JP2017507149A - 抗体精製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
カプリル酸沈殿による夾雑物除去
種々の量のカプリル酸を遠心分離によって清澄化した細胞培養採取物にそれぞれ最終濃度0.1、0.2、0.3、0.4及び0.5%となるように添加した。各試料にはアラントインを最終濃度1%となるように添加した。pHも塩濃度も調整しなかった。0.4%カプリル酸の最終pHは5.4であった。これらの混合物を2時間撹拌した。0.22μmマイクロフィルタに試料を通して固体を除去した。宿主細胞タンパク質は、上記採取物における元の242,888ppmのIgGから0.1%カプリル酸中では233,318、0.2%中では193,400ppm、0.3%では57,519ppm、0.4%では38,602ppm及び0.5%では42,666ppmに減少した。遊離軽鎖及び軽鎖ダイマーを含むIgG断片は、上記採取物中の12.2%から0.3%カプリル酸では5.3%、0.4%中では3.4%及び0.5%カプリル酸中では3.6%に減少した。0.1及び0.2%カプリル酸では断片の減少はなかった。凝集体は、上記採取物中の1.28%から0.1%カプリル酸中では1.22%、0.2%カプリル酸中では0.87%、0.3%カプリル酸中では0.31%に減少し、0.4及び0.5%カプリル酸では検出不能(0.05%未満)であった。これらのカプリル酸濃度の全体にわたるIgG回収率は0.1%カプリル酸では99%、0.2%では99%、0.3%では95%、0.4%では99%及び0.5%では95%であった。
宿主タンパク質減少に及ぼす操作pHの影響
IgG含有精密ろ過清澄化採取物を0.4%カプリル酸で処理し、pHを実験対照では調整せず、2つの別々の実験ではpHをpH6及び7に調整した一連の実験を実施した。宿主タンパク質含量は、未調整対照(pH5.4)では38,602ppm、pH6.0では171,232及びpH7.0では243,675ppmであった。
ポリエチレングリコールを用いたIgG沈殿によるその後の精製
0.4%及び0.5%カプリル酸により処理した後、多孔質粒子処理した実施例1からの試料を、20.5%PEG、800mMのNaCl、50mMヘペス、pH7.0で実施した、ポリエチレングリコール(PEG−6000)による沈殿によってさらに精製した。0.4%カプリル酸で処理した採取物のPEG沈殿後、宿主タンパク質は11ppm、凝集体は0.09%に減少し、軽鎖断片は検出不能であった。0.5%カプリル酸で処理した採取物のPEG沈殿後、宿主タンパク質は13ppm、凝集体は0.1%に減少し、軽鎖断片は検出不能であった。これらの結果はいずれも宿主タンパク質の99.9995%減少に相当する。採取物を本方法によって処理しなかった並行対照実験では、PEG沈殿は宿主タンパク質を67,687ppmまで減少させた。開示した方法によりもたらされる6,000倍を超える改善は2つの確かな利益を示す。明白な利益は、本方法により宿主タンパク質汚染を減少させると、後続の方法が宿主タンパク質汚染のさらに一層の減少を達成することが可能になることである。また、それは、開示した方法が特に、上記精製方法自体のその最良の結果を達成する能力を妨害する夾雑物を除去するというほぼ間違いなくより大きな利益を強調している。
本方法の陰イオン交換深層フィルタとの一体化
0.4%カプリル酸を細胞培養採取物に如何なる前処理も行わずに添加した。アラントインは最終濃度1%となるように添加した。この混合物を2時間連続的に撹拌した後、実施例1に記載したのと同じ多孔質粒子混合処理に向けて、実施例1乃至3におけるような膜マイクロフィルタではなく2段階陰イオン交換深層フィルタを通した。この深層ろ過工程により宿主タンパク質は176,244ppmから9,173ppmへと19分の1に、凝集体は2.03%から検出不能(0.05%未満)へ、軽鎖夾雑物は12%から1%へ減少した。
プロテインA親和性クロマトグラフィーによる能力の向上
アラントイン、カプリル酸及び実施例4に記載した混合粒子を用いた処理により調製した試料をプロテインA親和性クロマトグラフィー(トヨパール(ToyoPearl)AF−rProtein A 650F、Tosoh Bioscience)による精製に供した。注入流が遠心分離及び/又は精密ろ過により清澄化された細胞採取物からなる場合、プロテインAは通常夾雑宿主タンパク質レベルをIgGの500乃至2,000ppmの範囲に低下させる。プロテインAの前に、実施例1に記載したカプリル酸−アラントイン及び多孔質粒子法を実施すると、プロテインA工程により1ppmを下回る宿主タンパク質レベル及び検出可能レベルを下回る凝集体を得ることが可能となった。このことは特に、開示した方法がプロテインAのその潜在力実現能を妨げる夾雑物を除去することを強調するものである。
抗体沈殿及びその後の陰イオン交換クロマトグラフィーによる能力の向上
アラントイン、カプリル酸及び実施例4に記載した混合粒子を用いた処理により調製した試料を、最初は実施例3に記載のようにPEGを用い、次いで2.0硫酸アンモニウム、pH7.0に変える混合モード沈殿工程による更なる精製に供した。上記IgGを再可溶化して調べ、宿主細胞タンパク質は5.9ppmであることが明らかとなった。凝集体は検出レベルを下回った(0.05%未満)。50mM Tris、pH8.25におけるボイド排除モードの後続の陰イオン交換の単一ポリッシング工程では宿主タンパク質は1ppm未満に減少した。この結果は、費用のかからない低機能分画方法が全体的な精製性能の向上を達成するのを可能にする基盤を提供する本開示方法の能力を強調するものであるので重要である(全ての認識された最高性能分別法に基づいているプロセス:プロテインAアフィニティークロマトグラフィー)。
遠心分離及び精密ろ過によって清澄化した細胞培養採取物を実施例7に記載した沈殿により分画する実験対照を実施した。これにより、宿主タンパク質は287,655ppmから67,687ppmへ、凝集体は2.83から1.57%へ、抗体断片は10.4から2.3%へ減少した。ボイド排除モードの後続の陰イオン交換工程では宿主タンパク質は99.6%から221ppmへ、凝集体は1.45%へ減少した。
アラントイン使用下及び不使用下の種々のカプリル酸濃度の評価
細胞含有採取物を遠心分離及び0.22ミクロン膜による膜ろ過によって清澄化した後、上清のpHを6.0に低下させた。種々の副試料を0.01%、0.05%及び0.1%の量のカプリル酸で処理した。全ての試料は処理後、濁っており、沈殿した物質が遠心分離によって除去された後も粒子状物質が存続又は再形成することが分かる。同じシリーズの実験を2%アラントインの存在下に繰り返した。抗体回収及び夾雑物減少は基本的に同等であったが、処理された物質は処理後、スパーリングクリアであった。本実施例は、全体としての本開示方法の能力へのアラントインの寄与を例示したものである。
アラントインの添加による哺乳動物細胞採取物の清澄化の促進
夾雑物の通常の範囲の中でIgMモノクロナール抗体を含む5Lの細胞含有細胞培養採取物にアラントインを1%の最終濃度となるように添加した。容器を穏やかにぐるぐるとかき混ぜてこれらの成分を混合した。アラントインと未知の細胞培養成分との相互作用によりこの量のアラントインは十分に溶解したので、さらに1%を添加し、総添加量を2%(w/v)とした。容器を再びぐるぐるとかき混ぜてこれらの成分を混合した。粒子状物質はアラントインの添加前には極めてゆっくりと、1%のアラントインの存在下ではほんの僅かにより速く沈降するのが認められたが、沈降速度は2%のアラントインでは明らかに促進され、約20分間以内に細胞培養上清スパークリングを光学的にクリアなままにした。1%及び2%アラントインの間の差は、1%アラントインが、試料中のいく種かの可溶化物質の存在のために、ほぼ完全に溶解したことを示すものと解釈された。次いで、この上清を静かに移した。これにより、意図せずに沈殿物の一部が再懸濁されたので、その後これを遠心分離して残る固体を沈殿させた。このことは、アラントインが脂肪酸又は他の添加物とは関係なく細胞採取物澄明化の質を改善できることを強調するものである。また、これは、少なくとも2%のアラントイン濃度を用いて初期の試験を行うことの潜在的なメリットを強調するものでもある。さらに、これは、アラントインの溶解性が試料の成分の影響を受ける可能性があるという重要な点及びアラントインの過飽和濃度を実験的に求めることができるという効果を強調するものであるが、その水への既知の溶解性は有用な予備ガイドとなり得る。
アラントイン添加による大腸菌溶解液の澄明化
250mLの50mMヘペス(pH7.0パスト)でペースト状にした大腸菌20グラムを16,000×gでミクロフルイダイザーを用いてホモジナイズした。次いで、このホモジネートを15,000×gで1時間遠心分離して最も大きな粒子状種を除去した。これにより褐色の濁った上清が得られた。この上清に乾燥アラントインを最終濃度5%w/vとなるように直接添加した。この混合物を約1分間かき混ぜた後、沈降させた。元のホモジネートに存在したタンパク質産物の90%超を含有するスパークリングクリアな上清を残して不溶性物質が数分以内に沈降した。この上清は0.22ミクロン膜フィルタを容易に通過したが、アラントイン処理前の上清はこのフィルタに接触のほぼ直後に目詰まりを起こした。本実施例は、アラントインが処理後の試料のろ過性を劇的に改善することができることを強調すると共に、全体として本方法の能力へのアラントインの独自の寄与を強調するものである。また、本実施例は、本開示方法が哺乳動物細胞培養によって増やされた抗体に限定されないことを例示している。
アラントインを用いたIgG−内毒素混合物からの抗体の回収及び内毒素の減少
1mg/mLヒトIgGの5mMヘペス100mM NaCl(pH7.0)溶液に内毒素を22,000EU/mlとなるように添加した。この混合物のアリコートに2%(w/v)アラントインを添加し、室温で15分間混合させた。この懸濁液を遠心分離により清澄化した。タンパク質及び内毒素濃度を測定して抗体回収率及び内毒素除去率を算出した。2%(w/v)アラントインは内毒素を2分の1に減少させた。抗体の回収はアラントインの量の影響を受けなかった。その後の一連の実験では、アラントインの量を徐々に10%まで増加させた。10%アラントインでは、抗体回収率は徐々に約93%へ減じたが、内毒素除去効率は約99%へと増大した。これらの実験は、比較的大量のアラントインを用いると、IgGのロスが生じることを例示している。大きさが約12kDaから1MDaの範囲のタンパク質を用いた別の実験は、タンパク質のロスがタンパク質の大きさの増加と共に増加する明確な傾向を示した。本実施例は、アラントインが全体として本開示方法の能力を向上させることができることを例示している。
1010粒子/mLのマウス微小ウイルスを含有するウイルス培養液を10%の量でアラントインを添加することにより生理的条件下で共沈させた。この上清の感染試験により上記ウイルスの99.9%が除去されたことが立証された。1010粒子/mLのマウス白血病ウイルスを含有する別のウイルス培養液を10%の量でアラントインを添加することにより生理的条件下で共沈させた。この上清の感染試験により上記ウイルスの99.9%が除去されたことが立証された。本実施例は、全体として本開示方法へのアラントインの独自の寄与を例示している。
DNA及び脂肪酸の非相互作用力
カプリル酸沈殿は、DNAを沈殿させる能力を有するものとして報告されている(ブロツキーほか、上記文献)。これは、それらの同一の陰性電荷が互いに反発し合うはずであるので、意味をなさない。このことは、1、2、5及び10マイクログラム/mLの濃度の精製DNAを0.4%カプリル酸とpH5.2及び生理的導電率で2時間結合させる実験において確認された。処理後のDNA濃度に有意な差は認められなかった。このことから、他の研究者により報告された見かけ上のDNA結合は中間体種を介した間接的な結合に起因することが分かり、この種は、ガンほか(上記文献)による研究によれば、ヌクレオソームのヒストン成分であると考えられる。
カプリル酸沈殿による夾雑物の減少
カプリル酸による清澄化能力のベースラインを記録するために実験を行った。全ての実験は、259,777ppmの宿主タンパク質及び非凝集IgGの約30%に上る凝集体を含むIgG含有細胞培養採取物に関して行った。また、全ての実験は生理的導電率で行った。宿主タンパク質、IgG回収及び凝集体含量に対する効果は、0.5単位間隔で3.5から7.0までのpHにおいて評価した。宿主タンパク質の最大の減少はpH3.5で認められたが、IgG回収率は50%未満であった。最大の凝集体除去はpH4.5で認められた。最大のIgG回収はpH6.5及び7.0で認められたが、宿主タンパク質及び凝集体減少は満足のいくものではなかった。結果は下記の表に示した。
官能化粒子添加の非存在下におけるpH及び導電率の組合せ影響
12mS/cm、16mS/cm及び20mS/cmの各導電率値におけるpH4.8、5.2及び5.6の影響を評価する一連の実験を行った。出発物質は、213,821ppmの宿主タンパク質及び25.6%の凝集体に加えて同一抗体を含む細胞培養採取物とした。データから、アラントイン及びカプリル酸成分に限定した本開示方法によってカプリル酸単独の場合(実施例30)よりも実質的により優れた結果が得られることが分かる。完全な結果は以下の表に記載されている。
本開示方法に対する固体及び溶解カルシウム化合物の影響
652,450ppm及び34.1%の凝集体をも含むIgG含有細胞培養採取物を1%アラントイン、0.4%カプリル酸及び種々の濃度の塩化カルシウム又はヒドロキシアパタイトで処理し、pH5.2に滴定し、2時間混合した。固体を除去し、これらの試料を評価した。0.5から8.0mMの範囲のカルシウム濃度はIgG回収に有意な影響を与えなかった。HCPは約70,000乃至80,000ppmの範囲であり、軽鎖含量は辛うじて減少し、凝集体レベルは概して約2.5%へ減少した。0.5乃至4%のv:v濃度のヒドロキシアパタイトはIgG回収率を0.5%HAの79%から8%HAの38%まで減少させた。宿主タンパク質は減少したが、そうした減少はIgGのロスよりも少なかった。軽鎖含量は効果的に減じなかった。凝集体は本研究では最低値にまで減少したが、抗体ロスを補うほどには十分でなかった。以下の表にデータを示した。CA種はそれぞれ塩化カルシウム(CC)又はヒドロキシアパタイト(HA)を意味する。「ベース」と記した行はカルシウム添加剤を用いずに得られた結果を示す。
非イオン性界面活性剤の効果
遠心分離及び精密ろ過により清澄化した細胞培養採取物の450mLのアリコートのそれぞれに1%アラントインを添加した。1つのアリコートは対照として保持した。その他の3つのアリコートにはツイーン20をそれぞれ0.005、0.01及び0.02%の量で添加した。これらの試料を10分間インキュベートした後、カプリル酸を0.4%となるまで添加し、1M酢酸の添加によりpHを5.3に調整した後、2時間インキュベートした。試料を取り出し、ろ過して分析した。試料の残りにTREN粒子(バイオワークス(BioWorks)、ワークビーズ(Workbeads)TREN、high)を5%の量で添加し、4時間混合した後、精密ろ過により固体を除去した。TREN粒子の添加時点まで、凝集体含量は対照値から0.005%ツイーン値まで減少し、0.01%ツイーン値で再度減少したが、0.02%ツイーン値ではさらに改善することはなかった。抗体回収率及び過剰遊離軽鎖含量にはおおむね変化はなかった。TREN粒子添加後、凝集体レベルは全ての試料にわたって同じであり、軽鎖含量は殆ど影響を受けなかったが、IgG回収率は、ツイーン含量が0.01%のところまで増加したものの、0.02%ではさらに増加することはなかった。
非イオン、双性イオン及び陽イオン性界面活性剤の効果
遠心分離及び精密ろ過により清澄化した細胞培養採取物の50mLのアリコートのそれぞれに1%アラントインを添加した。1つのアリコートは対照として保持した。2つのアリコートの各々に以下の界面活性剤をそれぞれ0.01%及び0.05%の量で添加した:グリコール酸エトキシレート4−ノニルフェニルエーテル(グリック(Glych)、非イオン性)、エチレンジアミンプロポキシレート−ブロック−エトキシレートテトロール(TET、非イオン性)、ブリジ(Brij)58(プルロニック(Pluronic)F−127、非イオン性)、トリトン(Triton)X−100(非イオン性)、ノニデット(Nonidet)P40(非イオン性)、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−1−プロパンサルフェートハイドレート(CHAPS:3−[(3−cholamidopropyl)dimethylammonio]−1−propanesulfonate hydrate)、双性イオン性)、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム(CTAB、陽イオン性)、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム(DDTAB、陽イオン)、臭化デシルトリメチルアンモニウム(DTAB、陽イオン性)、臭化ミリスチルトリメチルアンモニウム(MTAB、陽イオン性)、臭化オクタデシルトリメチルアンモニウム(OTAB、陽イオン性)。これらの試料を10分間インキュベートした後、カプリル酸を0.4%となるまで添加し、1M酢酸の添加によりpHを5.3に調整した後、2時間インキュベートした。
種々の脂肪酸の効果
遠心分離及び精密ろ過により清澄化した細胞培養採取物の50mLのアリコートのそれぞれに1%アラントインを添加した。1つのアリコートは対照として保持した。別の対照としてカプリル酸を0.4%となるまで添加し、1M酢酸の添加によりpHを5.3に調整した後、2時間混合してインキュベートした。採取物の5つのアリコートを0.1%、0.2%、0.3%、0.4%及び0.5%の2−エチルヘキサン酸(EHA)で処理した。これらの実験は、3−ヘプテン酸(3HA:3−heptenoic acid)、次いで3−オクテン酸(3OA:3−octenoic acid)及び8−ノネン酸(8NA:8−nonenoic acid)を用いて繰り返した。
官能化粒子使用下及び不使用下におけるオクテン酸と8−ヘプテン酸との比較
遠心分離及び精密ろ過により清澄化した細胞培養採取物の50mLのアリコートのそれぞれに1%アラントインを添加した。1つのアリコートは対照として保持した。別の対照としてカプリル酸を0.4%となるまで添加し、1M酢酸の添加によりpHを5.3に調整した。この混合物を2時間混合してインキュベートし、試料を取り出して試験した後、TREN粒子を5%(v:v)の量で添加し、さらに4時間混合してインキュベートした。固体を精密ろ過により除去した後、分析した。この実験フォーマットは、0.4%、0.5%及び0.6%の8−ヘプテン酸を用いて繰り返した。
Claims (21)
- (a)少なくとも1種の抗体を含む細胞培養採取物又はタンパク質調製物を7乃至10個の炭素原子を有する少なくとも1種の脂肪酸と接触させて混合物を形成する工程、
(b)前記混合物をアラントインと接触させる工程、
(c)IgG含有液から固体物を分離する工程
を含む抗体を精製する方法。 - アラントインは(a)約0.6乃至約30%、(b)約1乃至約10%及び(c)約1乃至約2%からなる群から選ばれる範囲の濃度で存在する、請求項1に記載の方法。
- アラントインは非ゼロ量から約0.6%までの範囲にある、請求項1に記載の方法。
- 工程(a)又は(c)の後に存在する固体物は沈降、遠心分離又はこれらの組合せによって除去される、請求項1に記載の方法。
- 工程(a)又は(c)の後に存在する固体物はろ過によって除去される、請求項1に記載の方法。
- ろ過は膜ろ過又は深層ろ過を含む、請求項5に記載の方法。
- 前記膜ろ過又は深層ろ過は官能化されている接触表面を含む、請求項6に記載の方法。
- 前記細胞培養採取物又はタンパク質調製物は細胞を含み、必要に応じて、細胞培養産生が行われるバイオリアクターに存在する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞培養採取物又はタンパク質調製物は細胞を含まない、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質調製物は天然起源の生体液である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1種の脂肪酸はCH3(CH2)nCOOHの一般構造式を含み、nは5乃至8の整数である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1種の脂肪酸はエナント(ヘプタン)酸、カプリル(オクタン)酸、ペラルゴン(ノナン)酸又はカプリン(デカン)酸を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1種の脂肪酸は少なくとも1つの二重結合を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1種の脂肪酸はノネン酸を含む、請求項13に記載の方法。
- 前記少なくとも1種の脂肪酸は末端の位置に二重結合を有するノネン酸を含む、請求項13に記載の方法。
- 前記少なくとも1種の脂肪酸はa)約0.05乃至約5%、(b)約0.1乃至約1.0%、(c)約0.2乃至約0.4%及び(d)約0.1乃至0.2%からなる群から選ばれる範囲の濃度で存在する、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記混合物はさらに界面活性剤を含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 界面活性剤は非イオン性又は双性イオン性又は陽イオン性である、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記陽イオン性界面活性剤は臭化セチルトリメチルアンモニウムである、請求項18に記載の方法。
- 臭化セチルトリメチルアンモニウムは約0.001%乃至0.05%又は約0.005%乃至0.025%又は約0.0075%乃至約0.01%の範囲の濃度で存在する、請求項19に記載の方法。
- 請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法の実施を容易にするためのキット。
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