CN106939045A - 一种单克隆抗体细胞培养液澄清的方法 - Google Patents

一种单克隆抗体细胞培养液澄清的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106939045A
CN106939045A CN201710299581.7A CN201710299581A CN106939045A CN 106939045 A CN106939045 A CN 106939045A CN 201710299581 A CN201710299581 A CN 201710299581A CN 106939045 A CN106939045 A CN 106939045A
Authority
CN
China
Prior art keywords
acid
nutrient solution
cell
capric acid
monoclonal antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710299581.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106939045B (zh
Inventor
宋海鹏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Creation Nanometer Antibody Technology Co Ltd
Original Assignee
Shenzhen Creation Nanometer Antibody Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Creation Nanometer Antibody Technology Co Ltd filed Critical Shenzhen Creation Nanometer Antibody Technology Co Ltd
Priority to CN201710299581.7A priority Critical patent/CN106939045B/zh
Publication of CN106939045A publication Critical patent/CN106939045A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106939045B publication Critical patent/CN106939045B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于9‑10碳脂肪酸单克隆抗体细胞培养液澄清的方法。所述方法是在发酵后期或发酵完成后在培养液中加入所述脂肪酸，溶液pH调至5.0‑5.5，通过搅拌，在37℃呈液态的脂肪酸特异性吸附宿主蛋白、残留DNA、抗体聚集体等污染物，反应20‑40分钟后加入精胺，利用其在酸性条件下呈现多阳离子多胺类特性，与DNA结合以促进污染物的进一步凝聚；当温度降至25℃以下，所述脂肪酸呈固态析出，通过离心或过滤去除固态沉淀，即可达到细胞培养液澄清的预处理目的。本发明操作简单、耗时短、温度易控，极大减轻了后续蛋白纯化的压力，缩短了工艺流程，既可用于实验室小体系制备，又可用于产业化生产。

Description

一种单克隆抗体细胞培养液澄清的方法
技术领域
本发明公开了一种单克隆抗体蛋白细胞培养液澄清的预处理方法，属于蛋白质纯化制备领域。
背景技术
单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)是一类重要的生物技术药物，在现代生物检测领域和医疗领域起着越来越重要的作用。现有技术中，单克隆抗体通常由中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary，CHO)表达产生，随着上游高表达细胞株的构建、基因改造、发酵条件的不断优化，CHO细胞的单克隆抗体表达量已经达到30g/L以上，培养规模也逐步扩大，伴随着生物量以及杂质量的显著提高，上游产能的提升给下游分离纯化过程带来极大的压力。而高效的细胞回收液澄清预处理将大大减轻后续抗体纯化的压力，对于缩短工艺流程、提高经济性具有决定性的作用。由此可见，评价细胞回收液澄清效果的主要标准已经逐渐转变为不单单能有效地去除哺乳动物细胞、细胞碎片，更重要是在保证最终抗体蛋白回收率的同时，尽可能多地去除宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)、宿主残留DNA、高分子量蛋白聚集体等污染物。
传统单克隆抗体分离纯化通常包括蛋白A亲和层析纯化、阴阳离子交换树脂纯化、疏水性作用树脂纯化等3-4步单元操作，工艺流程长、产品产率较低，导致单克隆抗体产品成本居高不下。因此如何缩短工艺流程、降低生产成本直接决定了在当前上游产能大大提升状况下，下游抗体分离纯化的主要研究方向。离心和切向流过滤常被应用于工业中去除细胞，最近几年深层过滤的应用也越来越广泛。絮凝剂用来增强细胞、杂质的去除和离心的效果也越来越受到广泛的关注。沉淀法因具有操作简单、省时省力、回收率高等特点在抗体分离纯化中应用广泛。沉淀技术的原理是利用不同蛋白疏水性的差异，通过调节盐浓度沉淀相应的蛋白，达到分离纯化的目的。辛酸是一种饱和脂肪酸，促进酸性蛋白发生沉淀，等电点较高的单克隆抗体因具有足够的电荷以中和辛酸的疏水作用，得以保留在上清液中，但是该方法会增加浊度和黏度，不利于分离上清液。所以本领域亟需一种更为简单有效的沉淀法用于单克隆抗体细胞培养液的澄清以增加后续分离纯化的效率。因此，本发明的目的就是提供一种操作便捷、快速高效地基于脂肪酸沉淀的单克隆抗体细胞培养液澄清的预处理方法。
发明内容
为实现上述发明目的，本发明提供了一种使细胞培养液澄清的预处理方法，以去除各种宿主细胞杂质，所述方法包括以下步骤：
(1)在所述细胞培养回收液中添加9或10碳脂肪酸；
(2)调节并保持pH为5.0-5.5的反应环境使脂肪酸与培养液反应；反应进行20-40分钟后加入精胺，所述精胺在酸性条件下呈现多阳离子多胺类特性，与DNA结合以辅助并促进抗体污染物的进一步凝聚；
(3)降低反应温度至25℃以下并静置，以使脂肪酸呈固态析出；
(4)去除步骤(3)析出的固态杂质，收集上清液。
在一个优选的技术方案中，所述脂肪酸为十碳脂肪酸，即癸酸。
在一个更为优选的技术方案中，所述培养液为CHO细胞发酵获得的培养液。
更为优选地，在步骤(1)中，在细胞发酵结束前2-4小时至发酵结束后添加所述癸酸进入细胞培养液。
再为优选地，步骤(1)中，所述癸酸的终浓度为0.2-1％。
尤为优选地，步骤(1)中，所述癸酸的终浓度为0.4％。
在另一个优选的技术方案中，步骤(2)中，所述精胺的终浓度保持在0.1％。
在一个优选的技术方案中，步骤(2)中，所述反应的温度为35-37℃。
在另一个优选的技术方案中，步骤(2)中，所述反应的时间为2-4小时。
在另一个优选的技术方案中，步骤(3)中，所述静置的时间为2-4小时。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1)操作简单、耗时短、工作量小，可应用于工业化生产。
2)操作温度易控，符合常规工业生产设备要求。
3)应用该方法纯化的单克隆抗体的纯度和收率高，HCP降低至低于500ppm，DNA小于10ppb；IgG1纯度为95％以上，回收率高于90％。当应用赛多利斯双级深层过滤时，利用癸酸沉淀后的细胞回收液滤过量是利用辛酸沉淀的两倍以上。
附图说明
图1：利用癸酸沉淀分离纯化单克隆抗体的流程图一；
图2：癸酸浓度与IgG收率相关性曲线图；
图3：利用癸酸沉淀分离纯化单克隆抗体的流程图二
具体实施方式
参照以下实施例可以对本发明作进一步详细说明，但以下实施例仅是例证，本发明并不局限于这些实施例。实施例中的实验方法，如无特殊说明，均采用本领域常规技术。无特殊说明，所有化学试剂均为商用常规分析纯试剂。
癸酸，又名正癸酸、羊蜡酸(Capric acid；Decanoic acid；Decatoic acid；Decylic acid；Decoic acid；Nonane-d-carboxylic acid)，分子式：CH3(CH2)8CO(OH)，分子量：172.27，CAS号：334-48-5
其分子式如下式(I)所示：
癸酸主要用于制取癸酸酯类产品，其酯类用作香料、湿润剂、增塑剂和食品添加剂等。
精胺，是含有两个氨基和两个亚氨基的多胺类物质(中文别名：精碱精素；精胺；精素；N,N'-双(3-氨基丙基)-1,4-丁二胺；O,O-二甲基硫代磷酰胺；1,12-二氨基-4,9-二氮十二烷)，分子量：202.34，CAS号：71-44-3。
其分子式如下式(II)所示：
精胺可作为有机磷农药中间体。同时，精胺是典型的阴离子表面活性剂，具有良好的渗透、乳化、泡沫和去污能力，广泛应用于化工，农药、纤维、电渡、选矿等工业，尤其适用于化妆品、牙膏、香波等的制造。纺织工业中适用于洗涤羊毛和丝绸。
实施例1.单克隆抗体细胞培养液的澄清(具体流程见图1)
(1)细胞培养：单克隆抗体IgG1由CHO表达产生，抗体在5LB搅拌式玻璃生物反应器中生产，采用分批补料的培养方式，利用1∶1的无蛋白培养基CD CHO(LifeTechnologies)和HyQ PF(GE Healthcare)。
(2)培养液预处理：将细胞培养液在室温、4000×g条件下离心20min，之后经由0.22μm滤膜(Rapid-Flow Filters,Thermo Scientific)过滤，收集过滤液。
(3)沉淀污染物：在收集的过滤液中添加癸酸，使其终浓度为0.4％，通过添加1M醋酸或1M Tris缓冲液将反应pH调至5.0-5.5，在反应进行30分钟后加入终浓度为0.1％的精胺。37℃混匀4h，搅拌速率控制在200-300rpm。之后将温度降至25℃。
(4)分离污染物沉淀：4 000g离心15min，收集上清液。
(5)检测：通过Generation III CHO HCP试剂盒检测，HCP降低至500ppm以下；由数字型PCR仪QX100TM Droplet DigitalTM PCR System(Bio-Rad)测量DNA小于10ppb；IgG1纯度为高于95％，回收率高于90％。
实施例2.不同癸酸浓度对宿主杂质去除的影响
(1)细胞培养：同实施例1。
(2)培养液预处理：同实施例1。
(3)沉淀污染物：在收集的过滤液中添加不同量的癸酸，使其终浓度分别为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％，pH调至5.0-5.5，37℃混匀4h。将温度降至25℃，静置4h。
(4)分离污染物沉淀：同实施例1。
(5)检测：同实施例1。结果显示，综合考虑抗体蛋白收率与宿主杂质去除效率，0.4％的癸酸浓度为最优(见图2)。
实施例3.单克隆抗体细胞培养液的澄清(具体流程见图3)
(1)细胞培养：同实施例1。
(2)添加癸酸：在发酵结束前4h添加癸酸，使其终浓度为0.4％。在反应进行30分钟后加入0.1％精胺。
(3)降温：发酵结束后，将发酵罐温度降至25℃。
(4)分离沉淀和细胞：将发酵液进行深层过滤去除细胞和污染物沉淀，收集过滤液。
(5)检测：同实施例1。HCP降低至低于500ppm，DNA小于10ppb；IgG1纯度为95％以上，回收率高于90％。
实施例4.辛酸和癸酸细胞培养液澄清对比
(1)细胞培养：同实施例1。
(2)添加辛酸和癸酸：在发酵结束前4h添加癸酸，使其终浓度为0.4％。在反应进行30分钟后加入0.1％精胺。
(3)降温：发酵结束后，将发酵罐温度降至25℃。
(4)分离沉淀和细胞：将发酵液进行深层过滤去除细胞和污染物沉淀，收集过滤液。
(5)应用赛多利斯双级深层过滤，利用癸酸沉淀后的细胞回收液滤过量是利用辛酸沉淀的两倍以上。
实施例5.应用蛋白A亲和层析分离癸酸澄清后细胞培养液
(1)细胞培养：同实施例1。
(2)添加癸酸：在发酵结束前4h添加癸酸，使其终浓度为0.4％。在反应进行30分钟后加入0.1％精胺。
(3)降温：发酵结束后，将发酵罐温度降至25℃。
(4)分离沉淀和细胞：将发酵液进行深层过滤去除细胞和污染物沉淀，收集过滤液。
(5)经过蛋白A分离纯化单克隆抗体HCP降低至低于检测线，DNA小于1ppb；IgG1纯度为99％以上，回收率高于99％。而没有经过癸酸澄清的细胞回收液，HCP在500-1000ppm，DNA小于1ppm；IgG纯度为95％，回收率为90-95％。
实施例6.应用切向流过滤分离纯化癸酸法澄清后的细胞培养液
(1)细胞培养：同实施例1。
(2)添加癸酸：在发酵结束前4h添加癸酸，使其终浓度为0.4％。在反应进行30分钟后加入0.1％精胺。
(3)降温：发酵结束后，将发酵罐温度降至25℃。
(4)分离沉淀和细胞：将发酵液进行深层过滤去除细胞和污染物沉淀，收集过滤液。
(5)直接应用切向流过滤浓缩进行单克隆抗体的分离纯化，HCP降低至低于100ppm，DNA小于10ppb；IgG1纯度为95％以上，回收率高于95％。符合现有FDA标准的单克隆抗体蛋白产品。实现无色谱柱单克隆抗体分离纯化。

Claims (10)

1.一种单克隆抗体细胞培养液澄清的预处理方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)在所述细胞培养液中添加9或10碳脂肪酸；
(2)调节并保持pH为5.0-5.5的反应环境使脂肪酸与培养液反应，反应进行20-40分钟后加入精胺；
(3)降低反应温度至25℃以下并静置，以使脂肪酸呈固态析出；
(4)去除步骤(3)析出的固态杂质，收集上清液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脂肪酸为癸酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养液为CHO细胞发酵获得的培养液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，在细胞发酵结束前2-4小时至发酵结束后添加所述癸酸进入细胞培养液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述癸酸的终浓度为0.2-1％。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述癸酸的终浓度为0.4％。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述精胺的终浓度保持在0.1％。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述反应的温度为35-37℃。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述反应的时间为2-4小时。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述静置的时间为2-4小时。
CN201710299581.7A 2017-05-01 2017-05-01 一种单克隆抗体细胞培养液澄清的方法 Active CN106939045B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710299581.7A CN106939045B (zh) 2017-05-01 2017-05-01 一种单克隆抗体细胞培养液澄清的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710299581.7A CN106939045B (zh) 2017-05-01 2017-05-01 一种单克隆抗体细胞培养液澄清的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106939045A true CN106939045A (zh) 2017-07-11
CN106939045B CN106939045B (zh) 2020-03-31

Family

ID=59463448

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710299581.7A Active CN106939045B (zh) 2017-05-01 2017-05-01 一种单克隆抗体细胞培养液澄清的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106939045B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113286804A (zh) * 2018-12-21 2021-08-20 伊克诺斯科学公司 细胞培养物澄清的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013180655A1 (en) * 2012-05-31 2013-12-05 Agency For Science, Technology And Research Selective binding of biological targets to solid phase ureides
CN105188872A (zh) * 2013-03-15 2015-12-23 葛兰素史克知识产权第二有限公司 用于纯化抗体的方法
CN105263946A (zh) * 2013-06-04 2016-01-20 新加坡科技研究局 蛋白质纯化方法
CN106164086A (zh) * 2014-02-27 2016-11-23 新加坡科技研究局 抗体纯化方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013180655A1 (en) * 2012-05-31 2013-12-05 Agency For Science, Technology And Research Selective binding of biological targets to solid phase ureides
CN105188872A (zh) * 2013-03-15 2015-12-23 葛兰素史克知识产权第二有限公司 用于纯化抗体的方法
CN105263946A (zh) * 2013-06-04 2016-01-20 新加坡科技研究局 蛋白质纯化方法
CN106164086A (zh) * 2014-02-27 2016-11-23 新加坡科技研究局 抗体纯化方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
赵彭花: "正己酸—低温乙醇沉淀法纯化小鼠腹水", 《阜阳师范学院学报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113286804A (zh) * 2018-12-21 2021-08-20 伊克诺斯科学公司 细胞培养物澄清的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN106939045B (zh) 2020-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Singh et al. Clarification of recombinant proteins from high cell density mammalian cell culture systems using new improved depth filters
CN109689191B (zh) 交替切向流快速收获
CN102532254B (zh) 一种从水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白的方法
RU2009131765A (ru) Осаждение и очистка белков полиэлектролитами
CN103379949A (zh) 蛋白纯化方法
US9416400B2 (en) Method and device for producing and/or purifying polynucleotides and products obtainable thereof
EP2121753A2 (en) Method of isolating antibodies by precipitation
KR20190135489A (ko) 세포 배양물 정화
CN114829371A (zh) 使用透析过滤缓冲液强化的病毒过滤
JP2015520026A (ja) 溶媒抽出法で処理される低有機抽出物デプスフィルター媒体
Tan et al. Recent progress in harvest and recovery techniques of mammalian and algae cells for industries
CN105732738A (zh) 一种妥布霉素的提纯方法
CN106939045A (zh) 一种单克隆抗体细胞培养液澄清的方法
CN110330565B (zh) 从血浆分离组分ⅰ和ⅲ中提取静注人免疫球蛋白的方法
JP2023145471A (ja) 容積測定ローディング流量を低減し、そして結合及び溶出クロマトグラフィー精製の生産性を増大するためのインライン生成物濃縮
CN115948351B (zh) 一种分离纯化cvb1的方法
WO2018116269A1 (en) Depth filtration of a protein
CN111318077A (zh) 一种复用对流色谱系统及其用于纯化蛋白的方法
CN115746086A (zh) 一种处理高固含量细胞液的澄清收获工艺
US20210107938A1 (en) Polypeptide separation method, polypeptide production method, and polypeptide purification device
KR20160060058A (ko) 고밀도의 미정제 세포 배양 수거물의 정화를 위한 방법
CN109320611A (zh) 一种人鼠嵌合单克隆抗体生物类似药的纯化方法
KR20220077927A (ko) 바이러스 벡터를 제조하는 방법
JP2012505863A (ja) 高密度細胞における清澄化方法
CN115779683B (zh) 除病毒过滤方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant