KR20150118103A - 단백질 정제 방법 - Google Patents

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KR20150118103A
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에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치
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Abstract

단백질 제제로부터 원하는 단백질을 정제하는 방법은 상기 단백질 제제를 선택적으로 과포화된 알란토인의 존재 하에 용해성 유기 다가 이온들, 고정화된 유기 다가 이온들, 또는 양자로 처리하여 조절하는 것을 포함하며, 이에 따라 적어도 90%의 크로마틴이 제거되며, 이어서 (1) 원하는 단백질을 비-단백질-침전 염들의 생리학적 농도보다 큰 농도의 존재 하에 비-이온성 유기 고분자로 침전시켜 원하는 단백질의 침전물을 제공하고; 또는 (2) 원하는 단백질을 생리학적 농도보다 큰 비-침전 염들의 부존재 하에 비이온성 유기 고분자로 침전시켜 침전물을 제공하고, 이어서 침전물을 생리학적 농도보다 큰 비-단백질-침전 염들의 존재 하에 비이온성 유기 고분자로 세척하는 것을 포함한다.

Description

단백질 정제 방법{PROTEIN PURIFICATION METHODS}
본 발명은 단백질 정제 방법에 관한 것이다. 본 출원은 미국 임시 출원 제61/761,646호(출원일: 2013년 2월 6일), 제61/764,966호(출원일: 2013년 2월 14일), 제61/831,099호(출원일: 2013년 6월 4일), 제61/859,772호(출원일 2013년 7월 29일), 및 제61/907,877호(출원일: 2013년 11월 22일)에 대해 우선권을 주장하며, 이들 각각은 본 출원에 참조로서 병합된다.
재조합 단백질의 정제는 일반적으로 세포들 및 잔해들이 제거되어 잔류하는 상청액이 세포들 및 잔해들의 존재에 의해 방해되거나 비효율화될 수 있는 방법들에 의해 처리될 수 있는 정화 단계로 시작된다. 이들의 제거는 일반적으로 원심분리 및 정밀여과와 같은 물리적 방법들을 포함한다. 이는 때로는 음이온 교환 성능을 갖는 멤브레인 또는 뎁스(depth) 필터의 사용을 포함하거나, 항체-함유 수확물에 직접 음이온 교환 고분자 또는 입자들의 첨가를 포함한다(Gagnon, P., Purification Tools for Monoclonal Antibodies, Validated Biosystems, Tucson, 1996; Kuczewski, M,. et al, Biopharm Int. 23 (3) (2010) 20-25; Kuczewski, M., et al, Biotechnol. J., 6 (2011) 56-65). 최근 Gan et al(J. Chromatography A 191 (2013) 33-40)에서 다가 유기 이온의 수용 및 불용성 형태로 크로마틴 이화생성물(catabolites)의 표적화된 제거가 특히 세포 배양 수확물의 효과적인 조절을 뒷받침할 수 있음이 보고되었다. 물리적인 정화 방법은 일반적으로 유의한 크로마틴 제거를 획득하지 못한다. 상기 수확물에 음이온 교환 입자들을 첨가하는 것은 일반적으로 DNA의 약 반을 제거한다. Gan et al (supra)에서 기술된 방법들의 일부는 크로마틴의 99%를 제거하고, 크로마틴-유도(directed) 정화 방법으로 정확히 지칭될 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 사용한 침전에 의한 단백질 정제가 개시되어 왔다. 이는 일반적으로 PEG가 수용성 단백질 제제 내에 용해되어 단백질이 용액으로부터 침전되는 것을 야기하는 수상(aqueous phase) 기술로 수행된다. PEG의 사이즈 및 농도는 pH와 같이 공지된 공정 변수이다(Gagnon1996 supra; D. Atha, K., et al, J. Biol. Chem., 256 (1981) 12108-12117; 미국 특허출원 공개공보 제2008/0214795호, 이들은 본 출원에 참조로서 병합된다). 동작 pH가 항체의 등전점에 근접할수록, 침전을 위해 요구되는 PEG의 농도는 낮아진다. 소듐 클로라이드(NaCl)와 같은 비- 단백질-침전 염들의 농도는 선택성에 거의 효과가 없지만(Atha et al supra), 상기의 기술은 1.7M 까지의 NaCl의 존재 하에 수행되어왔다(10%, Gervais et al., U.S. Patent Application Publication No. 2010/0204455). 또한, PEG가 상승된 NaCl 농도와 결합되었을 때, PEG-중재 입체 배제 크로마토그래피로 보다 높은 IgG 회수 및 낮은 레벨의 오염물을 획득할 수 있음이 밝혀져 왔으며, 추가적으로 이는 대체로 pH의 영향을 지연하는 것으로 밝혀졌다(P. Gagnon et al, J. Chromatogr. A 1324 (2014) 171-180). PEG를 단백질-침전 염 소듐 포스페이트와 결합하는 것이 개시되어왔다(Gervais, supra; US Patent Nos. 4,379,086 and 4,515,776).
침전이 재용해된 후 잔여 PEG를 제거하는 것이 상기의 기술의 주된 도전이다. Kuczewski et al supra 에서는 PEG가 흐르는 동안 IgG가 양이온 교환 칼럼에 결합하는 조건 하에서 양이온 교환 크로마토그래피를 수행함으로써 이를 제거하였다. PEG 제거는 이것이 침전시키는데 사용되는 단백질과, 유체역학 반경 또는 지름으로 측정된 동일 범위의 사이즈를 차지한다는 사실에 의해 또한 복잡해진다. 이는 PEG 제거를 위한 크기 배제 크로마토그래피, 투석, 및 다이아필트레이션(diafiltration)의 표준 방법들을 곤란하게 한다. IgG 모노클로날 항체들에 널리 실행되는, 플로우-쓰루(flow-through) 모드에서의 음이온 교환 크로마토그래피는 PEG가 항체들과 함께 흐르기 때문에 역시 부적절하다.
본 발명은 단백질 정제 방법을 제공한다.
일부 측면들에 있어서, 본 출원에 개시된 실시예들은 단백질 제제로부터 원하는 단백질 정제를 위한 방법에 관한 것이며, 선택적으로 과포화된 알란토인(allantoin)의 존재 하에서, 용해성 유기 다가 이온, 고정화된 유기 다가 이온 또는 양자 모두로 처리를 통해 상기 단백질 제제를 조절(conditioning)하여 적어도 90%의 크로마틴을 제거하고, 이어서 (1) 상기 원하는 단백질을 생리학적 농도 이상의 비-단백질-침전 염들의 존재 하에 비-이온성 유기 고분자로 침전시켜 원하는 단백질의 침전물을 제공하고, 또는 (2) 생리학적 농도보다 큰 비-침전 염들의 부존재하에서 비이온성 유기 고분자로 상기 원하는 단백질을 침전시켜 침전물을 제공하고 이어서 상기 침전물을 생리학적 농도보다 큰 비-단백질-침전 염들의 존재하에서 비이온성 유기 고분자로 상기 침전물을 세척하는 것을 포함하며, 상기 침전 또는 세척 단계는 단백질-침전 염의 실질적인 부존재하에서 선택적으로 수행되고, 선택적으로 상기 원하는 단백질의 등전점의 0.5 pH 단위 내의 값으로 상기 원하는 단백질의 pH를 조절함이 없이 수행되고, 선택적으로 비-이온성 유기 고분자의 부존재하에서 단백질-침전 염으로 상기 침전물을 세척하며, 상기 침전 염은 원하는 단백질을 침전된 상태로 유지시킬 수 있는 충분한 농도로 존재한다.
90% 이상의 크로마틴 및 크로마틴 이화생성물이 제거되었으나, 항체는 용해되어 잔류하는 조건 하에서 용해성 유기 다가 이온들 및/또는 고체 표면 상에 고정화된 유기 다가 이온들에 노출에 의한 항체-함유 단백질 제제의 조절(conditioning)이 예측하지 못하게 높은 정도로 PEG 침전에 의한 분리능을 향상시킴이 밝혀져왔다. 예를 들면, 상기 조절 단계는 30-70% 인자로 호스트 단백질로부터 오염을 제거하며, 이는 놀랍게도 특히, 침전 포뮬러(formula)가 또한 과량의 비-침전 염들을 포함하는 경우, 후속 PEG 침전 단계의 능력을 증가시켜 추가적으로 400-500% 이상으로 호스트 단백질 오염을 감소시킨다. 이는 크로마틴-유도 정화 방법이 단지 총 오염 로드를 감소시킴에 의해 후속 정제를 촉진하는 것이 아니라, 후속 정제 단계를 방해하는 오염물들을 제거함에 의한 것이라는 중요한 포인트를 부각시킨다. 또한, 침전 동안 정상 임상 레벨보다 높은 농도의 염들의 존재가 동작 pH를 원하는 단백질의 등전점까지 또는 근접하게 조절할 필요성을 극적으로 감소시키고, 일부 경우에 있어서는 실제로 제거함이 관찰되었다. 침전된 단백질을 유지하기에 적절한, 그러나 PEG는 없는 농도에서 단백질-침전 염을 포함하는 최종 세척으로 침전된 원하는 단백질을 세척하는 것은 상기 원하는 단백질을 재-용해하기 전에 PEG를 제거하는 추가적인 이점을 제공한다. 이러한 특징들의 다양한 조합은 조절 단계 및 침전 단계의 조합이 호스트 세포 오염이 생친화 크로마토그래피와 같은 고성능 방법들에 의해 획득되는 레벨 아래로 현저하게 감소시키는 것을 가능케한다. 이어서, 이는 개시된 방법들이 항체의 재용해 후에 단지 단일의 추가 분리 단계로 정제된 원하는 단백질의 인 비보 용도를 지지하기에 충분한 정제 레벨 획득을 가능케한다. 실험 데이터에 의하면, 집적된 방법은 IgG 및 IgM 항체들에 광범위하게 적용가능하다. 효과적으로 IgM을 정제하는 이의 능력은 비-항체 단백질 정제에도 적용될 수 있음을 제시한다. 본 출원에 개시된 방법 측면들은 국제 특허 출원 WO 2013180650호, WO 2013180649호, 및 WO 2013180655호들에 개시된 방법들과 결합되어 사용되며, 이들 문헌은 본 출원에 전체로서 참조로 병합된다.
일 이상의 실시예들에 있어서, 단백질 제제를 유기 다가 이온들로 조절하는 것은 샘플을 양전하성 유기 첨가물에 접촉시키는 것을 포함한다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 양전하성 유기 첨가물은 에타크리딘(ethacridine), 메틸렌 블루(methylene blue), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide)로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 하나를 포함한다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 이러한 종들 또는 종들의 조합의 집합 농도는 0.001 내지 1%, 또는 0.01 내지 0.1%, 또는 0.02 내지 0.05% 범위이다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 제제의 pH는 원하는 단백질의 실질적인 회수 감소를 야기하지 않는 알칼리성 값까지 조절될 수 있다. 상기 원하는 단백질이 IgG 모노클로날 항체인 일 실시예에 있어서, pH는 항체 등전점보다 반 pH 단위 아래 값으로 조절되거나, 실험 결과들이 항체 회수가 용인가능하나, 이러한 조절들이 불필요함을 제시하는 경우 더 높아질 수 있다. 임의의 pH 조절이 상승된 염 농도의 존재 하에서 수행되는 한, pH 값은 단백질 등전점의 약 0.5 내지 약 1.0 pH 단위 내이면 충분하며, 또는 약 1.5 pH 단위 내, 또는 약 2.0 pH 단위 내이다.
일 이상의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 단백질 제제를 유기 다가 이온으로 조절하는 것은 샘플을 양전하성 유기 첨가물에 접촉시키는 것을 포함한다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 양전하성 유기 첨가물은 헵탄산, 옥탄산, 옥텐산, 노난산, 노넨산, 데칸산, 메틸 블루로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 이러한 종들 또는 종들의 조합의 총 농도는 0.001 내지 10%, 또는 0.01 내지 1%, 또는 0.1 내지 0.5% 범위이다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 제제의 pH는 상기 원하는 단백질의 회수 감소를 실질적으로 야기하지 않는 산성 값까지 조절될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 제제의 pH는 3.5 내지 6.5, 4.0 내지 6.0, 4.5 내지 5.5, 5.0 내지 5.3, 5.15 내지 5.25, 또는 5.2, 또는 또 다른 중간 값으로 조절될 수 있다.
일 이상의 전술한 실시예들에 있어서, 양전하성 다가 유기 이온들 및 음전하성 다가 유기 이온들이 제제를 조절하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 양전하 다가 유기 이온은 음전하 다가 유기 이온들에 앞서 상기 제제와 접촉된다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 양전하 다가 유기 이온은 약 0.01% 농도의 세틸트리메틸암모늄이고, 상기 음전하성 다가 유기 이온은 약 0.4% 농도의 노난산이다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 약 1% 내지 약 2% 알란토인이 상기 조절의 임의의 단계에서 존재할 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 조절된 제제의 총 함량은 상기 음전하성 다가 유기 이온이 먼저 첨가된 제제 내에서보다 약 3 내지 4배 낮다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 단백질 제제를 유기 다가 이온들로 조절하는 것은 샘플을 미용해된 알란토인과 접촉시키는 것을 포함한다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 단백질 제제 내에 존재하는 첨가된 알란토인은 약 0.6% 내지 50%, 또는 0.7 내지 20%, 또는 0.8 내지 10%, 또는 0.9 내지 5%, 또는 1 내지 2%, 또는 중간값의 양일 수 있다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 단백질 제제를 유기 다가 이온들로 조절하는 것은 샘플을 이의 임계 미셀(micelle) 농도보다 낮은 농도에서 비이온성 또는 양쪽성 계면활성제와 접촉시키는 것을 포함한다.
일 이상의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 단백질 제제를 유기 다가 이온들로 조절하는 것은 (i) 음전하성 표면을 갖는 제1 고체 기질(substrate)인 제1 성분을 제공하고; (ii) 상기 단백질 제제를 상기 제1 성분과 접촉시키고, 동작 조건은 실질적으로 원하는 단백질이 상기 제1 성분에 결합하는 것을 방지하며; 그리고 (iii) 상기 제1 성분으로부터 감소된 크로마틴 함량을 갖는 상기 원하는 단백질을 분리하는 것을 포함한다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 제1 음전하성 표면은 제2 음전하성 표면을 수반할 수 있다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 단백질 제제를 유기 다가 이온들로 조절하는 것은 (i) 양전하성 표면을 갖는 제1 고체 기질인 제1 성분을 제공하고; (ii) 상기 단백질 제제를 상기 제1 성분과 접촉시키고, 동작 조건은 원하는 단백질이 상기 제1 성분에 결합하는 것을 실질적으로 방지하며; 그리고 (iii) 상기 제1 성분으로부터 감소된 크로마틴 함량을 갖는 상기 원하는 단백질을 분리하는 것을 포함한다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 제1 양전하성 표면은 2(아미노에틸)아민의 잔류물을 함유한다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 제1 양전하성 표면은 제2 양전하성 표면을 수반할 수 있다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 단백질 제제를 유기 다가 이온들로 조절하는 것은 (i) 양전하성 표면을 갖는 제1 고체 기질인 제1 성분을 제공하고; (ii) 음전하성 표면을 갖는 제2 고체 기질은 제2 성분을 제공하고; (iii) 상기 단백질 제제를 상기 제1 및 제2 성분들과 접촉시키고, 상기 제1 및 제2 성분들은 상기 단백질 제제가 두 성분들을 동시에 접촉하도록 설계되며, 동작 조건은 원하는 단백질이 상기 제1 및 제2 성분들과 결합하는 것을 실질적으로 방지하며; 그리고 (iv) 상기 제1 및 제2 성분들로부터 감소된 크로마틴 함량을 갖는 상기 원하는 단백질을 분리하는 것을 포함한다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 제1 양전하성 표면은 2(아미노에틸)아민의 잔류물을 함유한다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 단백질 제제를 유기 다가 이온들로 조절하는 것은 (i) 상기 단백질 제제를 금속 결합이 가능한 적어도 하나의 표면-결합 리간드를 포함하는 적어도 하나의 고체 표면에 접촉시키고, 금속 결합이 가능한 상기 표면-결합 리간드는 최초 실질적으로 금속이 결여되고, 동작 조건은 원하는 단백질이 상기 적어도 하나의 고체 표면에 결합하는 것을 실질적으로 방지하기 위해 선택되며; 그리고 (ii) 상기 단백질 제제를 상기 적어도 하나의 표면-결합 리간드로부터 분리하는 것을 포함한다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 이미 용해성 양전하성 또는 음전하성 유기 첨가물 및/또는 음전하성, 양전하성 또는 금속 친화성 리간드를 함유한 고체 표면으로 처리된 단백질 제제는 이어서 양전하를 포함한 유체-접촉 표면을 갖는 장치를 통과해 유동될 수 있다.
크로마틴-유도 정화 방법의 적용을 설명하는 일 실시예에 있어서, 알란토인이 1% (v/v)의 양으로 세포 배양 수확물 내에 첨가된다. 세포 배양물은 세포들을 포함하며, 또는 상기 세포들은 이전에 제거되었을 수 있다. 메틸렌 블루가 0.025% (w/v)의 농도로 첨가된다. 이와는 달리, 에타크리딘이 0.025%의 농도로 첨가된다. 이와는 달리, 0.025% 세틸트리메틸암모늄 브로마이드가 0.025%의 농도로 첨가될 수 있다. 이와는 달리, 이러한 또는 다른 양전하성 유기 첨가물의 조합이 0.025%의 조합 농도로 사용될 수 있다. 혼합물은 이어서 2 시간동안 교반하며 인큐베이션된다. 양전하성 금속 친화성 리간드 2(아미노에틸)아민(TREN)을 함유한 입자들이 2-5% v:v의 양으로 첨가된다. 혼합물은 4 시간 동안 교반하며 인큐베이션되고, 이어서 고체들이 임의의 적합한 방법을 통해 제거된다. 원하는 단백질을 함유하는 잔류 용액은 선택적으로 유체 접촉 표면 상에 양전하를 보유한 뎁스 필터를 통과해 유동될 수 있다.
크로마틴-유도 정화 방법의 적용을 설명하는 또 다른 실시예에 있어서, 알란토인이 세포 배양 수확물에 1% (v/v)의 양으로 첨가된다. 세포 배양물은 세포들을 함유하며, 또는 상기 세포들은 이전에 제거되었을 수 있다. 0.6% 헵탄산(heptanoic acid)이 첨가된다. 이와는 달리, 0.4% 옥탄산(octanoic acid)이 첨가된다. 이와는 달리, 0.3% 펠라곤산(pelargonic acid)이 첨가된다. 이와는 달리, 0.2% 카프릭산(capric acid)가 첨가된다. 이와는 달리, 0.5% 메틸 블루가 첨가된다. 이와는 달리, 이러한 또는 다른 음전하성 유기 첨가물들의 조합이 사용될 수 있다. 혼합물은 이어서 2 시간동안 교반되며 인큐베이션된다. 양전하성 금속 친화성 리간드 2(아미노에틸)아민(TREN)을 보유한 입자들이 2-5% v:v의 양으로 첨가된다. 혼합물은 4시간동안 믹싱하며 인큐베이션되고, 이어서 고체들은 임의의 적절한 방법을 통해 제거된다. 원하는 단백질을 함유한 잔류 용액은 선택적으로 유체 접촉 표면 상에 양전하를 보유한 뎁스 필터를 통해 유동된다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 염이 정화 혼합물에 첨가되어 용해성 또는 불용성 다가 유기 이온과의 과도한 상호작용을 통해 원하는 단백질이 소실되는 것을 방지할 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, IgM 항체 또는 비-항체 단백질이 크로마틴-유도 정화 시스템의 성분들과 결합하는 것을 방지할 목적으로, NaCl이 첨가되어 약 200 mM에 상응하는 레벨로 전도도를 증가시킬 수 있으며, 이는 약 20 mS/cm의 대략적인 전도도 균등치이다. 이러한 다른 실시예들에 있어서, NaCl 농도가 특정 재조합 단백질을 수용하는 정도보다 높은 혹은 낮은 정도로 상승될 수 있다. 특정 단백질을 수용하기 위한 적절한 염 농도는 양이온 교환기 또는 음이온 교환기에 원하는 단백질 샘플을 적용하고, 이들을 증가된 염 구배로 용출하고, 원하는 단백질 피크의 중심에서 전도도를 결정하고, 이어서 상기 전도도 값을 정화 공정에 사용하는 것에 의해 빠르고 용이하게 평가될 수 있다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 원하는 단백질 침전에 사용되는 비이온성 유기 고분자는 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, PEG의 평균 사이즈는 8 kDa, 또는 6 kDa, 또는 4 kDa, 또는 3 kDa, 또는 2 kDa, 또는 중간 사이즈일 수 있다. 통상의 기술자라면 PEG가 작아질수록 보다 큰 고분자와 동일한 효과를 획득하는데 요구되는 농도가 높아짐을 이해할 것이다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 침전 중재를 위해 사용되는 상기 비이온성 유기 고분자는 PEG와 다른 종, 예를 들면 폴리프로필렌 글리콜, 폴리비닐비롤리돈, 덱스트란, 셀룰로오스 또는 다른 고분자일 수 있다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 비이온성 유기 고분자와 결합된 비-단백질-침전 염은 (i) 약 50 mS/cm 내지 약 100 mS/cm; (ii) 약 16 mS/cm 내지 약 200 mS/cm, (iii) 160 mS/cm 보다 큰 전도도로 구성된 그룹에서 선택된 범위의 전도도를 갖는 소듐 클로라이드이다. NaCl의 수용액에 대해서, 16 mS/cm는 약 160 mM의 NaCl 농도에 상응하고, 50 mS/cm는 대략 600 mM에 상응하고, 160 mS/cm는 대략 약 2 M NaCl 농도에 상응하고, 200 mS/cm는 대략 약 2.5 M NaCl에 상응한다. 개시된 방법은 포화농도까지의 NaCl 농도에서 실행될 수 있으며, 이는 5 M 보다 약간 높은 농도에서 발생하며, 유리한 동작 범위는 일반적으로 약 0.5 내지 1.5 M일 수 있다. 정확한 전도도 측정은 비이온성 유기 고분자의 존재에 의해 방해될 수 있으며, 이는 증가된 고분자 농도 및 고분자 사이즈를 갖는 명확한 전도도 값을 저지한다. 정확한 전도도 측정은 추가적으로 일부 전도도-모니터링 장치의 열악한 선형성에 의해 방해될 수 있다. 이에 따라, 전도도가 염 농도의 인덱스로 사용되는 정도에서, 제안된 전도도 값은 비-이온성 유기 고분자가 없는 수용액을 나타내며, 선형 정밀성을 지지하는 장치에 의해 측정된다고 이해된다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 방법들은 약 16 mS/cm 내지 약 200 mS/cm 범위의 염의 전도도를 갖는 것으로 특징되는 비-단백질-침전 염을 사용한다. 고하면, 생리 용액의 전도도는 약 12-15 mS/cm이며, 따라서 16-160의 기재는 정상 생리학적 레벨보다 높은 전도도 및 상응하는 염 농도를 지칭하는 것으로 의도된다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 비이온성 유기 고분자 침전 방법들은 약 20 내지 140 mS/cm 범위의 염 전도도를 갖는 것으로 특징되는 비-침전 염을 사용한다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 비이온성 유기 고분자 침전 방법들은 약 50 내지 120 mS/cm 범위의 염의 전도도를 갖는 것으로 특징되는 비-침전 염을 사용한다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 비이온성 유기 고분자 침전 방법들은 약 60 내지 약 100 mS/cm 범위의 염의 전도도를 갖는 것으로 특징되는 비-침전 염을 사용한다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 비이온성 유기 고분자 침전 방법들은 약 80 내지 120 mS/cm 범위의 염의 전도도를 갖는 것으로 특징되는 비-침전 염을 사용한다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 비-단백질-침전 염은 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 소듐 아세테이트, 포타슘 아세테이트, 소듐 티오시아네이트, 포타슘 티오시아네이트 및 구아니딘 클로라이드 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 하나의 종보다 많은 비-단백질-침전 염이 존재할 수 있으며, 결합된 비-단백질-침전 염들의 총 전도도는 약 16 mS/cm 내지 약 200 mS/cm 범위일 수 있다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 비-단백질-침전 염들의 농도는 일반적으로 침전 및 세척 단계 동안 일정하다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 침전 후에, 침전물은 원하는 단백질이 최초 침전되었던 용액과 명목적으로 동일한 비이온성 유기 고분자 및 비-침전 염의 농도 및 pH를 포함하는 용액으로 세척된다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 침전 후에, 침전물은 원하는 생성물을 침전된 상태로 유지하기에 충분한 농도의 침전 염을 포함하고, 비이온성 유기 고분자가 명목적으로 결여된 용액으로 세척된다. 관련 실시예에 있어서, 상기 침전물은 침전물을 침전된 상태로 유지하기에 충분한 농도의 침전 염을 포함하고, 명목적으로 비이온성 유기 고분자가 결여된 용액으로 다시 세척될 수 있다. 관련 실시예에 있어서, 침전 후 및 상기 침전물이 비이온성 유기 고분자 및 비-침전 염을 함유하는 용액으로 세척된 후에, 상기 침전물은 원하는 생성물을 침전된 상태로 유지하기에 충분한 농도의 침전 염을 포함하고, 명목적으로 비이온성 유기 고분자가 결여된 용액으로 더 세척된다. 관련 실시예에 있어서, 상기 침전물은 추가적으로 세척될 수 있다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 비-단백질-침전 염과 결합된 비이온성 유기 고분자에 의한 침전에 이어 원하는 단백질을 침전된 상태로 유지하기에 충분한 농도의 단백질-침전 염으로 세척한다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 비-단백질-침전 염과 결합된 비이온성 유기 고분자로의 침전에 이어 비이온성 유기 고분자 및 비-단백질-침전 염으로의 세척이 행해지고, 이어서 원하는 단백질을 침전된 상태로 유지하기에 충분한 농도에서 단백질-침전 염으로 세척한다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 방법들은 후속 크로마토그래피 단계에서의 공정을 더 포함한다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 원하는 단백질은, 비이온성 유기 고분자의 명목적 부존재 하에서 침전 염으로 세척 후, 그리고 재용해 후, 샘플 평형 없이, 배제 모드가 없는 음이온 교환 크로마토그래피 방법에 의해 더 정제될 수 있다(Nian et al, J. Chromatogr. A 1282 (2013) 127-132).
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 원하는 단백질은 재용해 이후, 히드록시애퍼타이트, 또는 플루오르애퍼타이트, 또는 하이브리드 애퍼타이트, 또는 2차 칼슘-유도 애퍼타이트, 또는 아연 애퍼타이트, 또는 구리 애퍼타이트, 또는 철 애퍼타이트, 또는 또다른 금속-유도 애퍼타이트와 같은 다른 금속-유도 애퍼타이트로 구성된 크로마토그래피 미디엄 상의 애퍼타이트(apatite) 크로마토그래피 방법에 의해 추가적으로 정제될 수 있다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 원하는 단백질은, 재용해 이후, 소수성 양전하 미디엄을 갖는 다중모드 크로마토그래피 방법으로 추가적으로 정제될 수 있다. 이러한 일 실시예에 있어서, 상기 양전하 소수성 크로마토그래피 미디엄은 또한 수소 결합을 중재할 수 있는 잔기들을 함유한다. 이러한 일 실시예에 있어서, 상기 크로마토그래피 미디엄은 Capto adhere일 수 있다.
본 출원에 개시된 방법들의 다수의 측면들을 병합하는 예시적인 일 실시예에 있어서, 크로마틴-유도 방법에 의해 정화된 IgG-함유 세포 배양 수확물은 pH 7.0에서 600 mM NaCl 및 20-50 mM Hepes 또는 포스페이트 버퍼의 존재 하에 19% PEG-6000으로 침전된다. 침전물은 침강되고 상청액은 제거되고, 이어서 침전물은 pH 7.0에서 600 mM NaCl 및 20-50 mM Hepes 또는 포스페이트 버퍼의 존재 하에 19% PEG-6000으로 세척된다. 상청액은 폐기되고, 침전물은 pH 8.0, 50 mM Tris, 1 M NaCl내에 재-용해되고, Capto adhere로 충전된 칼럼에 적용된다. 잔류 PEG는 칼럼을 통해 흐르고, 따라서 제거된다. 항체는 유지되고, 이어서 NaCl의 농도를 300 mM으로 감소시킴으로써 응집체 대부분을 제거하는 효과와 함께 용출된다.
본 출원에 개시된 방법들의 다수의 측면들을 병합하는 예시적인 일 실시예에 있어서, 크로마틴-유도 방법에 의해 정화된 IgG-함유 세포 배양 수확물은 pH 7.0에서 600 mM NaCl 및 20-50 mM Hepes 또는 포스페이트 버퍼의 존재 하에 19% PEG-6000으로 침전된다. 침전물은 침강되고, 상청액은 제거되며, 이어서 침전물은 pH 7.0에서 20-50 mM Hepes 또는 포스페이트 버퍼, 1.5 M 암모늄 설페이트로 세척된다. 침전물은 침강되고, 상청액은 제거되며, 이어서 침전물은 pH 7.0에서 20-50 mM Hepes 또는 포스페이트 버퍼, 1.5 M 암모늄 설페이트로 다시 세척된다. 침전물은 pH 7.0에서 Hepes 또는 포스페이트 버퍼 내에 재-용해되고, 배제 모드가 없이 작동하는 20 mM Tris, pH 8.0으로 평형된 UNOsphere Q로 충전된 칼럼에 적용된다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 단백질-침전 염들은 소듐 설페이트, 포타슘 설페이트, 암모늄 설페이트, 포타슘 포스페이트, 소듐 시트레이트, 포타슘 시트레이트, 암모늄 시트레이트와 같은 특정 예들을 포함하는 포스페이트, 설페이트, 시트레이트, 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나를 포함한다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 단백질-침전 염들은 비이온성 유기 고분자의 실질적 부존재 하에서, 비-단백질 침전 염들과 결합된다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 단백질-침전 염의 실질적 부존재는 단지 pH 조절 중재를 위해 충분량의 존재를 포함하며, 상기 충분량은 약 5 mM 내지 약 100 mM 범위이다. 전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 단백질-침전 염의 실질적 부존재는 침전 염의 완전한 부존재를 포함한다. 전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 침전 염의 실질적 부존재는 침전 염 또는 염들의 중간 농도를 포함한다. 이는 단백질-침전 염과 같은 특정 염의 참조가 원하는 단백질을 침전시키는데 충분한 농도에서 필수적으로 존재하는 것을 의미하지는 않는 점을 부각시킨다. 침전 염들은 카오트로픽(chaotropic) 또는 라이오트로픽(lyotropic) 이온들의 Hofmeister 시리즈 내에서의 위치에 따라 소위 라이오트로픽 또는 코스모트로픽(kosmotropic) 염들을 언급하는 것으로 이해된다. 용어 비-단백질-침전 염들은 일반적으로 임의의 농도에서 단백질을 침전시키지 않는 염들을 언급한다. 이러한 염들은 Hofmeister 시리즈에서 카오트로픽인 이온들, 또는 시리즈의 중간-범위 내에 있으나, 라이오트로픽 또는 코스모트로픽인 것으로 일반적으로 분류되는 것들 사이에 있지 않은 이온들을 포함한다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 침전 단계에서의 pH는 약 7, 또는 (i) 약 6.5 내지 약 7.5, (ii) 약 5.5 내지 약 8.5, 및 (iii) 약 4.0 내지 약 9.0.으로 구성된 그룹에서 선택된 범위내이다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 침전 단계에서의 pH는 조정되지않는다. 관련 실시예에 있어서, 침전 단계에서의 pH는 원하는 단백질의 등전점의 1 pH 단위 내로 조정되지 않는다. 관련 실시예에 있어서, 침전 단계 동안 pH는 원하는 단백질의 등전점의 0.5 pH 단위 내로 조정되지 않는다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 침전 단계 동안 pH는 원하는 단백질의 등전점의 0.6 단위 내, 또는 0.7 단위 내, 또는 0.8 단위 내, 또는 0.9 단위 내, 또는 1 단위 내, 또는 1.1 단위내, 또는 1.2 단위 내, 또는 1.3 단위 내, 또는 1.4 단위 내, 또는 1.5 pH 단위 내, 또는 2.0 pH 단위 내, 또는 원하는 단백질의 등전점으로부터 더 큰 간격 내로 조정될 수 있다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 공정의 다른 단계들에서 다른 pH 값들이 활용될 수 있다. 일 실시예에 있어서, 고 염 조건 동안 pH 값은 염이 정전(electrostatic) 상호작용을 억제하므로 매우 넓을 수 있다. 이는 pH를 원하는 단백질의 등전점으로 조절할 필요가 없다는 점을 부각시킨다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 본 방법의 특정 단계가 수행되는 pH는 이의 오염물 제거 향상 능력에 따라 선택될 수 있다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 본 방법의 특정 단계가 수행되는 pH는 오염물을 결합하는 시스템 내의 양전하성 물질의 능력을 향상시키는 능력에 따라 선택될 수 있다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 원하는 단백질은 IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, Fc-융합 단백질, 비-항체 단백질, 클로팅(clotting) 단백질, 클로팅 단백질의 공동-인자와의 복합체이다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 원하는 단백질은 부분적으로 정제된다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 항체는 IgG이다. 이러한 일 실시예에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 IgG이다. 밀접하게 연관된 일 실시예에 있어서, 원하는 단백질은 소위 Fc-융합 단백질의 병합 성분인 Fc-절편과 같은 IgG 절편을 포함한다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 방법은 비-IgG 항체를 정제하는데 사용된다. 이러한 일 실시예에 있어서, 상기 항체는 IgM이다.
일부 실시예들에 있어서, 원하는 단백질은 항체이다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 항체를 정제하는 방법들은 적어도 하나의 항체를 포함하는 세포 배양 수확물 또는 단백질 제제를 7 내지 10 탄소 원자들을 갖는 적어도 하나의 지방산에 접촉시켜 혼합물을 형성하는 것, 선택적으로 상기 혼합물을 알란토인에 접촉시키는 것, 상기 혼합물을 일 이상의 관능화된 고체 및/또는 용해성 기질에 접촉시켜 혼합물을 형성하는 것을 포함하고, 상기 일 이상의 관능화된 기질은 양이온성 관능기, 금속 결합 관능기, 또는 양자를 포함하고, 상기 금속 결합 관능기는 (1) 폴리아민, (2) 이민, (3) N-헤테로사이클, (4) 아미노산, (5) N-히드록시아미드, (6) 아릴아민, 및 이들의 조합으로 구성된 그룹에서 선택된 질소-함유 잔기를 포함하고, 그리고 상기 혼합물을 일 이상의 상기 고체들과 접촉시킨 후 고체 물질을 분리하여 IgG 항체를 포함하는 용액을 제공하는 것을 포함한다.
이러한 일부 실시예들에 있어서, 방법들은 상기 세포 배양 수확물을 알란토인과 접촉시키는 것을 더 포함할 수 있다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 알란토인은 (a) 약 0.6 내지 약 30%, (b) 약 1 내지 약 10%, 및 (c) 약 1 내지 약 2%로 구성된 그룹에서 선택된 범위의 농도로 존재할 수 있다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 알란토인은 0이 아닌 값에서 약 0.6% 까지의 범위의 양일 수 있다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 일 이상의 관능화된 기질의 총량은 약 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.25%, 0.5%, 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 또는 이들 사이의 중간값의 총 부피의 부피비일 수 있다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 지방산 및 상기 일 이상의 관능화된 기질들은 단일 용기 내에 배치된다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 일 이상의 관능화된 기질들은 고체 물질의 통과를 억제하면서 유체의 흐름을 허용하는 장치 내에 배치된다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 방법은 용액을 장치 내에 배치된 관능화된 고체와 접촉시키는 것을 더 포함한다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 고체 흐름의 통과를 억제하면서 유체 흐름을 허용하는 상기 장치는 멤브레인, 모노리스, 직조 물질, 결정 물질, 젤라틴 물질, 충전 입자 칼럼 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된 다공성(porous) 물질을 포함한다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 세포 배양 수확물을 상기 적어도 하나의 지방산과 접촉시키는 것 이후, 혹은 분리하는 단계에서 존재하는 고체 물질들은 침강 또는 원심분리 후의 침강에 의해 제거된다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 세포 배양 수확물을 상기 적어도 하나의 지방산과 접촉시키는 것 이후, 혹은 분리하는 단계에서 존재하는 고체 물질들은 여과에 의해 제거된다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 여과는 멤브레인 여과 또는 뎁스 여과를 포함한다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 멤브레인 여과 또는 뎁스 여과는 관능화된 접촉 표면을 포함한다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 제1 접촉 단계보다 IgG 항체의 부분 정제가 선행된다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 세포 배양 수확물 또는 단백질 제제는 세포들을 포함하고, 선택적으로 세포 배양 생산이 수행된 바이오반응기 내에 존재한다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 세포 배양 수확물 또는 단백질 제제는 세포들을 함유하지 않는다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 단백질 제제는 천연 발생 생물학적 유체이다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 지방산은 CH3(CH2)nCOOH의 일반 구조식을 포함한다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 지방산은 에난틱(헵타노익)산, 카프릴릭(옥타노익)산, 옥테노익 산, 펠라르고닉(노나노익) 산, 노넨산, 또는 카프릭(데카노익) 산을 포함한다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 지방산은 노난산이다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 지방산은 (a) 약 0.05 내지 약 5%, (b) 약 0.1 내지 약 1.0%, (c) 약 0.2 내지 약 0.4%, 및 (d) 약 0.1 내지 0.2%로 구성된 그룹에서 선택된 범위의 농도로 존재한다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 혼합물은 계면활성제를 포함할 수 있다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 혼합물에 포함된 계면활성제는 비이온성, 양쪽 이온성 또는 양전하성일 수 있다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 혼합물에 포함된 양전하성 계면활성제는 세틸트리메틸암모늄 브로마이드일 수 있다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드는 약 0.001% 내지 0.05%, 또는 약 0.005% 내지 0.025%, 또는 약 0.0075% 내지 약 0.01%의 농도로 존재할 수 있다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 일 이상의 관능화된 기질은 음이온성, 양이온성 또는 양쪽이온성으로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 하나의 전하 구성을 포함한다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 일 이상의 관능화된 기질은 금속 결합 관능기를 갖는 하나의 기질 및 양이온성인 분리된 기질을 포함한다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 금속 결합 관능기는 양이온성이다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 금속 결합 관능기는 트리스(2-아미노에틸)아민, 디에틸렌트리아민, 트리에틸렌트리아민, 테트라에틸렌펜트아민, 폴리프로필렌이민 테트라민(polypropylenimine tetramine), 폴리(아미노아민)(PAMAM) 덴드리머, 데페록사민(데스페리옥사민), 아르기닌, 히스티딘, 히스타민, 이미다졸 및 이들의 조합으로 구성된 그룹에서 선택된다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 금속 결합 관능기는 화학식 I의 화합물이다.
[화학식 I]
Figure pct00001
각 R의 경우 독힙적으로 수소 또는 C1-C4 알킬이며, 적어도 하나의 R은 고체 담체가 선택적으로 링커를 통해 부착되는 사이트이며; 각 X, Y 및 Z는 (CH2)n이고, n은 2 내지 6의 정수이며, CH2 그룹은 선택적으로 산소(O) 또는 NH로 치환된다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 양이온성 킬레이팅 제제는 트리스(2-아미노에틸)아민이다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 일 이상의 관능화된 고체 또는 용해성 기질은 상기 금속 결합 관능기를 갖는 하나의 기질 및 음이온성인 분리된 기질을 포함한다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 금속 결합 관능기는 음이온성이다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 금속 결합 관능기는 이미노디아세트산, 니트릴로아세트산, 글루탐산, 아스파르트산, 아미노페닐 포스페이트, 및 이들의 조합으로 구성된 그룹에서 선택된다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 음이온성 킬레이팅 제제는 이미노디아세트산이다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 일 이상의 관능화된 고체 또는 용해성 기질은 양이온성인 하나의 기질과 음이온성인 분리된 기질을 포함한다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 항체는 IgG 또는 IgM 항체이다.
일부 실시예들에 있어서, 항체를 정제하는 방법이 제공되며, 이는 세포 배양 수확물 또는 단백질 제제를 8 내지 10 탄소 원자를 갖는 적어도 하나의 지방산과 접촉시켜 혼합물을 형성하고, 상기 혼합물을 알란토인과 접촉시키고, 상기 혼합물을 알란토인과 접촉시킨 후 고체 물질들을 분리하여 항체를 포함하는 용액을 제공하는 것을 포함한다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 방법은 상기 용액을 적어도 하나의 화학적으로 관능화된 고체 또는 용해성 기질과 접촉시키는 것을 더 포함한다.
이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 화학적으로 관능화된 고체는 트리스(2-아미노에틸)아민이다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 알란토인은 (a) 약 0.6 내지 약 30%, (b) 약 1 내지 약 10%, (c) 약 1 내지 약 5%, 및 (d) 약 1 내지 약 2%으로 구성된 그룹에서 선택된 범위의 농도로 존재한다.
전술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 알란토인은 0보다 크며 약 0.6% 까지 범위이다.
일부 실시예들에 있어서, 단백질 제제로부터 원하는 단백질을 정제하는 방법에 제공되며, 이는 단백질 제제를 선택적으로 과포화된 알란토인의 존재 하에서 용해성 유기 다가 이온들, 고정화된 유기 다가 이온들 또는 양자로 조절하여 적어도 90%의 크로마틴을 제거하고, 이어서 (1) 원하는 단백질을 생리학적 농도보다 높은 비-단백질-침전 염의 존재 하에 비-이온성 유기 고분자로 침전시켜 원하는 단백질의 침전물을 제공하고, 또는 (2) 상기 원하는 단백질을 생리학적 농도보다 높은 비-침전 염의 존재하에 비이온성 유기 고분자로 침전시켜 침전물을 제공하고, 이어서 침전물을 생리학적 농도보다 높은 비-단백질-침전 염의 존재 하에 비이온성 유기 고분자로 세척하는 것을 포함하고, 상기 침전 또는 세척 단계는 선택적으로 단백질-침전 염이 실질적으로 부존재 조건에서 수행되며, 선택적으로 원하는 단백질의 pH를 원하는 단백질의 등전점의 0.5 pH 단위 내로 조절하지 않으며, 그리고 선택적으로 비-이온성 유기 고분자의 부존재하에서 단백질-침전 염으로 침전물을 세척하며, 침전 염은 원하는 단백질을 침전된 상태로 유지하기에 충분한 농도로 존재한다.
"생리학적 염(Physiological Salts)"은 주로 소듐 및 포타슘 클로라이드인 혼합물을 포함하나, 많은 다른 염들도 낮은 레벨로 포함할 수 있다. "생리학적 염"의 양은 약 0.15 M NaCl에 상응하는 총 염 농도에 대응하는 것으로 평가됨을 일반적으로 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 본 출원에 사용되는 "생리학적 농도보다 큰"비-단백질-침전 염의 양은 0.15M 보다 큰, 또는 0.2M 보다 큰, 또는 0.3M 보다 큰, 또는 0.5M 보다 큰 등의 염 농도들을 포함하며, 이들 사이의, 그리고 일부의 임의의 양을 포함한다. 즉, 상기 양은 생리학적 상태에 있는 일반적인 것보다 큰 임의의 양일 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 농도는 약 0.2M 내지 약 2.0M의 범위일 수 있으며, 그 사이의 그리고 일부의 임의의 양을 포함한다.
따라서, 예를 들면, 본 출원에 개시된 방법들은 다음의 단계들을 포함할 수 있다: (1) 0.2M 보다 높은 농도의 비-단백질-침전 염의 존재 하에 비-이온성 유기 고분자로 원하는 단백질을 침전시켜 상기 원하는 단백질의 침전물을 제공하고; 또는 (2) 0.2M 보다 큰 농도의 비-침전 염의 부존재 하에 상기 원하는 단백질을 비이온성 유기 고분자로 침전시켜 침전물을 제공하고, 이어서 상기 침전물을 0.2M 보다 큰 농도의 비-단백질-침전 염의 존재 하에 비이온성 유기 고분자로 세척하고, 상기 침전 또는 세척 단계는 선택적으로 단백질-침전 염의 실질적 부존재하에 수행되고, 선택적으로 상기 원하는 단백질의 pH를 원하는 단백질의 등전점의 약 0.5 pH 단위 내의 값의 조절함이 없이 수행되며, 그리고 선택적으로 비이온성 유기 고분자의 부존재 하에서 단백질-침전 염으로 상기 침전물을 세척하며, 상기 침전 염은 상기 원하는 단백질을 침전된 상태로 유지시키기에 충분한 농도이다.
일부 실시예들에 있어서, 단백질 제제를 유기 다가 이온들로 조절하는 것은 샘플을 양전하성 유기 첨가물에 접촉시키는 것을 포함한다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 양전하성 유기 첨가물은 메틸렌 블루, 에타크리딘, 클로르헥시딘, 벤잘코늄 클로라이드, 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드로 구성된 용해성 양이온들의 그룹으로부터의 일 이상이다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 양전하성 유기 첨가물은 고체 표면 상에서의 고정화에 기인하여 불용성인 양이온으로 구성된 그룹으로부터 일 이상이며, 일차 아미노기, 이차 아미노기, 삼차 아미노기, 사차 아미노기, 일이상의 아미노기들에 의해 부여된 일 보다 큰 양전하를 함유하는 복합 양이온을 포함한다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 양전하성 유기 첨가물은 고체 상에 고정된 2(아미노에틸)아민(TREN)이다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 단백질 제제를 유기 다가 양이온들로 조절하는 것은 샘플을 음전하성 유기 첨가물에 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 음전하성 유기 첨가물은 헵탄산, 옥탄산, 옥텐산, 노난산, 노넨산, 데칸산, 메틸 블루로 구성된 용해성 음이온들의 그룹으로부터의 일 이상이다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 음전하성 유기 첨가물은 고체 표면 상에서의 고정화에 기인하여 불용성인 음이온으로 구성된 그룹으로부터의 일 이상이며, 이는 포스포 그룹, 카르복실 그룹, 설포(sulfo) 그룹, 일 이상의 종류의 음으로 하전된 그룹들에 의해 부여된 일 보다 큰 음전하를 함유하는 복합 음이온을 포함한다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 음전하성 유기 첨가물은 이미노디아세트산, 니트릴로아세트산, 또는 이의 조합이다.
일부 실시예들에 있어서, 음전하성 유기 첨가물 또는 양전하성 유기 첨가물은 금속 이온들에 대해 1:1 친화도를 갖는다.
일부 실시예들에 있어서, 알란토인이 포함되는 경우 0.6 내지 50%, 0.7 내지 20%, 0.8 내지 10%, 0.9 내지 5%, 1 내지 2%, 또는 중간값으로 구성된 그룹으로부터의 범위의 과포화 농도로 포함된다.
일부 실시예들에 있어서, 비이온성 유기 고분자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다.
일부 실시예들에 있어서, 고분자 사이즈는 1000 내지 12,000 Daltons (D), 2000 내지 8,000 D, 3000 내지 6000 D, 또는 1500 D, 3500 D, 4000 D, 6000 D로 구성된 그룹에서 선택된 하나와 같은 중간 사이즈로 구성된 그룹으로부터의 범위이다.
일부 실시예들에 있어서, 비-단백질-침전 염은 소듐 아세테이트, 포타슘 아세테이트, 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나를 포함할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 일 이상의 비-단백질-침전 염은 상기 비이온성 유기 고분자의 첨가 후의 염 농도가 적어도 0.05M 내지 약 2.0M 범위의 증분으로 생리학적 농도보다 크기에 충분한 양으로 조절된 세포 배양 수확물에 첨가될 수 있다. 따라서, 상기 증분은 적어도 약 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 1.0, 1.5, 및 2.0 M 보다 클 수 있으며, 또는 그 이상이고, 이들의 사이 값 및 부분값의 임의의 값을 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 농도는 약 0.5 내지 약 1.5 M의 범위일 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 개별 염 또는 비-단백질-침전 염들의 조합은 세포 배양 수확물에 첨가되어 전체적인 염 농도를 정상 생리학적 염 함량보다 상승시키며, 과량의 비-단백질-침전 염이 상기 비이온성 유기 고분자의 첨가와 결합되어 유지된다. 일부 실시예들에 있어서, 농도는 약 1.2M 내지 약 1.8M 범위의 증분보다 클 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 증분은 1.2 M, 1.3 M, 1.4 M, 1.5 M, 1.6 M, 1.7 M, 또는 약 1.8M이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 농도는 약 0.5 내지 약 1.5M 범위이다.
일부 실시예들에 있어서, 일 이상의 비-단백질-침전 염이 상기 비이온성 유기 고분자의 첨가와 결합되어 단백질 제제에 첨가되며, 최종 염 농도는 적어도 0.05M의 증분으로 정상 생리학적 농도보다 클 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 농도는 약 1.2M 내지 약 1.8M 범위의 증분보다 클 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 증분은 약 1.2 M, 1.3 M, 1.4 M, 1.5 M, 1.6 M, 1.7 M, 또는 약 1.8M이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 농도는 약 0.5 내지 약 1.5M의 범위일 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 일 이상의 비-단백질 침전 염이 첨가되어 단백질 제제의 총 염 농도는 200 mM 내지 2 M, 300 mM 내지 1.5 M, 400 mM 내지 1 M, 500 mM 내지 800 mM, 또는 중간 값으로 구성된 그룹으로부터의 범위를 갖는 정상 생리학적 값보다 높을 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 적어도 0.2M의 농도의 비-침전 염들이 세척 용액에 포함되어 침전물 내에 이미 존재하는 과량을 유지할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 최초 침전 단계에서 비-침전 염들이 부존재하는 경우, 이들은 적어도 하나의 세척 단계에서 포함될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 침전물은 원하는 단백질을 침전된 상태로 유지하기에 충분한 농도의 일 이상의 침전 염들로 세척될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 침전 염들은 PEG와 같은 비이온성 유기 고분자의 부존재 또는 실질적인 부존재 하에서 사용될 수 있다. 통상의 기술자라면 PEG는 별도의 유기층으로 분리될 수 있으므로, 충분히 높은 농도에서 상기 두 제제들이 양립불능임을 이해할 것이다. 그러나, 저농도의 일 제제가 고농도의 다른 제제에 첨가될 수 있는 실행가능한 조건들이 있다.
일부 실시예들에 있어서, 일 이상의 침전염들은 소듐 설페이트, 포타슘 설페이트, 암모늄 설페이트, 소듐 포스페이트, 포타슘 포스페이트, 암모늄 포스페이트, 소듐 시트레이트, 포타슘 시트레이트, 암모늄 시트레이트 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 원하는 단백질은 천연 발생 단백질, 재조합 단백질, 항체, 모노클로날 항체, IgG 항체, 또는 IgM 항체이다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 제제는 체약, 밀크, 플라즈마, 세럼(serum), 또는 세포 배양 수확물이다.
실시예들이 보다 잘 이해될 수 있도록 용어들이 정의된다. 추가적인 정의들은 상세한 설명을 통해 제공된다.
"PEG 침전(PEG precipitation)"은 원하는 단백질이 PEG의 임계 농도에서 불용성이 되어 여과 또는 원심분리에 의해 용액으로부터 제거될 수 있는 고체 침전물을 형성하고, 대부분의 오염물들은 잔류하는 액체(상청액)에 남게되는 정제 방법을 지칭한다. 상기 상청액은 전통적으로 여과 또는 원심분리 후 디캔테이션(decantation)에 의해 제거된다. 대부분의 경우, 상기 침전물은 상기 침전물을 PEG-함유 버퍼로 일 이상 횟수로 재-서스펜딩하여 특히 원심분리 후에 침전물의 공극들 내에 존재하는 오염물들을 희석 배출함에 의해 세척된다. 세척 단계들은 전통적으로 일 이상 횟수로, 빈번히 다른 조성의 버퍼들을 사용하나, 항상 원하는 단백질을 침전상태로 유지시키기에 충분한 PEG로 반복된다. 침전된 단백질은 최종적으로 PEG 버퍼가 낮게 또는 없는 상태에서 재용해된다. 전통적으로, 원하는 단백질은 일 이상의 횟수로 재-침전 및 재-용해되어 상기 원하는 단백질의 순도를 증가시킬 수 있다.
"단백질(Protein)"은 탄소, 수소, 산소, 질소 및 보통 황을 함유하며, 주로 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산의 일 이상의 체인으로 구성된 복합 유기 마크로분자들의 그룹을 지칭한다. 단백질은 천연 또는 재조합 유래일 수 있다. 단백질은 예를 들면 글리코실레이션, 페길레이션 또는 다른 화학 잔기들과 결합을 통해 비-아미노산 잔기들로 변성될 수 있다. 단백질의 비제한적인 예는 항체, 클로팅 인자, 효소 및 펩티드 호르몬을 포함한다.
"호스트 오염물(Host contaminant)" 또는 "호스트 세포 오염물"은 관심 대상 생성물이 성장되는 세포들에 의해 생성되는 생분자들을 지칭한다. 상기 용어는 호스트 단백질 및 호스트 DNA와 같은 호스트 오염물들의 다양한 클래스들을 포함할 수 있다.
"호스트 단백질"또는 "호스트 셀 단백질"또는 "HCP"는 관심 대상의 생성물이 성장되는 세포들에 의해 생성되는 단백질들을 지칭한다. 이러한 단백질들은 상기 관심 대상 생성물로부터 제거되어야 하는 오염물들의 일 클래스를 나타낸다.
"항체(Antibody)"는 인간 또는 다른 포유류 세포주들로부터 유래된 IgG, IgM, IgA, IgD, 또는 IgE 계통의 면역글로불린을 지칭하며, 인간화, 인간, 단일-사슬, 키메릭, 합성, 재조합, 하이브리드, 돌연변이, 이식, 및 인 비트로 생성 항체들과 같은 자연적 또는 유전적 변성 형태를 포함한다. "항체"는 또한 이에 제한되는 것은 아니나, 또 다른 항체, 효소, 형광단 또는 다른 신호 생성 잔기, 비오틴, 약물 또는 다른 관능성 잔기에의 IgG의 합성 결합에 의해 생성된 면역글로불린 잔기 또는 면역콘쥬게이트를 함유하는 융합 단백질을 포함하는 합성물 형태를 포함할 수 있다.
"비이온성 유기 고분자(Non-ionic organic polymer)"는 하전된 그룹이 없는 결합된 반복 유기 서브유닛들로 구성된 천연 발생 또는 합성 탄화수소이다. 이는 선형, 일부 브랜치를 갖는 지배적 선형, 또는 지배적인 브랜치 구조일 수 있다. 본 발명 실행에 적절한 비제한적인 예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈(PVP) 등을 포함한다. PEG는 HO-(CH2-CH2-O)n-H의 구조식을 갖는다. 예들은 이에 제한되는 것은 아니나 평균 고분자 분자량이 100 미만으로부터 10,000 dalton 이상인 조성들을 포함한다.
"음이온 교환 입자"또는"양전하성 입자"는 표면이 양전하에 의해 지배되는 다공성 또는 비다공성 입자를 지칭한다. 입자 크기는 50 nm 미만에서부터 200 미크론이상의 범위일 수 있다. 상기 입자들은 본 출원에 개시된 방법들을 수행하는 이들의 능력을 방해하지 않지만 일부 전체적인 향상을 제공하는 수단에 의해 격리될 수 있도록 하는 특징들을 또한 병합할 수 있는 고분자, 결정 또는 세라믹 구조를 포함할 수 있다. 비제한적인 예들은 부유성(flotation)을 가능케하는 저밀도, 빠른 침강을 촉진하는 고밀도, 및/또는 자기장에서 수집을 가능케하는 자성을 부여하는 특징들을 포함한다. 양전하성은 이에 제한되는 것은 아니나, 아미노, 에틸렌 디아미노, 디에틸아미노에틸, 폴리알릴아민, 폴리에틸렌이민과 같은 약한 음이온 교환기들; 4차 아미노기와 같은 강한 음이온 교환기; 폴리리신, 폴리아르기닌, 또는 트리스(2-아미노에틸)아민, 디에틸렌트리아민, 트리에틸렌테트라아민, 테트라에틸렌펜트아민, 폴리프로필렌이민 테트라아민, PAMAM 덴드리머(에틸렌디아민 코어) 또는 이들의 조합과 같은 약-강 교환기들의 조합을 포함하는 화학 그룹에 의해 부여될 수 있다. 양성으로 하전된 멤브레인 상에 혼합 화학 성질을 생성하는 이차 관능성은 음성 또는 양성 하전된 그룹, 소수성 그룹, 파이-파이 결합 그룹, 수소결합 그룹, 또는 금속-킬레이팅 그룹으로 구성될 수 있다. 상기 이차 관능성은 제조 물질 또는 입자들이 합성되는 공정의 비의도된 부산물로서 상기 멤브레인 상에 존재하거나, 의도된 디자인에 의해 존재할 수 있다. 이차 관능성의 농도는 입자들의 mL 당 1밀리 당량 미만으로부터, mL 당 100 밀리당량 이상까지 존재할 수 있다.
"유기 다가 이온(Organic multivalent ion)"은 적어도 하나의 전하 및 적어도 하나의 추가적 화학 관능성을 구현하여 다가를 갖는 천연 또는 합성 유래의 유기 분자, 이온 또는 염을 지칭한다. 특정 실시예들에 있어서, 유기 다가 이온의 상기 적어도 하나의 추가적 화학 관능성은 추가 전하이며, 이에 따라 유기 다가 양이온은 2 이상의 유사 혹은 상이한 전하들을 보유할 수 있다. 상기 유기 다가 이온은 넷(net) 양성, 넷 음성 또는 넷 중성 전하를 보유할 수 있다. 상기 유기 다가 이온이 넷 양성인 경우, 이는 클로라이드, 브로마이드, 설페이트, 유기산, 락테이트, 글루코네이트, 및 본 방법과 양립가능한 다른 임의의 음이온과 같은 음이온돌과 함께 제공될 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 유기 다가 이온의 특정 양전하는 아민, 이민 또는 다른 질소 잔기들에 의해 공급된다. 상기 유기 다가 이온은 추가적으로 혼합 화학 성질일 수 있으며, 소수성 잔기, 다른 관능기를 포함하고, 및/또는 예를 들면 수소 결합, 소수성 상호작용, 파이-파이 결합, 금속 배위 및 인터칼레이션(intercalation)에 참여하는 능력을 포함하는 다른 종류의 화학적 상호작용에 참여하는 능력을 보유할 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 양으로 하전된 유기 다가 이온들의 예는 이에 제한되는 것은 아니나, 디아미노산, 폴리리신, 폴리아르기닌, 폴리히스티딘, 폴리오르니틴과 같은 디-, 트리- 또는 보다 큰 호모- 또는 헤테로-펩티드들; 폴리에틸렌이민; 폴리알릴아민; 폴리디메트린, 폴리메틸아크릴아미도프로필트리메틸암모니아; 폴리디알릴디메틸암모니아; 폴리비닐벤질트리메틸암모니아; 폴리비닐구아니딘; 폴리(N-에틸-4-비닐피리딘; DEAE- 텍스트란; DEAE-셀룰로오스; 에타크리딘(CAS number 442-16-0; 7-에톡시아크리딘-3,9-디아민); 트리스(2-아미노에틸)아민; 구아니딘; 클로르헥시딘; 알렉시딘; 시트리시달, 프로타민; 스페르민; 스페르미딘; 살민; 키토산; 및 전술한 물질의 변형물 및 유도체를 포함한다. 예를 들면, 에타크리딘의 변형물 및 유도체는 9-아미노아크리딘(아미나크린), 3,6 아크리딘디아민(프로플라빈), 아크리소르신, 아크리잔(페나크리단), 아크리딘 오렌지, 퀴나크린, 아크리사이드, 아크리돈, 아크리딘-9-카르복실산, 아크라닐(1-[(6-클로로-2-메톡시-9- 아크리디닐)아미노]-3-(디에틸아미노)-2-프로판올 디하이드로클로라이드), 페노사프라닌, 페녹사진, 페노티아진, 아크리플라빈(3,6-디아미노-10-메틸아크리디늄, 클로라이드 및 3,6-아크리딘이디아민), 및 이들의 염(예를 들면, 클로라이드, 브로마이드, 설페이트, 락테이트, 글루코네이트; 또한 메틸렌 블루(basic blue 9로도 알려진), 메틸렌 그린(basic green 5로도 알려진), 라우스 바이올렛(Lauth's violet, 티오닌으로도 알려진), 메틸렌 아주르 A, 메틸렌 아주르 B, 및 메틸렌 아주르 C를 포함하는 이의 유사체 및 변형물과 같은 티아진을 포함하는 것으로 이해된다. 상기 유기 다가 이온이 넷 음성인 경우, 이는 소듐 또는 포타슘, 또는 본 방법과 양립 가능한 임의의 다른 양이온과 같은 양이온들과 함께 제공될 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 유기 다가 이온의 특정 음전하들은 카르복실, 포스포 또는 설포 잔기들에 의해 공급된다. 상기 유기 다가 이온은 추가적으로 혼합 화학 성질일 수 있으며, 소수성 잔기, 다른 관능기를 포함하고, 및/또는 예를 들면 수소 결합, 소수성 상호작용, 파이-파이 결합, 금속 배위 및 인터칼레이션에 참여하는 능력을 포함하는 다른 종류의 화학적 상호작용에 참여하는 능력을 보유할 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 음으로 하전된 유기 다가 이온들의 비제한적인 예들은 옥탄산, 옥텐산, 노난산, 노넨산, 음전하성 고분자 및 이의 염들(예를 들면, 클로라이드, 브로마이드, 설페이트, 락테이트, 글루코네이트)와 같은 지방산들 및 메틸 블루와 같은 아릴 화합물들을 포함한다.
"단백질-침전 염(Protein-precipitating salt)"또는 "항체-침전 염" 또는 "IgG-침전 염"은 원하는 단백질의 침전을 중재하는 능력을 포함하는 염을 지칭한다. 일반적인 예들은 소듐 또는 암모늄 설페이트, 소듐 또는 포타슘 시트레이트, 소듐 또는 포타슘 포스페이트를 포함한다. 이러한 염들은 공통적으로 코스모트로픽(kosmotropic) 염들로 지칭된다.
"비-단백질-침전 염(Non-protein-precipitating salt)"또는"비-항체-침전 염"또는"비-IgG-침전 염"은 원하는 단백질의 침전을 중재하는 능력이 없는 염을 지칭하며, 원하는 단백질의 용해도를 증가시키는 능력을 포함할 수 있다. 비제한적인 일반적인 예들은 소듐 또는 포타슘 클로라이드, 소듐 또는 포타슘 아세테이트, 소듐 또는 포타슘 티오시아네이트, 또는 구아니디늄 클로라이드를 포함한다. 이러한 일부 염들은 공통적으로 카오트로픽(chaotropic) 염들로 지칭되며, 다른 염들은 카오트로픽 또는 코스모트로픽으로 불리지 않는다.
"폴리뉴클레오티드(Polynucleotide)는 사슬 내에 공유결합된 다중 뉴클레오티드 모노머들로 구성된 바이오폴리머를 지칭한다. DNA(deoxyribonucleic acid) 및 RNA(ribonucleic acid)는 폴리뉴클레오티드의 예이다. 폴리뉴클레오티드는 수소 결합 형성에 대한 강한 경향성을 가질 수 있다.
"단백질 제제(Protein preparation) 세포-함유 세포 배양 수확물, (실질적으로)세포-프리 세포 배양 상청액과 같은 관심 대상 단백질을 함유하는 임의의 수성 또는 거의 수성의 용액, 또는 정제 단계에서부터 관심 대상 단백질을 함유하는 용액을 지칭한다.
IgG 정제 공정의 발전은 특정한 원하는 단백질에 대한 개시된 방법을 커스터마이징하는 단계들을 설명하는 유용한 예로서 제공된다. 발전은 세포 배양 수확물로부터 90% 이상의 크로마틴을 제거하는 정화방법을 선택하는 것으로 시작된다. 하나의 유용한 개시점은 1% w/v의 알란토인을 수확물에 첨가하고 이어서 0.4% w/v 카프릴산을 첨가하는 것이다. 혼합물의 pH는 5.2로 조절되고 상온에서 2시간 동안 혼합된다. BioWorks TREN high와 같은 양으로 하전된 금속 친화성 입자들이 pH 5.2로 평형화되고, 이어서 5% v/v의 양으로 상기 혼합물에 첨가되고 4시간 동안 교반하면서 인큐베이션된다. 고체들은 임의의 적절한 방법으로 제거된다. 상기 방법에 이어서 상청액이 유체 접촉 표면이 양전하성 리간드를 보유하는 뎁스 필터로 통과된다. 전도도, pH, 및 반응물의 농도는 이어서 원한다면 정제될 수 있다. 크로마틴 및 크로마틴 이화생성물이 실질적으로 결여된 정화된 IgG 제제는 최종 농도 19%로 PEG-6000이 첨가되어 침전된다. NaCl이 또한 600 mM의 양으로 첨가되어 총 염 농도(샘플 + 첨가된 NaCl)가 약 750 mM의 추정 농도로 조절된다. pH는 20-50 mM Hepes, 또는 pH 7 소듐 또는 포타슘 포스페이트에 의해 부여 및 조절된 약 7(6.8 내지 7.2) 값을 갖는다. 이러한 조건들은 다른 버퍼 물질의 치환에 의한 것을 포함하는 방법으로 원하는 경우 추가적으로 정제될 수 있다. 침전물은 원심분리 또는 여과에 의해 수집되고, 상청액은 배출된다. 침전물은 19% PEG-6000, 750 mM NaCl, 20-50 mM Hepes 또는 phosphate, pH 7 내에서 재-서스펜딩되고, 이어서 상기 침전물은 재수집되고 상청액은 배출된다. 이 시점에서 하나의 옵션은 상기 침전물을 IgG를 침전된 상태로 유지시키는 농도의 침전 염으로 다시 세척하는 것이다. 이는 잔여 PEG를 제거하는 효과를 갖는다. 상기 침전물은 이어서 다시 재용해되고 원하는 경우 일 이상의 추가적인 분리 방법에 의해 추가적으로 정제될 수 있다. 하나의 옵션은 샘플을 배제모드가 없이 작동하는 UNOsphere Q 칼럼에 주입하는 것이며, 상기 칼럼은 50 mM Tris, pH 8.2로 평형화된다. 대체적인 크로마토그래피 방법들은 공지되어 있으며, 적절한 방법을 선택하고 이를 동작하는 조건들을 개발하는 것은 통상의 기술자의 이해 범위 내에 있다.
IgG 정제 발전의 다른 접근법은 고려가능한 일부 대안들을 설명한다. 전술한 일반예에서와 같이, 발전은 세포 배양 수확물로부터 크로마틴의 90% 이상을 제거하는 정화방법을 선택하는 것에서 시작된다. 유용한 하나의 개시점은 수확물에 1% w/v 알란토인을 첨가하고, 0.025% w/v 에타크리딘 산을 첨가하는 것이다. 혼합물의 pH는 7.5로 조절되고, 상온에서 2시간동안 혼합된다. BioWorks TREN high와 같은 양으로 하전된 금속 친화성 입자들이 pH 7.5로 평형화되고, 4% v/v의 양으로 상기 혼합물에 첨가되며, 이와 함께 Bio-Rad MacroPrep tbutyl과 같은 음으로 하전된 소수성 입자들이 1% v/v의 양으로 첨가되소, 4시간 동안 교반하면서 인큐베이션된다. 고체들은 적절한 방법으로 제거된다. 상기 방법에 이어서 유체 접촉 표면이 양전하 리간드를 보유한 뎁스 필터로 상청액을 통과시킨다. 전도도, pH, 및 반응물의 농도는 이어서 원하는 경우 정제될 수 있다. 크로마틴 및 크로마틴 이화생성물이 실질적으로 결여된 정화된 IgG 제제는 최종 농도 19%로 PEG-6000의 첨가에 의해 침전된다. NaCl이 또한 850 mM의 양으로 첨가되어 총 염 농도(샘플 + 첨가된 NaCl)가 약 1 M의 추정 농도로 조절된다. pH는 20-50 mM Hepes, 또는 pH 7 소듐 또는 포타슘 포스페이트에 의해 부여 및 조절된 약 7(6.8 내지 7.2) 값을 갖는다. 이러한 조건들은 원하는 경우 추가적으로 정제될 수 있다. 침전물은 원심분리 또는 여과에 의해 수집되고, 상청액은 배출된다. 침전물은 19% PEG-6000, 1 M NaCl, 20-50 mM Hepes 또는 phosphate, pH 7 내에서 서스펜딩되고, 이어서 상기 침전물은 재침강되고 상청액은 배출된다. 상기 침전물은 이어서 예를 들면, 50 mM 포스페이트, 1 M NaCl, pH 7.2를 사용하여 재용해되고, 원하는 경우 동일 조건으로 평형화된 Capto adhere 칼럼에의 적용에 의해 추가적으로 정제될 수 있다. 정제된 IgG는 NaCl 농도를 300 mM으로 감소시킴에 의해 용출될 수 있다, 대체적인 크로마토그래피 방법들이 공지되어 있으며, 적절한 방법 및 이의 동작 조건을 개발하는 것은 통상의 기술자의 이해 범위내에 있다.
상술한 공정들의 다양한 변형들이 고려될 수 있으며, 알란토인과 같은 특정 성분이 생략되거나, TREN 입자들을 Dowex AG1X2 또는 다른 것들로 치환, MacroPrep t-butyl을 Chelex 100 또는 다른 것들로 치환하는 것과 같이 특정 성분들이 변형되고, 상술한 배치(batch) 포맷 대신 칼럼 포맷 내에서 이러한 입자들을 혼합물에 접촉시키거나, 또는 양전하 및/또는 음전하성 유기 이온들이 멤브레인, 섬유, 하이드로겔, 또는 다른 물리적 담체와 같은 다른 고체 표면 상에 존재하는 것과 같은 것들을 포함한다. 이러한 변형의 예들은 부록 A-D에서 논의된다.
개시된 방법들의 적용은 빈번히 정화 중에 염들 또는 다른 첨가물들의 추가를 포함하여 용해성 또는 불용성 양전하 또는 음전하 유기 이온들과의 강한 상호작용을 통해 원하는 단백질의 손실을 방지할 수 있다.
본 출원에 개시된 방법들의 사용에 의해 수득되는 결과들은 화학적 공정의 성능이므로, 모든 물리적 포맷들이 유사 결과를 획득하기 위해 가능하나, 또한 다른 레벨의 효율성, 다른 유체 부피 및 다른 시간 간격으로 행해질 수 있음을 이해해야 한다. 특정 적용에 본 방법들을 어떻게 효과적으로 구성할 지 결정하는 것은 통상의 기술자의 이해 범위내에 있다.
실시예
실시예 1
침전 수행을 위한 NaCl 농도의 선택. 1.2 g/L의 모노클로날 항-HER2 IgG를 함유한 1L의 세포 배양 상청액이 원심분리 및 멤브레인 여과에 의해 정화되었다. 이러한 항체의 등전점은 약 8.6이다. 1% 알란토인이 첨가되고, 최종농도 0.025%로 에타크리딘이 첨가되었다. 고체들은 여과에 의해 제거되었다. 동일 비율의 양으로 하전된 금속 친화성 입자들(BioWorks TREN hi-sub), 음으로 하전된 금속 친화성 입자들(Chelex-100), 및 양으로 하전된 소수성 입자들(Dowex AG1x2 400-mesh)이 조합되었다. 상기 입자 혼합물 20 mL가 1.6 x 10 cm 칼럼 내에 충진되었으며, 대략 생리학적 조건으로 평형화되고, 샘플은 선 유속 300 cm/hr으로 상기 칼럼을 통과하였다. 처리된 HER2은 165,663 ppm의 호스트 세포 단백질 오염물을 함유하였다. 이는 18% PEG-6000 용액 내, pH 7에서 침전되었다. 상청액은 평균 0.22 미크론 기공들을 갖는 비하전된 멤브레인을 통한 여과에 의해 제거되었다. 이어서 항체는 50 mM Hepes, pH 7.0 내에 용해되었다. 병행 실험에 있어서, NaCl이 최초 샘플에 첨가되어 200 mM 상당의 염 농도를 생성하였다. 또한, 200 mM NaCl이 재서스펜션 버퍼에 첨가되었다. 추가 병행 실험에 있어서, NaCl 농도는 400, 800, 및 1000 mM NaCl으로 증가되었다. 호스트 세포 단백질을 오염시키는 농도는 각 실험에 있어서 재용해된 항체 내에서 측정되었다. 이러한 레벨들은 다음과 같다: NaCl 미첨가, 16,544 ppm; 200 mM NaCl, 1,984 ppm; 400 mM NaCl, 605 mM NaCl; 800 mM NaCl, 50 ppm; 1000 mM NaCl, 32 ppm.
실시예 2
800 mM NaCl에서의 실시예 1에서의 실험이 최초 샘플에 염이 첨가되지 않은 것을 제외하고는 반복되었다. 재용해된 항체는 155 ppm의 호스트 세포 단백질을 함유하였다. 재서스펜션 버퍼에의 노출이 연장 또는 반복되는 후속 실험들에서 호스트 단백질을 오염시키는 농도는 약 70 ppm으로 감소하였다. 이는 최초 침전 단계가 상승된 염 농도에서 수행될 때 성능이 향상되는 점을 부각시킨다.
실시예 3
최초 샘플에 첨가된 염이 없는 실시예 2의 기본 형태이나, 재서스펜딩된 침전물의 세척 동안 800 mM NaCl에의 연장된 노출이 포함되었다. 침전된 IgG는 이어서 항체가 50 mM Tris, pH 8.0 내에 용해되기 전에 50 mM Tris, 18% PEG, pH 8.0로 세척되었다. 호스트 단백질 오염은 88 ppm으로 감소되었다; 여전히 최초 침전물이 고 염에서 수행된 결과보다 열등하였다.
실시예 4
세포-함유 세포 배양 수확물로 시작된 것을 제외하고는 실시예 3의 실험이 반복되었다. 결과는 본질적으로 변화된 것 없었으며, 이는 조절 방법의 이점들이 세포-함유 및 세포-프리 단백질 제제에 모두 적용됨을 보여준다.
실시예 5
IgG가 1 M NaCl, 50 mM Hepes, pH 7.0으로 재용해된 것을 제외하고는 실시예 3의 기본 형태가 반복되었으며; 이어서 동일 조건에서 평형화된 소수성 음이온 교환기인 Capto adhere의 10 mL 칼럼에 적용되고, 이어서 50 mM Hepes, pH 7.0의 하향 그래디언트로 용출되었다. 잔여 PEG가 상기 칼럼을 통해 적용 샘플 상으로 유동되었으며, 이에 따라 제거되었다. IgG는 상기 그래디언트 내에서 용출되었다. 용출된 IgG 내의 호스트 단백질 오염은 1 ppm 미만이었다. 상기의 실시예는 본 출원에 개시된 방법의 단지 2개의 분리 단계들에서 조절된 IgG의 놀라운 항체 정제를 획득할 수 있는 능력을 부각시킨다. 본 출원에 개시된 방법의 매우 낮은 레벨의 호스트 단백질 오염을 달성하는 능력은 이러한 많은 2-단계 공정을 가능케함을 이해할 것이다.
실시예 6
Dowex AG1x2 형태의 소수성 양전하성 다공 입자들이 IgG가 재용해되기 직전에 부피비 2%로 도입된 것을 제외하고는 실시예 3의 기본 형태가 반복되었다. 호스트 단백질 오염은 21 ppm으로 감소하였다. 항체회수는 90%였다. 병행 실험에서 Dowex 입자들은 UNOsphere Q 입자들로 교체되었다. 호스트 단백질 감소는 동일하였으나, 항체회수는 95%였다.
실시예 7
정화된 세포 상청액의 염 농도가 1 M NaCl로 상승된 것을 제외하고는 실시예 6의 기본 형태가 반복되었다. UNOsphere Q 형태의 음이온 교환 입자들이 4% v/v 비율로 첨가되었다. 50 mM Tris, 1 M NaCl 내의 PEG-6000이 최종 농도 19% PEG로 첨가되어 항체를 침전시켰다. 상청액은 0.22 미크론 비이온성 멤브레인을 통한 여과에 의해 제거되었다. 침전물 및 입자들은 19% PEG-6000, 1 M NaCl, 50 mM Tris, pH 8.0 내에서 재서스펜딩되었으며, 상청액은 다시 여과를 통해 제거되었다. 침전물 및 입자들은 이어서 19% PEG, 50 mM Tris, pH 8.0 내에서 재서스펜딩되고, 15 분동안 교반하며 인큐베이션되고, 상청액은 동일한 필터를 통한 여과에 의해 제거되었다. 이러한 세척이 반복되어 항체는 50 mM Tris, pH 8.0로 용해되었다. 재용해된 항체 및 양전하성 입자들은 30분 동안 약하게 혼합되어 산성 호스트 단백질이 입자들에 결합되는 기회가 제공되었으며, 이어서 항체 용액은 멤브레인을 통해 여과되어 입자들을 잔류시켰다. 항체의 호스트 단백질 농도는 18 ppm이었다. 항체회수는 93%였다.
실시예 8
IgG 정제 및 회수가 16, 18, 20, 및 22% 농도의 PEG-6000 대 0.0, 0.5, 1.0, 1.5, 및 2.0 M 농도의 NaCl를 평가하는 2차원 매트릭스 내에서 평가되는 일련의 실험들이 수행되었다. 원료물질은 마이크로여과에 의해 배타적으로 정화된 IgG-함유 상청액이었다. IgG 회수, 순도 및 재생성, 및 PWEG 농도에 대한 변경은 약 1 M NaCl에서 최상으로 나타났다. 순도는 약 1.5 M과 동일하였으나, 회수는 절충되었다. 회수는 0.5 M NaCl에서 미소하게 양호하였으나, 순도는 1.0 M보다 낮았다. 순도 및 회수 모두 NaCl 부재 및 2.0 M NaCl에서 심하게 절충되었다.
실시예 9
IgM 정제를 위한 병합된 방법. 120 mg/L의 모노클로날 IgM 클론 529를 함유하는 세포 배양 상청액 1L가 원심분리 및 멤브레인 여과에 의해 정화되었다. 이러한 항체의 등전점은 약 6.0이다. 고체 소듐 클로라이드가 첨가되어 최종 전도도 25 mS/cm를 획득하였다. 1% 알란토인이 첨가되고, 이어서 최종 농도 0.025%의 에타크리딘이 첨가되었다. 고체들은 여과에 의해 제거되었다. 동일한 비율의 강한 음이온 교환 입자들(Macroprep High-Q), 음으로 하전된 금석 친화성 입자들(Chelex-100), 및 강한 양이온 교환 하전 입자들(Macroprep High-S)이 결합되었다. 상기 입자 혼합물 20 mL이 1.6 x 10 cm 칼럼에 충진되어, 대략 생리학적 조건으로 평형화되고, 샘플은 칼럼을 통해 선 유속 200 cm/hr으로 통과되었다. 처리된 HER2은 165,663 ppm의 호스트 세포 단백질 오염을 함유하였다. 통제 실험에서, 항체는 13% PEG-6000으로 침전 및 전도도 25 mS/cm에서 세척으로 침전에 의해 정제되었다. 잔류하는 호스트 단백질 오염은 1383 ppm이었다. 병행 실험에서, 항체는 동일한 수단에 의해, 그러나 전도도 47 mS/cm에서 정제되었다. 잔류하는 호스트 단백질 오염은 69 ppm이었다. 후속의 음이온 교환 및 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제는 호스트 단백질 농도를 3 ppm 미만으로 낮추었다.
실시예 10
275,357 ppm의 호스트 세포 단백질, 5283 ppm DNA, 및 13.96% 응집체들을 함유하는 IgG-함유 세포 배양 수확물이 1% 알란토인, 및 이어서 0.025% 에타크리딘 첨가에 의해 조절되고, 15분 동안 혼합되었다. MacroPrep High Q, MacroPrep High S, Macroprep tButyl, 및 Chelex-100 (Bio-Rad Laboratories)의 동일한 혼합물이 50 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.0으로 세척에 의해 먼저 평형화되었다. 평형화된 혼합 입자들이 2%(v:v)의 양으로 불순 IgG 제제에 첨가되어, 하룻밤 동안 4-8 oC에서 혼합되었다. 고체들은 마이크로여과에 의해 제거되었다. 200 nm 자성 입자들로 코팅된 1.25 mg 전분이 상기의 조절된 불순 IgG 제제에 첨가되었다. 1.6 M NaCl, 50 mM HEPES, pH 7.0 내에 20 mL의 36% PEG-6000이 500 rpm에서 와류 믹서에서 혼합되면서 점진적으로 첨가되어 최종 농도 18% PEG-6000 및 0.8 M NaCl을 생성하였다. 와류 믹싱은 30분 동안 지속되고, 이어서 IgG-로딩 입자들이 자기적으로 수집되었다. 상기 IgG-로딩 입자들은 신선한 50 mM HEPES, 0.8 M NaCl, pH 7.0로 세척되고, 세척 용액은 제거되었다. 세척 버퍼는 제거되고, 입자들은 동일 방식으로 다시 세척되었다. 세척 버퍼는 제거되었으며, 항체는 50 mM HEPES, 1 M NaCl, pH 7에서 재용해되었다. 1 mL 칼럼이 양전하성-소수성 크로마토그래피 미디엄(Capto adhere, GE Healthcare)으로 충진되고 동일한 조건에서 평형화되었다. 용해된 IgG가 칼럼에 적용되고, 잔여 PEG가 결합되면서 IgG가 결합되고 일부 오염물들도 결합된 것으로 이해되었다. 평형 버퍼를 갖는 6 칼럼 부피의 세척액이 적용되어 보다 강하게 미결합 성분들을 시스템으로부터 제거하였다. IgG는 50 mM HEPES, 300 mM NaCl, pH 7.0으로 종결되는 10 칼럼 부피 선형 그래디언트로 용출되었다. 정제 성능은 하기의 표에서 표시되며, post-con은 조절-이후(post-conditions), post-NP는 나노입자 이후(post nanoparticles), 및 post-CA는 Capto adhere이후(post Capto adhere)를 나타낸다. 회수(recovery) 아래의 좌측 값은 그 단계에 대한 회수를 표시하며, 우측 값은 그 단계에 이전 단계들의 축적 회수를 표시한다. bld는 검출한계 미만(below limit of detection)을 나타낸다. 추가적인 상세사항은 Gagnon et al 2014 supra를 참조할 수 있다.
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실시예 11
176,244 ppm 호스트 단백질 오염물 및 19% 응집체들을 함유한 IgG-함유 세포 배양 수확물을 1% 알란토인, 4% 양전하성 금속 친화성 입자들(TREN 40 high)의 첨가에 의해 조절되고, 상온에서 4 시간동안 혼합되었다. 분석을 위해 제거된 샘플은 90,259 ppm의 호스트 단백질 및 응집물 1.2%로 감소를 나타냈다. pH는 5.2로 감소되고, 0.5% 카프릴산이 첨가되고, 혼합물은 2 시간 동안 인큐베이션되었다. 분석을 위해 제거된 샘플은 1,758 ppm의 호스트 단백질 약 0.4%의 응집물로 감소를 나타냈다. 고체들은 양전하성 뎁스 필터(Sartorius PC1)를 통해 제거되었다. 호스트 단백질은 135 ppm로 감소되고, 응집물은 0.05% 미만으로 감소되었다. 항체는 pH 7.0에서 18% PEG-6000 내에서 침전에 의해 정제되었다. 침전물은 1.8 M 암모늄 설페이트로 세척되어 PEG를 제거하고, 이어서 항체는 50 mM Hepes, pH 7.0 내에서 재용해되었다. 호스트 단백질은 32 ppm으로 감소되었다. 50 mM Tris, pH 8.0에서 배제 모드가 없이 동작하는 음이온 교환 크로마토그래피(UNOsphere Q, Bio-Rad)에 적용 후에, 호스트 단백질은 1 ppm 미만으로 감소되었다. 800 mM NaCl의 존재 하에 수행되되는 PEG 침전에서만 차이가 있는 병행 실험은 호스트 단백질은 1 ppm 미만으로 감소시켰다. 상기 음이온 교환 단계는 호스트 단백질 및 응집물들을 검출불능한 레벨로 감소시켰다. 배제 모드가 없는(in void exclusion mode) 음이온 교환 크로마토그래피 방법은 R. Nian et al (J. Chromatogr. A 1282 (2013) 127-132)에 설명되어 있다.
실시예 12
286,010 ppm 호스트 단백질 오염물 및 23% 응집물을 함유하는 IgG-함유 세포 배양 수확물을 1% 알란토인 및 0.025% 에타크리딘 첨가에 의해 조절하고, 상온에서 1 시간 동안 교반하며 인큐베이션하였다. 입자들의 1:1:1 혼합물(Chelex-100, MacroPrep tButyl, Macroprep High Q, Bio-Rad)이 혼합되어, 생리학적 조건으로 평형화되고, 안정화된 혼합 입자들이 조합량 5%로 상기 수확물에 첨가되고, 상온에서 2 시간 동안 혼합되었다. 호스트 단백질은 43,058 ppm, 및 응집물들은 3.4%로 감소하였다. pH 8.0에서 수행된 일 시리즈의 실험들에서, 샘플은 분리된 실험들에서 농도가 600 mM, 800 mM, 900 mM, 및 1000 mM (1 M)인 PEG-6000으로 침전에 의해 분류되었다. 이어서, 침전물은 PEG, 50 mM Tris, pH 8.0 내에서 세척되고, 이후 항체는 50 mM Tris, pH 8.0. 내에서 재용해되었다. 상기의 실험들에서 호스트 단백질은 각각 51, 55, 45, 및 41 ppm으로 감소되었다. Dowex AG1X2 (Bio-Rad) 형태의 음이온 교환 입자들이 각 샘플에 5% v/v의 양으로 첨가되고, 60분 동안 혼합되었다. 상기 실험에 걸쳐 호스트 단백질은 16, 17, 15, 및 13 ppm으로 감소되었다. 또 다른 시리즈의 실험들이 수행되었으며, 최초 PEG 침전이 pH 7.0에서 수행된 것을 제외하고는 모든 상세사항은 동일하였다. PEG 단계 후, 호스트 단백질은 600 mM NaCl 트랙에서 44 ppm, 800 mM 트랙에서 43 ppm, 900 mM 트랙에서 29 ppm, 및 1000 mM 트랙에서 31 ppm이었다. Dowex 처리 이후, 호스트 단백질은 각각 20, 17, 12, 및 16 ppm으로 감소하였다.
실시예 13
286,010 ppm 호스트 단백질 오염물 및 23% 응집물들을 함유한 IgG-함유 세포 배양 수확물을 1% 알란토인 및 0.025% 에타크리딘으로 조절하고, 상온에서 1시간 동안 교반하며 인큐베이션하였다. 입자들의 1:1:1:1 혼합물(Chelex-100, MacroPrep tButyl, MacroPrep High Q from Bio-Rad), 및 양전하성 금속 친화성 입자들(TREN 40 high from Bio-Works)이 혼합되고, 생리학적 조건으로 평형화되고, 안정화된 혼합 입자들은 조합량 5%로 상기 수확물에 첨가되었고, 이어서 상온에서 2 시간 동안 혼합되었다. 호스트 단백질은 38,061 ppm으로 감소되었으며, 응집물은 1.4%로 감소되었다. pH 8.0에서 수행된 일 시리즈의 실험들에서, 샘플은 PEG-6000으로 침전에 의해 분별되었고, 분리된 실험들에서 NaCl의 농도가 600 mM, 800 mM, 900 mM, 및 1000 mM(1 M)이었다. 침전물들은 PEG, 50 mM Tris, pH 8.0에서 세척되고, 이후 항체는 50 mM Tris, pH 8.0에서 재용해되었다. 호스트 단백질은 각각 79, 69, 56, 및 57 ppm으로 감소되었다. Dowex AG1X2(Bio-Rad) 형태의 음이온 교환 입자들이 각 샘플에 5% v/v의 양으로 첨가되고, 60분 동안 혼합되었다. 상기 시리즈에 걸쳐 호스트 단백질은 18, 17, 16, 및 13 ppm으로 감소되었다. 또 다른 실험들의 시리즈가 수행되었으며, 최초 PEG 침전이 pH 7.0에서 수행된 것을 제외하고 모든 상세 사항들은 동일하였다. PEG 단계이후 호스트 단백질은 600 mM NaCl 트랙에서 94 ppm, 800 mM track에서 62 ppm, 900 mM 트랙에서 67 ppm, 및 1000 mM 트랙에서 46 ppm이었다. Dowex 처리 이후, 호스트 단백질은 각각 28, 9, 23, 및 17 ppm으로 감소되었다.
실시예 14
321,483 ppm 호스트 단백질 및 26% 응집물들을 함유한 IgM 함유 세포 배양 수확물을 1% 알란토인, 0.025% 에타크리딘, 및 NaCl 첨가에 의해 조절되어 25 mS/cm의 전도도를 생성하였다. 혼합물은 1 시간 동안 인큐베이션되고, 고체들은 원심분리에 의해 제거되었으며, 액체는 동일 비율의 MacroPrep Tbutyl, Macroprep High Q, Macroprep High S, 및 Chelex 100으로 충진된 칼럼을 통과시켰으며, 칼럼의 수확물에 대한 부피비는 5%였다. 호스트 단백질은 73,663 ppm으로 감소되었고, 응집물들은 0.8%로 감소되었다. 샘플은 모두 pH 7에서 13% PEG-6000으로, 하나는 100 mM NaCl, 다른 하나는 800 mM NaCl으로 병행실시에 의해, 그러나 별개 실험들을 통해 분별되었다. 침전물들은 13% PEG, 50 mM Hepes, pH 7.0로 세척되어 과량의 염을 제거하였고, IgM은 50 mM Hepes, pH 7.0에서 재용해되었다. 100 mM NaCl에서 호스트 단백질은 7,411 ppm으로 감소되었다. 800 mM NaCl에서 호스트 단백질은 417 ppm으로 감소되었다. 응집물 함량은 1.1%로 증가하였다. 샘플들은 pH 7.0에서 음이온 교환 모노리스(CIM QA, BIA Separations)에 적용되어, 소듐 클로라이드 그래디언트로 용출되었다. 100 mM NaCl에서의 PEG 침전에 상응하는 샘플 내의 호스트 단백질은 1.424 ppm으로 감소되었다. 800 mM NaCl에서 PEG 침전에 상응하는 샘플내의 호스트 단백질은 63 ppm으로 감소되었다. 응집물들은 두 제제들에서 0.01% 미만이었다.
실시예 15
관능화된 입자들에 의한 처리와 결합되어 카프릴 산 침전에 의한 오염물 제거에 이어서, 800 mM NaCl에서 PEG 침전이 수행되었다. 다른 양의 카프릴 산이 원심분리에 의해 정화된 세포 배양 수확물에 첨가되어 최종 농도는 각각 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 및 0.5%로 조절되었다. 알란토인이 각 샘플에 첨가되어 최종 농도는 1%가 되었다. pH 및 염 농도는 조절되지 않았다. 0.4 카프릴산에서 최종 pH는 5.4였다. 혼합물은 2 시간 동안 교반되었다. 고체들은 샘플을 0.22ㅅm 마이크로필터를 통과시켜 제거되었다. 여과물은 이후 TREN을 함유한 다공성 입자들, 이미노디아세트산, 및 부틸 리간드(각각 WORKBEADS™ TREN 40 High from BioWorks, Chelex-100 from Bio-Rad, 및 Macro-Prep T-butyl from Bio-Rad)의 동등 혼합물을 함유한 칼럼을 통과시켰으며, 입자들의 조합 부피는 적용된 샘플 부피의 5%였다. 호스트 세포 단백질은 최초 수확물 내 IgG 242,888 ppm에서 0.1% 카프릴산 내 233,318; 0.2% 내 193,400 ppm; 0.3% 내 57,519 ppm; 0.4% 내 38,602 ppm; 및 0.5% 내 42,666 ppm으로 감소하였다. 자유 경쇄 및 경쇄 이합체를 포함하는 IgG 절편들은 수확물 내에서 12.2% 로부터 0.3% 카프릴산에서 5.3%; 0.4%에서 3.4%; 및 0.5% 카프릴 산에서 3.6%로 감소하였다. 0.1 및 0.2% 카프릴 산에서는 절편 감소는 없었다. 응집물들은 수확물 내 1.28%로부터, 0.1% 카프릴 산 내 1.22%, 0.2% 카프릴 산 내 0.87%, 0.3% 카프릴산 내 0.31%, 및 0.4 및 0.5% 카프릴 산에서는 검출불능 수준으로 감소하였다. 카프릴 산 농도들에 걸쳐 IgG 회수는 0.1% 카프릴 산에서 99%, 0.2%에서 99%, 0.3%에서 95%, 0.4%에서 99%, 및 0.5%에서 95%였다. 다공성 입자들의 혼합물로의 처리 후에, 호스트 단백질은 0.4% 카프릴 산으로 처리된 샘플 내에서 4205 ppm으로 감소되었으며, 이는 98% 감소를 나타내며, 1% 절편과 및 검출가능한 응집물들이 없이 99% 순도보다 높은 항체를 잔류시키고, 전체적인 IgG 회수는 99%였다. 상기 항체는 0.5% PEG, 800 mM NaCl, 50 mM Hepes, pH 7.0에서 수행된 폴리에틸렌글리콜(PEG-6000)으로 침전에 의해 추가적으로 정제되었다. 0.4% 카프릴산으로 처리된 수확물의 PEG 침전 후에, 호스트 단백질들은 11 ppm으로 감소되고, 응집물들은 0.09%로 감소되었으며, 경쇄 절편들은 검출되지 않았다. 0.5% 카프릴산으로 처리된 수확물의 PEG 침전 후에, 호스트 단백질은 13 ppm으로 감소되고, 응집물은 0.1%로 감소되고, 경쇄 절편은 검출되지 않았다. 이러한 결과들은 모두 호스트 단백질의 99.9995% 감소에 상응한다. 수확물이 본 방법에 의해 처리되지 않은 병행 통제 실험에서, PEG 침전은 호스트 단백질을 67,687 ppm으로 감소시켰다. 본 출원에 개시된 방법에 의해 제공되는 6,000배 이상의 향상은 두가지의 뚜렷한 이점들을 제공한다. 명백한 이점은 본 방법에 의한 호스트 단백질 오염의 감소는 호스트 단백질 오염의 더 큰 감소를 획득하는 후속 방법들을 허용한다는 점이다. 이는 또한, 개시된 방법들이 특히 정제 방법 자체의 능력을 방해하는 오염물들을 제거하여 최상의 결과를 획득한다는 이점을 부가시킨다.
본 실시예들은 다른 정제 방법들과 조합되어 너 높은 레벨의 정제를 획득할 수 있다. 이러한 다른 정체 방법들의 예들은, 이에 제한되는 것은 아니나, 단백질 A와 같은 IgG 정제를 위해 공통으로 사용되는 다른 방법들 및 다른 형태의 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 고정화 금속 친화도 크로마토그래피, 및 추가적인 혼합 모드 크로마토그래피 방법들; 또한 침전, 결정화 및 액체-액체 추출 방법들을 포함한다. 다양한 방법들의 적절한 조건들을 개발하고 이를 본 출원에 개시된 방법들에 병합하여 특정 항체의 필요한 정제를 획득하는 것은 통상의 기술자의 이해 범위 내에 있다.
언급된 모든 참조 문헌들은 전체로서 참조로 병합되고, 각 개별 문헌 또는 특허 또는 특허 출원은 특정적으로 그리고 개별적으로 모든 목적을 위해 전체로서 참조로서 병합되는 것처럼 동일한 정도의 모든 목적으로 병합된다. 참조로서 병합된 문헌들 및 특허들 또는 특허 출원들이 본 명세서에 포함된 개시 내용과 모순되는 경우, 명세서는 이러한 모순점에 대해 우위를 가지고 대체하는 것으로 의도된다.
명세서 및 청구항들에 사용된 성분들, 크로마토그래피 조건들 등의 양을 표현하는 모든 숫자들은 용어"약(about)"에 의해 모든 경우에서 변형되는 것으로 이해된다. 따라서, 반대로 지시되지 않는 한, 명세서에 제공되며 청구항에 포함된 수치 변수들은 본 출원에 개시된 방법들에 의해 추구되는 원하는 성능에 따라 변화할 수 있는 대략적인 값들이다.
본 출원에 개시된 방법들의 많은 변형들 및 변경들은 통상의 기술자에게 명백하게 이해되는 바와 같이, 그 사상 및 범위로부터 벗어남이 없이 수행될 수 있다. 개시된 특정 실시예들은 단지 예시적으로 설명된 것이며, 어떤 방식으로든 제한적인 의도는 아니다. 명세서 및 실시예들은 단지 예로서 제공되는 것이며, 개시된 실시예들의 진정한 범위 및 사상은 하기의 청구항들에 의해 나타나는 것으로 의도된다.

Claims (24)

  1. 단백질 제제로부터 원하는 단백질을 정제하는 방법으로서,
    상기 단백질 제제를 선택적으로 과포화된 알란토인의 존재 하에 용해성 유기 다가 이온들, 고정화된 유기 다가 이온들 또는 양자 모두로 처리함에 의해 조절하여(conditioning), 적어도 90%의 크로마틴을 제거하고, 이어서
    (1) 생리학적 농도보다 높은 비-단백질-침전 염들의 존재 하에 비-이온성 유기 고분자로 상기 원하는 단백질을 침전시켜 상기 원하는 단백질의 침전물을 제공하고; 또는
    (2) 생리학적 농도보다 높은 비-침전 염들의 부존재 하에 비이온성 유기 고분자로 상기 원하는 단백질을 침전시켜 침전물을 제공하고 이어서 상기 침전물을 생리학적 농도보다 높은 비-단백질-침전 염들의 존재 하에 비이온성 유기 고분자로 상기 침전물을 세척하고;
    상기 침전 또는 세척 단계는 선택적으로 단백질-침전 염의 실질적 부존재 하에 수행되고, 그리고 선택적으로 상기 원하는 단백질의 pH를 상기 원하는 단백질의 등전점의 0.5 pH 단위 내의 값으로 조절하는 것 없이 수행되며; 그리고
    선택적으로 상기 침전물을 비이온성 유기 고분자의 부존재 하에 단백질-침전 염으로 세척하는 것을 포함하며, 상기 침전 염은 상기 원하는 단백질을 침전된 상태로 유지하기에 충분한 농도로 존재하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단백질 제제를 유기 다가 이온들로 조절하는 것(conditioning)은 샘플을 양전하성 유기 첨가물에 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 양전하성 유기 첨가물은 메틸렌 블루(methylene blue), 에타크리딘(ethacridine), 클로르헥시딘(chlorhexidine), 벤잘코늄 클로라이드(benzalkonium chloride), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide)로 구성된 용해성 양이온들의 그룹으로부터의 일 이상인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 양전하성 유기 첨가물은 일차 아미노 그룹, 이차 아미노 그룹, 삼차 아미노 그룹, 사차 아미노 그룹, 일 이상 종류의 아미노 그룹에 의해 부여된 일 보다 큰 양전하들을 함유하는 복합 양이온을 포함하며, 고체 표면에의 고정화에 의해 불용성인 양이온으로 구성된 그룹으로부터의 일 이상인 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 양전하성 유기 첨가물은 고체 상에 고정된 2(아미노에틸)아민(TREN)인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 단백질 제제를 유기 다가 양이온들로 조절하는 것은 샘플을 음전하성 유기 첨가물에 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 음전하성 유기 첨가물은 헵탄산, 옥탄산, 옥텐산, 노난산, 노넨산, 데칸산, 메틸 블루로 구성된 용해성 음이온들의 그룹으로부터의 일 이상인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 음전하성 유기 첨가물은 포스포(phospho) 그룹, 카르복실 그룹, 설포(sulfo) 그룹, 일 이상의 종류의 음전하 그룹에 의해 부여된 일 보다 큰 음전하를 함유한 복합 음이온을 포함하며, 고체 표면 상에서의 고정화에 의해 불용성인 음이온으로 구성된 그룹으로부터의 일 이상인 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 음전하성 유기 첨가물은 이미노디아세트산(iminodiacetic acid), 니트릴로아세트산(nitriloacetic acid), 또는 둘의 조합인 방법.
  10. 제2항 또는 제6항에 있어서, 음전하성 유기 첨가물 또는 양전하성 유기 첨가물은 금속 이온들에 대해 1:1 친화도를 갖는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 알란토인이 포함되는 경우 0.6 내지 50%, 0.7 내지 20%, 0.8 내지 10%, 0.9 내지 5%, 1 내지 2%, 또는 중간값으로 구성된 그룹으로부터의 범위의 과포화 농도로 존재하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 비이온성 유기 고분자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 고분자 사이즈는 1000 내지 12,000 Daltons (D), 2000 내지 8,000 D, 3000 내지 6000 D, 또는 1500 D, 3500 D, 4000 D, 6000 D로 구성된 그룹으로부터의 하나와 같은 중간 사이즈로 구성된 그룹으로부터의 범위인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 비-단백질-침전 염은 소듐 아세테이트, 포타슘 아세테이트, 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 및 이의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나를 포함하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 비-단백질-침전 염은 상기 비이온성 유기 고분자 첨가 후의 염 농도가 적어도 0.05M 내지 2.0M 범위의 증분으로 생리학적 농도보다 크기에 충분한 양으로 조절된 세포 배양 수확물에 첨가되는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 비-단백질-침전 염들의 개별 염 또는 조합이 세포 배양 수확물에 첨가되어 전체 염 농도를 정상 생리학적 염 함량 보다 상승시키고, 과량의 비-단백질-침전 염이 상기 비이온성 유기 고분자의 첨가와 결합되어 유지되는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 비-단백질-침전 염이 상기 비이온성 유기 고분자의 첨가와 결합되어 단백질 제제에 첨가되어 최종 염 농도는 적어도 0.05M 증분으로 정상 생리학적 농도보다 큰 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 비-단백질 침전 염이 첨가되어 상기 단백질 제제의 총 염 농도는 200 mM 내지 2 M, 300 mM 내지 1.5 M, 400 mM 내지 1 M, 500 mM 내지 800 mM, 또는 중간 값으로 구성된 그룹으로부터의 범위에서 정상 생리학적 값보다 높은 방법.
  19. 제1항에 있어서, 적어도 0.2M의 농도로 상기 비-침전 염이 세척 용액 내에 포함되어 상기 침전물 내에 이미 존재하는 과량을 유지시키는 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 비-침전 염이 최초 침전 단계에서 부존재할 때, 이는 적어도 하나의 세척 단계에서 포함되는 방법.
  21. 제1항에 있어서, 침전물은 상기 원하는 단백질을 침전된 상태로 유지하기에 충분한 농도의 일 이상의 침전염들로 세척되는 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 침전 염은 소듐 설페이트, 포타슘 설페이트, 암모늄 설페이트, 소듐 포스페이트, 포타슘 포스페이트, 암모늄 포스페이트, 소듐 시트레이트, 포타슘 시트레이트, 암모늄 시트레이트, 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  23. 제1항에 있어서, 상기 원하는 단백질은 천연 발생 단백질, 재조합 단백질, 항체, 모노클로날 항체, IgG 항체, 또는 IgM 항체인 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 제제는 체액, 밀크(milk), 플라즈마, 세럼(serum), 또는 세포 배양 수확물인 방법.
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