CN106029690B

CN106029690B - 蛋白质纯化

Info

Publication number: CN106029690B
Application number: CN201480069196.8A
Authority: CN
Inventors: A·詹格保尔; R·索姆尔
Original assignee: Nova Machining Ltd
Current assignee: Sartorius Chromatography Equipment SAS
Priority date: 2013-10-18
Filing date: 2014-10-17
Publication date: 2021-08-31
Anticipated expiration: 2034-10-17
Also published as: EP3057987B1; SG10201811186XA; KR102356757B1; SG11201603028SA; US10508133B2; WO2015056237A3; WO2015056237A2; CN106029690A; EP3057987A2; US20160272675A1; KR20160078994A

Abstract

本申请涉及蛋白质比如抗体的纯化方法，该方法使用亲水聚合物(比如，PEG)、脂肪酸(比如，羊脂酸)和/或另外的试剂(比如，氯化钙)。

Description

蛋白质纯化

相关申请

本申请要求2013年10月18日提交的美国序列号61/892,975的优先权。

技术领域

本申请涉及蛋白质比如抗体的纯化方法。

背景技术

用疏水聚合物(聚乙二醇＝PEG)沉淀IgG(重组抗体)是传统蛋白A亲和层析纯化单克隆抗体的可选方法。用PEG沉淀蛋白质是Poison建立的(Poison等，1964)。Atha和Ingham(Atha和Ingham，1981)显示沉淀蛋白质的浓度随着PEG浓度的增加而增加，以及沉淀也受PEG大小和pH值的影响(Poison等，1964)。据推定聚乙二醇沉淀机理是体积排阻反应(volume exclusion reaction)(Mahadevan和Hall，1990)。PEG可被用于沉淀大蛋白(largeprotein)(比如，宿主细胞蛋白(HCP))以及DNA。然而，以分子质量差异大约2倍(by afactor of about two)用PEG从DNA分离IgG(以及其他大蛋白)要求接近完整分离(比如，100％)所必须的(Lis和Schleif，1975)。为了获得所需的DNA和HCP的清除率，PEG沉淀可与另一沉淀方法结合。羊脂酸沉淀是从马血浆分离毒液(venom)的常见方法(Rojas等，1994)。羊脂酸沉淀的沉淀参数在一些出版物中被描述(McKinney和Parkinson，1987；Mohanty和Elazhary，1989；Russo等，1983)。将羊脂酸沉淀与不同的纯化方法，比如硫酸铵沉淀相结合，以纯化人免疫球蛋白(Perosa等，1990)或与离子交换层析结合以分离马的抗蛇毒素(equine antivenom)(Raweerith和Ratanabanangkoon，2003)。同样地，结合另外的阳离子交换层析步骤，从CHO细胞培养物上清液，CA沉淀出源于工艺(process-derived)的杂质也被进行(Wang等，2009)。

羊脂酸也已经被用于从人血浆沉淀非免疫球蛋白。在上清液(其包含，就吸光单位来说26-29％的总蛋白质或者按重量计78-87％的IgG)中存在的粗IgG在DEAE-纤维素被分开(fractionated)，以产生纯IgG，如圆盘电泳、免疫电泳和凝胶过滤所显示的。纯IgG没有纤维蛋白溶酶和纤维蛋白酶原，且在40℃多至4周的时间段储存期间并不显示任何片段化(fragmentation)或聚集，且其抗补体活性(anticomplementary activity)低。病毒剂抗体被未改变地回收(recovered)。(Habeeb等，Preparation of Human Immunoglobulin byCaprylic Acid Precipitation.Preparative Biochemistry，14(1)：1-17(1984))。

Parkkinen等(Vax Sanguinis，90：97-104(2006))描述了纯的、基本上没有聚合物的IgG从人的Cohn氏组分II+III的分离，分离通过羊脂酸处理以灭活有包膜病毒，以及沉淀污染的蛋白质和脂类，聚乙二醇沉淀IgG，以及通过阴离子交换层析最终纯化。US2007/0244305Al(Parkkinen,J.)描述了类似的工艺。

Bergmann-Leitner等(Malaria J.7：129-139(2008))比较了使用免疫的兔血清或暴露于疟疾的人血清作为Ig源的不同免疫球蛋白(Ig)的过程。被测试的过程包括总Ig的富集(enrichment)，其通过血清蛋白的羊脂酸清除(depletion)，接着硫酸铵沉淀(CA-AS)。发现CA-AS方法提供高产量而无显著降解。PEG沉淀被发现对分离人Ig是最佳的。

Vargas等(Biotechnol.Prog.，28(4)：1005-1011(2012))描述从白蛋白通过PEG沉淀作为上相和下相分离人IgG。存在于上相中的IgG之后通过羊脂酸沉淀和离子交换层析被进一步分离。

美国专利号4,164,495(Hansen,J.)描述了在具有4-12个碳原子的单链烷酸或多链烷酸比如羊脂酸的存在下，使用缩聚的二元醇或多元醇，比如聚乙二醇，分离免疫球蛋白(Ig)的方法。其中描述的是从人血浆分离Ig的方法，其通过首先单独使用PEG从其中沉淀血纤蛋白原，分离包括Ig的沉淀物，在氯化钠溶液中将其溶解，以及将溶液与羊脂酸和PEG混合。产生的沉淀物被去除，并且液相单独用PEG沉淀以获得“纯”Ig，产率60％。

美国专利号5,164,487(Kothe等)涉及分离"静脉内耐受的"Ig的方法，其通过处理经层析或Cohn氏工艺获得的包含IgG的原始组分，并使用0.4到1.5％的辛酸(按体积计)以及层析(离子或阳离子交换剂或疏水基体)富集IgG。“静脉内耐受的”制剂被描述为可被施用至患者而无副作用。

Steinbuch等(Arch.Biochem.Biophy.134:279-284(1969))描述了羊脂酸用于自人血清中沉淀纯化的IgG(至90％，使用羊脂酸/乙酸盐缓冲液(pH 4.8))的用途，以及离子交换纤维素和/或尺寸排阻层析(以去除IgA、血浆铜蓝蛋白和α1-酸-糖蛋白)。相似的过程被用于从动物(马、羊、兔)血清分离Ig。

McKinney(J.Immunol.Meth.96:271-8(1987))公开了从哺乳动物腹水流体分离IgG的两步过程。第一步用羊脂酸(辛酸)沉淀白蛋白和其他非IgG蛋白，和第二步用硫酸铵沉淀IgG(比如，从兔血清80-90％的回收)。

美国专利号5,747,031(Ruch等)描述了通过将脂类和非Ig蛋白同时和带电荷的聚合物(比如，几丁质)和脂肪酸(比如，羊脂酸)共沉淀，从乳清(比如，从超免疫乳制得)分离Ig的方法。产生的上清液之后被进一步处理，通过，例如膜渗滤以获得分离的Ig(比如，66-79％)。

WO 86/05099A1(Steinbuch等)涉及使用饱和脂肪酸比如羊脂酸自人血浆分离IgG4的工艺。

US 2002/177693AA(Lebing等)描述了通过下述自人血浆纯化抗体的工艺：制备包括沉淀的Ig的组合物，溶解Ig在具有3.8到4.5的pH的溶液中，添加辛酸根离子以及增加pH至5.0到5.2，和通过过滤去除沉淀的蛋白质、脂类和辛酸盐。辛酸盐之后被添加到产生的溶液，温度被提高，以及助滤剂被引入。产生的沉淀之后通过流过滤(flow filtration)被去除。溶液之后通过两个阴离子交换层析柱以生产>99％纯度的Ig。

WO 2012/136172A1(Segura Ruiz等)描述通过在包括苯酚的两相系统中精馏源材料(source material)，生产可注射的源于血液的(blood-derived)蛋白质材料的工艺，一相用羊脂酸沉淀和另一相通过热凝固加工。

Svendsen等(Lab.Animal Sci.45(1):89-93(1995))比较了分别通过硫酸铵、PEG和羊脂酸从蛋黄中纯化抗体。硫酸铵被确定提供最好的纯度和产率，以及发现羊脂酸没有产生任何纯化的抗体。

Tscheliessnig等(J.Chromatography,1216:7851-7864(2009))描述使用PEG和阴离子交换层析对IgM(从杂交瘤中)纯化的两步工艺。产率28％-84％，纯度范围从46％到>95％。

Knevelman，等。(Biotechnol.Prog.26:697-705(2010))描述PEG基(PEG-based)的IgG4的快速沉淀，IgG4从细胞培养基沉淀。最大产量和纯度被确定由10-18％(w/v)之间的PEG的使用得到。

Kuczewski等(Biopharm.Int.,Supp.,pp.20-28(March 2010))描述从澄清的细胞培养基PEG型沉淀单克隆抗体，产率大约90％，并且降低宿主细胞蛋白(HCP)含量7倍。抗体通过阳离子交换层析被捕获。PEG-3350的使用被发现提供了较高的回收但较少的HCP降低。发现PEG-6000较好地降低HCP但是导致较低产量。PEG-3350在14％(pH8.5)被选为最佳条件。

Gibson等(J.Pharm.Sci.100(3):1009-1021(2011))涉及跨不同pH值PEG与柠檬酸盐、乙酸盐、组氨酸或磷酸盐缓冲液一起使用，以测试由CHO细胞或鼠细胞系(每个提供不同的糖基化模式到mAb)产生的IgGl mAb的溶解度。进行这些比较以明确用于mAb制剂的高生产量分析的策略。

在本领域中存在对从细胞培养物上清液分离蛋白质比如抗体的改进方法的需求。本公开提供这样的改进的方法。

附图说明

图1.PEG沉淀分析。

图2. 2-D凝胶电泳结构。

图3.示例性的羊脂酸(CA)沉淀方案。

图4.B03(组A)和B07(组B)上清液(在pH4.5的上清液(SN)和在CA沉淀后在ph4.5的SN)的SEC(BIO-SEC 3，Agilent)层析谱比较。

图5.在pH5.5和混合速度40rpm，在不同NaAc盐浓度的存在下，CA沉淀(1％CA)后B03和B07的产率；与细胞培养物上清液(组A)或pH调节的细胞培养物上清液(组A)比较。

图6.示例性的CA/PEG沉淀方案。

图7.在不同pH值，在CA和CA/PEG沉淀之后mAbs的产率(BIO-SEC 3,Agilent)和HCP(HCP-ELISA,Cygnus)(组A:B03；组B:B07)。

图8.mAb沉淀的产率(BIO-SEC 3,Agilent)随着PEG浓度增加的提高。

图9.在不同pH值，在CA(棕色条)和CA/PEG(绿色条)沉淀后的产率(BIO-SEC 3,Agilent)和在CA/PEG沉淀(蓝色条)后的纯度(HCP-ELISA,Cygnus)(组A:B03；组B:B07)。

图10.在不同NaAc缓冲液浓度，在CA(棕色条)和CA/PEG(绿色条)沉淀后mAbs的产率(BIO-SEC 3,Agilent)和在CA/PEG沉淀(蓝色条)后的纯度(HCP-ELISA,Cygnus)(组A:B03；组B:B07)。

图11.在不同pH值，在CA(棕色条)和CA/PEG(绿色条)沉淀后mAbs的产率(BIO-SEC3,Agilent)和在CA/PEG沉淀(蓝色条)后的纯度(HCP-ELISA,Cygnus)(组A:B03；组B:B07)。

图12.在CA和PE沉淀后的产率和倍-HCP降低(组A:B03；组B:B07)。

图13.在100和200mM NaCit E，在CA(棕色条)和CA/PEG(绿色条)沉淀之后mAb的产率(BIO-SEC 3,Agilent)和CA/PEG沉淀(蓝色条)后的纯度(HCP-ELISA,Cygnus)：在CA/PEG沉淀之后的产率和纯度(mAb1)。

图14.在NaCit缓冲体系中在不同CA浓度，在CA(棕色条)和CA/PEG(绿色条)沉淀后mAb的产率(BIO-SEC 3,Agilent)和在CA/PEG沉淀(蓝色条)后的纯度(HCP-ELISA,Cygnus)(组A:B03；组B:B07)。

图15.在NaCit缓冲体系中在不同CA浓度，在CA(棕色条)和CA/PEG(绿色条)沉淀后mAbs的产率(蛋白A亲和层析)和在CA/PEG沉淀(蓝色条)后的纯度(HCP-ELISA,Cygnus)(组A:B03；组B:B07)。

图16.CA/PEG沉淀纯化的mAbs和细胞培养物上清液的比较(SEC TSK3000SWXL,Tosho,280nm)(组A:B03；组B:B07)。

图17.沉淀数据(A：乙酸钠(NaAc)；B：柠檬酸钠(NaCit)；C：NaAc筛选；D：NaCit筛选；E：CA/PEG沉淀后的产率和纯度(mAb1)；F：在CA/PEG沉淀(mAb2)后的产率和纯度(mAb2)。

图18A-B.示例性的结合羊脂酸沉淀、PEG沉淀、CaCl₂沉淀和乙醇沉淀的工艺。

图19.示例性的mAb纯化的反应器。

发明概述

在一些实例中,本公开涉及从存在于包括所述蛋白质的细胞培养物上清液中的核酸和其他宿主蛋白分离目的蛋白的方法，该方法包括在pH 5.0-8.5将所述细胞培养物上清液和10-14％聚乙二醇(PEG(比如，PEG2000、PEG4000、PEG6000和PEG20000))(比如，大约14％或大约21％)结合。在一些实例中，使用14％的PEG6000。在一些实例中，这些方法可包括首先使用氯化钙沉淀核酸和蛋白质杂质。在特定实例中，这些方法可包括用脂肪酸(比如，羊脂酸)沉淀宿主细胞蛋白。在一些实例中，可使用大约5到大约200mM或0.1到10％的脂肪酸(比如，羊脂酸)，和/或pH可在大约4.0和大约6.0之间(比如，pH4.5)。在一些实例中，这样的制剂可可选地和/或也使用氯化钙(250mM CaCl₂，pH 8.5)处理以沉淀杂质(比如，DNA)。目的蛋白可使用任何方法的结合被分离，所述方法比如使用羊脂酸和/或氯化钙沉淀杂质、使用聚合物(比如，PEG)沉淀目的蛋白、和使用冷乙醇进一步沉淀(比如，洗涤)，其可以任何顺序进行，但通常最后进行在乙醇存在下的沉淀。在一些实例，抗体可通过下述被分离：使用羊脂酸沉淀杂质、使用聚合物(比如，PEG)沉淀目的蛋白、再增溶目的蛋白和从该组合物沉淀杂质、去除这些杂质、和使用冷乙醇沉淀(比如，洗涤)所分离的抗体。在任何这些方法中，目的蛋白可为抗体。另外，这些方法可不使用层析而被完成(比如，目标蛋白在理想的产率(比如，大约80％或更多)被纯化到理想的水平(比如，大约95％或更高纯度)。

在一些实例中，本公开涉及从细胞培养物上清液分离免疫球蛋白G(IgG)的方法，所述方法通过：(a)在缓冲液(比如，柠檬酸盐如柠檬酸钠)中使用至少一种脂肪酸(比如，羊脂酸)(比如，直接地)从细胞培养物上清液沉淀宿主细胞污染物，以生产包括免疫球蛋白的二级(secondary)上清液；和(b)使用至少一种亲水聚合物(比如，聚乙二醇(PEG))——任选地包括至少一种盐——从二级上清液沉淀IgG，；其中纯化IgG到至少大约95％；产率为至少大约80％。典型地,这些方法不包括层析的使用。在特定实例中，在步骤(a)期间使用的羊脂酸的浓度可为从大约0.1％到大约10％(比如，1％)和/或大约5mM到大约200mM。在一些实例中，步骤(a)使用的pH可为大约4.0到大约6.0(比如，大约pH 4.5)。在步骤(b)，PEG的浓度可为大约10％到大约30％(比如，大约14％或大约21％)；在步骤b)沉淀期间pH可为大约5到大约8.5；以及温度可为大约4℃到大约35℃。在特定实例中，步骤b)可在大约15分钟之后完成，和/或在大约30到大约60分钟之后达到平衡。在一些实例中，至少一个另外的沉淀过程(比如，冷乙醇沉淀)跟在步骤b)之后。另外，这些方法可被完成(比如，将抗体纯化在理想的产率(比如，大约80％或更多)到理想的水平(比如，大约95％或更高纯度)，而不使用层析。

在一些实例中，本公开也提供了用于连续生产包括基本上分离的目的蛋白(比如，抗体)的制剂的装置和方法。装置可为，例如，两步沉淀反应器(比如，图18)。在一些实例中，反应器提供大约2升的体积和/或合适的流速(比如，20ml/min)。装置可包括管(比如，5mm直径的硅管)、磁阀、过滤单元等等。装置也可被配置为第一和第二沉淀反应可彼此独立运行。

其他实例通过本文提供的公开内容将是显而易见的。

发明详述

如以上简要描述和以下更详细的描述，本公开涉及解决在蛋白质比如抗体(比如，单克隆抗体)纯化期间遇到的典型问题的方法。本文描述的方法可被出乎意料地使用，以从包括抗体、其他蛋白质、和/或核酸等组分的组合物中提供纯化的抗体制剂。在一些实例中，本文描述的方法提供直接从无细胞的培养物上清液以高产率(比如，80％或更多)生产高纯度抗体(比如，95％或更高)。

如以上和权利要求所述，本公开涉及使用聚乙二醇(PEG)从存在于包括所述蛋白质的细胞培养物上清液(其可为无细胞的培养物上清液)中的核酸和其他宿主细胞蛋白分离目的蛋白的方法。在一些实例中，方法包括结合这样的细胞培养物上清液和第一沉淀剂(比如，氯化钙和/或脂肪酸比如羊脂酸)以去除沉淀的蛋白质和/或其他组分来生产二级细胞培养物上清液(比如，其仍包括目的蛋白)，以及引入沉淀聚合物(比如，聚乙二醇(PEG))以从二级细胞培养物上清液沉淀目的蛋白(比如，抗体)。在一些实例中，可之后使用氯化钙以进一步从PEG-沉淀的蛋白质中去除杂质。

在特定实例中，这些方法可包括使用一种或更多种脂肪酸(比如，羊脂酸)沉淀细胞培养物组分，比如宿主细胞蛋白(HCPs)。在一些实例中，脂肪酸可以从大约0.1％到大约10％(v/v)(比如，大约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0中的任何值)的量存在于沉淀混合物中和/或可使用大约5到大约250mM脂肪酸(比如，大约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245或250mM中的任何值)。大约4-6的pH(比如，在大约4.5到大约5.5之间，或大约4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0.5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0中的任何值)。脂肪酸也可与盐或不与盐一起使用(比如，乙酸钠或柠檬酸钠(比如，0.1-200mM的二者之一的盐，比如大约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200mM中的任何值)。沉淀可进行一段合适的时间量，比如，例如，5到90分钟(比如，大约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或90分钟中的任何值)。这样的反应的合适的温度可为，例如，大约4℃到大约35℃。示例性的方法可包括下述步骤：制备包括大约1％羊脂酸的细胞培养物上清液，使用乙酸钠或柠檬酸钠制剂(比如，以大约10-300mM存在，比如大约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300mM中的任何值)调节细胞培养物上清液/羊脂酸的pH4.5，以及在室温(比如，大约25℃)混合这些组分大约10分钟。沉淀物可之后被从细胞培养物上清液去除以生产二级细胞培养物上清液。

二级细胞培养物上清液可之后用聚合物处理以沉淀目的蛋白(一种或多种)(比如，抗体)。合适的聚合物为聚乙二醇(PEG)。合适的PEG聚合物可包括但不限于，例如，PEG2000、PEG4000、PEG6000和PEG20000。可通过以大约5-30％(比如，大约10-21％、或大约10-14％、或大约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30％中的任何值)的量将PEG引入至二级细胞培养物上清液完成沉淀。混合物的合适的pH可为大约4-9中任何值(比如，大约5.0-8.5、或大约4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5或9)。一般不考虑目的蛋白的pI来选择这些方法中使用的pH。沉淀可进行一段合适的时间，比如,例如，5到90分钟(比如，大约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或90分钟中的任何值)。这样的反应的合适的温度可为，例如，大约4℃到大约35℃。示例性的方法可包括在大约5和大约8.5之间的pH(比如，独立于目的蛋白pI)制备包括大约14％或大约21％PEG(比如，PEG6000)的细胞培养物上清液，允许沉淀在适当的温度(比如，大约室温或大约25℃)进行至少大约10到15-60分钟，以及分离包含目的蛋白的沉淀物。目的蛋白可接着被分离和/或再悬浮于适当缓冲液和/或溶液中以产生包括目的蛋白的组合物。在一些实例中，这些方法可包括使用氯化钙从该组合物沉淀核酸和蛋白质杂质。在一些这样的实例中，包括目的蛋白的组合物可用氯化钙(CaCl₂)(比如，大约10-400mM中的任何值，比如，大约10、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350或400mM中的任何值)在适当pH(比如，大约6到大约9中的任何值，比如大约6、6.5、7、7.5、8、8.5或9中的任何值)处理以沉淀这样的杂质(比如，DNA)。典型地，氯化钙沉淀可在羊脂酸沉淀和PEG沉淀后但在乙醇沉淀之前进行(比如，图18)。然而，任何这些沉淀步骤可在任何其他沉淀步骤之前、之后或同时被使用，如本领域技术人员可确定的。

在不使用层析的情况下，一旦目的蛋白在理想的产率(比如，大约80％或更多)被纯化和/或被纯化到理想的水平(比如，大约95％或更高纯度)，这些方法可被认为完成。产率当然可比80％更高或更低(比如，大约50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、99.5、99.9或100％中的任何值)。纯度水平也可比95％更高或更低(比如，大约50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、99.5、99.9或100％)。纯度也可依据从细胞培养物上清液去除的宿主细胞蛋白(HCP)的量被定义，其可被表达为"倍-HCP降低"或类似术语(比如，大约10、25、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500-倍HCP降低中的任何值)。这些测量可以任何理想的形式结合(比如，产率/纯度、产率/倍-HCP降低、产率/倍-HCP降低/纯度、和/或纯度/倍-HCP降低)。产率、纯度和/或HCP水平可使用任何对于本领域技术人员可用的工具确定，包括但不限于层析(比如，尺寸排阻(SEC)、蛋白A)和/或酶联免疫吸附测定(ELISA)。如本领域技术人员应理解的，其他产率和/或纯度的测量和做出这样测定的方法对于那些本领域技术人员是可用的以及可适当用于此处。

在一些实例中，本公开涉及从细胞培养物上清液分离目的蛋白的方法，所述目的蛋白是比如免疫球蛋白G(IgG)的抗体，分离通过：(a)在缓冲液(比如，柠檬酸盐比如柠檬酸钠)中使用至少一种脂肪酸(比如，羊脂酸)(比如，直接地)从细胞培养物上清液沉淀宿主细胞污染物，以产生包括免疫球蛋白的二级上清液；(b)使用至少一种亲水聚合物(比如，聚乙二醇(PEG))——任选地包括至少一种盐——从二级上清液沉淀IgG；和，任选地，(c)从包括步骤(b)中沉淀的抗体的组合物沉淀杂质；其中IgG被纯化到至少大约95％；产率为至少大约80％。典型地，这些方法不包括层析的使用。在特定实例中，在步骤(a)期间使用的羊脂酸的浓度可从大约0.5％到大约10％(v/v)和/或大约5mM到大约200mM。在一些实例中，步骤(a)使用的pH可为大约4.5到大约5.5(比如，大约4.5)。在步骤(b)，合适的PEG的浓度可为如以上所述的(比如，大约14％或大约21％)；在步骤b)沉淀期间的pH可为大约5到大约8.5(比如，大约pH 7)；以及温度可为大约4℃到大约35℃。在任选的步骤(c)使用的氯化钙(CaCl₂)的量可为任何适当的量，比如，例如，250mM。在特定实例中，步骤b)可在大约15分钟后完成和/或在大约30到大约60分钟之后达到平衡。在一些实例中，至少一个另外的沉淀程序(比如，冷乙醇沉淀)在步骤b)之后。另外，在不使用层析的情况下，这些方法可被完成(比如，抗体在理想的产率(比如，大约80％或更多)被纯化到理想的水平(比如，大约95％或更高纯度)。

在一些实例中，本公开也提供连续生产包括基本上分离的目的蛋白(比如，抗体)的制剂的装置和方法。在一些实例中，装置可为，例如，两步沉淀反应器(比如，图18)。在一些实例中，反应器提供大约2升的体积和/或合适的流速(比如，20ml/min)。装置可包括管(比如，5mm直径的硅管)、磁阀、过滤单元等等。装置也被配置为第一和第二沉淀反应(或另外的沉淀步骤)可彼此独立运行。

短语"直接地从细胞培养物上清液"典型地意思是培养物上清液(比如，无细胞的培养物上清液)未被处理(比如，未被“预处理”)，而不是被收集以加工，以使培养物上清液的其他组分(比如，非抗体组分比如宿主细胞蛋白(HCP))与目的蛋白(比如，抗体)的比例在进行本文描述的方法之前(比如，培养物上清液未以被理解为从免疫球蛋白分开(separate)和/或分离(isolate)HCP和/或从HCP纯化免疫球蛋白的方式被处理)基本上未被改变。这样，为了分离抗体，本文描述的方法可从杂交瘤的无细胞的培养物上清液开始，产生待被分离的单克隆抗体。应该被理解也可使用其他起始材料(比如，腹水、半纯化或纯化的包含待被结晶的抗体的制备剂)。这些方法对于从血清等等分离“纯化的”多克隆抗体也是合适的。对于无细胞的培养物上清液，其可被从培养物直接使用，或在一些实例中，在加工之前浓缩。无细胞的培养物上清液也可被浓缩，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20中任何值的倍数，以提供较少的体积，和因此较高的蛋白质(和其他组分)的浓度(比如，100ml到10ml，倍数为10，或10:1)。无细胞的上清液的蛋白质浓度可为，例如，大约1-100g/L，比如大约10g/L、25g/L、或50g/L中的任何值。如本领域技术人员可理解的，浓缩可以通过使用一些广泛可用的技术中的任何技术去达到，比如离心、硫酸铵浓缩、旋转离心和/或超滤(比如，具有Ultracel-10膜的Amicon Ultra-15离心过滤器单元)。本领域技术人员可理解这些和其他合适的起始原料。

这样，本公开提供蛋白质比如抗体的纯化方法，其使用脂肪酸比如羊脂酸(CA)分离杂质(宿主细胞蛋白，dsDNA)和亲水聚合物比如聚乙二醇(PEG)以沉淀抗体。细胞培养物上清液的杂质可从这些蛋白质中使用羊脂酸分离，并且在一些实例中，通过添加柠檬酸钠l00mM和调节pH到4.5分离。在特定实例中，沉淀可在大约30到60分钟强力混合后被基本上完成。在盐存在或不存在的情况下，在合适的pH(比如，大约5和8.5之间(不依赖于目的蛋白pI))，在合适的温度(比如，大约4到35℃之间)，可通过添加PEG沉淀蛋白质。在大约10-15分钟之后沉淀可被几乎完成；在大约30到大约60分钟之后达到平衡。上清液可之后被丢弃，并且使用另一试剂比如氯化钙洗涤和/或再悬浮沉淀物以进一步纯化，以及之后被重新沉淀(比如，洗涤)。最终沉淀物可被溶解在适当的缓冲液中或冻干储存。工艺可以批次操作和连续操作进行。方法意图大规模纯化重组抗体和片段(可能也为其他重组蛋白)作为层析工艺的可选方法。工艺可被与其他层析或非层析步骤结合。本方法可整体地应用于重组抗体、片段和相似蛋白质的纯化。

在一些实例中，本公开提供用脂肪酸(一种或多种)和亲水聚合物溶液纯化蛋白质(比如，重组抗体)的方法，以产生从dsDNA、宿主细胞蛋白、和其他在抗体的生产期间产生的杂质中分离的天然蛋白质。在特定实例中，方法是用脂肪酸(比如，羊脂酸)(而不增加工作容积)和用柠檬酸钠而非乙酸钠作为主要缓冲组分沉淀杂质/蛋白质(pI≤7)。那些本领域技术人员理解，工作容积为在下游加工方法中是非常重要的问题，因为较低的容积可加快工艺速度以及降低设备的占地(footprint)。在一些实例中，这些优点被本文描述的方法认可。

在一些实例中，本公开提供从细胞培养物或发酵上清液沉淀蛋白质(比如，抗体)的方法，其使用亲水聚合物溶液(聚乙二醇)而不添加盐(磷酸盐)和/或调节pH至抗体pI。本文描述的方法也不依赖于培养物上清液的条件而作用。这样，调节步骤并不是必须的，并且这随后简化了工艺。进一步地，沉淀可在10到15分钟内完成。本公开也显示为达到第一捕获步骤要求在杂质的脂肪酸沉淀和重组抗体/相似蛋白质的亲水聚合物沉淀之间的组合。

在特定实例中，羊脂酸沉淀、PEG沉淀和/或CaCl₂沉淀可被结合为单一工艺(比如，图18A和18B)。在一个示例性的实例，澄清的细胞培养物上清液可使用柠檬酸钠或乙酸钠和羊脂酸在如本文描述的合适的pH(比如，100mM柠檬酸钠(NaCit)，pH 4.5，1％羊脂酸)被首先沉淀，以及产生的沉淀物被去除以提供二级上清液。抗体可之后使用合适量的PEG以及在合适的pH(比如，PEG 21％，pH 7)被从二级上清液中沉淀、分离和再悬浮于适当的缓冲液。之后可使用合适量的氯化钙在合适的pH(比如，250mM CaCl₂，pH 8.5)从该制剂沉淀分离的抗体。沉淀物之后可被再悬浮于适当缓冲液中以及在乙醇(比如，25％(v/v)，pH 6.5，-10℃)中被重新沉淀(比如，洗涤)。一个该组合工艺的示例性的实例和其结果在实施例5中被描述。如本文描述的其他方法，通过这样的工艺被分离的抗体可提供更理想的产率、纯度、HCP的降低。在一些实例中，超滤、膜渗滤和/或离子交换层析可作为另外的步骤被加入以进一步纯化抗体。

如上所述，在特定实例中，目的蛋白可为抗体。示例性的抗体可包括，例如，人抗体(比如，IgG(IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA(IgAl和IgA2)、IgD、和IgE)、犬抗体(比如，IgGA、IgGB、IgGC、IgGD)、鸡(比如，IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、IgY)、山羊抗体(比如，IgG)、小鼠抗体(比如，IgG、IgD、IgE、IgG、IgM)、猪抗体(比如，IgG、IgD、IgE、IgG、IgM)、大鼠抗体(比如，IgG、IgD、IgE、IgG、IgM)和/或其片段和/或其衍生物。合适的示例性的抗体类型可为，例如，人IgG。示例性的片段和/或衍生物可包括，例如，Fab、F(ab')₂、Fab'单链抗体、Fv、单链单特异性抗体、双特异性抗体、三特异性抗体、多价抗体、嵌合抗体、犬-人嵌合抗体、犬-小鼠嵌合抗体抗体、包括犬Fc的抗体、人源化抗体、人抗体、犬源化(caninized)CDR-移植(grafted)抗体、鲨抗体、纳米抗体(nanobody)(比如，由单一单体可变结构域组成的抗体)、骆驼属(camelid)抗体(比如，驼科(Camelidae family)抗体成员)微体、胞内抗体(intrabody)(比如，细胞内的抗体)、和/或去岩藻糖基(de-fucosylated)抗体和/或其衍生物。结合剂和/或抗体的的模拟物(Mimetics)也被提供。那些本领域技术人员应理解的，其他类型抗体和/或其片段和/或其衍生物也合适于使用本文描述的方法分离/纯化。

使用本文描述的工艺分离的目的蛋白可被配制为组合物，其中一些可为药物组合物。本文描述的这样的组合物可采用任何适合用于研究和/或施用到宿主(比如，哺乳动物比如人类)的形式。合适的类型包括，例如，液体、胶囊、乳液、颗粒、膜、植入物(implant)、液体溶液、锭剂(lozenges)、多微粒(multi-particulates)、囊剂(sachets)、固体、片剂(tablet)、锭剂(troch)、微丸(pellet)、粉末和/或混悬剂(suspension)。添加或不添加药学上可接受的表面活性剂的情况下，液体制剂可包括稀释剂，比如水和醇，比如乙醇、苯甲醇和聚乙烯醇。胶囊形式可由明胶形成(比如，硬或软壳的)。任何这样的组合物可包括，例如，表面活性剂、润滑剂、和惰性填料，比如乳糖、蔗糖、磷酸钙、玉米淀粉和/或等等。片剂形式可包括，例如，赋形剂和/或其他试剂比如乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、土豆淀粉、藻酸(alginic acid)、微晶纤维素、阿拉伯胶、明胶、瓜尔豆胶、胶态(colloidal)二氧化硅、崩解剂(比如，交联羧甲基纤维素钠(croscarmellose sodium))、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸、着色剂、稀释剂、缓冲剂、崩解剂、湿润剂、防腐剂、和/或调味剂。也可使用锭剂形式，典型地，有惰性基(inert base)，比如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶、乳液、凝胶等等。组合物也可被制备为冻干的形式。本领域技术人员应理解的，其他形式也可为合适的。

药物组合物可采用上述描述的或本领域可知的任何形式。在用于研究和/或施用到宿主(比如，动物比如人类)之前，可使用一种或更多种药学上可接受的载体制备药物组合物。药学上可接受的载体是非生物学或其他方面不理想的材料，比如，材料可用于研究和/或施用到受试者，而不引起任何不理想的生物效应或以有害方式与包含其的药物组合物和/或使用其的反应中的任何其他组分相互作用。本领域技术人员应众所周知的，载体会自然地被选择以最小化任何活性剂的降解和最小化受试者中任何不良副作用。合适的药学载体和它们的制剂被描述在，例如，Remington's:The Science and Practice ofPharmacy,第21版,David B.Troy,ed.,Lippicott Williams&Wilkins(2005)。典型地，适当量的药学上可接受的盐被用于制剂以使得制剂等渗(isotonic)。药学上可接受的载体的实例包括，但不限于，无菌水、盐水(saline)、如Ringer's溶液的缓冲液和葡萄糖溶液。溶液的pH整体上从大约5到大约8或从大约7到大约7.5。其他载体包括缓释制剂(sustained-release preparation)，比如包括多肽或其片段的固态疏水性聚合物的半透性(semipermeable)基质。基质可为有形状的物体的形式，比如，膜、脂质体或微粒(microparticles)。对于那些本领域技术人员来说是明显的，依赖于例如施用途径和施用的组合物的浓度，某些载体可为更优选的。也提供通过将组合物(比如，作为药物组合物)施用到需要治疗的宿主来治疗疾病的方法。合适的施用途径包括，例如，口服(oral)、含服(buccal)、直肠的(rectal)、穿粘膜的(transmucosal)、局部的(topical)、经皮的(transdermal)、皮内的(intradermal)、肠道的(intestinal)、和/或肠胃外的途径。那些本领域技术人员应理解的，其他施用途径和/或本文描述的组合物形式也可为合适的。

本文描述的组合物可被用于治疗不同疾病，包括但不限于癌症和非癌症病况。可治疗癌症和/或细胞生长相关的病况，包括，例如，良性肿瘤、恶性肿瘤、疣、息肉等等。使用本文描述的组合物可治疗的癌症的实例可包括，但不限于膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、食管癌、淋巴癌(比如，Burkitt's、非-Hodgkin's)、子宫内膜癌、头颈癌、白血病、肝癌、肺癌、非息肉病、黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌等等。本领域技术人员之一应理解的，其他癌症和/或细胞生长相关的疾病也可被治疗。

除了癌症外，可用本文描述的组合物治疗的典型的疾病可包括，例如，胃肠失调(gastrointestinal disorder)比如慢性腹泻、小肠疾病(比如，肠炎，包括但不限于十二指肠炎、空肠炎、回肠炎)、胃/十二指肠溃疡(比如，柯林氏溃疡(Curling's ulcer))、和吸收障碍(比如，腹部(coeliac's)疾病、热带口炎性腹泻、盲袢综合征、惠普尔氏症(Whipple's)、短肠综合症(short bowel syndrome)、脂肪痢(steatorrhea)、米洛氏病(Milroydisease)))、大肠疾病(比如，盲肠炎(appendicitis)、结肠炎(colitis)(比如，伪膜性(pseudomembranous)、溃疡性(ulcerative)、缺血性(ischemic)、显微镜下(microscopic)、胶原性(collagenous)、淋巴细胞性(lymphocytic))、功能性慢性疾病(IBS、假性肠梗阻(intestinal pseudoobstruction)/奥格尔维氏(Ogilvie)综合症)、巨结肠(megacolon)/中毒性巨结肠、憩室炎(diverticulitis)/憩室病(diverticulosis)、小肠结肠炎(enterocolitis)(比如，坏死)，炎症性肠病("IBD")、克罗恩氏(Crohn's)病、腹泻(比如，传染的、慢性的)、腹绞痛(abdominal angina)、肠系膜缺血(mesenteric ischemia)、血管发育不良(angiodysplasia)、直肠炎(proctitis)(比如，放射性(radiation)直肠炎)、痉挛性肛部痛(proctalgia fugax)、肛裂(anal fissure)/肛瘘(anal fistula)、肛周脓肿(analabscess)、关节炎等等。本领域技术人员应理解的，其他非癌(non-cancerous)或细胞生长相关的疾病也可被治疗。

如本文描述被生产的蛋白质和/或包括其的组合物，可被用于研究以检测蛋白质和/或核酸在细胞、组织等等中体内和/或体外的功能/表达。例如，单克隆抗体可被用于染色(stain)细胞以明确表达特定蛋白质的那些。单克隆抗体也可被结合到可检测的标记和/或细胞毒素部分。本领域技术人员可容易地确定，如本文描述被生产的单克隆抗体的其他用途也是可预期的。

也提供包括从无细胞的上清液分离蛋白质所需要的试剂的试剂盒。示例性的试剂盒可包括一种或更多种进行方法所需要的溶液和/或缓冲液(比如，氯化钙的贮存液、羊脂酸和/或PEG)。试剂盒也包括不同类型的设备(比如，图18图示的装置)，这些设备对于执行本文描述的方法可为必要的或有用的。试剂盒也可包括可用于确认方法如期望地作用的阳性对照和/或阴性对照。也可包括使用说明。也提供包括目的蛋白和/或包括其的组合物的试剂盒。在一些实例中，试剂盒包括一个或更多包括本文描述的组合物或其混合物的容器，以及在体内或体外使用的说明。例如，试剂盒可包括含有本文描述的组合物的容器和体外将其引入到细胞的说明，比如通过添加组合物到大量细胞培养物或到单一细胞。对于体内使用，试剂盒可包括含有目的蛋白的组合物的容器和将其施用到动物(比如人类)以防止或治疗疾病情况的说明。本领域技术人员可理解的，其他试剂盒的实例也被提供。

范围在本文可被表达为从大约一个特定的值，和/或到大约另一个特定的值。当这样的范围被表达时，另一方面包括从一个特定的值和/或到另一特定值。类似地，当值作为约值被表达时，通过使用先行词大约(about)或约(approximately)，应该被理解特定值形成了另一个方面。应被进一步理解，每个范围的端点与另一端点的关系以及独立于另一端点都是明显的。范围(比如，90-100％)意思是包括范围本身以及范围内每个独立的值，就像每个值都单独地列出。

一定注意地，如在说明书和随附的权利要求中使用的，单数形式"一个"、"一种"、和"该(the)"包括复数的所指，除非文中明确另外指出。这样，例如，提及一个片段可包括片段的混合物以及提及药学上载体或辅药可包括两种或更多这样的载体或辅助剂的混合物。术语"大约(about)"、"约(approximately)"等等，当在一组数字值或范围之前，独立指组或范围中的每个单独值就如组或范围中的每个个体值紧跟那个术语。术语意思是值本身的是指与其精确的(exactly)、相近(close to)或相似(similar)的值。如本文使用的，受试者和宿主意思是个体。受试者可包括驯化的动物，比如猫和狗、家畜(比如，牛、马、猪、绵羊和山羊)、实验动物(比如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠)和鸟。在一方面，受试者是哺乳动物比如灵长类或人。任选的或任选地意思是随后描述的事件或情况可发生或不发生，以及描述包括事件或情况发生的例子或不发生的例子。例如，短语任选地组合物可包括组合的意思是组合物可包括不同分子的组合或可不包括组合，以使描述包括组合和不存在组合(例如，结合中的单个成员)二者。

所有本文引用的文献通过引用以其全部并入本公开。通过说明的方式，从以下的实例中可获得本公开及其很多优点的更好的理解。

实施例

实施例1

使用聚乙二醇沉淀抗体

A.使用聚乙二醇从细胞培养物上清液沉淀抗体的动力学

使用杂交瘤A、B07、B03、和C的上清液作为起始材料以及PEG2000(12.5％)、PEG4000(10.0％)、PEG6000(7.5％)、PEG20000(2.5％)之一分别测量PEG沉淀动力学；5.0、7.0、或8.5的pH值；以及15、30、60、和180分钟的反应时间被选择。在60分钟后，达到沉淀工艺的平衡，其通过平衡产率(leveling yeild)指示。观察到对于每种抗体不同的产率，这依赖于参数PEG大小/浓度和pH值。C沉淀的产率比其他三种抗体低，这可通过C的较高的溶解度解释。然而，抗体具有相似的沉淀动力学。抗体A用PEG4000(10.0％)沉淀，并显示出最高的IgG产率。因此，用PEG4000(10.0％)的A沉淀被用于大规模测试。

以小规模和大规模(分别为1.5ml和150ml)用PEG4000(10.0％)的A的动力学测试显示出大规模的沉淀的IgG的浓度略微更高。然而，小规模和大规模的反应的动力学相似。大规模反应的最佳沉淀时间被确定为60分钟。

B.PEG浓度筛选

对于在杂交瘤B03和B07的培养物上清液中的抗体，不同浓度的PEG(0％、1％、2.5％、5％、7.5％、10％、12.5％、和14％)作为沉淀剂被测试。用较高的PEG分子量在较低的PEG浓度实现抗体沉淀。例如，使用PEG2000在12.5％的浓度大约10％IgG被沉淀，而PEG20000在5％沉淀出相同的量。使用PEG4000、PEG6000和PEG20000沉淀达到大约80％。这可通过在去除包含沉淀蛋白质的悬液后，液体膜仍存在于微量滴定板的孔壁解释。残留的20％IgG被截留在该膜中。起始溶液的pH不影响这些实验中的沉淀产率。具有较低PEG浓度的沉淀示出较小的pH影响。随着增加PEG浓度，沉淀蛋白质的纯度增加，但最大产率在特定PEG浓度获得，其不能更进一步地增加(比如，纯度可随着高于特定水平的PEG浓度的增加而降低)。B03的纯度比C的纯度高大约5到10％，其可与不同上清液的组合物有关。

使用在微量滴定板中的PEG沉淀筛选和在15mL规模的实验确定不同被测试抗体(B03、B07、A和C)的最佳沉淀参数(14％PEG6000)。PEG浓度依赖于细胞培养物上清液的抗体浓度。如果上清液中抗体浓度较高，需要较低PEG浓度以及在较低抗体浓度时反之亦然。相比于较低分子量的PEG，因需要较低PEG浓度，PEG6000被选择，由于在浓度高于20％的高粘度，PEG20000不是一个选项。

C.pH优化

对于B03、B07、A和C，PEG沉淀(14％PEG6000)的最佳pH被确定。不考虑pH，在90％到95％之间的产率被获得。纯度不受pH影响。因每种抗体制剂具有不同的起始纯度，观察到产率的差异。PEG沉淀提供20到40％的纯度增加。

D.温度优化

温度对mAb沉淀的纯度和产率的影响也被研究。在15mL规模用14％(v/v)PEG6000在大约pH 7.0沉淀上清液(B03、B07和A)。对任何被测试的上清液，观察到温度对产率和纯度没有显著影响。在较高温度(35℃)，mAbs B03和B07显示略微更高的纯度但也略微更低的产率。在低温度(5℃)，观察到相反的情况(略微更高的产率但更低的纯度)。对于A，观察到温度没有影响。因此，考虑到产率和纯度和在大规模工艺的易适应性的权衡，对于所有进一步沉淀选择室温(～25℃)。在这些研究中，也评价在pH 7.0用14％(v/v)PEG6000洗涤沉淀物。与未洗涤的沉淀物相比，洗涤过的沉淀物的分析显示出更高纯度但更低产率。

E.纯化的mAbs的PEG沉淀和总蛋白质杂质溶解度曲线

纯化的mAbs(B03、B07和A)的溶解度曲线也被制作。为了计算随着PEG浓度的增加溶液中蛋白质组分的性能，使用列方程中表达的Juckes(Juckes 1971a)理论：

log S＝log S₀-βω

在该方程中，S为溶解度，S₀为常数，ω为聚合物浓度，

为微分比容(partialspecific volume)，rr为排出的分子半径以及rs为聚合物的横截(cross sectional)半径。因B03和B07指相同抗体，尽管不同发酵，B03和B07的溶解度曲线应一致。虽然B03和B07的溶解度曲线的拟合显示不同斜率(B03：-0.3767；B07：-0.3331)和截距(B03：2.4643；B07：1.9713)，置信区间(95％)是重叠的，这意味着曲线间存在相似性。溶解度曲线的截距提供没有沉淀剂存在时的mAb的溶解度。对于B07和B03，溶解度被确定在80和500mg/mL之间。对于A，较低的在3.2和32mg/mL之间的S0被确定。蛋白质的溶解度依赖于微分比容、分子的半径和沉淀剂的性质(Arakawa和Timasheff 1985)。溶解度曲线的斜率与mAb和PEG的流体力学相互作用相关，并且影响PEG沉淀浓度(Juckes 1971a)。根据PEG沉淀机理(体积排阻效应(Arakawa和Timasheff 1985；Lee和Lee 1981；Lee和Lee 1979))，产率不单依赖于添加的PEG的量也依赖于在上清液中mAb的浓度。例如，使用14％(v/v)PEG6000沉淀mAb B07时，只有1.8μg/mL的mAb仍存在于可溶组分中。因此，对于浓度1mg/ml的上清液，99.8％的产率是理论上可能的。如果上清液浓度为10mg/mL，沉淀将在大概3％(v/v)PEG6000以及在大概9％(v/v)PEG6000开始，可达到99.9％的理论产率。

纯化的mAb B07和B03的溶解度曲线以及在蛋白A纯化的细胞培养物上清液的流通(flow-through)中发现的总蛋白质杂质的溶解度曲线也被比较并发现为是相当的。上清液的蛋白质杂质显示不同的溶解度(比如，因其使用的发酵策略的不同)。斜率的平滑指示PEG对蛋白质杂质的溶解度几乎没有影响(比如，不同于mAb溶解度，其斜率显著更陡)。在另一方面，在0％(v/v)PEG6000的溶解度，杂质的比mAbs的更低。这些测量的发现是其他新颖的连续的沉淀技术(羊脂酸沉淀)的实施原因。新颖的纯化步骤必须分离杂质组分，其在PEG沉淀期间也用mAbs沉淀。

F.纯化的mAbs在不同pH值的PEG沉淀溶解度曲线

B03、B07和A的溶解度曲线在从5.0到9.0的pH值(对于A从pH4.5到9.0)被测量。确定用14％PEG6000值的沉淀导致log S为-2(0.01mg/mL未沉淀)。这些发现独立于pH。唯一例外是在低范围的pH值。对于B03和B07，该pH 5.0和5.5，以及对于A为该pH4.5、5.0、5.5和9.0。mAbs的不同的原因是不同的pI值。然而，PEG浓度的增加引起log S的降低，以及因此产率的增加。那意味着可在极端宽的pH范围进行mAb沉淀，并且仅需要PEG浓度的增加(达到25％)。

G.从CHO细胞上清液的PEG沉淀

用五种CHO细胞培养物上清液、不同PEG大小(2000-20,000)、浓度(0-14％)、以及不同pH值(5.0-8.5)，进行PEG沉淀的自动孔板筛选。产率和纯度用分析级蛋白A的CIM盘(BIA)确定，并且显示出在pH 7.0用14％PEG6000最佳。数据呈现在图.1中。

实施例2

CaCl₂/PEG结合沉淀

用聚乙二醇(PEG)沉淀的沉淀机理为体积排阻反应。PEG结合水分子，使得围绕蛋白质的水合层被消耗并且蛋白质聚集(agglomerate)。PEG可被用于沉淀大蛋白(比如，如上所示的mAbs)以及DNA。为了分离DNA，可进行CaCl₂共沉淀。CaCl₂和PO₄ ³⁺引起不同种类的不溶磷酸钙沉淀物的形成，其共沉淀大的且带负电的分子。CaCl₂/PEG共沉淀研究的参数如表1所示。

表1

如其中所示，该共沉淀的产率在85-90％的范围中；SEC显示在蛋白A层析和CaCl₂/PEG纯化之间的相当的HMWI和HCP的降低；CaCl₂/PEG沉淀的HCP ELISA在3倍到13倍之间的减少以及必须为30到900(蛋白A)之间。通过SEC和HCP ELISA的纯度分析中的任何不一致可由HCP ELISA中的Ca²⁺的干扰引起。与DS比较，蛋白A(protA)和CaCl₂/PEG纯化显示在2DDIGE的印迹(spot)的相等的降低(图2和表2)。与CaCl2/PEG沉淀相比，发现蛋白A层析纯化降低更多的HCP。

表2

实施例3

改进的HCP降低的羊脂酸(CA)沉淀

CA沉淀的主要改进为使用乙酸钠稳定pH。为了达到缓冲能力，根据相关文献(Mohanty和Elazhary 1989；Raweerith和Ratanabanangkoon 2003)计算乙酸钠的量(大约50mM)。因此，在CA沉淀在溶液前，混合浓缩的缓冲溶液与CHO细胞培养物上清液以获得浓度50mM的乙酸钠(pH调节略微增加CH₃COONa浓度)。缓冲的上清液用乙酸调节到pH 4.0以及随后分为4个相似的部分。每个部分用氢氧化钠调节到特定pH(4.5、5.0、5.5、和6.0)。为检测工艺过程期间不同的温度，这对两个mAbs(B03和B07)上进行以及进行了三次。第一个工艺调整(alignment)被执行、在室温离心并且储存，第二个工艺调整被执行以及在室温离心和在4℃储存，以及第三个工艺调整在室温进行以及在4℃储存和离心(图3)。

来自pH/缓冲测试的样品被收集以及通过使用SEC和Bradford测定法被测量。不同温度的工艺调整的比较(不同pH值(4.5、5.0、5.5和6.0))显示产率没有差异。CA沉淀导致10到20％的产率损失。pH调节后，产率降低大约20到30％。由于这个原因，pH调节上的改进是必要的。最高产率在最低pH(pH 4.5)被达到。原因可为在低pH或者甚至更低pH，较低的盐浓度。因此为验证该推定，需要精确的pH调节以得到较低盐浓度。为了测定产率，比较从细胞培养物上清液和样品的尺寸排阻层析的IgG面积。改变产率测定方法的原因是为大概4.5的样品的pH。对于得到可重复的数据，该值与分析亲和层析的洗脱pH(pH 3)太接近。

表3

在不同pH值CA沉淀后mAb产率(通过SEC的mAb浓度)

在表4中，总蛋白质测量的数据被列出。工艺调整比较显示在蛋白质浓度没有显著不同。这意味着温度改变在对工艺没有影响。可以明显观察到的是总蛋白质在pH调节后降低，在pH4.5的降低最高。CA沉淀后总蛋白质的降低几乎保持不变，总蛋白质产率在60和70％之间。最高产率和总蛋白质的降低发生在pH 4.5。具有该pH的样品被选择进一步测量。

表4

在不同pH值CA沉淀后总蛋白质的数据(Bradford)

具有最高mAb产率和最低总蛋白质浓度(在pH4.5)的B03和B07的样品的尺寸排阻层析谱的比较显示在pH调节后高分子量和低分子量杂质的略微降低(图4A-B)。在CA沉淀后，该降低增加但主要杂质没有被去除。

样品也通过HCP-ELISA比较。表5显示在pH调节和CA沉淀后的ELISA数据。宿主细胞的降低(HCP)，在pH调节后大概降低2倍，以及在CA沉淀后大概降低10倍以上。CA沉淀的HCP的降低与PEG沉淀相似(Jungbauer等，2011)，除了SEC层析谱显示在PEG沉淀后杂质降低。原因可为不同方法分离不同蛋白质。因此PEG和CA沉淀的结合必需被评价。

表5

在pH4.5CA沉淀样品的HCP-ELISA数据(Cygnus)

所有mAbs(B03和B07)的"pH 4.5样品"的DNA含量也被测定(表6)。pH调节显示从3到10倍的DNA降低。CA沉淀后，DNA含量低于检测限。该数据与SEC层析谱是相当的。经CA沉淀，高分子量杂质的发生明显的降低。

表6

在pH4.5CA沉淀样品的DNA数据(Picogreen)

CA沉淀的参数筛选

为最佳化羊脂酸沉淀，进行了盐浓度、混合速度和反应时间的筛选。羊脂酸浓度(1％CA)和pH值(pH 5.5)保持不变。图5A和5B说明NaAc盐浓度对B03和B07产率的影响。较高的盐浓度引起产率的降低。这可能因为在较高盐浓度引起的pH改变。如之前所示(Jungbauer等，2011)，产率随着降低的pH降低。图5A和5B的比较指出在CA沉淀前pH调节的影响(从大约pH 7到5.5)。图中的产率数据以与细胞培养物上清液浓度的关系被设定(图5A)和以与pH调节的细胞培养物上清液的关系被设定(图5B)。产率的比较显示在所有盐浓度，对于mAbs(B03和B07)，差异大概都为10％。

CA沉淀期间最佳混合速度也被研究。用50mM乙酸钠和1％CA做沉淀剂，在pH5.5进行沉淀60分钟。在旋转器上以5、10、20、30和40rpm完成混合速度测试。与细胞培养物上清液和pH调节的细胞培养物上清液比较，该设置以样品的mAbs(B03、B07)都实现。如上所述，pH调节引起产率的显著降低(大约10％)。进一步地，混合速度测试显示产率随着增加的沉淀时间而降低。以5rpm的混合速度可达到最高产率(注意宿主细胞蛋白(HCP)数据未被收集)。在较高混合速度的产率损失可源于对蛋白质上增加的机械压力致，其引起蛋白质相从水相到有机相(羊脂酸)的转移，以及因为有机环境随后沉淀和变性。另一原因可为羊脂酸和带负电的蛋白质/IgG直接作用。理想的混合速度可为5或10和30rpm之间，以提供在低产率损失下的合适的HCP降低。

CA沉淀的反应时间也被研究。在pH5.5，以50mM乙酸钠和1％CA作为沉淀剂，以恒定混合速度(40rpm(旋转器))，从B03和B07培养物上清液(包括pH调节的培养物上清液)沉淀5、15、30、45和60分钟。如以上所述，pH调节导致IgG的损失(大约10％)。发现增加反应时间降低产率。5分钟的反应时间可达到最高的产率(注意宿主细胞蛋白(HCP)数据未被收集)。在较长反应时间的产率损失可涉及增加的对蛋白质的机械压力，其引起蛋白质相从水相到有机相(羊脂酸)的转移，之后由于有机环境蛋白质(IgG也)沉淀，或羊脂酸与带负电的蛋白质直接作用也可为蛋白质沉淀和变性的原因。理想的反应时间最可能在15和45分钟之间以提供在低产率损失下的合适的HCP降低。

实施例3

改进的HCP降低的PEG和CA沉淀的结合

之后室温工艺调整的CA沉淀上清液样品被用于以14％PEG6000的沉淀以得到CA/PEG沉淀结合的估计值。样品如之前描述的PEG沉淀那样被处理。CA沉淀调整接着PEG沉淀显示在图6。用SEC(BIO-SEC3，Agilent)测量CA/PEG沉淀样品的产率。纯度用HCP-ELISA确定。mAb(B03和B07)的数据都在图7A和7B中显示。CA和PEG沉淀的结合对于mAbs都显示相似的结果。在CA沉淀后，对于所有pH值，产率在60和80％之间以及HCP降低在大概10倍。对于pH5.0到6.0的样品，随后的PEG沉淀的产率下降到40到50％。在pH4.5，获得大约10％产率。在pH5.0，PEG沉淀后，HCP浓度以200-到400-倍HCP降低开始，以及在pH6.0大约100倍HCP降低。这样，在pH5.0观察到最大的HCP降低。最高产率，对于B03，在pH 6.0观察到，以及对于B07在pH5.0和6.0之间。然而，产率仅为40％。为改进产率，较高的PEG浓度可被选择或在PEG沉淀前pH调节到较高。

为PEG沉淀的产率改进，进行PEG浓度筛选。CA沉淀上清液(比如，羊脂酸沉淀后的上清液)的样品用三种不同PEG浓度(14、18和21％)沉淀。以工艺步骤调整1和3(在室温和4℃)并且对于pH值4.5、5.0、5.5和6.0，用mAbs(B03和B07)都进行了沉淀。观察到通过类似的沉淀参数，对于两个mAbs产率都增加。不同的工艺步骤调整的比较显示温度对产率没有影响。与CA沉淀后的起始值比较，增加的PEG浓度导致较高的产率。较高pH值也引起产率增加。PEG沉淀数据和这些pH值的比较显示出随着PEG浓度增加pH值的增加，和因此产率的增加。因此，在CA沉淀后，提高pH到大约pH7.0和PEG浓度的提高被期待改进产率。新结果与PEG沉淀的以往经验是相反的，以往经验是增加PEG浓度压制pH影响。在低pH，增加的PEG浓度的低产率可以引导回CA的存在。

图8A和8B中所示的条形图用PEG沉淀后对于SN测量的的pH标记。对于PEG沉淀，pH值对于以14％PEG的沉淀以较低pH开始，以及对于以21％PEG的沉淀以较高pH结束。以18％的PEG沉淀的pH在最高和最低pH值之间。

之前的最佳pH(4.5到6.0)的筛选被执行，并且显示在PEG沉淀后高的宿主细胞蛋白(HCP)的降低但低的产率。CA沉淀在3个pH值(4.5、5.0和5.5)进行以分离HMWI和HCP沉淀物，接着调节pH到大约7(6.9和7.1之间)。与之前的数据比较，pH变化引起PEG沉淀(14％PEG6000)后产率增加。然而，也观察到HCP量的略微增加。以两个mAbs(B03和B07)进行所有pH值测试；数据在图9A和9B中呈现。如其中所示，CA沉淀后最高的产率在pH4.5达到。最高的HCP降低和总产率对于mAb B03在pH5.0以及对于B07在pH4.5。依据该数据，需要为CA沉淀后产率的进一步改进进行初始缓冲夜浓度的筛选和PEG浓度的增加以增加CA/PEG沉淀后产率。

为进一步改进CA/PEG沉淀，进行乙酸钠缓冲液筛选。CA沉淀在pH 5.5，1％CA，在40rpm(旋转器)，进行60分钟被完成。只有乙酸钠缓冲液浓度变化(5、10、20、40、50、100、125和200mM乙酸钠)。在PEG沉淀前，CA相和沉淀物被从上清液分离。随后，上清液的pH值被调节到大约pH 7以及PEG6000被加入到14％的最终浓度(v/v)。图10A和10B分别显示在CA和CA/PEG沉淀后，在不同盐浓度，B03和B07的产率和HCP降低数据。在低盐浓度(5mM乙酸钠)，达到最高产率和HCP降低。这样，pH被盐浓度影响并且其本身影响产率。增加的PEG浓度可以实现PEG沉淀后产率的进一步增加。然而，缓冲体系从乙酸钠到柠檬酸钠(缓冲液在相同范围)的改变也可改进mAb的纯度和产率。因此，进行以柠檬酸钠的类似的缓冲液和盐浓度的筛选。

用乙酸钠pH筛选相同的参数进行B03(图11A)和B07(图11B)的柠檬酸钠pH筛选。与之前研究的唯一区别是柠檬酸钠替换乙酸钠。柠檬酸盐缓冲液数据和乙酸盐缓冲液数据的比较显示PEG沉淀后用乙酸钠缓冲液增加产率和纯度。pH值对于缓冲体系的影响都是相似的(pH 4.5沉淀最适)。

与乙酸钠盐浓度筛选相同的方式进行柠檬酸钠盐浓度筛选(图.12A和12B)。数据显示CA后产率降低但PEG沉淀后产率和纯度提高。尤其在较高盐浓度(100到200mM)，这样的值出现。其原因可引导回盐-蛋白质或盐-沉淀剂相互作用。这些发现与乙酸钠数据相对，乙酸钠数据中，最高产率在低盐浓度达到，引起低pH以及因而较高的产率。

基于这些结果，进行改进的测试的系列，其对于mAb沉淀使用以100和200mM柠檬酸钠作为缓冲体系的B03和B07细胞培养物上清液以及三个不同PEG浓度(14％、18％和21％[v/v])。如之前的筛选，参数比如混合速度(40rpm)、混合时间(60min)和反应温度被应用。pH在CA沉淀前，被调节到pH 4.5以及在PEG沉淀前被调节到大约7(pH 6.90到7.10)。B03的数据在图13A中呈现。在100mM柠檬酸钠，观察到总产率随着PEG浓度的增加而增加但纯度降低。在200mM柠檬酸钠，产率和纯度都随着PEG浓度增加而降低。该对照方式可由在改变的盐浓度下由盐-蛋白质或盐-沉淀剂的相互作用的改变引起。对于B03，使用100mM柠檬酸钠和21％PEG达到最高的总产率以及HCP降低。B07的数据在图13B呈现。在l00mM柠檬酸钠，随着增加的PEG浓度，没有显著的产率和纯度变化。在200mM柠檬酸钠，提高的PEG浓度未出现增加产率；然而观察到在较高的PEG浓度纯度的降低。对于B07的最高产率被确定由l00mM柠檬酸钠和21％PEG得到，但最高的HCP降低用200mM HCP和14％PEG达到。该数据的比较显示较差的B07的产率和纯度，这可由在细胞培养物上清液的较低的mAb浓度(B03＝2.6mg/mL；B07＝1mg/mL)导致。基于这些发现，为进一步筛选，选择参数100mM柠檬酸钠和21％PEG。

为了进一步纯度改进，完成了CA/PEG沉淀的CA浓度筛选。因此，参数混合速度、混合时间、缓冲体系、盐浓度、pH调节和PEG浓度由先前的筛选发现假定(旋转器在40rpm；反应时间60分钟；l00mM柠檬酸钠；用氢氧化钠/或柠檬酸调节pH；CA沉淀前4.5、PEG沉淀前6.9到7.1)。CA浓度范围在0.5到10％(0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0％)。对于mAbs，图14A和14B都显示了CA浓度筛选的产率和纯度。所有产率数据的比较显示CA浓度没有影响。例外是在1％CA的B07样品的总产率数据，其两倍高于其他，最可能因为细胞培养物上清液的起始浓度(其用蛋白A纯化的mAb浓缩到2.5mg/mL(B07的原始浓度＝1mg/mL))。mAb的纯度数据都指示CA浓度没有显著影响。用10％CA的B03的沉淀显示较高的HCP降低，其是微不足道(或离群分析)的，因为这样高的CA浓度难以处理。因为涉及在低pH的样品测量的原始问题，图14A和14B的产率数据用SEC确定。因为该问题被如以上所述解决，通过分析亲和层析可进行产率测量(图15A和15B)。这些数据的比较显示类似的纯度值。然而，测量的产率数据(分析亲和层析，蛋白A)大约高20％。这些发现引向所有之前测量的产率值(用SEC)可能太低(Jungbauer等，2010a)的假定。

分析了来自CA浓度筛选研究的样品(从图16A和16B中对于沉淀1％的CA)的产率和纯度。对于细胞培养物上清液，mAb的浓度都在大概2.5mg/mL(B03＝2.65mg/mL和B07＝2.59mg/mL)。产率和纯度数据在表7和8呈现。

表7

通过SEC TSK3000SWXL,Tosho,280nm(BOKU))和SEC TSK3000SWXL,Tosho,210nm(Nov))测量的来自B03的CA/PEG沉淀的产率(蛋白A亲和层析)和纯度的数据。

B03	PEG(BOKU)(％)	PEG(Nov)(％)
			单体纯度(％)	97.9	96.7
聚集(％)	2.1	3.3
			产率(％)	81	81
HCP(ppm)	3711	4404
			HCP降低(x，-倍)	72	65

表8

通过SEC TSK3000SWXL,Tosho,280nm(BOKU))和SEC TSK3000SWXL,Tosho,210nm(Nov))测量的来自B07的CA/PEG沉淀的产率(蛋白A亲和层析)和纯度的数据。

B07	PEG(BOKU)(％)	PEG(Nov)(％)
			单体纯度(％)	98.9	95.5
聚集(％)	1.1	4.5
			产率(％)	84	84
HCP(ppm)	3038	1019
			HCP降低(x，-倍)	102	107

虽然，聚集体(高分子重量杂质＝HMWI)的含量使用Nov系统测量出是较高的，但是这些比较显示所有测量的参数是相当的。这可能由于测定使用的不同波长(280nm对210nm)或其他原因。mAb的回收为高于80％以及HCP(宿主细胞蛋白)降低大约100倍。然而,如图16A和16B所示，对于mAbs都进行了细胞培养物上清液和CA/PEG纯化的mAb的尺寸排阻层析谱比较。这些工艺产生的HMWI(聚集物)和LMWI(低分子重量杂质)的显著降低在其中是明显的。

对于最佳盐种类(乙酸盐或柠檬酸盐)、浓度(5-200mM)和pH值(4.5、5.0、5.5)的CA/PEG沉淀的筛选，以沉淀步骤后的产率和HCP测定引向选择l00mM柠檬酸钠、pH 4.5作为最佳沉淀。图17A-F和表9呈现对于两个示例性的单克隆抗体的优化的CA/PEG沉淀的产率、SEC、HCP和HMWI数据。

表9

概述

开发了CaCl₂/PEG和CA/PEG两个沉淀结合。CaCl₂沉淀用于HMWI比如dsDNA和聚集物的分离。CA沉淀被用于HMWI和HCP降低以及PEG沉淀从LMWI分离mAbs。用5种不同CHO细胞培养物上清液进行CaCl₂/PEG沉淀测试并且显示数据是与蛋白A层析纯化大致相当的。CA/PEG沉淀引起在80到85％之间的产率，大约3000ppm HCP和HMWI低于2％。该沉淀与蛋白A层析具有高度竞争性(highly competitive)。

实施例5

羊脂酸沉淀、PEG沉淀和CaCl₂沉淀可被结合进入单一工艺。在示例性实例中，澄清的细胞培养物上清液首先使用100mM柠檬酸钠(NaCit)、pH 4.5、1％羊脂酸沉淀，以及产生的沉淀物被去除以提供二级上清液。抗体之后使用21％PEG在pH 7被从二级上清液中沉淀和分离以及再悬浮于是适当的缓冲液。该制剂之后使用氯化钙(250mM CaCl₂，pH 8.5)处理以沉淀进一步杂质(比如，DNA)。沉淀出的沉淀杂质之后被去除以提供包括抗体的溶液。该溶液之后再悬浮于适当的缓冲液中，并且其中的抗体在25％(v/v)乙醇中、pH 6.5、-10℃沉淀(比如，洗涤)。该工艺(图18A和B)的结果总结在表10：

表10

产率(％)	HCP(ppm)	HCP(倍)	HMWI(％)	dsDNA(ng/mL)
					100	97.608	0	2,931	6.374
93	27.357	4	2,134	1.363
					86	12.158	8	1,343	258
77	1968	29	0.000	#NV
					69	277	253	0.000	94

在一些实例中，超滤、膜渗滤和/或离子交换层析可作为另外的步骤被加入以进一步纯化抗体。

实施例6

mAbs的连续生产

如以上所述，沉淀方法比如氯化钙(CaCl₂)、聚乙二醇(PEG)和羊脂酸(CA)沉淀被筛选和结合用于达到至少等于传统的第一捕获步骤的产率和纯度。最终的工艺是两个沉淀方法的结合，其对于蛋白A亲和层析具有竞争性以及可在管状反应器被连续驱动。在开发该工艺之后，一个实验规模中试站被设计和建造(图19)。该中试站由两步沉淀反应器组成，体积约2升以及流速20ml/min；20m硅管(5mm直径)为沉淀区域(precipitation area)；磁阀和有反冲洗模式(black flush mode)的过滤器用于沉淀分离；其中类似体系控制具有手动切换过滤器状态的可能性和/或两个沉淀线都可独立地运行。然而，为替换整个mAb下游处理，需要进行进一步纯化/补齐(polishing)步骤。因此，测试另外的沉淀方法(冷乙醇沉淀，CEP)以及进行所有方法中的一些结合。最终地，12个沉淀调整中的2个显示卓越的好产率(约70％)和纯度(约280ppm HCP和无聚集物)的数据。两个工艺都没有柱，仅由4个(而非7或8个)纯化步骤组成，其可被连续运行。该新颖的沉淀工艺可被连续驱动以替换至少第一捕获步骤(蛋白A亲和层析)，但最可能替换mAb纯化工艺技术的整体。

虽然本申请就优选的实例描述，对于那些本领域技术人员应理解的，变化和改进将发生。因此，意图随附的权利要求覆盖所要求保护的本发明的范围内的所有的这样的等同的变化。

Claims

1.一种从存在于包括抗体的细胞培养物上清液中的核酸和其他宿主细胞蛋白分离抗体的方法，其包括：

(a) 将所述细胞培养物上清液与第一沉淀剂结合以去除沉淀的蛋白质和/或其他组分来生产二级细胞培养物上清液，所述第一沉淀剂是氯化钙和/或羊脂酸，其中羊脂酸与盐一起使用，并且所述盐选自乙酸钠或柠檬酸钠；

(b) 引入聚乙二醇（PEG）至所述二级细胞培养物上清液以从上所述二级细胞培养物上清液沉淀所述抗体，

其中，所述方法不包括任何层析步骤。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述PEG选自PEG2000、PEG4000或PEG6000。

3.如权利要求1所述的方法，其中以5%至30%的量将所述PEG引入至所述二级细胞培养物上清液。

4.如权利要求1所述的方法，其中以10%至21%的量将所述PEG引入至所述二级细胞培养物上清液。

5.如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)中的pH为4至9。

6.如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)中的pH为5.0至8.5。

7. 如权利要求1 所述的方法，其中所述第一沉淀剂是羊脂酸。

8. 如权利要求7所述的方法，其中羊脂酸以从0.1 v/v%到10v/v %的量存在于步骤(a)中。

9. 如权利要求7所述的方法，其中羊脂酸以1 v/v%的量存在于步骤(a)中。

10.如权利要求7所述的方法，其中步骤(a)中的pH为4.0至6.0。

11.如权利要求7所述的方法，其中步骤(a)中的pH为4.5至5.5。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述第一沉淀剂是氯化钙。

13.如权利要求7至11中任一项所述的方法，其进一步包括：

(c) 将沉淀的抗体重悬并随后以氯化钙沉淀杂质。

14.如权利要求13所述的方法，其中，

在步骤(c)中的所述氯化钙的浓度为10 mM至400mM。

15.如权利要求13所述的方法，其中步骤(c)中的pH为6至9。

16.如权利要求1所述的方法，其包括随后使用冷乙醇沉淀。

17.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述抗体为免疫球蛋白G。

18.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其以连续方式实施。