KR102489451B1

KR102489451B1 - 항체를 정제하는 방법

Info

Publication number: KR102489451B1
Application number: KR1020197009554A
Authority: KR
Inventors: 안드레 씨. 두메츠; 켄트 이. 고클렌; 니콜라스 이. 레비; 제시카 레이첼 몰렉; 앤드류 에스. 톰슨; 케네스 지. 얀시
Original assignee: 글락소스미스클라인 인털렉츄얼 프로퍼티 디벨로프먼트 리미티드
Priority date: 2016-09-07
Filing date: 2017-09-06
Publication date: 2023-01-16
Also published as: SG11201901059QA; WO2018047080A1; JP7058272B2; RU2759909C2; JP2019530744A; JP2024037787A; US20230046182A1; CA3035853A1; KR20190043601A; US20210284686A1; CN109689675A; RU2019109975A; IL265016B; JP2022058441A; EP3510042A1; US11530238B2; BR112019004459A2; RU2019109975A3; EP3510042B1; AU2017323583A1

Abstract

본 발명은 숙주 세포 단백질 (HCP)로부터 재조합 폴리펩티드를 정제하는 방법이며, (a) 재조합 폴리펩티드 및 HCP를 포함하는 용액을 초항원 크로마토그래피 고체 지지체에 적용하는 단계, (b) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체를 카프릴레이트 및 아르기닌을 포함하는 세척 완충제로 세척하는 단계; 및 (c) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체로부터 재조합 폴리펩티드를 용리하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

Description

항체를 정제하는 방법

본 발명은 고체 지지체에 고정화된 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 L과 같은 초항원을 사용하는 단백질 정제 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 세척 완충제 구성성분 및 세척 단계 동안 숙주 세포 불순물을 제거하기 위해 상기 세척 완충제를 사용하여 목적하는 단백질 산물의 손실을 최소화하는 방법에 관한 것이다.

"공정-관련" 불순물로서 FDA에 의해 분류된 숙주 세포 단백질 (HCP) 불순물은 생물제약 하류 가공에서 충분히 낮은 수준까지 제거되어야 한다. HCP의 적절한 클리어런스는 특히 전형적인 하류 가공 동안 일부 모노클로날 항체 (mAb) 산물에 대한 도전과제일 수 있다. 대부분의 mAb 하류 공정은 '플랫폼' 접근법을 활용하며; 전형적인 mAb 하류 플랫폼은 단백질 A 친화도 크로마토그래피 포획, 이어서 1 내지 3개의 비-친화도 폴리싱 단계로 이루어진다. 단백질 A 친화도 포획 단계는 플랫폼의 워크호스이고 HCP 클리어런스의 대부분을 제공한다. 후속 폴리싱 단계는 일반적으로 이온-교환, 소수성 상호작용 또는 다중모드 크로마토그래피이다.

많은 mAb 산물의 경우에 HCP 농도는 제1 폴리싱 크로마토그래피 단계 후에 충분히 낮다. 그러나, 제2 폴리싱 크로마토그래피 단계가 구체적으로 추가적인 HCP를 제거하는데 실시되어지는 많은 mAb가 있고; 이는 상당한 공정 개발 노력을 필요로 할 수 있고 더 큰 공정 복잡성을 초래한다. 이전 연구는 mAb 산물 분자와 매력적인 상호작용을 갖는 HCP 불순물의 하위-집단을 확인하였다 (Levy et al., (2014) Biotechnol. Bioeng. 111(5):904-912; Aboulaich et al., (2014) Biotechnol. Prog. 30(5):1114-1124). 단백질 A 단계를 통한 클리어런스를 피하는 대부분의 HCP는 단백질 A 리간드 또는 염기 매트릭스에 대한 공동-용리 또는 흡착보다는 오히려 산물-회합에 기인한다. 제거 곤란한 HCP의 집단은 - 세포 배양물에 존재하는 HCP의 다양한 집단과 비교하여 - 상대적으로 작고, 상이한 mAb 산물에 대해서는 유사하다.

곤란한 HCP 불순물의 집단이 모든 mAb 산물에 대해 대체로 동일할지라도, 다양한 정도의 HCP-mAb 상호작용은 단백질 A 단계를 거친 총 HCP 클리어런스에 유의한 영향을 미칠 수 있으며; mAb 산물의 아미노산 서열에 대한 매우 사소한 변화는 단백질 A 및 폴리싱 단계에서의 HCP-mAb 상호작용에 영향을 미칠 수 있다. HCP-mAb 회합에 대한 잠재력에 명백한 영향을 갖는, 단백질 A 칼럼 상에 로딩된 HCP의 집단은 세포 연령, 수확 방법론 및 조건에 의해 영향을 받을 수 있고, 작은 차이가 상이한 숙주 세포주 사이에서 관찰되어졌다. 산물-회합 이외에도, 대부분의 단백질 A 수지의 경우에 염기 매트릭스에 결합하고 산물과 공동-용리하는 낮은 수준의 HCP 불순물이 있다. 제어 공극 유리 수지는 염기 매트릭스에 결합된 훨씬 더 높은 수준의 HCP를 갖는다.

하나의 특정한 세척 첨가제인 나트륨 카프릴레이트는 HCP-mAb 회합을 붕괴하고 단백질 A 용리액 중 낮은 HCP 농도를 초래하는 가장 성공적인 것 중 하나로 이전에 확인되어 있다. 나트륨 카프릴레이트 (또한 나트륨 옥타노에이트로도 알려짐)는 대략 360 mM의 임계 미셀 농도로 마우스에서 비-독성인 것으로 밝혀진 8개-탄소 포화 지방산이다. 이전 연구는, HCP 클리어런스를 개선시키기 위해, 50 mM 나트륨 카프릴레이트 (Aboulaich et al., (2014) Biotechnol. Prog. 30(5):1114-1124), 다양한 NaCl 및 pH를 갖는 40 mM 나트륨 카프릴레이트 (Chollangi et al., (2015) Biotechnol. Bioeng. 112(11):2292-2304), 및 최대 80 mM 나트륨 카프릴레이트 (Herzer et al., (2015) Biotechnol. Bioeng. 112(7):1417-1428), 및 단백질분해적 HCP 불순물의 총 HCP 클리어런스 및 제거 둘 다를 위해 NaCl을 갖는 높은 pH에서의 50 mM 나트륨 카프릴레이트 (Bee et al., (2015) Biotechnol. Prog. 31(5):1360-1369)를 사용한 바 있다. 최대 100 mM 나트륨 카프릴레이트를 함유하는 단백질 A 세척제에 대해 특허 출원이 이전에 출원되어 있다 (WO2014/141150; WO2014/186350). 추가적으로, 카프릴산은 단백질 A 포획 단계 전 및 후에 비-크로마토그래피 공정에서의 숙주 세포 단백질 불순물의 침전을 위해 사용된 바 있다 (Brodsky et al., (2012) Biotechnol. Bioeng. 109(10): 2589-2598; Zheng et al., (2015) Biotechnol. Prog. 31(6):1515-1525; Herzer et al., (2015) Biotechnol. Bioeng. 112(7):1417-1428).

숙주 세포 단백질로부터 단백질, 특히 항체를 정제하는 개선된 방법을 제공할 관련 기술분야에서의 필요가 있다.

본 발명은 숙주 세포 단백질 (HCP)로부터 재조합 폴리펩티드를 정제하는 방법이며, (a) 재조합 폴리펩티드 및 HCP를 포함하는 용액을 초항원 크로마토그래피 고체 지지체에 적용하는 단계, (b) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체를 약 50 mM 초과의 카프릴레이트 및 약 0.5 M 초과의 아르기닌을 포함하는 세척 완충제로 세척하는 단계; 및 (c) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체로부터 재조합 폴리펩티드를 용리하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 카프릴레이트는 나트륨 카프릴레이트이다. 또 다른 실시양태에서, 세척 완충제는 약 75 mM 내지 약 300 mM 카프릴레이트를 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 세척 완충제는 약 0.75 M 내지 약 1.5 M 아르기닌을 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 세척 완충제는 약 0.5 M 내지 약 1 M 리신을 추가로 포함한다.

본 발명의 한 실시양태에서, 용리된 재조합 폴리펩티드는 약 2% 미만의 단편화된 재조합 폴리펩티드를 함유한다.

본 발명의 한 측면에서, HCP는 포유동물 세포로부터 유래되며, 예를 들어, HCP는 포스포리파제 B-유사 2 단백질 및/또는 카텝신 L이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 카텝신 L로부터의 재조합 폴리펩티드의 정제는 단계 (c)의 용리액에서의 감소된 카텝신 L 활성에 의해 측정된다.

한 실시양태에서, 세척 완충제의 pH는 pH 7 내지 pH 9; 또는 pH 7.5 내지 pH 8.5이다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드는 모노클로날 항체 (mAb), 예컨대, 예를 들어, IgG1, 또는 IgG4이다.

또 다른 실시양태에서, 세척 완충제는 나트륨 클로라이드를 함유하지 않는다.

본 발명의 한 측면에서, 초항원은 단백질 A, 단백질 G, 및 단백질 L로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 단계 (c) 후에 HCP의 양은 약 200 ng HCP/mg 산물 미만이다.

본 발명은 숙주 세포 단백질 (HCP)로부터 재조합 폴리펩티드를 정제하는 방법이며, (a) 재조합 폴리펩티드 및 HCP를 포함하는 용액을 초항원 크로마토그래피 고체 지지체에 적용하는 단계; (b1) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체를 약 50mM 초과의 카프릴레이트를 포함하는 세척 완충제로 세척하는 단계; (b2) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체를 약 0.5 M 초과의 아르기닌을 포함하는 세척 완충제로 세척하는 단계; 및 (c) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체로부터 재조합 폴리펩티드를 용리하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 숙주 세포 단백질 (HCP)로부터 재조합 폴리펩티드를 정제하는 방법이며, (a) 재조합 폴리펩티드 및 HCP를 포함하는 용액을 초항원 크로마토그래피 고체 지지체에 적용하는 단계; (b1) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체를 약 0.5 M 초과의 아르기닌을 포함하는 세척 완충제로 세척하는 단계; (b2) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체를 약 50mM 초과의 카프릴레이트를 포함하는 세척 완충제로 세척하는 단계; 및 (c) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체로부터 재조합 폴리펩티드를 용리하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 포스포리파제 B-유사 2 단백질로부터 재조합 폴리펩티드를 정제하는 방법이며, (a) 재조합 폴리펩티드 및 HCP를 포함하는 용액을 초항원 크로마토그래피 고체 지지체에 적용하는 단계, (b) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체를 약 100 mM 카프릴레이트 및 약 1.1 M 아르기닌을 포함하는 세척 완충제로 세척하는 단계; 및 (c) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체로부터 재조합 폴리펩티드를 용리하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 카텝신 L로부터 재조합 폴리펩티드를 정제하는 방법이며, (a) 재조합 폴리펩티드 및 HCP를 포함하는 용액을 초항원 크로마토그래피 고체 지지체에 적용하는 단계, (b) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체를 약 150 mM 카프릴레이트 및 약 1.1 M 아르기닌을 포함하는 세척 완충제로 세척하는 단계; 및 (c) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체로부터 재조합 폴리펩티드를 용리하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

한 측면에서, 본 발명은 숙주 세포 단백질 (HCP)로부터 재조합 폴리펩티드를 정제하는 방법이며, (a) 재조합 폴리펩티드 및 HCP를 포함하는 용액을 초항원 크로마토그래피 고체 지지체에 적용하는 단계; (b) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체를 약 250 mM 초과의 농도로 카프릴레이트를 포함하는 세척 완충제로 세척하는 단계; 및 (c) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체로부터 재조합 폴리펩티드를 용리하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 숙주 세포 단백질 (HCP)로부터 재조합 폴리펩티드를 정제하는 방법이며, (a) 재조합 폴리펩티드 및 HCP를 포함하는 용액을 초항원 크로마토그래피 고체 지지체에 적용하는 단계, (b) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체를 약 150 mM 내지 약 850 mM 카프릴레이트를 포함하는 세척 완충제로 세척하는 단계; 및 (c) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체로부터 재조합 폴리펩티드를 용리하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 숙주 세포 단백질 (HCP)로부터 재조합 폴리펩티드를 정제하는 방법이며, (a) 재조합 폴리펩티드 및 HCP를 포함하는 용액을 초항원 크로마토그래피 고체 지지체에 적용하는 단계, (b) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체를 약 100 mM 내지 약 850 mM 카프릴레이트 및 약 0.25 M 내지 약 1.5 M 아르기닌을 포함하는 세척 완충제로 세척하는 단계; 및 (c) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체로부터 재조합 폴리펩티드를 용리하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

도 1: mAb1을 모델로서 사용한 세척제 중 다양한 농도의 나트륨 카프릴레이트로의 단백질 A 용리액에서의 퍼센트 수율 (삼각형, ▲) 및 HCP 농도 (사각형, ■).
도 2: 세척 완충제 중 나트륨 카프릴레이트의 5가지 농도에 대한 용리액, 스트립, 및 세척 분획에서의 로딩된 mAb1의 퍼센트.
도 3: 상이한 나트륨 카프릴레이트 농도의 용액에서의 맙셀렉트 슈어(MabSelect SuRe) 수지 상의 mAb1 흡착에 대한 랭뮤어 등온선 피팅.
도 4: 100 mM 및 250 mM 나트륨 카프릴레이트 세척 완충제로의 5종의 mAb에 대한 단백질 A 용리액 HCP 농도.
도 5: 다양한 pH에서의 상이한 농도의 나트륨 카프릴레이트 및 아르기닌을 함유하는 세척 완충제로의 mAb2에 대한 단백질 A 용리액 HCP 농도. 주: 모든 세척 완충제는 300 mM 나트륨 아세테이트를 함유한다.
도 6: 다양한 pH에서의 상이한 농도의 나트륨 카프릴레이트 및 아르기닌을 함유하는 세척 완충제로의 2종의 상이한 mAb1 피드 스트림에 대한 단백질 A 용리액 HCP 농도. 주: 모든 세척 완충제는 300 mM 나트륨 아세테이트를 함유한다.
도 7: 다양한 pH에서의 상이한 농도의 나트륨 카프릴레이트 및 아르기닌을 함유하는 세척 완충제로의 mAb5 피드 스트림에 대한 단백질 A 용리액 PLBL2 농도.
도 8: 다양한 pH에서의 상이한 농도의 나트륨 카프릴레이트 및 아르기닌을 함유하는 세척 완충제로의 mAb5 피드 스트림에 대한 단백질 A 용리액 HCP 농도.
도 9: 다양한 pH에서의 상이한 농도의 나트륨 카프릴레이트 및 아르기닌을 함유하는 세척 완충제로의 mAb5 피드 스트림에 대한 단백질 A 단계 수율.
도 10: 나트륨 카프릴레이트 및 아르기닌 또는 리신을 함유하는 세척제에 대한 mAb3 단백질 A 용리액에서의 카텝신 L 활성.
도 11: 모노클로날 항체 공정 중간체에 대한 퍼센트 항체 단편화.
도 12: 카프릴레이트 단독 대 카프릴레이트 플러스 아르기닌 세척 완충제로의 HCP 농도.
도 13: 25C에서 최대 10일 동안 유지된 모노클로날 항체 벌크 약물 물질에 대한 퍼센트 항체 단편화.

본 발명은 특정한 방법, 시약, 화합물, 조성물, 또는 생물학적 시스템에 제한되지 않으며, 이들은 물론 달라질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태를 기재하는 목적을 위한 것이며, 제한하는 것을 의도하지 않는 것이 이해되어야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구 범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 달리 내용이 명확하게 나타내지 않는 한 복수 지시 대상을 포함한다. 이에 따라, 예를 들어, "폴리펩티드"에 대한 지칭은 2종 이상의 폴리펩티드 등의 조합을 포함한다.

용어 "포함하는"은 "포함한" 또는 "이루어진"을 포괄하며 예를 들어, X를 "포함하는" 조성물은 X로 독점적으로 이루어질 수 있거나 또는 추가적인 것 예를 들어 X + Y를 포함할 수 있다. 용어 "로 본질적으로 이루어진"은 특색의 범주를 명시된 물질 또는 단계 및 청구된 특색의 기본 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들로 제한한다. 용어 "로 이루어진"은 임의의 추가적인 구성성분(들)의 존재를 배제한다.

양, 시간적 지속기간 등과 같은 측정가능한 값을 지칭할 때 본원에서 사용된 바와 같은 "약"은 명시된 값으로부터 ±5%, ±1%, 및 ±0.1%를 포함한 ±20% 또는 ±10%의 변경을, 이러한 변경이 개시된 방법을 수행하는데 적절하다면, 포괄하도록 의도된다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 비록 본원에 기재된 것들과 유사하거나 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 시험을 위한 실시에 사용될 수 있을지라도, 바람직한 물질 및 방법이 본원에 기재된다. 본 발명을 기재하고 청구하는데 있어서, 하기 용어가 사용될 것이다.

"폴리펩티드," "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하는 것으로 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 폴리펩티드는 천연 (조직-유래) 기원의 것, 원핵 또는 진핵 세포 제제로부터의 재조합 또는 천연 발현의 것, 또는 합성 방법을 통해 화학적으로 생산된 것일 수 있다. 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공 화학적 모방체인 아미노산 중합체, 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산 중합체 및 비-자연 발생 아미노산 중합체에 적용된다. 아미노산 모방체는, 아미노산의 일반적인 화학적 구조와 상이한 구조를 갖지만, 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 지칭한다. 비-천연 잔기는 과학 및 특허 문헌에 널리 기재되어 있으며; 천연 아미노산 잔기의 모방체로서 유용한 몇몇 예시적인 비-천연 조성물 및 가이드라인은 하기에 기재되어 있다. 방향족 아미노산의 모방체는, 예를 들어, D- 또는 L-나프틸알라닌; D- 또는 L-페닐글리신; D- 또는 L-2 티에닐알라닌; D- 또는 L-1, -2,3-, 또는 4-피레닐알라닌; D- 또는 L-3 티에닐알라닌; D- 또는 L-(2-피리디닐)-알라닌; D- 또는 L-(3-피리디닐)-알라닌; D- 또는 L-(2-피라지닐)-알라닌; D- 또는 L-(4-이소프로필)-페닐글리신: D-(트리플루오로메틸)-페닐글리신; D-(트리플루오로메틸)-페닐알라닌: D-p-플루오로-페닐알라닌; D- 또는 L-p-비페닐페닐알라닌; K- 또는 L-p-메톡시-비페닐페닐알라닌: D- 또는 L-2-인돌(알킬)알라닌; 및 D- 또는 L-알킬알라닌 (여기서 알킬은 치환 또는 비치환된 메틸, 에틸, 프로필, 헥실, 부틸, 펜틸, 이소프로필, 이소-부틸, sec-이소틸, 이소-펜틸일 수 있음), 또는 비-산성 아미노산에 의해 대체함으로써 생성될 수 있다. 비-천연 아미노산의 방향족 고리는, 예를 들어, 티아졸릴, 티오페닐, 피라졸릴, 벤즈이미다졸릴, 나프틸, 푸라닐, 피롤릴, 및 피리딜 방향족 고리를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 "펩티드"는 본원에 구체적으로 예시된 펩티드의 보존적 변이인 펩티드를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "보존적 변이"는 아미노산 잔기의 또 다른 생물학적으로 유사한 잔기에 의한 대체를 나타낸다. 보존적 변이의 예는 하나의 소수성 잔기 예컨대 이소류신, 발린, 류신, 알라닌, 시스테인, 글리신, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 티로신, 노르류신 또는 메티오닌으로 또 다른 것을 치환하는 것, 또는 하나의 극성 잔기로 또 다른 것을 치환하는 것, 예컨대 아르기닌으로 리신을, 글루탐산으로 아스파르트산을, 또는 글루타민으로 아스파라긴을 치환하는 것 등의 치환을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 서로에 대해 치환될 수 있는 중성 친수성 아미노산은 아스파라긴, 글루타민, 세린 및 트레오닌을 포함한다.

"보존적 변이"는 또한, 치환된 폴리펩티드에 대해 유발된 항체가 또한 비치환된 폴리펩티드와 면역반응한다면, 비치환된 모 아미노산 대신에 치환된 아미노산의 사용을 포함한다. 이러한 보존적 치환은 본원에 기재된 단백질의 부류의 정의 내에 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "양이온성"은 pH 7.4에서 순 양전하를 보유하는 임의의 펩티드를 지칭한다. 펩티드의 생물학적 활성은 통상의 기술자에게 알려져 있는 표준 방법에 의해 결정될 수 있고 본원에 기재된다.

"재조합"은 단백질에 대한 참조로 사용될 때 단백질이 이종 핵산 또는 단백질의 도입, 또는 천연 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형된 것을 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같은 "치료 단백질"은, 예를 들어, 연구원 또는 의사에 의해 추구되는 조직, 시스템, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 도출하기 위해 포유동물에게 투여될 수 있는 임의의 단백질 및/또는 폴리펩티드를 지칭한다. 치료 단백질은 하나 초과의 생물학적 또는 의학적 반응을 도출할 수 있다. 게다가, 용어 "치료 유효량"은, 이러한 양을 제공받지 않은 상응하는 대상체와 비교하여, 질환, 장애, 또는 부작용의 치유, 예방, 또는 호전, 또는 질환 또는 장애의 진행 속도에서의 저하를 초래하나 이에 제한되지는 않는 임의의 양을 의미한다. 용어는 또한 정상적인 생리학적 기능을 증진시키는데 효과적인 양 뿐만 아니라 제2 제약 작용제의 치료 효과를 증진시키거나 또는 보조하는 환자의 생리학적 기능을 야기하는데 효과적인 양을 그의 범주 내에 포함한다.

본원에서 확인된 모든 "아미노산" 잔기는 천연 L-배위로 존재한다. 표준 폴리펩티드 명명법에 따라, 아미노산 잔기에 대한 약어는 하기 표에 제시된 바와 같다.

표 1: 아미노산 약어.

모든 아미노산 잔기 서열은 좌측에서 우측으로의 배향이 아미노-말단에서 카르복시-말단으로의 통상적인 방향인 화학식에 의해 본원에 나타내어진다는 것에 주지하여야 한다.

정제 방법

한 측면에서 본 발명은 숙주 세포 단백질 (HCP)로부터 재조합 폴리펩티드를 정제하는 방법이며, (a) 재조합 폴리펩티드 및 HCP를 포함하는 용액을 초항원 크로마토그래피 고체 지지체에 적용하는 단계; (b) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체를 카프릴레이트 및 아르기닌을 포함하는 세척 완충제로 세척하는 단계; 및 (c) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체로부터 재조합 폴리펩티드를 용리하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

한 측면에서 본 발명은 숙주 세포 단백질 (HCP)로부터 재조합 폴리펩티드를 정제하는 방법이며, (a) 재조합 폴리펩티드 및 HCP를 포함하는 용액을 초항원 크로마토그래피 고체 지지체에 적용하는 단계; (b) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체를 약 50 mM 초과의 카프릴레이트 및 약 0.5 M 초과의 아르기닌을 포함하는 세척 완충제로 세척하는 단계; 및 (c) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체로부터 재조합 폴리펩티드를 용리하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

한 측면에서 본 발명은 숙주 세포 단백질 (HCP)로부터 재조합 폴리펩티드를 정제하는 방법이며, (a) 재조합 폴리펩티드 및 HCP를 포함하는 용액을 초항원 크로마토그래피 고체 지지체에 적용하는 단계; (b) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체를 250 mM 초과의 농도로 카프릴레이트를 포함하는 세척 완충제로 세척하는 단계; 및 (c) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체로부터 재조합 폴리펩티드를 용리하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

한 측면에서 본 발명은 숙주 세포 단백질 (HCP)로부터 재조합 폴리펩티드를 정제하는 방법이며, (a) 재조합 폴리펩티드 및 HCP를 포함하는 용액을 초항원 크로마토그래피 고체 지지체에 적용하는 단계, (b) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체를 약 150mM 내지 약 850mM 카프릴레이트를 포함하는 세척 완충제로 세척하는 단계; 및 (c) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체로부터 재조합 폴리펩티드를 용리하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

또 다른 측면에서 본 발명은 숙주 세포 단백질 (HCP)로부터 재조합 폴리펩티드를 정제하는 방법이며, (a) 재조합 폴리펩티드 및 HCP를 포함하는 용액을 초항원 크로마토그래피 고체 지지체에 적용하는 단계; (b1) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체를 카프릴레이트를 포함하는 제1 세척 완충제로 세척하는 단계; (b2) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체를 아르기닌을 포함하는 제2 세척 완충제로 세척하는 단계; 및 (c) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체로부터 재조합 폴리펩티드를 용리하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

또 다른 측면에서 본 발명은 숙주 세포 단백질 (HCP)로부터 재조합 폴리펩티드를 정제하는 방법이며, (a) 재조합 폴리펩티드 및 HCP를 포함하는 용액을 초항원 크로마토그래피 고체 지지체에 적용하는 단계; (b1) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체를 아르기닌을 포함하는 제1 세척 완충제로 세척하는 단계; (b2) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체를 카프릴레이트를 포함하는 제2 세척 완충제로 세척하는 단계; 및 (c) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체로부터 재조합 폴리펩티드를 용리하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

단계 (a)에서 용액을 초항원 크로마토그래피 고체 지지체에 적용 (또는 로딩)한 후에, 재조합 폴리펩티드는 고체 지지체 상에 고정화된 초항원에 흡착될 것이다. HCP 불순물은 이어서 흡착된 재조합 폴리펩티드를 함유하는 고정화된 초항원을 본원에 기재된 바와 같은 세척 완충제와 접촉시킴으로써 제거될 수 있다.

"초항원"은 이들 단백질의 표적 리간드-결합 부위와 별개인 부위에서 이뮤노글로불린 슈퍼패밀리의 구성원과 상호작용하는 포괄적인 리간드를 지칭한다. 스타필로코쿠스 장독소는 T-세포 수용체와 상호작용하는 초항원의 예이다. 항체에 결합하는 초항원은 IgG 불변 영역에 결합하는 단백질 G (Bjorck and Kronvall (1984) J. Immunol., 133:969); IgG 불변 영역 및 VH 도메인에 결합하는 단백질 A (Forsgren and Sjoquist, (1966) J. Immunol., 97:822); 및 VL 도메인에 결합하는 단백질 L (Bjorck, (1988) J. Immunol., 140:1194)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 한 실시양태에서 초항원은 단백질 A, 단백질 G, 및 단백질 L로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본원에 사용될 때, 용어 "단백질 A"는 그의 천연 공급원 (예를 들어, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 세포 벽)으로부터 회수된 단백질 A, 합성적으로 (예를 들어 펩티드 합성에 의해 또는 재조합 기술에 의해) 생산된 단백질 A, 및 C_H2/C_H3 영역을 갖는 단백질에 결합하는 능력을 보유하는 그의 변이체를 포괄한다. 단백질 A는, 예를 들어 리플리겐(Repligen) 또는 파마시아(Pharmacia)로부터 상업적으로 구입될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, "친화도 크로마토그래피"는 크로마토그래피 분리를 실행하기 위해, 등전점, 소수성, 또는 크기와 같은 생체분자의 일반적인 특성보다는 오히려 생체분자 사이의 특이적, 가역성 상호작용을 이용하는 크로마토그래피 방법이다. "단백질 A 친화도 크로마토그래피" 또는 "단백질 A 크로마토그래피"는 이뮤노글로불린 분자의 Fc 부분에 대한 단백질 A의 IgG 결합 도메인의 친화도를 이용하는 특이적 친화도 크로마토그래피 방법을 지칭한다. 이러한 Fc 부분은 인간 또는 동물 이뮤노글로불린 불변 도메인 C_H2 및 C_H3 또는 이들과 실질적으로 유사한 이뮤노글로불린 도메인을 포함한다. 실제로, 단백질 A 크로마토그래피는 고체 지지체에 고정화된 단백질 A를 사용하는 것을 수반한다. 문헌 [Gagnon, Protein A Affinity Chromatography, Purification Tools for Monoclonal Antibodies, pp. 155-198, Validated Biosystems, (1996)] 참조. 단백질 G 및 단백질 L이 또한 친화도 크로마토그래피에 대해 사용될 수 있다. 고체 지지체는 단백질 A가 부착되는 비-수성 매트릭스 (예를 들면, 칼럼, 수지, 매트릭스, 비드, 겔 등)이다. 이러한 지지체는 아가로스, 세파로스, 유리, 실리카, 폴리스티렌, 콜로디온 챠콜, 모래, 폴리메타크릴레이트, 가교된 폴리(스티렌-디비닐벤젠), 및 덱스트란 표면 연장제 및 임의의 다른 적합한 물질을 수반한 아가로스를 포함한다. 이러한 물질은 관련 기술분야에 널리 알려져 있다. 임의의 적합한 방법은 초항원을 고체 지지체에 부착하는데 사용될 수 있다. 단백질을 적합한 고체 지지체에 부착하는 방법은 관련 기술분야에 널리 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [Ostrove, in Guide to Protein Purification, Methods in Enzymology, (1990) 182: 357-371] 참조. 단백질 A 또는 단백질 L이 고정화되어 있거나 또는 고정화되어 있지 않은 이러한 고체 지지체는 많은 상업적 공급원 예컨대 벡터 래보러토리(Vector Laboratory) (캘리포니아주 벌링게임), 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology) (캘리포니아주 산타 크루즈), 바이오라드(BioRad) (캘리포니아주 허큘레스), 아머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences) (지이 헬스케어(GE Healthcare)의 일부, 스웨덴 웁살라) 및 밀리포어(Millipore) (매사추세츠주 빌러리카)로부터 용이하게 입수가능하다.

본원에 기재된 방법은 하나 이상의 추가 정제 단계, 예컨대 하나 이상의 추가 크로마토그래피 단계를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 추가 크로마토그래피 단계는 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 및 혼합-모드 크로마토그래피, 특히 음이온 교환 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 방법의 단계 (c)에 의해 생성된 용리액을 여과하는 것을 추가적으로 포함한다.

한 실시양태에서 방법은 단계 (c) 후에 하기 단계를 추가로 포함한다: (d) 회수된 단백질을 함유하는 용액을 30 mM 아세트산, 100 mM HCl로 약 pH 3.5로 적정하는 단계; (e) 단계 (d)의 용액을 약 pH 3.5에서 약 30 내지 약 60분 동안 유지되도록 하는 단계; 및 (f) 단계 (e)의 용액의 pH를 1 M 트리스로 약 pH 7.5로 조정하는 단계. 한 실시양태에서 방법은 단계 (f)에 의해 생성된 용액을 여과하는 것을 추가로 포함한다.

한 실시양태에서, 단계 (a)에서 칼럼에 적용된 재조합 단백질의 양 (즉, 로드 비)은 35 mg/ml 이하, 예컨대 30 mg/ml 이하, 20 mg/ml 이하, 15 mg/ml 이하 또는 10 mg/ml 이하이다. "로드 비"는 수지 밀리리터 (ml)당 단백질 (예를 들어 모노클로날 항체) 밀리그램 (mg)을 지칭하는 것으로 이해될 것이다.

세척 완충제

"완충제"는 그의 산-염기 짝 구성성분의 작용에 의한 pH에서의 변화에 저항하는 완충 용액이다. "평형화 완충제"는 크로마토그래피에 대한 고체 상을 제조하는데 사용되는 용액을 지칭한다. "로딩 완충제"는 단백질 및 불순물의 혼합물을 고체 상 (즉, 크로마토그래피 매트릭스) 상에 로딩하는데 사용되는 용액을 지칭한다. 평형화 및 로딩 완충제는 동일할 수 있다. "세척 완충제"는 로딩이 완결된 후 고체 상으로부터 남아있는 불순물을 제거하는데 사용되는 용액을 지칭한다. "용리 완충제"는 크로마토그래피 매트릭스로부터 표적 단백질을 제거하는데 사용된다.

"염"은 산 및 염기의 상호작용에 의해 형성된 화합물이다.

본 발명의 한 측면에서, 세척 완충제는 지방족 카르복실레이트를 포함한다. 지방족 카르복실레이트는 직쇄형 또는 분지형 중 어느 하나일 수 있다. 특정 실시양태에서 지방족 카르복실레이트는 지방족 카르복실산 또는 그의 염이거나, 또는 지방족 카르복실레이트의 공급원은 지방족 카르복실산 또는 그의 염이다. 특정 실시양태에서, 지방족 카르복실레이트는 직쇄형이고 메탄산 (포름산), 에탄산 (아세트산), 프로판산 (프로피온산), 부탄산 (부티르산), 펜탄산 (발레르산), 헥산산 (카프로산), 헵탄산 (에난트산), 옥탄산 (카프릴산), 노난산 (펠라르곤산), 데칸산 (카프르산), 운데칸산 (운데실산), 도데칸산 (라우르산), 트리데칸산 (트리데실산), 테트라데칸산 (미리스트산), 펜타데칸산, 헥사데칸산 (팔미트산), 헵타데칸산 (마르가르산), 옥타데칸산 (스테아르산), 및 이코산산 (아라키디드산) 또는 그의 임의의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 따라서, 지방족 카르복실레이트는 1-20개의 탄소 길이의 탄소 백본을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서 지방족 카르복실레이트는 6-12개의 탄소 백본을 포함한다. 한 실시양태에서 지방족 카르복실레이트는 카프로에이트, 헵타노에이트, 카프릴레이트, 데카노에이트, 및 도데카노에이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가 실시양태에서, 지방족 카르복실레이트는 카프릴레이트이다.

한 실시양태에서 지방족 카르복실레이트의 공급원은 지방족 카르복실산, 지방족 카르복실산의 나트륨 염, 지방족 카르복실산의 칼륨 염, 및 지방족 카르복실산의 암모늄 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서 지방족 카르복실레이트의 공급원은 지방족 카르복실산의 나트륨 염이다. 추가 실시양태에서 세척 완충제는 나트륨 카프릴레이트, 나트륨 데카노에이트, 또는 나트륨 도데카노에이트, 특히 나트륨 카프릴레이트를 포함한다.

한 실시양태에서 세척 완충제는 약 50 mM 초과의 카프릴레이트를 포함한다. 한 실시양태에서 세척 완충제는 약 200 mM 초과의 카프릴레이트를 포함한다. 한 실시양태에서 세척 완충제는 약 250 mM 초과의 카프릴레이트를 포함한다. 추가 실시양태에서 세척 완충제는 적어도 약 50 mM 카프릴레이트, 예컨대 적어도 약 75 mM, 약 100 mM, 약 150 mM, 약 200 mM, 약 250 mM 또는 약 300 mM 카프릴레이트를 포함한다. 한 실시양태에서 세척 완충제는 약 850 mM 미만의 카프릴레이트, 예컨대 약 800 mM, 약 750 mM, 약 700 mM, 약 650 mM, 약 600 mM, 약 550 mM, 약 500 mM, 약 450 mM, 약 400 mM, 약 350 mM, 약 300 mM 미만의 카프릴레이트를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 세척 완충제는 약 100 mM, 약 125 mM, 약 150 mM, 약 175 mM, 약 200 mM, 또는 약 250 mM 카프릴레이트를 포함한다.

한 실시양태에서 세척 완충제는 약 50 mM 초과의 나트륨 카프릴레이트를 포함한다. 한 실시양태에서 세척 완충제는 약 200 mM 초과의 나트륨 카프릴레이트를 포함한다. 한 실시양태에서 세척 완충제는 약 250 mM 초과의 나트륨 카프릴레이트를 포함한다. 추가 실시양태에서 세척 완충제는 적어도 약 50 mM 나트륨 카프릴레이트, 예컨대 적어도 약 75 mM, 약 100 mM, 약 150 mM, 약 200 mM, 약 250 mM 또는 약 300 mM 나트륨 카프릴레이트를 포함한다. 한 실시양태에서 세척 완충제는 약 850 mM 미만의 나트륨 카프릴레이트, 예컨대 약 800 mM, 약 750 mM, 약 700 mM, 약 650 mM, 약 600 mM, 약 550 mM, 약 500 mM, 약 450 mM, 약 400 mM, 약 350 mM, 약 300 mM 미만의 나트륨 카프릴레이트를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 세척 완충제는 약 100 mM, 약 125 mM, 약 150 mM, 약 175 mM, 약 200 mM, 또는 약 250 mM 나트륨 카프릴레이트를 포함한다.

한 실시양태에서 세척 완충제는 약 50 mM 내지 약 750 mM 카프릴레이트; 약 50 mM 내지 약 500 mM 카프릴레이트; 약 75 mM 내지 약 400 mM 카프릴레이트; 약 75 mM 내지 약 350 mM 카프릴레이트; 약 75 mM 내지 약 300 mM 카프릴레이트; 약 75 mM 내지 약 200 mM 카프릴레이트; 약 250 mM 초과 내지 약 750 mM 카프릴레이트; 약 250 mM 초과 내지 약 500 mM 카프릴레이트; 약 250 mM 초과 내지 약 400 mM 카프릴레이트; 약 250 mM 초과 내지 약 350 mM 카프릴레이트; 또는 약 250 mM 초과 내지 약 300 mM 카프릴레이트를 포함한다.

한 실시양태에서 세척 완충제는 약 50 mM 내지 약 750 mM 나트륨 카프릴레이트; 약 50 mM 내지 약 500 mM 나트륨 카프릴레이트; 약 75 mM 내지 약 400 mM 나트륨 카프릴레이트; 약 75 mM 내지 약 350 mM 나트륨 카프릴레이트; 약 75 mM 내지 약 300 mM 나트륨 카프릴레이트; 약 75 mM 내지 약 200 mM 나트륨 카프릴레이트; 약 250 mM 초과 내지 약 750 mM 나트륨 카프릴레이트; 약 250 mM 초과 내지 약 500 mM 나트륨 카프릴레이트; 약 250 mM 초과 내지 약 400 mM 나트륨 카프릴레이트; 약 250 mM 초과 내지 약 350 mM 나트륨 카프릴레이트; 또는 약 250 mM 초과 내지 약 300 mM 나트륨 카프릴레이트를 포함한다.

한 실시양태에서 세척 완충제는 유기 산, 유기 산의 짝염기의 알칼리 금속 또는 암모늄 염, 및 유기 염기를 포함한다. 한 실시양태에서 세척 완충제는 NaCl의 첨가 없이 만들어진다.

한 실시양태에서, 유기 산의 짝염기는 유기 산의 짝염기의 나트륨, 칼륨 또는 암모늄 염이다. 한 실시양태에서, 유기 산은 아세트산이고 유기 산의 짝염기는 나트륨 염 (즉 나트륨 아세테이트)이다.

한 실시양태에서 세척 완충제는 약 1 mM 내지 약 500 mM 아세트산을 추가적으로 포함한다. 한 실시양태에서 세척 완충제는 약 45 mM 아세트산을 포함한다. 한 실시양태에서 세척 완충제는 약 1 mM 내지 약 500 mM 트리스 염기를 추가적으로 포함한다. 한 실시양태에서 세척 완충제는 약 55 mM 트리스 염기를 포함한다. 한 실시양태에서 세척 완충제는 약 1 mM 내지 약 500 mM 나트륨 아세테이트를 추가적으로 포함한다. 한 실시양태에서 세척 완충제는 약 300 mM 나트륨 아세테이트를 포함한다.

한 실시양태에서, 세척 완충제의 pH는 약 pH 7 내지 약 pH 9; 예를 들어 약 pH 7.5 내지 약 pH 8.5이다.

한 실시양태에서, 세척 완충제는 약 0.25 M 내지 약 1.5 M 아르기닌을 포함한다. 추가 실시양태에서, 세척 완충제는 약 0.25 M 내지 약 2 M 아르기닌을 포함한다. 추가 실시양태에서, 세척 완충제는 약 0.5 M 내지 약 2 M 아르기닌을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 세척 완충제는 약 0.75 M 내지 약 1.5 M 아르기닌을 포함한다. 추가 실시양태에서, 세척 완충제는 약 1 M, 약 1.1 M, 약 1.2 M, 약 1.3 M, 약 1.4 M, 약 1.5 M, 약 1.6 M, 약 1.7 M, 약 1.8 M, 약 1.9 M, 또는 약 2 M 아르기닌을 포함한다. 한 실시양태에서, 세척 완충제는 약 0.5 M 내지 약 2 M 아르기닌, 특히 약 0.75 M 내지 약 2 M 아르기닌을 포함한다. 추가 실시양태에서, 세척 완충제는 약 1 M 초과의 아르기닌을 포함한다.

"아르기닌"에 대한 지칭은 천연 아미노산을 지칭할 뿐만 아니라, 아르기닌 유도체 또는 그의 염, 예컨대 아르기닌 HCl, 아세틸 아르기닌, 아그마틴, 아르긴산, N-알파-부티로일-L-아르기닌, 또는 N-알파-피바로일 아르기닌을 포괄하는 것으로 이해될 것이다.

대안적으로, 아르기닌은 초기 세척 완충제에 포함 (즉 동시에 사용)될 수 있다. 따라서, 한 측면에서 본 발명은 숙주 세포 단백질 (HCP)로부터 재조합 폴리펩티드를 정제하는 방법이며, (a) 재조합 폴리펩티드 및 HCP를 포함하는 용액을 초항원 크로마토그래피 고체 지지체에 적용하는 단계, (b) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체를 약 100 mM 내지 약 850 mM 카프릴레이트 및 약 0.25 M 내지 약 1.5 M 아르기닌을 포함하는 세척 완충제로 세척하는 단계; 및 (c) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체로부터 재조합 폴리펩티드를 용리하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본원에 기재된 실시예에 제시된 바와 같이, 카프릴레이트 및 아르기닌의 조합을 포함하는 초항원 크로마토그래피 세척제는, 특히 제거하기 특별히 곤란한 2종의 숙주 세포 단백질인 PLBL2 및 카텝신 L을 제거하기 위한, 개선된 숙주 세포 단백질 클리어런스의 예상외의 상승작용적 효과를 가졌다.

한 실시양태에서, 세척 완충제는 약 100 mM 내지 약 750 mM 카프릴레이트; 약 100 mM 내지 약 500 mM 카프릴레이트; 약 100 mM 내지 약 400 mM 카프릴레이트; 약 100 mM 내지 약 350 mM 카프릴레이트; 또는 약 100 mM 내지 약 300 mM 카프릴레이트; 및/또는 약 0.25 M 내지 약 2 M 아르기닌, 약 0.5 M 내지 약 1.5 M 아르기닌; 또는 약 0.5 M 내지 약 1 M 아르기닌을 포함한다.

한 실시양태에서, 세척 완충제는 약 100 mM 내지 약 750 mM 나트륨 카프릴레이트; 약 100 mM 내지 약 500 mM 나트륨 카프릴레이트; 약 100 mM 내지 약 400 mM 나트륨 카프릴레이트; 약 100 mM 내지 약 350 mM 나트륨 카프릴레이트; 또는 약 100 mM 내지 약 300 mM 나트륨 카프릴레이트; 및/또는 약 0.25 M 내지 약 2 M 아르기닌; 약 0.5 M 내지 약 1.5 M 아르기닌; 또는 약 0.5 M 내지 약 1 M 아르기닌을 포함한다.

한 실시양태에서, 세척 완충제는 약 0.5 M 내지 약 2 M 아르기닌 및 약 50 mM 내지 약 750 mM 나트륨 카프릴레이트; 약 0.5 M 내지 약 1.5 M 아르기닌 및 약 50 mM 내지 약 500 mM 나트륨 카프릴레이트; 또는 약 0.5 M 내지 약 1.5 M 아르기닌 및 약 50 mM 내지 약 250 mM 나트륨 카프릴레이트를 포함한다.

한 실시양태에서, 세척 완충제는 약 0.5 M 내지 약 1 M 리신, 예컨대 약 0.75 M 리신을 추가로 포함한다. 이러한 실시양태에서, 리신은 초기 세척 완충제에 포함 (즉 동시에 사용)된다. 대안적 실시양태에서, 리신은 별개의 세척 완충제에 포함 (즉, 순차적으로 사용)된다. 본원에 제공된 실시예에 제시된 바와 같이, 리신의 첨가는 용리 부피를 성공적으로 감소시키는 것으로 제시되었다.

재조합 폴리펩티드

한 실시양태에서 폴리펩티드는 항원 결합 폴리펩티드이다. 한 실시양태에서 항원 결합 폴리펩티드는 항체, 항체 단편, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 (dAb), mAbdAb, Fab, F(ab')₂, Fv, 디술피드 연결된 Fv, scFv, 폐쇄된 입체형태 다중특이적 항체, 디술피드-연결된 scFv, 디아바디 또는 가용성 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가 실시양태에서 항원 결합 단백질은 항체, 예를 들어 모노클로날 항체 (mAb)이다. 용어, 재조합 폴리펩티드, 산물 분자 및 mAb는 상호교환가능하게 본원에서 사용된다. 항체는, 예를 들어, 키메라, 인간화 또는 도메인 항체일 수 있다.

용어 Fv, Fc, Fd, Fab, 또는 F(ab)₂는 그들의 표준 의미로 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)] 참조).

"키메라 항체"는 수용자 항체로부터 유래된 경쇄 및 중쇄 불변 영역과 회합된 공여자 항체로부터 유래된 자연 발생 가변 영역 (경쇄 및 중쇄)을 함유하는 조작된 항체의 유형을 지칭한다.

"인간화 항체"는 비-인간 공여자 이뮤노글로불린으로부터 유래된 그의 CDR을 가지며 분자의 나머지 이뮤노글로불린-유래된 부분이 1종 (또는 1종 초과)의 인간 이뮤노글로불린(들)으로부터 유래된 것인 조작된 항체의 유형을 지칭한다. 게다가, 프레임워크 지지 잔기는 결합 친화도를 보존하도록 변경될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Queen et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10032, Hodgson et al., (1991) Bio/Technology, 9:421] 참조). 적합한 인간 수용자 항체는 공여자 항체의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대한 상동성에 의해 통상적인 데이터베이스, 예를 들어, 카바트(KABAT).RTM. 데이터베이스, 로스 알라모스(Los Alamos) 데이터베이스, 및 스위스 프로테인(Swiss Protein) 데이터베이스로부터 선택된 것일 수 있다. 공여자 항체의 프레임워크 영역에 대한 상동성 (아미노산에 기초함)에 의해 특징화된 인간 항체는 공여자 CDR의 삽입을 위한 중쇄 불변 영역 및/또는 중쇄 가변 프레임워크 영역을 제공하는데 적합할 수 있다. 경쇄 불변 또는 가변 프레임워크 영역을 공여할 수 있는 적합한 수용자 항체는 유사한 방식으로 선택될 수 있다. 수용자 항체 중쇄 및 경쇄는 동일한 수용자 항체로부터 기원하도록 요구되지 않는 것이 주지되어야 한다. 선행 기술은 이러한 인간화 항체를 생산하는 여러 방식을 기재한다 - 예를 들어, EP-A-0239400 및 EP-A-054951 참조.

용어 "공여자 항체"는, 그의 가변 영역, CDR, 또는 그의 다른 기능적 단편 또는 유사체의 아미노산 서열을 제1 이뮤노글로불린 파트너에 기부하여, 변경된 이뮤노글로불린 코딩 영역 및 그에 따라 발현되는, 공여자 항체의 항원 특이성 및 중화 활성 특징을 갖는 변경된 항체를 제공하는 항체 (모노클로날 및/또는 재조합)를 지칭한다. 용어 "수용자 항체"는 그의 중쇄 및/또는 경쇄 프레임워크 영역 및/또는 그의 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 코딩하는 아미노산 서열 모두 (또는 임의의 일부, 그러나 일부 실시양태에서는 모두)를 제1 이뮤노글로불린 파트너에 기부하는, 공여자 항체와 이종성인 항체 (모노클로날 및/또는 재조합)를 지칭한다. 특정 실시양태에서 인간 항체는 수용자 항체이다.

"CDR"은 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역인 항체의 상보성 결정 영역 아미노산 서열로서 정의된다. 예를 들어, 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U. S. Department of Health 및 Human Services, National Institutes of Health (1987)] 참조. 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR (또는 CDR 영역)이 이뮤노글로불린의 가변 부분에 존재한다. 이에 따라, 본원에 사용된 바와 같은 "CDR"은 모든 3개의 중쇄 CDR, 또는 모든 3개의 경쇄 CDR (또는 적절한 경우에 모든 중쇄 및 모든 경쇄 CDR 둘 다)을 지칭한다. 항체의 구조 및 단백질 폴딩은 다른 잔기가 항원 결합 영역의 부분으로 간주되고 통상의 기술자에 의해 이해될 것을 의미할 수 있다 (예를 들어 문헌 [Chothia et al., (1989) Nature 342:877-883] 참조).

본원에 사용된 바와 같은 용어 "도메인"은 나머지 단백질과 관계없이 3차원 구조를 갖는 폴딩된 단백질 구조를 지칭한다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 별개의 기능적 특성을 담당하고, 다수의 경우에서 나머지 단백질 및/또는 도메인의 기능을 손실하지 않으면서 다른 단백질에 부가되거나, 제거되거나, 또는 전달될 수 있다. "항체 단일 가변 도메인"은 항체 가변 도메인의 특징적인 서열을 포함하는 폴딩된 폴리펩티드 도메인이다. 따라서, 이는, 예를 들어, 하나 이상의 루프가 항체 가변 도메인의 특징적이지 않은 서열에 의해 대체된, 완전한 항체 가변 도메인 및 변형된 가변 도메인, 또는 말단절단되었거나 또는 N- 또는 C-말단 연장부를 포함하는 항체 가변 도메인, 뿐만 아니라 적어도 전장 도메인의 결합 활성 및 특이성을 보유하는 가변 도메인의 폴딩된 단편을 포함한다.

어구 "이뮤노글로불린 단일 가변 도메인"은 상이한 V 영역 또는 도메인과 관계없이 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 가변 도메인 (V_H, V_HH, V_L)을 지칭한다. 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 다른 상이한 가변 영역 또는 가변 도메인을 가지는 포맷 (예를 들어, 동종- 또는 이종-다량체)으로 존재할 수 있으며, 여기서 다른 영역 또는 도메인은 단일 이뮤노글로불린 가변 도메인에 의한 항원 결합에 요구되지 않는다 (즉, 여기서 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 추가적인 가변 도메인과 관계없이 항원에 결합함). "도메인 항체" 또는 "dAb"는 본원에 사용된 용어와 같은 항원에 결합할 수 있는 "이뮤노글로불린 단일 가변 도메인"과 동일하다. 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 인간 항체 가변 도메인일 수 있지만, 또한 다른 종 예컨대 설치류 (예를 들어, WO 00/29004에 개시된 바와 같음), 너스 상어 및 낙타류 VHH dAb (나노바디)로부터의 단일 항체 가변 도메인을 포함한다. 낙타류 VHH는 낙타, 라마, 알파카, 단봉낙타, 및 구아나코를 포함한 종으로부터 유래된 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드이며, 이는 경쇄가 자연적으로 없는 중쇄 항체를 생산한다. 이러한 VHH 도메인은 관련 기술분야에서 이용가능한 표준 기술에 따라 인간화될 수 있고, 이러한 도메인은 여전히 본 발명에 따른 "도메인 항체"인 것으로 간주된다. 본원에 사용된 바와 같은 "VH"는 낙타류 VHH 도메인을 포함한다. NARV는 너스 상어를 포함한 연골 어류에서 확인되었던 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인의 또 다른 유형이다. 이들 도메인은 또한 신규 항원 수용체 가변 영역 (Novel Antigen Receptor variable region: 흔히 V(NAR) 또는 NARV로 약칭됨)으로도 알려져 있다. 추가의 세부사항에 대해 문헌 [Mol. Immunol. (2006) 44, 656-665] 및 US2005/0043519를 참조한다.

용어 "mAbdAb" 및 dAbmAb"는 모노클로날 항체 및 적어도 1종의 단일 도메인 항체를 포함하는 항원-결합 단백질을 지칭하는 것으로 본원에 사용된다. 두 가지 용어는 상호교환가능하게 사용될 수 있고, 본원에 사용된 바와 동일한 의미를 갖는 것으로 의도된다.

종종, 숙주 세포 단백질로부터의 재조합 폴리펩티드의 정제는 재조합 폴리펩티드의 단편화를 초래한다. 출원인은, 본원에 기재된 정제 방법이 활용될 때, 재조합 폴리펩티드 단편화의 양이 유의하게 감소된다는 것을 발견하였다. 한 실시양태에서, 용리된 재조합 폴리펩티드는 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 미만의 단편화된 재조합 폴리펩티드를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드는 항체이고, 용리된 항체는 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 미만의 단편화된 항체를 함유한다.

숙주 세포 단백질

"불순물"은 용리액 중 초항원 크로마토그래피 전에 또는 초항원 크로마토그래피 후에 로드 샘플에 존재하는 임의의 외부 또는 바람직하지 않은 분자를 지칭한다. "공정 불순물"이 존재할 수 있다. 이들은 관심 단백질이 생산되는 공정의 결과로서 존재하는 불순물이다. 예를 들어, 이들은 숙주 세포 단백질 (HCP), RNA, 및 DNA를 포함한다. "HCP"는, 관심 단백질에 관련되지 않은, 세포 배양 또는 발효 동안 숙주 세포에 의해 생산된 단백질, 예컨대 세포내 및/또는 분비된 단백질을 지칭한다. 숙주 세포 단백질의 예는 정제 동안 및 후에 여전히 존재하는 경우에 관심 단백질에 손상을 야기할 수 있는 프로테아제이다. 예를 들어, 프로테아제가 관심 단백질을 포함하는 샘플 중에 남아있는 경우에, 원래 존재하지 않았던 산물-관련 물질 또는 불순물을 생성할 수 있다. 프로테아제의 존재는 정제 공정 동안 시간 경과에 따라, 및/또는 최종 제제 중에서 관심 단백질의 붕괴, 예를 들어 단편화를 야기할 수 있다.

한 실시양태에서, 숙주 세포 단백질은 포유동물 세포 또는 박테리아 세포로부터 생산/유래된다. 추가 실시양태에서 포유동물 세포는 인간 또는 설치류 (예컨대 햄스터 또는 마우스) 세포로부터 선택된다. 또 다른 추가 실시양태에서 인간 세포는 HEK 세포이거나, 햄스터 세포는 CHO 세포이거나 또는 마우스 세포는 NS0 세포이다.

특정 실시양태에서 숙주 세포는 CHO 세포, NS0 세포, Sp2/0 세포, COS 세포, K562 세포, BHK 세포, PER.C6 세포, 및 HEK 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다 (즉, 숙주 세포 단백질은 이들 숙주 세포로부터 유래됨). 대안적으로, 숙주 세포는 이. 콜라이(E. coli) (예를 들어, W3110, BL21), 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및/또는 다른 적합한 박테리아; 진핵 세포, 예컨대 진균 또는 효모 세포 (예를 들면, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 아스페르길루스 종(Aspergillus sp.), 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa))로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아 세포일 수 있다.

"용액"은 세포 배양 배지, 예를 들어 세포 배양 피드스트림일 수 있다. 피드스트림은 여과될 수 있다. 용액은 정화된 미가공 브로쓰 (CUB) (또는 정화된 발효 브로쓰/상청액)일 수 있다. CUB는 또한 정화에 의해 제거된 임의의 세포 및/또는 세포 파편이 있는 세포 배양 상청액으로서 알려져 있다. 용액은 단백질을 발현하는 세포의 용해된 제제일 수 있다 (예를 들어 용액은 용해물임).

공정 불순물은 또한 세포를 성장시키거나 또는 관심 단백질의 발현을 보장하는데 사용되는 구성성분, 예를 들어, 용매 (예를 들어 효모 세포를 배양하는데 사용되는 메탄올), 항생제, 메토트렉세이트 (MTX), 배지 구성성분, 응집제 등을 포함한다. 또한 이전 단계 동안 샘플 내로 침출된 초항원 고체 상의 부분인 분자, 예를 들어, 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 L이 포함된다.

불순물은 또한, 그들의 활성은 보유하지만 그들의 구조는 상이한 단백질, 및 구조에서의 그들의 차이 때문에 그들의 활성을 상실하는 단백질을 포함하는 "산물-관련 변이체"를 포함한다. 이들 산물-관련 변이체는, 예를 들어, 고분자량 종 (HMW), 저분자량 종 (LMW), 응집된 단백질, 전구체, 분해된 단백질, 미스폴딩된 단백질, 언더디술피드-결합된 단백질, 단편, 및 탈아미드화된 종을 포함한다.

용리액에서의 이들 불순물 중 임의의 하나의 존재는 세척 단계가 성공적이었는지 여부를 확립하기 위해 측정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명자들은 mg 산물당 ng HCP로서 표현된, HCP의 수준에서의 감소를 제시하였다 (실시예 참조). 대안적으로, 검출된 HCP는 ng/mg에 등가인 "백만분율" 또는 "ppm", 또는 pg/mg에 등가인 "ppb" ("십억분율")로서 표현될 수 있다.

한 실시양태에서, 단계 (c) 후에 HCP의 양은 약 200 ng HCP/mg 산물 (즉, ng/mg) 미만; 약 150 ng/mg 미만; 약 100 ng/mg 미만; 약 50 ng/mg 미만; 또는 약 20 ng/mg 미만이다.

감소는 또한 지방족 카르복실레이트 부재 하의 대조군 세척 단계와 비교될 때, 및/또는 정제 전의 용액 (예를 들어 정화된 미가공 브로쓰)과 비교될 때 제시될 수 있다.

한 실시양태에서, 단계 (c) 후에 HCP의 상대 감소 인자는 - 이전에 공개된 100 mM 카프릴레이트 세척제 (예를 들어 WO2014/141150 참조)와 비교 시 - 약 2배 내지 약 50배이다. 따라서, 한 실시양태에서, 단계 (c) 후에 HCP의 상대 감소 인자는 100 mM 카프릴레이트로 본질적으로 이루어진 세척 완충제와 비교 시 약 2배 내지 약 50배이다. 추가 실시양태에서, 상대 감소 인자는 적어도 약 2배, 5배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배 또는 50배이다. 의심을 피하기 위해, "100 mM 카프릴레이트로 본질적으로 이루어진 세척 완충제"에 대한 지칭은 100 mM 카프릴레이트 세척제의 기본 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가적인 구성성분, 예를 들어 완충 염 및/또는 나트륨 아세테이트의 존재를 배제하지 않는다.

한 실시양태에서, 용리액으로부터의 관심 단백질의 회수는, 본 발명의 세척 단계 후, 100% 내지 50% 범위 내 임의의 별개 값 또는 이들 범위 내 별개 값의 임의의 쌍에 의해 정의된 하위 범위를 포함한, 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60%, 50% 또는 그 미만이다. 한 실시양태에서, 용리액으로부터의 관심 단백질의 회수는 70% 초과, 예컨대 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 초과이다. 용리액에서의 퍼센트 (%) 회수는 하기 식에 따라 칼럼에 적용된 관심 단백질의 양의 백분율로서 용리액 중 관심 단백질의 양을 결정함으로써 계산된다:

백분율 회수 = 용리액 중 산물의 양 ÷ 칼럼에 적용된 산물의 양 X 100

용리액에 존재하는 불순물 (즉 숙주 세포 단백질)의 양은 ELISA, OCTET, 또는 상기 기재된 불순물 중 하나 이상의 수준을 결정하기 위한 다른 방법에 의해 결정될 수 있다. 본원에 기재된 실시예에서, ELISA 방법은 샘플 중 HCP의 수준을 결정하는데 사용된다.

한 실시양태에서 숙주 세포 단백질은 PLBL2 (포스포리파제 B-유사 2 단백질) 및/또는 카텝신 L로부터 선택된다.

한 실시양태에서 숙주 세포 단백질은 PLBL2이다. 따라서, 본 발명의 한 측면에서, 포스포리파제 B-유사 2 단백질 (PLBL2)로부터 재조합 폴리펩티드를 정제하는 방법이며, (a) 재조합 폴리펩티드 및 PLBL2를 포함하는 용액을 초항원 크로마토그래피 고체 지지체에 적용하는 단계, (b) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체를 약 150 mM 내지 약 850 mM 카프릴레이트를 포함하는 세척 완충제로 세척하는 단계; 및 (c) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체로부터 재조합 폴리펩티드를 용리하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 포스포리파제 B-유사 2 단백질 (PLBL2)로부터 재조합 폴리펩티드를 정제하는 방법이며, (a) 재조합 폴리펩티드 및 PLBL2를 포함하는 용액을 초항원 크로마토그래피 고체 지지체에 적용하는 단계, (b) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체를 약 55 mM 내지 약 850 mM 카프릴레이트 및 약 0.25 M 내지 약 1.5 M 아르기닌을 포함하는 세척 완충제로 세척하는 단계; 및 (c) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체로부터 재조합 폴리펩티드를 용리하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 포스포리파제 B-유사 2 단백질 (PLBL2)로부터 재조합 폴리펩티드를 정제하는 방법이며, (a) 재조합 폴리펩티드 및 PLBL2를 포함하는 용액을 초항원 크로마토그래피 고체 지지체에 적용하는 단계, (b) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체를 약 100 mM 카프릴레이트 및 약 1.1 M 아르기닌을 포함하는 세척 완충제로 세척하는 단계; 및 (c) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체로부터 재조합 폴리펩티드를 용리하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

PLBL2는, 산물 분자에 대한 명백한 결합으로 인해, 항체, 특히 mAb5 (실시예 참조)의 하류 가공 동안 제거 곤란한 HCP 불순물인 것으로 밝혀진 바 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드는 항체, 예컨대 IgG 항체, 특히 IgG4 항체이다. PLBL2 양은 관련 기술분야에 알려진 방법을 사용하여, 예컨대 ELISA, 예를 들어 실시예에 기재되거나 또는 WO2015/038884에 개시된 PLBL2-특이적 ELISA에 의해 측정될 수 있다.

카텝신 L 프로테아제는 CHO 세포 배양 동안 생산되고 이는 잠재적으로 항체, 예컨대 mAb3 산물 분자 (실시예 참조)를 분해할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드는 항체, 예컨대 IgG 항체, 특히 IgG1 항체이다.

한 실시양태에서 숙주 세포 단백질은 카텝신 L이다. 이러한 실시양태에서, 카텝신 L로부터의 재조합 폴리펩티드의 정제는 단계 (c)의 용리액에서의 감소된 카텝신 L 활성에 의해 (예를 들어 프로모킨(PromoKine) PK-CA577-K142로) 측정될 수 있다.

본 발명의 한 측면에서, 카텝신 L로부터 재조합 폴리펩티드를 정제하는 방법이며, (a) 재조합 폴리펩티드 및 카텝신 L을 포함하는 용액을 초항원 크로마토그래피 고체 지지체에 적용하는 단계, (b) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체를 약 150 mM 내지 약 850 mM 카프릴레이트를 포함하는 세척 완충제로 세척하는 단계; 및 (c) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체로부터 재조합 폴리펩티드를 용리하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 카텝신 L로부터 재조합 폴리펩티드를 정제하는 방법이며, (a) 재조합 폴리펩티드 및 카텝신 L을 포함하는 용액을 초항원 크로마토그래피 고체 지지체에 적용하는 단계, (b) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체를 약 55 mM 내지 약 850 mM 카프릴레이트 및 약 0.25 M 내지 약 1.5 M 아르기닌을 포함하는 세척 완충제로 세척하는 단계; 및 (c) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체로부터 재조합 폴리펩티드를 용리하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 카텝신 L로부터 재조합 폴리펩티드를 정제하는 방법이며, (a) 재조합 폴리펩티드 및 카텝신 L을 포함하는 용액을 초항원 크로마토그래피 고체 지지체에 적용하는 단계, (b) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체를 약 150 mM 카프릴레이트 및 약 1.1 M 아르기닌을 포함하는 세척 완충제로 세척하는 단계; 및 (c) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체로부터 재조합 폴리펩티드를 용리하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

본 발명의 한 측면에서, 본원에 정의된 정제 방법 중 임의의 하나에 의해 수득된 정제된 재조합 폴리펩티드가 제공된다.

본 발명은 이제 하기 비제한적 실시예를 참조하여 기재될 것이다.

폴리소르베이트 분해

폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80은 최종 제제 제품에서 단백질 제약을 안정화시키는데 광범위하게 사용되는 비-이온성 계면활성제이다. 폴리소르베이트는 제약 제품에서 잔류 효소에 의해 분해될 수 있으며, 이는 산물의 궁극적인 저장 수명에 영향을 미칠 수 있다. 이론에 얽매이지는 않지만, 본원에 기재된 방법은 최종 제품에서 잔류 숙주 세포 단백질의 양을 감소시킴으로써 분해된 폴리소르베이트의 양을 감소시킨다. 한 실시양태에서, 분해된 폴리소르베이트의 양은 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 10%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 미만이다.

실시예 1: 단백질 A 세척제 중 pH 및 나트륨 카프릴레이트 농도의 스크리닝 및 최적화

도입

본원에 기재된 작업에서 단백질 A 세척제는 모든 mAb 산물에 대해 2-칼럼 공정 (단백질 A 이어서 음이온 교환)으로 충분한 HCP 제거를 달성하도록 최적화하였다. 기존 플랫폼 공정은 요구되는 HCP 수준을 달성하기 위해 제2 폴리싱 단계를 빈번하게 요구한다. 크로마토그래피 단계를 제거하는 것은 공정을 단순화하고, 더 빠른 공정 개발을 가능하게 하고, 시설 피팅 위험을 완화시킬 수 있다. 세척제 최적화에 대한 전략은 HCP-mAb 상호작용을 붕괴함으로써 HCP 클리어런스를 개선시켰다. 다양한 세척 첨가제 및 세척제 pH를 스크리닝하고 이어서 단백질 A 공정에 걸친 총 HCP 제거에 대해 최적화하였다.

물질 및 방법

나트륨 n-옥타노에이트, 빙초산, 나트륨 아세테이트, 나트륨 히드록시드, 벤질 알콜 및 트리즈마 염기를 시그마-알드리치 케미칼 캄파니(Sigma-Aldrich Chemical Co.) (미주리주 세인트 루이스)로부터 구입하였다. 밀리포어 밀리-큐(Millipore Milli-Q)® 시스템을 사용하여 추가로 정제된 물을 사용하여 용액을 만들었다. 3 M 트리스 염기 또는 3 M 아세트산 중 어느 하나를 사용하여 임의의 pH 조정을 행하였다.

mAb 생산을 위한 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 배양

정화된 미여과 브로쓰 (CUB)는 여러 GSK mAb 산물 예컨대 mAb1 (IgG1, pI = 8.7, MW = 149 kDa), mAb2 (IgG1, pI = 8.3, MW = 149 kDa), mAb3 (IgG1, pI = 7.9, MW = 149 kDa), mAb4 (IgG1, pI = 8.6, MW = 148 kDa), 또는 mAb5 (IgG4, pI = 7.1, MW = 145 kDa) 중 하나를 함유하였다. 유사한 방법을 사용하여 본 연구에 사용되는 모든 mAb를 생산하고 수확하였다. 예를 들어, mAb1은 2 리터 반응기를 mAb1-발현 DG44 세포로 1.23-1.24 MM/mL의 생존 세포 계수 및 ~93.8%의 생존율에서 시딩함으로써 제조하였다. 이어서 배양물을 ~34℃, pH ~6.9, 및 6 g/L의 글루코스에서 16일 동안 유지하였다. 교반 속도를 ~300 rpm으로 유지하였다. 배양 후, 미정화된 세포 및 mAb 함유 배양 유체를 10,000g에서 20분 동안 배치-원심분리하였다. 이어서 배양 유체를 날진(Nalgene)으로부터의 0.45 μM 및 0.2 μM SFCA 필터를 통해 진공-여과하였다.

단백질 A 정제

지이 헬스케어(GE Healthcare)로부터의 맙셀렉트 슈어(MabSelect SuRe)™ (MSS) 단백질 A 수지를 25 cm의 최종 베드 높이까지 0.5 cm 직경 칼럼에 패킹하였다. 수지를, 중력 침강 후에, AKTA 아반트 25를 사용하여 2시간 동안 475 cm/hr의 선형 유속으로 0.4 M NaCl 중에서 유동-패킹하였다. 패킹 품질을 2M NaCl의 100 μL 주사로 평가하여 비대칭이 1.0 +/- 0.2 및 미터당 적어도 1000개 플레이트였다는 것을 확증하였다. 35 mg mAb/mL 수지의 로드 비 및 모든 공정 유속이 사용된 모든 단백질 A 실험은 300 cm/hr의 선형 속도에 등가였다. 단백질 A 크로마토그래피 방법 및 완충제는 표 2에 기재된다.

표 2: 단백질 A 크로마토그래피에 대한 작동 조건 (WO2014/141150)

세척제 최적화

이전 연구는 많은 제거 곤란한 HCP 불순물이 mAb와 직접적으로 회합되는 것으로 제시한 바 있으며 (Levy et al., (2014) Biotechnol. Bioeng. 111(5):904-912; Aboulaich et al., (2014) Biotechnol. Prog. 30(5):1114-1124); HCP-mAb 상호작용을 붕괴하는 용액 조건은 단백질 A 세척 단계 동안 개선된 HCP 클리어런스를 제공할 가능성이 있고 본 작업에서 이러한 목적을 위해 다양한 세척 용액을 스크리닝하고 최적화하였다. 구체적으로, 다양한 pH에서의 상이한 농도의 나트륨 카프릴레이트를 함유하는 세척 용액을 샘플 로드 후에 사용하여 용리 전에 단백질 A-흡착된 mAb로부터 HCP를 클리어링하였다. HCP 제거의 각각의 세척제의 유효성을 평가하고 정량화하기 위해, 사내 HCP ELISA를 하기 ELISA 방법 섹션에 기재된 바와 같이 개발하였다. 나트륨 카프릴레이트는 단백질 A 세척제에 사용될 때 강건한 HCP 클리어런스를 제공하는 것으로 이전에 밝혀졌다. 그러나, 이전 연구는 100 mM 미만의 나트륨 카프릴레이트 농도 및 pH 7.5로 제한하였으며; 초기 스코핑 연구는 농도 및 pH의 범위에 걸친 나트륨 카프릴레이트 단백질 A 세척제의 거동을 특징화하는 구형 중심 복합 설계 연구로 이어졌다. 이들 설계는 하기 표 3 및 4에 제시된다. 통계적 모델링을 하기 통계적 분석 방법 섹션에 따라 완료하였다.

분석

단백질 A 수율

단백질 A 수율을 나노드롭(Nanodrop) 2000c (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 사용하여 용리액 중 mAb 농도를 측정함으로써 결정하였다. 각각의 용리액 샘플에 대한 3가지 나노드롭 판독물을 평균내어 단백질 농도를 결정하였으며; mAb 농도를 용리 부피 (크로마토그램으로부터 결정됨)와 곱하여 단백질 A 용리액 중 총 mAb 함량을 계산하였다. 로드 중 mAb 농도를 애질런트 1100 시리즈 HPLC 상에서 포로스(POROS)® A 20 μM 칼럼을 사용하여 결정하였다. 분석적 단백질 A에 대한 각각의 CUB 샘플에 대한 미가공 데이터를 각각의 특정한 mAb에 대한 기지의 농도를 갖는 표준과 비교하여 역가를 계산하였다. 총 로드 부피를 측정된 역가와 곱하여 로딩된 mAb의 총 질량을 계산하고, 용리액 중 총 mAb를 로드 중 총 mAb로 나누어 수율을 계산하였다.

숙주 세포 단백질 (HCP) 농도 측정: HCP ELISA

HCP ELISA를 사용하는 숙주 세포 단백질 분석을 사내 개발하여 CHO-유래된 산물 샘플 중 면역원성 HCP의 총 양을 정량화하였다 (Mihara et al., (2015) J. Pharm. Sci. 104: 3991-3996). 이러한 HCP ELISA를 주문형 염소 항-CHO HCP 폴리클로날 항체 및 CHO-유래된 산물에 걸친 다중-산물 사용에 대한 사내 생산된 HCP 참조 표준을 사용하여 개발하였다.

통계적 분석

세척제 성능을 HCP 클리어런스 및 수율의 관점에서 분석하기 위해, 스코핑 실험 및 중심 복합 설계 연구를 수행하였다. 인자를 둘 다 -1, 1 단위 스케일에 대해 스케일링하고 일반적 선형 모델을 데이터에 피팅하였다. 별개의 모델을 각각의 반응에 피팅하였다. 일단 최종 모델이 선택되었으면, 잔차에 대한 모델 가정을 평가하고 적절한 경우에 변환을 수행하였다. 모든 모델 항을 5% 유의성 수준에 대하여 평가하고 후진 제거를 모든 2차 인자 항을 포함한 완전 모델로 출발하여 수행하였다.

맙셀렉트 슈어 평형 등온선 측정

맙셀렉트 슈어™ 수지를 DI수로 완충제 교환하여 ~50% 슬러리를 생성하였다. 슬러리를 레지쿼트(ResiQuot)에 첨가하고, 하우스 진공 라인으로 건조시키고, 20.8 μL 수지 플러그를 96-딥 웰 플레이트에 분배하였다. 별개의 96-웰 플레이트에서, 100, 250 및 500 mM 나트륨 카프릴레이트를 함유하는는 0 내지 10 mg/mL 단백질 용액을 생성하였다. 단백질 농도를 각각의 용액에 대해 측정하고 이어서 각각의 수지 플러그에 1 mL를 첨가하였다. 수지-단백질 혼합물을 교반하면서 밤새 평형화하였다. 수지를 직접적으로 UV 96-웰 플레이트로의 여과에 의해 제거하고, 최종 농도를 측정하였다. 흡착된 단백질 농도, q를 하기 방정식으로 계산하였다:

결과 및 논의

본 섹션에 제시된 결과는 고농도의 나트륨 카프릴레이트 (>100 mM)가 이전에 공개된 나트륨 카프릴레이트-기재 단백질 A 세척 완충제보다 단백질 A 크로마토그래피 동안 유의하게 더 많은 숙주 세포 단백질 (HCP)을 제거한다는 것을 입증한다. 이는 상대적으로 높은 HCP 수준을 갖는 여러 mAb를 모델로서 사용하여 입증하였고 통계적 실험 설계에 의해 확증하였으며; 시험된 mAb에 대한 CUB (단백질 A 로드)는 10⁶ 내지 10⁷ ng/mg의 HCP 농도를 가졌다.

이러한 작업의 1차 목적은 단백질 A 크로마토그래피 단계를 거친 HCP 클리어런스에 대한 세척 완충제의 나트륨 카프릴레이트 농도 및 pH의 영향을 평가하는 것이었다. 주요 목표는 2-폴드였다. 첫번째는 나트륨 카프릴레이트 농도 및 pH의 완전 작업 범위에 걸친 HCP에 대한 영향을 이해하는 것이었다. 스코핑 설계는 양쪽 파라미터의 전체 범위를 탐구하는데 사용되었으며 (표 3); 최대 나트륨 카프릴레이트 농도는 1 M이었고, pH 범위는 7-9였다. 두번째 목표는 허용되는 단계 수율을 유지하면서 HCP 클리어런스에 대한 나트륨 카프릴레이트 농도 및 pH를 최적화하는 것이었다. 구형 중심 복합 설계 (CCD, 표 4)를 이러한 최적화에 사용하였다. 스코핑 및 CCD 연구 둘 다는 mAb1을 모델 mAb로서 사용하였다. 이들 초기 연구로부터의 조사결과를 추가적인 mAb에 대해 시험하였다. 스코핑 및 CCD 둘 다로부터의 결과는 하기 제시된다.

표 3: 단백질 A 세척제 중 나트륨 카프릴레이트 농도 최대 1 M 및 pH 7.0 내지 9.0을 탐구하기 위한 스코핑 연구 설계

표 4: 단백질 A 세척제 중 나트륨 카프릴레이트 농도 및 pH를 최적화하기 위한 구형 중심 복합 실험 설계.

CCD 연구로부터 수득된 결과는 표 5에 제시된다. 전반적으로, 단백질 A 세척 완충제의 pH는 HCP 클리어런스에 대해 최소 영향을 가졌다. 500 mM 또는 750 mM 나트륨 카프릴레이트를 함유하는 세척제는 시험된 전체 pH 범위에 걸쳐 거의 동일한 HCP 수준을 가졌다. 통계적 분석은 방법 섹션에서 기재된 바와 같이 수행하였다. 간략하게, 별개의 모델을 각각의 반응 (수율 및 HCP)에 피팅하였고, 모델 항을 F-검정을 사용하여 5% 유의성에 대하여 평가하였다. F-검정은 세척제 pH가 HCP 농도에 대해 통계적으로 유의한 효과를 갖지 않았다는 것을 확증하였다. 유사한 분석은 또한 pH가 퍼센트 수율에 대한 유의한 인자가 아니었다는 것을 확증하였다.

표 5: (mAb1로 시험된) 단백질 A 세척 용액의 나트륨 카프릴레이트 농도 및 pH에 대한 중심 복합 설계의 결과.

CCD 결과의 통계적 분석은 나트륨 카프릴레이트 농도가 HCP 클리어런스 및 퍼센트 수율 둘 다에 대하여 - 선형 및 2차 항 둘 다로 - 유의한 인자라는 것을 확증하였다. HCP 농도 (ng/mg)는 나트륨 카프릴레이트 농도가 0에서 1 M로 증가했을 때 두 자릿수만큼 감소하였다 (도 1 - 퍼센트 수율 (삼각형, ▲) 및 HCP 농도 (사각형, ■)). 그러나, 나트륨 카프릴레이트 농도가 250 mM를 넘어 증가함에 따라, 수율은 90% 초과에서 70%로 떨어진다 (도 1). 250 mM 나트륨 카프릴레이트 초과의 단계 수율에서의 이러한 큰 저하는 카프릴레이트 미셀의 형성에 기인할 수 있다. 단백질 A 세척 완충제 중 카프릴레이트 임계 미셀 농도 (CMC)는 340 mM인 것으로 실험적으로 결정하였다. 나트륨 카프릴레이트의 농도가 250 mM에서 500 mM로 증가하였을 때 수율에서의 15% 저하 및 HCP에서의 단지 2.8% 저하가 있었다. 이는 유리 형태의 나트륨 카프릴레이트가 HCP 제거를 위한 활성 형태이면서, 카프릴레이트 미셀이 수율 손실을 야기하기 때문에 CMC 초과의 임의의 농도가 수확 체감을 제시한다는 것을 나타낼 수 있다.

실시예 2: 수율 손실 및 잠재적 완화 전략의 조사

CMC 초과의 퍼센트 수율에서의 저하는 - 유리 형태의 카프릴레이트보다는 오히려 - 카프릴레이트 미셀이 단백질 A 단계를 거쳐 수율을 감소시킬 수 있다는 것을 시사한다. 수율 손실의 성질을 결정하기 위해, mAb 농도를 다양한 나트륨 카프릴레이트 세척제로의 단백질 A 공정에 대해 용리액, 스트립, 및 세척 분획에서 측정하였다 (도 2). 이러한 결과는 높은 나트륨 카프릴레이트 농도에서의 수율 손실이 세척 단계 동안의 탈착에 기인하였다는 것을 입증한다.

고농도 나트륨 카프릴레이트 세척제에서의 수율 손실을 추가로 특징화하기 위해, 평형 결합 등온선을 측정하여 높은 나트륨 카프릴레이트 농도에서의 mAb 용량 손실을 결정하였다 (도 3). 100 mM 나트륨 카프릴레이트를 함유하는 이전에 공개된 카프릴레이트 세척제는 랭뮤어 등온선으로 피팅하였을 때 57 g/L의 최대 결합 능력을 가졌다. 흡착 등온선은 250 mM 나트륨 카프릴레이트에서 유사했지만, 500 mM 나트륨 카프릴레이트에서 랭뮤어 등온선은 불량한 피팅이었다. 이러한 결과는 고농도 나트륨 카프릴레이트 세척제가 단백질 A 수지의 결합 능력을 저하시키고 수율 손실을 야기한다는 것을 확증한다.

수율 손실의 근원을 결정한 후, 수율 손실을 감소시키는 방법을 조사하였다. 조사된 2가지 전략은 저하된 세척제 부피 및 저하된 로드 비였다. 250 mM 나트륨 카프릴레이트 세척제를 4, 6, 및 8 CV에서 시험하였다. 8에서 4 CV로 세척 길이를 저하시키는 것은 수율에서 단지 2% 증가만을 제공하였고 (표 6), HCP 농도는 단지 31.0에서 35.8 ng/mg으로 증가하였다. 이는 고농도 나트륨 카프릴레이트 세척제가 초기 스코핑 및 CCD 연구 동안 시험된 것보다 더 작은 부피로 허용되는 HCP 수준을 달성할 수 있다는 것을 나타내었고, 이는 또한 더 작은 세척제 부피가 높은 나트륨 카프릴레이트 농도로 저하된 결합 용량을 보상하지 않는다는 것을 입증하였다.

표 6: mAb1을 모델로서 사용한 상이한 부피의 250 mM 나트륨 카프릴레이트 세척제에 대한 HCP 농도 및 단백질 A 단계 수율.

단백질 A 포획 동안의 저하된 로드 비를 또한 고농도 나트륨 카프릴레이트 세척제에서의 수율 손실에 대한 완화로서 조사하였다 (표 7). 로드 비가 30 mg/ml에서 10 mg/ml로 저하되었을 때, 수율은 250 mM 및 500 mM 나트륨 카프릴레이트 세척제에 대해 각각 4.7% 및 7.7%만큼 증가하였다. 로드 비는 단백질 A 용리액 중 HCP 농도에 대해 최소 영향을 가졌다.

표 7: mAb1을 모델로서 사용한 250 mM 및 500 mM 나트륨 카프릴레이트 세척제 둘 다로의 다양한 단백질 A 로드 비에 대한 HCP 농도 및 단백질 A 단계 수율.

실시예 3: 추가적인 mAb로의 개선된 세척제의 성능

이전의 단백질 A 세척제 최적화 연구를 단지 mAb1을 모델 산물로서 사용하여 완료하였다. CCD 연구는 pH가 HCP 제거를 위한 유의한 인자가 아니었다는 것을 확증하였다. 통계적 분석 및 후속 수율 조사는 나트륨 카프릴레이트 농도가 최대 400 mM에서 최적이었다는 것을 나타내었다. 이전에 개발된 100 mM 나트륨 카프릴레이트 세척제 대비 250 mM 나트륨 카프릴레이트 세척제의 개선된 HCP 제거를 확증하기 위해, 추가적인 mAb를 본 섹션에서 연구하였다. 5종의 mAb에 대한 단백질 A 용리액 중 HCP 농도를 100 또는 250 mM 나트륨 카프릴레이트 중 어느 하나를 함유하는 세척제에 대해 비교하였다 (도 4). 1종의 mAb (mAb3)는 2가지 별개의 상류 공정으로부터 공급받았다: 더 높은 수준의 HCP를 수반한 높은 세포 밀도 공정 및 연구된 다른 분자와 필적할만한 표준 공정.

mAb2를 제외하고는, 여기서 시험된 모든 mAb는 250 mM 나트륨 카프릴레이트 세척제를 사용할 때 단백질 A 용리액 중 100 ng/mg 미만을 가졌다. 대부분의 경우에, HCP 농도는 단순히 세척제 중 나트륨 카프릴레이트 농도를 증가시킴으로써 대략 한 자릿수만큼 개선되었다. 추가적으로, 이들 mAb는 상승된 나트륨 카프릴레이트 농도로 허용되는 단계 수율 및 산물 품질을 가졌다.

실시예 4: 아르기닌의 나트륨 카프릴레이트-기재 단백질 A 세척제에의 첨가

아미노산인 아르기닌은 지방산인 나트륨 카프릴레이트와 비교하여 매우 상이한 물리적 및 화학적 특성을 갖는다. 이들 2종의 첨가제 사이의 구조적 차이가 직교 HCP 제거 메카니즘으로 이어질 수 있으며, 즉 아르기닌 및 카프릴레이트의 혼합물이 단지 단일 구성성분을 함유하는 세척제보다 더 우수한 HCP 제거를 가질 수 있다는 것이 가설화되었다. 하기 연구를 완료하여 카프릴레이트/아르기닌 혼합물에 대한 총 HCP 제거 및 특이적 HCP 제거 둘 다를 평가하였다.

카프릴레이트/아르기닌 단백질 A 세척 완충제로의 총 HCP 클리어런스

나트륨 카프릴레이트 및 아르기닌의 조합을 함유하는 단백질 A 세척 완충제를 mAb1 및 mAb2로 시험하였다. mAb2에 대한 결과는 도 5에 제시된다. 단지 100 mM 나트륨 카프릴레이트 또는 750 mM 아르기닌을 함유하는 단백질 A 세척 완충제는 HCP 농도 700 내지 1300 ng/mg을 초래하였다. 나트륨 카프릴레이트 농도를 250 mM로 증가시키는 것은 상기 논의된 '고농도 나트륨 카프릴레이트' 결과와 일치하는 HCP 클리어런스에 대한 큰 개선을 초래하였다. pH 8.5에서의 250 mM 나트륨 카프릴레이트를 함유하는 세척제는 단백질 A 용리액 중 273 ng/mg HCP를 초래하였다. 아르기닌의 카프릴레이트-기재 단백질 A 세척제에의 첨가는 HCP 제거를 추가로 개선시켰다: pH 7.5 또는 8.5 중 어느 하나에서의 250 mM 나트륨 카프릴레이트와 750 mM 아르기닌은 각각 209 및 144 ng/mg의 HCP 농도를 초래함.

유사한 카프릴레이트/아르기닌 연구를 mAb1로 완료하였다. mAb1은 2가지 별개의 상류 공정으로부터 공급받았다: '표준' 페드-배치 생물반응기 및 높은 세포 밀도 공정. 높은 세포 밀도 공정은 더 높은 산물 역가 및 HCP 농도를 초래하였다. 그것은 '최악의 경우' 피드 물질로서 본 연구에 포함되었다. 결과는 도 6에 제시된다.

전반적으로, mAb1 결과는 도 5에 제시된 mAb2 조사결과와 유사하다. 표준 mAb1 피드 스트림 및 고밀도 물질 둘 다에 대해, 100에서 250 mM로 나트륨 카프릴레이트를 증가시킴으로써 HCP 클리어런스가 개선되었다. 추가적으로, 500 mM 아르기닌은 나트륨 카프릴레이트-단독 세척제 중 어느 하나보다 더 우수한 HCP 클리어런스를 가졌다. 그러나, 나트륨 카프릴레이트 및 아르기닌 둘 다로의 - 혼합물로서 또는 순차적인 세척제를 적용함으로써 - 세척은 개별적으로 구성성분 중 어느 하나 대비 개선된 HCP 클리어런스를 제시하였다. 최고 성능은 pH 8.5에서의 250 mM 나트륨 카프릴레이트 및 750 mM 아르기닌을 함유하는 세척제였다. 고농도 나트륨 카프릴레이트 및 아르기닌의 이러한 조합은 고밀도 및 표준 mAb1에 대해 각각 113 및 67 ng/mg의 단백질 A 용리액을 생성하였다.

실시예 5: PLBL2를 제거하기 위한 카프릴레이트/아르기닌 단백질 A 세척제

PLBL2는, 산물 분자에 대한 명백한 결합으로 인해, IgG4인 mAb5의 하류 가공 동안 제거하기 곤란한 특이적 HCP 불순물이다. 이러한 특정한 HCP 불순물은 하류 가공 동안 IgG4 산물에 결합하는 것으로 이전에 밝혀진 바 있다. PLBL2는 또한 HCP ELISA 분석 동안 '희석성 비-선형성'을 야기한다. 높은 나트륨 카프릴레이트 농도 및/또는 아르기닌을 함유하는 단백질 A 세척제를 mAb5에 대한 단백질 A 단계 동안의 PLBL2 제거에 대해 시험하였다.

세척제를 나트륨 카프릴레이트 농도 최대 750 mM, pH 7.5 내지 8.5, 및 아르기닌 농도 최대 1 M로 시험하였다. 각각의 단백질 A 세척제 시험에 대해 총 PLBL2 농도 (도 7, PLBL2-특이적 ELISA를 사용하여 측정됨)를 총 HCP (도 8), 및 단계 수율 (도 9)과 함께 보고하였다.

PLBL2 농도는 상이한 시험 세척제에 대해 거의 1 내지 600 ng/mg으로 달라졌다. 아르기닌이 없고 100 mM 미만의 나트륨 카프릴레이트를 함유하는 세척제가 가장 불량하게 수행되었고 대략 600 ng/mg PLBL2를 갖는 단백질 A 용리액을 생성하였다. 나트륨 카프릴레이트 농도를 250 mM로 증가시키는 것은 PLBL2를 ~100 ng/mg로 감소시켰으며; 250 mM 초과의 나트륨 카프릴레이트 농도는 PLBL2를 ~50 ng/mg로 계속 저하시켰지만, 또한 수율 손실을 초래하였다. 총 HCP는 또한 나트륨 카프릴레이트를 증가시키면 일반적으로 저하하였다.

아르기닌을 함유하는 단백질 A 세척제는 PLBL2 클리어런스의 관점에서 가장 성공적이었고, 이들은 또한 총 HCP의 우수한 제거를 입증하였다. 나트륨 카프릴레이트가 없는 1000 mM 아르기닌은 ~10 ng/mg PLBL2 및 62 ng/mg HCP를 초래하였다. 고농도의 아르기닌은 유의한 수율 손실을 야기하지 않았다.

나트륨 카프릴레이트 및 아르기닌의 조합은 mAb5에 대해 가장 효과적인 세척제였다. 구체적으로, pH 7.5 또는 8.5에서의 250 mM 나트륨 카프릴레이트와 1 M 아르기닌은 ~90% 단계 수율을 유지하면서 2-3 ng/mg PLBL2 및 ~20-30 ng/mg HCP를 초래하였다. 1 M 아르기닌 및 100 mM 나트륨 카프릴레이트를 함유하는 세척제가 또한 성공적이었지만, 다소 더 높은 PLBL2 및 HCP 농도를 초래하였다.

실시예 6: 카텝신 L 활성 감소를 위한 카프릴레이트/아르기닌 세척제

나트륨 카프릴레이트 및 아르기닌을 함유하는 단백질 A 세척제를 카텝신 L 클리어런스 능력에 대해 mAb3으로 시험하였다. 카텝신 L 프로테아제는 CHO 세포 배양 동안 생산되고 이는 잠재적으로 mAb3 산물 분자를 분해할 수 있다. 카텝신 L은 단백질 A 공정 동안 mAb3으로부터 제거되지 않는 것으로 입증되어 있다. 100 mM 나트륨 카프릴레이트, 250 mM 나트륨 카프릴레이트, 100 mM 나트륨 카프릴레이트와 1000 mM 아르기닌, 및 100 mM 나트륨 카프릴레이트와 750 mM 리신을 함유하는 세척제를 시험하였다.

이러한 특이적 산물에 대한 250 mM 나트륨 카프릴레이트를 함유하는 세척제는 예상외의 단백질 A 용리 거동을 초래하였다: 통상적으로 ~2 칼럼 부피로 완료된 낮은 pH 용리는 10 칼럼 부피 초과로 확대되었다. 추가적으로, mAb3 단백질 A 용리액은 250 mM 나트륨 카프릴레이트 세척제를 시험하였을 때 매우 높은 응집체 (SEC에 의해 측정됨)를 가졌다. 이러한 거동은 고농도 나트륨 카프릴레이트 세척제로 시험된 임의의 다른 산물로는 관찰되지 않았다.

아르기닌 또는 리신을 함유하는 단백질 A 세척제는 250 mM 나트륨 카프릴레이트 단독으로 관찰되었던 확대된 용리 거동을 갖지 않았다. 3종의 상이한 세척제에 대한 단백질 A 용리액 (100 mM 카프릴레이트 ("플랫폼 msss 용리액"); 250 mM 카프릴레이트, 1M 아르기닌 ("cap/arg msss 용리액"); 250 mM 카프릴레이트, 750 mM 리신 ("cap/lys msss 용리액"))에서 측정된 카텝신 L 활성은 도 10에 보고되며; 단백질 A 용리 부피는 표 8에 열거된다. 측정된 활성은 100 mM 나트륨 카프릴레이트, 1000 mM 아르기닌 세척제로 유의하게 저하되었고, 후속 안정성 연구는 단편화가 100 mM 나트륨 카프릴레이트 세척제와 비교하여 이러한 세척제를 사용하여 제조된 물질에 대해 저하되었다는 것을 입증하였다. 아르기닌보다는 오히려 750 mM 리신의 첨가가 큰 용리 부피를 성공적으로 저하시켰지만, 카텝신 L 활성을 유의하게 저하시키지 않았다. 나트륨 카프릴레이트 및 1000 mM 아르기닌의 조합은 합리적인 용리 부피 및 허용되는 산물 품질 속성을 유지하면서 개선된 카텝신 L 및 총 HCP 클리어런스를 제공하였다.

표 8: 상이한 세척 용액으로의 mAb3에 대한 단백질 A 용리액 부피.

실시예 7: HCP를 제거하기 위한 카프릴레이트/아르기닌 단백질 A 세척제

나트륨 카프릴레이트 및 아르기닌을 함유하는 단백질 A 세척제를 HCP 클리어런스 능력에 대하여 mAb3으로 시험하였다. 세척 완충제 농도 및 생성된 HCP 농도는 하기 표 9에 요약된다. 아르기닌/카프릴레이트 세척제를 mAb3에 대하여 카프릴레이트-단독 세척제와 비교하였다.

150 mM 카프릴레이트 세척제는 100 mM 카프릴레이트 세척제보다 유의하게 더 높은 HCP 클리어런스를 제공한다. 1.1 M 아르기닌 및 150 mM 카프릴레이트의 조합은 유의한 인자만큼 HCP 클리어런스를 추가로 개선시킨다. 단백질 A 단계 동안의 HCP의 개선된 클리어런스는 카프릴레이트-단독 공정에서 요구되었던 최종 폴리싱 크로마토그래피 단계의 제거를 가능하게 하였다.

표 9

실시예 8: mAb3 단편화에서의 저하

나트륨 카프릴레이트 및 아르기닌을 함유하는 세척제로의 mAb3의 단백질 A 정제를 정제 동안의 항체 단편화에 대해 시험하였다. 데이터 (도 11 - 13)를 100 mM 카프릴레이트 세척제를 함유하는 세척 완충제의 3개 배치, 및 150 M 카프릴레이트 플러스 1.1 M 아르기닌을 함유하는 세척 완충제의 2개 배치를 포함하여 생성하였다.

도 11은 전체 하류 공정 전반에 걸친 퍼센트 항체 단편화 (SEC HPLC로 측정됨)를 제시한다. 도 12는 공정을 통한 HCP 농도를 입증한다. 카프릴레이트/아르기닌 배치는 공정 동안 유의한 항체 단편화 형성을 갖지 않는 반면에, 카프릴레이트-단독 배치는 제3 폴리싱 단계 (카프릴레이트/아르기닌 세척제가 요구되지 않음) 후 유의한 항체 단편화 생성을 갖는다.

게다가, 공정 둘 다 (카프릴레이트-단독 및 카프릴레이트+아르기닌)에 의해 생산된 벌크 약물 물질의 안정성을 비교하였다. 카프릴레이트+아르기닌 공정으로부터의 벌크 약물 물질은 25℃에서 10일 이내에 항체 단편화를 생성하지 않았으며; 카프릴레이트-단독 공정으로부터의 벌크 약물 물질은 25℃에서 10일 동안 유의한 항체 단편화를 생성한다 (도 13).

세척 완충제 중 카프릴레이트 및 아르기닌의 조합은 카텝신 L의 개선된 클리어런스로 인해 하류 공정 전반에 걸쳐 항체 단편화의 생성을 유의하게 저하시킨다.

결론

단백질 A 단계를 거친 HCP 클리어런스는 HCP-mAb 상호작용을 최소화하도록 세척 완충제를 변형시킴으로써 최적화하였다. 초기 스크리닝 연구는 - 7 내지 9로 달라진 - 단백질 A 세척 완충제의 pH가 HCP 클리어런스 또는 단계 수율에 유의하게 영향을 미치지 않는 것으로 결론지었다. 나트륨 카프릴레이트 농도는 단계 수율 및 HCP 제거 둘 다에 대해 강력한 효과를 갖는다. 매우 높은 나트륨 카프릴레이트 농도 (CMC 초과)에서 HCP 클리어런스는 최적이지만, 단계 수율은 매우 낮다. 본 연구는 250 mM 나트륨 카프릴레이트를 함유하는 단백질 A 세척제를 활용하는 것이 허용되는 단계 수율을 유지하면서 이전에 사용된 100 mM 나트륨 카프릴레이트 세척제와 비교하여 HCP 클리어런스의 큰 개선을 제공한다는 것을 밝혀내었다. 본 연구는 또한 250 mM 나트륨 카프릴레이트 및 500-1000 mM 아르기닌의 조합을 함유하는 단백질 A 세척제가 단지 나트륨 카프릴레이트만을 함유하는 세척제와 비교하여 더 큰 HCP 클리어런스를 갖는다는 것을 밝혀내었다. 나트륨 카프릴레이트 및 아르기닌을 함유하는 단백질 A 세척제는 각각 mAb3 및 mAb5로부터 2종의 특별히 곤란한 HCP 불순물인 카텝신 L 및 PLBL2를 성공적으로 제거하는 것으로 밝혀졌다.

본원에 기재된 실시양태는 본 발명의 모든 측면에 적용될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 게다가, 본 명세서에서 인용된 특허 및 특허 출원을 포함하나 이에 제한되지는 않는 모든 간행물은 완전히 제시된 것처럼 본원에 참조로 포함된다.

Claims

숙주 세포 단백질 (HCP)로부터 재조합 폴리펩티드를 정제하는 방법이며, (a) 재조합 폴리펩티드 및 HCP를 포함하는 용액을 초항원 크로마토그래피 고체 지지체에 적용하는 단계, (b) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체를 적어도 약 100 mM의 카프릴레이트 및 적어도 약 0.5 M의 아르기닌을 포함하는 세척 완충제로 세척하는 단계; 및 (c) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체로부터 재조합 폴리펩티드를 용리하는 단계를 포함하고, 여기서 '약'은 ±20%를 의미하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 카프릴레이트가 나트륨 카프릴레이트인 방법.
제1항에 있어서, 세척 완충제가 약 100 mM 내지 약 300 mM 카프릴레이트를 포함하고, 여기서 '약'은 ±20%를 의미하는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세척 완충제가 약 0.75 M 내지 약 1.5 M 아르기닌을 포함하고, 여기서 '약'은 ±20%를 의미하는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세척 완충제가 약 0.5 M 내지 약 1 M 리신을 추가로 포함하고, 여기서 '약'은 ±20%를 의미하는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 용리된 재조합 폴리펩티드가 약 2% 미만의 단편화된 재조합 폴리펩티드를 함유하고, 여기서 '약'은 ±20%를 의미하는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, HCP가 포유동물 세포로부터 유래되는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, HCP가 포스포리파제 B-유사 2 단백질인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, HCP가 카텝신 L인 방법.
제9항에 있어서, 카텝신 L로부터의 재조합 폴리펩티드의 정제가 단계 (c)의 용리액에서의 감소된 카텝신 L 활성에 의해 측정되는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세척 완충제의 pH가 pH 7 내지 pH 9; 또는 pH 7.5 내지 pH 8.5인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 폴리펩티드가 모노클로날 항체 (mAb)인 방법.
제12항에 있어서, mAb가 IgG1, 또는 IgG4인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세척 완충제가 나트륨 클로라이드를 함유하지 않는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 초항원이 단백질 A, 단백질 G, 및 단백질 L로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c) 후에 HCP의 양이 약 200 ng HCP/mg 산물 미만이고, 여기서 '약'은 ±20%를 의미하는 것인 방법.
숙주 세포 단백질 (HCP)로부터 재조합 폴리펩티드를 정제하는 방법이며, (a) 재조합 폴리펩티드 및 HCP를 포함하는 용액을 초항원 크로마토그래피 고체 지지체에 적용하는 단계; (b1) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체를 적어도 약 100 mM의 카프릴레이트를 포함하는 세척 완충제로 세척하는 단계; (b2) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체를 적어도 약 0.5 M의 아르기닌을 포함하는 세척 완충제로 세척하는 단계; 및 (c) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체로부터 재조합 폴리펩티드를 용리하는 단계를 포함하고, 여기서 '약'은 ±20%를 의미하는 것인 방법.
숙주 세포 단백질 (HCP)로부터 재조합 폴리펩티드를 정제하는 방법이며, (a) 재조합 폴리펩티드 및 HCP를 포함하는 용액을 초항원 크로마토그래피 고체 지지체에 적용하는 단계; (b1) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체를 적어도 약 0.5 M의 아르기닌을 포함하는 세척 완충제로 세척하는 단계; (b2) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체를 적어도 약 100 mM의 카프릴레이트를 포함하는 세척 완충제로 세척하는 단계; 및 (c) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체로부터 재조합 폴리펩티드를 용리하는 단계를 포함하고, 여기서 '약'은 ±20%를 의미하는 것인 방법.
포스포리파제 B-유사 2 단백질로부터 재조합 폴리펩티드를 정제하는 방법이며, (a) 재조합 폴리펩티드 및 HCP를 포함하는 용액을 초항원 크로마토그래피 고체 지지체에 적용하는 단계, (b) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체를 약 100 mM 카프릴레이트 및 약 1.1 M 아르기닌을 포함하는 세척 완충제로 세척하는 단계; 및 (c) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체로부터 재조합 폴리펩티드를 용리하는 단계를 포함하고, 여기서 '약'은 ±20%를 의미하는 것인 방법.
카텝신 L로부터 재조합 폴리펩티드를 정제하는 방법이며, (a) 재조합 폴리펩티드 및 HCP를 포함하는 용액을 초항원 크로마토그래피 고체 지지체에 적용하는 단계, (b) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체를 약 150 mM 카프릴레이트 및 약 1.1 M 아르기닌을 포함하는 세척 완충제로 세척하는 단계; 및 (c) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체로부터 재조합 폴리펩티드를 용리하는 단계를 포함하고, 여기서 '약'은 ±20%를 의미하는 것인 방법.
숙주 세포 단백질 (HCP)로부터 재조합 폴리펩티드를 정제하는 방법이며, (a) 재조합 폴리펩티드 및 HCP를 포함하는 용액을 초항원 크로마토그래피 고체 지지체에 적용하는 단계; (b) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체를 적어도 250 mM의 농도로 카프릴레이트를 포함하는 세척 완충제로 세척하는 단계; 및 (c) 초항원 크로마토그래피 고체 지지체로부터 재조합 폴리펩티드를 용리하는 단계를 포함하는 방법.