적 기능을 수행하는데 필요한 물질을 신체가 처리하는 방식에 영향을 미치는 질환 또는 장애를 의미한다. 대사 장애의 예에는 당뇨병 및 비만이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명의 한가지 양태에서, "대사 장애"란 용어는 자가면역 당뇨병을 제외한, 생리적 기능을 수행하는데 필요한 물질을 신체가 처리하는 방식에 영향을 미치는 장애를 나타내는데 사용된다.
본 발명은 이러한 대사 장애를 앓고 있는 피험체의 TNFα 활성을 억제하는 방법으로서, 대사 장애를 앓고 있는 피험체의 TNFα 활성이 억제되도록 피험체에게 항체 또는 항체 부분을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 또한, TNFα 항체는 대사 장애의 발생 위험이 있는 피험체를 치료하는 데에도 사용될 수 있다.
대사 장애는 종종 류마티스 관절염을 포함하는 관절염과 연관이 있다. 한가지 양태에서, 항체와 같은 TNFα 억제제는 류마티스 관절염과 연관이 있는 대사 장애를 앓고 있는 피험체의 다회 가변 용량 섭생에 사용된다. 다른 양태에서, 본 발명은 당뇨병 또는 비만과 연관 있는 장애를 치료하기 위해 TNFα 항체를 투여하는 것을 포함한다.
대사 장애를 치료하는 TNFα 항체의 효능을 평가하는 동물 모델의 예에는 NOD 돌연변이 마우스, 아키타(Akita) 마우스, NSY 돌연변이 마우스 및 ob/ob 마우스가 있다[Baeder et al. (1992) Clin Exp Immunol. 89:174; Haseyama et al. (2002) Tohoku J Exp Med. 198:233; Makino et al. (1980): Exp.Anim. 29:1; KoIb (1987) Diabetes/Metabolism Reviews 3:751; Hamada et α/.(2001) Metabolism. 50:1282; Coleman, (1978) Diabetologia, 14:141; Bailey et al. (1982) Int. J. Obesity 6:11 참조]. 혈관염을 연구하는데 사용된 동물 모델의 예에는 마우스 HSV 모델(베체트병), 마우스 L.카제이 모델(가와사키병) 및 마우스 ANCA 모델(가와사키병)이 있다. 다른 혈관염 모델에는 McH5-lpr/lpr 계통(Nose et al (1996) Am. J. Path. 149:1763) 및 SCG/Kj 계통의 마우스(Kinjoh et al. (1993) Proc. Natl. Acad. ScL, USA 90:3413)가 있다. 이러한 마우스 계통들은 소동맥 및 비장, 위, 심장, 자궁 및 난소의 세동맥들에 괴사성 혈관염 및 초승달사구체신염을 자발적으로 발생시킨다. 이 동물들은 미엘로퍼옥시다제(MPO)와 반응하는 ANCA 자가항체 및 고감마글로불린혈증을 발생시킨다. 또한, 사람 MPO를 사용한 래트의 면역화는 ANCA 관련 괴사성 초승달사구체신염을 초래한다(Brouwer et al.(1993) J.Exp.Med. 177:905).
대사 장애는 생리적 기능을 수행하는데 필요한 물질을 신체가 처리하는 방식에 영향을 미친다. 본 발명의 많은 대사 장애는 특정 특징을 공유하며, 즉 인슐린 내성, 혈당 조절능의 결여, 체중 증가 및 체질량지수의 증가와 관련이 있다. 대사 장애의 예에는 당뇨병과 비만이 있다. 당뇨병의 예에는 타입 1 진성당뇨병, 타입 2 진성당뇨병, 당뇨성 신경병증, 말초신경병증, 당뇨망막병증, 당뇨병성 궤양, 망막병증 궤양, 당뇨병성 거대혈관병증 및 비만이 있다. TNFα 항체의 투여를 포함하는 다회 가변 용량 방법으로 치료할 수 있는 대사 장애의 예에 대해서는 이하에 더 상세히 설명된다:
1. 당뇨병
종양 괴사 인자는 당뇨병의 병태생리에 연루되어 있다(Navarro et al . (2003) Am J Kidney Dis. 42:53; Daimon et al. (2003) Diabetes Care. 26:2015; Zhang et al. (1999) JTongji Med Univ. 19:203; Barbieri et α/.(2003) Am JHypertens. 16:537). 예를 들어, TNFα는 인슐린 내성의 병태생리에 연루되어 있다. 위장암 환자의 혈청 TNF 수준은 인슐린 내성과 상관성이 있는 것으로 밝혀져 있다(예를 들면, McCaIl et 미.(1992) Br. J. Surg. 79:1361 참조).
본 명세서에서 호환 사용되는, "당뇨병" 또는 "당뇨 장애" 또는 "진성당뇨병"이란 용어는 혈액에 존재하는 당의 상승된 수준으로 나타나는 질환을 의미한다. 당뇨병은 지나치게 적은 인슐린(혈당을 조절하는, 췌장에 의해 생산된 화학물질), 인슐린 내성 또는 이 둘 모두에 의해 일어날 수 있다. 당뇨병에는 이 장애의 가장 일반적인 2가지 종류, 즉 타입 I 당뇨병 및 타입 II 당뇨병이 있으며, 이 둘 모두 신체가 인슐린을 조절하는 능력 부족으로 인해 일어난다. 인슐린은 혈액 내의 혈당(포도당)의 수준 증가에 반응하여 췌장에 의해 방출된 호르몬이다.
본 명세서에 사용된 "타입 1 당뇨병"이란 용어는 췌장이 인슐린을 지나치게 적게 생산하여 혈당 수준을 적당히 조절하지 못할 때 일어나는 만성 질환을 의미한다. 타입 1 당뇨병은 인슐린 의존적 진성당뇨병, IDMM, 소아 개시 당뇨병, 및 당뇨병 타입 I로 지칭되기도 한다. 타입 1 당뇨병은 후속적인 인슐린 결핍으로 인한 췌장 β 세포의 진행성 자가면역 파괴의 결과이다.
"타입 2 당뇨병"이란 용어는 췌장이 혈당을 정상 수준으로 유지하기에 충분한 인슐린을 만들지 못할 때, 종종 신체가 인슐린에 잘 반응하지 않기 때문에 일어나는 만성 질환을 의미한다. 타입 2 당뇨병은 또한 비인슐린 의존적 진성당뇨병, NDDM 및 당뇨병 타입 II로 지칭되기도 한다.
당뇨병은 당내성검사의 시술로 진단할 수 있다. 임상적으로, 당뇨병은 종종 여러 개의 기본 카테고리로 분류된다. 이러한 카테고리의 제1 예에는 자가면역 진성당뇨병, 비인슐린 의존적 진성당뇨병(타입 1 NDDM), 인슐린 의존적 진성당뇨병(타입 2 IDDM), 비자가면역 진성당뇨병, 비인슐린 의존적 진성당뇨병(타입 2 NIDDM), 및 청소년의 성숙 개시 당뇨병(MODY)이 있다. 종종 제2로 불리는 다른 카테고리는 당뇨 증후군의 발생을 유발하거나 허용하는 몇몇 식별가능한 증상에 의해 일어난 당뇨병을 의미한다. 제2 카테고리의 예에는 췌장 질환에 의한 당뇨병, 호르몬 이상, 약물 또는 화학물질 유도 당뇨병, 인슐린 수용체 이상에 의한 당뇨병, 유전자 증후군과 연관이 있는 당뇨병 및 다른 원인의 당뇨병이 있다(예를 들면, Harrison's(1996) 14th ed., New York, McGraw-Hill).
당뇨병은 종종 식이, 인슐린 투여 및 본 명세서에 기술된 다양한 약제로 치료된다. 따라서, TNFα 항체는 당뇨병과 일반적으로 연관이 있는 통증 및 대사 장애를 치료하는데 일반적으로 사용된 제제와 함께 투여될 수 있다.
또한, 본 명세서에 사용된 "당뇨병과 연관 있는 장애"란 문구는 당뇨병과 일반적으로 연관이 있거나 관련된 증상 및 다른 질환을 의미한다. 당뇨병과 연관 있는 장애의 예에는, 고혈당증, 고인슐린혈증, 고지질혈증, 인슐린 내성, 글루코스 대사 장애, 비만, 당뇨망막병증, 황반변성, 악액질, 당뇨신장병증, 사구체경화증, 당뇨병성 신경병증, 발기기능장애, 월경전 증후군, 혈관 재협착증, 궤양결장염, 관상심장질환, 고혈압, 협심증, 심근경색, 발작, 피부 및 결합조직 장애, 족부 궤양, 대사 산증, 관절염 및 골다공증이 있다.
당뇨병은 앞의 카테고리들로 나타나고, 이하 항목에서 논의되는 여러 합병증을 유발할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합단편은 당뇨병을 치료하는데 사용될 수 있다. 한가지 양태에서, TNFα 항체 또는 이의 항원결합단편은 위에서 확인된 카테고리와 연관이 있는 당뇨병을 치료하는데 사용된다. 다른 양태에서, 본 발명은 당뇨병과 연관 있는 장애를 치료하기 위해 TNFα 항체를 투여하는 것을 포함한다. 당뇨병은 당뇨병과 연관 있는 여러 합병증 및 증상으로 나타나고, 다음과 같은 카테고리를 포함한다:
a. 당뇨병성 신경병증 및 말초신경병증
종양 괴사 인자는 당뇨병성 신경병증 및 말초신경병증의 병태생리에 연루되어 있다(Benj afield et al. (2001) Diabetes Care. 24:753; Qiang et al. (1998) Diabetologia 41:132l; Pfeiffer et al. (1997) Horm Metab Res. 29:111).
본 명세서에 사용된, 신경 손상-당뇨병으로도 불리는 "신경병증"이란 용어는 고혈당증(높은 혈당 수준)의 결과로서 신경이 손상되어 있는 당뇨병의 공통된 합병증을 의미한다. 다양한 당뇨병성 신경병증이 확인되어 있으며, 그 예에는 원위 감각운동 다발신경병증 또는 초점성 운동 신경병증 및 자율 신경병증이 있다.
본 명세서에 사용된 말초신경염 및 당뇨병성 신경병증으로 알려진 "말초 신경병증"이란 용어는 뇌 및 척수로부터 정보를 전달하고, 뇌 및 척수로 정보를 전달하는 신경의 기능상실을 의미한다. 말초 신경병증은 통증, 감각 상실 및 근육 조절 불능과 같은 증후군을 산출한다. 몇몇 경우에, 혈관, 장 기능 및 다른 기관을 조절하는 신경의 기능상실은 비정상적 혈압, 소화 및 다른 기본적인 불수의 과정의 상실을 초래한다. 말초 신경병증은 단일 신경 또는 신경군에 대한 손상을 수반하거나(단발신경병증) 또는 다발성 신경에 영향을 미칠 수 있다(다발신경병증).
교감 및 부교감 신경의 작은 유수 및 무수 섬유에 영향을 미치는 신경병증은 "말초 신경병증"으로 알려져 있다. 또한, 말초 신경병증의 관련 장애인 말초 신경염 및 당뇨병성 신경병증 등은 뇌 및 척수로, 그리고 뇌 및 척수로부터 정보를 전달하는 신경의 기능상실을 의미한다. 이것은 통증, 감각 상실 및 근육 조절 불능과 같은 증후군을 산출한다. 몇몇 경우에, 혈관, 장 기능 및 다른 기관을 조절하는 신경의 기능상실은 비정상적 혈압, 소화 및 다른 기본적인 불수의 과정의 상실을 초래한다. 말초 신경병증은 단일 신경 또는 신경군에 대한 손상을 수반하거나(단발신경병증) 또는 다발성 신경에 영향을 미칠 수 있다(다발신경병증).
"당뇨 신경병증"이란 용어는 신경이 고혈당증(높은 혈당 수준)의 결과로서 손상된 당뇨병의 일반적인 합병증을 의미한다. 당뇨 신경병증은 신경병증 및 신경 손상-당뇨병이라고도 불린다. 다양한 당뇨병성 신경병증이 확인되어 있으며, 그 예에는 원위 감각운동 다발신경병증 또는 초점성 운동 신경병증 및 자율 신경병증이 있다.
b. 당뇨병성 망막병증
종양 괴사 인자는 당뇨병성 망막병증의 병태생리에 연루되어 있다(Scholz et al.(2003) Trends Microbiol. 11: 171). 본 명세서에 사용된 "당뇨병성 망막병증"이란 용어는 장기 당뇨병으로 인한 눈 망막에 대한 점진적인 손상을 의미한다. 당뇨병성 망막병증에는 증식 망막병증이 있다. 증식 망막병증은 결과적으로 혈관신생, 망막앞출혈, 및 망막박리가 있다.
진행 망막병증에서는 망막의 표면에서 소혈관이 증식한다. 이러한 혈관은 취약하여 출혈을 일으키기 쉽고 망막앞 출혈을 유발할 수 있다. 출혈은 시각을 흐르게 할 수 있고, 출혈이 섬유성 조직 형태로 재흡수되면 망막 박리 및 시력 상실에 걸리기 쉽다. 또한, 당뇨병성 망막병증은 혈관신생, 망막앞 출혈 및 망막 박리를 포함하는 증식 망막병증을 포함한다. 또한, 당뇨병성 망막병증은 망막 층에서 일어나는변화를 수반하는 "배경 망막병증"을 포함하기도 한다.
c. 당뇨병성 궤양 및 망막병증 궤양
종양 괴사 인자는 당뇨성궤양의 병태생리에 연루되어 있다(Lee et al. (2003) Hum Immunol. 64:614; Navarro et al. (2003) Am J Kidney Dis. 42:53; Daimon et al (2003) Diabetes Care. 26:2015; Zhang et al. (1999) J Tongji Med Univ. 19:203; Barbieri et al. (2003) Am JHypertens. 16:537; Venn et al. (1993) Arthritis Rheum. 36:819; Westacott et al. (1994) J Rheumatol 21:1710).
본 명세서에 사용된 "당뇨병성 궤양"이란 용어는 당뇨병의 합병증으로서 나타나는 궤양을 의미한다. 궤양은 염증성, 감염성, 악성 증상 또는 대사 장애로 인한 피부 또는 점막 상의 함몰 유사 병변이다. 통상적으로, 당뇨병성 궤양은 팔다리 및 사지, 더욱 통상적으로 발에서 발견될 수 있다. 당뇨성 증상에 의해 유발된 이러한 궤양, 예를 들면 신경병증 및 공포 부전증 등은 허혈 및 불량한 상처 치유를 유도할 수 있다. 더욱 광범위한 궤양은 골수염으로 진행될 수 있다. 골수염이 일단 발생하면, 항생제만으로 근절시키기가 어렵고 절단이 필요할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "망막병증 궤양"이란 용어는 눈 및 눈 망막에 대한 손상을 일으키거나 초래하는 궤양을 의미한다. 망막병증 궤양은 망상 출혈과 같은 증상을 포함할 수 있다.
d. 당뇨병성 거대혈관병증
종양 괴사 인자는 당뇨병성 거대혈관병증의 병태생리에 연루되어 있다(Devaraj et al. (2000) Circulation. 102:191; Hattori et al. (2000) Cardiovasc Res. 46:188; Clausell et al. (1999) Cardiovasc Pathol.8:145). 본 명세서에 사용된 "거대혈관 질환"이라고도 부른 "당뇨병성 거대혈관병증"이란 용어는 당뇨병에서 기인하는 혈관의 질환을 의미한다. 당뇨병 거대혈관병증 합병증은 예를 들면 지방과 혈액 응고가 대혈관에 축적하여 혈관벽에 점착할 때 일어난다. 당뇨병성 거대혈관병증에는 관상 질환, 뇌혈관질환 및 말초혈관 질환, 고혈당증 및 심혈관 질환, 및 발작과 같은 질환을 포함한다.
2. 비만
종양 괴사 인자는 비만의 병태생리에 연루되어 있다(예를 들면, Pihlajamaki J et al. (2003) Obes Res. l:912; Barbieri et al. (2003) Am J Hypertens. 16:537; Tsuda et al. (2003) J Nutr. 133:2125). 본 명세서에 사용된 "비만"이란 용어는 체질량에 비해 체지방이 과다한 피험체의 상태를 의미한다. 한가지 양태에서, 비만은 개체 무게가 키에 바람직한 최대 무게보다 약 20% 이상 더 나가는 상태를 의미한다. 성인이 100파운드 이상 체중초과이면, "병적으로 비만"인 것으로 간주된다. 다른 양태에서, 비만은 30kg/㎡ 이상의 BMI(체질량지수)로서 정의된다. 비만은 당뇨, 발작, 관상동맥질환, 고혈압, 높은 콜레스테롤, 및 신장 및 담낭 장애로 인한 개인의 병의 위험 및 사망을 증가시킨다. 비만은 또한 암의 일부 유형의 위험을 증가시킬 수 있고, 골관절염 및 수면무호흡의 발생의 위험 요인일 수 있다.
K. 빈혈
TNFα는 다양한 빈혈의 병태생리에 연루되어 있다(Jongen-Lavrencic et al. (1997) J. Rheumatol.24:15Q4; Demeter et al. (2002) Ann Hematol. 81:566; DiCato (2003) The Oncologist 8 (suppl 1):19). 본 발명은 빈혈을 앓고 있는 피험체의 TNFα 활성이 억제되도록 항체, 항체 부분을 피험체에게 투여하는 것을 포함하여, 빈혈을 앓고 있는 피험체의 TNFα 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 한가지 양태에서, 빈혈은 류마티스 관절염과 연관이 있다.
본 명세서에 사용된 "빈혈"이란 용어는 비정상적으로 낮은 수의 혈중 적혈구 또는 혈액 중의 감소된 헤모글로빈 농도를 의미한다. 류마티스 관절염과 관련된 빈혈의 예에는 만성 질환의 빈혈, 철결핍 빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈이 있다. 한가지 양태에서, 본 발명은 예를 들면 류마티스 관절염 관련 빈혈, 감염 및 만성 염증 질환의 빈혈, 철결핍 빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈, 골수치환성 빈혈, 재생불량빈혈, 저형성빈혈, 순수 적혈구무형성 및 망막 손상 또는 내분비 장애와 연관 있는 빈혈, 거대적혈모구 빈혈, 헴 또는 글로빈 합성의 결함, 적혈구 세포의 구조 결함으로 인한 빈혈, 예 겸상적혈구 빈혈, 및 미지 기원의 빈혈, 예를 들면 철적모구빈혈, 말라리아, 파동편모충증, HIV, 간염바이러스 또는 다른 바이러스와 같은 만성 감염과 연관 있는 빈혈, 및 골수 결핍으로 인한 골수치환성 빈혈이 있다.
빈혈 연구에 사용된 동물 모델의 예에는 펩티도글리칸-폴리사카라이드 폴리머 접종된 래트(Coccia et al.,(2001) Exp Hematology. 29: 1201-1209)가 있다. 통증 연구에 사용된 동물 모델의 예는 당업계에 공지되어 있고, 래트 좌골신경연결 모델, 및 래트 단편 척추 신경 연결 모델이 있다(Bennett and Zie, (1988) Pain. 33:87-107; Kim and Chung, (1992) Pain 50:355-363).
L. 통증
TNFα는 다양한 통증 증후군의 병태생리에 연루되어 있다(예를 들면, Sorkin et al. (1997) Neuroscience. 81:255; Huygen et al. (2002) Mediators Inflamm. 11:47; Parada et al. (2003) Eur J Λfewrascz.17: 1847 참조). 본 명세서에 사용된 "통증"이란 용어는 모든 종류의 통증을 의미한다. 이 용어는 급성 및 만성 통증, 예를 들면 신경변성 통증 및 수술후 통증, 만성요통, 군발두통, 헤르페스 신경통, 환상사지통, 중추성통증, 치통, 아편계 내성 통증, 내장통증, 수술통증, 골상해통증, 산통 및 분만통, 일광화상을 포함하는 화상에 의한 통증, 분만후통, 편두통, 협심통 및 방광염을 포함하는 비뇨생식관 관련 통증을 의미한다. 이 용어는 또한 통각성 통증 또는 통각도 포함한다.
본 발명은 이러한 통증 장애를 앓고 있는 피험체의 TNFα 활성을 억제하는 방법으로서, 통증을 앓고 있는 피험체의 TNFα 활성이 억제되도록, 항체 또는 항체 부분을 피험체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 통증은 통각성 통증 및 신경변성 통증을 포함하는 다양한 방식으로 정의되어 있다. 가장 일반적으로 경험하는 통증 형태는 대뇌로 자극을 전파시키는 신경종말에 미치는 자극의 효과로서 정의될 수 있다. 통증은 또한 류마티스 관절염을 포함하는 염증 장애와 일반적으로 연관이 있다. 한가지 양태에서, 본 발명의 항체는 류마티스 관절염과 연관이 있는 통증을 겪고 있는 피험체를 치료하는데 사용된다. TNFα 활성이 유해한 통증 장애의 예는 이하에 논하는 바와 같다:
1. 신경병증성 통증
종양 괴사 인자는 신경병증성 통증의 병태생리에 연루되어 있다(Sommer (1999) Schmerz. 13:315; Empl et al, (2001) Neurology. 56:1371; Schafers et al. (2003) JNeurosci. 23:3028 참조). 본 명세서에 사용된, "신경병증성 통증"이란 용어는 신경, 척수 또는 뇌에 대한 손상으로부터 초래되는 통증을 의미하며, 종종 신경 초민감성을 수반한다. 신경병증성 통증의 예에는 만성요통, 관절염 관련 통증, 암 관련 통증, 헤르페스 신경통, 환상 사지통, 중추성 통증, 아편계 내성 신경병증성 통증, 골상해통증 및 산통 및 분만통이 있다. 다른 신경병증성 통증의 예에는 수술후 통증, 군발두통, 치통, 수술통, 3도 화상과 같이 심한 화상으로 인한 통증, 분만후 통증, 협심성 통증, 방광염을 포함하는 비뇨생식관 관련 통증이 있다.
신경병증성 통증은 침해성 통증(nociceptive pain)과 다르다. 침해성 기전을 수반하는 통증은 보통 조직 복구 기간 동안에만 제한되고, 일반적으로 입수용이한 진통제 또는 아편제에 의해 경감된다(Myers(1995) Regional Anesthesia 20: 173). 신경병증성 통증은 통상적으로 장기 지속성 또는 만성이고 종종 초기 급성 조직 상해 후에 수일 또는 수개월 동안 발생한다. 신경병증성 통증은 영구적인 자발적 통증뿐만 아니라, 정상적으로는 아프지 않은 자극에 대한 통증성 반응인 무해자극통증도 수반할 수 있다. 신경병증성 통증은 또한 바늘로 콕 찌르기와 같이 보통은 사소한 아픈 자극에 대한 강화된 반응인 통각과민을 특징으로 할 수 있다. 침해성 통증과 달리, 신경병증성 통증은 일반적으로 아편양 치료 저항성이다(Myers, 상기 문헌 참조, 1995). 따라서, 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 항체는 신경병증성 통증의 치료에 사용될 수 있다.
2. 침해성 통증
본 명세서에 사용된 "침해성 통증"이란 용어는 신체에 손상을 입었을 때 유발되는 통증인, 완전한 신경 경로를 통해 전파되는 통증을 의미한다. 침해성 통증은 통증의 정상 기능 및 체성 감각을 포함하고, 조직 손상이 임박함을 피험체에게 알린다. 침해성 경로는 피험체의 보호를 위해 존재한다(예를 들면, 화상에 반응하여 경험한 통증). 침해성 통증은 뼈 통증, 내장 통증 및 연조직 관련 통증을 포함한다.
종양 괴사 인자는 내장 통증의 병태생리에 연루되어 있다(Coelho et al. (2000) Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 279:G781; Coelho et al. (2000) Brain Res Bull. 52:223). 내장 통증은 A-델타 및 C 신경 섬유 상의 수용체에 의해 매개되는 침해성 통증의 의미하는데 사용된다. A-델타 및 C-신경 섬유는 피부, 뼈, 결합조직, 근육 및 내장에 위치하는 것이다. 내장 통증은 분포가 불분명하고 본래 경련성이며, 보통 심한 통증성, 동통성, 압착성 및 경련통성 성질인 것으로 설명되어 있다. 내장 통증의 예에는 팔, 목 및/또는 등에서 내장 통증을 느낄 수 있는 심장발작과 연관이 있는 통증, 및 등 및/또는 오른쪽 어깨에서 내장 통증을 느낄 수 있는 간 피막 통증이 있다. 따라서, 본 발명을 사용하여 수득한 항체는 내장 통증을 치료하는데 사용될 수 있다.
M. 간 장애
TNFα는 다양한 간 장애의 병태생리에 연루되어 있다(Colletti et al (1990) J CUn Invest. 85: 1936; Tiegs (1997) Acta Gastroenterol BeIg. 60:176; Fernandez et al. (2000) J Endotoxin Res. 6:321). 본 발명은 이러한 간 장애를 앓고 있는 피험체의 TNFα 활성을 억제하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 사용된, "TNFα 활성이 유해한 간 장애"란 용어는 이 장애를 앓고 있는 피험체 내에 TNFα의 존재가 이 장애의 병태생리에 원인이거나 또는 이 장애의 악화에 기여하는 요인으로 밝혀져 있거나 의심되는 담도 장애 또는 간세포 손상과 연관이 있는 증상 또는 간의 질환 및 다른 장애를 포함하는 것을 나타낸다. 따라서, TNFα 활성이 유해한 간 장애는 TNFα 활성의 억제가 간 장애의 증후군 및/또는 진행을 경감시킬 것으로 예상되는 장애이다. 한가지 양태에서, 간 장애는 간염, 알콜성간염 및 바이러스성 간염을 제외한, 간세포 손상 또는 담도와 연관이 있는 사람 간 질환 또는 증상을 의미한다.
다회 가변 용량 방법을 사용하여 간 장애를 치료하는 제제의 치료 효능을 평가하는데 사용된 동물 모델의 예에는, 침팬지 C형 간염 바이러스 모델(Shimizu et al.(1990) Proc Natl Acad Sci. USA 87: 6441). 피부 및 손발톱 장애의 연구에 사용된 동물 모델의 예에는 중증복합면역결핍(SCID) 마우스 모델(건선) 및 스미드 라인(SL) 병아리 및 탈색 마우스(백반증) 등이 있다(Nickoloff (2000) Investig Dermatol Symp Proc.5:67; Austin et al. (1995) Am J Pathol. 146: 1529; Lerner et al (1986) J Invest Dermatol. 87:299).
간 장애는 간이 부적당하게 기능하거나 기능하지 않는 많은 질환 및 장애를 포함한다. 간세포 손상은 알콜경화증, α1 항트립신 결핍, 자가면역 경화증, 잠재성 경화증, 전격간염, B형 및 C형 간염, 지방간염을 포함할 수 있다. 담도 장애의 예에는 낭성 섬유증, 원발성 담즙성 경화증, 경화성 담도염 및 담도폐쇄증이 있다( Wiesner (1996) "Current Indications, Contra Indications and Timing for Liver Transplantation" in Transplantation of the Liver, Saunders (publ.); Busuttil and Klintmalm (eds.) Chapter 6; Klein (1998) Partial Hypertension: The Role of Liver Transplantation, Musby (publ.) in Current Surgical Therapy 6.sup.th Ed. Cameron, J. (ed)).
"간염"이란 용어는 간의 염증을 의미한다. 간염은 다양한 유기체, 예를 들면 세균, 바이러스(A형, B형, C형 간염 등) 또는 기생충 등으로의 감염에 의해 유발될 수 있다. 화학적 독소, 예를 들면 알콜, 약물 또는 독버섯과 같은 화학 독소 역시 간을 손상시킬 수 있고 염증성이 되게 할 수 있다. 간염의 드물지만 극한 유해 원인은 치사성일 수 있는 아세트아미노펜(Tylenol)의 과용량에서 초래되기도 한다. 또한, 신체의 면역 세포는 간을 공격하고 자가면역 간염을 유발할 수 있다. 간염은 빠르게 소멸되거나(급성 간염) 또는 장기 질환을 유발할 수 있다(만성 감염). 일부 경우에, 진행성 간 손상 또는 간 기능상실을 초래할 수도 있다. 간염의 빈도 및 병도는 환자의 임의의 기본적인 병 및 간 손상의 원인 등과 같은 다양한 요인에 따라 달라진다.
한가지 양태에서, 본 발명은 TNFα 활성이 유해한 간 장애를 치료하는 방법으로서, 이 장애가 치료되도록 TNFα 억제제의 유효량을 유도 용량 및 그 다음 치료 용량으로 피험체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 특징으로 한다. 한가지 양태에서, 간 장애는 C형 간염 바이러스, 자가면역 간염, 지방간 질환, B형 간염 바이러스, 간독성 및 비알콜성 간염, 예를 들면 비알콜성 지방간염(NASH)으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 간 장애의 예는 이하에 더 상세히 기술된다.
1. C형 간염 바이러스(HCV)
종양 괴사 인자는 C형 간염 바이러스의 병태생리에 연루되어 있다(Gonzalez-Amaro. (1994) J Exp Med. 179:841; Nelson et al. (1997) DigDis Sd 42:2487; Kallinowski et al. (1998) Clin Exp Immunol. 111 :269). "C형 간염 바이러스" 또는 "HCV"란 용어는 비A형, 비B형 간염의 원인 인자인 간염 바이러스를 나타내는데 사용된다. C형 간염 바이러스는 간의 염증을 유발한다. HCV 감염은 C형 간염을 유발한다. 급성상의 C형 간염은 일반적으로 B형 간염보다 효력이 약하지만, 이러한 감염들의 대부분은 만성이 되기 시작한다. HCV는 경화증 및 간암을 포함하는 급성 간염 및 만성 간질환의 주요 원인이다. HCV는 바이러스 간염의 대부분의 증례를 함께 설명하는, 바이러스들(A, B, C, D 및 E) 중의 하나이다. 이것은 숙주 범위가 좁은 것으로 나타나는 플라비비리대 과에 속하는 엔벨로프형 RNA 바이러스이다. 이 바이러스의 중요한 특징은 이 게놈의 상대적인 돌연변이성으로서, 이는 만성 감염을 유도하는 높은 성향(80%)과 아마도 관련이 있을 것이다. HCV는 이 질환의 병도 및 치료에 대한 반응을 측정하는데 중요할 수 있는 여러 독특한 유전자형으로 분류된다. 한가지 양태에서, 본 발명은 HCV를 치료하는 다회 가변 용량 방법을 제공한다.
2. 자가면역성 간염(AIH)
종양 괴사 인자는 자가면역성 간염의 병태생리에 연루되어 있다(Cookson et al., (1999) Hepatology 30:851; Jazrawi et al., (2003) Liver Transpl. 9:377). 본 명세서에 사용된, "자가면역성 감염"은 이종 조직 또는 병원균(질병 유발 인자)과 간의 정상 세포를 혼동하는 불량 면역세포에 의해 유발된 간의 염증을 특징으로 하는 간 장애를 의미한다. 자가면역 간염은 종종 치료하지 않으면 치사율이 높은 간 실질의 점진적 파괴에 원인이다(Johnson et al.(1993) Hepatology, 18: 998). 자가면역 간염의 특징 중 하나는 환자 혈청의 거의 90%에서 나타나는 혈중 자가항체의 존재이다. 이러한 항체는 자가면역성 간염을 보유하는 피험체를 동정하는데 사용될 수 있다.
환자간의 임상적 및 혈청학적 차이는 AIH를 2가지 종류로 분류할 수 있게 했다. 타입 I은 환자 혈청 중에 항평활근(SMA) 및/또는 항핵 항체(ANA)의 존재를 특징으로 하는 반면, 타입 II 환자 유래의 혈청은 항-간 신장 마이크로좀 항체 타입 1(LKM1)을 보여준다(Homberg et al.,(1987) Hepatology, 7:1333; Maggiore etal. (1993)J. Pediatr.Gastroenterol Nutr. 17:376). 혈청학적 마커인 항-간 세포졸 타입 I 항체(LC1)는 AIH 타입 II 환자의 30%에서 동정되었다. 또한, LC1은 검사된 환자의 10%에서 유일한 혈청학적 마커인 것으로 입증되었다(Martini et al. (1988) Hepatology, 8:1662). 한가지 양태에서, 본 발명의 방법은 AIH를 치료하는데 사용된다.
3. 지방간 질환
종양 괴사 인자는 지방간 질환의 병태생리에 연루되어 있다(Valenti et al, (2002) Gastroenerology 122:274; Li et al, (2003) Hepatology 37:343 참조). 지방간 질환은 지방(간세포)이 간에 과도하게 축적되는 질환을 의미한다. 지방간 질환은 과영양, 알콜 과다섭취, 당뇨병 및 약제 투여로 인한 부작용이 원인인 것으로 생각되고 있다. 지방 간 질환은 만성 간염 및 간경화증과 같은 심한 질환을 유발할 수 있다. 지방간 질환이 있는 환자에서, 지질, 특히 중성 지방의 양은 생리학적 허용 범위를 초과하는 정도까지 간세포에 축적한다. 생화학적 관점에서 지방간 판단 기준은 중성 지방의 중량이 간조직의 습윤 중량의 약 10%(100mg/g 습윤 중량) 이상이다. 한가지 양태에서, 본 발명의 방법은 지방간 질환을 치료하는데 사용된다.
4. B형 간염 바이러스(HBV)
종양 괴사 인자는 B형 간염 바이러스의 병태생리에 연루되어 있다(Kasahara et al, (2003) J Virol 77:2469; Wang (2003) World J Gastroenterol. 9:641 ;Biermer et al (2003) J Virol 77:4033). "B형 간염 바이러스"(HBV)는 사람의 B형 바이러스 간염을 생산하는 바이러스(혈청 간염 바이러스)를 나타내는데 사용된 것이다. 이는 항온처리 기간이 짧은 A형 간염 바이러스(감염성 간염 바이러스)와 달리, 항온처리 기간이 긴(약 50 내지 160일) 바이러스 질환이다. B형 간염은 감염 혈액이나 혈액 유도체를 주사하거나 또는 단지 오염된 주사바늘, 란셋 또는 다른 기구의 사용 시에 일반적으로 전염된다. 임상적 및 병리학적으로, 이질환은 바이러스 간염 타입 A와 유사하지만, 교차 방어 면역성은 없다. 바이러스 항원(HBAg)은 감염 후 혈청에서 관찰된다.
B형 간염 바이러스는 매우 높은 속도로 사람을 감염시킨다. B형 간염으로 감염되기 시작한 대부분의 사람들은 6개월 안에 그 바이러스를 없애고, 이러한 단기 감염은 B형 간염의 "급성" 증례로 알려져 있다. 적어도 약 3억만명의 사람이 HBV의 만성 보균자인 것으로 추정된다. 이 바이러스에 의한 감염은 작게는 감기 유사 증후군에서부터 사망에 이르기까지 광범위한 임상 증후군을 초래한다. 한가지 양태에서, 본 발명의 다회 가변 용량 방법은 HBV 감염의 치료에 사용된다.
5. 간독성
종양 괴사 인자는 간독성의 병태생리에 연루되어 있다(Bruccoleri et al. (1997) Hepatology 25:133; Luster et al (2000) Ann NY Acad Sd. 919:214; Simeonova et al. (2001) Toxicol Appl Pharmacol. 177:112). 간독성이란 용어는 약제 및 다른 화학물질 또느 sdiranf에 의해 유발된 간 손상을 의미한다. 피험체의 간 독성을 식별하는데 최상의 지시인자는, AST(아스파테이트 아미노트란스퍼라제), ALT(알라닌 아미노트란스퍼라제) 및 GOT(글루타메이트 옥살아세테이트 트란스아미나제)와 같은 혈액내 특정 효소 측정치의 상승이다.
간독성은 영구적인 손상 및 사망을 유발할 수 있다. 간독성의 초기 증후군은 급성 위장 증후군, 예를 들면 심한 설사를 포함할 수 있다. 간독성의 제2기는 증후군의 증상감소를 특징으로 한다. 이러한 뚜렷한 침강 동안 간 손상의 생화학적 증거가 나타난다. 요량감소증(소변 배출 감소)은 2기 동안 일반적이다. 명백한 간 손상 단계인 제3기는 화학물질의 소화 후 3 내지 5일 후 임상적으로 뚜렷해지고, 이와 하께 황달이 출현한다. 신부전 또한 일어날 수 있다. 화학적으로 유도된(약물 유도된) 간염의 증후군은 전염성 간염의 증후군과 유사하다. 한가지 양태에서, 본 발명의 방법은 간독성을 치료하는데 사용된다.
6. 간 기능상실 (예: 만성 간 기능상실)
종양 괴사 인자는 간 기능상실(예: 만성 간 기능상실)의 병태생리에 연루되어 있다(Takenaka et al, (1998) Dig Dis ScL 43:887; Nagaki et al. (1999) J Hepatol. 31:997; Streetz et al., (2000) Gastroenterology. 119:446). 만성 간 기능상실을 포함하는 간 기능상실은 보통 수년에 걸쳐 발달하고, 기관을 서서히 손상시키는 간에 반복 손상을 통해 유발된다(예: 알콜 남용 또는 간염 바이러스에 의한 감염). 덜 일반적이지만, 간 기능상실은 급성인 경우도 있고 수일 또는 수주 동안에 걸쳐 나타난다. 급성 간 기능상실의 원인에는 간염 바이러스 감염, 약물, 임신, 자가면역 질환 및 간으로 갑작스런 낮은 혈류가 있다. 한가지 양태에서, 본 발명의 방법은 간 기능상실을 치료하는데 사용된다.
7. 비알콜성 간염 (예: NASH )
종양 괴사 인자는 비알콜성 간염, 예를 들면 비알콜성 지방간염의 병태생리에 연루되어 있다(Crespo et al., (2001) Hepatology. 34: 1158; Pessayre et al.(2002) 282(2): G193). "비알콜성 지방간염" 또는 "NASH"란 용어는 고도한 알콜 섭취로 유도된 것과 비슷하지만 알콜 남용의 부재하에 일어난, 간의 조직학적 변화의 발달을 의미한다. NASH는 거대수포성 지방증 및/또는 미세수포성 지방증, 소엽 및 문맥 염증, 및 때로 섬유증 및 경화증을 보유한 말로리 소체를 특징으로 한다. NASH는 또한 고지질혈증, 비만 및 타입 II 진성당뇨병과 일반적으로 관련이 있다.
간 지방증 및 염증을 특징으로 하는 다른 임상 증상으로는 과도 절식, 공회장 바이패스, 완전비경구영양법, 만성 C형 간염, 윌슨씨병 및 코르티코스테로이드, 칼슘 채널 차단제, 고용량 합성 에스트로겐, 메토트렉세이트 및 아미오다론에 의한 것과 같은 약물 부작용을 포함한다. 즉, "비알콜성 지방간증"이란 용어는 (a) 유의적인 알콜 소비, (b) 과거 체중 감소를 수술, (c) 지방간증과 연관이 있는 약물의 이력, (d) 유전자 간 질환의 증거 또는 (e) 만성 C형 간염 감염과 연계된, 상기 생검 소견을 나타내는 환자를 설명하는데 사용될 수 있다(Ludwig et ah, (1980) Mayo Clin. Proc. 55:434; Powell et al. (1990) Hepatol. 11:74). 한가지 양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 항체는 NASH를 치료하는데 사용된다.
N. 피부 및 손발톱 장애
종양 괴사 인자는 피부 및 손발톱 장애의 병태생리에 연루되어 있다. 한가지 양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 항체는 피부 및 손발톱 장애를 치료하는데 투여된다. 본 명세서에서 호환 사용되는 "피부 장애" 또는 "피부 질병"이란 용어는 염증 상태가 유도된 피부의 상해 상처 외에 다른 이상을 의미한다. 한가지 양태에서, 본 발명의 피부 장애는 피부가 모세혈관 확장, 백혈구 침윤, 발적, 열 및/또는 통증을 특징으로 하는 염증성 피부 장애이다. 피부 장애의 예에는 건선, 심상성천포창, 공피증, 아토피성 피부염, 사르코이드증, 결절홍반, 화농땀샘염, 편평태선, 스위트 증후군 및 백반증이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 명세서에 사용된 "TNFα 할성이 유해한 피부 및 손발톱 장애"는 이 장애를 앓고 있는 피험체의 TNFα의 존재가 이 장애의 병태생리의 원인이거나 또는 이 장애, 예를 들면 건선의 악화에 기여하는 요인인 것으로 확인되었거나 또는 의심되는 기타 장애 및 피부 및/또는 손발톱 장애를 포함하는 것을 의미한다. 따라서, TNFα 활성이 유해한 피부 및 손발톱 장애는 TNFα 활성의 억제가 이 장애의 증후군 및/또는 진행을 경감시키는 것으로 예상되는 장애이다. 특정 피부 및 손발톱 장애의 치료에 사용되는 항체, 항체 부분 및 다른 TNFα 억제제의 용도에 대해서는 이하에 더 상세히 논의된다. 특정 양태에서, 본 발명의 치료 방법은 이하에 기술되는 다른 치료제와 함께 처치된다. 한가지 양태에서, TNFα 항체와 함께 다른 치료제를 투여하는 것을 포함하는 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 항체는 건선 치료 및 관절염과 연관 있는 건선 치료에 사용된다.
1. 건선
종양 괴사 인자는 건선의 병태생리에 연루되어 있다(Takematsu et al. (1989) Arch Dermatol Res. 281 :398; Victor and Gottlieb (2002; J Drugs Dermatol. 1 :264). 본 명세서에 사용된 "건선"이란 용어는 표피 증식증과 연관 있는 피부 장애를 의미한다. 건선의 예에는 만성 플라크 건선, 방울 건선, 역위 건선, 농포 건선, 심상성건선 및 홍피성 건선이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 건선은 또한 다른 염증 장애, 예를 들면 염증성 장 질환(IBD) 및 류마티스 관절염(RA)와 연관이 있을 수도 있다.
건선은 피부에 발적, 가려움증, 및 두껍고 건조한 은색 비늘의 빈번한 발작을 특징으로 하는 피부 염증(자극 및 발적)으로 설명된다. 특히, 표피 증식의 1차 및 2차 변화, 피부의 염증성 반응 및 림포카인 및 염증성 요인과 같은 조절 분자의 발현을 포함한 병변이 형성된다. 건선 피부는 표피 세포의 증가된 전환, 비후된 표피, 비정상적인 각질화, 표피 내로의 염증성 세포 침윤물, 및 기저 세포 주기에 있어서의 증가를 초래하는 표피 층내로의 다형핵 백혈구 및 림프구 침윤을 형태학적 특징으로 한다. 건선은 흔히 손발톱을 포함하며, 이는 흔히 함요, 손발톱의 분리, 비후화 및 탈색을 포함한다. 건선은 종종 다른 염증 질환, 예를 들면, 류마티스 관절염, 염증성 장 질환(IBD), 및 크론병과 관련되어 있다. 건선 환자중 대략 1/3은 또한 위에서 기술한 바와 같이 경직, 관절의 팽윤, 통증 및 감소된 운동범위를 유발하는 건선 관절염(PsA)을 보유한다[참조: Greaves et al. (1995) N. Eng. J. Med. 332:581].
건선의 증거는 몸통, 팔꿈치, 무릎, 두피, 피부 주름 또는 손톱에서 가장 일반적으로 관측되나, 이는 피부의 어떠한 또는 모든 부위에 영향을 미칠 수 있다. 일반적으로, 신규 피부 세포는 하부 층으로부터 표면으로 상향 이동하는데 약 1개월이 걸린다. 건선에서, 당해 과정은 단지 수일이 걸리며, 죽은 피부 세포의 축적 및 비후한 비늘(scale)의 형성을 초래한다. 건선의 증후군은, 건조 또는 적색이고, 은빛 비늘로 덮여있고, 피부 반을 융기시키며, 적색 경계를 동반하며, 균열이 질 수 있고 통증이 있을 수 있으며, 일반적으로 팔꿈치, 무릎, 몸통, 두피 및 손에 위치하는 피부 반(patch); 농포, 피부의 균열 및 피부 발적을 포함하는 피부 병변; 관절염, 예를 들면, 건선 관절염과 관련될 수 있는 관절 통증 또는 쑤심을 포함한다.
건선에 대한 치료는 흔히 국소 코르티코스테로이드, 비타민 D 유사체 및 국소 또는 경구 레티노이드, 또는 이의 조합물을 포함한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 TNFα 항체는 이들 일반적인 치료중 하나와 함께 또는 이들의 존재 하에 투여된다. 건선 치료용의 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 TNFα 억제제와 조합될 수 있는 추가의 치료제는 이하에서 더욱 상세히 기술한다.
건선의 진단은 일반적으로 피부의 외관에 기초한다. 또한, 피부 생검 또는 피부 반의 찰과 및 배양이 기타 피부 장애를 관리하기 위해 요구될 수 있다. x-선을 사용하여 관절 통증이 존재하고 지속되는 경우 건선 관절염에 대해 체크할 수 있다.
피험체내 건선에 있어서의 개선은 피험체의 건선 부위 및 중증도 지표 점수(PASI)로 모니터할 수 있다. PASI를 측정하기 위한 방법은 문헌[참조: Fredriksson 및 Pettersson (1978) Dermatologica 157:238 및 Marks et al (1989) Arch Dermatol 125:235]에 기술되어 있다. 요약하면, 당해 지표는 두부, 상지, 몸통 및 하지를 포함하는 4개의 해부학적 부위의 5점 규모를 사용하여 홍반, 경화 및 표피탈락에 대한 평가를 기초로 한다(0= 증상 없음; 1=약간; 2=중간; 3=현저; 4= 매우 현저). 제공된 해부학적 부위내 병변의 정도를 기초로 하여, 영향받은 부위를 수치로 지정한다(0=0; 1 = < 10%; 2 = 10-29%; 3 = 30-49%; 4 = 50-69%; 5 = 70-89%; 6 = 90-100%). PASI 점수를 이후에 계산하는데, 여기서, PASI 점수의 가능한 범위는 심각한 정도의 완전한 홍색피부증을 나타내는 최대 점수는 0.0 내지 72.0이다.
본 발명의 한가지 양태에서, TNFα 항체는 만성 판상 건선, 방울 건선, 역위 건선, 농포성 건선, 심상성 천포창, 홍피 건선, 염증성 장 질환(IBD)와 관련된 건선, 및 류마티스 관절염(RA)과 관련된 건선을 포함하는, 건선의 치료에 사용된다. 다른 양태에서, 아달리무맙과 같은 TNFα 항체는 PsA와 함께 건선이 있는 피험체를 치료하는데 사용된다. 본 발명의 치료 방법에 포함된 특정 유형의 건선은 하기에 상세히 기술한다:
a. 만성 판상 건선
종양 괴사 인자는 만성 판상 건선의 병태생리학과 연루되어 있다[참조: Asadullah et al. (1999) Br J Dermatol.141:94]. 만성 판상 건선(또한 심상성 건선으로도 언급됨)은 건선의 가장 일반적인 형태이다. 만성 판상 건선은 동전 크기에서부터 훨씬 더 큰 범위의 피부의 융기된 발적 반을 특징으로 한다. 만성 판상 건선에서, 플라크는 하나이거나 또는 다수일 수 있으며, 이들은 몇 밀리미터 내지 수 센티미터의 크기로 변할 수 있다. 플라크는 일반적으로 비늘 표면을 지닌 적색이고, 부드럽게 긁을 경우 빛을 반사하여 "은빛" 효과를 낸다. 만성 판상 건선 유래의 병변(이는 종종 대칭이다)은 신체상의 모두 곳에서 발생하지만 무릎, 팔꿈치, 요천골 영역, 두피 및 손발톱을 포함하는 강한 표면을 편애한다. 때때로 만성 판상 건선은 페니스, 외음 및 굽이에서 발생할 수 있으나, 비늘형성은 일반적으로 존재하지 않는다. 만성 판상 건선 환자의 진단은 일반적으로 하기 기술된 임상 특징을 기초로 하다. 특히, 만성 판상 건선에서 병변의 분포, 색상 및 대표적인 은빛 비늘형성은 만성 판상 건선의 특징이다.
b. 방울 건선
방울 건선은 물방울형 비늘 플라크를 특징으로 하는 건선의 형태를 말한다. 방울 건선의 발적은 일반적으로 감염, 대부분 현저하게는 스트렙토코커스 인후 감염을 수반한다. 방울 건선의 진단은 일반적으로 피부의 외관과, 종종 최근 인후통 병력이 있는지를 기준으로 한다.
c. 역위 건선
역위 건선은, 환자가 적색의 염증이 있는 피부의 부드럽고, 일반적으로 축축한 부위를 갖는 건선의 형태이며, 이는 판상 건선과 관련된 비늘형성과는 다르다. 역위 건선은 또한 인터티기너스(intertiginous) 건선 또는 자리바꿈 건선(flexural psoriasis)로 언급된다. 역위 건선은 대부분 겨드랑이, 샅고랑 부위, 유방밑 및 생식기와 엉덩이 주변의 기타 피부 겹침부 위에서 대부분 발생하며, 부위의 위치로 인하여, 문지름 및 발한이 영향받은 부위를 자극할 수 있다.
d. 농포성 건선
또한 손발바닥 건선으로 언급되는 농포성 건선은 크기 및 위치가 다양한 고름이-찬 물집을 유발하는 건선의 형태이나, 흔히 손 및 발에 발생한다. 물집은 신체의 많은 부위에 위치하거나 이들 부위에 분산될 수 있다. 농포성 건선은 압통 및 통증 둘다를 유발할 수 있으며, 열을 유발시킬 수 있다.
e. 기타 건선 장애
본 발명의 방법에 의해 수득된 TNFα 항체로 치료할 수 있는 건선 장애의 다른 예에는 홍피 건선, 사마귀, IBD와 관련된 건선, 및 류마티스 관절염을 포함하는 관절염과 관련된 건선을 포함한다.
2. 심상성 천포창
심상성 천포창은 경구 점막 및 피부에 흔히 영향을 미치는 심각한 자가면역 전신 피부병이다. 심상성 천포창의 발병기전은 피부 및 경구 점막 결합체에서 지시된 자가면역 과정인 것으로 고려된다. 결과적으로, 세포는 각각 서로 부착하지 않는다. 당해 장애는 다량의 유액이 충전된, 파열되는 경향의 수포로 표시되며, 명백한 조직학적 외관을 지닌다. 소염제가 고 치사율을 갖는 당해 질병에 대한 유일한 치료요법이다. 심상성 천포창으로 고생하는 환자에서 발생하는 합병증은 검출가능한 통증, 영양 및 유체 상실을 지닌 간섭 및 감염이다.
3. 아토피피부염/습진
아토피피부염(또한 습진으로 언급)은 비늘성 및 소양성 플라크로 범주화된 만성 피부 장애이다. 습진이 있는 사람은 흔히 천식, 건초열 또는 습진과 같은 알레르기 상태의 가족력을 지닌다. 아토피피부염은 피부에서 발생하는 과감작 반응(알레르기와 유사)이며, 만성 염증을 유발한다. 염증은, 피부가 가려워지고 비늘처럼 되게 한다. 만성 자극 및 긁음은 피부를 비후해지게 할 수 있고 가죽과 같은 감촉이 되도록 할 수 있다. 환경 자극에 대한 노출은 물, 온도 변화 및 스트레스에 대한 노출시 피부를 건조시키므로, 증상을 악화시킬 수 있다.
아토피피부염을 가진 피험체는 흔히 심한 소양, 진물 및 겉껍질, 피부 발적 또는 수포주변의 염증, 발진, 건조한, 가죽과 같은 피부 부위, 긁음로 인한 피부의 거친 부위 및 이루/출혈을 포함하는, 특정 증후군으로 확인될 수 있다.
4. 사르코이드증
사르코이드증은, 육아종 염증이 림프절, 폐, 간, 눈, 피부 및/또는 기타 조직에서 발생하는 질병이다. 사르코이드증은 피하 사르코이드증(피부의 사르코이드증) 및 결절 사르코이드증(림프절의 사르코이드증)을 포함한다. 사르코이드증을 지닌 환자는 흔히 일반적인 불쾌, 근심 또는 아픈 느낌; 열; 피부 병변을 포함하는 증상으로 확인될 수 있다.
5. 결절 홍반
결절 홍반은 피부하, 통상적으로 앞하지상의 압통, 적색 결절을 특징으로 하는 염증 장애를 말한다. 결절 홍반과 관련된 병변은 흔히 평편하지만 견고한, 선홍색의 고통스러운 덩어리(대략 1인치 직경)로 시작된다. 수일내에, 당해 병변은 엷은 자주빛으로 된 후, 수주 후에 갈색의 평편한 판이 된다.
일부 경우에, 결절 홍반은 스트렙토코커스, 콕시디오이도마이코시스, 투베르쿨로시스, B형 간염, 시필리스, 고양이 긁힘병, 야생토끼병, 예르시니아(yersinia), 렙토스피로시스 프시타코시스(leptospirosis psittacosis), 히스토플라스모시스(histoplasmosis), 모노뉴클레오시스(mononucleosis)(EBV)를 포함하는 감염과 관련이 있을 수 있다. 다른 경우에, 결절 홍반은 경구피임제, 페니실린, 설폰아미드, 설폰, 바르비투레이트, 하이단토인, 페나세틴, 살리사이클레이트, 요오다이드 및 프로게스틴을 포함하는 특정의 의약에 대한 민감성과 연관될 수 있다. 결절 홍반은 흔히 백혈병, 사르코이드증, 류미티스 열 및 궤양성 결장염과 관련이 있다.
결절 홍반의 증후군은 일반적으로 정강이 상에 자체로 존재하나, 병변들은 또한 엉덩이, 종아리, 발목, 대퇴부 및 상부 팔다리를 포함하는 신체의 다른 부위에서도 발생할 수 있다. 결절 홍반 환자에 있어서 다른 증후군은 열 및 권태감을 포함할 수 있다.
6. 화농땀샘염
화농땀샘염은, 팽윤되고 통증이 있는 염증성 병변 또는 덩어리가 샅고랑 부위 및 때때로 팔아래 및 유방 아래에 진행되는 피부 질병이다. 화농땀샘염은, 아포크린 선 배출구가 발한에 의해 차단되거나 불완전한 선 발달로 인하여 정상적으로 배출될 수 없는 경우 발생한다. 선내에 포착된 분비물은 발한 및 세균을 주변 조직으로 밀어내어, 피하 경화, 염증 및 감염을 유발한다. 화농땀샘염은 아포크린 샘을 함유하는 신체의 부위로 한정된다. 이들 부위는 겨드랑이, 유두의 젖꽃판, 샅고랑부위, 회음, 항문주위 및 배꼽주위 영역이다.
7. 편평태선
종양 괴사 인자는 편평태선의 병태생리에 연루되어 있다[참조: Sklavounou et al. (2000) J Oral Pathol Med. 29:370]. 편평태선은 염증, 소양증 및 뚜렷한 피부 병변을 초래하는 피부 및 점막의 질환을 말한다. 편평태선은 C형 간염 또는 특정 약제와 관련이 있을 수 있다.
8. 스위트 증후군(Sweet's syndrome)
종양 괴사 인자를 포함하는 염증성 사이토카인은 스위트 증후군의 병태생리에 연루되어 있다[참조: Reuss-Borst et al. (1993) Br J Haematol. 84:356]. 1964년 알. 이. 스위트(R.D. Sweet)에 의해 기술된 스위트 증후군은 열, 백혈구증가증 및 경피 발진의 갑작스러운 발병으로 특징화된다. 발진은 현미경적으로 농밀한 호중구 침윤물을 나타내는 압통, 홍반성, 잘-한정된 구진 및 플라크로 이루어진다. 이들 병변은 어디에서도 나타날 수 있으나, 얼굴을 포함하는 신체 상부를 선호한다. 개개의 병변은 흔히 슈도소포(pseudovesicular) 또는 슈도농포(pseudopustular)로 기술되나, 흔히 농포성, 물집성 또는 궤양성일 수 있다. 경구 및 눈 병발(결막염, 겉공막염)이 또한 스위트 증후군을 지닌 환자에서 흔히 보고되어 있다. 백혈병 또한 스위트 증후군과 관련되어 있다.
9. 백반증
백반증은 정상의 피부 감촉을 지닌 불규칙적인 백색 패치를 생성하는 피부 부위로부터의 색소가 상실된 피부 상태이다. 백반증의 특징적인 병변은 편평 탈색 부위로 여겨진다. 병변의 가장자리는 정의되나 불규칙적이다. 백반증이 있는 피험체에서 가장 영향받은 부위는 얼굴, 팔꿈치 및 무릎, 손 및 발, 및 생식기를 포함한다.
10. 공피증
종양 괴사 인자는 공피증의 병태생리에 연루되어 있다[참조: Tutuncu et al. (2002) Clin Exp Rheumatol. 20(6 Suppl 28):S146; Mackiewicz et al. (2003) Clin Exp Rheumatol. 21 :41; Murota et al. (2003) Arthritis Rheum. 48:1117]. 공피증은 피부, 혈관, 골격근 및 내부 기관에서의 변화로 특징화되는 광범위 결합 조직 질병을 말한다. 공피증은 또한 CREST 증후군 또는 진행성 전신 공피증으로 언급되며, 일반적으로 30 내지 50세의 사람들에게 영향을 미친다. 여성은 남성보다 더욱 흔히 영향을 받는다.
공피증의 원인은 알려져 있지 않다. 당해 질병은 국소 또는 전신계 증상을 생산할 수 있다. 당해 질병의 과정 및 중증도는 영향받는 것에 따라 광범위하게 변한다. 피부 및 기타 기관에서 과도한 콜라겐 침착은 당해 증상을 생성한다. 피부 및 영향받은 기관내 소 혈관에 대한 손상이 또한 일어난다. 피부에서, 궤양, 석회화, 및 색소침착에 있어서의 변화가 일어날 수 있다. 전신계적 특징은 섬유증 및 심장, 폐, 신장 및 위장관의 변성을 포함할 수 있다.
공피증으로 고생하는 환자는 열 및 냉기에 대한 반응시 손 및 발가락의 창백화, 푸름 또는 붉음, 손가락 및 관절의 통증, 경직 및 팽윤, 피부 비후화 및 빛나는 손 및 아래팔, 식도 역류 또는 가슴쓰림, 연하 어려움 및 숨참을 포함하는 특정의 임상적 특징을 나타낸다. 공피증을 진단하는데 사용된 기타 임상 증상은 상승된 적혈구 침강율(ESR), 상승된 류마티스 인자(RF), 양성 항핵 항체 시험, 단백질 및 현미경적 혈액을 보이는 요 검사, 섬유증을 나타낼 수 있는 흉부 X-선, 및 제한된 폐 질병을 나타내는 폐 기능 연구를 포함한다.
11. 손발톱 장애
손발톱 장애는 손발톱의 비정상을 포함한다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "손발톱 장애" 또는 "손발톱 질환"은, 손톱 또는 발톱이 비정상적인 색, 형태, 촉감 또는 두께로 되는 상태를 말한다. 특정의 손발톱 질환은 함요, 스푼형 손톱, 보우선(Beau's line), 손가락 손톱, 손발톱박리증, 황색 손발톱, 익상편(편평 태선에서 관측됨) 및 백색 손발톱을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 함요는 손발톱 표면상의 작은 함몰의 존재로 특징화된다. 능선 또는 선형 융기는 "길이" 또는 "가로" 방향으로 손발톱을 따라 발생하여 진행할 수 있다. 보우선은 손톱에서 "가로"(횡 방향) 방향으로 발생하는 직선 함몰이다. 백색 손발톱은 손발톱상의 백색 줄무늬 또는 점을 나타낸다. 스푼형손톱은 손톱의 비정상적인 유형이며, 여기서, 손발톱은 가장자리가 올라와서 오목하게 된다. 스푼형손톱은 흔히 철 결핍과 관련되어 있다.
본 발명의 TNFα 항체로 치료할 수 있는 손발톱 장애는 또한 건선 손발톱을 포함한다. 건선 손발톱은 건선에 기여할 수 있는 손발톱내 변화를 포함한다. 일부 경우에, 건선은 신체 다른 부위를 제외한 단지 손발톱에서만 발생할 수 있다. 손발톱에서 건선 변화는 약한 정도에서 중증으로 다양하며, 일반적으로 손발톱 판, 손발톱 매트릭스, 즉, 손발톱이 성장하는 조직, 손발톱 층, 늑, 손발톱아래 조직 및 손발톱 기저부 피부의 건선 연루 정도를 반영한다. 건선의 농포 유형에 의한 손발톱 층에 대한 손상은 손발톱 상실을 초래할 수 있다. 건선에서 손발톱 변화는 낱개로 또는 전부 발생할 수 있는 일반적인 범주에 속한다. 건선 손발톱의 하나의 범주에서, 손발톱 판은 건선에 의해 유발된 손발톱 성장에 있어서의 결손으로 인하여 깊게 함요된다. 다른 범주에서, 손발톱은 손발톱 층의 건선 연루로 인하여 황색 내지 황색-핑크색으로 탈색된다. 건선 손발톱의 제3 유형은 손발톱 판하에서 나타나는 백색 부위로 특징화된다. 백색 부위는 실제로 점을 표시하는 공기 거품이며, 여기서, 손발톱 판은 손발톱 층으로부터 박리되기 시작한다. 또한 손발톱 주변 피부는 적색이 될 수 있다. 제4 범주는 손발톱 매트릭스내 건선 연루로 인한 황색 피치내 손발톱 판의 부서짐, 즉 손발톱이상증에 의해 확인된다. 제5 범주는 손발톱 매트릭스 및 손발톱 층이 건선 연루로 인한 이의 실체내 손발톱의 결여로 특징화된다.
본 발명의 방법을 사용하여 수득한 항체는 또한 사용하여 편평태선과 관련된 손발톱 질환을 치료할 수 있다. 편평태선을 지닌 피험체에서 손발톱은 세로방향의 가장자리 또는 익상편과 함께 손발톱 판의 비후 및 표면 거칠음을 흔히 나타낸다.
본 발명을 사용하여 본원에 기술된 것과 같은 손발톱 질환을 치료할 수 있다. 흔히 손발톱 장애는 피부 장애와 관련되어 있다. 하나의 양태에서, 본 발명은 TNFα 항체를 사용한 손발톱 장애의 치료 방법을 포함한다. 다른 양태에서, 손발톱 장애는 건선과 같은 피부 장애를 포함하는 다른 장애와 관련되어 있다. 다른 양태에서, 손발톱 장애와 관련된 장애는 건선관절염을 포함하는 관절염이다.
12. 기타 피부 및 손발톱 장애
본 발명의 방법을 사용하여 수득한 항체는 만성 광선 피부염, 수포성 유천포창 및 원형탈모증과 같은 기타 피부 및 손발톱 질환을 치료하는데 사용할 수 있다. 만성 광선 피부염(CAD)는 또한 감광성 피부염/만성 활성 광선 과민 증후군(PD/ AR)으로 언급된다. CAD는, 피부, 특히 태양광 또는 인공 광에 노출된 부위에서 염증이 생기는 상태이다. 일반적으로, CAD 환자는 이들의 피부와 접촉하는 특정 물질, 특히 각종 꽃, 나무, 향, 선크림 및 고무 화합물에 대해 알레르기를 지닌다. 수포성 유천포창은 몸통 및 팔다리에 거대한 수포가 형성되는 것을 특징으로 하는 피부 질병을 말한다. 원형탈모증은 두피 및 수염에서 완전한 대머리의 원형 패치가 특징인 모발 손실을 말한다.
O. 맥관염
TNFα는 각종 맥관염의 병태생리에 연루되어 있다[참조: Deguchi et al. (1989) Lancet. 2:745]. 하나의 양태에서, 본 발명은 TNFα 활성이 유해한 혈관염으로 고생하는 피험체의 TNFα 활성을 억제하는 다회 가변 용량 방법을 제공한다.
본원에 호환 사용된 것으로서, 용어 "혈관염" 또는 "맥관염"은 혈관의 염증을 특징으로 하는 질환의 그룹을 말한다. 모든 크기의 혈관은 체내 가장 큰 혈관(대동맥)으로부터 피부에서 가장 작은 혈관(모세혈관)에 까지 영향을 미칠 수 있다. 영향받는 혈관의 크기는 혈관염의 특정 유형에 따라 변한다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "TNFα 활성이 유해한 혈관염"은, 당해 질환으로 고생하는 피험체내 TNFα의 존재가 질환의 병태생리 또는 질환의 악화에 기여하는 인자에 관여하는 것으로 밝혀지거나 관여하는 것으로 예측된 혈관염을 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 질환은 예를 들면, 질환으로 고생하는 피험체의 생물학저 유액중 TNFα의 농도의 증가(예: 피험체의 혈청, 혈장, 윤활액 등에서 TNFα 농도의 증가)에 의해 입증될 수 있으며, 이러한 증가는 예를 들면, 위에서 기술한 바와 같은 항-TNFα 항체를 사용하여 검출할 수 있다.
TNFα 활성이 유해한 혈관염은 베체트병을 포함하여 많은 예가 존재한다. 특정 맥관염을 치료하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 사용은 하기에 추가로 논의된다. 특정 양태에서, 본 발명을 사용하여 수득한 항체, 항체 부분은 하기 기술한 바와 같이 다른 치료제와 함께 피험체에게 투여된다.
본 발명을 사용하여 수득한 항체 또는 항체 부분은 또한 TNFα 활성이 유해한 혈관염을 치료하는데 사용할 수 있으며, 여기서, TNFα 활성의 억제는 혈관염의 증상 및/또는 진행을 완화시키거나 또는 혈관염을 예방하는 것으로 예측된다. 혈관염으로 고생하거나 이로 진행될 위험이 있는 피험체는 임상 증후군 및 시험을 통해 확인할 수 있다. 예를 들어, 맥관염을 지닌 피험체는 흔히 호중구의 세포질내 특정 단백질에 대한 항체, 항호중구 세포질 항체(ANCA)를 생성한다. 즉, 일부 경우에, 맥관염은 ANCA 존재를 측정하는 시험(예: ELISA)에 의해 확인할 수 있다.
혈관염 및 이의 예후는 질병의 단독 표시일 수 있거나, 또는 이는 다른 1차 질병의 2차 성분일 수 있다. 혈관염은 단일 기관으로 한정될 수 있거나 또는 몇몇 기관에 동시에 영향을 미칠 수 있고, 증상에 따라, 모든 크기의 동맥 및 혈관이 영향을 받을 수 있다. 혈관염은 체내 어떠한 기관에도 영향을 미칠 수 있다.
혈관염에서, 혈관 내강은 일반적으로 손상되며, 이는 관련 혈관에 의해 공급되는 조직의 허혈과 연관되어 있다. 이러한 과정으로부터 초래될 수 있는 광범위한 질환은, 혈관(예: 동맥, 정맥, 세동맥, 세정맥, 모세혈관)의 모든 유형, 크기 및 위치가 포함될 수 있다는 사실에 기인한다. 맥관염은 일반적으로 하기 기술하는 바와 같이, 이환된 혈관의 크기에 따라 일반적으로 분류된다. 일부 작고 큰 혈관의 맥관염은 중간-크기의 동맥을 수반할 수 있으나, 큰 및 중간-크기의 혈관 맥관염은 동맥보다 작은 혈관을 수반하지 않는다는 사실을 주목하여야 한다. 큰 혈관병은 또한 관자동맥염 또는 두개동맥염으로 또한 공지된 거세포 동맥염, 류마티스 다발 근육통증 및 다카야수병 또는 대동맥활증후군, 젊은 여성 동맥염 및 무맥병으로 또한 공지된 동맥염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 중간 혈관 질병은 전통적인 결절다발동맥염 및 점막피부 림프절 증후군으로서 또한 공지된 바와사키병을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 소 혈관병의 비-제한적 예는 베체트 증후군, 베그너 육아종증, 현미경적 여러혈관염, 피하 혈관염으로 또한 공지된 고감작성 혈관염, 작은 혈관 혈관염, 헤노호쉔라인 자색반, 알레르기 육아종증 및 또한 초그 스트라우스 증구군으로 공지된 혈관염이다. 기타 혈관염은 또한 폐쇄혈전혈관염으로 공지된 폐쇄성 혈전혈관염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 전통적인 결절다발동맥염(PAN), 현미경적 PAN, 및 알레르기성 육아종증이 또한 흔히 함께 그룹화되며 전신계 괴사 혈관염으로 불린다. 혈관염의 추가 기술은 하기 기술한다:
1. 거대 혈관 혈관염
하나의 양태에서, 본 발명을 사용하여 수득한 TNFα 항체는 거대 혈관 혈관염을 지닌 피험체를 치료하는데 사용될 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "거대 혈관(들)"은 대동맥 및 주요 신체 영역으로 뻗은 최대 분지를 말한다. 거대 혈관은 예를 들면, 대동맥을 포함하며, 이의 분지 및 상응하는 혈관, 예를 들어, 빗장밑동맥; 팔머리 동맥; 일반적인 목동맥; 무명 동맥; 내부 및 외부 목정맥; 폐 동맥 및 정맥; 대정맥; 신장 동맥 및 정맥; 넙다리 동맥 및 정맥; 및 목동맥을 포함한다. 거대 혈관 맥관염의 예는 하기에 기술한다.
a. 거세포 동맥염(GCA)
종양 괴사 인자는 거세포 동맥염의 병리생리학에 연관되어 있다[참조: Sneller (2002) Cleve. Clin. J. Med. 69:SII40;Schett et al. (2002) Ann. Rheum. Dis. 61 :463]. 거세포 동맥염(GCA)은 염증 및 혈관, 특히 목의 바깥 목동맥으로부터 분지된 거대 또는 중간 동맥에 대한 손상을 말한다. GCA는 또한 관자동맥염 또는 두개동맥염으로 언급되며 노인에 있어 가장 일반적인 일차적 혈관염이다. 이는 50세 이상의 개인에게 주로 가장 영향을 미치지만, 40세 및 그보다 젊은 환자의 경우도 잘 조사되어 있다. GCA는 바깥 목동맥에 일반적으로 영향을 미친다. GCA는 또한 관자 동맥을 포함하는 목 동맥의 분지에 영향을 미칠 수 있다. GCA는 또한 다수 위치에서 동맥을 포함할 수 있는 전신 질병이다.
조직학적으로, GCA는 흔히 랑게르한스 거대 세포 형성과 함께 혈관 벽내에 염증성 단핵 세포 침윤물을 지닌 전층동맥염이다. 내막의 증식, 육아종 염증 및 내부 엘라스틴 라미나의 단편화가 있다. 기관내 병리학적 발견은 포함된 혈관에 대한 허혈의 결과이다.
GCA로 고생하는 환자는 열, 두통, 빈혈, 고 적혈구 침강율(ESR)을 포함하는 특정의 임상 증상을 나타낸다. GCA의 다른 대표적인 지표는 턱 및 혀 절파행, 두피 압통, 체질 증상, 담색 시신경유두부종[특히, '찰키 화이트(chalky white)' 유두 부종] 및 시각 교란을 포함한다. 진단은 측두 동맥 생검으로 확인한다.
b. 류마티스 다발성 근육통
종양 괴사 인자는 류마티스 다발성 근육통의 병태생리에 연루되어 있다[참조: Straub et al. (2002) Rheumatology(Oxford) 41 :423; Uddhammar et al. (1998) Br. J. Rheumatol.37:7 766]. 류마티스 다발성 근육통은 대부분 아침에 인식가능한 심각한 근육 통증 및 목, 어깨 및 히프에서 경직에 대한 완화와 연관된, 류마티스 질환을 말한다. IL-6 및 IL-1β 발현은 또한 류마티스 다발성근육통을 지닌 환자에서 순환하는 단핵세포의 대부분에서 검출된다. 류마티스 다발성근육통은 별개로 발생할 수 있거나, 또는 혈관의 염증인 GCA와 동시에 또는 이에 앞서 존재할 수 있다.
c. 다카야스 동맥염(Takayasu's Arteritis)
종양 괴사 인자는 다카야스 동맥염의 병태생리에 연루되어 있다[참조: Kobayashi 및 Numano (2002) Intern. Med. 41 :44; Fraga 및 Medina (2002) Curr. Rheumatol. Rep .4:30]. 다카야스 동맥염은 대동맥 및 이의 주요 가지의 염증으로 특징화되는 혈관염을 말한다. 다카야스 동맥염(또한 대동맥활 증후군, 젊은 여성 혈관염 및 무맥병으로 공지됨)은 흉부 및 복부 대동맥 및 이의 주요 가지 또는 폐 동맥에 영향을 미친다. 대동맥 벽 및 이의 가지(예: 목 동맥, 무명 동맥 및 빗장밑 동맥)의 섬유성 비후는 대동맥 활로부터 발생하는 혈관의 관 크기의 감소를 초래한다. 당해 상태는 또한 통상적으로 신장 동맥에 영향을 미친다.
다카야스 동맥염은 주로 일반적으로 20 내지 40세의 젊은 여성, 특히 아시아 내림에 영향을 미치며, 권태감, 관절통 및 극심한 절뚝거림의 점진적인 개시에 의해 표시될 수 있다. 대부분의 환자는 비대칭적으로 감소한 맥박과 함께 일반적으로 팔에서 혈압 차를 지닌다. 관상 및/또는 신장 동맥 협착이 발생할 수 있다.
다카야스 동맥염의 임상 특징은 조기 염증 질병의 특징 및 말기 질병의 특징으로 분리될 수 있다. 다카야스 질병의 조기 염증 상태의 임상 특징은 권태감, 낮은 수준의 열, 체중 감소, 근육통 및 다형 홍반이다. 다카야스 질병의 말기 단계는 동맥의 섬유성 협착 및 혈전증으로 특징화된다. 주요 초래되는 임상 특징은 허혈성 현상, 예를 들면, 약하고 비대칭적인 동맥 맥박, 팔사이의 혈압 불일치, 시각 교란, 예를 들면, 스코토마타(scotomata) 및 반부전마비, 현기증 및 실신을 포함하는 기타 신경학적 특징, 반부전마비 및 뇌졸증이다. 임상적 특징은 동맥 협착 및혈전증으로 인한 허혈로부터 생성된다.
2. 중간 혈관 질병
하나의 양태에서, 본 발명의 TNFα 항체는 중간 혈관 혈관염을 지닌 피험체를 치료하는데 사용된다. 용어 "중간 혈관(들)"은 주요 내장 동맥인 혈액 혈관을 언급하는데 사용된다. 중간 혈관의 예는 창자간 동맥 및 정맥, 엉덩동맥 및 정맥, 및 위턱동맥 및 정맥을 포함한다. 중간 혈관 맥관염의 예는 하기 기술한다.
a. 결절다발동맥염
종양 괴사 인자는 결절다발동맥염의 병태생리에 연루되어 있다[참조: DiGirolamo et al. (1997) J. Leukoc. Biol. 61:667]. 결절다발동맥염 또는 결절동맥주위염은, 작은 및 중간 크기 동맥이 변이 면역 세포에 의해 공격받기 때문에 팽윤되어 손상을 입는 심각한 혈액 혈관 질병인 혈관염을 말한다. 결절다발동맥염은 일반적으로 어린이보다 더욱 특히 성인에 영향을 미친다. 이는 적절한 혈액 공급없이 충분한 산소와 영양물을 제공받지 못하므로 이환된 동맥에 의해 공급된 조직을 손상시킨다.
결절다발동맥염 환자에서 나타난 증후군은 일반적으로 이환된 기관, 흔히 피부, 심장, 신장 및 신경계에 대한 손상으로부터 초래된다. 결절다발동맥염의 일반 증상은 열, 피로, 쇠약, 식욕 상실 및 체중 감소를 포함한다. 근육 통증(근육통) 및 관절 통증(관절통)이 일반적이다. 결절다발동맥염 환자의 피부는 또한 발진, 팽윤, 궤양 및 종괴(결절성 병소)를 나타낼 수 있다.
전통적인 PAN(결절다발동맥염)은, 신장 및 내장 동맥의 병별이 일반적인 중간 근육 동맥염에 대한 전신계 동맥염이다. 복부 혈관은 PAN 환자중 50%에서 동맥류 및 폐색을 지닌다. 전통적인 PAN은, 비록 기관지 혈관이 포함될 수 있다고 해도 폐 동맥을 포함하지 않는다. 육아종, 현저한 호산구증가증 및 알레르기 체질은 증후군의 일부가 아니다. 어떠한 기관도 포함될 수 있다 해도, 대부분의 일반적인 표시는 말초 말초 신경병증, 다발홑신경염, 장 허혈, 신장 허혈, 고환 통증 및 그물울혈반을 포함한다.
b. 가와사키병(Kawasaki's Disease)
종양 괴사 인자는 가와사키병의 병태생리에 연루되어 있다[참조: Sundel (2002) Curr. Rheumatol. Rep. 4:474;Gedalia (2002) Curr. Rheumatol. Rep. 4:25]. 비록 가와사키병의 원인이 알려져 있지 않다고 해도, 이는 관상 동맥의 급성 염증과 관련되어 있으며, 이러한 질병과 관련된 조직 손상이 TNFα와 같은 전염증제에 의해 매개될 수 있음을 제안한다. 가와사키병은 점막, 림프절, 혈액 혈관의 내층 및 심장에 영향을 미치는 혈관염을 말한다. 가와사키병은 또한 점막피부림프절 증후군, 점막피부 림프절 질병 및 영아 다발동맥염으로 언급된다. 가와사키병으로 고생하는 피험체는 심근염 및 심장막염을 초래할 수 있는 관상 동맥을 흔히 포함하는 혈관염으로 진행된다. 흔히, 급성 염증이 감소되면서, 관상 동맥은 동맥류, 혈전증으로 진행될 수 있고, 심근 경색을 초래한다.
가와사키병은 경부림프절, 뒤꿈치 갈라짐 및 "딸기혀"의 확장과 함께 손바닥내 및 발의 발바닥내 부종과 연관되어 있다. 비록 염증 반응이 신체 전체 혈관에서 발견된다고 해도, 말기-기관 손상의 가장 일반적인 부위는 관상 동맥이다. 가와사키병은 주로 5세 이하의 어린이에게 영향을 미친다. 최대 발병은 일본에서 이지만 서방에서 증가하는 것으로 인지되어 있으며 현재 미국 어린이중 후천성 심장병의 주요 원인이다. 가와사키병의 가장 심각한 합병증은 관상 동맥 및 제3의 치료받지 않은 환자에서 발생하는 동맥류 형성이다.
3. 작은 혈관병
하나의 양태에서, TNFα 항체는 작은 혈관 혈관염을 지닌 피험체를 치료하는데 사용된다. 용어 "작은 혈관(들)"은 세동맥, 세정맥 및 모세관을 언급하는데 사용된다. 세동맥은 평활근 세포의 단지 1개 또는 2개 층을 함유하는 동맥이며 모세관 네트웍에 대해 말단 및 연속하여 존재한다. 세정맥은 혈액을 모세관 네트워그로부터 정맥 및 모세관 연결 세동맥 및 세정맥으로 이동한다. 작은 혈관 혈관염의 예는 하기에 기술한다.
a. 베체트병(Behcet's Disease)
종양 괴사 인자는 베체트 병의 병태생리에 연루되어 있다[참조: Sfikakis (2002) Ann. Rheum. Dis. 61 :ii51-3; Dogan 및 Farah (2002) Oftalmologia. 52:23]. 베체트병은 신체 전체의 혈관의 염증을 포함하는 만성 질환이다. 베체트병은 또한 각종의 피부 병변, 관절염, 장 염증 및 수막염(뇌 및 척수의 막의 염증)을 유발할 수 있다. 베체트병의 결과로서, 당해 질환을 가진 피험체는 위장관, 중추 신경계, 혈관계, 폐 및 신장을 포함하는 신체 전체의 조직 및 기관에 염증을 지닐 수 있다. 베체트병은 여성보다 남성에게 3배 더 일반적이며 동부 지중해 및 일본에서 더욱 일반적이다.
베체트병을 지닌 피험체는 재발성 경구 궤양(재발 아프타 구내염), 재발 생식기 궤양 및 눈 염증을 포함하는 임상 증상을 나타낼 수 있다. 베체트병 환자에서 TNFα, IL-8, IL-1, IL-6, INF-γ 및 IL-12의 혈청 수준은 상승하며, 이들 인자들의 생산은 베체트병 환자의 단핵구에서 상승하는 것으로 밝혀졌다[참조: Inflammatory Disease of Blood Vessels (2001) Marcel Dekker, Inc., eds. G.S. Hoffman 및 CM. Weyand, p. 473].
b. 베게너 육아종증
종양 괴사 인자는 베게너 육아종증의 병리생리학에 연관되어 있다[참조: Marquez et al. (2003) Curr. Rheumatol. Rep. 5:128; Harman 및 Margo (1998) Surv. Ophthalmol. 42:458]. 베게너 육아종증은 상부호흡관(코, 굴, 귀), 폐 및 신장에서 혈관의 염증을 유발하는 혈관염을 말한다. 베게너 육아종증은 또한 중간선 육아종증으로 언급된다. 베게너 육아종증은 호흡관을 포함하고, 작은 내지 중간 크기의 혈관에 영향을 미치는 혈관염을 괴사시키는 육아종증 염증을 포함한다. 베게너 육아종증을 지닌 피험체는 또한 관절염(관절 염증)을 지닌다. 육아종증은 또한 이환된 피험체에 존재할 수 있으나, 실질적으로 어떠한 기관도 포함될 수 있다.
베게너 육아종증에 걸린 환자는 통상적으로 재발성 굴염 또는 코피, 점막 궤양, 중이염, 기침, 객혈 및 호흡곤란을 포함하는 임상 증후군을 나타낸다. 베그너 육아종증의 제1 증상은 흔히 상부 호흡기관 증상, 관절 통증, 쇠약 및 피로를 포함한다.
c. 초그-스트라우스 증후군(Churg-Strauss syndrome)
종양 괴사 인자는 초그-스트라우스 증후군의 병태생리에 연루되어 있다[참조: Gross (2002) Curr. Opin. Rheumatol.14:11; Churg (2001) Mod. Pathol. 14:1284]. 초그-스트라우스 증후군은 전신계이며 천식 및 호산구증가증의 조기 표시를 나타내는 혈관염을 말한다. 초그-스트라우스 증후군은 또한 알레르기 육아종증 및 혈관염(angiitis)으로 언급되며, 알레르기 비염, 천식 및 호중구증가증의 고착시 발생한다. 굴염 및 폐 침윤이 또한 초그-스트라우스 증후군에서 발생되며, 주로 폐 및 심장에 영향을 미친다. 말초 신경병, 관상 동맥염 및 위장 연루가 일반적이다.
초그-스트라우스 증후군으로 고생하는 환자는 미국 대학의 류마티스학과(ACR)에 의해 설립된 범주에 따라 진단될 수 있다. 이들 범주는 CSS를 다른 형태의 혈관염으로부터 구별하기위해 의도되었다. 모든 환자가 매 범주에 부합되지는 않는다. 실제로 일부는 단지 2 또는 3개 범주만을 지닐 수 있으나, 이들은 여전히 초그-스트라우스 증후군으로 분류된다. ACR은 다른 혈관염으로부터 초그-스트라우스 증후군을 가장 잘 구별하는 것들로서 6개의 질병 특징(범주)를 선택한다. 이들 범주는 1) 천식; 2) 호중구증가증[차등 WBC 수에 있어서 > 10%]; 3) 단발신경병증; 4) 흉부 X-선에서 일시적인 폐 침윤물; 5) 부비동 이상; 및 6) 혈관외 호중구를 지닌 혈관을 함유하는 생검.
P. 기타 TNF α-관련 장애
하나의 양태에서, 본 발명은, TNFα 활성이 유해한 TNFα 관련 장애를 치료하기 위한 다회 가변 용량 방법으로서, 피험체에게 TNFα 항체를 투여함으로써 TNFα 관련 장애가 치료되도록 하는 것을 포함하는 방법을 특징으로 한다. TNFα 활성이 유해한 TNFα 관련 장애의 예는 하기에 추가로 논의한다.
1. 소아 관절염
종양 괴사 인자는 소아 류마티스관절염을 포함하는 소아 관절염의 병태생리에 연루되어 있다[참조: Grom et al. (1996) Arthritis Rheum. 39:1703; Mangge et al. (1995) Arthritis Rheum. 8:211]. 하나의 양태에서, 본 발명은 TNFα 항체는 소아 류마티스 관절염을 치료하는데 사용된다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "소아 류마티스 관절염" 또는 "JRA"는 관절 또는 결합 조직 손상을 유발할 수 있는 16세 이하에서 발생하는 만성의 염증 질병을 말한다. JRA는 또한 소아 만성 다발관절염 및 스틸씨병(Still's disease)으로 언급된다.
JRA는 16세 이하의 어린이에서 6주 이상 동안 관절 염증 및 경직을 유발한다. 염증은 관절내 발적, 팽윤, 온점 및 동통을 유발한다. 어떠한 관절도 영향받을 수 있으며, 염증은 영향받은 관절의 운동성을 제한할 수 있다. JRA의 하나의 유형은 또한 내부 기관에 영향을 줄 수 있다.
JRA는 흔히 관여된 관절의 수, 증상 및 혈액 검사에 의해 밝혀진 특정 항체의 존재 또는 부재에 의해 3개 유형으로 분류된다. 이러한 분류는 의사들이 내부 기관 또는 피부가 영향을 받는지 및 질병이 진행될 방식을 결정하는데 도움을 준다. JRA의 분류는 다음을 포함한다:
a. 소수관절성 JRA, 여기서, 환자는 영향받은 4개 이하의 관절을 지닌다. 소수관절은 JRA의 가장 일반적인 형태이며 통상적으로 무릎과 같은 큰 관절에 영향을 미친다.
b. 여러관절 HRA, 여기서, 5개 이상의 관절이 영향받는다. 손 및 발에서와 같은 작은 관절이 가장 통상적으로 포함되나, 질병은 또한 큰 관절에 영향을 미칠 수 있다.
c. 전신계 JRA는 관절 팽윤, 열, 약간의 피부 발진으로 특징화되며 또한 심장, 간, 비장 및 림프절과 같은 내부 기관에 영향을 미칠 수 있다. 전신계 JRA는 또한 스틸씨병으로 언급된다. 이들 어린이중 약간의 퍼센트는 많은 관절에서 관절염으로 진행되며 성인까지 지속되는 심각한 관절염을 지닐 수 있다.
2. 자궁내막증
종양 괴사 인자는 자궁내막증의 병태생리에 연루되어 있는데, 이는 자궁내막증을 지닌 여성에서 TNF의 복막내 수준이 상승하기 때문이다[참조: Eisermann et al. (1988) Fertil Steril 50:573; Halme (1989) Am J Obstet Gynecol 161:1718; Mori et al. (1991) Am J Reprod Immunol 26:62; .Taketani et al. (1992) Am J Obstet Gynecol 167:265; Overton et al. (1996) Hum Reprod 1996; 11 :380]. 하나의 양태에서, TNFα 항체는 자궁내막증을 치료하는데 사용된다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "자궁내막증"은 일반적으로 자궁(내막)에 정렬된 조직이 신체의 다른 부위에 서 성장하여, 통증, 불규칙적인 출혈 및 빈번한 유산을 유발하는 상태를 말한다.
3. 전립선염
종양 괴사 인자는 전립선염의 병태생리에 연루되어 있는데, 이는 만성 전립선염 및 골반 통증을 지닌 남성이 대조군과 비교하여 정액내 TNF 및 IL-1의 수준이 현저히 높기 때문이다[참조: Alexander et al. (1998) Urology 52:744; Nadler et al. (2000) J Urol 164:214; Orhan et al. (2001) Int J Urol 8:495]. 또한, 전립샘의 랫트 모델에서 TNF 수준은 또한 대조군과 비교하여 증가하였다[참조: Asakawa et al. (2001) Hinyokika Kiyo 47:459; Harris et al. (2000) Prostate 44:25]. 하나의 양태에서, 본 발명의 TNFα 항체는 전립선염을 치료하는데 사용된다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "전립선염"은 전립선의 염증을 언급한다. 전립선염은 또한 골반 통증 증후군으로 언급된다. 전립샘 자체는 비세균성 전립선염, 급성 전립선염, 세균성 전립선염 및 만성 전립선염을 포함하는 다양한 형태로 표시된다. 급성 전립선염은 갑자기 진행되는 전립선의 염증을 말한다. 급성 전립선염은 일반적으로 전립선의 세균 감염으로 유발된다. 만성 전립선염은 점진적으로 장기간 지속되어 진행되는 전립선의 염증이며 통상적으로 미묘한 증상을 갖는다. 만성 전립선염은 또한 일반적으로 세균 감염에 의해 유발된다.
4. 맥락막 혈관신생
종양 괴사 인자는 맥락막 혈관신생의 병태생리에 연루되어 있다. 예를 들어, 외과적으로 절개한 맥락막 신생혈관막에서, 신생혈관은 TNF 및 IL-1 둘다에 대해 양성으로 염색된다[참조:Oh H' et al. (1999) Invest Ophthalmol Vis Sci 40:1891]. 하나의 양태에서, TNFα 항체는 맥락막 혈관신생을 치료하는데 사용된다. 본원에 사용된 용어 "맥락막 혈관신생은 바닥복합층내 파열을 통해 맥락막으로부터 망막 색소 상피(sub-RPE) 또는 망막 공간으로 새로운 혈관이 성장하는 것을 말한다. 맥락막 혈관신생(CNV)는 이러한 상태의 환자에서 시각 상실의 주요 원인이다.
5. 좌골신경통
종양 괴사 인자는 좌골신경통의 병태생리에 연루되어 있다[참조: Ozaktay et al. (2002) Eur Spine J. 11 :467; Brisby et al.(2002) Eur Spine J. 11 :62]. 하나의 양태에서, 본 발명은 TNFα 항체는 좌골신경통을 치료하는데 사용된다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "좌골신경통"은 좌골 신경에 대한 손상으로 유발된 다리의 운동 및/또는 감각의 손상을 포함하는 상태를 말한다. 좌골신경통은 또한 좌골신경 및 좌골신경 기능장애의 신경병으로 일반적으로 언급된다. 좌골신경통은 말초 신경병의 형태이다. 이는 다리의 뒷쪽에 위치하는 좌골 신경에 손상이 있는 경우 발생한다. 좌골 신경은 무릎 및 다리 아래쪽의 뒷부분 근육을 조절하며 접다리의 뒷부분, 다리 아래쪽 부분 및 발의 발바닥에 감각을 제공한다. 좌골신경통은 또한 허리헤르니아 디스크, 척주관협착증, 변성 디스크 질병, 협부 척추전방전위증 및 만상증후군((piniformis syndrome)을 포함하는 다른 질환의 지표일 수 있다.
6. 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome)
종양 괴사 인자는 쇼그렌 증후군의 병태생리에 연루되어 있다[참조: Koski et al. (2001) CHn Exp Rheumatol. 19:131]. 하나의 양태에서, 본 발명의 TNFα 항체는 쇼그렌 증후군을 치료하는데 사용된다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "쇼그렌 증후군은 마른 입, 눈물 감소 및 기타 건조 점막이 특징인 전신계적 염증 질병이며, 흔히 류마티스 관절염과 같은 자가면역 류마티스 질환과 관련된다. 안구 및 입의 건조는 당해 증후군의 가장 일반적인 증상이다. 당해 증후군은 단독으로 일어나거나, 류마티스 관절염 또는 기타 결합 조직 질병과 연합한 증후군으로 발생할 수 있다. 타액선의 확장과 관련될 수도 있다. 기타 기관이 영향받을 수도 있다. 당해 증후군은 류마티스 관절염, 전신홍반루푸스, 공피증 및 기타 질병과 연관될 수 있다.
7. 포도막염
종양 괴사 인자는 포도막염의 병태생리에 연루되어 있다[참조: Wakefield 및 Lloyd (1992) Cytokine 4:1; Woon et al (1998) Curr Eye Res. 17:955]. 하나의 양태에서, 본 발명의 TNFα 항체는 포도막염을 치료하는데 사용된다. 본원에 사용된 것으로서 "포도막염"은 공막 및 망막사이의 층인 포도막의 염증을 말하며, 이는 홍채, 섬모체, 및 맥락막을 포함한다. 포도막염은 또한 일반적으로 홍채, 주변포도막염, 맥락막염, 맥락망막염, 급성앞포도막염 및 뒷쪽 포도막염으로 언급된다. 포도막염의 가장 일반적인 형태는 앞쪽 포도막염이며, 이는 안구의 앞쪽 부분에서의 염증을 포함하고, 일반적으로 홍채에 대해 분리된다. 당해 상태는 흔히 홍채염으로 명명된다. 하나의 양태에서, 용어, 포도막염은 자가면역 질환과 관련된 염증을 제외한, 예를 들면 자가면역 포도막염을 제외한, 포도막의 염증을 말한다.
8. 습윤 황반변성
종양 괴사 인자는 습윤 황반변성의 병태생리에 연루되어 있다. 하나의 양태에서, 본 발명은 TNFα 항체는 습윤 황반변성을 치료하는데 사용된다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "습윤 황반변성"은 황반(눈의 망막의 중심 부분)에 영향을 미치고 시력 감소 및 중심 시야의 가능한 상실을 유발한다. 습윤 황반병성을 지닌 환자는 망막아래에 새로운 혈관을 생성하며, 이는 출혈, 팽윤 및 흉터 조직을 유발한다.
9. 골다공증
종양 괴사 인자는 골다공증의 병태생리에 연루되어 있다[참조: Tsutsumimoto et al. (1999) J Bone Miner Res.14:1751]. 골다공증은 골 밀도의 점진적인 상실 및 골 조직의 비후로 특징되는 질환을 말한다. 골다공증은, 신체가 새로운 뼈를 충분히 형성하지 못하거나, 또는 보다 많은 오래된 뼈가 신체에 의해 재흡수되는 못하는 경우 둘다에서 발생한다. 본 발명의 TNFα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 골다공증을 치료하는데 사용된다.
10. 골관절염
종양 괴사 인자는 골관절염의 병태생리에 연루되어 있다[참조: Venn (1993) Arthritis Rheum. 36:819; Westacott et al. (1994) J Rheumatol. 21:1710]. 골관절염(OA)은 또한 비대 골관절염, 골관절염 및 퇴행성 관절 질병으로 언급된다. OA는 모든 연령의 성인에서 특정 관절, 흔히 무릎, 엉덩이, 손 관절 및 척추에 영향을 미치는 골격 관절의 만성 퇴행성 질환이다. OA는 "궤양" 또는 가장자리에서 골의 함몰, 골극 형성, 비대의 진행과 간련된 관절 연골의 퇴행 및 비후, 및 이환된 관절의 확장 및 윤활막내 변화를 포함하는 다수의 표시로 특징화된다. 또한, 골관절염은 특히 장기간의 활성후 통증 및 경직을 동반한다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 골관절염을 치료하는데 사용할 수 있다. 골관절염의 특징적인 방사선 특징은 관절 공간 협소화, 연골밑 경화, 골증식증, 연골밑 난 형성, 느슨한 골체[또는 "관절 마우스(joint mouse)"]를 포함한다.
골관절염을 치료하는데 사용된 의약은 광범위한 비스테로이드성, 소염 약물(NSAID)을 포함한다. 또한, COX2 억제제, 예를 들면, 셀레브렉스, 비옥스 및 벡스트라 및 에토리콕시브가 또한 OA를 치료하는데 사용된다. 관절내로 직접 주사되는 스테로이드를 또한 사용하여 염증 및 통증을 완화시킬 수 있다. 본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명의 TNFα 항체는 NSAID, COX2 억제제, 및/또는 스테로이드와 함께 투여된다.
11. 기타
본 발명의 방법은 또한 TNFα 활성이 유해한 각종의 다른 장애를 치료하는데 사용할 수 있다. TNFα 활성이 병태생리에 연루되어 있어, 본 발명의 항체, 또는 항체 부분을 사용하여 치료할 수 있는 다른 질병 및 장애의 예는 염증성 골 질환, 골 재흡수 질병, 응고 장애, 화상, 재관류 손상, 켈로이드 형성, 흉터 조직, 발열, 치주병, 비만, 방사선 독성, 노화 관련 악액질, 알츠하이머병, 뇌 부종, 염증성 뇌 손상, 암, 만성 피로 증후군, 피부근육염, 약물 반응, 예를 들면, 스티븐스-존슨 증후군(Stevens-Johnson syndrome) 및 야리시-헤륵스하이머 반응(Jarisch-Herxheimer reaction), 척수내 및/또는 주변의 부종, 주기적 가족열(familial periodic fevers), 펠티 증후군(Felty's syndrome), 섬유증, 사구체신염(예: 후-스트렙토코커스 사구체신염 또는 IgA 콩팥병증), 인공보철물의 이완, 현미경적 다발혈관염, 혼합된 결합 조직 질환, 다발골수종, 암 및 악액질, 다수 기관 질환, 골수이형성 증후군, 고환 뼈용해, 급성 및 만성을 포함하는 췌장염, 및 이자 고름집, 다발근육염, 진행성 신장 기능상실, 가성통풍, 괴저 농피증, 재발성 다발신경병증, 류마티스심장병, 사르코이드증, 경화쓸개관염, 뇌졸증, 흉복부대동 맥류복구(TAAA), TNF 수용체 관련 주기성 증후군(TRAPS), 황색열 백신화와 관련된 증후군, 귀와 관련된 염증병, 만성 귀 염증, 진주종과 함께 또는 단독이 만성 중이염, 소아 귀 염증, 골수증, 난소암, 직결장암, 치료요법 관련 유도된 염증 증후군(예: IL-2 투여후 증후군), 및 재관류 손상과 관련된 질환을 포함한다.
상기 언급한 TNFα 관련 질환 모두는 경우에 따라, 당해 질병의 성인 및 소아 형태 둘 다를 포함하는 것으로 이해된다. 또한 상기 질환 모두는 질병의 만성 및 급성 형태 둘 다를 포함하는 것으로 이해된다. 또한, 본 발명의 다회 가변 투여 방법을 사용하여 상기 언급된 TNFα 관련 질환 각각의 단독 또는 다른 질환을 함께 지닌 피험체, 예를 들면 포도막염과 루푸스로 고생하는 피험체를 치료하는데 사용할 수 있다.
추가적인 치료제
본 발명은 다회 가변 용량 방법을 사용하여 TNFα 관련 장애를 치료하는 약제학적 조성물, 및 이의 사용 방법에 관한 것이다. 약제학적 조성물은 TNFα 관련 장애를 예방하거나 억제하는 제1 제제를 포함한다. 약제학적 조성물 및 사용 방법은 활성 약제학적 성분이 제2 제제를 포함할 수 있는데; 즉 제2 제제는 치료제이고 이의 작용은 약제학적 담체, 방부제, 희석제 또는 완충제와 같은 불활성 성분의 작용을 능가한다. 제2 제제는 TNFα-관련 질환을 치료 또는 예방하는데 유용할 수 있다. 제2 제제는 표적 질병과 연관된 하나 이상의 증상을 소멸시키거나 치료할 수 있다. 제1 및 제2 제제는 유사하거나 관련되지 않은 작용 메카니즘에 의해 자체의 생물학적 효과를 발휘할 수 있거나; 또는 하나 또는 둘다의 제1 및 제2 제제가 다수의 작용 메카니즘에 의해 자체의 생물학적 효과를 발휘할 수 있다. 약제학적 조성물은 심지어, 제3(및 제4 등) 화합물이 제2 제제와 동일한 특성을 지니는 경우에도 제3 화합물 또는 심지어 그 이상의 화합물을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 약제학적 조성물은 동일한 약제학적으로 허용되는 담체 또는 상이한 약제학적으로 허용되는 담체 중에 각각의 기술된 양태를 위해 제1 및 제2, 제3 또는 추가의 제제를 가질 수 있음을 이해하여야 한다. 제1, 제2, 제3 및 추가의 제제를 기술한 양태 내에서 동시에 또는 연속적으로 투여할 수 있음을 또한 이해하여야 한다. 달리는, 제1 및 제2 제제는 동시에 투여되고, 제3 또는 추가의 제제는 처음 2개의 제제 전 또는 후에 투여될 수 있다.
본원에 기술된 방법 및 약제학적 조성물내에서 사용된 제제의 조합은 치료를 위해 표적된 상태(들) 또는 질병(들)에 치료학적인 추가 또는 상승 효과를 지닐 수 있다. 본원에 기술된 약제학적 조성물 또는 방법내에서 사용된 제제들의 조합은 또한 단독으로 또는 특정의 약제학적 조성물의 다른 제제(들)의 부재하에 투여되는 경우 하나 이상의 제제와 연합된 유해 효과를 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 하나의 제제의 부작용의 독성은 조성물의 다른 제제에 의해 약화될 수 있으므로, 보다 높은 용량, 개선된 환자 순응도 및 개선된 치료학적 결과를 허용한다. 조성물의 부가적 또는 상승 효과, 잇점 및 장점은 구조적 또는 작용 부류이던 치료제의 부류에 또는 개개의 화합물 자체에 적용된다.
보충 활성 화합물이 또한 조성물내로 혼입될 수 있다. 특정의 양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 부위는 TNFα 활성이 유해한 TNFα 관련 질환을 치료하는데 유용한 하나 이상의 추가의 치료제와 공제형화되고/되거나 공투여된다. 예를 들어, 본 발명의 항-hTNFα 관련 항체, 항체 부분 또는 기타 TNFα 억제제는 다른 표적물에 결합하는 하나 이상의 추가의 항체(예: 다른 사이토카인과 결합하거나 세포 표면 분자와 결합하는 항체), 하나 이상의 사이토카인, 가용성 TNFα 수용체(참조: PCT 공보 번호 제WO 94/06476호) 및/또는 TNFα 생산 또는 활성을 억제하는 하나 이상의 화학제(예: PCT 공보 번호 제WO 93/19751호에 기술된 사이클로헥산-일리덴 유도체)와 공제형화되고/되거나 공투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 하나 이상의 항체 또는 기타 TNFα 억제제는 2개 이상의 상기한 치료제와 함께 사용될 수 있다. 이러한 배합 치료요법은 투여된 치료제의 보다 적은 용량을 사용할 수 있어 각종 단독치료요법과 연관된 가능한 독성 또는 합병증을 피할 수 있어 바람직하다. 특정 치료제(들)은 일반적으로 하기 논의된 바와 같이, 치료되는 특정 TNFα 관련 질환을 기초로 하여 선택된다.
본 발명의 다회 가변 용량 방법에서 항체, 항체 부분 또는 기타 TNFα 억제제와 배합될 수 있는 치료제의 비제한적 예는 다음을 포함한다: 비-스테로이드 소염 약물(들)(NSAIDs); 사이토카인 억제 소염 약물(들)(CSAIDs); CDP-571/BAY-10- 3356[사람화된 항-TNFα 항체; 셀테크/바이엘(Celltech/Bayer) 제조원]; cA2/인플릭시맙[키메릭 항-TNFα 항체; 센토코르(Centocor) 제조원]; 75kd TNFR-IgG/에타네르셉트[75kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질; 임뉴넥스(Immunex) 제조원; 참조: Arthritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, S295; J. Invest. Med. (1996) Vol. 44, 235A]; 55kd TNF-IgG[55 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질; 호프만-라로슈(Hoffmann-LaRoche) 제조원]; IDEC-CE9.1/SB 210396[비-고갈 영장류화된 항-CD4 항체; IDEC/스미쓰클라인(SmithKline) 제조원; 참조: Arthritis & Rheumatism (1995) Vol. 38, S185]; DAB 486-IL-2 및/또는 DAB 389-IL-2[IL-2 융합 단백질; 세라젠(Seragen) 제조원; 참조: Arthritis & Rheumatism (1993) Vol. 36, 1223]; 항-Tac[사람화된 항-IL-2Rα; 단백질 디자인 랩스/로슈(Protein Design Labs/Roche) 제조원]; IL-4 (소염 사이토카인; DNAX/쉐링(Schering) 제조원]; IL-IO (SCH 52000; 재조합 IL-10, 소염 사이토카인; DNAX/쉐링 제조원); IL-4; IL-10 및/또는 IL-4 효능제(예: 효능제 항체); IL-IRA[IL-I 수용체 길항제; 시너젤/암젠 (Synergen/Amgen) 제조원]; 아나킨라(Kineret®/암젠 제조원); TNF-bp/s-TNF[가용성 TNF 결합 단백질; 참조: Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S284; Amer. J. Physiol. - Heart and Circulatory Physiology (1995) Vol. 268, pp. 37-42]; R973401[포스포디에스테라제 제IV형 억제제; 참조: Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S282]; MK-966 (COX-2 억제제; 참조: Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S81]; 일로프로스트[참조: Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S82]; 메토트렉세이트; 탈리도마이드[참조: Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S282] 및 탈리도마이드-관련 약물(예: 켈젠); 레플루노마이드[소염제 및 사이토킨 억제제; 참조: Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S131; Inflammation Research (1996) Vol. 45., pp. 103-107]; 트라넥사민산[플라스미노겐 활성화 억제제; 참조: Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S284]; T-614 [사이토킨 억제제; 참조: Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S282]; 프로스타글란딘 El[참조: Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S282]; 테니댑[비스테로이드성 소염 약물; 참조: Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S280]; 나프록센[비-스테로이드성 소염 약물; 참조: Neuro Report (1996) Vol. 7, pp. 1209-1213]; 멜록시캄(비-스테로이드성 소염 약물); 이부프로펜(비스테로이드성 소염 약물); 피록시캄(비-스테로이드성 소염 약물); 디클로페낙(비스테로이드성 소염 약물); 인도메타신(비-스테로이드성 소염 약물); 술파살라진[참조: Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S281]; 아자티오프린[참조: Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S281]; ICE 억제제(인터루킨-lβ 전환 효소의 억제제); zap-70 및/또는 lck 억제제 (타이로신 키나제 zap-70 또는 lck의 억제제); VEGF 억제제 및/또는 VEGF-R 억제제 (혈관 내피세포 성장 인자 또는 혈관 내피세포 성장 인자 수용체 억제제; 혈관형성 억제제); 코르티코스테로이드 소염 약물{예: SB203580); TNF-콘버타제 억제제; 항-IL-12 항체; 항-IL-18 항체; 인터루킨-11[참조: Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S296]; 인터루킨-13[참조: Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S308]; 인터루킨-17 억제제[참조: Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S120]; 금; 페니실아민; 클로로퀸; 하이드록시클로로퀸; 클로람부실; 사이클로스포린; 사이클로포스파미드; 총 림프구 자극; 항-티로사이트 글로불린; 항-CD4 항체; CD5-독소; 경구-투여된 펩타이드 및 콜라겐; 로벤자리트 이나트륨; 사이토킨 조절제(CRAs) HP228 및 HP466[오프턴 파마슈티칼즈, 인코포레이티드(Houghten Pharmaceuticals, Inc.) 제조원]; ICAM-I 안티센스 포스포티오에이트 올리고데옥시뉴클레오타이드[ISIS 2302; 아이시 스 파마슈티칼즈, 인코포레이티드(Isis Pharmaceuticals, Inc.) 제조원]; 가용성 상보체 수용체 1[TPlO; T 세포 사이언스, 인코포레이티드(Cell Sciences, Inc.) 제조원]; 프레드니손; 오르고테인; 글리코사미노글리칸 폴리설페이트; 미노사이클린; 항-IL2R 항체; 마린 및 식물 지질[어류 및 식물 종자 지방산; 참조: DeLuca et al. (1995) Rheum. Dis. Clin. North Am. 21:759-777]; 아우라노핀; 페닐부타존; 메클로페남산; 플루페남산; 정맥내 면역 글로불린; 질레우톤; 아자리빈; 마이코페놀산(RS-61443); 타크롤리무스(FK-506); 시롤리무스(라파마이신); 아미프리로즈(테라펙틴); 클라드리빈(2-클로로데옥시아데노신); 메토트렉세이트; 항바이러스제; 및 면역 조절제. 상술한 제제중 어느 제제도 본 발명의 TNFα 항체와 함께 본 발명의 다회 가변 용량 또는 1회 용량 방법을 사용하여 TNFα 관련 장애를 치료하는데 투여될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명의 TNFα 항체는 본 발명의 다회 가변 용량 방법을 사용하여 류마티스 관절염을 치료하기 위한 다음 제제 중 하나와 함께 투여된다: KDR의 소 분자 억제제(ABT- 123), Tie-2의 소 분자 억제제; 메토트렉세이트; 프레드니손; 셀레콕시브; 엽산; 하이드록시클로로퀸 설페이트; 로페콕시브; 에타네르셉트; 인플릭시맙; 아나킨라(Kineret®/암젠 제조원); 레플루노마이드; 나프록센; 발데콕시브; 설파살라진; 이부프로펜; 메틸프레드니솔론; 멜록시캄; 메틸프레드니솔론 아세테이트; 금 나트륨 티오말레이트; 아스피린; 아자티오프린; 트리암시놀론 아세토나이드; 프록시펜 납실레이트/아파프; 폴레이트; 나부메톤; 디클로페낙, 피록시캄; 에토돌락; 디클로페낙 나트륨; 옥사프로진; 옥시코돈 hcl; 하이드로코돈 비타르트레이트/아파크/ 디클로페낙 나트륨/미소프로스톨; 페타닐; 아나킨라, 사람 재조합; 트라마돌 hcl; 살살레이트; 술린닥; 시아노코발라민/fa/피리독신; 아세트아미노펜; 알렌드로네이트 나트륨; 프레드니솔론; 모르핀 설페이트; 리도카인 하이드로클로라이드; 인도메타신; 글루코사민 설페이트/콘드로이틴; 사이클로스포린; 설파디아진; 아미트립틸린 hcl; 옥시코돈 hcl/아세트아미노펜; 올로파타딘 hcl; 미소프로스톨; 나트록센 나트륨; 오메프라졸; 마이코페놀레이트 포페틸; 사이클로포스파미드; 리툭시맙, IL-1 TRAP; MRA; CTLA4-IG; IL-18 BP; ABT-874; ABT-325 (항-IL 18); 항-IL 15; BIRB-796; SCIO-469; VX-702; AMG-548; VX-740; 로플루밀라스트; IC-485; CDC-801; 및 메소프람. 다른 양태에서, 본 발명의 TNFα 항체는 류마티스 관절염을 치료하기 위한 상기 언급한 제제 중 하나와 함께 TNFα 관련 장애를 치료하기 위한 다회 가변 용량 방법을 사용하여 투여한다. 다른 양태에서, 상기 언급한 추가의 제제는 본 발명의 1회 용량 방법에서 TNFα 항체와 함께 사용된다.
하나의 양태에서, 본 발명의 TNFα 항체는 TNFα 활성이 유해한 TNFα 관련 장애를 치료하기 위한 하기 제제 중 하나와 함께 다회 가변 용량 요법을 사용하여 투여한다: 항-IL12 항체 (ABT 874); 항-IL18 항체 (ABT 325); LCK의 소 분자 억제제; COT의 소 분자 억제제; 항-IL 1 항체; MK2의 소 분자 억제제; 항-CD 19 항체; CXCR3의 소 분자 억제제; CCR5의 소분자 억제제; CCR11 항-E/L 셀렉틴 항체; P2X7의 소 분자 억제제; IRAK-4의 소 분자 억제제; 글루코코르티코이드 수용체의 소 분자 효능제; 항-C5a 수용체 항체; C5a 수용체의 소 분자 억제제; 항-CD32 항체; 및 치료 단백질로서의 CD32.
다른 양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 TNFα 항체는 항생제 또는 항감염제와 함께 다회 가변 용량 요법을 사용하여 투여한다. 항감염제는 바이러스, 진균, 기생충 또는 세균 감염을 치료하기 위해 당해 분야에 공지된 제제를 포함한다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "항생제"는 미생물의 성장을 억제하거나, 미생물을 사멸시키는 화학 물질을 말한다. 당해 용어에는 미생물에 의해 생산된 항생제, 및 당해 분야에 공지된 합성 항생물질(예: 유사체)을 포함한다. 항생물질은 클라리트로마이신(Biaxin®), 키프로플록사신(Cipro®), 및 메트로니다졸(Flagyl®)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
다른 양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 TNFα 항체는 좌골신경통 또는 통증을 치료하기 위한 추가의 치료제와 배합된 다회 가변 용량 요법을 사용하여 투여한다. 좌골신경통 또는 통증을 감소시키거나 억제하는데 사용할 수 있는 제제의 예는 하이드로코돈 비타르트레이트/아파프, 로페콕시브, 사이클로벤자프린 hcl, 메틸프레드니솔론, 나프록센, 이부프로펜, 옥시코돈 hcl/아세트아미노펜, 셀레콕시브, 발데콕시브, 메틸프레드니솔론 아세테이트, 프레드니손, 코데인 포스페이트/아파프, 트라마돌 hcl/아세트아미노펜, 메탁살론, 멜록시캄, 메토카르바몰, 리도카인 하이드로클로라이드, 디클로페낙 나트륨, 가바펜틴, 덱사메타손, 카리소프로돌, 케토롤락 트로메타민, 인도메타신, 아세트아미노펜, 디아제팜, 나부메톤, 옥시코돈 hcl, 티자니딘 hcl, 디클로페낙 나트륨/미소프로스톨, 프로폭시펜 납실레이트/아파프, 아사/옥시코드/옥시코돈 테르, 이부프로펜/하이드로코돈 비트, 트라마돌 hcl, 에토돌락, 프로폭시펜 hcl, 아미트립틸린 hcl, 카리소프로돌/코데인 포스/아사, 모르핀 설페이트, 멀티비타민, 나프록센 나트륨, 오르페나드린 시트레이트, 및 테마제팜을 포함한다.
다른 양태에서, TNFα 관련 질환은 혈액투석과 함께 본 발명을 사용하여 수득한 TNFα 항체를 사용하여 치료한다.
다른 양태에서, 본 발명을 사용하여 수득한 TNFα 항체는 본 발명의 다회 가변 용량 요법에서 크론병 또는 크론 관련 질환을 치료하는데 사용된 약물과 함께 사용된다. 크론병을 치료하는데 사용될 수 있는 치료제의 예는 메살라민, 프로드니손, 아자티오프린, 머캅토퓨린, 인플릭시맙, 부데소나이드, 설파살라진, 메틸프레드니솔론 나트륨 석시네이트, 디페녹실레이트/아트로프 설프, 로페라미드 하이드로클로라이드, 메토트렉세이트, 오메프라졸, 폴레이트, 시프로플록사신/덱스트로즈-물, 하이드로코돈 비타르트레이트/아파프, 테트라사이클린 하이드로클로라이드, 플루오키노나이드, 메트로니다졸, 티메로살/붕산, 효스시아민 설페이트, 콜레스티라민/슈크로즈, 시프로플록사신 하이드로클로라이드, 메페리딘 하이드로클로라이드, 미다졸람하이드로클로라이드, 옥시코돈 hcl/아세트아미노펜, 프로메타진 하이드로클로라이드, 나트륨 포스페이트, 설파메톡사졸/트리메토프림, 셀레콕시브, 폴리카르보필, 프로폭시펜 납실레이트, 하이드로코르티손, 멀티비타민, 발살라자이드 이나트륨, 코데인 포스페이트/아파프, 콜레세벨람 hcl, 시아노코발라민, 엽산, 레보플록사신, 나탈리주맙, 메틸프로드니솔론, 인터페론-감마, 및 사르그라모스틴(GM-CSF)를 포함한다. 하나의 양태에서, 메토트렉세이트는 주당 2.5mg 내지 30mg 의 투여량으로 크론병의 치료를 위해 투여된다.
다른 양태에서, TNFα 항체는 본 발명의 다회 가변 용량 요법에서 천식을 치료하기 위한 추가의 치료제와 함께 투여된다. 천식 증상을 완화시키거나 억제하는데 사용할 수 있는 제제의 예는 다음을 포함한다: 알부테롤; 살메테롤/플루티카손; 나트륨, 플루티카손 프로피오네이트; 부데소나이드; 프레드니손; 살메테롤 크시나포에이트; 레발부테롤 hcl; 설페이트/이프라트로피움; 프레드니솔론 나트륨 포스페이트/ 트리암시놀론 아세토나이드; 베클로메타손 디프로피오네이트; 이프라트로피움 브로마이드; 아지트로마이신; 피르부테롤 아세테이트; 프레드니솔론, 테오필린 무수물; 자피를루카스트; 메틸프레드니솔론 나트륨 석시네이트; 클라리트로마이신; 포르모테롤 푸마레이트; 인플루엔자 바이러스 백신; 메틸프로드니솔론; 트리하이드레이트; 알레르기 주사; 크로몰린 나트륨; 세프프로질; 펙소페나딜 하이드로클로라이드; 플루니솔라이드/멘톨; 레보플록사신; 아목실린/클라불라네이트, 흡입 보조 장치, 구아니페네신, 덱사메타손 나트륨 포스페이트; 목시플록사신 hcl; 하이클레이트; 구아니페네신/d-메토르판; 갈티플록사신; 페페드린/코드/클로르페니르; 세티리진 하이드로클로라이드; 모메타손 푸로에이트; 살메테롤 크시나포에이트; 벤조나테이트; 셀팔렉신; 페/하이드로코돈/클로르페니르; 세티리진 hcl/슈도에페드; 페닐에프린/코드/프로메타진; 코데인/프로메타진; 플루니솔라이드; 덱사메타손; 구아이페네신/슈도에페드린; 클로르페니라민/하이드로코돈; 네도크로밀 나트륨; 테르부탈린 설페이트; 에피네프린 및 메틸프로드니솔론, 메타프로테레놀 설페이트.
다른 양태에서, 본 발명의 TNFα 항체는 COPD를 치료하기 위한 추가의 치료제와 함께 투여된다. COPD의 증상을 완화시키거나 억제하는데 사용할 수 있는 제제의 예는 알부테롤 설페이트/이프라트로피움; 이프라트로피운 브로마이드; 살메테롤/플루티카손; 알부테롤; 살메테롤, 크시나포에이트/ 플루티카손 프로피오네이트; 프레드니솔; 테오필린 무수물; 레보플록사신; 메틸프레드니솔론 나트륨 석시네이트; 몬텔루카스트 나트륨; 부데소나이드; 포르모테롤 푸마레이트; 트리암시놀론 아세토나이드; 구아이페네신; 아지트로마이신; 베클로메타손; 디프로피오네이트; 레발부테롤 hcl; 플루니솔라이드; 나트륨, 트리하이드레이트; 가티플록사신; 카피를루카스트; 푸로에이트; 아목시실린/클라불라네이트; 플루니솔라이드/멘톨; 클로르페니르아민/하이드로코돈; 메타프로테레놀 설페이트; 메틸프레드니솔론; 에페드린/코드/클로프페니르; 피르부테롤 아세테이트; -에페드린/로라타딘; 테르부탈린 설페이트; 티오프로피움 브로마이드; (R,R)-포르모테롤; TgAAT; 실로밀라스트 및 로플루밀라스트를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명의 TNFα 항체는 IPF를 치료하기 위한 추가의 치료제와 함께 투여한다. IPF의 증상을 완화시키거나 억제하는데 사용할 수 있는 제제의 예는 프레드니손; 아자티오프린; 알부테롤; 콜치킨; 설페이트; 디곡신; 감마 인터페론; 메틸프레드니솔론 나트륨 석시네이트; 푸로세마이드; 리시노프릴; 니트로글리세린; 스피로놀락톤; 사이클로포스파미드; 이프라트로피움 브로마이드; 악티노마이신 d; 알테플라제; 플루티카손 프로피온네이트; 레보플록사신; 메타프로테레놀 설페이트; 모르핀 설페이트; 옥시코돈 hcl; 염화나트륨; 트리암시놀론 아세토나이드; 타크로리무스 무수물; 칼슘; 인터페론-알파; 메토트렉세이트; 마이코페놀레이트 모페틸을 포함한다.
본 발명의 하나의 양태에서, TNFα 항체는 척추관절병증을 치료하는데 일반적으로 사용되는 제제와 함께 투여된다. 이러한 제제의 예는 비스테로이드성, 소염 약물(NSAIDs), COX2 억제제, 예를 들면, Celebrex®, Vioxx®, 및 Bextra®, 및 에토리콕시브를 포함한다. 물리치료는 일반적으로 비-스테로이드성 염증 약물과 함께 척추관절병증을 치료하는데 일반적으로 사용된다.
다른 양태에서, 본 발명의 TNFα 항체는 강직성 척추염을 치료하기 위한 추가의 치료제와 함께 투여된다. 강직성 척추염의 증상을 완화시키거나 억제하는데 사용할 수 있는 제제의 예는 이부프로펜, 디클로페낙 및 미소프로스톨, 나프록센, 멜록시캄, 인도메타신, 디클로페낙, 셀레콕시브, 로페콕시브, 설파살라진, 프로드니손, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 미노사이클린, 프레드니손, 에타네르셉트 및 인플릭시맙을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명의 TNFα 항체는 건선 관절염을 치료하기 위한 추가의 치료제와 함께 투여된다. 건선 관절염의 증상을 완화시키거나 억제하는데 사용될 수 있는 제제의 예는 메토트렉세이트; 에타네르셉트; 로페콕시브; 셀레콕시브; 엽산; 설파살라진; 나프록센; 레플루노마이드; 메틸프로드니솔론 아세테이트; 인도메타신; 하이드록시클로로퀸 설페이트; 술린닥; 프레드니솔; 증강된 베타메타손 디프로프; 인플릭시맙; 메토트렉세이트; 폴레이트; 프리암시놀론 아세토나이드; 디클로페낙; 디메틸설폭사이드; 피록시캄; 디클로페낙 나트륨; 케토프로펜; 멜록시캄; 프레드니손; 메틸프레드니솔론; 나부메톤; 톨메틴 나트륨; 칼시포트리엔; 사이클로스포린; 디클로페낙; 나트륨/미소프로스톨; 플루오시노나이드; 글루코사민 설페이트; 금 나트륨 티오말레이트; 하이드로코돈; 비타르트레이트/아파프; 이부프로펜; 리세드로네이트 나트륨; 설파디아진; 티오구아닌; 발데콕시브; 알레파셉트; 및 에팔리주맙을 포함한다.
하나의 양태에서, TNFα 억제제는 본 발명의 다회 가변 용량 요법에서 관상 심장병을 치료하기 위한 초기 시술 후 투여된다. 이러한 과정의 예는 관상 동맥 바이패스 이식(CABG) 및 경피경혈관심장동맥확장술(PTCA) 또는 혈관성형술을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 하나의 양태에서, TNFα 억제제는 재발로부터 협착증을 예방하기 위하여 투여된다. 본 발명의 다른 양태에서, TNFα 억제제는 재협착증을 예방하거나 치료하기 위해 투여된다. 본 발명은 또한, TNFα 억제제가 관상 심장병을 치료하기 위한 수술을 받은 피험체의 동맥내 스텐트의 삽입 전, 삽입과 함께 또는 삽입 후 투여된다. 하나의 양태에서, 스텐트는 CABG 또는 PTCA에 이어서 투여된다.
광범위한 스텐트 이식체를 목적한 치료 부위 및 특성에 따라 본 발명의 내용안에서 사용할 수 있다. 스텐트 이식은 예를 들면, 두갈래 또는 튜브형 이식체, 원통형 또는 첨형, 자가-확장가능하거나 또는 풍선-확장가능한, 단일체 또는 모듈러(modular)일 수 있다. 또한, 스텐트 이식체는 스텐트 이식체의 단지 근접한 말단에서 또는 전체를 따라 약물을 방출하도록 조절할 수 있다. 본 발명의 TNFα 억제제는 스텐트 상에서 또한 투여될 수 있다. 하나의 양태에서, 예를 들면, 아달리무맙/D2E7/HUMIRA®를 포함하는 TNFα 항체는 약물-용리 스텐트로 투여한다.
TNFα 항체는 재협착증을 치료하기 위한 추가의 치료제와 함께 투여될 수 있다. 재협착증을 치료하거나 예방하는데 사용할 수 있는 제제의 예는 시롤리무스, 파클리탁셀, 에버롤리무스, 타크롤리무스, ABT-578, 및 아세트아미노펜을 포함한다.
본 발명의 TNFα 항체는 심근경색을 치료하기 위한 추가의 치료제와 함께 투여할 수있다. 심근경색을 치료하거나 예방하는데 사용할 수 있는 제제의 예는 아스피린, 니트로글리세린, 메토트롤롤 타르트레이트, 에녹사파린 나트륨, 헤파린 나트륨, 클로피도그렐 비설페이트, 카르베딜롤, 아테놀롤, 모르핀 설페이트, 메토프롤롤 석시네이트, 와르파린 나트륨, 리시노프릴, 이소소르바이드 모노니트레이트, 디곡신, 푸로세마이드, 심바스타틴, 라미프릴, 테넥테플라세, 에날라프릴 말레에이트, 토르세마이드, 레타바세, 로사르탄 칼륨, 퀴나프릴 hcl/마그 카브, 부메타니드, 알테플라세, 에날라프릴라트, 아미노다론 하이드로클로라이드, 티로피반 hcl m-하이드레이트, 딜티아젬 하이드로클로라이드, 캅토프릴, 이르베사르탄, 발사르탄, 프로프라놀롤 하이드로클로라이드, 포시노프릴 나트륨, 리도카인 하이드로클로라이드, 엡티피바타이드, 세파졸린 나트륨, 아트로핀 설페이트, 아미노카프로산, 스피로놀락톤, 인터페론, 소탈롤 하이드로클로라이드, 염화나트륨, 도쿠세이트 나트륨, 도부타민 hcl, 알프라졸람, 프라바스타틴 나트륨, 아토르바스탄틴 칼슘, 미다졸람 하이드로클로라이드, 메페리딘 하이드로클로라이드, 이소소르바이드 디니트레이트, 에피네프린, 도파민 하이드로클로라이드, 비발리루딘, 로수바스타틴, 에제티미베/심바스타틴, 아바시미베, 압식시맙, 및 카리포라이드를 포함한다.
본 발명의 TNFα 항체는 협심증을 치료하기 위한 추가의 치료제와 함께 투여할 수 있다. 협심증을 치료하거나 예방하는데 사용할 수 있는 제제의 예는 아스피린; 니트로글리세린; 이소소르바이드 모노니트레이트; 아테롤롤; 메토프롤롤 석시네이트; 메토프롤롤 타르트레이트; 암로디핀 베실레이트; 디곡신; 딜리티아젬 하이드로프 클로라이드; 이소소르바이드 디니트레이트; 클로피도그렐 비설페이트; 니페디핀; 아토르바스타틴 칼슘; 염화칼륨; 심바스타틴; 베라파밀 hcl; 푸로세마이드; 프로프라놀롤 hcl; 카르베딜로; 리시노프릴; 스프리오노락톤; 하이드로클로로티아자이드; 에날라프릴 말레이트; 마돌롤; 라미프릴; 에녹사파린 나트륨; 헤파린 나트륨; 발사르탄; 소탈롤 하이드로클로라이드; 페노피브레이트; 에제티미베; 부메타니드; 로사르탄 칼륨; 리시노프릴/하이드로클로로티아자이드; 펠로디핀; 카프토프릴; 및 비소프롤롤 푸마레이트를 포함한다.
본 발명의 하나의 양태에서, TNFα 항체는 C형 바이러스 간염을 치료하기 위해 일반적으로 사용된 제제와 함께 투여된다. 이러한 제제의 예는 인터페론-알파-2a, 인터페론-알파-2b, 인터페론-알파 con1, 인터페론-알파-n1, 페길화된 인터페론-알파-2a, 페길화된 인터페론-알파-2b, 리바비린, 페긴테르페론 알파-2b 및 리바비린, 우르소데옥시콜산, 글리시리즈산, 티말파신, 막사민 및 VX-497를 포함한다.
TNFα 항체는 건선을 치료하기 위한 국소 코르티코스테로이드, 비타민 D 유사체 및 국소 또는 경구 레티노이드, 또는 이의 배합물과 함께 투여된다. 또한, 본 발명의 TNFα 항체는 건선 치료용의 다음 제제중 하나와 함께 투여된다: KDR의 소분자 억제제(ABT-123), Tie-2의 소 분자 억제제, 칼시포트리엔, 클로베타솔 프로피오네이트, 트리암시놀론 아세토나이드, 할로베타솔 프로피오네이트, 타카로텐, 메토트렉세이트, 플루오시노나이드, 증강된 베타메타손 디프로프, 플루오시놀론, 아세토나이드, 아시트레틴, 타르 삼푸, 베타메타손 발러레이트, 모메타손 푸로에이트, 케토코나졸, 프라목신/플루오시놀론, 하이드로코르티손 발러레이트, 플루란드레놀라이드, 우레아, 베타메타손, 클로베타솔 프로피오네이트/에놀, 플루티카손 프로피오네이트, 아지트로마이신, 하이드로코르티손, 습윤화 제형, 엽산, 데소나이드, 콜타르, 디플로라손 디아세테이트, 에타네르셉트, 폴레이트, 락트산, 메톡스살렌, hc/비스무쓰 수브갈/제녹스(znox)/레소르, 메틸프레드니솔론 아세테이트, 프레드니손, 선스크린, 살리사이클산, 할시노나이드, 안트랄린, 클로코르콜론 피발레이트, 숯 추출물, 콜타르/살리사이클산, 콜타르/살리사이클산/황, 데속시메타손, 디아제팜, 피부연화제, 광오일/카스터 오일/나 락트(na lact), 광오일/땅콩 오일, 석유/이소프로필 미리스테이트, 프소랄렌, 살리사이클산, 비누/트리브롬살란, 티메로살/붕산, 셀레콕시브, 인플릭시맙, 알레파셉트, 에팔리주맙, 타크로리무스, 피메크롤리무스, PUVA, UVB 및 기타 광치료요법, 및 설파살라진.
항체, 항체 부분은 피부 상태를 치료하기 위한 기타 제제와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체, 항체 부분 또는 기타 TNFα 억제제는 PUVA 치료요법과 병용된다. PUVA는 프소랄렌(P) 및 많은 상이한 피부 장애를 치료하는데 사용된 장-파장의 자외선 조사(UVA)이다. 본 발명의 항체, 항체 부분 또는 기타 TNFα 억제제는 피메크롤리무스와 병용될 수 있다. 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 건선을 치료하는데 사용되며, 여기서, 항체는 타크롤리무스와 함께 투여된다. 추가의 양태에서, 타크롤리무스 및 TNFα 억제제는 메토트렉세이트 및/또는 사이클로스포린과 함께 투여된다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 TNFα 억제제는 건선 치료용 엑시머 레이저 치료와 함께 투여된다.
TNFα 항체가 피부 또는 손발톱 질환을 치료하기 위해 병용될 수 있는 기타 치료제의 비제한적 예는 UVA 및 UVB 광치료요법을 포함한다. TNFα 억제제와 함께 사용될 수 있는 기타 비제한적 예는 항-IL-12 및 항-IL-18 치료제, 예를 들면, 항체를 포함한다.
하나의 양태에서, TNFα 항체는 베체트병의 치료시 추가의 치료제와 함께 투여된다. 베체트병을 치료하는데 사용될 수 있는 추가의 치료제는 프레드니손, 사이클로포스파미드(사이톡산), 아자티오프린(또한 이무란으로 명명됨), 메토트렉세이트, 티메토프림/설파메톡사졸(또한 박트림 또는 셉트라로 명명됨) 및 엽산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
단독 또는 병용되는 위에서 언급한 치료제중 어느 하나도 본 발명의 다회 가변 용량 치료 용법을 사용하여 TNFα 항체와 함께, TNFα가 유해한 TNFα 관련 질환으로 고생하는 피험체에 투여될 수 있다. 하나의 양태에서, 단독 또는 병용되는, 위에서 언급한 치료제중 어느 것도 TNFα 관련 질환을 치료하기 위해 TNFα 항체외에 류마티스 관절염으로 고생하는 피험체에 투여될 수 있다. 추가의 치료제는 상술한 병용 치료요법에서 사용할 수 있으나, 또한 유익한 효과가 요구되는 본원에 기술된 다른 조치로 사용될 수 있음을 이해하여야 한다.
본 발명은 또한 한정하는 것으로 간주되지 않아야 하는 하기 실시예에 의해 추가로 예증된다. 본 명세서를 통해 인용된 모든 참조문헌, 특허 및 공개된 특허원의 내용은 본원에 참조로 인용된다.
실시예 1: 아달리무맙의 정제 과정
본 실시예에서는, 아달리무맙과 숙주 세포 단백질(HCP)의 혼합물을 정제하는 정제 방법을 창안했고, 이 방법을 공정 A라 지칭했다. 공정 A에서, 아달리무맙-HCP혼합물은 단백질 A 크로마토그래피 단계로 처리하지 않았다. 공정 A에 사용된 1차 칼럼은 양이온 교환 수지인 프락토겔 S로서, 아달리무맙은 여기에 결합하는 반면 HCP는 관통했다. 아달리무맙은 그 다음 프락토겔 S 칼럼으로부터 1차 용출액로 용출되었다. 그 다음, 1차 용출액은 pH 바이러스 불활성화 처리되어 바이러스 불활성화된 제조물이 되었다. 그 다음, 바이러스 불활성화된 제조물은 아달리무맙이 결합하지 않는 음이온 교환 수지인 Q 세파로스 칼럼에 공급되어 1차 관류물을 수득했다. 1차 관류물은 그 다음, 아달리무맙은 결합하고 HCP는 관통하는, 소수성 상호작용 칼럼인 페닐 세파로스 칼럼에 공급되어, 2차 용출액을 수득했다. 2차 용출액의 2차 가공 및 포장을 수행하여 최종 병제품을 수득했다.
더 상세하게는 공정 A는 다음과 같은 단계를 포함한다:
단계 1: 프락토겔 S 칼럼, 100x20cm(157L), v=175cm/hr, 로딩량 ≤30g 단백질/L 수지/사이클, 20mM 인산나트륨, 25mM 염화나트륨으로 평형화시킴. 아달리무맙의 로딩 후, 칼럼은 평형완충액으로 1회 세척하고, 20mM 인산나트륨, 150mM 염화나트륨을 포함하는 용출 완충액으로 용출시켜 1차 용출액을 수득했다;
단계 2: 탈지질 여과;
단계 3: 한외여과;
단계 4: pH 3.5에서 1시간 동안 pH 불활성화; 불활성화가 완료된 후, pH는 6.8 내지 7.5로 조정했고, 필터 트레인은 2부피량의 50mM 트롤라민으로 세척했다;
단계 5: Q 세파로스 FF 칼럼, 60x30cm(85L), v=150cm/hr, 로딩량 ≤40g 단백질/L 수지/사이클, 25mM 트롤라민, 40mM 염화나트륨을 포함하는 평형 완충액(pH 7.6)으로 평형화됨; 관류물을 수득함;
단계 6: 페닐 세파로스 HP 칼럼, 80x15cm(75L), v=75cm/hr(용출액 37.5cm/hr), 로딩량 20 내지 40g 단백질/L 수지/사이클, 20m 인산나트륨, 1.1M (NH4)2SO4를 포함하는 평형완충액(pH7)으로 평형화됨, 평형완충액으로 1회 세척, 염단계 구배를 11mM 인산나트륨, 0.625M (NH4)2SO4(pH7.0)로 수행하여 용출시켜, 2차 용출액을 수득함, 로딩량이 ≤35g 단백질/L수지이면, 산물 피크 분획화를 실시함;
단계 7: 바이러스 여과;
단계 8: 최종 한외여과/투석여과;
단계 9: 최종 병입(bottling).
공정 A의 추가 세부사항은 이하 실시예 2에서도 기술된다.
실시예 2: 수율은 개선시키고 불순물은 감소시키는 아달리무맙의 정제
상기 실시예 1에 기술된 공정 A인 항체 아달리무맙의 제조 방법에 캡처 및 세부 정제 작업에 변형을 부가했다. 이와 같이 변형된 방법을 본 명세서에서 "공정 B"라 지칭했고, 다음과 같은 총 단계를 포함한다: 출발 물질은 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 발현 시스템를 사용하여 발효법으로 수득한 혼합물이다. 이 혼합물은 먼저 양이온 교환 크로마토그래피, 즉 프락토겔 S 칼럼으로 분리했고, 여기서 아달리무맙은 칼럼("캡처"라 부름)에 포획되었다. 프락토겔 S 칼럼 상의 로딩량은 치환에 의해 증가시켰다. 숙주 세포 단백질(HCP)의 양을 감소시키기 위해, 프락토겔 S 칼럼을 세척하는 개선된 방법을 사용했다. 아달리무맙이 결합되어 있는 프락토겔 S 칼럼은 용출완충액 45%와 주사용수(WFI) 55%를 포함하는 고전도도 세척제인 중간 세척제를 포함하는 다수의 세척제로 세척했다. 캡처 및 세척 후, 아달리무맙은 플랙토젤 S 칼럼으로부터 용출시키고, 이 용출액을 음이온 교환 크로마토그래피,즉 Q 세파로스 칼럼으로 처리했다. 1차 아달리무맙 용출액을 음이온 교환칼럼 상으로 이동시키기 전에, 이 용출액을 pH 및 전도도에 기초한 개선된 방법에 의해 바이러스 불활성화시켰다. 이 아달리무맙 제조물은 음이온 칼럼의 관류물로 수집한 다음, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 즉 페닐 세파로스 칼럼을 따라 추가 분리했다. 페닐 세파로스 칼럼 유래의 용출액은 다시 당업계의 표준 방법에 따라 바이러스 여과, 최종 한외여과 및 최종 병입으로 처리했다.
공정 B는 HCP 및 프로카텝신 L의 수준이 감소된 항체 제조물을 수득하는 개선된 정제 방법이다. 본 명세서에 기술된 방법은 6000L 부피를 사용하여 수행했지만, 공정 B에 기술된 변법은 임의의 부피를 사용하여 수행할 수 있음을 유념해야 한다. 공정 A 대 공정 B 변형 사이의 비교는 표 5에 제시했다(공정 B의 변형은 진하게 강조했다):
공정 A와 공정 B의 비교
단위 작업 공정 A 공정 B
프락토겔 S 칼럼 100 x 20cm (157L) v = 175cm/hr 로딩량 ≤30g 단백질/L/사이클 세척 1 = 평형완충액 용출 = 용출완충액 100 x 20cm (157L) v = 175cm/hr 로딩량 ≤35g 단백질/L/사이클 세척 1 = 평형완충액 세척 2 = 45% 용출완충액:55% WFI 용출 = 용출완충액
탈지질 여과 이 처리 단계에 대해서는 아무 변화가 없음
한외여과 이 처리 단계에 대해서는 아무 변화가 없음
pH 불활성화 불활성화를 완료한 후, pH 6.8 내지 7.5로 조정. 필터 트레인은 2부피의 50mM 트롤라민으로 세척 불활성화 완료 후, pH를 7.8 내지 8.2로 조정. 필터 트레인을 약 2.5부피의 WFI로 세척하여 3.9 내지 5.2 mS/cm 범위의 전도도를 달성함.
Q 세파로스 FF 칼럼 60 x 30cm (85L) v = 150cm/hr 로딩량 ≤40g 단백질/L수지/사이클 60 x 30cm (85L) v = 150cm/hr 로딩량 ≤40g 단백질/L수지/사이클
페닐 세파로스 HP 칼럼 80 x 15cm (75L) v = 75cm/hr(37.5cm/hr 용출) 로딩량 20 내지 40g 단백질/L 수지/사이클, 로딩량이 ≤35g/L수지이면 산물 피크 분획화 80 x 15cm (75L) v = 75cm/hr(37.5cm/hr 용출) 로딩량 20 내지 40g 단백질/L 수지/사이클, 로딩량이 ≤35g/L수지인 경우 산물 피크를 분획화하지 않음.
바이러스 여과 이 처리 단계에 대해서는 아무 변화가 없음
최종 한외여과/투석여과 이 처리 단계에 대해서는 아무 변화가 없음
최종 병입 이 처리 단계에 대해서는 아무 변화가 없음
공정 B에 포함된 각 단계의 변형에 대해서는 이하에 더 상세히 설명한다:
양이온 크로마토그래피
공정 B의 1차적인 회수 및 캡처 작업은 심층 여과인 프락토겔 SO3 - 양이온 교환 크로마토그래피(프락토겔 S)를 포함하고, 이 크로마토그래피는 청징화된 수거물로부터 아달리무맙을 포획하여 방법 관련 불순물(예: CHO 숙주 세포 및 배지 불순물)을 감소시키는 작용을 한다. 이 작업에는 100cm 직경 x 20cm 길이의 칼럼(베드 부피 157L)을 사용했다. 이 칼럼에 프락토겔 S 수지(EM Industries, Hawthorne, NY)를 충진하고, 패킹 질을 측정하기 위해 비대칭 및 HETP(Height of an Equivalent Theoretical Plate)를 측정했다. 그 다음, 이 칼럼을 1.0M NaOH로 1시간 동안 살균처리하고, 사용할 때까지 0.1M NaOH에서 보관했다.
양이온 교환 크로마토그래피는 단백질 로딩량, 이온 농도(여과된 수거물 희석에 의해 조절됨), pH 및 선형 속도에 의해 영향을 받을 수 있다. 단백질 로딩량은 선택성, 분리능(순도) 및 수율에 영향을 미칠 수 있다. 로딩 샘플의 이온 농도(로딩 희석에 의해 조절됨) 및 pH는 결합능, 선택성, 분리능 및 수율에 영향을 미칠 수 있다. 선형 속도는 물질수송성에 영향을 미칠 수 있어, 아마도 극히 높은 유속에서는 결합과 분리능의 감소, 극히 낮은 유속에서는 축상 분산을 초래할 것이다.
프락토겔 S 칼럼에 최대 로딩량은 수지 1리터당 35g 단백질로 증가시켰다. 양이온 칼럼은 20mM 인산나트륨, 25mM NaCl(pH 7)로 평형화시켰다. 평형화 후, 칼럼에는 희석된 심층 여과물 ≤35g 단백질/L 수지를 로딩했다. 심층 여과물 1부를 물 약 1.3부로 희석하여 전도도를 약 6.1 mS/cm로 감소시켰다. 그 다음, 칼럼을 평형완충액으로 기준선까지 세척한 다음, 9mM 인산나트륨, 68mM NaCl(pH 7)(45% 용출 완충액, 55% WFI에 대등함)로 세척했다. 칼럼으로부터 용출된 산물은 20mM 인산나트륨, 150mM NaCl(pH 7)(용출 완충액)으로 단일 분획으로 수집했다. 산물 풀은 산물 피크 A280의 10% 풀스케일(full scale) 편향이 나타나는 전연(leading edge) 및 후연(tailing edge)에서 수집된다. 이 칼럼은 미정제 아달리무맙의 처리를 위해 필요하다면 순환시켰다. 각 칼럼 사이클 유래의 프락토겔 S 용출액은 같은 수집 탱크 속에 풀링하였다. 각 사이클 사이에서, 칼럼은 25mM 인산나트륨, 1.0M NaCl(pH 7)로 재생시켰다.
실험실 규모로 수행한 연구 결과, 산물의 효율적인 회수와 HCP의 감소가 종래 수립된 허용 작업 범위(AOR)인 15 내지 30g 단백질/L 수지보다 훨씬 높은 로딩량 범위에서 달성될 수 있다는 것이 확인되었다. 아달리무맙 격변(breakthrough) 대 칼럼 로딩물의 분석에서는, 실측된 5% 격변이 pH 7의 38g/L 수지에서 일어난다는 것을 보여준다. 따라서, 프락토겔 S 크로마토그래피 단계에서, ≤35g 단백질/L 수지의 개정된 AOR이 수립되었다. 요약하면, 로딩 한계는 수지 1L당 단백질 35g으로 증가되어 처리능이 증가되었다.
프락토겔 수지를 사용한 다른 실험 세트에서는 아달리무맙 격변 대 칼럼 로딩량에 미치는 pH 효과를 조사했다. 구체적으로, 산물 격변 곡선을 사용하여 일정한 로딩 조건 하에서의 수지 동적 결합 용량을 측정했다. 이하 표 6은 상기한 pH 7 조건 하에서 프락토겔 로딩 용량에 대한 회수 데이터를 정리한 것이다. 10g/L의 회수율을 100%로 표준화했다.
Figure 112008069485914-PCT00001
pH 7에서의 결과는 90% 초과의 아달리무맙 회수가 프락토겔 수지 1리터당 50g 미만의 아달리무맙 로딩 조건에서 관찰되었음을 보여준다. 아달리무맙 격변은 로딩 용량에 대해 플로팅하여 이론적 격변 곡선을 작도했다. pH 7에서, 이론적 10% 격변은 프락토겔 수지 1리터당 아달리무맙 54g인 것으로 확인되었다. 또한, pH 7에서 이론적 5% 격변은 프락토겔 수지 1리터당 아달리무맙 38g인 것으로 확인되어, 상기한 결과를 입증했다.
로딩량과 1차 세척 pH 조건을 pH 5로 조정한 것을 제외하고는 유사한 연구를 상기한 바와 같이 수행했다. 양이온 칼럼은 24mM 시트르산 및 51mM 인산나트륨(이염기성) pH 5로 평형화시켰다. 평형화 후, 칼럼에는 80g 단백질/L수지 이하의 희석된 심층 여과물을 로딩했다. 세포 배양 수거물은 심층 여과하기 전에 3M 산성 산으로 pH 5.0으로 조정했다. 심층 여과물 1부를 거의 동일한 부피의 물로 희석하여 전도도를 약 8 내지 10 mS/cm로 감소시켰다. 다시, 아달리무맙 격변을 로딩 용량에 대하여 플로팅하여 이론적 격변 곡선을 작도했다. 연구된 조건 하에서, 이론적 10% 격변은 프락토겔 수지 1리터당 약 74g의 아달리무맙에서 이루어지는 것으로 관찰되었다. 이론적 5% 격변은 프락토겔 수지 1리터당 약 73g 아달리무맙에서 이루어지는 것으로 관찰되었다. 수지의 양이온 교환 특성으로 인해, 크로마토그래피 조건의 pH 저하는 아달리무맙 동적 결합 용량을 유의적으로 증가시켰다. pH 5 및 pH 7에서의 격변 곡선을 비교한 결과, 아달리무맙 분자와 프락토겔 수지 사이의 결합은 더 낮은 pH에서 더 강해지는 것으로 관찰되었다. 또한, pH 5에서의 더 높은 로딩 동적 용량에 의해 더 우수한 HCP 제거율이 수득되는 것으로 확인되었다. 이하 표 7은 새로 검사된 pH 5 조건 하에서 용출액에 존재하는 HCP에 대한 프락토겔 로딩 용량 연구에 대한 데이터를 정리한 것이다. 이 데이터는 검사된 조건 하에서 아달리무맙에 의한 HCP 치환이 일어났음을 분명하게 보여준다.
Figure 112008069485914-PCT00002
pH 5에서 칼럼 로딩량에 대한 아달리무맙 격변 분석은 실측된 5% 격변이 73g/L수지에서 나타남을 보여주는 바, pH 5의 프락토겔 S 크로마토그래피 단계에서는 ≤70g 단백질/L 수지의 개정된 AOR이 수립될 수 있다는 것을 보여주었다. 종합해보면, 종래 pH7에서 수지 1리터당 35g 단백질로 증가되었던 로딩 한계(상기한 바와 같다)는 pH를 5로 저하시킴으로써 수지 1리터당 70g 단백질까지 더 증가시킬 수 있다.
중간 세척
아달리무맙 제조물 중의 불순물의 양을 더욱 감소시키기 위해, 양이온 칼럼으로부터 아달리무맙을 용출시키기 전에 중간 세척 단계를 수행했다(이하 표 8 참조). 이러한 추가 세척은 용출 완충액의 전도도에 비교하여 조정했고, HCP의 제거를 증가시키는데 도움이 되었다. 용출 전에 중간 세척 단계의 삽입은 아달리무맙과 함께 용출되는 HCP의 양을 공정 A에 비해 60%가 넘게 감소시켰다. 조사된 매개변수에는 세척제에 사용된 물과 용출 완충액의 배합물(용출완충액%), 전도도, pH, 세척 용량, 유속 및 수지 연령이 포함된다. 최적 세척은 45% 용출 완충액(20mM 인산나트륨, 150mM 염화나트륨, pH 7)과 55% 물의 배합물로 이루어진다. 표 8은 추가 세척 존재 및 부재 하에 프락토겔 S 용출액 중의 HCP 수준을 비교한 데이터를 제시한 것이다. 프락토겔 S 용출액 시료를 HCP에 대해 분석하고, 더 높은 로딩량과 세척 단계를 포함하는 파일로트 규모의 프락토겔 S 방법 유래의 용출액에 존재하는 HCP 수준과 비교했다. 파일로트 규모의 데이터는 2차 세척 단계의 첨가가 프락토겔 S 단계에 의한 HCP 제거율을 크게 증가시킨다는 것을 보여준다.
Figure 112008069485914-PCT00003
각 방법에서 수득되는 프락토겔 S 크로마토그래피 단계의 통상적으로 용출 프로파일은 도 1에 제시했다. 공정 B는 용출 전에 상기한 중간 세척 단계를 추가로 포함하여, 종래 방법보다 적은 조기 용출 종이 검출되면서 더 첨예화된 용출 피크의 전연을 제공한다. 종합해보면, 아달리무맙의 용출 직전에 중간 세척 단계를 프락토겔 S 단계에 도입하면, HCP와 같은 방법 관절 불순물의 제거가 향상된다.
바이러스 불활성화
공정 B의 낮은 pH 불활성화 단계는 탈지질 여과물에 존재할 수 있는 잠재적인 미검출 엔벨로프형 바이러스를 불활성화시켜 안전성의 여지를 제공한다. 바이러스 불활성화된 풀을 이어서 pH 중화시키고, 여과하여 입자물을 제거하고 미생물오염정도(bioburden)를 최소화한다. 낮은 pH 바이러스 불활성화 동안 아달리무맙의 성질은 pH 및 낮은 pH 항온처리 기간이 영향을 미칠 수 있다. 바이러스 불활성화는 이와 같은 매개변수에도 의존적이고, 단백질 농도가 영향을 미칠 수 있으며, 고농도의 단백질 농도는 불활성화를 감소시킬 수 있다. 낮은 pH에서 최소 항온처리 시간을 15분에서 60분까지 증가시켰다. 낮은 pH 단계 전과 후에 채취한 제조 샘플의 분석 결과, 아달리무맙이 종양 괴사 인자(TNF)의 세포독성 효과에 대하여 쥐 L929 세포를 보호하는 능력을 손상시킴이 없이 pH 3.5에서 1시간 동안 안전하게 유지될 수 있음이 확인되었다.
불활성화 후, 바이러스 불활성화된 용출액의 pH 및 전도도는 다음 칼럼, 예를 들면 Q 세파로스 칼럼의 평형 완충액에 따라 조정했다. pH는 7.8 내지 8.2로 조정했고 목표 pH는 8.0이었다. 정리하면, Q 세파로스 FF 로딩물로서 사용되는 바이러스 불활성화된 풀의 pH 및 전도도는 Q 세파로스 평형완충액의 pH 및 전도도에 일치하도록 조정했다.
음이온 크로마토그래피
음이온 칼럼, 즉 Q 세파로스 단계는 DNA 및 인슐린뿐만 아니라 특히 프로카텝신 L을 포함하는 HCP와 같은 방법 관련 불순물을 감소시키는 작용을 한다. 직경 60cm x 길이 30cm 칼럼(베드 부피 85L)을 Q 세파로스 FF 크로마토그래피에 사용했다. 이 칼럼에는 Q 세파로스 FF 수지(Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ)를 충진하고, 패킹의 질을 측정하기 위해 비대칭과 HETP를 계측했다. 그 다음, 이 칼럼을 1.0M NaOH로 1시간 동안 살균처리하고, 사용할 때까지 25mM 인산나트륨, 20% 이소프로판올에 보관했다.
수지의 평형화는 25mM 트롤라민, 40mM NaCl, pH 8(평형완충액)으로 달성했다. 이 단계의 최대 단백질 로딩량은 ≤40g 단백질/L 수지/사이클이었다. 이 수지에는 방법 관련 불순물이 흡착되고 아달리무맙은 칼럼을 통해 관류되었다. 희석, 여과, 바이러스 불활성화된 물질은 보통 대략 동일한 양을 2회 순환시켜 처리했고, 사용가능한 물질을 모두 처리하기 위해 추가 순환이 필요할 수도 있다. 로딩 및 용출은 150cm/hr의 속도로 수행했고, A280 이 전체적으로 2% 이상 상승하면 칼럼 관류물을 수집했다. 그 다음, 이 칼럼을 평형완충액으로 세척하고, A280이 전체적으로 5%로 후퇴할 때까지 세척물을 수집했다. 세척물을 관류물과 풀링하여 Q 세파로스 FTW라 지칭했다. 사이클 사이에, 칼럼은 25mM 인산나트륨, 1.0M NaCl, pH 7로 재생시킨 후, 평형완충액으로 평형화시켰다.
관류 방식으로 작동하는 음이온 교환 크로마토그래피는 단백질 로딩량, 이온 농도(낮은 pH 불활성화 여과물의 희석에 의해 조절될 수 있는 전도도), pH 및 선형 속도가 영향을 미칠 수 있다. 단백질 로딩량은 선택성 및 수율에 영향을 미칠 수 dLT다. 이온 농도 및 로딩 샘플의 pH는 결합 용량 및 선택성에 영향을 미칠 수 있다. 선형 속도는 물질수송성에 영향을 미칠 수 있어, 아마도 극히 높은 유속에서는 방법관련불순물의 결합의 감소 및 극히 낮은 유속에서는 축상 분산을 초래할 것이다. 실험실 규모의 연구에 기초하여 새로운 로딩 전도도 및 pH 범위가 수립되었다.
실험실 연구는, Q 세파로스 FF 단계에 의한 HCP의 감소가 로딩 조건의 변경에 따라 증대될 수 있음을 시사했다. 조사된 매개변수에는 로딩 pH, 전도도 및 수지 1리터당 로딩된 단백질의 g이 있다. 칼럼 평형완충액과 일치하는 로딩 전도도 및 pH의 조정(5 mS/cm, pH 8) 및 로딩량 ≤40g 아달리무맙/L수지로의 제한은 HCP 및 프로카텝신 L의 제거율을 증가시켰다. 표 9는 공정 A(pH 7.7, 전도도 6.65 mS/cm) 및 공정 B의 pH 8 및 전도도 5 mS/cm의 개선된 방법 조건 하에서의 HCP의 감소를 보여주는 실험실 규모의 데이터를 제시한 것이다. Q 세파로스 칼럼에 대한 로딩량을 40g/L수지로 제한하면, HCP 제거율이 4배 증가했고, 로딩물의 pH 및 전도도를 추가 변경하면 HCP 감소 계수가 3배 더 증가했다.
Figure 112008069485914-PCT00004
이온 교환 칼럼에서 수득된 아달리무맙을 포함하는 HCP 감소된 관류물은 그 다음 소수성 상호작용 크로마토그래피에 사용했다.
소수성 상호작용 크로마토그래피
페닐 세파로스 HP 크로마토그래피 칼럼의 목적은 각각 숙주 세포 단백질 및 응집물과 같은 방법관련불순물 및 산물관련불순물을 더욱 저하시키기 위한 것이었다. 이 작업을 위해 직경 80cm x 길이 15cm의 칼럼(베드 부피 75L)을 사용했다. 이 칼럼에는 페닐 세파로스 HP 수지(Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ)를 충진하고, 패킹의 질을 측정하기 위해 비대칭과 HETP를 계측했다. 그 다음, 칼럼은 1.0M NaOH로 1시간 동안 살균처리하고, 사용 전까지 25mM 인산나트륨, 20% 이소프로판올에 보관했다.
수지의 평형화는 20mM 인산나트륨, 1.1M (NH4)2SO4, pH 7.0(평형완충액)으로 수행했다. 이 단계의 단백질 로딩량은 수지 1L당 단백질 20 내지 40g이었고, 유효 물질의 전량을 처리하기 위해 2 또는 3회의 크로마토그래피 사이클을 수행해야만 했다. 칼럼은 75cm/hr의 선형 속도로 가동시켰다. Q 세파로스 관류물은 동량의 40mM 인산나트륨, 2.2M (NH4)2SO4, pH 7.0으로 희석했다. 로딩 후, 칼럼은 20mM 인산나트륨, 1.1M (NH4)2SO4, pH 7.0으로 세척했다. 산물은 11mM 인산나트륨, 0.625M (NH4)2SO4, pH 7.0까지 염 단계 구배를 수행하여 용출시켰다. 산물은 흡광도가 50% UV 풀스케일 이상으로 상승할 때 수집하고, 그리고 후속 피크에서 흡광도가 20% 미만 UV 풀스케일로 감소할 때까지 계속 수집했다.
프락토겔 S 및 Q 세파로스 FF 크로마토그래피 단계에 대한 방법 변경은 페닐 세파로스 HP 단계에 위치한 방법관련불순물 감소의 부담을 유의적으로 감소시켰다. 변화의 결과로서, 페닐 세파로스 HP 단계의 주요 기능은 아달리무맙 응집물의 제거였다.
공정 A는 35g 단백질/L수지 이상의 칼럼 로딩량에서, UV 흡광도가 50% 풀스케일 편향 이상으로 상승할 때 산물을 수집하고 흡광도가 <20% 풀스케일로 감소할 때까지 계속 수집했다. 35g 단백질/L 수지 이하의 칼럼 로딩량에서는 용출액 피크의 처음 0.15 칼럼 부피를 수집된 풀로부터 제거하여 이 단계의 HCP 제거율을 향상시켰다. 공정 B에서 이전 크로마토그래피 단계들의 변경의 혼입으로, 유입되는 HCP 로딩량이 유의적으로 감소되었기 때문에 35g 단백질/L 수지 이하의 로딩량에서 피크를 배제할 필요가 줄게 되었다. HCP 로딩량의 감소는 분획화 없이 로딩 범위를 확장시켰다. 이 변화의 효과는 페닐 세파로스 HP 피크 절단 없이 각 발효에서 수득되는 모든 물질을 회수 공정으로 처리할 수 있게 한다는 것이다.
페닐 세파로스 작업의 선형 유속을 실험실 규모로 조사했다. 아달리무맙 로딩량은 일정하게 유지시키고 25 내지 125cm/hr의 유속을 조사했다. 유속은 산물 회수에 영향을 미치지만, SEC(단량체 %) 및 HCP 제거율(표 10)로 평가되듯이 산물의 질에는 어떠한 영향도 미치지 않아, 보다 광범위한 25 내지 125cm/hr의 범위가 분석될 수 있게 했다. 페닐 세파로스 제조 작업의 목표 유속은 이미 정해진 바와 같이 75cm/hr로, 용출 단계에서는 37.5cm/hr로 유지시킨다.
Figure 112008069485914-PCT00005
페닐 세파로스 HP 크로마토그래피의 허용되는 작업 범위를 조사했다. 소수성 상호작용 크로마토그래피에는 단백질 로딩량, 이온 농도(전도도) 및 선형 속도가 영향을 미칠 수 있다. 단백질 로딩량은 선택성 및 수율에 영향을 미칠 수 있다. 로딩 샘플의 이온 농도는 결합 용량, 선택성 및 분리능에 영향을 미칠 수 있다. 선형 속도는 물질수송성에 영향을 미칠 수 있어, 아마도 극히 높은 유속에서는 방법관련불순물의 분리 감소 및 극히 낮은 유속에서는 축상 분산을 초래할 것이다. 선형 유속 범위는 25 내지 125cm/hr 범위로 확대된다. 페닐 세파로스 크로마토그래피에 대한 다른 허용 작업 범위는 6000L 방법에서 이미 설정된 것을 그대로 사용했고, 표 10에 게재했다.
두 방법의 세부 정제 작업의 비슷한 성능이 입증되었다. 개선된 공정 B의 부분으로서 도입된 변화는 다음을 포함한다: Q 세파로스 FF 로딩물로서 사용되는 바이러스 불활성화된 풀의 Q 세파로스 평형완충액과 일치하는 pH 및 전도도의 조정, Q 세파로스 로딩량의 수지 1리터당 40g 단백질 미만으로의 제한, 및 페닐 세파로스 용출액을 수지 1리터당 35g 단백질 미만의 로딩량으로 분별해야 하는 필요의 제거. SEC 및 WCX-10 분석으로 측정되는, 중간물의 특성은 두 방법 간에 비슷했다.
각 방법에서 Q 세파로스 FF 및 페닐 세파로스 HP 크로마토그래피의 통상적인 용출 프로파일은 각각 도 2와 3에 제시했다. 아달리무맙을 포함하는 Q 세파로스 관류물은 수집했다. 공정 B의 로딩 용량은 이전 방법보다 더 컸는데, 이는 이전 크로마토그래피 단계(프락토겔 S)의 로딩량이 더 크고 용출 부피가 증가했기 때문이며, 따라서 총 관류물 부피도 대응하게 증대된다.
즉, 수지 1리터당 35g 단백질 미만으로 로딩을 위해 페닐 세파로스 용출액을 분획화해야 하는 필요성은 프락토겔 S 및 Q 세파로스 작업의 변화로부터 불순물 제거율이 개선됨으로 인해 제거되었다. 또한, 선형 유속 범위도 25 내지 125cm/hr로 확대되었다.
HCP의 감소
공정 B는 프락토겔 S 및 Q 세파로스 크로마토그래피 단계에 변형을 포함하여, 숙주 세포 단백질(HCP) 및, 특히 프로카텝신 L과 같은 방법관련불순물의 조절을 개선시키고자 했다. 이러한 불순물의 제거에 공정 B가 미치는 영향을 평가하기 위한 연구를 수행했다. 프락토겔 S, Q 세파로스 FF 및 페닐 세파로스 HP 칼럼이 CHO 숙주 세포 단백질을 제거하는 능력을 제조업 규모에서 평가했다. 숙주 세포 단백질 수준은 HCP ELISA(실시예 3 참조)로 측정하고, 데이터는 ng HCP/mg 아달리무맙으로 나타냈다.
공정 B 동안 대표 시료를 채취하여 HCP에 대해 분석했다. 결과는 표 11에 제시했다. 크로마토그래피 단계에 대한 변화는 HCP 제거율을 향상시길 것으로 예측되는 더욱 엄밀한 크로마토그래피 조건을 나타낸다. 보고된 탈지질 여과 결과는 공정 A의 결과이다. 탈지질 여과 단계는 공정 B에서 변화시키지 않았으며, 이 단계에서 달성된 HCP 감소 계수가 공정 B의 전체 성능에 포함된다. 평균적으로, 공정 B는 4.35 log10 이상의 HCP를 제거할 수 있다. 프락토겔 S 크로마토그래피 및 Q 세파로스 FF 크로마토그래피는 둘 모두 1 log10 이상의 HCP를 제거했고, 심층 여과 단계 역시 1 log10 이상을 제거했다. 페닐 세파로스 칼럼에 의해 추가 HCP가 제거되었으나, 제거 값은 로딩물과 용출액의 HCP 수준이 정량분석 수준 이하였기 때문에 계산할 수 없었다. 공정 B에 의해 생산된 약물 성분은 3회의 확인 로트마다 정량분석한계(LOQ) 이하의 HCP 수준을 나타냈다.
Figure 112008069485914-PCT00006
HCP 및 프로카텝신 L 수준의 전체 개선은 표 12와 13에 각각 제시했으며, 공정 B는 공정 A에 비해 유의적으로 감소된 HCP 및 프로카텝신 L의 수준을 보여주었다.
프로카텝신 L 공정 매핑
방법 중간체 시료는 여러 단계에서 채취하여 프로카텝신 L의 카텝신 L로의 활성화 시에 발생되는 형광을 분석했다. 공정 B 및 공정 A 시료에 대한 결과는 이하 표 14에 제시했다. 프락토겔 S 로딩 및 페닐 세파로스 로딩 및 용출 시료는 이 방법에서 방해로 인해 평가할 수 없었다. Q 세파로스 FF 크로마토그래피 단계는 로딩물에 90%가 넘는 검출가능한 효소를 제거하는 능력이 있다. 개선된 방법 유래의 Q 세파로스 관류물 및 세척물(FTW)은 이전 6000L 방법 유래의 Q 세파로스 FTW보다 약 50% 적은 활성화가능한 프로카텝신 L을 포함했다. 또한, 탈지질 여과, 한외여과에 의해 농축, 낮은 pH 바이러스 불활성화 및 심층 여과 작업이 수행되는, 프락토겔 S 및 Q 세파로스 단계 사이에서도 감소가 나타난다.
Figure 112008069485914-PCT00007
공정 A와 B에서 프로카텝신 L의 감소는 도 4에 비교 도시했다. 공정 B는 각 중간 단계마다 공정 A보다 더 낮은 프로카텝신 L 수준을 나타내는 바, 프락토겔 S와 Q 세파로스 크로마토그래피 단계에 대한 변경이 상기 불순물의 제거와 관련하여 방법 성능을 향상시킨다는 것을 시사한다.
HCP 공정 매핑
방법의 중간 샘플은 공정 A와 공정 B에서 모다 수거하여 HCP 함량에 대해 분석했다. 본 연구는 HCP 감소에 대하여 두 방법을 직접 비교하기 위해 수행했다. HCP 분석의 결과는 표 15에 제시했다. 두 방법 모두의 프락토겔 S 및 Q 세파로스 단계에서 유의적인 HCP 제거가 나타났지만, 이 두 단계들에서 공정 B의 HCP 제거율이 더욱 높았다. 산물을 용출시키기 전에 2차 세척 단계를 포함하는 개선된 프락토겔 S 단계는 감소 계수가 96(1.96 log10)인 반면, 이전 방법의 같은 단계는 감소 계수가 48(1.67 log10)이었다. 두 방법에서, 프락토겔 S와 Q 세파로스 크로마토그래피 단계 사이에서 수행된 탈지질 여과에 의해 달성된 감소 계수는 50이다. 공정 B의 Q 세파로스 작업은 칼럼 평형완충액의 pH 및 전도도로 조정된 로딩물로 수행한다. 개선된 Q 세파로스 단계에 의해 달성된 HCP 감소 계수는 이전 방법에 의해 확인된 것보다 4배 더 컸다(21 vs. 5). 페닐 세파로스 단계를 통해서도 추가 감소가 일어나, HCP 수준은 개선된 방법 UF/DF 풀 및 약물 성분에서 정량 수준 이하였고; 이전 약물 성분의 시료는 HCP 수준이 매우 낮지만 측정가능한 수준으로 나타난다.
Figure 112008069485914-PCT00008
log10 스케일로 플롯팅한 공정 B 대 공정 A의 HCP 감소 비교는 도 5에 도시했다. 공정 B는 Q 세파로스 단계 이후 10배의 차이를 비롯하여 각 중간 단계에서 공정 A보다 더 낮은 HCP 수준을 나타냈고, 이는 프락토겔 S 및 Q 세파로스 크로마토그래피 단계에 대한 변경이 HCP 제거와 관련하여 방법 성능을 개선시킨다는 것을 시사한다.
캡처 및 세부 정제 작업이 처리능에 미치는 영향
공정 B의 캡처 및 세부 정제 작업의 처리능을 증가시키기 위해 2가지 변화를 도입시켰다. 첫 번째는 프락토겔 S 칼럼 상의 허용되는 로딩 범위를 pH 7에서 30g 단백질/L 수지에서 35g 단백질/L 수지로, pH 5에서 30g 단백질/L 수지에서 70g 단백질/L 수지로 증가시킨 것이다. 이 변화는 생물반응기로부터 여과된 모든 수거 물질을 프락토겔 S 칼럼 위에 로딩할 수 있게 했다. 프락토겔 S 칼럼 위의 평균 로딩량은 이전 방법의 로딩량에 비해 개선된 방법(pH 7에서)에서 약 9% 이상 높았다(표 16).
두 번째 변화는 페닐 세파로스 산물 피크를 로딩량을 35g 단백질/L 수지 미만으로 하기 위해 분획화할 필요를 없앤 것이다. 분획화는 숙주 세포 단백질을 적당한 조절하기 위해 산물 피크의 유의적인 부분이 제거되게 했다. 숙주 세포 단백질과 프로카텝신 L의 수준을 조절하기 위해 프락토겔 S 및 Q 세파로스 단계에 수행된 변화는 페닐세파로스 피크의 분획화를 불필요하게 했다. 이러한 변화는 공정 B에서 더 적은 로딩량 범위인 경우에도 페닐 세파로스 칼럼을 3회 반복 수행하여 페닐 세파로스 칼럼에 부하되는 총 로딩량은 공정 A에 비해 12% 증가되게 했다.
표 16은 프락토겔 S 및 페닐 세파로스 칼럼 상의 로딩량 뿐만 아니라 개선된 방법과 이전 방법에서 수득된 최종 약물 성분의 양을 비교한 것이다. 개선된 방법은 3회의 확인 배취에서 아달리무맙 총 수율이 약 8% 증가했음을 보여준다.
Figure 112008069485914-PCT00009
항체 아달리무맙을 정제하는 개선된 방법은 HCP 및 프로카텝신 L의 제거율을 증가시켜(공정 A에 비해), 약물 성분의 수준을 감소시켰다. 더 상세하게는, 약물 성분의 로트 방출 데이터의 비교에서, 표 17에 제시한 바와 같은 HCP 및 프로카텝신 L의 수준이 측정되었다.
Figure 112008069485914-PCT00010
공정 B를 사용하여 수득한 약물 성분의 특성분석을 확대하여 수행했다. 3가지 확인 로트에서 수득한 약물 성분을 아달리무맙 참조 표준물과 비교 분석하기 위해, 아미노산 분석, 원편광이색성분석, 분석용원심분리, QSTAR LC-질량분광분석, 비환원성 트립신처리 및 LYS C 펩타이드 매핑과 MS 검출, 유리 설프하이드릴 분석, 트립신처리 펩타이드 매핑과 MS 검출, 면역블롯, L929 생물분석, 및 BIAcore를 포함하는 분석법을 사용한다. 개선된 방법에 의해 제조된 모든 배취의 약물 성분은 허용 기준을 충족시켰고 참조 표준물과 비슷했다.
즉, 공정 B의 성능은 발효, 캡처 및 세부 정제 단계에서 공정 A와 비슷한 수준인 것으로 입증되었다. 하지만, 공정 B의 성능은 숙주 세포 단백질 및 프로카텝신 L의 감소와 관련해서는 개선된 능력을 나타낼 뿐만 아니라 아달리무맙 수율 면에서 증가된 능력을 보여주었다. 또한, 약물 성분 방출 검사 및 확대된 특성 분석을 통해, 공정 B에 의해 생산된 아달리무맙 약물 성분과 공정 A에 의해 생산된 약물 성분의 유사성을 확인했다.
Figure 112008069485914-PCT00011
Figure 112008069485914-PCT00012
실시예 3: HCP 검출을 위한 검정
다음 실시예는 실시예 2에 기술된 공정 B로부터 수득된 아달리무맙 약물 성분 시료에 존재하는 잔류 숙주 세포 단백질(HCP) 농도를 측정하는 HCP ELISA 방법을 설명한 것이다. 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 사용하여, HCP 항원을 포함하는 시료를 2층의 특정 항체 사이에 샌드위치시켰다. 그 다음, 비특이적 부위를 카제인으로 차단시켰다. 그 다음, 시료를 항원 분자가 1차 항체(친화성 정제된, 코팅 항체 사이그너스 염소 항CHO(중국 햄스터 난소))에 의해 포획되는 시간 동안 항온처리했다. 그 다음, 2차 항체(비오틴화된 항CHO 숙주 세포 단백질)를 첨가하여 그 항원(CHO 숙주 세포 단백질)에 고정시켰다. 중요한 것은, HCP에 특이적인 2차 항체가 당해 항체의 생산에 사용된 세포로부터 생산된다는 점이다. 비오틴화된 항CHO 숙주 세포 단백질에 결합하는 HRP 접합된 뉴트라비딘을 첨가했다. 그 다음, K 블루 기질을 첨가했다. 이 발색원성 기질은 결합된 효소 접합 항체에 의해 가수분해되어 청색을 나타낸다. 반응은 2M H3PO4로 정지시키고 색은 황색으로 변했다. 색 강도는 웰에 결합된 항원의 양에 정비례했다. HCP ELISA는 항체 제조물 중의 HCP 수준의 측정능이 표준 ELISA 방법보다 향상된 것으로 나타났다.
실시예 4: 카텝신 L 속도론적 검정
공정 B의 아달리무맙 제조 방법의 중간물에서 카텝신 L 활성을 정량분석하기 위해 속도론적 검정법을 개발하여 사용했다(실시예 2 참조). 약물 성분 방출 검사에서 HCP를 측정하는데 사용한 약한 음이온 교환 HPLC 분석(WAX-10 HPLC)은, 이 방법내 시료 중의 다양한 단백질 함량과 완충액 조성이 이 방법을 방해할 수 있기 때문에 본 연구에 사용할 수 없었다. 이와 같이 방법의 중간물에 존재하는 프로카텝신 L을 직접 정량분석하지 못함으로 인해, 속도론적 형광 방법으로 카텝신 L의 활성을 측정하는 분석법을 개발하게 되었다. 속도론적 검정법, 즉 고처리량 형광효소방법은 프로카텝신 L 수준을 검출하는데 사용되는 표준 방법보다 방법내 시료들에 덜 방해되었다. 속도론적 검정법은 또한 실시예 1과 2에 기술된 아달리무맙 방법내 시료를 정제하는 방법의 신뢰성을 조사하는 수단을 제공한다.
본 방법은 시료 중의 프로카텝신 L을 덱스트란 설페이트의 첨가로 인해 카텝신 L로 활성화시킨다. 여기 파장인 380nm와 방출 파장인 460nm에서 카텝신 L 활성을 검출하기 위해 형광원성 펩타이드 기질인 Z-류신-아르기닌-AMC(7-아미노-4-메틸 쿠마린)를 사용했다. 시료 중의 형광 활성의 수준은 1초당 기질의 절단에 의해 발생되는 형광 시그날의 기울기를 통해 측정했다. 이러한 형광 활성의 분석 범위는 0.0144 내지 1.04 RFU/sec 사이인 것으로 측정되었다. 이러한 활성은 시험 시료 중에 존재하는 아달리무맙의 양과 상관성이 있었다; 따라서 결과는 RFU/sec/mg 아달리무맙으로 기록했다. 최대 형광 시그날을 발생시키는 최적 활성화 조건은 JMP 소프트웨어 유도 DOE 실험을 사용하여 각 방법의 중간 시료마다 수득했다. 이 분석에 권장되는 활성화 조건은 표 16에 정리했다.
재료 및 방법
500mM DTT 스톡 용액의 제조
Ultrapure DTT(Invitrogen) 7.7g을 90ml의 Milli-Q 물에 첨가하고 균질할 때까지 혼합했다. 이 용액을 Milli-Q 물로 최종 부피가 100mL가 되게 충전했다. 이 500mM DTT 스톡을 그 다음 일정량씩 분취하여 -80℃에 보관했다.
활성화 완충액(25mM NaOAc, 5mM DTT, 1mM EDTA pH 5.5)의 제조
아세트산나트륨(J.T. Baker) 3.44g, EDTA(J.T.Baker) 0.38g 및 Milli-Q 물 950mL를 적당한 용기에 첨가하고 완전하게 균질할 때까지 혼합했다. 완충액의 pH는 1M HCl로 5.5로 조정하고, 부피 플라스크에 최종 부피를 1L로 만들었다. 완충액을 0.22㎛ 필터를 통해 여과한 뒤, 사용하기 전에 4℃에 보관했다. DTT 스톡 용액(상기한 500mM) 500㎕는 사용하는 날에 최종 농도가 5mM가 되도록 완충액 50mL에 첨가했다.
덱스트란 설페이트 + 0.1% 아지화나트륨 스톡 용액의 제조
덱스트란 설페이트(EM Science) 1g을 Milli-Q 물 90ml에 첨가하고 균질할 때까지 혼합했다. 1mg/mL 스톡 용액(J.T.Baker)으로부터 아지화나트륨 100㎕를 첨가했다. 이 용액을 최종 부피가 100mL가 되도록 충전했다. 이 용액을 그 다음 일정량씩 분취하여 -80℃에서 보관했다.
속도론적 검정 셋업
카텝신 L 활성을 검사할 시료는 전구효소(프로카텝신 L)를 활성 효소(카텝신 L)로 활성화해야만 한다. 이는 시료를 활성화 완충액으로 희석한 뒤, 덱스트란 설페이트를 첨가하고, 적당한 시간 동안 37℃에서 항온처리하여 수행했다(이하에 더 상세히 논함). 활성화 후, 시료는 -80℃에 보관할 수 있고 안정 상태를 유지한다. 방법내 시료에 대해 측정된 최적의 활성화 조건은 표 18에 제시했다.
Figure 112008069485914-PCT00013
검사일에, 시험 시료의 일정량을 -80℃에서 꺼내어 얼음조에서 해동시켰다. 시험 시료가 해동되면, 100㎕(2x)의 각 시료를 흑색 폴리스티렌 마이크로역가 평판(Corning cat# 3650)에 로딩했다. Z-L-R-AMC 플루오제닉 펩타이드 서브스트레이트 VII(R&D Systems)의 일정량을 차광된 상태에서 해동시켰다. 기질은 아세테이트 완충액으로 1:1350의 비율로 최종 농도가 20μM이 되게 희석했다. 형광원성 기질 100㎕를 각 웰에 첨가했다. 그 다음, 평판을 약 1초 동안 혼합하고, 차광된 상태동안 37℃에서 3분 동안 항온처리했다. 그 다음, 37℃로 설정된 형광판 판독기에 평판을 장착했다. 여기 파장은 380nm, 발광 파장은 460nm로 설정했다. 각 웰의 형광성은 3분마다 30분 동안 측정하고, 기질 가수분해 속도를 계산했다. 희석율을 참작하는 결과는 그 다음 비교하기 위해 아달리무맙 농도로 나누었다. 이 속도론적 검정법을 사용한 결과는 상기 실시예 2에 기술되어 있다.
아달리무맙 농도는 1.39의 흡광계수를 사용하여 A280으로 측정했다. 아달리무맙 정량분석은 Poros A 분석을 사용하여 연구 시료를 가지고 수행했다. 시료 희석은 판독값이 표준 곡선 범위 내가 되도록 적용했다. 시마즈 HPLC 시스템은 Poros A ImmunoDetection 센서 카트리지(Applied Biosystems, Foster City, CA)와 함께 장착했다. 칼럼은 상온에서 유지시켰다. 시스템은 2mL/분의 속도로 진행시켰다. 자동샘플러 트레이 온도는 4℃로 설정했다. 흡광도는 280nm에서 모니터했다. 완충액 A는 1X PBS였고; 완충액 B는 0.1M 아세트산과 150mM 염화나트륨이었다. 시료를 주입하고, 아달리무맙은 100% 완충액 B를 사용하여 용출시켰다.
아달리무맙의 CHO 세포 발현으로부터 수득된 물질로부터 프락토겔 로딩물(1차 용출액 실시예 2; 공정 B 참조)을 사용한 형광원성 펩타이드의 턴오버(turnover)는 도 6에 도시했다. 이 시료를 0.5㎍/ml 덱스트란 설페이트를 사용하는 활성화 완충액으로 200, 50 및 20㎍/mL의 아달리무맙으로 희석하고, 37℃에서 16시간 동안 항온처리했다. 50 및 20㎍/ml의 로트는 선형 반응을 나타냈다. R2값은 ≥0.99이다. 하지만, 200㎍/mL의 로트는 30분간의 측정 시간 말기쪽으로 비선형 기질 턴오버를 나타내어, 0.91의 낮은 R2 값을 나타냈다. 따라서, 선형의 가수분해 속도를 유지하기 위해서, 신중한 시료 희석이 중요하다.
또한, 프로카텝신 A의 수준을 측정하기 위해 카텝신 활성을 사용하는 속도론적 검정법이 정확한 분석, 반복 정확성을 포함하는 ICH 지침에 따르는지를 확인하는 분석도 수행했다. 또한, 유리 및 폴리프로필렌 바이엘과 같은 용기의 종류가 카텝신 L 활성에 영향을 미치는지도 측정했다. 그 결과는 카텝신 L의 더 높은 수준이 유리 용기보다 폴리프로필렌 용기에서 배양되었을 때 달성된다는 것을 암시한다. 어느 경우든지, 0.5㎍/ml 덱스트란 설페이트의 첨가는 pH 5.5에서 프로카텝신 L 활성화에 필요했다.
즉, 속도론적 검정법의 정확성은 이 분석법이 아달리무맙 방법 중간체의 잠재적인 카텝신 L 활성의 검출에 유효하다는 것을 증명한다.
본 출원은 미국특허 6,090,382, 6,258,562 및 6,509,015와 관련되어 있다. 본 출원은 미국특허출원 일련변호 09/801,185 (March 7, 2001); 미국특허출원 일련번호 10/302,356(November 22, 2002); 미국특허출원 일련번호 10/163657(June 5, 2002); 및 미국특허출원 일련번호 10/133715(April 26, 2002); 미국특허출원 일련번호 10/222140(August 16, 2002); 미국특허출원 일련번호 10/693233(October 24, 2003); 미국특허출원 일련번호 10/622932(July 18, 2003); 미국특허출원 일련번호 10/623039(July 18, 2003); 미국특허출원 일련번호 10/623076(July 18, 2003); 미국특허출원 일련번호 10/623065(July 18, 2003); 미국특허출원 일련번호 10/622928(July 18, 2003); 미국특허출원 일련번호 10/623075(July 18, 2003); 미국특허출원 일련번호 10/623035(July 18, 2003); 미국특허출원 일련번호 10/622683(July 18, 2003); 미국특허출원 일련번호 10/622205(July 18, 2003); 미국특허출원 일련번호 10/622210(July 18, 2003); 및 미국특허출원 일련번호 10/623318(July 18, 2003)과 관련되어 있다. 또한, 본 출원은 2005년 4월 11일에 출원된 PCT/US05/12007과도 관련되어 있다. 이러한 특허 및 특허출원의 전 명세서는 본 발명에 참고인용되었다.
동등물
당업자는, 통상적인 실험만을 통해 본 명세서에 기술된 본 발명의 특정 양태들에 대한 많은 등가물을 이해하거나 식별할 수 있을 것이다.이러한 대등물은 다음 청구의 범위에 포함되는 것으로 간주되어야 한다. 본 출원을 통해 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 공개된 특허출원의 내용은 본 발명에 참고인용되었다.
<110> Abbott Biotechnology Ltd. <120> Antibody purification <130> BBI-240CPPC <150> US 60/789,725 <151> 2006-04-05 <150> US 60/790,414 <151> 2006-04-06 <160> 37 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> adalimumab light chain variable region <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> adalimumab heavy chain variable region <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys 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Claims (73)

  1. 항체와 하나 이상의 숙주 세포 단백질(HCP)을 포함하는 혼합물로부터 HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법으로서,
    (a) 평형 완충액 중의 1차 이온 교환 수지에 상기 혼합물을 공급하되, 수지 1리터당 30g 초과의 항체를 공급하는 단계;
    (b) 다수의 세척 단계로 상기 수지로부터 HCP를 세척하는 단계; 및
    (c) 용출 완충액으로 상기 수지로부터 항체를 용출시켜 1차 용출액을 형성하여, HCP 감소된 항체 제조물을 수득하는 단계를 포함하여,
    HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 수지 1리터당 약 35 내지 70g의 항체를 공급하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 수지 1리터당 약 70g의 항체를 공급하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 항체와 하나 이상의 HCP를 포함하는 혼합물을 1차 이온 교환 수지에 공급하기 전에 상기 혼합물을 단백질 A 캡처(protein A capture)로 처리하지 않는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 다수의 세척 단계가 적어도 1차 세척 및 2차 세척을 포함하고, 1차 세척에서 2차 세척으로 갈수록 전도도가 증가하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 1차 세척은 평형 완충액으로 수행하고, 2차 세척은 용출 완충액과 물의 혼합물로 수행하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 용출 완충액과 물의 혼합물이 약 40 내지 50% 용출 완충액과 약 50 내지 60% 물을 포함하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 용출 완충액과 물의 혼합물이 약 45% 용출 완충액과 약 55% 물을 포함하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 용출 완충액이 20mM 인산나트륨과 150mM 염화나트륨을 포함하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, pH 7에서 수행하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 약 pH 5 내지 약 pH 7의 pH에서 수행하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, pH 5에서 수행하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 1차 이온 교환 수지가 양이온 교환 수지인, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 양이온 교환 수지를 칼럼 속에 형성하고, 항체와 하나 이상의 HCP를 포함하는 혼합물을 상기 칼럼에 공급하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 양이온 교환 수지가 설포네이트 그룹에 부착된 합성 메타크릴레이트계 중합체 수지를 포함하는 것인, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 1차 용출액을 바이러스 불활성화 단계로 처리함을 추가로 포함하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 바이러스 불활성화를 pH 바이러스 불활성화에 의해 달성하여, 바이러스 불활성화된 제조물을 형성하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 바이러스 불활성화된 제조물을 2차 이온 교환 수지에 공급하며, 바이러스 불활성화된 제조물을 2차 이온 교환 수지에 공급하기 전에, 바이러스 불활성화된 제조물의 pH 및 전도도가 2차 이온 교환 수지의 pH 및 전도도와 상당히 유사하도록 조정하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 2차 이온 교환 수지의 pH가 약 pH 7.7 내지 약 pH 8.3의 범위이고, 바이러스 불활성화된 제조물의 pH가 약 pH 7.7 내지 약 8.3의 범위가 되도록 조정하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 2차 이온 교환 수지의 pH가 약 pH 8.0이고, 바이러스 불활성화된 제조물의 pH가 약 pH 8.0이 되도록 조정하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  21. 제18항에 있어서, 2차 이온 교환 수지의 전도도가 약 3.5 mS/cm 내지 약 5.2 mS/cm의 범위이고, 바이러스 불활성화된 제조물의 전도도가 약 3.5 mS/cm 내지 약 5.2 mS/cm의 범위가 되도록 조정하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 2차 이온 교환 수지의 전도도가 약 5.0 mS/cm이고, 바이러스 불활성화된 제조물의 전도도가 약 5.0 mS/cm가 되도록 조정하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  23. 제18항에 있어서, 2차 이온 교환 수지가 음이온 교환 수지인, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 음이온 교환 수지가 Q 세파로스 수지인, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  25. 제18항에 있어서, 2차 이온 교환 수지를 칼럼 속에 형성하고, 바이러스 불활성화된 제조물을 상기 칼럼에 공급하여 1차 관류물(flow through)이 수득되도록 하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 1차 관류물을 소수성 상호작용 칼럼에 공급하여, 2차 용출액이 수득되도록 하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 소수성 상호작용 칼럼이 페닐 세파로스 칼럼인, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  28. 제26항에 있어서, 소수성 상호작용 칼럼에 공급되는 1차 관류물이 소수성 상호작용 칼럼 물질 1리터당 약 20 내지 약 40g의 항체를 포함하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 소수성 상호작용 칼럼에 공급되는 1차 관류물이 소수성 상호작용 칼럼 물질 1리터당 약 30 내지 약 36g의 항체를 포함하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  30. 제26항에 있어서, 2차 용출액을 산물 피크 분획화(product peak fractionation)로 처리하지 않는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  31. 제1항에 있어서,
    (a) 혼합물을 평형 완충액 중의 양이온 교환 수지에 공급하되, 상기 양이온 교환 수지에 공급하기 전에 상기 혼합물을 단백질 A 캡처로 처리하지 않으며 수지 1리터당 30g 초과의 항체를 공급하는 단계;
    (b) 다수의 세척 단계로 상기 양이온 교환 수지로부터 HCP를 세척하는 단계;
    (c) 용출 완충액을 사용하여 상기 양이온 교환 수지로부터 항체를 용출시켜 1차 용출액을 형성하는 단계;
    (d) 상기 1차 용출액을 바이러스 불활성화 단계로 처리하는 단계;
    (e) 상기 바이러스 불활성화된 제조물을 음이온 교환 수지에 공급하여 1차 관류물을 수득하는 단계; 및
    (f) 상기 1차 관류물을 소수성 상호작용 칼럼에 공급하여 2차 용출액을 수득하여, HCP 감소된 항체 제조물을 수득하는 단계를 포함하여,
    HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 양이온 교환 수지가 pH 7이고 수지 1리터당 약 35g의 항체를 공급하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  33. 제31항에 있어서, 양이온 교환 수지가 pH 5이고 수지 1리터당 약 70g의 항체를 공급하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  34. 제31항에 있어서, 다수의 세척 단계가 평형 완충액을 사용한 1차 세척 및 용출 완충액과 물의 혼합물을 사용한 2차 세척으로 수지를 세척함을 포함하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 용출 완충액과 물의 혼합물이 약 40 내지 50% 용출 완충액과 약 50 내지 60% 물을 포함하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  36. 제31항에 있어서, 바이러스 불활성화된 제조물을 음이온 교환 수지에 공급하 기 전에, 바이러스 불활성화된 제조물의 pH 및 전도도가 음이온 교환 수지의 pH 및 전도도와 상당히 유사하도록 조정하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  37. 제31항에 있어서, HCP ELISA로 측정했을 때, 1차 용출액이 혼합물보다 약 90 내지 약 100배 더 적은 범위의 HCP를 포함하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  38. 제31항에 있어서, HCP ELISA로 측정했을 때, 1차 관류물이 1차 용출액보다 약 840 내지 약 850배 더 적은 범위의 HCP를 포함하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  39. 제31항에 있어서, HCP ELISA로 측정했을 때, 2차 용출액이 1차 관류물보다 약 3 내지 5배 더 적은 범위의 HCP를 포함하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  40. 제1항에 있어서,
    (a) 혼합물을 평형 완충액 중의 양이온 교환 수지에 공급하되, 상기 양이온 교환 수지의 pH가 7이고 수지 1리터당 약 35g의 항체를 공급하거나, 또는 상기 양이온 교환 수지의 pH가 pH 5 내지 pH 7의 범위이고 수지 1리터당 약 35 내지 약 70g의 항체를 공급하거나, 또는 양이온 교환 수지의 pH가 5이고 수지 1리터당 약 70g의 항체를 공급하는 단계;
    (b) 평형 완충액을 사용한 1차 세척 및 용출 완충액과 물의 혼합물을 사용한 2차 세척을 포함하는 세척 단계로 상기 양이온 교환 수지로부터 HCP를 세척하는 단계;
    (c) 용출 완충액을 사용하여 상기 양이온 교환 수지로부터 항체를 용출시켜 1차 용출액을 형성하는 단계;
    (d) 상기 1차 용출액을 바이러스 불활성화 단계로 처리하되, 바이러스 불활성화를 pH 바이러스 불활성화에 의해 달성하여 바이러스 불활성화된 제조물을 형성하는 단계;
    (e) 상기 바이러스 불활성화된 제조물을 음이온 교환 수지에 공급하되, 바이러스 불활성화된 제조물을 음이온 교환 수지에 공급하기 전에, 바이러스 불활성화된 제조물의 pH 및 전도도가 음이온 교환 수지의 pH 및 전도도와 상당히 유사하도록 조정하여, 1차 관류물을 수득하는 단계; 및
    (f) 상기 1차 관류물을 소수성 상호작용 칼럼에 공급하여 2차 용출액을 수득하여, HCP 감소된 항체 제조물을 수득하는 단계를 포함하여,
    HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 항체 혼합물을 양이온 교환 수지에 공급하기 전에 단백질 A 캡처로 처리하지 않는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  42. 제40항에 있어서, 용출 완충액과 물의 혼합물이 약 40 내지 50% 용출 완충액과 약 50 내지 60% 물을 포함하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  43. 제40항에 있어서, HCP ELISA로 측정했을 때, 1차 용출액이 혼합물보다 약 90 내지 약 100배 더 적은 범위의 HCP를 포함하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  44. 제40항에 있어서, HCP ELISA로 측정했을 때, 1차 관류물이 1차 용출액보다 약 840 내지 약 850배 더 적은 범위의 HCP 포함하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  45. 제40항에 있어서, HCP ELISA로 측정했을 때, 2차 용출액이 1차 관류물보다 약 3 내지 약 5배 더 적은 범위의 HCP를 포함하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중의 어느 한 항에 있어서, HCP가 프로카텝신 L을 포함하여 프로카텝신 L 감소된 항체 제조물을 수득하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 카텝신 L 속도론적 검정으로 측정했을 때, 1차 용출액이 약 25 내지 약 60 RFU/s/항체mg 범위의 카텝신 L 활성을 포함하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  48. 제46항에 있어서, 카텝신 L 속도론적 검정으로 측정했을 때, 1차 관류물이 약 0.4 내지 약 4 RFU/s/항체mg 범위의 카텝신 L 활성을 포함하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  49. 제46항에 있어서, 카텝신 L 속도론적 검정으로 측정했을 때, 2차 용출액이 약 0.5 내지 약 1.5 RFU/s/항체mg 범위의 카텝신 L 활성을 포함하는, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  50. 제46항 내지 제49항 중의 어느 한 항에 있어서, 프로카텝신 L의 수준이 재현가능하게 낮은, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  51. 제1항 내지 제45항 중의 어느 한 항에 있어서, 항체가 항-종양 괴사 인자-알파(TNFα) 항체 또는 이의 항원 결합 부분인, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 사람화된 항체, 키메릭(chimeric) 항체 또는 다가 항체인, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  53. 제51항에 있어서, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 인플릭시맙(infliximab) 또는 골리무맙(golimumab)인, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  54. 제51항에 있어서, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 사람 항체인, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 표면 플라스몬 공명으로 측정했을 때, 1 x 10-8 M 이하의 Kd 및 1 x 10-3 s-1 이하의 Koff 속도상수로 사람 TNFα로부터 해리되고, 표준 시험관내 L929 검정에서 1 x 10-7 M 이하의 IC50으로 사람 TNFα 세포독성을 중화시키는 분리된 사람 항체인, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  56. 제54항에 있어서, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합 부분이,
    a) 표면 플라즈몬 공명으로 측정했을 때, 1 x 10-3 s-1 이하의 Koff 속도 상수로 사람 TNFα로부터 해리되고;
    b) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나, 위치 1, 4, 5, 7 또는 8번에서의 단일 알라닌 치환 또는 위치 1, 3, 4, 6, 7, 8 및/또는 9번에서의 1개 내지 5개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호 3으로부터 변형된, 경쇄 CDR3 도메인을 보유하며;
    c) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나, 위치 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 또는 11번에서의 단일 알라닌 치환 또는 위치 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 및/또는 12번에서의 1개 내지 5개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호 4로부터 변형된, 중쇄 CDR3 도메인을 보유하는 특징을 갖는 분리된 사람 항체인, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  57. 제54항에 있어서, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역(LCVR) 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역(HCVR)을 보유하는 분리된 사람 항체인, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  58. 제54항에 있어서, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 아달리무맙인, HCP 감소된 항체 제조물을 생산하는 방법.
  59. 제1항 내지 제45항 중의 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 생산된, HCP ELISA로 측정했을 때 HCP가 실질적으로 부재하는 항체 제조물.
  60. 제1항 내지 제45항 중의 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 생산된 HCP 감소된 항체 제조물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  61. HCP 감소된 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서, HCP ELISA로 측정했을 때 HCP의 수준이 항체 1mg당 약 70ng 이하의 HCP를 포함하는 약제학적 조성물.
  62. 제61항에 있어서, HCP ELISA로 측정했을 때, HCP의 수준이 항체 1mg당 약 13ng 이하의 HCP를 포함하는 약제학적 조성물.
  63. 제61항에 있어서, HCP ELISA로 측정했을 때, HCP의 수준이 항체 1mg당 약 5ng 이하의 HCP를 포함하는 약제학적 조성물.
  64. 항체를 포함하는 조성물로서, HCP ELISA 검정으로 측정했을 때, 조성물에 검출가능한 수준의 HCP가 없는, 항체를 포함하는 조성물.
  65. 제1항 내지 제45항 중의 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 생산된, 프로카텝신 L이 실질적으로 부재하는 항체 제조물.
  66. 제1항 내지 제45항 중의 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 생산된, 프로카텝신 L 감소된 항체 제조물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  67. 프로카텝신 L 감소된 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서, 프로카텝신 L의 수준이 약 3.0 RFU/s/항체mg의 카텝신 활성 이하인 약제학적 조성물.
  68. 제59항 내지 제67항 중의 어느 한 항에 있어서, 항체가 항-종양 괴사 인자-알파(TNFα) 항체 또는 이의 항원 결합 부분인 조성물 또는 제조물.
  69. 제68항에 따른 조성물 또는 제조물을 사람 피험체에게 투여함을 포함하여, TNFα 활성이 유해한 장애를 치료하는 방법.
  70. 포장 재료 및 아달리무맙을 포함하고, 아달리무맙 제형이 아달리무맙 1mg당 약 70ng 이하의 HCP를 포함한다는 것을 표시하는 라벨 또는 포장 삽입물이 상기 포장 재료 내에 포함된 제조품.
  71. 포장 재료 및 아달리무맙을 포함하고, 아달리무맙 제형이 아달리무맙 1mg당 약 13ng 이하의 HCP를 포함한다는 것을 표시하는 라벨 또는 포장 삽입물이 상기 포 장 재료 내에 포함된 제조품.
  72. 포장 재료 및 아달리무맙을 포함하고, 아달리무맙 제형이 아달리무맙 1mg당 약 5ng 이하의 HCP를 포함한다는 것을 표시하는 라벨 또는 포장 삽입물이 상기 포장 재료 내에 포함된 제조품.
  73. 포장 재료 및 아달리무맙을 포함하고, 아달리무맙 제형이 약 3.0 RFU/s/아달리무맙mg의 카텝신 L 활성으로 표시되는 수준 이하의 프로카텝신 L의 수준을 포함한다는 것을 표시하는 라벨 또는 포장 삽입물이 상기 포장 재료 내에 포함된 제조품.
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