KR20160118369A - 항체 정제 프로세스 - Google Patents

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KR20160118369A
KR20160118369A KR1020167026578A KR20167026578A KR20160118369A KR 20160118369 A KR20160118369 A KR 20160118369A KR 1020167026578 A KR1020167026578 A KR 1020167026578A KR 20167026578 A KR20167026578 A KR 20167026578A KR 20160118369 A KR20160118369 A KR 20160118369A
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피터 스탠리 가그논
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에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치
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Abstract

표적 단백질을 정제하는 방법은 혼합물을 형성하도록 적어도 하나의 표적 단백질을 포함하는 세포 배양 수확물 또는 단백질 제제를 7개 내지 10개의 탄소 원자들을 갖는 적어도 하나의 지방산과 접촉시키는 단계, 이러한 혼합물을 알란토인과 접촉시키는 단계, 그리고 이후에 상기 표적 단백질을 포함하는 용액을 제공하도록 고체 물질들을 분리하는 단계를 포함한다. 고체 물질들은 여과, 침강 또는 원심분리에 의해 제거될 수 있고, 상기 지방산들은 에난트산, 카프릴산, 펠라르곤산, 노넨산 또는 카프릭산이 될 수 있다. 본 발명은 또한 이러한 항체 정제의 방법을 가능하게 하는 키트들에 관한 것이다.

Description

항체 정제 프로세스{ANTIBODY PURIFICATION PROCESS}
여기에 개시되는 실시예들은 IgG 및 IgM 항체들과 같은 항체들을 포함하는 단백질들을 정화하기 위한 방법들에 관한 것이다.
단백질들의 정제는 통상적으로 세포들과 잔해물이 제거되는 정화 단계로 시작되므로, 남아 있는 상청액(supernatant)은 그렇지 않으면 이들의 존재에 의해 방해받을 수 있는 방법들로 처리될 수 있다. 이들의 제거는 통상적으로 원심분리 및 여과와 같은 물리적인 방법들을 수반한다. 이러한 단계는 때때로 음이온 교환 능력들을 갖는 여과 물질들의 사용, 또는 항체를 함유하는 수확물에 대한 음이온 교환 입자들 또는 가용성 중합체들의 직접적인 첨가를 수반한다(Gagnon, P.의"Purification Tools for Monoclonal Antibodies"(Validated Biosystems, Tucson, 1996); Kuczewski, M, 등의 "Biopharm Int."(23(3), (2010), 20-25); Kuczewski, M. 등의 "Biotechnol. J."(6, (2011) 56-65).
알란토인(allantoin), 가용성 유기 양이온들 및 혼합된 입자들로의 물리적으로 정화된 세포 배양 수확물들의 이차적인 처리는 기재되어 있다(Gan, H. 등의 "J. Chromatogr. A"(1291 (2013) 33-40)). 이러한 접근은 특히 죽은 세포들 및 크로마틴(chromatin)과 연관된 응집체들의 레벨들에 의해 배출되는 크로마틴의 함량을 감소시켰지만, 원하는 순도를 구현하는 데 세 크로마토그래피 단계들이 연속적으로 필요하였다. 알란토인은 처방전 없이 구입할 수 있는 건강관리 제품들에서 널리 사용되는 FDA 승인된 항염증제이다. 이는 수소 결합을 통해 분명히 IgG의 용액들을 포함하여 단백질 용액들로부터 엔도톡신(endotoxin)을 제거하는 것으로 알려져 있다(Vagenende 등의 "ACS. Appl. Mater. Interfaces"(22 (2013) 4472-4478); Vagenende 등의 "J. Chromatogr. A"(1310 (2013) 15-20)).
카프릴산(옥탄산)으로의 오염물 공동 침전에 의한 IgG 항체들의 부분 정제는 개시되었다(Chantuin, A. 등의 "Arch. Biochem. Biophys."(89 (1960) 218-220); McKinney, M. 등의 "J. Immunol. Met."(96 (1987) 271-278)). 지방산은 모든 단백질들과 결합되지만, 특히 산성의 비-IgG 오염물들을 침전시키는 경향이 있다(Gagnon의 앞서의 문헌; Morais, V. 등의 "Biotechnol. Appl. Biochem."(59 (2012) 50-54)). 카프릴산 농도, pH, 염 농도, 온도 그리고 가용성 IgG 제제로부터 잔류 카르릴산을 제거하는 후속 크로마토그래피 단계에 대한 필요성을 포함하여 세포 배양 수확물들에 대한 적용을 위한 메커니즘과 프로세스 발달 지침들은 나타나있다(Gagnon의 앞서의 문헌). 상기 기술은 다른 수단들에 의한 후속 정제를 위한 원료 샘플들을 제조하는 데 가장 흔히 기재되지만(Gagnon의 앞서의 문헌; Y. Yigsaw 등의 "Improving upstream feed stock to downstream operations, Recovery of Biologics Conference XIII"(Quebec, 2008); Arunakumari, A. 등의 미국 특허 출원 공개 제2012/0101262(A1)호), 단백질 A 친화 크로마토그래피에 의한 항체 포집에 후속하는 연마 단계로서도 적용되어 왔다(Y. Brodsky 등의 "Biotechnol. Bioeng."(109 (2012) 2589-2598)).
본 발명은 항체들을 포함하는 단백질들을 정화하기 위한 방법들을 제공한다.
일부 측면들에 있어서, 여기에 개시되는 실시예들은 혼합물을 형성하도록 세포 배양 수확물(cell culture harvest)을 7개 내지 10개의 탄소 원자들을 갖는 적어도 하나의 지방산 및 과포화시키는 농도로 알란토인(allantoin)과 접촉시키는 단계, 그리고 오염물(contaminant)들의 감소된 부하(load)를 갖는 상기 표적 단백질을 포함하는 용액을 제공하도록 고체 물질들을 분리하는 단계를 포함하는 표적 단백질(target protein)을 정제하는 방법들에 관한 것이다. 처리된 액체는 원하는 경우에 다른 정제 방법들에 의해 처리되기 전에 양성 전하들을 포함하는 내부 접촉 표면 접촉을 갖는 장치를 선택적으로 더 통과할 수 있다.
일부 측면들에 있어서, 여기에 개시되는 실시예들은 혼합물을 형성하도록 세포 배양 수확물을 7개 내지 10개의 탄소 원자들을 갖는 적어도 하나의 지방산과 접촉시키는 단계, 상기 혼합물을 알란토인과 접촉시키는 단계 및 상기 혼합물을 with 비이온성 또는 양이온성 계면활성제와 접촉시키는 단계, 이후에 상기 항체를 포함하는 용액을 제공하도록 고체 물질들을 제거하는 단계를 포함하는 항체를 정제하기 위한 방법들에 관한 것이다.
서로에 대해 화학적으로 길항적인 물질들의 결합이 물질들의 임의의 하나에 개별적으로 의존하는 정제 방법들보다 높은 레벨의 순도 및 낮은 레벨의 탁도(turbidity)로 항체들을 포함하는 표적 단백질들을 제공하는 예기치 않은 효과를 가지는 점이 발견되었다. 길항적인 물질들의 결합들은 통상적으로 각각의 다른 개별적인 효과들을 소거하는 것으로 기대되었고, 낮은 단백질 정제, 낮은 단백질 회수 또는 이들 모두를 가져올 수 있었다, 본 발명의 실시예들은 제공되는 각각의 성분들의 임의의 것의 능력을 실질적으로 넘는 레벨들의 단백질 순도 및 회수를 상승 작용에 의해 구현하도록 동작하는 물질들 내의 정의된 윈도우(window)들을 제공한다. 이들 관찰들은 특히 IgG 및 IgM 항체들과 같은 항체들에 적용될 수 있다. 또한, 실험 결과들은 결합에서 각각의 성분들의 반응도 곡선들이 개별적으로 사용될 때의 이들의 반응도 곡선들과 구별되는 점을 나타낸다. 이는 여기에 개시되는 실시예들의 유용성이 각각의 성분들의 알려진 성질들이나 적용들에 의해 예상될 수 없었던 점을 강조한다. 결합되는 성분들은 특히 7개 또는 8개 또는 9개 또는 10개의 탄소 원자들을 함유하는 포화 지방산들, 또는 6개 또는 7개 또는 8개 또는 9개의 탄소 원자들 및 1개의 이중 결합을 함유하는 불포화 지방산들; 그리고 가용성 및/또는 양성 전하들을 지니는 고체 물질들을 포함한다. 이들은 알란토인(allantoin)을 더 포함할 수 있다. 여기에 개시되는 방법들에 있어서, 상기 물질들은 항체의 종들과 같은 표적 단백질을 함유하는 액체 제제 내에서 결합되며, 이후에 배양의 적절한 기간 후, 고체들은 상기 항체를 포함하는 용액을 제공하도록 제거된다.
실험 데이터는 여기에 개시되는 방법들에 채용되는 성분들 사이의 상호간의 길항적인 상호작용들을 나타낸다. 상호 길항작용의 하나의 예에서, 결정성 알란토인은 유사한 방식으로 첨가된 지방산들에 작용하는 높은 가능성을 나타내는 세포 배양 수확물 내의 지방산들의 99% 이상에 결합되는 것으로 실험적으로 나타났다. 이는 비-항체 오염물들을 침전시키는 목적을 위해 항체를 함유하는 세포 배양 수확물에 첨가되는 지방산들의 효과를 감소시키는 것으로 예상되어야 한다. 이와 반대로, 여기에 개시되는 방법들의 이러한 측면은 과학 문헌에서 최적으로 보고된 레벨들의 반보다 작은 농도들에서 지방산들의 효과적인 사용에 기여한다. 이론에 의해 제한되지 않고, 수소 결합을 통해 용해되지 않은 알란토인과 복합된 지방산들이 이들의 고유 전하, 소수성, 그리고 오염물들에 결합되는 능력을 보존하지만, 용해되지 않은 알란토인의 물리적 밀도가 침강에 의한 이들의 제거를 향상시키는 것이 될 수 있다. 상호 길항작용의 다른 예에서, 소수성 상호작용들을 약화시키고, 이에 따라 이들의 효과를 구현하는 지방산들의 능력을 간섭할 것으로 예상되는 매우 낮은 농도들의 비이온성 계면활성제들의 첨가는 놀랍게도 유리 경쇄(free light chain) 오염물들을 제거하는 효과들을 증진시키지만, 보다 큰 양들은 산성의 비-항체 단백질들의 제거와 절충된다. 다른 예에서, 보다 놀라운 예로서, 지방산들의 전하 및 소수성 효과들 모두를 간섭해야 하는 낮은 레벨들의 양이온성 계면활성제들이 산성의 비-항체 단백질들을 제거하는 상기 결합의 능력을 대략 두 배로 만들지만, 보다 높은 농도들은 반대의 효과를 가진다. 이들 예들은 통상적으로 길항적인 성분들이 적절하게 균형을 이룬 비율들로 결합될 때에 이들이 이러한 길항제들의 부존재에서 효과적으로 제거되지 않는 오염물들을 제거하는 것이 가능한 윈도우들을 생성하는 점을 강조한다.
알란토인의 포함이 특히 미립자들을 제거하는 지방산 침전의 능력을 향상시키는 점이 더 발견되었다. 이론에 의해 제한되지 않고, 알란토인의 효과들은 수소 결합을 통해 매개되는 것으로 여겨지며, 이에 의해 바이러스들을 포함하는 극히 작은 입자들을 포함하여 큰 분자 집합들이 보다 큰 알란토인 결정들에 결합된다. 입방 ㎝당 1.45g의 그 상대적으로 높은 밀도로 인하여, 알란토인 결정들은 연관된 물질들의 빠른 중력 침강을 증진시키며, 원심분리에 의한 이들의 침강을 향상시킨다. 알란토인 결정들은 또한 지방산-오염물 침전물들의 물리적인 구성을 통상적으로 끈적끈적한 슬러지(sludge)로부터 액체의 통과를 가능하게 하고 여과 효율을 증진시키는 보다 케이크와 같은 경도(consistency)로 변경시킨다. 약 36mM의 최대까지 수성 용액에 첨가되는 알란토인의 일부기 용해되며, 단백질들과 지방산들의 상호작용을 약화시키는 것으로 여겨진다. 용해된 알란토인은 고체들의 제거 후에 항체를 함유하는 용액 내에 남는 것으로 이해된다. 이들 특징들은 환영할만하지만, 이들은 실험 데이터가 알란토인이 세포 배양 수확물들로부터의 99.7%의 지방산들과 결합되는 것을 나타내기 때문에 역설적이다. 이러한 의미에서, 알란토인의 비율은 이상적으로 세심하게 조절된다. 정해진 응용에 대한 적절한 비율은 일반적으로 1%-2%(w/v)로부터 출발하여 간단한 실험에 의해 결정된다.
또한, 여기에 개시되는 방법들이 카프릴산(caprylic acid)으로 치환되는 7개 또는 9개 또는 10개의 탄소 원자들을 갖는 포화 지방산들을 예기치 않게 허용하는 점이 발견되었다. 에난트(enanthic)(헵탄(heptanoic))산은 7개의 탄소들을 함유한다. 펠라르곤(pelargonic)(노난(nonanoic))산은 9개의 탄소들을 함유한다. 카프릭(capric)(데칸(decanoic))산은 10개의 탄소들을 함유한다. 심지어 보다 놀랍게는, 6개 또는 7개 또는 8개 또는 9개의 탄소 원자들 및 1개의 이중 결합을 갖는 불포화 지방산들이 효과적이다. 항체 정제에 대해 과학 문헌에서 무시되었던 옥탄산(octanoic acid) 이외의 종들에도 불구하고, 실험 데이터는 비록 항체 회수를 감소시키는 높은 위험이 있지만, 보다 소수성인 지방산들이 카프릴산보다 항체 응집체들 및 조각들을 효과적으로 제거하는 점을 나타낸다.
여기에 개시되는 방법들의 많은 측면들의 통합을 제시하는 예시적인 일 실시예에 있어서, 알란토인은 0.3%(v:v)의 최종 농도를 생성하는 양으로 노난산의 첨가가 수반되어 1%(w/v)의 최종 농도를 생성하는 양으로 항체를 함유하는 세포 배양 수확물에 첨가된다. 상기 혼합물은 침전물이 노난산과 오염물들의 상호작용에 의해 형성되고, 용해되지 않은 알란토인 결정들 사이에 배치되는 동안인 2시간 동안 배양된다. 혼합이 종료되고, 노난산-알란토인-오염물 침전물들, 잔류 노난산 및 용해되지 않은 알란토인으로 구성되는 고체들이 임의의 편리한 방법으로 제거된다. 관련된 실시예에 있어서, 실질적으로 고체가 없는 항체를 함유하는 액체는 전기양성 뎁스 필터(depth filter)를 통한 통과, 또는 상기 샘플이 전기양성 또는 다른 기능화된 표면에 접촉되는 다른 장치에 의해 더 처리되며, 이는 샘플로부터 잔류 지방산 또는 다른 가용성의 비-항체 종들을 포집하는 추가적인 이점을 제공할 수 있다.
여기에 개시되는 방법들의 다양한 측면들의 통합을 제시하는 예시적인 다른 실시예에 있어서, 알란토인은 0.2%(v:v)의 최종 농도를 생성하는 양으로 카프릭산(capric acid)의 첨가가 후속되어 2%(w/v)의 최종 농도를 생성하는 양으로 세포 배양 수확물에 첨가된다. 상기 혼합물은 2시간 동안 배양되며, 그 동안에 침전물이 카프릭산과 오염물들의 상호작용에 의해 형성되고, 용해되지 않은 알란토인 결정들 사이에 배치된다. 상기 혼합물은 이후에 용해되지 않은 알란토인으로 그 사이에 배치되는 카프릭산-오염물 침전물들을 유지하지만 액체의 통과를 허용하는 적어도 하나의 기능화된 고체를 포함하는 장치와 접촉된다.
여기에 개시되는 방법들의 다양한 측면들의 통합을 제시하는 예시적인 다른 실시예에 있어서, 알란토인은 0.5%(v:v)의 최종 농도를 생성하는 양으로 노넨산(nonenoic acid)의 첨가가 수반되어 1%(w/v)의 최종 농도를 생성하는 양으로 세포 배양 수확물에 첨가된다. 상기 혼합물은 2시간 동안 배양되며, 그 동안에 침전물이 노넨산과 오염물들의 상호작용에 의해 형성되고, 용해되지 않은 알란토인 결정들 사이에 배치된다. 용해되지 않은 알란토인 사이에 배치되는 노넨산-알란토인-오염물 침전물들은 임의의 편리한 방법으로 제거된다.
일부 실시예들에 있어서, 약 0.2%의 카프릭산은 약 0.3%의 농도의 펠라르곤산(pelargonic acid), 또는 약 0.4%의 농도의 카프릴산(caprylic acid), 또는 약 0.6%의 농도의 에난트산(enanthic acid)으로 대체될 수 있다. 이는 상기 지방산의 농도 및 소수성에 대한 오염물 제거 및 항체 회수의 의존성을 나타낸다. 지방산이 보다 소수성일수록, 우수한 결과를 구현하기 위해 필요한 농도가 보다 낮아지며, IgG 항체 회수와 절충하는 농도가 보다 낮아지는 점이 발견되었다. 절대 및 상대 농도가 하나의 항체로부터 다른 하나 사이에 변화될 수 있으며, 상기 특정 지방산들의 농도들이 이에 따라 변화될 수 있지만, 이러한 값들이 숙련자에게 새로운 항체 시스템 내의 정제를 평가할 때에 편리한 출발점을 알리도록 제공되는 점이 이해될 것이다.
일부 실시예들에 있어서, 약 0.2%의 카프릴산이 높은 농도들에 비해 보다 효과적인 응집체 제거를 유지할 수 있다. 그러나, 약 0.4%에서, 유리 항체 경쇄, 경쇄 이합체(dimer)들 및 다른 조각 형태들뿐만 아니라 다른 오염물들의 보다 효과적인 제거가 구현될 수 있다. 따라서, 해당 기술 분야의 숙련자는 잠재적인 후속하는 분별 방법들의 구성에서 그 영향들을 고려하여 주어진 지방산의 농도를 최적화하는 값을 인지할 것이다. 여기에 개시되는 방법들에 응집체들의 제거를 위해 특히 적합한 방법이 후속되는 경우, 항체 조각들을 제거하도록 지방산 농도를 최적화하는 것이 유리할 수 있다. 여기에 개시되는 방법들이 조각들을 제거하기 위해 특히 적합한 방법에 수반되는 경우, 응집체들을 제거하도록 지방산 농도를 최적화하는 것이 유리할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 알란토인은 지방산 이후에 첨가될 수 있다. 다른 관련된 실시예에 있어서, 알란토인은 상기 침전물이 형성되었던 이후까지 첨가되지 않는다. 다른 실시예에 있어서, 알란토인은 상기 침전물이 제거되었던 이후까지 첨가되지 않는다. 일부 실시예들에 있어서, 알란토인이 생략된다.
일부 실시예들에 있어서, 비이온성 계면활성제 또는 쌍성 이온성 계면활성제가 그 임계 미셀 농도(critical micelle concentration) 아래의 농도로 혼합물에 첨가될 수 있다. 실험 데이터는 이러한 점이 항체 조각들의 제거를 향상시키는 반면, 비록 항체 회수를 증가시키는 이익을 상쇄하지만 상기 임계 미셀 농도 이상의 계면활성제 농도들은 항체 조각들의 제거를 억제하는 것을 나타낸다. 일부 실시예들에 있어서, 실질적으로 높은 농도의 비이온성 또는 쌍성 이온성 계면활성제는 산성의 숙주 세포 단백질들의 감소와 실질적으로 절충될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 낮은 농도의 양이온성 계면활성제는 숙주 단백질들 및 DNA의 제거를 실질적으로 향상시킬 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 계면활성제는 세틸트리메틸암노늄 브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide: CTAB)로도 알려진 헥사데실트리메틸암노늄 브로마이드(hexadecyltrimethylammonium bromide), 또는 도데실트리메틸암모늄 브로마이드(dodecyltrimethylammonium bromide); 또는 데실트리메틸암모늄 브로마이드(decyltrimethylammonium bromide); 또는 미리스틸트리메틸암모늄 브로마이드(myristyltrimethylammonium bromide); 또는 트리메틸옥타데실암모늄 브로마이드(trimethyloctadecylammonium bromide), 또는 일차, 이차 또는 삼차 아미노기와 같은 다른 양성으로 하전된 모이어티(moiety)를 갖는 변형들, 또는 보다 많거나 보다 적은 탄소 원자들을 갖는 변형들이다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 0.01%의 CTAB가 제거되는 숙주 단백질의 양을 두 배로 할 수 있는 반면, 0.05%의 CTAB는 5의 양으로 제거 효율을 감소시킬 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 하나 또는 그 이상의 화학적으로 기능화된 고체들은 동일하거나 유사한 모이어티들을 갖는 화학적으로 기능화된 가용성 실체(entity)들로 대체될 수 있거나, 이들과 결합될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 고체들은 여과 또는 침강을 포함하고, 미세여과(microfiltration), 심층 여과(depth filtration) 및 원심분리를 포함하는 그룹들로부터의 하나 또는 그 이상의 처리들을 포함하는 임의의 편리한 방법으로 항체를 함유하는 용액으로부터 분리될 수 있으며, 여기서 심층 여과는 실질적으로 불활성인 여과 매체, 또는 화학적으로 기능화되었거나 화학적으로 기능화된 물질들과 결합된 여과 매체로 수행될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 알란토인은 약 0.6% 내지 약 30%, 또는 약 1% 내지 약 30%, 또는 약 1% 내지 약 10%, 또는 약 1% 내지 약 2%의 중량 대 부피 농도로 첨가될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 알란토인은 생략될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 알란토인은 약 0.6%까지의 영(0)이 아닌 양으로 존재할 수 있다. 알란토인의 존재가 1%와 같이 첨가된 알란토인의 일부가 용해되지 않는 충분한 농도인 것이 바람직할 수 있지만, 방법들은 알란토인의 부존재, 또는 실질적으로 모든 알란토인이 용해될 수 있는 농도로의 알란토인의 존재를 충분히 야기할 수 있다. 실험 데이터는 2%, 3%, 4%, 5%, 10% 또는 그 이상과 같은 알란토인의 보다 큰 비율들이 응집체들의 보다 효과적인 감소를 보아 우수하게 유지하지만, 통상적이지만 측정가능하게 항체 회수 또한 감소시키는 점을 나타낸다. 실험 데이터는 또한 채용될 때에 알란토인이 여기에 개시되는 방법들에 바람직하게 기여하는 모든 기록에서 알란토인이 독립적으로 바이러스 및 엔도톡신(endotoxin)의 레벨들을 by 3로그(log) 또는 그 이상으로 감소시킬 수 있고, 일반적으로 현저히 깨끗한(2.0NTU) 상청액을 생성하는 점을 보여준다. 어떤 특정한 이론에 의해 제한되지 않고, 큰 생물학적 종들 및 집합들과 알란토인의 작용 매커니즘은 주로 수소 결합을 수반하며, 이는 왜 그 효과가 pH 또는 전도도의 실질적인 변화들에 의해 적은 영향을 받는 지를 부분적으로 설명할 수 있는 점을 나타낸다. 이는 또한 왜 알란토인에 결합된 지방산들이 오염물들과 이들의 상호 작용성을 유지하는 지를 설명할 수 있었다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 지방산은 CH3(CH2)nCOOH의 일반 구조식을 갖는 하나 또는 그 이상의 종들을 포함할 수 있고, 여기서 n은 4부터 12까지를 포함하는 정수이다. 일부 실시예들에 있어서, n은 5부터 8까지의 정수이다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 지방산은 에난트산(헵탄산)이 될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 지방산은 카프릴산(옥탄산)이 될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 지방산은 펠라르곤산(노난산)이 될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 지방산은 카프릭산(데칸산)이 될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 지방산의 하나 이상의 종들이 채용될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 지방산은 나트륨 염, 예를 들면 카프릴산 나트륨(sodium caprylate)과 같은 염의 형태로 첨가될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 지방산의 지방 부분은 탄소 원자들의 선형의 "직선" 사슬로 구성될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 지방산의 지방 부분은 일차 6-탄소 사슬의 2번 위치에서 2-탄소 사슬을 함유할 수 있어, 전체 8개의 탄소 원자들을 생성하는 2-에틸헥산산(ethylhexanoic acid)과 같은 분지 사슬로 구성될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 지방산은 0.05% 내지 5%, 또는 0.1% 내지 2%, 또는 0.2% 내지 0.5%, 또는 중간 값의 농도로 존재할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 지방산은 이중 결합을 포함할 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 이중 결합은 탄소 사슬 내의 임의의 위치에 있을 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 지방산 사슬은 6개 또는 7개 또는 8개 혹은 9개의 탄소 원자들을 함유할 수 있다. 이러한 일 실시예에 있어서, 상기 지방산은 말단 이중 결합을 갖는 노넨산(nonenoic acid)이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 지방산은 염의 형태로 첨가될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 지방산은 0.05% 내지 5%, 또는 0.1% 내지 2%, 또는 0.2% 내지 0.5% 혹은 중간 값의 농도로 존재할 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 0.4% 내지 0.6%의 8-노넨산이 0.4%의 카프릴산보다 우수한 결과들을 제공한다.
지방산의 하나 이상의 종들을 채용하는 일부 실시예들에 있어서, 상기 종들은 소수성들, 예를 들면 헵탄산 및 데칸산의 결합, 또는 카프릴산 및 노난산의 결합, 또는 보다 크거나 보다 작은 소수성의 지방산들을 잠재적으로 포함하는 다른 결합들의 범위를 포괄하도록 선택될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 각각의 지방산들의 비율들은 10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 또는 그 사이의 임의의 중간 범위, 또는 이들 범위 바깥의 다른 비율들이 될 수 있다. 이러한 일부 결합들에서, 작업 용액에 첨가된 지방산 종들의 전체 양은 0.01%까지의 영(0)이 아닌 양, 0.01% 내지 0.1%, 0.1% 내지 1%, 1% 내지 5%, 0.2% 내지 0.4%, 또는 중간 범위나 값의 범위 내에 있을 수 있다.
지방산의 하나 이상의 종들을 채용하는 일부 실시예들에 있어서, 상기 종들의 전체 숫자는 임의의 비율 및 유용성을 제공하는 실험 결과들에 의해 도시되는 임의의 전체 양으로 3이나 4 또는 그 이상을 포함할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 지방산은 상기 혼합물을 하나 또는 그 이상의 기능화된 고체들에 노출시키기 전에 항체 제제 내에 5분 내지 360분, 또는 15분 내지 240분, 또는 60분 내지 120분, 또는 30분 내지 60분 동안, 또는 중간 기간 동안 배양되도록 남는다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 지방산이 배양되는 온도는 탄소 사슬 길이가 지방산 용해도에 직접 영향을 미치기 때문에 존재하는 지방산의 가장 큰 종들에 의해 영향을 받을 수 있으며, 여기서 상기 사슬 길이가 짧을수록 상기 용해도는 높아지고, 상기 사슬 길이가 길수록 감소되는 온도와 함께 용해도의 감소가 커진다. 이에 따라 모든 경우들에서, 약 37℃의 초기 온도가 낮은 온도들에서보다 지방산을 보다 높은 농도로 용매화할 것이다. 이는 세포 배양의 종료에 즉시 후속되는 상기 수확물에 대한 지방산의 직접 첨가를 선호한다. 배양은 후에 여전히 바이오리액터 내에서 37℃에서 계속될 수 있다. 상기 지방산이 보다 소수성일수록, 그 용해도는 온도에 보다 민감하며, 이에 따라 그 기능성이 온도에 보다 민감한 점이 분명해질 것이다. 일부 실시예들에 있어서, 보다 높은 온도들은 C12, C13, C14, C15 또는 심지어 그 이상까지의 지방산들의 사용을 허용할 수 있다. 보다 낮은 온도들을 채용하는, 예를 들면 처리가 약 2℃ 내지 약 8℃에서 수행되는 일부 실시예들에 있어서, C8, C7, C6 또는 심지어 그 이하와 같은 보다 짧은 사슬의 지방산들의 사용이 선호될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 여기에 개시되는 방법들은 pH 조정이 필요하지 않다. 상기 지방산의 첨가는 충분히 낮은 레벨까지 상기 수확물의 pH를 감소시킬 수 있고, 하나 또는 그 이상의 고체들에 의한 과잉의 지방산의 후속하는 포집이 pH를 최초의 값으로 실질적으로 회복시킬 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 수확물은 상기 지방산의 첨가 전에 특정 pH 값으로 적정될 수 있으며, 이는 상기 방법에 견고성을 더할 수 있지만, 후속하는 방법에 의해 보다 높은 정도의 순도로 분별되는 상기 샘플의 제조를 위한 목적으로 잠재적으로 상기 방법이 수행되었던 후에 pH가 다시 조정되는 점을 필요로 할 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 초기 pH는 4 내지 6, 또는 4.5 내지 5.5, 또는 4.75 내지 5.25, 혹은 5.1 내지 5.3의 범위 내의 값, 또는 5.2와 같은 중간 값, 또는 또 다른 중간 값까지 조절될 수 있다. 해당 기술 분야의 숙련자라면 최적 pH가 항체의 하나의 종으로부터 다른 하나까지 및 항체가 머무르는 배지의 조성에 따라 변화될 수 있는 점을 이해할 것이다. 최적의 결과들을 구현하기 위해 채용되는 pH가 여기에 개시되는 방법들의 추가적인 요소들의 기여로 인해 지방산 침전만이 요구되는 경우보다 적절할 수 있는 점이 동일하게 이해될 것이다. 이는 종래의 지방산 침전의 이용과 관련된 낮은 pH 값들에 대한 노출이 상기 항체에 대해 지속되는 역효과들을 가질 수 있는 범위 이내이기 때문에 주목할 만한 고려 사항이 된다. 이는 개시되는 방법들의 또 다른 예기치 않은 유익을 강조한다.
일 실시예에 있어서, 여기에 개시되는 방법들은 물로나 NaCl 또는 다른 염으로와 같이 염 농도의 감소 또는 증가를 통해 전도도를 조절할 필요가 없다. 그러나, 염 농도가 항체 회수 및 순도에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 변화들이 상기 방법의 본질적인 특징들을 벗어나지 않고 탐구될 수 있다. 실험 증거는 항체 용해도가 지방산들 또는 다른 첨가제들의 존재와 독립적으로 낮은 전도도 및 낮은 pH의 조건들에서 절충되게 되는 점을 나타낸다. 낮은 항체 용해도는 지방산 침전들과 함께 상당한 항체 손실의 상승된 가능성으로 해석된다. pH의 감소가 전도도가 감소될 수 있는 정도를 제한할 수 있고, 항체의 과도한 손실을 회피하도록 증가되는 전도도를 제시할 수 있는 것을 의미한다. 놀랍게도, 여기에 개시되는 방법들의 효과는 20mS/㎝까지 증가되는 전도도에 의해 실질적으로 감소되지 않는다. 이는 전하 상호작용들이 상기 시스템의 선택성의 주요 부분을 조절하는 것으로 여겨지고, 20mS/㎝는 많은 이러한 상호작용들을 유지하기에 충분하며, 모든 이러한 상호작용들을 실질적으로 약화시기 때문에 주목할 만하다. 그러나, 결과들이 추출되는 정제된 항체에 따라 변화될 수 있고, 보다 낮은 전도도 값들에서 실험들이 수행되는 값이 존재할 수 있는 점이 이해될 것이다. 전도도를 감소시키는 것은 양이온성 고체들의 간섭과 지방산과 오염시키는 단백질들의 상호작용을 증가시키는 것으로 나타날 수 있었지만, 가용성 오염물들에 결합되는 양이온성 고체들의 능력을 증가시켜 향상된 전체적인 결과를 예기치 않게 생성할 수 있었다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 세포 배양 수확물을 상기 적어도 하나의 지방산과 접촉시킨 후 또는 상기 분리하는 단계에서 존재하는 고체 물질들은 침강 또는 원심분리에 후속하는 침강에 의해 제거된다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 세포 배양 수확물을 상기 적어도 하나의 지방산과 접촉시킨 후 또는 상기 분리하는 단계에서 존재하는 고체 물질들은 여과에 의해 제거된다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 여과는 멤브레인 여과(membrane filtration) 또는 심층 여과(depth filtration)를 포함한다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 멤브레인 여과 또는 심층 여과는 기능화된 필터 멤브레인을 포함한다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 적어도 하나의 작용기(functional group)는 전기양성이다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 적어도 하나의 작용기는 금속 이온들과 결합된다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 첫 번째의 접촉시키는 단계는 상기 IgG 항체의 부분 정제에 의해 진행된다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 세포 배양 수확물은 세포들을 함유한다. 앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 세포 배양 수확물은 세포들을 함유하지 않는다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 적어도 하나의 지방산은 CH3(CH2)nCOOH의 일반 구조식을 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 지방산은 에난트(헵탄)산, 또는 카프릴(옥탄)산, 또는 펠라르곤산, 또는 카프릭(데칸)산을 포함한다. 일부 관련된 실시예들에 있어서, 상기 지방산은 상기 지방산 사슬의 임의의 위치에 단일 결합을 함유할 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 이중 결합을 함유하는 지방산은 노넨산이다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 지방산은 8-노넨산이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 일차 탄소 사슬은 분지되지 않을 수 있고, 다른 것들은 분지될 수 있다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 적어도 하나의 지방산은 (a) 약 0.05%부터 약 5%까지, (b) 약 0.1%부터 약 1.0%까지, (c) 약 0.2%부터 약 0.4%까지, 그리고 (d) 약 0.1%부터 약 0.2%까지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 범위 내의 농도로 존재한다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 양이온성 계면활성제는 (a) 약 0.001%부터 0.1%까지, (b) 약 0.005%부터 0.05%까지, 또는 (c) 약 0.0125%부터 0.025%까지의 농도로 존재할 수 있다. 앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 양이온성 계면활성제는 세틸트리메틸암노늄 브로마이드가 될 수 있다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 소수성의 양이온 성분은 벤잘코늄 클로라이드(benzalkonium chloride), 또는 클로르헥시딘(chlorhexidine), 또는 알렉시딘(alexidine)과 같이 설질이 방향족이 될 수 있다. 이러한 일 실시예에 있어서, 클로르헥시딘의 농도는 (a) 약 0.001%부터 0.01%까지, (b) 약 0.005%부터 0.05%까지, 또는 (c) 약 0.0075%부터 약 0.0125%까지 범위에 있을 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 혼합물을 형성하도록 세포 배양 수확물을 8개 내지 10개의 탄소 원자들을 갖는 적어도 하나의 지방산과 접촉시키는 단계, 상기 혼합물을 알란토인(allantoin)과 접촉시키는 단계, 그리고 상기 IgG 항체를 포함하는 용액을 제공하도록 상기 혼합물을 알란토인과 접촉시킨 후에 고체 물질들을 분리하는 단계를 포함하는 IgG 항체를 정제하기 위한 방법들이 제공된다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 알란토인은 (a) 약 0.6%부터 약 30%까지, (b) 약 1%부터 약 10%까지, 그리고 (c) 약 1%부터 약 2%까지로 이루어진 그룹으로부터 선택된 범위 내의 농도로 존재한다. 앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 알란토인은 영(0)이 아닌 양으로부터 약 0.6%까지의 범위 내에 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 방법은 혈청 또는 혈장과 같이 자연 기원의 단일클론선 또는 다클론성 IgG 항체들에 적용된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 방법은 Fab, F(ab')2, 또는 ScFv와 같은 효소 또는 재조합 기원의 조각 면역글로불린 구성체들에 적용된다.
일부 실시예들에 있어서, 여기에 개시되는 방법들의 임의의 하나의 실행을 가능하게 하는 키트(kit)들이 제공된다.
다음의 용어들은 여기에 개시되는 실시예들이 보다 용이하게 이해될 수 있도록 정의된다. 추가적인 정의들은 상세한 설명에 전체적으로 설시된다.
"지방산(fatty acid)"은 CH3(CH2)nCOOH의 일반 구조식을 가지는 카르복실기(carboxyl group)로 종료되는 지방족 사슬로 구성되는 유기 분자를 언급하며, 여기서 n은 적어도 하나의 정수이다. 본 발명의 방법들을 실행하기 위해 적합한 지방산들에 대해, "n"은 적어도 4에서 12까지의 정수가 될 수 있다. 방법들을 실행하기 위해 적합한 포화 지방산들의 특정 예들은 특히 에난트(헵탄, C7)산, 카프릴(옥탄, C8)산, 펠라르곤(노난, C9)산, 그리고 카프릭(데칸, C10)산을 포함한다. 지방산이라는 용어는 또한 상기 일차 탄소 사슬을 따라 임의의 위치에서 발생될 수 있는 하나의 이중 결합 또는 보다 많은 숫자의 이중 결합들을 함유하는 불포화 지방산들을 언급할 수 있다.
"알란토인(allantoin)"은 C4H6N4O3의 구조식 및 2,5-디옥소(dioxo)-4-이미다졸리디닐우레아(imidazolidinylurea)의 IUPAC 명칭을 가지며, 요산(uric acid)의 산화에 의해 생성되는 퓨린(purine) 물질 대사 산물을 언급한다.
"세포 배양(cell culture)"은 본 문에서 IgG 단일클론성 항체들을 생성시키는 목적을 위한 액체 배지 내의 세포들의 배양을 언급한다. 이러한 목적들 위해 채용되는 세포들은 공통적으로 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary: CHO) 세포들을 포함하지만, 다른 포유돌물들의 세포 유형들뿐만 아니라 비포유동물 세포들, 식물들 및 미생물들을 포함할 수 있다. 모든 경우들에서, 상기 액체 배지는 세포 성장을 유지하는 영양소들을 함유한다.
"바이오리액터(bioreactor)"는 세포들이 조절된 조건들 하에서 성장되는 용기(vessel)를 언급한다. 상기 용기는 원하는 항체의 목표량을 생성하기 위해 요구되는 숫자의 세포들을 성장시키기에 적합한 치수이고, 임계 공정 변수들의 모니터링을 허용하도록 센서들과 입력 그리고 세포 성장 및 항체 생산을 위한 이상적인 조건들을 유지시키도록 필요한 경우에 조절들을 구비하는 스테인리스 스틸 탱크, 또는 다른 물질의 탱크, 또는 피복 탱크, 또는 중합체 백을 포함할 수 있다.
"수확물(harvest)" 또는 "세포 배양 수확물(cell culture harvest)"은 일반적으로 세포 배양 프로세스의 종료에서 바이오리액터의 구성들을 언급한다. 생성된 IgG 이외에도, 상기 수확물은 초기에 세포들, 세포 분비물들 및 죽은 세포들의 배출된 구성들뿐만 아니라 상기 세포들이 최초에 성장되었던 영양 배지의 구성들을 함유할 것이다. 이들 비-항체 성분들은 상기 항체로부터 제거되는 상기 오염물들을 구성한다. 이는 특히 숙주 단백질 및 DNA를 포함하지만, 바이러스 및 엔도톡신(endotoxin)도 포함할 수 있다. 세포 배양 수확물들은 또한 흔히 조각 형태(fragmentary form)들로 잘못 분해되거나 손상된 항체들을 함유한다.
"정화된 세포 배양 수확물(clarified cell culture harvest)"은 그로부터 상기 세포들이 제거되었던 수확물을 언급한다. 정화 프로세스는 단지 고체들을 제거하기 위한 원심분리 또는 미세여과, 또는 이 둘의 결합에 해당될 수 있거나, 수확물로부터 가용성 오염물들의 특정 클래스들을 추출하기 위한 화학 첨가제들이나 화학적으로 상호작용하는 표면들을 지니는 고체 물질들의 사용을 포함할 수 있다.
"단백질(protein)"은 탄소, 수소, 산소, 질소 및 통상적으로 황을 함유하고, 주로 펩티드 결합들에 의해 연결되는 아미노산의 하나 또는 그 이상의 사슬들로 구성되는 복합 유기 고분자들의 그룹의 임의의 것을 언급한다. 상기 단백질은 자연이나 재조합 기원이 될 수 있다. 단백질들은 글리코실레이션(glycosylation), 페길레이션(pegylation) 등을 통한 바와 같이 비-아미노산 모이어티(moiety)들로 변형될 수 있거나, 다른 화학적 모이어티들과 접합될 수 있다. 단백질들의 예들은 이에 한정되는 것은 아니지만, 항체들, 응고 인자(clotting factor)들, 효소들 및 펩티드 호르몬들을 포함한다.
"숙주 오염물(host contaminant)" 또는 "숙주 세포 오염물(host cell contaminant)"은 관심의 대상인 생성물이 성장되는 세포들에 의해 생성되는 생체 분자들을 언급한다. 상기 용어는 숙주 단백질들 및 숙주 DNA와 같이 다양한 클래스들의 숙주 오염물들을 포함할 수 있다.
"숙주 단백질들(host protein)" 또는 "숙주 세포 단백질(host cell protein)" 혹은 "HCP"는 이러한 단백질들은 관심의 대상인 생성물로부터 제거되는 오염물들의 하나의 클래스를 나타낸다.
"항체(antibody)"는 인간화, 인간, 단일 사슬, 키메라, 합성, 재조합, 혼성, 돌연변이, 그라프트(graft)되거나 생체 외로 생성된 항체들과 같이 자연이나 유전적으로 변형된 형태들을 포함하여 인간이나 다른 포유동물 세포주들로부터 유래되는 클래스 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE의 면역글로불린(immunoglobulin)을 언급한다. 상기 항체들은 단일 클론에 의해 생산될 수 있고, 이 경우에 이들은 단일클론성으로 언급되거나, 하나 이상의 클론으로부터 생산될 수 있으며, 이 경우에 이들은 다클론성으로 언급된다. IgG 항체들은 특히, 예를 들면 인간들에서 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로서; 혹은 마우스(mouse)들에서 IgG1, IgG2A, IgG2B 또는 IgG3로서; 혹은 랫(rat)에서 IgG1, IgG2A, IgG2B 또는 IgG2C로서 서브클래스들의 하나 또는 혼합물로 존재할 수도 있는 면역글로불린 G로 언급되는 항체들의 클래스를 언급한다. 자연적으로나 재조합으로 진핵(eukaryotic) 숙주들 내에 생성되는 항체들은 다양한 글리코실화된 형태들로 존재할 수 있는 반면, 비-진핵 숙주들 내에서 생성되는 항체들은 다양한 글리코실화된 및 비-글리코실화된 형태들로 존재할 수 있다. 항체들이라는 용어는 또한 이에 한정되는 것은 아니지만 Fab, F(ab')2, VHH 및 ScFv를 포함하는 효소 또는 단백질 분해 기원이던지 조각 구성체들을 포함하는 것으로 이해된다.
"엔도톡신(endotoxin)"은 세포용해에 따라 세포로부터 해리되는 그람 음성의(gram-negative) 박테리아의 외막 내에 존재하는 독성의 열에 안정한 지질다당류(lipopolysaccharide)를 언급한다. 엔도톡신들은 이들의 인산염 및 카르복실 잔기들의 높은 함량으로 인해 대체로 산성일 수 있으며, 지질-A 영역의 지방산 함량으로 인하여 높은 소수성이 될 수 있다. 엔도톡신들은 수소 결합에 대한 광범위한 기회를 제공할 수 있다.
"폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 사슬 내에 공유 결합으로 결합된 다중의 뉴클레오티드 단량체들로 구성되는 생물고분자를 언급한다. DNA(데옥시리보핵산) 및 RNA(리보핵산)는 폴리뉴클레오티드들의 예들이다. 폴리뉴클레오티드들은 수소 결합들의 형성에 대한 높은 경향을 가질 수 있다.
"단백질 제제(protein preparation)"는 세포를 함유하는 세포 배양 수확물, (실질적으로)무세포의 세포 배양 상청액, 또는 정제의 단계로부터 관심의 대상인 단백질을 함유하는 용액과 같이 관심의 대상인 단백질을 함유하는 임의의 수성이나 대부분 수성인 용액을 언급한다.
"바이러스(virus)" 또는 "비리온(virion)"은 살아있는 숙주들, 주로 박테리아, 식물들 및 동물들의 세포들 내에서만 복제되는 극히 미소한(대략 20㎚ 내지 300㎚의 직경), 대사적으로 불활성인 감염원을 언급하며, RNA 또는 DNA 코어(core), 단백질 코트 및 보다 복합한 유형들에서는 둘러싸는 외피로 구성된다.
여기에 개시되는 방법들을 특정한 세포 배양 수확물에 적합하게 하는 데 유용한 출발점은 건조 알란토인을 세포들을 함유하거나 세포들이 이미 제거되었던 세포 배양 수확물에 첨가하는 것이며, 여기서 첨가된 알란토인은 1%(w/v)에 해당된다. 혼합은 상기 첨가에 전체에 걸쳐 유지된다. 상기 알란토인의 일부는 용해되지만, 다른 부분은 용해되지 않고 남는다. 물속에서, 약 0.6%가 용해되고 나머지는 불용성으로 남지만, 상기 알란토인이 다양한 성분들과 상호작용하는 복합적인 생물학적 체계들 내에서는 비율들이 변할 수 있다. 노난산은 0.5%(v/v)까지의 비율로 첨가되고, 교반이 지속된다. 지방산 첨가는 선택적으로는 알란토인 첨가에 앞서 또는 알란토인 첨가와 동시에 일어날 수 있지만, 제시되는 순서는 처리로부터 약간 높은 항체의 회수를 유지하는 것으로 여겨진다. 일부 경우들에서 상기 지방산 자체상의 음성으로 대전된 카르복실기가 pH를 약 5.4까지 감소시키기 때문에 pH를 조절하는 것이 불필요하다. 다른 경우들이나 상기 지방산의 염이 사용되는 경우, 그러면 상기 수확물의 pH는 약 pH 5.2까지 조절되어야 한다. 전도도는 조정될 필요가 없다. 혼합은 2시간 동안 유지되지만, 후속하는 실험들에서 감소될 수 있다. 고체들은 선택적으로 처리되게 되며, 액체는 미세여과 또는 침강과 같은 임의의 편리한 방법으로 정화된다. 정화된 액체는 선택적으로 양성의 전하들이 채워진 내부 액체 접촉 표면을 갖는 장치를 통과함에 의해 더 처리될 수 있다. pH 또는 전도도 조건들의 조절이 이러한 단계에 추가될 필요는 없다. 처리된 물질은 탁도, 숙주 세포 단백질들, 항체 응집체들, 항체 조각들, DNA, 히스톤들, 뉴클레오솜(nucleosome)들, 바이러스, 엔도톡신 또는 특정한 정제의 목적들에 적절할 수 있는 다른 오염물들의 감소에 대해 평가될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 지방산들은 이들의 산성의 이온 형태로 상기 수확물에 도입될 수 있다. 산성의 형태로 도입될 때, 상기 지방산 자체가 동작 pH를 적합한 값으로 적정시킬 수 있기 때문에 상기 수확물의 pH를 조절할 필요가 없을 수 있다. pH는 일반적으로 pH 4.0 내지 6.0의 범위로 조절될 수 있지만, 보다 이상적으로는 4.5 내지 5.5, 또는 4.8 내지 5.2, 또는 5.2의 범위로 조절될 수 있다. 보다 산성인 조건들은 일반적으로 우수한 오염물 제거를 유지하지만, 덜 산성인 조건들은 일반적으로 보다 높은 IgG 회수를 선호한다. 일반적으로 사실상, 개시되는 방법들은 종래에 수행되었던 지방산 침전보다 높은 pH 값들에서 우수한 결과들을 유지한다. 지나친 pH의 회피가 상기 항체에 대한 화학적 스트레스를 감소시킬 수 있고, 기능성 항체의 보다 높은 회수 및/또는 향상된 항체 안정성의 형태로 이차적인 이점들을 제공할 수 있는 점이 인지될 것이다. 따라서, 지방산들로 침전을 수행하기 위해 해당 기술 분야에서 통상적으로 수행되는 반대되는 과정들에도 불구하고, 규칙적으로 정하여 4.5 내지 5.5와 같은 적정한 pH 값들을 평가하는 것이 일반적으로 유익하다. 사전의 pH 적정이 엄격하게 요구되지 않는 경우에도, 상기 방법의 재현성을 증가시킬 수 있기 때문에 이는 신중할 수 있다. 다른 실시예들에 있어서, 지방산들은 카프릴산 나트륨(sodium caprylate), 또는 펠라르곤산 나트륨(sodium pelargonate), 또는 카프린산 나트륨(sodium caprate); 혹은 카프릴산 칼륨(potassium caprylate), 또는 펠라르곤산염(pelargonate), 또는 카프린산염(caprate) 혹은 다른 염과 같은 염들, 칼륨 양이온과 같이 도입될 수 있다. 염으로 도입될 때, 염의 제조가 성분 이온들의 적정 능력을 효과적으로 유지하기 때문에 원하는 동작 pH를 구현하기 위해 적절한 적정제(titrating agent)의 첨가에 의해 상기 작업 유체의 pH를 조절할 필요가 있을 것이다. 적합한 적정제들은 표적 동작 pH로 또는 이에 가깝게 미리 적정된 산들이나 농축된 완충제들로 구성될 수 있다.
실험 데이터는, 일부 실시예들에 있어서, 카프릭산(capric acid)이 특히 응집체들의 제거를 위해 카프릴산보다 효과적이지만, 10원자의 탄소 사슬에 기인하는 이의 명백하게 높은 소수성으로 인하여, 때때로 보다 낮은 회수를 가져오거나 주위 온도에서 상대적으로 미소한 변화들로부터 일정하지 않은 결과들을 야기하는 항체 손실들의 보다 높은 위험 또한 수반하는 점을 나타낸다. 현재까지의 실험적인 발견들은 카프릭산의 유효 농도 범위가 유사한 구성에서 카프릴산의 농도의 대략 절반인 점을 보여준다. 이는 실험들이 시작되는 하나의 적합한 농도로서 0.2%의 카프릭산을 권고한다. 다른 실험적인 발견들은 펠라르곤산(노난산, 9-탄소)이 카프릴산 또는 카프릭산보다 소수성 및 전하의 바람직한 균형을 제공하며, 보다 효과적인 숙주 단백질 감소를 유지하는 점을 나타낸다. 다른 실험 결과들은 상기 지방산 사슬의 말단에 단일의 이중 결합을 갖는 9-탄소 지방산인 8-노넨산 또한 카프릴산 또는 카프릭산보다 우수한 결과들을 유지하는 점을 나타낸다.
특정 정제를 위한 가장 효과적인 구성을 결정하기 위해 각 변수들에 대한 값들을 평가하는 것이 일반적으로 가치가 있을 것이다. 알란토인 농도는 1%와 같은 보다 낮은 비율, 혹은 2%, 3%, 4%, 5% 또는 중간 증가분들과 같은 보다 높은 비율에서 평가될 수 있다. 실험 데이터는 알란토인이 1% 아래에서 덜 효과적이 되고, 항체 회수가 5% 이상에서는 절충될 수 있지만, 야기될 수 있는 잠재적인 절충의 인식이 존재하는 한 보다 넓은 범위들이 평가될 수 있는 점을 보여준다. 제시된 1% 보다 낮은 농도들은 특히 응집체 감소와 절충될 수 있는 반면, 보다 높은 농도들은 항체 회수와 절충될 수 있다. 보다 낮은 항체 회수가 보다 큰 값으로 여겨지는 다른 효과들로 인해 일부 경우들에서 허용될 수 있다. 알란토인만의 첨가를 위한 배양 조건들로의 실험은 경험적으로 그 효과들이 매우 신속하게 일어나기 때문에 일반적으로는 필요하지 않다. 지방산 농도는 0.05%부터 5%까지 변화될 수 있다. 15분 정도로 작은 배양 시간이 응집체 및 숙주 단백질 제거를 절충시킬 수 있지만, 30분, 또는 45분, 또는 60분, 또는 90분, 또는 120분, 혹은 선택의 다른 간격에 따라 평가될 수 있다. 2시간보다 긴 배양 시간들도 평가될 수 있지만, 지금까지의 실험 데이터는 이러한 간격들에서 상당한 이점을 나타내지는 않고 있다. 배양 시간은 효율의 주요한 결정 인자이지만, 긴 프로세스 시간 간격들의 경제적인 단점들과 균형을 이루어야 한다. 16시간이 지켜보지 않을 수 있는 하룻밤 동안의 배양에 상응하기 때문에 출발 시점으로 편리하지만, 1시간, 2시간, 4시간 및 사용자의 재량에 따라 아마도 보다 작거나 보다 큰 중간 간격들과 같이 보다 작은 간격들 또한 평가되어야 한다. 지방산으로 초기 배양을 위한 동작 pH는 4부터 6까지, 또는 4.5부터 5.5까지, 또는 4.8부터 5.2까지의 범위가 될 수 있다. 전도도는 일반적으로 조정을 요구하지 않지만, 염화나트륨과 같은 염의 첨가에 의한 정상적인 생리적 전도도의 약 2배까지 증가될 수 있거나, 물의 첨가에 의한 경우의 대략 반으로 감소될 수 있거나, 원하는 경우에 보다 넓은 범위들이 평가될 수 있다.
실험 결과들이 노난산이 일부 경우들에서 항체 조각들의 제거에 대해 보다 효과적이고, 대체로 모든 다른 관점들에서 적어도 효과적인 것으로 보이는 점을 나타내기 때문에 카프릴산 또는 카프릭산에 대한 선택적인 것으로서 노난산을 평가하는 것이 바람직할 수 있다. 카프릭산은 냉동 하에서 저장되는 세포 배양 수확물들에 적용될 때에 불리한 것으로 간주될 수 있지만, 이러한 우려는 상기 지방산이 신선한 세포 배양 수확물에 직접 첨가되는 경우와 특히 상기 세포 배양 수확물이 상기 바이오리액터 내에 머무르게 남는 경우의 상황들에서 유예된다. 후자의 경우에서, 높은 온도가 원하는 임의의 배양 간격을 위해 유지될 수 있다. 이러한 접근은 상기 온도가 지방산 배양에 이어서 감소되는 경우, 상기 카프릭산의 일부 비율이 가용성으로 될 것이고, 상기 시스템으로부터의 이의 제거의 효율을 증가시키는 효과와 함께 상기 시스템 내의 고체들과 더 연관될 수 있는 이차적인 이점을 가질 수 있다. 실험 데이터는 비록 일반적으로 보다 낮은 농도에서 효과적인 것으로 발견될 것이지만, 노난산이 카프릴산과 동일한 농도들의 범위에 걸쳐 평가될 수 있는 점을 나타낸다. 8보다 작은 탄소 사슬 길이들은 특히 응집체 제거에 대하여 덜 효과적이며, 이에 따라 보다 큰 상대적인 양들로 채용되지만, 잠재적으로는 유용하게 남는다. 10개의 탄소 원자들 또는 그 이상의 탄소 길이들은 상기 지방산의 고유의 용해도로 인해 가용성 시약의 높은 농도들을 구현하는 어려움으로 손상될 수 있으며, 이들은 일부 경우들에서 감소된 항체 회수의 보다 높은 위험성을 제기한다. 일반적인 사실상, 실험 데이터는 상기 지방산이 보다 소수성일수록, 그 유효 농도가 낮아지고 그 동적 범위(dynamic range)가 좁아지는 점을 나타낸다. 하나 또는 그 이상의 음성 전하들과, 이에 한정되는 것은 아니지만, 포화 지방산들, 불포화 지방산들, 고도 불포화 지방산들 및 인지질(phospholipid)들을 포함하는 하나 또는 그 이상의 지방족 또는 방향족 소수성 모이어티들을 결합시키는 다른 유기산들 또한 여기에 제시되는 지침들에 따라 여기에 개시되는 방법들을 실행하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 시스템 내의 각각의 요소들에 의해 전체적으로 제기되는 영향을 정도가 이들의 독립적인 행동에 의해 예상될 수 있기 때문에 개시되는 요소들이 존재하는 여기에 개시되는 방법들을 수행하는 것이 유리할 수 있다. 이는 상기 시스템이 전체적으로 종래 기술 분야에서 수행된 지방산 침전과 구별되는 물리적 및 화학적 메커니즘들의 조화를 통해 종래의 지방산 처리들과 다른 결과들을 구현하는 점을 강조한다. 여기에 개시되는 방법들을 수행함에 있어서, 상기 방법의 단일 요소들은 임의의 특정한 표적 IgG 항체에 대한 간소화된 접근을 제공하도록 연속적으로 실행될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 해당 기술 분야에서 알려진 바와 같이 실험 계획법(DoE)들과 같은 통계적 기술들이 특정 IgG 정제에 대해 설계된 감소된 숫자의 여기에 개시되는 방법 실시예들을 선택을 확인하는 수단을 제공한다.
일 실시예에 있어서, 상기 방법은 다른 수단들에 의해 이전에 처리되었던 IgG를 함유하는 공급 스트림(feed stream)들에 적용될 수 있다. 이러한 일 실시예에 있어서, 바이오리액터 수확물은 여기에 개시되는 방법들과 구별되는 방식으로 처리되었을 수 있다. 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 다른 화학 첨가제들의 존재가 본 발명의 방법의 효과를 절충시킬 수 있거나, 명료할 수 있거나, 본 발명의 방법이 이전의 처리의 유익한 효과들을 복합시킬 수 있는 점이 분명할 것이다. 이러한 다른 실시예에 있어서, 상기 IgG를 함유하는 공급 스트림은 부분적으로 정제되었던 것으로 말해질 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 정제되는 IgG는 단일클론성 또는 다클론성이 될 수 있고, 혈청이나 혈장과 같은 자연 생물체의 체액(biological fluid), 또는 다른 자연적으로 유도된 유체 내에 있을 수 있다. 이러한 실시예들에 있어서, 동일한 방법 변수들이세포 배양 기술들에 의해 생체 외로 생성되는 단일클론성 항체들을 처리하기 위해 기재된 바와 동일한 범위들에 대해 평가될 수 있다. 다클론성 항체들이 주어진 단일클론성 항체보다 넓은 범위의 분자 행동을 커버하는 점과 다른 종들로부터 유래되는 항체들의 행동의 차이들이 관찰될 수 있지만, 상기 방법들의 본질적인 특징들을 전체적으로 벗어나지 않고 여기에 개시되는 방법들의 요소들을 조절하기 위해 해당 기술 분야의 숙련자의 이해의 범위 내에 있게 되는 점이 예상된다.
일 실시예에 있어서, 상기 수확물은 상기 처리가 적용되었고 고체들이 상기 시스템으로부터 제거되었던 후에 하나 또는 그 이상의 방법들에 의해 더 처리될 수 있다. 이러한 일 실시예는 기능화된 필터 또는 상기 샘플과 동일한 조건들로 평형화된 다른 장치를 통한 처리된 수확물의 통과를 포함할 수 있다. 일부 이러한 실시예들에 있어서, 상기 샘플의 pH 및 전도도 조건들은 오염물들을 추출하는 기능화된 장치의 능력을 향상시키도록 변경될 수 있다. 다른 실시예에 있어서, 상기 IgG는 농축될 수 있고, 디아필트레이션(diafiltration)에 의해 완충 교환될 수 있으며, 이는 또한 일부 오염물들을 제거할 것이다. 다른 실시예에 있어서, 상기 처리된 수확물은 고성능 접선 유동 여과(tangential flow filtration)에 의해 처리될 수 있다. 다른 실시예에 있어서, 상기 정화된 상청액은 양이온 교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography)에 의해 처리될 수 있다. 다른 실시예에 있어서, 상기 IgG는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)에 의해 정화된 수확물로부터 침전될 수 있다. 다른 실시예에 있어서, IgG는 황산암모늄, 황산나트륨, 인산칼륨, 시트르산나트륨, 또는 시트르산칼륨과 같은 코스모트로픽 염(kosmotropic salt)에 의해 정화된 수확물로부터 선택적으로 침전될 수 있다. 다른 실시예에 있어서, 상기 정화된 수확물은 입체 배제 크로마토그래피(steric exclusion chromatography)에 의해 처리될 수 있고, 여기서 IgG는 폴리에틸렌 글리콜의 존재에서 또는 우선적 배제나 크로마토그래피에 의해 친수성 입자들 상에 부착되도록 강제되며, 상기 IgG는 하나 또는 그 이상의 코스모트로픽 염(kosmotropic salt)들의 존재에서 입자들 상에 부착되도록 강제된다. 다른 실시예에 있어서, 상기 처리된 수확물은 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 처리될 수 있다. 다른 실시예에 있어서, 상기 처리된 수확물은 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography)에 의해 처리될 수 있다. 다른 실시예에 있어서, 상기 처리된 수확물은 이른바 혼합 모드 크로마토그래피(mixed mode chromatography)의 형태에 의해 처리될 수 있고, 여기서 주어진 크로마토그래피 매체는 연속하여 적용되는 구성 성분 기능성들과 다른 분별 경과들을 구현할 수 있는 다중의 화학적 기능성들을 절충시킬 수 있다.
다음의 실험예들은 대체로 예시만을 위한 것으로 이해되며, 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실험예들
실험예 1. 카프릴산 침전에 의한 오염물 제거. 다른 양들의 카프릴산이 원심분리에 의해 정화된 세포 배양 수확물에 각기 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4% 및 0.5%의 최종 농도들까지 첨가되었다. 알란토인은 각 샘플에 1%의 최종 농도까지 첨가되었다. pH도 염 농도도 조절되지 않았다. 0.4%의 카프릴산에서 최종 pH는 5.4였다. 혼합물들은 2시간 동안 교반되었다. 고체들은 상기 샘플을 0.22㎛의 미세필터를 통과시켜 제거되었다. 숙주 세포 단백질은 상기 수확물 내에서 최초의 242,888ppm의 IgG로부터 0.1%의 카프릴산 내에서 233,318ppm까지; 0.2%에서 193,400ppm까지; 0.3%에서 57,519ppm까지; 0.4%에서 38,602ppm까지; 그리고 0.5%에서 42,666ppm까지 감소되었다. 유리 경쇄 및 경쇄 이합체들을 포함하는 IgG 조각들은 상기 수확물 내에서 12.2%로부터 0.3%의 카프릴산 내에서 5.3%까지; 0.4% 내에서 3.4%까지; 그리고 0.5%의 카프릴산 내에서 3.6%까지 감소되었다. 0.1% 및 0.2%의 카프릴산에서 조각 감소는 없었다. 응집체들은 상기 수확물 내에서 1.28%로부터, 0.1%의 카프릴산 내에서 1.22%까지, 0.2%의 카프릴산 내에서 0.87%까지, 0.3%의 카프릴산 내에서 0.31%까지 감소되었고, 0.4% 및 0.5%의 카프릴산에서 검출되지 않았다(0.05% 이하). 상기 카프릴산 농도들에 걸친 IgG 회수는 0.1%의 카프릴산 내에서 99%, 0.2%에서 99%, 0.3%에서 95%, 0.4%에서 99%, 그리고 0.5%에서 95%였다.
실험예 2. 숙주 단백질 감소에 대한 동작 pH의 효과. 일련의 실험들이 수행되었고, 여기서 IgG를 함유하는 미세여과-정화된 수확물은 0.4%의 카프릴산으로 처리되었으며; 대조 실험에서 pH는 조절되지 않았고; 두 별도의 실험들에서 pH는 pH 6 및 7까지 조절되었다. 숙주 단백질 함량은 조절되지 않은 대조 실험(pH 5.4)에서 38,602ppm이었고, 171,232ppm at pH 6.0에서 171,232ppm 및 pH 7.0에서 243,675ppm이었다.
실험예 3. 폴리에틸렌 글리콜로의 IgG 침전에 의한 후속 정제. 다공성 입자 처리가 수반되었던 0.4% 및 0.5%의 카프릴산으로 처리된 실험예 1로부터의 샘플들은 pH 7.0에서 20.5%의 PEG, 800mM의 NaCl, 50mM의 헤페스(Hepes)로 수행되었던 폴리에틸렌글리콜(PEG-6000)로의 침전에 의해 더 정제되었다. 0.4%의 카프릴산으로 처리된 수확물의 PEG 침전 후, 숙주 단백질들은 11ppm까지 감소되었고, 응집체들은 0.09%까지 감소되었으며, 경쇄 조각들은 검출할 수 없었다. 0.5%의 카프릴산에서 처리된 수확물의 PEG 침전 후, 숙주 단백질은 13ppm까지 감소되었고, 응집체들은 0.1%까지 감소되었으며, 경쇄 조각들은 검출할 수 없었다. 이들 결과들 모두는 99.9995%의 숙주 단백질의 감소에 상응한다. 상기 수확물이 본 발명의 방법에 의해 처리되지 않았던 병렬 대조 실험에서, PEG 침전은 숙주 단백질을 67,687ppm까지 감소시켰다. 개시되는 방법에 의해 제공된 6,000-폴드(fold) 이상의 향상은 두 가지의 구별되는 유익들을 나타낸다. 자명한 유익은 본 발명의 방법에 의한 숙주 단백질 오염의 감소가 숙주 단백질 오염의 여전히 보다 큰 감소를 구현하도록 후속하는 방법을 허용하는 것이다. 이는 또한 개시되는 방법이 특히 그 가장 우수한 결과들을 구현하는 상기 정제 방법의 능력을 저해하는 오염물들을 제거하는 거의 틀림없는 유익을 강조한다.
실험예 4. 음이온 교환 뎁스 필터와 상기 방법의 통합. 0.4%의 카프릴산이 어떠한 전-처리도 없이 세포 배양 수확물에 첨가되었다. 알란토인이 1%의 최종 농도까지 첨가되었다. 혼합물은 2시간 동안 계속하여 교반되었고, 이후에 실험예 1에 기재된 바와 동일한 다공성 입자 혼합물 처리의 준비로 실험예 1-실험예 3의 경우의 멤브레인 미세필터 대신에 2단계의 음이온 교환 뎁스 필터를 통과하였다. 심층 여과 단계는 숙주 단백질 19-폴드를 176,244ppm으로부터 9173ppm까지 감소시켰고, 응집체들을 2.03%로부터 검출 불가능(0.05% 이하)하게 감소시켰으며; 경쇄 오염물들을 12%로부터 1%까지 감소시켰다.
실험예 5. 단백질 A 친화 크로마토그래피(protein A affinity chromatography)에 의한 향상된 성능. 실험예 4에 기재된 바와 같이 알란토인, 카프릴산 및 혼합된 입자들로의 처리에 의해 제조된 샘플에 단백질 A 친화 크로마토그래피에 의한 정제(토요펄(ToyoPearl) AF-rProtein A 650F, 토소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience))기 수행되었다. 단백질 A는 공급 스트림들이 원심분리 및/또는 미세여과에 의해 정화된 세포 수확물로 구성될 때에 통상적으로 오염시키는 숙주 단백질 레벨들을 500ppm 내지 2,000ppm의 IgG의 범위까지 감소시켰다. 단백질 A에 앞서 실험예 1에 기재된 카프릴산-알란토인 및 다공성 입자 방법을 수행하는 것은 단백질 A 단계가 1ppm 이하의 숙주 단백질 레벨 및 검출 가능성의 레벨 아래의 응집체들을 구현하게 하였다. 이는 특히 개시되는 방법들이 그 잠재성을 수행하는 단백질 A의 능력을 저해하는 오염물들을 제거하는 점을 강조한다.
실험예 6. 음이온 교환 크로마토그래피 다음의 항체 침전의 향상된 성능. 실험예 4에 기재된 바와 같이 알란토인, 카프릴산 및 혼합된 입자들로의 처리에 의해 제조된 샘플에는 pH 7.0에서 2.0의 황산암모늄으로의 전기가 수반되는 실험예 3에 기재된 바와 같이 초기에 PEG로 다른 혼합 모드 침전 단계에 의한 정제가 수행된다. IgG는 재가용화되고 처리되어 5.9ppm의 숙주 세포 단백질을 나타내었다. 응집체들은 검출의 레벨 이하(0.05% 이하)였다. pH 8.25에서 50mM의 트리스(Tris) 내의 보이드 배제 모드로 음이온 교환의 단일 후속 연마 단계는 숙주 단백질을 1ppm 이하로 감소시켰다. 이러한 결과는 가장 우수하게 수행되는 것으로 여겨지는 모든 단백질 A 친화 크로마토그래피의 분별 방법들에 기초하여 처리되는 보다 우수한 전체적인 정제 성능을 구현하기 위한 비싸지 않은 낮은 기능의 분별 방법들을 허용하는 근거를 제공하는 개시되는 방법의 능력을 강조하기 때문에 중요하다.
실험예 7. 중간 정제 단계로서 개시되는 방법. 원심분리 및 미세여과에 의해 정화된 세포 배양 수확물이 실험예 7에 기재된 바와 같이 침전에 의해 분별되는 대조 실험이 수행되었다. 이는 숙주 단백질을 287,655ppm으로부터 67,687ppm까지 감소시켰고, 응집체들을 2.83%로부터 1.57%까지 감소시켰으며, 항체 조각들을 10.4%로부터 2.3%까지 감소시켰다. 보이드 배제 모드로 후속되는 음이온 교환 단계는 숙주 단백질을 99.6%에서 221ppm까지 감소시켰고, 응집체들을 1.45%까지 감소시켰다.
실험예 8. 알란토인으로 및 알란토인이 없는 다른 카프릴산 농도들의 평가. 세포를 함유하는 수확물은 원심분리 및 0.22미크론의 멤브레인을 통한 멤브레인 여과에 의해 정화되었고, 이후에 상청액의 pH가 6.0까지 감소되었다. 다양한 하위 샘플들이 0.01%, 0.05% 및 0.1%의 양의 카프릴산으로 처리되었다. 모든 샘플들은 심지어 침전된 물질들 원심분리에 의해 제거된 후에도 처리 다음에 탁했고, 미립자들의 잔류나 재형성을 나타내었다. 동일한 일련의 실험들이 2%의 알란토인의 존재에서 반복되었다. 항체 회수 및 오염물들의 감소는 본질적으로 동등하였지만, 처리된 물질은 처리 후에 반짝이고 깨끗했다. 이러한 실험예는 개시되는 방법의 성능에 대해 전체적으로 알란토인의 기여를 나타낸다.
실험예 9. 알란토인의 첨가에 의한 포유동물의 세포 수확물의 촉진된 정화. 알란토인은 오염물들의 통상 스펙트럼 중에서 IgM 단일클론성 항체를 포함하는 5L의 세포를 함유하는 세포 배양 수확물에 1%의 최종 농도까지 첨가되었다. 용기는 성분들이 혼합되도록 부드럽게 소용돌이치게 하였다. 알란토인과 알려지지 않은 세포 배양 성분들 사이의 상호작용들은 이러한 양의 알란토인이 완전히 용해되게 하였으며, 이에 따라 2%(w/v)까지의 전체 첨가량이 되도록 추가로 1%가 첨가되었다. 상기 용기는 상기 성분들이 혼합되도록 다시 소용돌이치게 하였다. 미립자 물질들은 알란토인의 첨가 전에는 매우 느리게 정착되었고, 1%의 알란토인의 존재에서만 약간 빠르게 정착된 것으로 관찰되었던 반면, 정착 속도는 2%의 알란토인에 의해 분명하게 촉진되었으며, 약 20분의 기간 내에 반짝이고 깨끗한 세포 배양 상청액이 남았다. 1% 및 2%의 알란토인 사이의 차이는 샘플 내의 일부 가용화된 물질들의 존재로 인해 1%의 알란토인이 거의 완전하게 용해되었던 점을 표시하는 것으로 설명된다. 상기 상청액은 후에 따라졌다. 이는 우연히 상기 침전물의 일부를 다시 현탁시켰으며, 남아 있는 고체들을 침강시키도록 후속하여 원심 분리되었다. 이는 지방산들 또는 다른 첨가제들과 독립적으로 세포 수확물 정화의 질을 향상시키는 알란토인의 능력을 강조한다. 이는 또한 적어도 2%의 알란토인 농도로 초기 시험들을 수행하는 잠재적인 유익을 강조한다. 비록 물속에서의 알려진 용해도가 유용한 예비 지침으로 제공될 수 있지만, 이는 또한 과포화되는 알란토인의 농도가 실험적으로 결정될 수 있는 효과와 함께 알란토인의 용해도가 샘플의 성분들에 영향을 받을 수 있는 중요한 점을 강조한다.
실험예 10. 알란토인의 첨가에 의한 E. coli 용해물의 정화. pH 7.0에서 250mL의 50mM의 헤페스 내의 20그램의 E. coli 페이스트가 16,000 x g에서 미세유동화기(microfluidizer)로 균질화되었다. 균질액은 이후에 가장 큰 미립자 종들이 제거되도록 15,000 x g에서 1시간 동안 원심 분리되었다. 이는 황갈색의 탁한 상청액을 생성하였다. 건조 알란토인이 5%(w/v)의 최종 농도까지 상청액에 직접 첨가되었다. 혼합물은 약 1분 동안 소용돌이치게 하였고, 이후에 정착되게 하였다. 불용성 물질들이 수분 내에 정착되었고, 최초 균질액 내에 존재하였던 단백질 생성물의 90% 이상을 포함하는 반짝이고 깨끗한 상청액이 남았다. 상기 상청액은 0.22미크론의 멤브레인 필터를 쉽게 통과하였으며, 여기서 알란토인 처리 이전의 상청액은 상기 필터를 접촉으로 사실상 막히게 하였다. 이러한 실험예는 처리된 샘플의 필터 능력을 급격히 증진시키는 알란토인의 능력을 강조하며, 상기 방법에 대해 전체적으로 알란토인의 독립적인 기여를 강조한다. 이는 또한 개시되는 방법이 포유동물의 세포 배양에 의해 성장된 항체들에 한정되지 않는 점을 나타낸다.
실험예 11. 알란토인을 이용한 IgG-엔도톡신 혼합물로부터의 항체의 회수 및 엔도톡신 감소. 엔도톡신이 pH 7.0에서 5mM의 헤페스, 100mM의 NaCl 내의 1㎎/㎖의 인간 IgG에 22,000EU/㎖까지 첨가되었다. 2%(w/v)의 알란토인이 이러한 혼합물의 부분 표본(aliquot)들에 첨가되었고, 실온에서 15분 동안 혼합되게 하였다. 서스펜션은 원심분리에 의해 정화되었다. 단백질 및 엔도톡신 농도들이 항체 회수 및 엔도톡신 제거를 계산하기 위해 측정되었다. 2%(w/v)의 알란토인은 엔도톡신 2-폴드를 감소시켰다. 항체 회수는 알란토인의 양에 영향을 받지 않았다. 후속된 일련의 실험들에서, 알란토인의 양은 10%까지의 증가분으로 증가되었다. 항체 회수는 10%의 알란토인에서 약 93%까지 점차 줄어들었지만, 엔도톡신 제거 효율은 약 99%까지 증가하였다. 이들 실험들은 보다 큰 양의 알란토인의 사용이 IgG의 손실을 가져올 수 있는 점을 나타낸다. 약 12kDa부터 1MDa까지의 크기 범위의 단백질들로의 추가적인 실험들은 단백질의 손실이 단백질 크기의 증가와 함께 증가하는 명확한 경향을 나타낸다. 이러한 실험예는 개시되는 방법의 성능을 전체적으로 향상시키는 알란토인의 능력을 나타낸다.
실험예 12. ㎖ 당 1010개의 입자들을 함유하는 마우스(mouse)들의 미세 바이러스의 바이러스 배양이 10%의 양으로 알란토인의 첨가에 의해 생리적 조건들 하에서 공동 침전되었다. 상청액의 감염력 시험은 바이러스의 99.9%의 제거를 보고하였다. ㎖ 당 1010개의 입자들을 함유하는 쥐 백혈병의 또 다른 바이러스 배양이 10%의 양으로 알란토인의 첨가에 의해 생리적 조건들 하에서 공동 침전되었다. 상청액의 감염력 시험은 바이러스의 99.9%의 제거를 보고하였다. 이러한 실험예는 전체적으로 개시되는 방법에 대한 알란토인의 독립적인 기여를 나타낸다.
실험예 13. DNA 및 지방산들의 비-상호작용성. 카프릴산 침전은 DNA를 침전시키는 능력을 가지는 것으로 기술되었다(Brodsky 등의 앞서의 문헌). 이는 이들의 동일한 음성 전하들은 서로 반발하기 때문에 타당하지 않다. 이는 ㎖ 당 1마이크로그램, 2마이크로그램, 5마이크로그램 및 10마이크로그램의 농도들로 정제된 DNA가 pH 5.2 및 생리적 전도도에서 0.4%의 카프릴산과 2시간 동안 결합되었던 실험에서 확인되었다. 처리 후의 DNA 농도들에서 중요한 차이들은 관찰되지 않았다. 이는 다른 것들로 기술되는 분명한 DNA 결합이 중간 종들을 통한 직접적인 결합에 기인할 수 있으며, Gan 등(앞서의 문헌)의 조사에 따르면, 뉴클레오솜들의 히스톤 성분일 수 있는 점을 보여준다.
실험예 14. 카프릴산 침전에 의한 오염물 감소. 실험들은 카프릴산에 의한 정화 성능에 대한 기준선을 기록하도록 수행되었다. 모든 실험들은 IgG를 함유하고, 259,777ppm의 숙주 단백질 및 응집되지 않은 IgG의 약 30%까지의 양으로 응집체들을 함유하는 세포 배양 수확물에 대해 수행되었다. 모든 실험들은 생리적 전도도에서 수행되었다. 숙주 단백질, IgG 회수 및 응집체 함량에 대한 효과들은 3.5부터 7.0까지 0.5 pH 단위 간격들에서 평가되었다. 가장 높은 숙주 단백질 감소는 pH 3.5에서 있었지만, IgG 회수는 50% 이하였다. 가장 높은 응집체 제거는 pH .5에서 있었다. 가장 높은 IgG 회수는 pH 6.5 및 7.0에서 있었지만, 숙주 단백질 및 응집체 감소는 낮았다. 결과들은 다음 표에 주어진다.
pH 숙주 단백질들(ppm) IgG 회수(%) 응집체(%)
CCH 260k 100 23.7
3.5 56.6k 46 7.9
4.0 78.3k 43 3.2
5.5 90.4k 76 2.9
5.0 102k 83 4.1
5.5 115k 89 5.1
6.0 257k 94 15.8
6.5 246k 100 16.6
7.0 266k 105 16.6
실험예 15. 기능화된 입자 추가의 부존재에서 pH 및 전도도의 결합된 영향. 일련의 실험들이 수행되었고, 각기 12mS/㎝, 16mS/㎝ 및 20mS/㎝의 전도도 값들에서 pH 4.8, 5.2 및 5.6의 영향들이 평가되었다. 상기 출발 물질은 동일한 항체 플러스 213,821ppm의 숙주 단백질 및 25.6%의 응집체들을 함유하는 세포 배양 수확물이었다. 데이터는 개시되는 방법이 심지어 알란토인 및 카프릴산 성분들에 한정되더라도 카프릴산 단독(실험예 30)의 경우보다 우수한 결과들을 실질적으로 구현하는 점을 보여준다. 완료된 결과들은 다음 표에 기재된다.
pH/cond. 숙주 단백질들(ppm)IgG 회수(%) 응집체(%) FLC(%)
CCH 195k 100 22.9 23.6
4.8
12 4556 79 1.0 0.4
16 5977 89 3.0 0.3
20 7433 89 3.0 0.7
5.2
12 2237 92 0.9 0.2
16 4340 100 1.8 0.9
20 4937 101 0.9 0.8
5.6
12 9679 100 0.8 14.5
16 35k 100 0.8 17.0
20 44k 100 0.9 14.1
실험예 16. 개시되는 방법에 대한 고체 및 용해된 칼슘 화합물들의 영향. 652,450ppm의 IgG와 34.1% 응집체들도 함유하는 세포 배양 수확물이 1%의 알란토인, 0.4%의 카프릴산, 다양한 농도의 염화칼슘 또는 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite)로 처리되었고, pH 5.2까지 적정되었으며, 두 시간 동안 혼합되었다. 고체들은 제거되었고 샘플이 평가되었다. 0.5mM부터 8.0mM까지의 범위의 칼슘 농도들은 IgG 회수에 대해 중요한 영향을 미치지 않았다. HCP는 70,000ppm-80,000ppm의 범위 내에 있었고, 경쇄 함량은 겨우 감소되었으며, 응집체 레벨들은 대체로 2.5%까지 감소되었다. 0.5% 내지 4%의 v:v 농도에서 하이드록시아파타이트는 IgG 회수를 0.5%의 HA에서 79%로부터 8%의 HA에서 38%까지 감소시켰다. 숙주 단백질은 감소되었지만, 감소는 IgG의 손실보다 작았다. 경쇄 함량은 효과적으로 감소되지 않았다. 응집체들은 연구에서 가장 낮은 값들까지 감소되었지만, 항체 손실들을 충분히 보상하지 못하였다. 데이터는 다음의 표에 제시된다. CA 종들은 각기 염화칼슘(CC) 또는 하이드록시아파타이트(HA)를 언급한다. "베이스(Base)"로 표시된 줄은 어떠한 칼슘 첨가제들도 없이 얻어진 결과들을 나타낸다.
CA 종들 숙주 단백질들(ppm)IgG 회수(%) 응집체(%) FLC(%)
CCH 652k 100 34.1 26.3
Base 73k 86 2.4 23.2
CA
0.5mM 75k 87 4.1 24.3
1mM 73k 86 2.6 27.8
2mM 71k 87 2.3 28.3
4mM 82k 83 2.2 25.5
8mM 70k 83 2.6 25.1
HA
0.5% 58k 80 1.5 30.6
1% 23k 75 0.8 23.8
2% 9k 67 1.4 24.6
4% 검출되지 않음 55 1.8 34.9
8% 검출되지 않음 38 0.2 26.8
실험예 17. 비이온성 계면활성제들의 효과. 1%의 알란토인이 원심분리 및 미세여과에 의해 정화된 각각의 450㎖의 세포 배양 수확물의 부분 표본들에 첨가되었다. 하나는 대조 실험으로 유지되었다. 트윈(Tween)-20이 각기 0.005%, 0.01% 및 0.02%의 양들로 나머지 세 개에 첨가되었다. 상기 샘플들은 0.4%까지의 카프릴산의 첨가 및 1M의 아세트산의 첨가에 의한 pH 5.3까지의 조정이 후속되어 10분 동안 배양되었고, 이후에 2시간 동안 배양되었다. 샘플들은 제거되었고, 분석을 위해 여과되었다. TREN 입자들(바이오워크스(BioWorks), 워크비드즈(Workbeads) TREN high)이 샘플의 나머지에 5%의 양으로 첨가되었고, 4시간 동안 혼합되었으며, 이후에 고체들은 미세여과에 의해 제거되었다. TREN 입자들을 첨가하는 시점까지, 응집체 함량은 상기 대조 실험으로부터 0.005%의 트윈까지 감소되었고, 이후에 다시 0.01%의 트윈에서 감소되었지만, 0.02%의 트윈에서 더 향상되지는 않았다. 항체 회수 및 과도한 유리 경쇄의 함량은 대략적으로 변하지 않았다. TREN 입자 첨가 후, 응집체 레벨은 모든 샘플들에 걸쳐 동일하였고, 경쇄 함량은 약간 영향을 받았지만, IgG 회수는 비록 0.02%에서 더 증가하지 않았지만 트윈 함량과 함께 0.01%까지 증가하였다.
OM 숙주 단백질들(ppm)IgG 회수(%) 응집체(%) FLC(%)
CCH 416k 100 20.3 33.4
TREN 이전
Tween-20
0.000% 137k 91 20.8 26.7
0.005% 132k 89 16.8 25.2
0.01% 160k 90 5.9 25.7
0.02% 151k 89 7.5 26.6
TREN 이후
Tween-20
0.000% 6109 78 1.7 0.4
0.005% 5627 81 1.7 0.1
0.01% 6247 88 1.7 0.4
0.02% 8039 87 1.8 2.1
실험예 18. 비이온성, 쌍성 이온성 및 양이온성 계면활성제들의 효과들. 1%의 알란토인이 원심분리 및 미세여과에 의해 정화된 50㎖의 세포 배양 수확물의 부분 표본들에 각기 첨가되었다. 하나는 대조 실험으로 유지되었다. 다음의 계면활성제들이 각기 0.01% 및 0.05%로 각각의 두 부분 표본들에 첨가되었다: 글리콜산 에톡실레이트(Glycholic acid ethoxylate) 4-노닐페늘 에테르(nonylphenl ether)(Glych., 비이온성), 에틸렌디아민 프로폭실레이트(Ethylenediamine propoxylate)-블록(block)-에톡실레이트 테트롤(ethoxylate tetrol)(TET, 비이온성), 브리즈(Brij) 58(플루로닉(Pluronic) F-127, 비이온성), 트리톤(Triton) X-100(비이온성), 노니데트(Nonidet) P40(비이온성), 3-[(3-클로라미도프로필(cholamidopropyl))디메틸암모니오(dimethylammonio)]-1-프로판술포네이트 하이드레이트(propanesulfonate hydrate)(CHAPS, 썽성 이온성), 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드(Hexadecyltrimethylammonium bromid)(CTAB, 양이온성), 도데실트리메틸암모늄 브로마이드(Dodecyltrimethylammonium bromide)(DDTAB, 양이온성), 데실트리메틸암모늄 브로마이드(decyltrimethylammonium bromide)(DTAB) cationic), 미리스틸트리메틸암모늄 브로마이드(myristyltrimethylammonium bromide)(MTAB, 양이온성), 옥타데실트리메틸암모늄 브로마이드(octadecyltrimethylammonium bromide)(OTAB, 양이온성). 상기 샘플들은 0.4%까지의 카프릴산의 첨가 및 1M의 아세트산의 첨가에 의한 pH 5.3까지의 조절이 후속되어 10분 동안 배양되었으며, 이후에 2시간 동안 배양되었다.
OM 숙주 단백질들(ppm)IgG 회수(%) 응집체(%) FLC(%)
CCH 394k 100 13.3 26.2
CaprAll 3928 86 1.7 1.5
Glych.0.1% 4209 81 1.4 1.8
Glych.0.5% 5655 83 2.1 5.1
F127.0.1% 55k 84 1.5 1.8
F127.0.5% 76k 85 1.8 0.5
TET.0.1% 5204 87 1.7 6.6
TET.0.5% 3138 88 1.3 2.0
Brij.0.1% 11k 87 3.5 6.5
Brij.0.5% 26k 93 1.9 1.6
Triton.0.1% 7241 90 1.9 1.6
Triton.0.5% 16k 92 3.9 11.5
Ndet.0.1% 7519 91 1.6 1.2
Ndet.0.5% 16k 92 3.8 10.5
CHAPS.0.1% 6884 85 1.2 1.9
CHAPS.0.5% 8700 89 1.8 3.3
CTAB.0.1% 2278 86 1.1 1.3
CTAB.0.5% 23k 86 10.3 1.7
DDTAB.0.1% 5274 90 1.2 2.0
DDTAB.0.5% 76k 91 1.8 4.4
DTAB.0.1% 7281 88 1.5 23.7
DTAB.0.5% 42k 91 1.8 13.6
MTAB.0.1% 9405 89 1.3 4.9
MTAB.0.5% 98k 90 1.7 16.9
OTAB.0.1% 6155 89 1.1 7.0
OTAB.0.5% 53k 89 1.4 15.4
실험예 19. 다른 지방산들의 효과들. 1%의 알란토인이 원심분리 및 미세여과에 의해 정화된 각각의 50㎖의 세포 배양 수확물의 부분 표본들에 첨가되었다. 하나는 대조 실험으로 유지되었다. 0.4%까지의 카프릴산이 다른 대조 실험에 첨가되었고, pH가 1M의 아세트산의 첨가에 의해 5.3까지 조정되었으며, 이후에 2시간 동안 혼합되면서 배양되었다. 수확물의 5개의 부분 표본들은 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4% 및 0.5% 2-에틸헥산산(ethylhexanoic acid: EHA)으로 처리되었다. 이들 실험들은 3-헵텐산(heptenoic acid)(3HA)으로, 이후에 3-옥텐산(octenoic acid)(3OA)으로, 그리고 8-노넨산(8NA)으로 반복되었다.
Samp. 숙주 단백질들(ppm)IgG 회수(%) 응집체(%) FLC(%)
CCH 400k 100 13.8 31.4
Capry.4% 14k 92 1.4 5.5
EHA.1% 226k 89 2.0 20.8
EHA.2% 180k 92 2.0 20.7
EHA.3% 154k 98 1.7 20.4
EHA.4% 214k 89 1.7 20.9
EHA.5% 188k 87 1.7 20.2
3HA.1% 123k 79 1.9 22.1
3HA.2% 130k 78 1.7 21.3
3HA.3% 135k 79 1.6 21.1
3HA.4% 113k 76 1.5 20.2
3HA.5% 116k 75 1.6 20.2
3OA.1% 123k 79 1.9 21.9
3OA.2% 108k 78 1.6 21.6
3OA.3% 107k 78 1.6 19.7
3OA.4% 84k 74 1.3 13.3
3OA.5% 23k 69 1.3 6.7
8NA.1% 160k 70 2.0 26.9
8NA.2% 160k 85 -- 25.7
8NA.3% 123 83 1.7 19.3
8NA.4% 9735 85 1.5 4.9
8NA.5% 1600 83 1.4 2.6
실험예 20. 기능화된 입자들과 함께 또는 기능화된 입자들이 없이 옥탄산과 8-헵텐산의 비교. 1%의 알란토인이 원심분리 및 미세여과에 의해 정화된 각각의 50㎖의 세포 배양 수확물의 부분 표본들에 첨가되었다. 하나는 대조 실험으로 유지되었다. 0.4%까지의 카프릴산이 다른 대조 실험에 첨가되었고, pH는 1M의 아세트산의 첨가에 의해 5.3까지 조절되었다. 혼합물은 2시간 동한 혼합되면서 배양되었고, 샘플은 시험들 위해 제거되었으며, 이후에 TREN 입자들이 5%(v:v)의 양으로 첨가되었고, 추가의 4시간 동안 혼합되면서 배양되었다. 고체들은 미세여과에 의해 제거되었고, 이후에 분석되었다. 이러한 실험 포맷은 0.4%, 0.5% 및 0.6%에서 8-헵텐산으로 반복되었다.
Samp. 숙주 단백질들(ppm)IgG 회수(%) 응집체(%) FLC(%)
CCH 416k 100 20.3 33.4
TREN 이전
Capry.4% 137k 91 20.8 26.7
8NA.4% 147k 91 18.6 26.6
8NA.5% 124k 90 -- 22.1
8NA.6% 71k 89 14.0 21.8
TREN 이후
Capry.4% 6108 78 17 0.4
8NA.4% 4353 91 1.8 1.7
8NA.5% 4561 78 1.5 nd
8NA.6% 6225 59 0.9 nd
실험예들로 예시한 바와 같이, 개시되는 방법들은 보다 높은 레벨들의 정제를 구현하기 위해 다른 정제 방법들과 결합될 수 있었다. 다른 정제 방법들의 이러한 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 친화 크로마토그래피 단백질 A 및 다른 형태들, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 혼합 모드 크로마토그래피 방법들과 같은 IgG의 정제를 위해 사용되는 다른 방법들; 폴리에틸렌글리콜과 같은 비이온성 중합체들로의 항체 침전이나 또는 황산암모늄, 황산나트륨, 인산칼륨, 시트르산나트륨, 또는 시트르산칼륨과 같음 염들로의 항체 침전을 포함하는 침전의 방법들; 결정화 및 2상 수성 추출(two-phase aqueous extraction)의 방법들을 포함한다. 다양한 방법들을 위한 적절한 조건들을 개발하고 특정 항체의 필수적인 정제를 구현하기 위해 이들을 여기에 개시되는 방법들과 통합하는 것은 해당 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자의 이해의 범주 내에 있을 것이다.
여기서 언급되는 모든 참고 문헌들은 각각의 개별적인 공개특허들이나 특허들 또는 특허출원들이 모든 목적들을 위해 그 전체 개시 사항들이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 나타내어지는 것과 같은 정도까지 그 전체 개시 사항들이 모든 목적들을 위해 참조로 포함된다. 참조로 포함되는 공개특허들이나 특허들 또는 특허출원들이 본 명세서에 포함되는 개시 사항에 모순되지 않는 정도까지 본 명세서는 임의의 이러한 모순적인 문제를 대체하거나 및/또는 우선하도록 의도된다.
본 명세서와 특허청구범위에서 사용되는 구성 성분들, 크로마토그래피 조건들 및 기타들의 양들을 나타내는 모든 숫자들은 모든 예들에서 "약(about)"이라는 용어에 의해 변경되는 것으로 이해된다. 이에 따라, 다르게 기재되지 않는 한, 본 명세서와 첨부된 특허청구범위에서 설정되는 수치적 변수들은 본 발명의 실시예들에 의해 수득되는 것으로 간주되는 원하는 성능에 따라 변화될 수 있는 근사치들이다.
여기에 개시되는 실시예들의 많은 변형들과 변화들이 해당 기술 분야의 숙련자에게는 분명한 바와 같이 이들의 사상과 범주를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다. 여기에 개시되는 특정 실시예들은 단지 예로써 제시되는 것이며, 어떠한 방식으로도 제한하는 것을 의미하지 않는다. 본 명세서와 실험예들은 다음의 특허청구범위에 의해 나타나는 여기에 개시되는 실시예들의 진실한 사상과 범주 내에서 단지 예시적인 것들로 간주되도록 의도된다.

Claims (21)

  1. 항체를 정제하는 방법에 있어서,
    (a) 혼합물을 형성하도록 적어도 하나의 항체를 포함하는 세포 배양 수확물(cell culture harvest) 또는 단백질 제제(protein preparation)를 7개 내지 10개의 탄소 원자들을 갖는 적어도 하나의 지방산과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 혼합물을 알란토인(allantoin)과 접촉시키는 단계; 및
    (c) 상기 IgG를 함유하는 용액으로부터 고체 물질들을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 알란토인은 (a) 약 0.6%부터 약 30%까지, (b) 약 1%부터 약 10%까지, 그리고 (c) 약 1%부터 약 2%까지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 범위 내의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 알란토인은 영(0)이 아닌 양으로부터 약 0.6%까지의 범위 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a) 또는 (c) 후에 존재하는 상기 고체 물질들은 침강, 원심분리 또는 이들의 결합에 의해 제거되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a) 또는 (c) 후에 존재하는 상기 고체 물질들은 여과에 의해 제거되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 여과는 멤브레인 여과 또는 심층 여과를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 멤브레인 여과 또는 심층 여과는 기능화된 접촉 표면을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 수확물 또는 단백질 제제는 세포들을 함유하며, 선택적으로 세포 배양 생산이 수행되었던 바이오리액터(bioreactor) 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 수확물 또는 단백질 제제는 세포들을 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 제제는 자연 생물체의 체액(fluidbiological fluid)인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 지방산은 CH3(CH2)nCOOH의 일반 구조식을 포함하며, n은 5부터 8까지의 정수인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 지방산은 에난트산(enanthic acid)(헵탄산(heptanoic acid)), 카프릴산(caprylic acid)(옥탄산(octanoic acid)), 펠라르곤산(pelargonic acid)(노난산(nonanoic acid)), 또는 카프릭산(capric acid)(데칸산(decanoic acid))을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 지방산은 적어도 하나의 이중 결합을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 지방산은 노넨산(nonenoic acid)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 13 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 지방산은 말단 위치에서 이중 결합을 갖는 노넨산인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 지방산은 (a) 약 0.05%부터 약 5%까지, (b) 약 0.1%부터 약 1.0%까지, (c) 약 0.2%부터 약 0.4%까지, 그리고 (d) 약 0.1%부터 0.2%까지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 범위 내의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합물은 계면활성제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계면활성제는 비이온성, 쌍성 이온성 또는 양이온성인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 양이온성 계면활성제는 세틸트리메틸암노늄 브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide)인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 세틸트리메틸암노늄 브로마이드는 약 0.001%부터 0.05%까지, 약 0.005%부터 0.025%까지, 또는 약 0.0075%부터 약 0.01%까지의 범위의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 따른 방법들의 하나의 수행을 가능하게 하는 키트(kit).
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