CN106164086A - 抗体纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种纯化目标抗体的方法，所述方法包括：使包含至少一种目标抗体的细胞培养收获物或蛋白质制剂与至少一种具有7至10个碳原子的脂肪酸接触以形成混合物；使所述混合物与尿囊素接触；以及然后分离固体材料以提供包含所述目标抗体的溶液。固体材料可通过过滤、沉降或离心来移除，并且所述脂肪酸可以是葡萄花酸、羊脂酸、天竺葵酸、壬烯酸或羊蜡酸。本发明还涉及用于促进所述抗体纯化方法的试剂盒。

Description

抗体纯化方法

背景技术

本文所公开的实施方案涉及用于纯化蛋白质，包括抗体，例如IgG和IgM抗体的方法。

蛋白质的纯化通常从净化步骤开始，在该步骤中移除细胞和碎片，使得剩余上清液可以通过原本会因细胞和碎片的存在而受阻碍的方法进行处理。它们的移除通常涉及物理方法，例如离心和过滤。这个步骤有时涉及使用具有阴离子交换能力的过滤材料，或者直接向含抗体的收获物中添加阴离子交换粒子或可溶性聚合物(Gagnon,P.,PurificationTools for Monoclonal Antibodies,Validated Biosystems,Tucson,1996；Kuczewski,M.等人，Biopharm Int.23(3)(2010)20-25；Kuczewski,M.等人，Biotechnol.J.,6(2011)56-65)。

已经描述了用尿囊素、可溶性有机阳离子和混合粒子对物理净化的细胞培养收获物进行二级处理(Gan,H.等人，J.Chromatogr.A,1291(2013)33-40)。这种方法特别降低由死细胞排出的染色质的含量以及与染色质有关的聚集体的水平，但随后需要三个色谱步骤以获得期望的纯度。尿囊素是FDA批准的广泛用于非处方保健品中的抗炎剂。已知显然可以通过氢键合从蛋白质溶液，包括从IgG溶液移除内毒素(Vagenende等人，ACS.Appl.Mater.Interfaces,22(2013)4472-4478；Vagenende等人，J.Chromatogr.A1310(2013)15-20)。

已经公开了通过用羊脂酸(辛酸)进行污染物共沉淀而对IgG抗体进行部分纯化(Chantuin,A.等人，Arch.Biochem.Biophys.89(1960)218-220；McKinney,M.等人，J.Immunol.Met.,96(1987)271-278)。脂肪酸结合所有的蛋白质，但往往特别使酸性非IgG污染物沉淀(Gagnon，见上文；Morais,V.等人，Biotechnol.Appl.Biochem.,59(2012)50-54)。已经指出(Gagnon，见上文)应用于细胞培养收获物的机制和方法开发准则，包括基本变量，例如羊脂酸浓度、pH、盐浓度、温度以及对用以从可溶性IgG制剂移除残余羊脂酸的后续色谱步骤的需要。该技术最通常被描述为制备粗样品以通过其它手段进行后续纯化(Gagnon，见上文；Y.Yigsaw等人，2008,Improving upstream feed stock to downstreamoperations,Recovery of Biologics Conference XIII,Quebec；Arunakumari,A.等人，美国专利申请20120101262A1)，但也作为抛光步骤在通过蛋白A亲和色谱捕获抗体之后被应用(Y.Brodsky等人，Biotechnol.Bioeng.109(2012)2589-2598)。

发明内容

在一些方面中，本文所公开的实施方案涉及纯化目标蛋白质的方法，所述方法包括：使细胞培养收获物与至少一种具有7至10个碳原子的脂肪酸以及过饱和浓度的尿囊素接触以形成混合物；以及分离固体材料以提供包含所述目标蛋白质的具有降低的污染物负荷的溶液。如果需要，经处理的液体可以在通过其它纯化方法进行处理之前任选地进一步通过具有包含正电荷的内部接触表面的装置。

在一些方面中，本文所公开的实施方案涉及用于纯化抗体的方法，所述方法包括：使细胞培养收获物与至少一种具有7至10个碳原子的脂肪酸接触以形成混合物；使所述混合物与尿囊素接触；以及使所述混合物与非离子性或阳离子性表面活性剂接触，然后移除固体材料，之后提供包含所述抗体的溶液。

具体实施方式

已经发现，彼此化学拮抗的材料的组合具有与单独依赖于任何一种材料的纯化方法相比以较高水平的纯度和较低水平的浊度提供包括抗体在内的目标蛋白质的出人意料的效果。拮抗材料的组合通常会被预期相互抵消个体效果以及导致低劣的蛋白质纯化、低劣的蛋白质回收率或两者。相反，本实施方案提供限定的窗口，在所述窗口内材料协同工作，以实现实质上超过任何单个组分所提供的能力的蛋白质纯度和回收率水平。这些观察特别适用于抗体，例如IgG和IgM抗体。另外，实验结果表明，组合中的每种组分的反应性曲线与其单独使用时的反应性曲线有所不同。这突出了本文所公开的实施方案的效用不能由单个组分的已知性质或应用来预测。待组合的组分特别包括含有7个或8个或9个或10个碳原子的饱和脂肪酸，或者含有6个或7个或8个或9个碳原子以及1个双键的不饱和脂肪酸；以及带有正电荷的可溶性和/或固体材料。它们可进一步包括尿囊素。在本文所公开的方法中，材料被组合在含有目标蛋白质，例如一种抗体的液体制剂中，然后在合适的孵育时间后，移除固体以提供包含所述抗体的溶液。

实验数据表明本文所公开的方法中使用的组分之间的相互拮抗的相互作用。在相互拮抗的一个实例中，已经通过实验显示结晶尿囊素结合细胞培养收获物中的超过99％的脂肪酸，这表明其以类似方式作用于所添加脂肪酸的高的可能性。预期这会降低出于使非抗体污染物沉淀的目的而添加至含有抗体的细胞培养收获物中的脂肪酸的有效性。与此相反，本文所公开的方法的这个方面有助于在低于科学文献中报告为最佳的水平的一半的浓度下脂肪酸的有效使用。不受理论的束缚，这可能是因为通过氢键合络合到未溶解尿囊素的脂肪酸保存其天然电荷、疏水性和结合污染物的能力，同时未溶解尿囊素的物理密度增强其通过沉降的移除。在相互拮抗的另一实例中，添加非常低浓度的非离子性表面活性剂令人惊讶地改善移除游离轻链污染物的有效性，而较大量会损害酸性非抗体蛋白的移除，所述非离子性表面活性剂削弱疏水相互作用并且由此预期会干扰脂肪酸实现其效果的能力。在另一个更令人惊讶的实例中，低水平的干扰脂肪酸的电荷和疏水效果两者的阳离子性表面活性剂大致会使组合移除酸性非抗体蛋白的能力加倍，而较高浓度则具有相反的效果。这些实例突出了当将通常拮抗的组分以适当平衡比例组合时，它们产生可以移除污染物的窗口，所述污染物在不存在此类拮抗剂下不会有效地被移除。

已经进一步发现，尿囊素的纳入特别增强脂肪酸沉淀移除微粒的能力。不受理论的束缚，据信尿囊素的效果通过氢键合介导，通过氢键合，大分子集聚物，包括超小粒子，包括病毒结合至较大的尿囊素晶体。由于其1.45克/立方厘米的相对高的密度，尿囊素晶体促进缔合材料的快速重力沉降，并增强其通过离心的沉降。尿囊素晶体也改变脂肪酸-污染物沉淀的物理构成，从典型胶质污泥改变为促进液体通过并提高过滤效率的更像蛋糕的稠度。添加至水溶液中的一部分尿囊素溶解，最多为约36mM，并且据信会削弱蛋白质与脂肪酸的相互作用。溶解的尿囊素被理解为在移除固体后保留在含有抗体的溶液中。虽然这些特征是受欢迎的，但它们代表悖论，因为实验数据表明尿囊素结合99.7％的来自细胞培养收获物的脂肪酸。这意味着，尿囊素的比例理想地仔细进行控制。对于给定应用，适当的比例通过简单的实验来确定，通常从1-2％(w/v)开始。

还已经发现，本文所公开的方法出人意料地允许用具有7个或9个或10个碳原子的饱和脂肪酸代替羊脂酸。葡萄花酸(庚酸)含有7个碳。天竺葵酸(壬酸)含有9个碳。羊蜡酸(癸酸)含有10个碳。甚至更令人惊讶地，具有6个或7个或8个或9个碳原子以及1个双键的不饱和脂肪酸是有效的。尽管在科学文献中除辛酸以外的物质被忽视用于抗体纯化，但实验数据表明，与羊脂酸相比，更疏水的脂肪酸更有效地移除抗体聚集体和片段，虽然降低抗体回收率的风险更高。

在示出本文所公开的方法的许多方面的整合的一个例示性实施方案中，将尿囊素以产生1％(w/v)的最终浓度的量添加至含有抗体的细胞培养收获物中，随后以产生0.3％(v:v)的最终浓度的量添加壬酸。将混合物孵育2小时，在此期间通过壬酸与污染物的相互作用形成沉淀，并且其穿插有未溶解的尿囊素晶体。终止混合，并通过任何便利的方法移除固体，所述固体由壬酸-尿囊素-污染物沉淀、残余壬酸和未溶解的尿囊素组成。在一个相关实施方案中，基本上无固体的含有抗体的液体进一步通过流过正电性深层过滤器或其它装置进行处理，在所述装置中样品接触正电性或其它官能化表面，并且所述装置可提供从样品清除残余脂肪酸或其它可溶性非抗体物质的额外益处。

在示出本文所公开的方法的各个方面的整合的另一例示性实施方案中，将尿囊素以产生2％(w/v)的最终浓度的量添加至细胞培养收获物中，随后以产生0.2％(v:v)的最终浓度的量添加羊蜡酸。将混合物孵育2小时，在此期间通过羊蜡酸与污染物的相互作用形成沉淀，并且其穿插有未溶解的尿囊素晶体。然后使混合物与包含至少一种官能化固体的装置接触，所述装置保留穿插有未溶解的尿囊素的羊蜡酸-污染物沉淀，但允许液体通过。

在示出本文所公开的方法的各个方面的整合的另一例示性实施方案中，将尿囊素以产生1％(w/v)的最终浓度的量添加至细胞培养收获物中，随后以产生0.5％(v:v)的最终浓度的量添加壬烯酸。将混合物孵育2小时，在此期间通过壬烯酸与污染物的相互作用形成沉淀，并且其穿插有未溶解的尿囊素晶体。通过任何便利的方法移除穿插有未溶解的尿囊素的壬烯酸-尿囊素-污染物沉淀。

在一些实施方案中，约0.2％的羊蜡酸可以用约0.3％的浓度的天竺葵酸或约0.4％的浓度的羊脂酸或约0.6％的浓度的葡萄花酸代替。这揭示了污染物移除和抗体回收率对脂肪酸的浓度和疏水性的依赖性。已经观察到，脂肪酸的疏水性越强，实现良好结果所需要的浓度越低，并且损害IgG抗体回收率的浓度越低。应当理解，绝对浓度和相对浓度可因抗体而异，并且特定脂肪酸的上述浓度可因此而变化，但提供此类值旨在告知本领域技术人员在评估新抗体系统中的纯化时方便的起点。

在一些实施方案中，约0.2％的羊脂酸可比在较高浓度下支持更有效的聚集体移除。然而，在约0.4％下，可以实现游离抗体轻链、轻链二聚体和其它片段形式、以及其它污染物的更有效移除。因此，本领域技术人员应认识到通过考虑给定脂肪酸在潜在后续分级分离方法的情形中的效果来优化给定脂肪酸的浓度的价值。如果在本文所公开的方法之后是特别适合于移除聚集体的方法，则优化脂肪酸浓度以移除抗体片段可能是有益的。如果在本文所公开的方法之后是特别适合于移除片段的方法，则优化脂肪酸浓度以移除聚集体可能是有益的。

在一些实施方案中，尿囊素可在脂肪酸之后添加。在另一相关实施方案中，尿囊素直至沉淀形成之后才添加。在另一实施方案中，尿囊素直至沉淀移除之后才添加。在一些实施方案中，尿囊素被省略。

在一些实施方案中，可向混合物中添加非离子性表面活性剂或两性离子性表面活性剂，所述表面活性剂的浓度低于其临界胶束浓度。实验数据表明，这改善抗体片段的移除，而高于临界胶束浓度的表面活性剂浓度会抑制抗体片段的移除，尽管具有增加抗体回收率的补偿益处。在一些实施方案中，实质上更高浓度的非离子性或两性离子性表面活性剂可实质上损害酸性宿主细胞蛋白的减少。

在一些实施方案中，低浓度的阳离子性表面活性剂可实质上增强宿主蛋白和DNA的移除。在一些此类实施方案中，阳离子性表面活性剂是十六烷基三甲基溴化铵，也称为鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)；或十二烷基三甲基溴化铵；或癸基三甲基溴化铵；或肉豆蔻基三甲基溴化铵；或三甲基十八烷基溴化铵，或者具有不同的带正电荷部分，例如伯氨基、仲氨基或叔氨基的变体，或者具有更多或更少的碳原子的变体。在一些此类实施方案中，0.01％CTAB可使所移除的宿主蛋白的量加倍，而0.05％CTAB可使移除效率降低至五分之一。

在一些实施方案中，一种或多种化学官能化固体可以用经相同或类似部分化学官能化的可溶性实体代替或与其组合。

在一些实施方案中，固体可以通过任何便利的方法从含有抗体的溶液分离，包括过滤或沉降，包括一种或多种来自包括微过滤、深层过滤和离心的组的处理，其中深层过滤可以用基本上惰性的过滤介质或用经化学官能化或者与经化学官能化的材料组合的过滤介质执行。

在一些实施方案中，尿囊素可以约0.6％至约30％、或约1％至约30％、或约1％至约10％、或约1％至约2％的重量/体积浓度添加。在一些实施方案中，尿囊素可被省略。在一些实施方案中，尿囊素可以至多约0.6％的非零量存在。尽管期望尿囊素以足以使一部分所添加的尿囊素不溶解的浓度，例如1％存在，但所述方法可以在不存在尿囊素下或者在存在其中基本上所有尿囊素都可溶的浓度的尿囊素下产生足够的结果。实验数据表明，更大比例，例如2％、3％、4％、5％、10％或更高比例的尿囊素支持更有效地减少聚集体，但也中等程度但可测量地降低抗体回收率。实验数据还表明，尿囊素可独立地使病毒和内毒素的水平降低3个对数或更多，并且通常产生显著澄清(2.0NTU)的上清液，所有这些证明当使用时，尿囊素对本文所公开的方法作出有利的贡献。不受任何特定理论束缚，似乎尿囊素与大的生物物质和集聚物的作用机制主要涉及氢键合，这可部分解释为何其有效性几乎不受pH或电导率的实质性变化所影响。这也可解释了为何结合至尿囊素的脂肪酸保留其与污染物的交互性。

在一些实施方案中，脂肪酸可包括一种或多种一般结构式为CH₃(CH₂)_nCOOH的物质，其中n是4至12的整数，包括4和12。在一些实施方案中，n是5至8的整数。在一些此类实施方案中，脂肪酸可以是葡萄花酸(庚酸)。在一些此类实施方案中，脂肪酸可以是羊脂酸(辛酸)。在一些此类实施方案中，脂肪酸可以是天竺葵酸(壬酸)。在一些此类实施方案中，脂肪酸可以是羊蜡酸(癸酸)。在一些实施方案中，可使用多于一种的脂肪酸种类。在一些实施方案中，脂肪酸可以盐，例如钠盐，例如辛酸钠的形式添加。在一些实施方案中，脂肪酸的脂肪部分可由碳原子的线性“直”链组成。在一些实施方案中，脂肪酸的脂肪部分可由支化链组成，例如2-乙基己酸，其在主6-碳链的2位含有2-碳链，从而产生总共8个碳原子。在一些实施方案中，脂肪酸可以0.05％至5％、或0.1％至2％、或0.2％至0.5％、或中间值的浓度存在。

在一些实施方案中，脂肪酸可包含双键。在一些此类实施方案中，双键可位于碳链的任何位置。在一些此类实施方案中，脂肪酸链可含有6个或7个或8个或9个碳原子。在一个此类实施方案中，脂肪酸是具有末端双键的壬烯酸。在一些实施方案中，脂肪酸可以盐的形式添加。在一些实施方案中，脂肪酸可以0.05％至5％、或0.1％至2％、或0.2％至0.5％、或中间值的浓度存在。在一些此类实施方案中，0.4％至0.6％的8-壬烯酸比0.4％的羊脂酸提供更好的结果。

在使用多于一种的脂肪酸种类的一些实施方案中，可选择种类以涵盖一系列疏水性，例如庚酸和癸酸的组合，或者羊脂酸和壬酸的组合，或者其它组合，从而可能包括更强或更弱疏水性的脂肪酸。在一些此类实施方案中，各脂肪酸的比例可为10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10，或其间的任何中间范围，或这些之外的其它比率。在一些此类组合中，添加至工作溶液中的脂肪酸种类的总量可以在非零量到至多0.01％、0.01％至0.1％、0.1％至1％、1％至5％、0.2％至0.4％、或者中间范围或中间值的范围内。

在使用多于一种的脂肪酸种类的一些实施方案中，种类的总数可包括3种、或4种、或更多种；其呈实验结果显示提供效用的任何比例和任何总量。

在一些实施方案中，将脂肪酸在抗体制剂中孵育5至360分钟、或15至240分钟、或60至120分钟、或30至60分钟、或中间时间间隔，然后将混合物暴露于一种或多种官能化固体。

在一些实施方案中，脂肪酸的孵育温度可受所存在的最大脂肪酸种类影响，因为碳链长度直接影响脂肪酸的溶解度，其中链长度越短，溶解度就越高，并且其中链长度越长，溶解度随温度降低的减低就越大。因此，在所有情况下，约37℃的初始温度与更低温度相比会使更高浓度的脂肪酸溶剂化。这有利于在细胞培养终止后紧接着向收获物中直接添加脂肪酸。孵育可随后在37℃下仍然在生物反应器中继续进行。显而易见的是，脂肪酸的疏水性越强，其溶解度对温度就越敏感，并且因此其功能性对温度就越敏感。在一些实施方案中，较高的温度可允许使用高达C₁₂、C₁₃、C₁₄、C₁₅或甚至更高级的脂肪酸。在使用较低温度的一些实施方案中，例如其中处理在约2℃至约8℃下进行，使用较短链脂肪酸可以是有利的，例如C8、C7、C6或甚至更低级。

在一个实施方案中，本文所公开的方法可以不需要调节pH。添加脂肪酸可使收获物的pH降低到足够低的水平，并且随后通过所述一种或多种固体清除过量的脂肪酸可将pH基本上恢复到原始值。在一个实施方案中，可将收获物滴定至特定pH值，然后添加脂肪酸，这可以增加所述方法的鲁棒性，但潜在地出于制备样品以通过后续方法分级分离至更高纯度的目的，这可使在执行所述方法后再次调节pH成为必需。在一个实施方案中，可将初始pH调节至在4至6、或4.5至5.5、或4.75至5.25、或5.1至5.3的范围内的值、或中间值例如5.2、或另一中间值。本领域技术人员应当理解，最佳pH可因抗体种类而异，并且随抗体所在介质的组成而变化。同样应当理解，由于本文所公开的方法的额外要素的贡献，用以实现最佳效果的pH可以比单独使用脂肪酸沉淀所需要的pH更温和。这是值得注意的考虑因素，因为暴露于与传统使用脂肪酸沉淀有关的低pH值处在可能对抗体具有持久不利影响的范围内。这突出了所公开的方法的另一个出人意料的益处。

在一个实施方案中，本文所公开的方法不需要通过例如用水或NaCl或其它盐降低或增加盐浓度来调节电导率。然而，已知盐浓度会影响抗体的回收率和纯度，并且可在不脱离本方法的基本特征的前提下探讨变型。实验证据表明，独立于脂肪酸或其它添加剂的存在，在低电导率和低pH的条件下，抗体的溶解度会受到损害。较差的抗体溶解度转化为提高的伴随脂肪酸沉淀的显著抗体损失的概率。这意味着，pH的降低可限制电导率的降低程度，并且表明增加电导率可避免抗体的过量损失。值得注意的是，将电导率增加至高达20mS/cm基本上不会降低本文所公开的方法的有效性。这是值得注意的，因为据信电荷相互作用控制大部分的系统选择性，并且20mS/cm足以中止许多此类相互作用，并且实质上削弱所有此类相互作用。然而，应当理解，结果可能取决于所纯化的确切抗体而变化，并且在较低的电导率值下进行实验可能有价值。降低电导率似乎会因脂肪酸与污染蛋白的相互作用而增加阳离子固体的干扰，但通过增加阳离子固体结合可溶性污染物的能力会出人意料地产生改善的总体结果。

在一个或多个前述实施方案中，通过沉降或离心后沉降来移除在使细胞培养收获物与至少一种脂肪酸接触后或在分离步骤存在的固体材料。

在一个或多个前述实施方案中，通过过滤来移除在使细胞培养收获物与至少一种脂肪酸接触后或在分离步骤存在的固体材料。在一些此类实施方案中，过滤包括膜过滤或深层过滤。在一些此类实施方案中，膜过滤或深层过滤包括经官能化的滤膜。在一些此类实施方案中，至少一个官能团是正电性的。在一些此类实施方案中，至少一个官能团结合金属离子。

在一个或多个前述实施方案中，第一接触步骤在IgG抗体的部分纯化之后。

在一个或多个前述实施方案中，细胞培养收获物含有细胞。在一个或多个前述实施方案中，细胞培养收获物不含细胞。

在一个或多个前述实施方案中，所述至少一种脂肪酸包含CH₃(CH₂)_nCOOH的一般结构式。在一些此类实施方案中，所述至少一种脂肪酸包含葡萄花酸(庚酸)、或羊脂酸(辛酸)、或天竺葵酸、或羊蜡酸(癸酸)。在一些相关实施方案中，脂肪酸可在脂肪酸链的任何位置含有一个双键。在一些此类实施方案中，含有双键的脂肪酸是壬烯酸。在一些此类实施方案中，脂肪酸是8-壬烯酸。在一些实施方案中，主碳链可以是非支化的；在其它实施方案中，可以是支化的。

在一个或多个前述实施方案中，所述至少一种脂肪酸的存在浓度在选自由以下组成的组的范围内：(a)约0.05％至约5％，(b)约0.1％至约1.0％，(c)约0.2％至约0.4％，以及(d)约0.1％至约0.2％。

在一个或多个前述实施方案中，阳离子性表面活性剂的存在浓度可以是：(a)约0.001％至0.1％，(b)约0.005％至0.05％，(c)约0.0125％至0.025％。在一个或多个前述实施方案中，阳离子性表面活性剂可以是鲸蜡基三甲基溴化铵。

在一个或多个前述实施方案中，疏水性阳离子组分在性质上可以是芳族的，例如苯扎氯铵、或氯己定、或阿来西定。在一个此类实施方案中，氯己定的浓度可以在以下范围内：(a)约0.001％至0.01％，(b)约0.005％至0.05％，(c)约0.0075％至约0.0125％。

在一些实施方案中，提供用于纯化IgG抗体的方法，所述方法包括：使细胞培养收获物与至少一种具有8至10个碳原子的脂肪酸接触以形成混合物；使所述混合物与尿囊素接触；以及在使所述混合物与尿囊素接触后分离固体材料，以提供包含所述IgG抗体的溶液。

在一个或多个前述实施方案中，尿囊素的存在浓度在选自由以下组成的组的范围内：(a)约0.6％至约30％，(b)约1％至约10％，以及(c)约1％至约2％。在一个或多个前述实施方案中，尿囊素在从非零量到至多约0.6％的范围内。

在一些实施方案中，所述方法应用于天然来源的单克隆或多克隆IgG抗体，例如血清或血浆。在一些实施方案中，所述方法应用于酶促来源或重组来源的片段免疫球蛋白构建体，例如Fab、F(ab’)₂或ScFv。

在一些实施方案中，提供用以促进本文所公开的方法中的任一种的实施的试剂盒。

定义下列术语，以使本文所公开的实施方案可以更容易地理解。另外的定义陈述于整个详细描述中。

“脂肪酸”是指由通过羧基封端的线性脂族链组成的有机分子，其一般结构式为CH₃(CH₂)_nCOOH，其中n是至少为1的整数。对于适合于实施本发明的方法的脂肪酸，“n”可以是至少4到至多12的整数。适合于实施所述方法的饱和脂肪酸的具体实例特别包括葡萄花酸(庚酸，C7)、羊脂酸(辛酸，C8)、天竺葵酸(壬酸，C9)和羊蜡酸(癸酸，C10)。术语脂肪酸也可以指含有一个双键或更大数量的双键的不饱和脂肪酸，所述双键可以位于沿主碳链的任何位置。

“尿囊素”是指通过尿酸的氧化产生的嘌呤代谢物，其结构式为C₄H₆N₄O₃且IUPAC名称为2,5-二氧代-4-咪唑烷基脲。

在本发明的上下文下，“细胞培养”是指出于产生IgG单克隆抗体的目的，在液体培养基中培养细胞。用于此目的的细胞通常包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，但也可包括来自其它哺乳动物的细胞类型，以及非哺乳动物的动物细胞、植物细胞和微生物细胞。在所有情况下，液体培养基均含有营养物以支持细胞生长。

“生物反应器”是指容器，在其内部在受控条件下生长细胞。所述容器可包括不锈钢罐、或者其它材料的罐、或者带衬里的罐、或者聚合物袋，其尺寸适于生长产生目标量的期望抗体所需数量的细胞；装备有传感器和输入，以允许根据需要监控关键工艺参数和调节，从而维持对于细胞生长和抗体产生而言理想的条件。

“收获物”或“细胞培养收获物”通常是指在细胞培养过程结束时生物反应器的内容物。除所产生的IgG以外，收获物最初还含有细胞、细胞分泌物和死细胞的排出内容物，以及最初生长细胞的营养培养基的内容物。这些非抗体组分构成待从抗体移除的污染物。特别包括宿主蛋白和DNA，但也可包括病毒和内毒素。细胞培养收获物也经常含有片段形式的抗体的错误装配或损坏形式。

“净化的细胞培养收获物”是指已从其移除细胞的收获物。净化过程可不外乎是离心或微过滤或两者的组合以移除固体，或者其可包括使用化学添加剂或带有化学交互性表面的固体材料以从收获物提取特定种类的可溶性污染物。

“蛋白质”是指含有碳、氢、氧、氮且通常含有硫并且主要由一条或多条通过肽键连接的氨基酸链构成的一群复杂有机大分子中的任一种。蛋白质可以是天然或重组来源的。蛋白质可以用非氨基酸部分进行修饰，例如通过糖基化、聚乙二醇化或与其它化学部分结合。蛋白质的实例包括但不限于抗体、凝血因子、酶和肽激素。

“宿主污染物”或“宿主细胞污染物”是指由其中生长目的产物的细胞所产生的生物分子。该术语可包括各种类别的宿主污染物，例如宿主蛋白和宿主DNA。

“宿主蛋白”或“宿主细胞蛋白”或“HCP”是指由其中生长目的产物的细胞所产生的蛋白质。此类蛋白质代表待从目的产物移除的一类污染物。

“抗体”是指衍生自人或其它哺乳动物细胞系的IgG、IgM、IgA、IgD或IgE类的免疫球蛋白，包括天然形式或基因改造的形式，例如人源化抗体、人抗体、单链抗体、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂合抗体、突变抗体、移植抗体和体外产生的抗体。抗体可由单一克隆产生，在这种情况下，它们被称为单克隆抗体，或者可从多于一种克隆产生，在这种情况下，它们被称为多克隆抗体。IgG抗体特别是指称为免疫球蛋白G的一类抗体，其也可作为一种子类或子类的混合物存在，例如在人中作为IgG₁、IgG₂、IgG₃或IgG₄；或者在小鼠中作为IgG₁、IgG_2A、IgG_2B或IgG₃；或者在大鼠中作为IgG₁、IgG_2A、IgG_2B、IgG_2C。在真核宿主中天然产生或重组产生的抗体可以各种糖基化形式存在，而在非真核宿主中产生的抗体可以各种糖基化和非糖基化形式存在。术语抗体也被理解为包括片段构建体，无论是酶促来源或蛋白水解来源，包括但不限于Fab、F(ab’)₂、VHH和ScFv。

“内毒素”是指在革兰氏阴性细菌的外膜中存在的对热稳定的毒性脂多糖物质，其在裂解过程中从细胞释放。内毒素可以由于其高含量的磷酸残基和羧基残基而通常是酸性的，并且可以由于脂质-A区域的脂肪酸含量而是高度疏水的。内毒素可提供广泛的氢键合的机会。

“多核苷酸”是指由在链中共价键合的多个核苷酸单体构成的生物聚合物。DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是多核苷酸的实例。多核苷酸可具有形成氢键的高倾向性。

“蛋白质制剂”是指含有目的蛋白质的任何水性溶液或主要为水性的溶液，例如含细胞的细胞培养收获物、(基本上)不含细胞的细胞培养上清液，或者来自纯化阶段的含有目的蛋白质的溶液。

“病毒”或“病毒粒子”是指超显微的(直径大约为20-300nm)、代谢惰性的、仅在活宿主(主要是细菌、植物和动物)的细胞内复制的传染原，其由RNA或DNA核心、蛋白外壳以及更复杂类型的包绕包膜构成。

在为特定细胞培养收获物定制本文所公开的方法中有用的起始点是向含细胞的或已经移除细胞的细胞培养收获物中添加干燥尿囊素，其中所添加的尿囊素总计1％w/v。在整个添加过程中保持混合。一部分尿囊素溶解，但另一部分保持不溶解。在水中，约0.6％溶解并且其余部分保持不溶解，但在其中尿囊素与各种组分相互作用的复杂生物系统中，这些比例可能会有偏移。将壬酸添加至0.5％v/v的比例，并继续搅拌。或者，脂肪酸添加可以在尿囊素添加之前进行，或者与尿囊素添加同时进行，但所建议的顺序似乎支持从所述处理获得略高的抗体回收率。在一些情况下，不需要调节pH，因为脂肪酸本身上的带负电荷的羧基将pH降低至约5.4。在其它情况下，或者如果使用脂肪酸的盐，则应将收获物的pH调节至约pH 5.2。电导率不需要调节。混合保持2小时，但可在后续实验中缩短。任选地使固体沉降，并且通过任何便利的方法例如微过滤或沉降对液体进行净化。净化的液体可以任选地进一步通过流过具有聚集有正电荷的内部液体接触表面的装置进行处理。这个步骤不需要调节pH或电导率条件。可针对浊度、宿主细胞蛋白、抗体聚集体、抗体片段、DNA、组蛋白、核小体、病毒、内毒素或可能与特定纯化的目标相关的其它污染物的减少对经处理的材料进行评估。

在一些实施方案中，脂肪酸可以其酸性离子形式被引入收获物中。当以酸性形式引入时，可以不需要调节收获物的pH，因为脂肪酸本身可将工作pH滴定至合适的值。pH通常可调节至pH 4.0至6.0的范围，但更理想地，在4.5至5.5、或4.8至5.2的范围内，或为5.2。更酸性的条件通常支持更好的污染物移除，但更不酸性的条件通常有利于更高的IgG回收率。一般来说，与传统执行的脂肪酸沉淀相比，所公开的方法在较高pH值下支持良好的效果。应认识到，避免极端pH可降低施加于抗体的化学应力，并且可以更高的功能性抗体回收率和/或改善的抗体稳定性的形式提供次生益处。因此，将温和的pH值例如4.5至5.5评估为常规通常是有益的，尽管在本领域中对于进行脂肪酸沉淀，通常实践相反的程序。甚至在预先pH滴定未严格要求的情况下，这也可为先见之明，因为它可提高方法的再现性。在其它实施方案中，脂肪酸可作为盐引入，例如辛酸钠、或壬酸钠、或癸酸钠；或辛酸钾、或壬酸钾、或癸酸钾，或其它盐，例如具有钾阳离子的盐。当作为盐引入时，需要通过添加适当的滴定剂来调节工作溶液的pH以实现所需的工作pH，因为盐制剂有效抑制组分离子的滴定能力。合适的滴定剂可由预滴定至目标工作pH或接近目标工作pH的酸或浓缩缓冲剂组成。

实验数据表明，在一些实施方案中，羊蜡酸比羊脂酸更有效，尤其是对于移除聚集体，然而，显然是由于其10个原子的碳链而造成的其较高的疏水性，它也涉及更高的抗体损失风险，有时会导致较低的回收率或因环境温度的相对较小变化而造成的不可靠的结果。迄今的实验结果表明，在类似情况下，羊蜡酸的有效浓度范围大约是羊脂酸的浓度的一半。这建议将0.2％的羊蜡酸作为一个合适的浓度来开始实验。其它实验结果表明，天竺葵酸(壬酸，9-碳)与羊脂酸或羊蜡酸相比提供疏水性和电荷的更有利平衡，并且支持更有效的宿主蛋白减少。其它实验结果表明，8-壬烯酸也支持比羊脂酸或羊蜡酸更好的结果，8-壬烯酸是在脂肪酸链的末端具有一个双键的9-碳脂肪酸。

为每个变量评估值的范围以为特定纯化确定最有效的配置通常是值得的。尿囊素浓度可以较低的比例例如1％或者较高的比例例如2％、3％、4％、5％或中间的增量进行评估。实验数据表明，低于1％时，尿囊素变得不太有效，而高于5％时，抗体回收率会受到损害，但可评估更广泛的范围，只要知晓可能出现的潜在损害。低于建议的1％的浓度会特别损害聚集体减少，而较高的浓度会损害抗体回收率。在一些情况下，由于其它效果被认为具有更大的价值，较低的抗体回收率是可接受的。用于单独添加尿囊素的孵育条件实验通常并不需要，因为经验表明，其效果发生得非常迅速。脂肪酸浓度可从0.05％至5％变化。短至15分钟的孵育时间可能会损害聚集体和宿主蛋白的移除，但可连同30分钟、或45分钟、或60分钟、或90分钟、或120分钟、或选择的其它时间间隔一起进行评估。长于2小时的孵育时间也可进行评估，但迄今的实验数据未表明此类时间间隔的显著优势。孵育时间是效率的主要决定因素，但应与长的处理时间间隔的经济缺点进行平衡。16小时方便作为起点，因为它对应于可无人参与地进行的过夜孵育，但更短的时间间隔也应进行评估，例如1小时、2小时、4小时以及使用者酌情决定的或许更短、更长或中间时间间隔。用于脂肪酸初始孵育的操作pH可在4至6、或4.5至5.5、或4.8至5.2的范围内。电导率通常不需要调节，但可通过添加盐例如氯化钠增加至约2倍于正常生理电导率，或者通过添加水降低约一半，或者如果需要，可评估更宽的范围。

可能需要对壬酸作为羊脂酸或羊蜡酸的替代进行评估，因为实验结果表明，在一些情况下，它对于移除抗体片段更有效，并且在所有其它方面中，通常似乎至少同样有效。当应用于冷藏储存的细胞培养收获物时，羊蜡酸被认为是不利的，但在其中脂肪酸可直接添加至新鲜的细胞培养收获物中，特别是其中细胞培养收获物仍留在生物反应器中的情况下，此类问题暂时消失。在后一种情况下，高温可保持所希望的任何孵育时间间隔。这种方法可具有次生优点，即如果在脂肪酸孵育后温度降低，则一定比例的羊蜡酸将变得不溶解并且更可能与系统中的固体缔合，结果是提高了其从系统移除的效率。实验数据表明，壬酸可在与羊脂酸相同的浓度范围内进行评估，尽管通常发现其在较低的浓度下有效。小于8的碳链长度不太有效，特别是对于聚集体移除，并且因此使用较大的相对量，但小于8的碳链长度仍然可能有用。由于脂肪酸的固有溶解性，10个碳原子或更大的链长度由于难以实现可溶性试剂的高浓度而有缺陷，并且在一些情况下，它们造成较高的抗体回收率降低的风险。一般来说，实验数据表明，脂肪酸的疏水性越强，则其有效浓度越低并且其动态范围越窄。组合一个或多个负电荷与一个或多个脂族或芳族疏水性部分的其它有机酸也可遵循本文所建议的准则用于实施本文所公开的方法，包括但不限于饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸和磷脂。

在一些实施方案中，在所有公开的要素都存在的情况下实施本文所公开的方法可能是有利的，因为作为整体的系统中的各个要素所表现出的影响程度不能由其独立的行为进行预测。这突出了一点，作为整体的系统通过与本领域中实施的脂肪酸沉淀不同的物理和化学机制协调而实现了与常规脂肪酸处理不同的结果。在实施本文所公开的方法中，该方法的单个要素可串行执行，以为任何特定目标IgG抗体提供简化方法。在一些实施方案中，本领域中已知的统计技术例如实验设计(DoE)提供识别一系列减少数量的本文所公开的方法实施方案的手段，所述方法实施方案被设计用于特定IgG纯化。

在一个实施方案中，该方法可应用于先前已通过其它手段进行处理的含IgG的进料流。在一个此类实施方案中，生物反应器收获物可以已经用与本文所公开的方法不同的方式进行处理。本领域普通技术人员显而易见，其它化学添加剂的存在可能会损害本发明的方法的有效性，或者可以是易察出的，或者本发明的方法可增加先前处理的有益效果。在另一此类实施方案中，含IgG的进料流可以说成已被部分纯化。

在一些实施方案中，待纯化的IgG可以是单克隆或多克隆的，并且可以留在生物流体例如血清或血浆或者其它天然来源的流体中。在此类实施方案中，相同的方法参数可以在与对于通过体外细胞培养技术产生的单克隆抗体的处理所描述的范围相同的范围内进行评估。预期与给定的单克隆抗体相比，多克隆抗体覆盖更广泛范围的分子行为，并且可观察到衍生自不同物种的抗体的行为的差异，但在不脱离作为整体的方法的基本特征的前提下调整本文所公开的方法的要素是在本领域技术人员的知识范围内。

在一个实施方案中，收获物可在已经应用所述处理并从系统移除固体后进一步通过一种或多种方法进行处理。一个此类实施方案可包括使经处理的收获物流过官能化过滤器或者平衡至与样品相同条件的其它装置。在一些此类实施方案中，可改变样品的pH和电导率条件以增强官能化装置提取污染物的能力。在另一实施方案中，IgG可通过渗滤进行浓缩和缓冲液交换，渗滤也会移除一些污染物。在另一实施方案中，经处理的收获物可通过高效切向流过滤进行处理。在另一实施方案中，净化的上清液可通过阳离子交换色谱进行处理。在另一实施方案中，IgG可通过聚乙二醇从净化的收获物沉淀。在另一实施方案中，IgG可通过离液序列低的盐例如硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠或柠檬酸钾从净化的收获物选择性沉淀。在另一实施方案中，净化的收获物可通过以下方式进行处理：空间排阻色谱，其中IgG被迫在聚乙二醇存在下附着在亲水性粒子上，或者优先排阻或色谱，其中IgG被迫在一种或多种离液序列低的盐存在下附着在粒子上。在另一实施方案中，经处理的收获物可通过阳离子交换色谱进行处理。在另一实施方案中，经处理的收获物可通过疏水相互作用色谱进行处理。在另一实施方案中，经处理的收获物可通过所谓的混合模式色谱形式进行处理，其中给定的色谱介质包含能够实现与顺序施加的构成官能团不同的分级分离效果的多个化学官能团。

下列实施例被理解为一般性的且仅出于说明目的，而不应被解释为以任何方式具有限制性。

实施例

实施例1.通过羊脂酸沉淀来移除污染物。将不同量的羊脂酸分别添加至通过离心净化的细胞培养收获物中，以达到0.1％、0.2％、0.3％、0.4％和0.5％的最终浓度。将尿囊素添加至每个样品中，以达到1％的最终浓度。既不调节pH也不调节盐浓度。在0.4％羊脂酸下，最终的pH是5.4。将混合物搅拌2小时。通过使样品通过0.22μm的微过滤器移除固体。在0.1％羊脂酸下，宿主细胞蛋白从收获物中的原始242,888ppm IgG减少至233,318ppm；在0.2％羊脂酸下，减少至193,400ppm；在0.3％羊脂酸下，减少至57,519ppm；在0.4％羊脂酸下，减少至38,602ppm；以及在0.5％羊脂酸下，减少至42,666ppm。在0.3％羊脂酸下，包括游离轻链和轻链二聚体在内的IgG片段从收获物中的12.2％减少至5.3％；在0.4％羊脂酸下，减少至3.4％；以及在0.5％羊脂酸下，减少至3.6％。在0.1％和0.2％羊脂酸下，片段未减少。在0.1％羊脂酸下，聚集体从收获物中的1.28％减少至1.22％；在0.2％羊脂酸下，减少至0.87％；在0.3％羊脂酸下，减少至0.31％，并且在0.4％和0.5％羊脂酸下，检测不到(小于0.05％)。在羊脂酸浓度范围内的IgG回收率为在0.1％羊脂酸下的99％、在0.2％下的99％、在0.3％下的95％、在0.4％下的99％以及在0.5％下的95％。

实施例2.操作pH对宿主蛋白减少的影响。运行一系列实验，其中将含IgG的经微过滤净化的收获物用0.4％羊脂酸进行处理；在实验对照中未调节pH；在两个独立的实验中将pH调节至pH 6和7。在未调节的对照(pH 5.4)中，宿主蛋白含量为38,602ppm；在pH 6.0下为171,232ppm；以及在pH 7.0下为243,675ppm。

实施例3.通过利用聚乙二醇的IgG沉淀进行后续纯化。将用0.4％和0.5％羊脂酸处理，接着多孔粒子处理的来自实施例1的样品通过用聚乙二醇(PEG-6000)沉淀而进一步纯化，所述沉淀在20.5％PEG、800mM NaCl、50mM Hepes、pH 7.0下进行。在用0.4％羊脂酸处理的收获物的PEG沉淀后，宿主蛋白减少至11ppm，聚集体减少至0.09％，并且检测不到轻链片段。在0.5％羊脂酸下处理的收获物的PEG沉淀后，宿主蛋白减少至13ppm，聚集体减少至0.1％，并且检测不到轻链片段。这些结果均对应于宿主蛋白的99.9995％减少。在收获物未通过本发明的方法进行处理的平行对照实验中，PEG沉淀使宿主蛋白减少至67,687ppm。由所公开的方法提供的超过6,000倍的改善示出两个独特的益处。明显的益处是，通过本发明的方法减少宿主蛋白污染允许后续方法实现宿主蛋白污染的更大减少。这也突出了可以说是更大的益处，即所公开的方法特别移除了干扰纯化方法本身实现其最佳效果的能力的污染物。

实施例4.将所述方法与阴离子交换深层过滤器整合。将0.4％羊脂酸添加至未经任何预处理的细胞培养收获物中。添加尿囊素，以达到1％的最终浓度。在为实施例1中所述的相同的多孔粒子混合物处理作准备时，将混合物连续搅拌2小时，然后通过两级阴离子交换深层过滤器而不是实施例1-3中的膜微过滤器。深层过滤步骤使宿主蛋白从176,244ppm减少至9173ppm，减少至1/19；使聚集体从2.03％减少至检测不到(小于0.05％)；并且使轻链污染物从12％减少至1％。

实施例5.通过蛋白A亲和色谱来增强性能。将如实施例4中所述通过用尿囊素、羊脂酸和混合粒子处理制备的样品通过蛋白A亲和色谱(ToyoPearl AF-rProtein A 650F,Tosoh Bioscience)进行纯化。当进料流由通过离心和/或微过滤净化的细胞收获物组成时，蛋白A通常会将污染宿主蛋白水平降低至500至2,000ppm IgG的范围。在蛋白A之前执行实施例1中所述的羊脂酸-尿囊素和多孔粒子方法允许蛋白A步骤达到低于1ppm的宿主蛋白水平以及低于检测限水平的聚集体水平。这特别突出了所公开的方法移除干扰蛋白A发挥其潜力的能力的污染物。

实施例6.通过抗体沉淀，随后阴离子交换色谱来增强性能。将如实施例4中所述通过用尿囊素、羊脂酸和混合粒子处理制备的样品通过混合模式的沉淀步骤进一步纯化，所述混合模式的沉淀步骤最初如实施例3中所述用PEG，随后转变为2.0硫酸铵，pH 7.0。将IgG再次溶解并进行测试，表明5.9ppm的宿主细胞蛋白。聚集体低于检测水平(小于0.05％)。在50mM Tris,pH 8.25中的空隙排阻模式的单个后续阴离子交换抛光步骤将宿主蛋白减少至低于1ppm。这个结果很重要，因为它突出了所公开的方法提供如下基础的能力，即允许廉价的低功能分级分离方法与基于所有方法中被认为最高性能的分级分离方法(即蛋白A亲和色谱)的过程相比实现更好的总体纯化性能。

实施例7.所公开的方法作为中间纯化步骤。运行实验对照，其中对通过离心和微过滤净化的细胞培养收获物通过如实施例7中所述的沉淀进行分级分离。这将宿主蛋白从287,655ppm减少至67,687ppm，将聚集体从2.83％减少至1.57％，并将抗体片段从10.4％减少至2.3％。空隙排阻模式的后续阴离子交换步骤将宿主蛋白减少99.6％，至221ppm，并将聚集体减少至1.45％。

实施例8.在有和无尿囊素下对不同羊脂酸浓度的评估。将含细胞的收获物通过离心和借助0.22微米膜的膜过滤进行净化，然后将上清液的pH降低至6.0。将各个子样用0.01％、0.05％和0.1％的量的羊脂酸进行处理。甚至在通过离心移除沉淀的材料后，所有样品在处理后都是混浊的，表明微粒持续存在或再形成。在2％尿囊素存在下重复同一系列的实验。抗体回收率和污染物减少基本上相当，但处理的材料在处理后清澈透明。这个实施例说明尿囊素对作为整体的所公开方法的性能的贡献。

实施例9.通过添加尿囊素来加速净化哺乳动物细胞收获物。在常规污染物谱系中，将尿囊素添加至5L含有IgM单克隆抗体的含细胞的细胞培养收获物中，以达到1％的最终浓度。将容器轻轻涡漩以混合组分。尿囊素与未知的细胞培养物组分之间的相互作用使得这个量的尿囊素完全溶解，因此，再添加1％，使总添加量达到2％(w/v)。将容器再次涡漩以混合组分。鉴于已经观察到微粒材料在添加尿囊素之前沉降得非常缓慢，并且在1％尿囊素存在下仅稍快，2％尿囊素明显加速沉降速率，并且在约20分钟时间内细胞培养物上清液变得清澈光学透明。1％和2％尿囊素之间的差异被解释为表明由于在样品中存在一些增溶物质，故1％尿囊素几乎完全溶解。随后滗析上清液。这无意中使一部分沉淀再悬浮，随后将其离心以使剩余的固体沉降。这突出了尿囊素独立于脂肪酸或其它添加剂改善细胞收获物净化品质的能力。它还突出了用至少2％的尿囊素浓度进行初步试验的潜在益处。它进一步突出了如下重要的一点，即尿囊素的溶解度可受样品的组分影响，结果是尿囊素的过饱和浓度可以通过实验确定，尽管其已知的在水中的溶解度可提供有用的初步指导。

实施例10.通过添加尿囊素来净化大肠杆菌裂解物。将20克在250mL50mM Hepes,pH 7.0中的大肠杆菌糊剂用微流化器在16,000×g下均质化。然后，将匀浆在15,000×g下离心1小时，以移除最大的微粒物质。这产生黄褐色混浊上清液。将干燥尿囊素直接添加至上清液中，以达到5％w/v的最终浓度。将混合物涡漩约1分钟，然后使其沉降。不溶性材料在几分钟内沉降，留下澄清透明上清液，所述上清液含有多于90％的存在于原始匀浆中的蛋白质产物。所述上清液容易地通过0.22微米的膜过滤器，而尿囊素处理之前的上清液几乎一接触就堵塞过滤器。这个实施例突出了尿囊素显著改善所处理样品的过滤性的能力，并且突出了尿囊素对作为整体的所述方法的性能的独立贡献。它也说明所公开的方法并不限于由哺乳动物细胞培养物生长的抗体。

实施例11.使用尿囊素从IgG-内毒素混合物回收抗体和减少内毒素。将内毒素添加至在5mM HEPES 100mM NaCl pH 7.0中的1mg/mL人IgG中，以达到22,000EU/ml。将2％(w/v)尿囊素添加至该混合物的等分试样中，并在室温下混合15分钟。通过离心来净化悬浮液。测定蛋白质和内毒素的浓度，以计算抗体回收率和内毒素的移除。2％(w/v)尿囊素将内毒素减少至1/2。该量的尿囊素未影响抗体回收率。在后续的一系列实验中，递增尿囊素的量，至多为10％。在10％尿囊素下，抗体回收率逐渐降低至约93％，而内毒素移除效率增加至约99％。这些实验说明，使用更大量的尿囊素可导致IgG的损失。使用大小在约12kDa至1MDa范围内的蛋白质的额外实验表明一个明确的趋势，即蛋白质损失随蛋白质大小的增加而增加。这个实施例说明尿囊素增强作为整体的所公开方法的性能的能力。

实施例12.在生理条件下，通过添加10％的量的尿囊素使每毫升含有10¹⁰个小鼠细小病毒粒子的病毒培养物共沉淀。上清液的感染性测试证明移除99.9％的病毒。在生理条件下，通过添加10％的量的尿囊素使每毫升含有10¹⁰个鼠类白血病病毒粒子的另一种病毒培养物共沉淀。上清液的感染性测试证明移除99.9％的病毒。这个实施例说明尿囊素对作为整体的所公开方法的独立贡献。

实施例13.DNA与脂肪酸的非交互性。已描述羊脂酸沉淀具有使DNA沉淀的能力(Brodsky等人，见上文)。这是没有意义的，因为它们的相同负电荷会相互排斥。这在如下实验中得以证实：其中将1、2、5和10微克/毫升浓度的纯化的DNA与0.4％羊脂酸在pH 5.2和生理电导率下组合2小时。未观察到处理后DNA浓度的显著差异。这表明，其它人所描述的表观DNA结合可归因于通过中间物质的间接结合，根据Gan等人(见上文)的研究，所述中间物质可能是核小体的组蛋白组分。

实施例14.通过羊脂酸沉淀来减少污染物。运行实验以证明羊脂酸净化性能的基线。所有实验均对含IgG的细胞培养收获物进行，所述收获物含有259,777ppm宿主蛋白和总计达非聚集IgG的约30％的聚集体。所有实验均在生理电导率下进行。对宿主蛋白、IgG回收率和聚集体含量的影响以0.5个pH的单位间隔从3.5至7.0进行评估。最高宿主蛋白减少在pH 3.5下，但IgG回收率低于50％。最高聚集体移除在pH 4.5下。最高IgG回收率在pH6.5和7.0下，但宿主蛋白和聚集体减少较差。结果在下表中给出。

实施例15.在不存在官能化粒子添加下pH和电导率的组合影响。进行一系列实验，以评估pH 4.8、5.2和5.6的影响，分别在12mS/cm、16mS/cm和20mS/cm的电导率值下。起始材料是含有相同抗体加上213,821ppm宿主蛋白和25.6％聚集体的细胞培养收获物。数据显示，所公开的方法即使限于尿囊素和羊脂酸组分也能实现比单独羊脂酸(实施例30)实质上更好的结果。完整的结果描述于下表中。

实施例16.固体和溶解的钙化合物对所公开的方法的影响。将还含有652,450ppm和34.1％聚集体的含IgG的细胞培养收获物用1％尿囊素、0.4％羊脂酸、各种浓度的氯化钙或羟基磷灰石处理，滴定至pH 5.2并混合2小时。移除固体，并对样品进行评估。在0.5mM至8.0mM范围内的钙浓度对IgG回收率没有显著影响。HCP在约70,000-80,000ppm的范围内，轻链含量几乎没有降低，并且聚集体水平通常降低至约2.5％。0.5％至4％的v:v浓度的羟基磷灰石使IgG回收率从0.5％HA下的79％降低至8％HA下的38％。宿主蛋白减少，但该减少低于IgG的损失。轻链含量未有效地降低。聚集体减少至该研究中的最低值，但不能充分地补偿抗体损失。数据在下表中给出。CA种类分别指氯化钙(CC)或羟基磷灰石(HA)。标有“基础”的一行表示在没有任何钙添加剂下获得的结果。

实施例17.非离子性表面活性剂的效果。将1％尿囊素添加至4份50mL的通过离心和微过滤净化的细胞培养收获物的等分试样中的每一份中。一份留作对照。将Tween-20分别以0.005％、0.01％和0.02％的量添加至其它三份中。将样品孵育10分钟，随后添加羊脂酸以达到0.4％，并通过添加1M乙酸调节至pH 5.3，然后孵育2小时。取出样品并过滤以进行分析。将TREN粒子(BioWorks,Workbeads TREN,high)以5％的量添加至其余部分的样品中，混合4小时，然后通过微过滤移除固体。在添加TREN粒子之前，聚集体含量在0.005％Tween下从对照降低，然后在0.01％Tween下再次降低，但用0.02％Tween没有进一步改善。抗体回收率和过量游离轻链的含量基本不变。在添加TREN粒子后，聚集体水平在所有样品内是相同的，并且轻链含量受影响较小，但IgG回收率随Tween含量高达0.01％而增加，但在0.02％下，没有进一步增加。

实施例18.非离子性、两性离子性和阳离子性表面活性剂的效果。将1％尿囊素添加至50mL的通过离心和微过滤净化的细胞培养收获物的等分试样中的每一份中。一份留作对照。将下列表面活性剂分别以0.01％和0.05％添加至两份等分试样中的每一份中：乙醇酸乙氧基化物4-壬基苯醚(Glych.，非离子性)、乙二胺丙氧基化物-嵌段-乙氧基化物四醇(TET，非离子性)、Brij 58(Pluronic F-127，非离子性)、Triton X-100(非离子性)、Nonidet P40(非离子性)、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸盐水合物(CHAPS，两性离子性)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，阳离子性)、十二烷基三甲基溴化铵(DDTAB，阳离子性)、癸基三甲基溴化铵(DTAB，阳离子性)、肉豆蔻基三甲基溴化铵(MTAB，阳离子性)、十八烷基三甲基溴化铵(OTAB，阳离子性)。将样品孵育10分钟，随后添加羊脂酸以达到0.4％，并通过添加1M乙酸调节至pH 5.3，然后孵育2小时。

实施例19.不同脂肪酸的效果。将1％尿囊素添加至50mL的通过离心和微过滤净化的细胞培养收获物的等分试样中的每一份中。一份留作对照。添加0.4％的羊脂酸作为另一对照，并通过添加1M乙酸将pH调节至5.3，然后孵育混合2小时。将收获物的5份等分试样用0.1％、0.2％、0.3％、0.4％和0.5％的2-乙基己酸(EHA)处理。用3-庚烯酸(3HA)、然后3-辛烯酸(3OA)和8-壬烯酸(8NA)重复这些实验。

实施例20.在有和无官能化粒子下比较辛酸和8-庚烯酸。将1％尿囊素添加至50mL的通过离心和微过滤净化的细胞培养收获物的等分试样中的每一份中。一份留作对照。添加0.4％的羊脂酸作为另一对照，并通过添加1M乙酸将pH调节至5.3。将混合物孵育混合2小时，并取出样品进行测试，然后以5％(v:v)的量添加TREN粒子，并再孵育混合4小时。通过微过滤移除固体，然后进行分析。用8-庚烯酸在0.4％、0.5％和0.6％下重复这种实验形式。

如通过实施例所说明，所公开的方法可以与其它纯化方法组合以实现更高的纯化水平。此类其它纯化方法的实例包括但不限于通常用于纯化IgG的其它方法，例如蛋白A和其它形式的亲和色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、疏水相互作用色谱和混合模式色谱方法；以及沉淀方法，包括用非离子聚合物例如聚乙二醇进行的抗体沉淀或用盐例如硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠或柠檬酸钾进行的抗体沉淀；以及结晶和双水相萃取的方法。开发用于各种方法的适当条件并将它们与本文所公开的方法结合以实现对特定抗体的所需纯化是在本领域普通技术人员的能力之内。

本文引用的所有参考文献整体地通过引用并入并用于所有目的，其程度如同每篇单个出版物或专利或专利申请特定地和个别地被指明整体地通过引用并入用于所有目的。当通过引用并入的出版物和专利或专利申请与说明书中所包含的公开内容相悖时，说明书意在代替和/或优先于任何这样的相矛盾的材料。

说明书和权利要求书中所用的表示成分数量、色谱条件等等的所有数字在所有情况下都应当理解为由术语“约”修饰。因此，除非指示相反情况，否则说明书和所附权利要求书中提出的数值参数是可以根据本发明的实施方案所寻求获得的所需性能而改变的近似值。

可对本文所公开的实施方案作出许多修改和变化而不会脱离其精神和范围，这对本领域技术人员是显而易见的。本文所述的具体实施方案仅以举例方式提供，而不意在以任何方式进行限制。本说明书和实施例意在被认为仅仅是例示性的，本文所公开的实施方案的真正范围和精神由所附权利要求书指示。

Claims (21)

1.一种纯化抗体的方法，所述方法包括：

(a)使包含至少一种抗体的细胞培养收获物或蛋白质制剂与具有7至10个碳原子的至少一种脂肪酸接触以形成混合物；

(b)使所述混合物与尿囊素接触；

(c)将固体材料与含IgG的液体分离。

2.根据权利要求1所述的方法，其中尿囊素以选自由以下组成的组的范围的浓度存在：(a)约0.6％至约30％，(b)约1％至约10％，以及(c)约1％至约2％。

3.根据权利要求1所述的方法，其中尿囊素在从非零量到至多约0.6％的范围。

4.根据权利要求1所述的方法，其中通过沉降、离心或其组合来移除在步骤(a)或(c)后存在的固体材料。

5.根据权利要求1所述的方法，其中通过过滤来移除在步骤(a)或(c)后存在的固体材料。

6.根据权利要求5所述的方法，其中过滤包括膜过滤或深层过滤。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述膜过滤或深层过滤包括经官能化的接触表面。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述细胞培养收获物或蛋白质制剂含有细胞，并且任选地存在于其中进行细胞培养物生产的生物反应器中。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述细胞培养收获物或蛋白质制剂不含细胞。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述蛋白质制剂是天然存在的生物流体。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述至少一种脂肪酸包含CH₃(CH₂)_nCOOH的一般结构式，其中n是5至8的整数。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述至少一种脂肪酸包括葡萄花酸(庚酸)、羊脂酸(辛酸)、天竺葵酸(壬酸)或羊蜡酸(癸酸)。

13.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述至少一种脂肪酸含有至少一个双键。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述至少一种脂肪酸包含壬烯酸。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述至少一种脂肪酸包含所述双键在末端位置的壬烯酸。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述至少一种脂肪酸以选自由以下组成的组的范围的浓度存在：(a)约0.05％至约5％，(b)约0.1％至约1.0％，(c)约0.2％至约0.4％，以及(d)约0.1％至0.2％。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述混合物进一步包含表面活性剂。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂是非离子性的、或两性离子性的、或阳离子性的。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述阳离子性表面活性剂是鲸蜡基三甲基溴化铵。

20.根据权利要求19所述的方法，其中鲸蜡基三甲基溴化铵以范围为约0.001％至0.05％、或约0.005％至0.025％、或约0.0075％至约0.01％的浓度存在。

21.一种用以促进根据权利要求1至20所述的方法中的任一种的实施的试剂盒。