JP6367277B2 - 抗体精製 - Google Patents

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Description

タンパク質の大規模で、経済的な精製は、バイオテクノロジー産業にとって、益々重要な問題となっている。一般に、タンパク質は、目的のタンパク質に対する遺伝子を含む組み換えプラスミドの挿入によって目的のタンパク質を産生するように操作された哺乳動物又は細菌の細胞株の何れかを用いて、細胞培養によって作製される。使用される細胞株は生きた生物であるので、それらには、通常、動物血清の調製物から供給される、糖、アミノ酸及び成長因子を含む複雑な増殖培地を与えなければならない。ヒトの治療薬として使用するのに十分な純度まで、細胞に与えられた化合物の混合物から、及び細胞自体の副産物から所望のタンパク質を分離することは、厄介な課題である。
プロカテプシンＬを含む宿主細胞タンパク質の低下した量を含む抗体調製物を取得する改善された方法に対する要求が存在する。本発明は、得られた抗体調製物がプロカテプシンＬを含む宿主細胞タンパク質の低下した量を含む、宿主細胞発現系内で発現された抗体を精製するための方法を提供する。本発明の改善された方法は、宿主細胞タンパク質を正確に検出する再現可能な方法及び速度論アッセイの開発も含む。
本発明は、抗体及び少なくとも１つのＨＣＰを含む混合物から、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）が減少した抗体調製物を作製するための方法であり、イオン交換分離工程を含み、ＨＣＰが減少した抗体調製物が得られるように、混合物が第一のイオン交換材料に供せられる、方法を提供する。一実施形態において、イオン交換分離工程は、ＨＣＰの低下したレベルを有する第一の溶出液が得られるように、第一のイオン交換材料上に混合物を通過させることを含む。一実施形態において、本発明の方法は、ＨＣＰの低下したレベルを有する第一の貫流が得られるように、第二のイオン交換材料に第一の溶出液が供される第二のイオン交換分離工程をさらに含む。別の実施形態において、本発明の方法は、ＨＣＰの低下したレベルを有する第二の溶出液が得られるように、第一の疎水性相互作用材料に第一の貫流が供される疎水性相互作用分離工程をさらに含む。
本発明の一実施形態において、イオン交換分離工程は、ＨＣＰの低下したレベルを有する第一の溶出液が得られるように、第一のイオン交換材料上に混合物が装填される第一のイオン交換クロマトグラフィー工程を含む。一実施形態において、本発明は、第一の貫流が得られるように、第二のイオン交換材料を含むカラム上に第一の溶出液を装填することを含む第二のイオン交換クロマトグラフィーをさらに含む。
一実施形態において、本発明は、第二の溶出液が得られるように、第一の疎水性相互作用材料を含むカラム上に第一の貫流を装填することを含む疎水性相互作用分離工程をさらに含む。一実施形態において、疎水性相互作用分離工程は、疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む。一実施形態において、疎水性相互作用クロマトグラフィーは、フェニルセファロースクロマトグラフィーである。さらに別の実施形態において、疎水性相互作用材料上に装填される抗体の量は、疎水性相互作用材料１リットル当り抗体約２０から約４０ｇの範囲である。さらに別の実施形態において、疎水性相互作用材料上に装填される抗体の量は、疎水性相互作用材料１リットル当り抗体約３０から約３６ｇの範囲である。
一実施形態において、イオン交換クロマトグラフィー工程は、陽イオン交換クロマトグラフィーである。別の実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィーは、スルホナート基に付着された、メタクリラートをベースとした合成ポリマー性樹脂である。さらに別の実施形態において、本発明は、複数の洗浄工程でイオン交換材料を洗浄することをさらに含む。一実施形態において、複数の洗浄工程は、伝導度の増加を含む。一実施形態において、イオン交換材料は、約４０から５０％の溶出緩衝液及び約５０から６０％の水（例えば、注射用水（ＷＦＩ））を含む洗浄液で洗浄される。一実施形態において、溶出緩衝液は、２０ｍＭＮａ２ＰＯ４、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７である。
一実施形態において、第一の溶出液は、第一のイオン交換クロマトグラフィー工程の前に、ウイルスの不活化に供せられる。一実施形態において、ウイルスの不活化は、ｐＨウイルス不活化（第一の溶出液のｐＨを低下させ、これにより、ウイルスを不活化する。）を通じて達成される。
本発明の一実施形態において、第二のイオン交換クロマトグラフィー工程は、陰イオン交換クロマトグラフィーを含む。一実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーは、フェニルセファロースクロマトグラフィーである。
本発明は、抗体及び少なくとも１つのＨＣＰを含む混合物から、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）が減少した抗体調製物を作製するための方法であり、第一の溶出液のｐＨ及び伝導度が第二のイオン交換材料のｐＨ及び伝導度と実質的に同様であるように、第一の溶出液のｐＨ及び伝導度を変化させることによって、ＨＣＰの減少したレベルが達成される、方法も提供する。一実施形態において、第二のイオン交換材料のｐＨは、約７．７から約８．３の範囲である。別の実施形態において、第一の溶出液のｐＨは、約７．７から約８．３の範囲である。さらに別の実施形態において、第一の溶出液のｐＨは、約８．０まで変化される。一実施形態において、第二のイオン交換材料の伝導度は、約３．５ｍＳ／ｃｍから約５．２ｍＳ／ｃｍ又は約３．５ｍＳ／ｃｍから約４．９ｍＳ／ｃｍの範囲である。一実施形態において、第一の溶出液の伝導度は、約３．５ｍＳ／ｃｍから約５．２ｍＳ／ｃｍ又は約３．５ｍＳ／ｃｍから約４．９ｍＳ／ｃｍの範囲である。
本発明の一実施形態において、第一の溶出液は、ＨＣＰＥＬＩＳＡによって測定された場合に、混合物より約９０から約１００倍の範囲少ないＨＣＰを含む。別の実施形態において、第一の貫流は、ＨＣＰＥＬＩＳＡによって測定された場合に、第一の溶出液より約８４０から約８５０倍の範囲少ないＨＣＰを含む。さらに別の実施形態において、第二の溶出液は、ＨＣＰＥＬＩＳＡによって測定された場合に、第一の貫流より約３から約５倍の範囲少ないＨＣＰを含む。
本発明は、抗体及びプロカテプシンＬを含む混合物から、プロカテプシンＬが減少した抗体調製物を作製するための方法であり、イオン交換分離工程を含み、プロカテプシンＬが減少した抗体調製物が得られるように、混合物が第一のイオン交換材料に供せられる、方法を提供する。
一実施形態において、イオン交換分離工程は、プロカテプシンＬの低下したレベルを有する第一の溶出液が得られるように、第一のイオン交換材料上に混合物を通過させることを含む。一実施形態において、イオン交換分離工程は、プロカテプシンＬの低下したレベルを有する第一の溶出液が得られるように、第一のイオン交換材料を含むカラム上に混合物が装填される第一のイオン交換クロマトグラフィー工程を含む。
一実施形態において、本発明は、プロカテプシンＬの低下したレベルを有する第一の貫流が得られるように、第二のイオン交換材料に第一の溶出液が供される第二のイオン交換分離工程をさらに含む。一実施形態において、本発明は、第一の貫流が得られるように、第二のイオン交換材料を含むカラム上に第一の溶出液を装填することを含む第二のイオン交換クロマトグラフィーをさらに含む。
一実施形態において、本発明は、プロカテプシンＬの低下したレベルを有する第二の溶出液が得られるように、第一の疎水性相互作用材料に第一の貫流が供される疎水性相互作用分離工程をさらに含む。別の実施形態において、本発明は、第二の溶出液が得られるように、第一の疎水性相互作用材料を含むカラム上に第一の貫流を装填することを含む疎水性相互作用分離工程をさらに含む。
一実施形態において、イオン交換クロマトグラフィー工程は、陽イオン交換クロマトグラフィー（スルホナート基に付着された、メタクリラートをベースとした合成ポリマー性樹脂を含むが、これに限定されない。）である。
別の実施形態において、イオン交換クロマトグラフィー工程は、複数の洗浄工程でイオン交換材料を洗浄することをさらに含む。一実施形態において、複数の洗浄工程は、伝導度の増加を含む。一実施形態において、イオン交換材料は、約４０から５０％の溶出緩衝液及び約５０から６０％の水（例えば、注射用水（ＷＦＩ））を含む洗浄緩衝液で洗浄される。さらに別の実施形態において、溶出緩衝液は、２０ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７である。
本発明の一実施形態において、第一の溶出液は、イオン交換クロマトグラフィー工程の前に、ウイルスの不活化に供せられる。一実施形態において、ウイルスの不活化は、ｐＨウイルス不活化（第一の溶出液のｐＨを低下させ、これにより、ウイルスを不活化する。）を通じて達成される。
一実施形態において、イオン交換クロマトグラフィー工程は、陰イオン交換クロマトグラフィーを含む。一実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーは、フェニルセファロースクロマトグラフィーである。
本発明は、第一の溶出液のｐＨ及び伝導度が第二のイオン交換材料のｐＨ及び伝導度と実質的に同様であるように、第一の溶出液のｐＨ及び伝導度を変化させることによって、プロカテプシンＬの減少したレベルが達成される方法を記載する。一実施形態において、第二のイオン交換材料のｐＨは、約７．７から約８．３の範囲である。別の実施形態において、第一の溶出液のｐＨは、約７．７から約８．３の範囲である。さらに別の実施形態において、第一の溶出液のｐＨは、約８．０まで変化される。さらに別の実施形態において、第二のイオン交換材料の伝導度は、約３．５ｍＳ／ｃｍから約５．２ｍＳ／ｃｍ又は約３．５ｍＳ／ｃｍから約４．９ｍＳ／ｃｍの範囲である。一実施形態において、第一の溶出液の伝導度は、約３．５ｍＳ／ｃｍから約５．２ｍＳ／ｃｍ又は約３．５ｍＳ／ｃｍから約４．９ｍＳ／ｃｍの範囲である。
本発明の一実施形態において、疎水性相互作用分離工程は、疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む。一実施形態において、疎水性相互作用クロマトグラフィーは、フェニルセファロースクロマトグラフィーである。さらに別の実施形態において、疎水性相互作用材料上に装填される抗体の量は、疎水性相互作用材料１リットル当り抗体約２０から約４０ｇの範囲である。さらに別の実施形態において、疎水性相互作用材料上に装填される抗体の量は、疎水性相互作用材料１リットル当り抗体約３０から約３６ｇの範囲である。
一実施形態において、第一の溶出液は、カテプシンＬ速度論アッセイによって測定された場合に、約２５から約６０ＲＦＵ／秒／ｍｇ抗体の範囲のカテプシンＬ活性を含む。
別の実施形態において、第一の貫流は、カテプシンＬ速度論アッセイによって測定された場合に、約０．４から約４ＲＦＵ／秒／ｍｇ抗体の範囲のカテプシンＬ活性を含む。
別の実施形態において、第二の溶出液は、カテプシンＬ速度論アッセイによって測定された場合に、約０．５から約１．５ＲＦＵ／秒／ｍｇ抗体の範囲のカテプシンＬ活性を含む。
本発明の一実施形態において、プロカテプシンＬのレベルは、再現可能に低い。
特に好ましい態様において、本発明は、混合物中のＨＣＰの低下を達成するために、抗体−ＨＣＰ混合物の高い量をイオン交換樹脂の上に装填することができる抗体精製法を提供する。この方法は、イオン交換樹脂への抗体−ＨＣＰ混合物の適用の前に、プロテインＡ捕捉へ供せられてない抗体−ＨＣＰ混合物とともに使用することができるという利点を有する。抗体がプロテインＡに結合し、及びＨＣＰが流出するように、抗体−ＨＣＰ混合物がプロテインＡカラムに適用されるプロテインＡ捕捉は、典型的には、ＨＣＰを除去するための手段として、抗体精製操作における最初の精製工程として使用される。従って、本発明の方法は、最初の工程として、プロテインＡクロマトグラフィーを実施する必要なしに、抗体−ＨＣＰ混合物の大量の装填物を精製するのに有用である。
従って、一実施形態において、本発明は、抗体及び少なくとも１つのＨＣＰを含む混合物から、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）が減少した抗体調製物を作製する方法であり、
ＨＣＰが減少した抗体調製物が得られるように、
（ａ）平衡化緩衝液中の第一のイオン交換樹脂に混合物を適用すること（樹脂１Ｌ当り抗体の３０グラム超が適用される。）；
（ｂ）複数の洗浄工程でＨＣＰを樹脂から洗浄すること；及び
（ｃ）第一の溶出液を形成させるために、溶出緩衝液で樹脂から抗体を溶出すること；
を含む方法を提供する。
別の実施形態において、樹脂１リットル当り抗体約３５から７０ｇが適用される。別の実施形態において、樹脂１リットル当り抗体約７０ｇが適用される。好ましい実施形態において、混合物を第一のイオン交換樹脂に適用する前に、抗体及び少なくとも１つのＨＣＰを含む混合物はプロテインＡ捕捉に供されない（すなわち、プロテインＡカラムに適用されない。）。
好ましくは、複数の洗浄工程は少なくとも第一の洗浄と第二の洗浄を含み、第一の洗浄から第二の洗浄へ伝導率の増加が存在する。より好ましくは、第一の洗浄が平衡化緩衝液を用いて行われ、並びに第二の洗浄が溶出緩衝液及び水（例えば、ＷＦＩ）の混合物を用いて行われる。例えば、溶出緩衝液及び水の混合物は、約４０から５０％の溶出緩衝液及び約５０から６０％の水を含むことができる。より好ましくは、溶出緩衝液及び水の混合物は、約４５％の溶出緩衝液及び約５５％の水を含むことができる。好ましい実施形態において、溶出緩衝液は、２０ｍＭリン酸ナトリウム及び１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む。この状況では、溶出緩衝液と水の混合物（４５％の溶出緩衝液及び約５５％の水である。）は、９ｍＭリン酸ナトリウム及び６８ｍＭ塩化ナトリウムである。好ましい実施形態において、第一の洗浄は、２０ｍＭホスファート、２５ｍＭ塩化ナトリウムを含む平衡化緩衝液を用いて行われ、第二の洗浄は、９ｍＭホスファート、６８ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液（４５％溶出緩衝液、５５％水）を用いて行われ、溶出緩衝液は、２０ｍＭリン酸ナトリウム及び１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む。
一実施形態において、第一のイオン交換樹脂を使用する方法はｐＨ７で実施される。別の実施形態において、第一のイオン交換樹脂を使用する方法はｐＨ５で実施される。さらに別の実施形態において、第一のイオン交換樹脂を使用する方法は、約ｐＨ５から約ｐＨ７の範囲又はｐＨ５からｐＨ７の範囲のｐＨで実施される。ｐＨ７が使用される場合には、好ましくは、樹脂１リットル当り抗体約３５ｇが適用される。ｐＨ５が使用される場合には、好ましくは、樹脂１リットル当り抗体約７０ｇが適用される。約ｐＨ５から約ｐＨ７（例えば、ｐＨ５からｐＨ７）の範囲のｐＨが使用される場合には、好ましくは、樹脂１リットル当り抗体約３５から約７０ｇまでの抗体（例えば、樹脂１リットル当り抗体の３５から７０ｇ）の量が適用される。
好ましい実施形態において、抗体−ＨＣＰ混合物からのＨＣＰのよりよい除去は、より少ない抗体（例えば、樹脂１リットル当り抗体約３０ｇ）が樹脂上に装填される場合に達成される抗体−ＨＣＰ混合物からのＨＣＰの除去に比べて、樹脂（例えば、樹脂１リットル当り抗体約７０ｇ）上により多くの抗体を装填することによって、よりよい除去が（例えば、ｐＨ５で）達成される。これは、樹脂に対する抗体の結合親和性が樹脂に対するＨＣＰの結合親和性より著しく高い条件が使用されるときに、抗体によって樹脂からＨＣＰが置換される結果であると考えられる。
好ましくは、第一のイオン交換樹脂は陽イオン交換樹脂である。好ましくは、陽イオン交換樹脂はカラム中に形成され、並びに抗体及び少なくとも１つのＨＣＰを含む混合物がカラムに適用される。好ましくは、陽イオン交換樹脂は、スルホナート基に付着された、合成メタクリラートをベースとしたポリマー性樹脂（例えば、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳ）を含む。あるいは、陽イオン交換樹脂は、例えば、メタクリラート又はポリスチレンをベースとする合成ポリマー、シリカ、デキストラン表面拡張剤を有する高度に架橋されたアガロース、アリルデキストランの架橋された共重合体及びスルホニウムイオン又はスルホエチルなどのスルホナート基に付着されたＮ，Ｎ−メチレンビスアクリラ樹脂を含むことができる。
本発明の別の態様において、上記第一のイオン交換樹脂を使用する方法の後に、方法は、第一の溶出液をウイルス不活化工程に供することをさらに含む。例えば、ウイルス不活化は、ウイルス的に不活化された調製物を形成するために、ｐＨウイルス不活化（例えば、第一の溶出液は、約３．５のｐＨなどの低ｐＨ条件下に供せられ、これにより、ウイルスを不活化する。）によって達成することができる。好ましくは、ウイルス的に不活化された調製物は第二のイオン交換樹脂に適用され、ウイルス的に不活化された調製物を適用する前に、ウイルス的に不活化された調製物のｐＨ及び伝導度が第二のイオン交換樹脂のｐＨ及び伝導度と実質的に同様であるように調整される。例えば、第二のイオン交換樹脂のｐＨが約ｐＨ７．７から約ｐＨ８．３の範囲であり、ウイルス的に不活化された調製物のｐＨが約ｐＨ７．７から約ｐＨ８．３の範囲にあるように調整される。別の実施形態において、第二のイオン交換樹脂のｐＨは約ｐＨ７．８から約ｐＨ８．２の範囲であり、ウイルス的に不活化された調製物のｐＨは約ｐＨ７．８から約ｐＨ８．２の範囲にあるように調整される。より好ましくは、第二のイオン交換樹脂のｐＨは約ｐＨ８．０であり、及びウイルス的に不活化された調製物のｐＨは約ｐＨ８．０であるように調整される。
さらに、第二のイオン交換樹脂の伝導度が約３．５ｍＳ／ｃｍから約ｐＨ５．２ｍＳ／ｃｍの範囲であり、ウイルス的に不活化された調製物の伝導度は約３．５ｍＳ／ｃｍから約５．２ｍＳ／ｃｍの範囲にあるように調整される。
好ましくは、第二のイオン交換樹脂の伝導度は約５．０ｍＳ／ｃｍであり、及びウイルス的に不活化された調製物の伝導度は約５．０ｍＳ／ｃｍであるように調整される。
好ましい実施形態において、第二のイオン交換樹脂は陰イオン交換樹脂である。例えば、陰イオン交換樹脂は、Ｑセファロース樹脂であり得る。好ましくは、第二のイオン交換樹脂がカラム中に形成され、及び第一の貫流が得られるように、ウイルス的に不活化された調製物がカラムに適用される。
本発明の別の態様において、第一の貫流が第二のイオン交換樹脂から得られた後に、第二の溶出液が得られるように、第一の貫流を疎水性相互作用カラムに適用することができる。好ましい実施形態において、疎水性相互作用カラムは、フェニルセファロースカラムである。一実施形態において、疎水性相互作用カラムに適用された第一の貫流は、疎水性相互作用カラム材料１リットル当り抗体約２０から約４０ｇを含む。別の実施形態において、疎水性相互作用カラムに適用された第一の貫流は、疎水性相互作用カラム材料１リットル当り抗体約３０から約３６ｇを含む。精製プロセス中の先行工程の効率性の故に、疎水性相互作用カラムから得られた第二の溶出液を生成物ピーク画分に供する必要がないことが見出された。従って、一実施形態において、第二の溶出液は産物ピーク分画に供されない。
特に好ましい一実施形態において、抗体及び少なくとも１つのＨＣＰを含む混合物から、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）が減少した抗体調製物を作製する本発明の方法は、
ＨＣＰが減少した抗体調製物が得られるように、
（ａ）平衡化緩衝液中の陽イオン交換樹脂に混合物を適用すること（混合物は、陽イオン交換樹脂への適用前に、混合物がプロテインＡ捕捉に供せされておらず、及び樹脂１Ｌ当り抗体の３０グラム超が適用される。）；
（ｂ）複数の洗浄工程でＨＣＰを陽イオン交換樹脂から洗浄すること；及び
（ｃ）第一の溶出液を形成させるために、溶出緩衝液で陽イオン交換樹脂から抗体を溶出すること；
（ｄ）第一の溶出液をウイルス不活化工程に供すること；
（ｅ）第一の貫流を得るために、ウイルス的に不活化された調製物を陰イオン交換樹脂に適用すること；並びに
（ｆ）第二の溶出液が得られるように、第一の貫流を疎水性相互作用カラムに適用すること；
を含む。
一実施形態において、陽イオン交換樹脂はｐＨ７であり、及び樹脂１リットル当り抗体約３５ｇが適用される。別の実施形態において、陽イオン交換樹脂はｐＨ５であり、及び樹脂１リットル当り抗体約７０ｇが適用される。さらに別の実施形態において、ｐＨが約ｐＨ５から約ｐＨ７（例えば、ｐＨ５からｐＨ７）の範囲のｐＨであり、樹脂１リットル当り抗体約３５から約７０ｇまでの抗体（例えば、樹脂１リットル当り抗体の３５から７０ｇ）の量が適用される。
好ましくは、複数の洗浄工程は、平衡化緩衝液を用いる第一の洗浄で樹脂を洗浄すること、並びに溶出緩衝液及び水の混合物を用いる第二の洗浄を含む。例えば、溶出緩衝液及び水の混合物は、約４０から５０％の溶出緩衝液及び約５０から６０％の水（例えば、ＷＦＩ）、より好ましくは、約４５％の溶出緩衝液及び約５５％の水（例えば、ＷＦＩ）を含むことができる。好ましい実施形態において、溶出緩衝液は、２０ｍＭリン酸ナトリウム及び１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む。この状況では、溶出緩衝液と水の混合物（４５％の溶出緩衝液及び約５５％の水である。）は、９ｍＭリン酸ナトリウム及び６８ｍＭ塩化ナトリウムである。好ましい実施形態において、第一の洗浄は、２０ｍＭホスファート、２５ｍＭ塩化ナトリウムを含む平衡化緩衝液を用いて行われ、第二の洗浄は、９ｍＭホスファート、６８ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液（４５％溶出緩衝液、５５％水）を用いて行われ、溶出緩衝液は、２０ｍＭリン酸ナトリウム及び１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む。
好ましくは、工程（ａ）から（ｆ）を有する上記方法では、陰イオン交換樹脂へウイルス的に不活化された調製物を適用する前に（すなわち、工程（ｄ）と（ｅ）の間に）、ウイルス的に不活化された調製物のｐＨ及び伝導度が、陰イオン交換樹脂のｐＨ及び伝導度と実質的に同様であるように調整される。例えば、第二のイオン交換樹脂のｐＨが約ｐＨ７．７から約ｐＨ８．３の範囲であり、ウイルス的に不活化された調製物のｐＨが約ｐＨ７．７から約ｐＨ８．３の範囲にあるように調整される。別の実施形態において第二のイオン交換樹脂のｐＨは約ｐＨ７．８から約ｐＨ８．２の範囲であり、ウイルス的に不活化された調製物のｐＨは約ｐＨ７．８から約ｐＨ８．２の範囲にあるように調整される。より好ましくは、第二のイオン交換樹脂のｐＨは約ｐＨ８．０であり、及びウイルス的に不活化された調製物のｐＨは約ｐＨ８．０であるように調整される。さらに、第二のイオン交換樹脂の伝導度が約３．５ｍＳ／ｃｍから約ｐＨ５．２ｍＳ／ｃｍの範囲であり、ウイルス的に不活化された調製物の伝導度は約３．５ｍＳ／ｃｍから約５．２ｍＳ／ｃｍの範囲にあるように調整される。好ましくは、第二のイオン交換樹脂の伝導度は約５．０ｍＳ／ｃｍであり、及びウイルス的に不活化された調製物の伝導度は約５．０ｍＳ／ｃｍであるように調整される。
工程（ａ）から（ｆ）を有する上記方法では、好ましくは、陽イオン交換樹脂は、スルホナート基に付着された、合成メタクリラートをベースとするポリマー性樹脂（例えば、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ）であり、陰イオン交換樹脂はＱセファロース樹脂であり、及び疎水性相互作用カラムはフェニルセファロースカラムである。
好ましくは、第一の溶出液は、ＨＣＰＥＬＩＳＡによって測定された場合に、混合物より約９０から約１００倍の範囲少ないＨＣＰを含む。好ましくは、第一の貫流は、ＨＣＰＥＬＩＳＡによって測定された場合に、第一の溶出液より約８４０から約８５０倍の範囲少ないＨＣＰを含む。好ましくは、第二の溶出液は、ＨＣＰＥＬＩＳＡによって測定された場合に、第一の貫流より約３から約５倍の範囲少ないＨＣＰを含む。
特に好ましい一実施形態において、抗体及び少なくとも１つのＨＣＰを含む混合物から、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）が減少した抗体調製物を作製する本発明の方法は、
ＨＣＰが減少した抗体調製物が得られるように、
（ａ）平衡化緩衝液中の陽イオン交換樹脂に混合物を適用すること（陽イオン交換樹脂がｐＨ７であり、及び樹脂１リットル当り抗体約３５グラムが適用され、又は陽イオン交換樹脂がｐＨ５からｐＨ７の範囲であり、及び樹脂１リットル当り抗体約３５から約７０ｇが適用され、又は陽イオン交換樹脂がｐＨ５であり、及び樹脂１リットル当り抗体約７０グラムが適用される。）；
（ｂ）ＨＣＰを、平衡化緩衝液を用いる第一の洗浄並びに溶出緩衝液及び水の混合物を用いる第二の洗浄を含む洗浄工程で、陽イオン交換樹脂からＨＣＰを洗浄すること；
（ｃ）第一の溶出液を形成させるために、溶出緩衝液で陽イオン交換樹脂から抗体を溶出すること；
（ｄ）第一の溶出液をウイルス不活化工程に供すること（ウイルスの不活化は、ウイルス的に不活化された調製物を形成するために、ｐＨウイルス不活化によって達成される。）；
（ｅ）ウイルス的に不活化された調製物が陰イオンイオン交換樹脂に適用され、第一の貫流が得られるように、ウイルス的に不活化された調製物を陰イオン交換樹脂に適用する前に、ウイルス的に不活化された調製物のｐＨ及び伝導度が、陰イオン交換樹脂のｐＨ及び伝導度と実質的に同様であるように調整されること；並びに
（ｆ）第二の溶出液が得られるように、第一の貫流を疎水性相互作用カラムに適用すること；
を含む。
好ましくは、陽イオン交換樹脂に適用する前に、抗体混合物は、プロテインＡ捕捉に供されない。好ましくは、溶出緩衝液及び水の混合物は、約４０から５０％の溶出緩衝液及び約５０から６０％の水、より好ましくは、約４５％の溶出緩衝液及び約５５％の水（例えば、ＷＦＩ）を含む。好ましい実施形態において、溶出緩衝液は、２０ｍＭリン酸ナトリウム及び１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む。この状況では、溶出緩衝液と水の混合物（４５％の溶出緩衝液及び約５５％の水である。）は、９ｍＭリン酸ナトリウム及び６８ｍＭ塩化ナトリウムである。好ましい実施形態において、第一の洗浄は、２０ｍＭホスファート、２５ｍＭ塩化ナトリウムを含む平衡化緩衝液を用いて行われ、第二の洗浄は、９ｍＭホスファート、６８ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液（４５％溶出緩衝液、５５％水）を用いて行われ、溶出緩衝液は、２０ｍＭリン酸ナトリウム及び１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む。好ましくは、第一の溶出液は、ＨＣＰＥＬＩＳＡによって測定された場合に、混合物より約９０から約１００倍の範囲少ないＨＣＰを含む。好ましくは、第一の貫流は、ＨＣＰＥＬＩＳＡによって測定された場合に、第一の溶出液より約８４０から約８５０倍の範囲少ないＨＣＰを含む。好ましくは、第二の溶出液は、ＨＣＰＥＬＩＳＡによって測定された場合に、第一の貫流より約３から約５倍の範囲少ないＨＣＰを含む。
上記精製方法の何れかの好ましい態様において、プロカテプシンＬが減少した抗体調製物が得られるように、ＨＣＰはプロカテプシンＬを含む。好ましくは、溶出液は、カテプシンＬ速度論アッセイによって測定された場合に、約２５から約６０ＲＦＵ／秒／ｍｇ抗体の範囲のカテプシンＬ活性を含む。好ましくは、第一の貫流は、カテプシンＬ速度論アッセイによって測定された場合に、約０．４から約４ＲＦＵ／秒／ｍｇ抗体の範囲のカテプシンＬ活性を含む。好ましくは、第二の溶出液は、カテプシンＬ速度論アッセイによって測定された場合に、約０．５から約１．５ＲＦＵ／秒／ｍｇ抗体の範囲のカテプシンＬ活性を含む。好ましくは、プロカテプシンＬのレベルは、再現可能に低い。
さらに別の態様において、本発明は、抗体及び少なくとも１つのＨＣＰを含む混合物から、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）が減少した抗体調製物を作製する方法であり、ＨＣＰが減少した抗体調製物が得られるように、
（ａ）第一の溶出液を得るために、陽イオン交換樹脂に混合物を適用すること；
（ｂ）第一の貫流を得るために、第一の溶出液を陰イオン交換樹脂に適用すること；並びに
（ｃ）第二の溶出液が得られるように、第一の貫流を疎水性相互作用カラムに適用すること；
を含む。
好ましくは、混合物を第一のイオン交換樹脂に適用する前に、抗体及び少なくとも１つのＨＣＰを含む混合物がプロテインＡ捕捉に供されない。好ましくは、方法は、陰イオン交換樹脂に第一の溶出液を適用する前に、第一の溶出液をウイルス不活化工程に供することをさらに含む。例えば、ウイルスの不活化は、ｐＨウイルス不活化によって達成することができる。
好ましくは、陽イオン交換樹脂は、スルホナート基に付着された、合成メタクリラートをベースとしたポリマー性樹脂（例えば、陽イオン交換樹脂は、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳカラムであり得る。）を含む。例えば、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳカラムは、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２５ｍＭ塩化ナトリウムを含む平衡化緩衝液で平衡化することが可能であり、混合物をカラムに適用することができ、カラムは、平衡化緩衝液で少なくとも１回洗浄することができ、第一の溶出液は、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む溶出緩衝液での溶出によって得ることができる。
好ましくは、陰イオン交換樹脂は、Ｑセファロースカラムである。例えば、Ｑセファロースカラムは、２５ｍＭトロラミン、４０ｍＭ塩化ナトリウムを含む平衡化緩衝液ｐＨ７．６で平衡化することが可能である。
好ましくは、疎水性相互作用カラムは、フェニルセファロースカラムである。例えば、フェニルセファロースカラムは、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１．１Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７を含む平衡化緩衝液で平衡化することが可能であり、第一の貫流をカラムに適用することができ、カラムは、平衡化緩衝液で少なくとも１回洗浄することができ、第二の溶出液は、１１ｍＭリン酸ナトリウム、０．６２５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７．０への塩の段階的グラジエントを実施することによって得ることができる。
好ましくは、ｐＨウイルス不活化は、約１時間にわたって、ｐＨ３．５に第一の溶出液を維持することによって達成される。
さらに別の態様において、本発明は、アダリムマブ及び少なくとも１つのＨＣＰを含む混合物から、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）が減少したアダリムマブ調製物を作製する方法であり、
ＨＣＰが減少したアダリムマブ調製物が得られるように、
（ａ）混合物を陽イオン交換樹脂に適用すること（混合物は、第一の溶出液を取得するために、混合物を第一のイオン交換樹脂に適用する前にプロテインＡ捕捉へ供せられない。）；
（ｂ）ウイルス的に不活化された調製物を得るために、第一の溶出液をｐＨウイルス不活化に供すること；
（ｃ）第一の貫流を得るために、ウイルス的に不活化された調製物を陰イオン交換樹脂に適用すること；並びに
（ｃ）第二の溶出液が得られるように、第一の貫流を疎水性相互作用カラムに適用すること；
を含む。
好ましくは、陽イオン交換樹脂は、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳカラムであり、陰イオン交換樹脂はＱセファロースカラムであり、及び疎水性相互作用カラムはフェニルセファロースカラムである。例えば、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳカラムは、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２５ｍＭ塩化ナトリウムを含む平衡化緩衝液で平衡化することが可能であり、混合物をカラムに適用することができ、カラムは、平衡化緩衝液で少なくとも１回洗浄することができ、第一の溶出液は、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む溶出緩衝液での溶出によって得ることができる。同じく、例えば、Ｑセファロースカラムは、２５ｍＭトロラミン、４０ｍＭ塩化ナトリウムを含む平衡化緩衝液ｐＨ７．６で平衡化することが可能である。例えば、フェニルセファロースカラムは、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１．１Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７を含む平衡化緩衝液で平衡化することが可能であり、第一の貫流をカラムに適用することができ、カラムは、平衡化緩衝液で少なくとも１回洗浄することができ、第二の溶出液は、１１ｍＭリン酸ナトリウム、０．６２５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７．０への塩の段階的グラジエントを実施することによって得ることができる。同じく、例えば、ｐＨウイルス不活化は、約１時間にわたって、ｐＨ３．５に第一の溶出液を維持することによって達成することができる。
上記精製方法の全てに関して、本発明の好ましい実施形態において、抗体は抗腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）抗体又はその抗原結合部分である。一実施形態において、抗ＴＮＦα抗体又はその抗体結合部分はヒト抗体、キメラ抗体又は多価抗体である。一実施形態において、抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分がインフリキシマブ又はゴリムマブである。
別の実施形態において、抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分は、ヒト抗体である。一実施形態において、抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分は、１×１０−８Ｍ又はそれ以下のＫｄ及び１×１０−３ｓ−１又はそれ以下のＫｏｆｆ速度定数でヒトＴＮＦαから解離し（何れも、表面プラズモン共鳴によって測定される。）、並びに、標準的なインビトロＬ９２９アッセイにおいて、１×１０−７Ｍ又はそれ以下のＩＣ５０でヒトＴＮＦα細胞毒性を中和する単離されたヒト抗体である。
別の実施形態において、抗ＴＮＦα抗体又はその抗体結合部分は、以下の特性を有する単離されたヒト抗体である。
ａ）表面プラズモン共鳴によって測定した場合に、１×１０−３ｓ−１又はそれ以下のＫｏｆｆ速度定数でヒトＴＮＦαから解離する；
ｂ）配列番号３のアミノ酸配列又は位置１、４、５、７若しくは８における単一のアラニン置換によって配列番号３から修飾されたアミノ酸配列又は位置１、３、４、６、７、８及び／又は９における１個から５個の保存的アミノ酸置換によって配列番号３から修飾されたアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを有する；
ｃ）配列番号４のアミノ酸配列又は位置２、３、４、５、６、８、９、１０若しくは１１における単一のアラニン置換によって配列番号４から修飾されたアミノ酸配列又は位置２、３、４、５、６、８、９、１０、１１及び／又は１２における１個から５個の保存的アミノ酸置換によって配列番号４から修飾されたアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメインを有する。
さらに別の実施形態において、抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分が、配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）及び配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を有する単離されたヒト抗体である。
さらに別の実施形態において、抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分は、アダリムマブである。
本発明は、本発明の方法の何れかを用いて作製された、ＨＣＰＥＬＩＳＡによって測定された場合にＨＣＰが実質的に存在しない抗体調製物を提供する。本発明は、本発明の方法の何れかを用いて作製された、ＨＣＰが減少した抗体調製物と、及び医薬として許容される担体とを含む医薬組成物も提供する。
本発明は、ＨＣＰが減少した抗体（ＨＣＰのレベルは、ＨＣＰＥＬＩＳＡによって測定された場合に、抗体の１ｍｇ当りＨＣＰの約７０ｎｇ以下を含む。）及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物を含む。一実施形態において、ＨＣＰのレベルが、ＨＣＰＥＬＩＳＡによって測定された場合に、抗体の１ｍｇ当りＨＣＰの約１３ｎｇ以下を含む。別の実施形態において、ＨＣＰのレベルが、ＨＣＰＥＬＩＳＡによって測定された場合に、抗体の１ｍｇ当りＨＣＰの約５ｎｇ以下を含む。
本発明は、ＨＣＰＥＬＩＳＡアッセイによって測定された場合にＨＣＰの検出可能なレベルを有さない、抗体を含む組成物を提供する。
本発明は、本明細書に記載されている方法の何れかを用いて作製された、プロカテプシンＬが実質的に存在しない抗体調製物も提供する。本発明は、本発明の方法の何れかを用いて作製された、プロカテプシン−Ｌが減少した抗体調製物と、及び医薬として許容される担体とを含む医薬組成物も含む。
本発明は、プロカテプシン−Ｌが減少した抗体及び医薬として許容される担体を含み、プロカテプシン−Ｌのレベルが、約３．０ＲＦＵ／秒／ｍｇ抗体のカテプシン活性以下である、医薬組成物を提供する。
上記抗体調製物及び医薬組成物の全てに関して、好ましくは、抗体は抗腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）抗体又はその抗原結合部分である。一実施形態において、抗ＴＮＦα抗体又はその抗体結合部分はヒト化、キメラ又は多価からなる群から選択される抗体である。一実施形態において、抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分がインフリキシマブ又はゴリムマブである。
別の実施形態において、抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分は、ヒト抗体である。一実施形態において、抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分は、１×１０−８Ｍ又はそれ以下のＫｄ及び１×１０−３ｓ−１又はそれ以下のＫｏｆｆ速度定数でヒトＴＮＦαから解離し（何れも、表面プラズモン共鳴によって測定される。）、並びに、標準的なインビトロＬ９２９アッセイにおいて、１×１０−７Ｍ又はそれ以下のＩＣ５０でヒトＴＮＦα細胞毒性を中和する単離されたヒト抗体である。
別の実施形態において、抗ＴＮＦα抗体又はその抗体結合部分は、以下の特性を有する単離されたヒト抗体である。
ａ）表面プラズモン共鳴によって測定した場合に、１×１０−３ｓ−１又はそれ以下のＫｏｆｆ速度定数でヒトＴＮＦαから解離する；
ｂ）配列番号３のアミノ酸配列又は位置１、４、５、７若しくは８における単一のアラニン置換によって配列３から修飾されたアミノ酸配列又は位置１、３、４、６、７、８及び／又は９における１個から５個の保存的アミノ酸置換によって配列番号３から修飾されたアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを有する；
ｃ）配列番号４のアミノ酸配列又は位置２、３、４、５、６、８、９、１０若しくは１１における単一のアラニン置換によって配列４から修飾されたアミノ酸配列又は位置２、３、４、５、６、８、９、１０、１１及び／又は１２における１個から５個の保存的アミノ酸置換によって配列番号４から修飾されたアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメインを有する。
さらに別の実施形態において、抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分が、配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）及び配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を有する単離されたヒト抗体である。
さらに別の実施形態において、抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分は、アダリムマブである。
本発明は、本発明の方法の何れかを用いて得られた抗体を含む医薬組成物をヒト対象に投与することを含む、ＴＮＦα活性が有害である疾患を治療する方法を含む。一実施形態において、調製物は、長期間にわたって、ヒト対象に投与される。一実施形態において、長期間には、少なくとも約３ヶ月、少なくとも約４ヶ月又は少なくとも約５ヶ月が含まれる。
一実施形態において、ＴＮＦα活性が有害である疾患は、自己免疫疾患、腸疾患及び皮膚疾患からなる群から選択される。一実施形態において、自己免疫疾患は、関節リウマチ、リウマチ様脊椎炎、骨関節炎、通風性関節炎、アレルギー、多発性硬化症、乾癬性関節炎、自己免疫性糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、ネフローゼ症候群及び若年性関節リウマチからなる群から選択される。別の実施形態において、腸疾患はクローン病である。さらに別の実施形態において、皮膚疾患は乾癬である。
一実施形態において、医薬組成物は、さらなる治療剤と組み合わせて投与される。一実施形態において、さらなる治療剤は、メトトレキサートである。
本発明は、本発明の方法の何れかを用いて得られた抗体を含む医薬組成物をヒト対象に投与することを含む、ＴＮＦα活性が有害である疾患を治療する方法を含む。一実施形態において、調製物は、長期間にわたって、ヒト対象に投与される。一実施形態において、長期間には、少なくとも約３ヶ月、少なくとも約４ヶ月又は少なくとも約５ヶ月が含まれる。一実施形態において、ＴＮＦα活性が有害である疾患は、自己免疫疾患、腸疾患及び皮膚疾患からなる群から選択される。一実施形態において、自己免疫疾患は、関節リウマチ、リウマチ様脊椎炎、骨関節炎、通風性関節炎、アレルギー、多発性硬化症、乾癬性関節炎、自己免疫性糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、ネフローゼ症候群及び若年性関節リウマチからなる群から選択される。一実施形態において、腸疾患はクローン病である。一実施形態において、皮膚疾患は乾癬である。
一実施形態において、医薬組成物は、さらなる治療剤と組み合わせて投与される。一実施形態において、さらなる治療剤は、メトトレキサートである。
本発明は、包装材料と、アダリムマブと、及びアダリムマブ製剤がアダリムマブの１ｍｇ当りＨＣＰの約７０ｎｇ以下を含むことを示す、包装材料内に含有されるラベル又は添付文書とを含む製品を提供する。一実施形態において、アダリムマブの１ｍｇ当りＨＣＰの約７０ｎｇが、ＨＣＰＥＬＩＳＡによって測定される。
本発明は、包装材料と、アダリムマブと、及びアダリムマブ製剤がアダリムマブの１ｍｇ当りＨＣＰの約１３ｎｇ以下を含むことを示す、包装材料内に含有されるラベル又は添付文書とを含む製品も提供する。一実施形態において、アダリムマブの１ｍｇ当りＨＣＰの約１３ｎｇが、ＨＣＰＥＬＩＳＡによって測定される。
本発明は、包装材料と、アダリムマブと、及びアダリムマブ製剤がアダリムマブの１ｍｇ当りＨＣＰの約５ｎｇ以下を含むことを示す、包装材料内に含有されるラベル又は添付文書とを含む製品を含む。一実施形態において、アダリムマブの１ｍｇ当りＨＣＰの約５ｎｇが、ＨＣＰＥＬＩＳＡによって測定される。
本発明は、包装材料と、アダリムマブと、及びアダリムマブ製剤が、約３．０ＲＦＵ／秒／ｍｇアダリムマブのカテプシンＬ活性によって示されるレベルを上回らないプロカテプシンＬのレベルを含むことを示す、包装材料内に含有されるラベル又は添付文書とを含む製品を含む。一実施形態において、カテプシンＬ活性は、カテプシンＬ速度論アッセイによって測定される。
本発明は、哺乳動物細胞発現系に由来する材料中のプロカテプシンＬの量を測定するための速度論アッセイであって、カテプシンＬ試料が得られるように、プロカテプシンＬを活性なカテプシンＬ形態へ加工するために、哺乳動物細胞発現系に由来する材料を酵素と接触すること、カテプシンＬ試料をカテプシンＬに対する基質と接触させること、及び哺乳動物細胞発現系に由来する材料中のプロカテプシンＬの量の指標として、カテプシンＬ試料中のカテプシンＬ活性を測定することを含む、アッセイを提供する。一実施形態において、哺乳動物細胞発現系は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。別の実施形態において、プロカテプシンＬを加工するための酵素は、エンドペプチダーゼである。さらに別の実施形態において、カテプシンＬに対する基質は標識を含む。さらに別の実施形態において、標識は蛍光剤である。一実施形態において、蛍光剤は、蛍光性７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）基を含む。一実施形態において、カテプシンＬに対する基質はＺ−ロイシン−アルギニンを含む。さらに別の実施形態において、Ｚ−ロイシン−アルギニンは、ＡＭＣ基を含む。
(発明の詳細な記述)
Ｉ．定義
本発明をさらに容易に理解できるようにするために、まず、幾つかの用語を定義する。
本明細書において使用される「混合物」という用語は、同じく存在し得る他の物質から精製することが求められている少なくとも１つの目的の抗体を含む、精製されるべき、粘度を有する物質を表す。混合物は、例えば、水溶液、有機溶媒系又は水性／有機溶媒混合物若しくは溶液であり得る。混合物は、しばしば、多くの生物分子（タンパク質、抗体、ホルモン及びウイルスなど）、小分子（塩、糖、脂質など）を含み、及び粒状物さえ含む複雑な混合物又は溶液である。生物学的起源の典型的な混合物は水溶液又は水性懸濁液として開始し得るが、溶媒沈殿、抽出などのより初期の分離工程において使用される有機溶媒も含有し得る。本発明の様々な実施形態による精製に適した貴重な生物物質を含有し得る混合物の例には、バイオリアクターから得られる培養上清、均質化された細胞懸濁液、血漿、血漿画分及び乳が含まれるが、これらに限定されない。
抗体及び１つ又はそれ以上の物質を含む混合物から抗体を「精製する」とは、（完全に又は部分的に）少なくとも１つ物質を組成物から除去することによって、混合物中の抗体の純度を増加させることを意味する。物質は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）など（但し、これに限定されない。）の不純物又はきょう雑物であり得る。
「宿主細胞タンパク質」又は「ＨＣＰ」という用語は、目的のタンパク質とは異なり、典型的には、抗体産生源に由来する混合物中のタンパク質を表す。ＨＣＰは、望ましくは、最終抗体調製物から除去される。
「減少した」という用語は、物質の量を低下させ、又は少なくすることを表す。減少した調製物には、当初の量と比べて、ＨＣＰ又はプロカテプシンＬなどの物質のより少量を有する調製物が含まれる。一実施形態において、物質は不純物又はきょう雑物である。一実施形態において、「減少した」という用語は、物質が大幅により少ないことを意味する。別の実施形態において、「減少した」という用語は、物質が存在しないことを意味する。一実施形態において、物質が存在しないことには、本明細書に記載されているアッセイを用いて「検出できない量」が含まれる。
「実質的に存在しない」という用語には、物質が存在しないことが含まれるが、物質の最小限の量も含まれ得る。一実施形態において、物質が存在しないことには、本明細書に記載されているアッセイを用いて「検出できない量」が含まれる。
「宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）が減少した」という用語は、１つ又はそれ以上の精製工程の後に、抗体及びＨＣＰの低下した量又は少なくなった量を含む溶出液、調製物、貫流などの（但し、これらに限定されない。）組成物を表す。一実施形態において、「ＨＣＰが減少した」という用語は、抗体を含む組成物中のＨＣＰが大幅に少ないことを意味する。別の実施形態において、「ＨＣＰが減少した」という用語は、抗体を含む組成物中にＨＣＰが含まれないことを意味する。一実施形態において、「ＨＣＰが減少した」という用語は、抗体を含む組成物中に本明細書に記載されているアッセイを用いて検出できない量を意味する。
「プロカテプシンＬが減少した」という用語は、１つ又はそれ以上の精製工程の後に、抗体及びプロカテプシンＬの低下した量又は少なくなった量を含む溶出液、調製物、貫流などの（但し、これらに限定されない。）組成物を表す。一実施形態において、「プロカテプシンＬが減少した」という用語は、抗体を含む組成物中のＨＣＰが大幅に少ないことを意味する。別の実施形態において、「プロカテプシンＬが減少した」という用語は、抗体を含む組成物中にＨＣＰが含まれないことを意味する。一実施形態において、「プロカテプシンが減少した」という用語は、抗体を含む組成物中に本明細書に記載されているアッセイを用いて検出できない量を意味する。
「再現可能に低い」という用語は、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％の低下した量又は少なくなった量を達成する能力など、低下した量又は少なくなった量を一貫して達成できることを表す。
「イオン交換分離工程」という用語は、望ましくない物質又は不純物（例えば、ＨＣＰ又はプロカテプシンＬ）が、帯電した物質との、目的の抗体及び望ましくない物質のイオン的相互作用の差に基づいて、目的の抗体が分離される工程を表す。イオン交換分離工程の例には、陰イオン交換クロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィーなどのイオン交換クロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されない。
「イオン交換物質」とは、抗体から望ましくない物質又は不純物（例えば、ＨＣＰ又はプロカテプシンＬ）を分離するための基礎として使用されるイオン性物質を表す。イオン交換物質の例には、陰イオン性及び陽イオン性樹脂が含まれる。
「陽イオン交換物質」は、共有結合された負に帯電したリガンドを有し、従って、樹脂が接触している溶液中の陽イオンと交換するための遊離の陽イオンを有するイオン交換樹脂を表す。様々な陽イオン交換樹脂、例えば、共有結合された基がカルボキシラート又はスルホナートである陽イオン交換樹脂が本分野において公知である。市販の陽イオン交換樹脂には、ＣＭＣ−セルロース、ＳＰ−ＳｅｐｈａｄｅｘＴＭ及びＦａｓｔＳ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ（後者２つは、Ｐｈａｒｍａｃｉａから市販されている。）が含まれる。
「陰イオン交換物質」は、共有結合された正に帯電した基（第四級アミノ基など）を有するイオン交換樹脂を表す。市販の陰イオン交換樹脂には、ＤＥＡＥセルロース、ＴＭＡＥ、ＱＡＥＳｅｐｈａｄｅｘＴＭ及びＦａｓｔＱ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ（後者２つは、Ｐｈａｒｍａｃｉａから市販されている。）が含まれる。
イオン交換物質へ分子を「結合する」とは、分子とイオン交換物質の１つ又は複数の帯電基との間のイオン的相互作用を通じて、イオン交換物質中に又はイオン交換物質上に分子が可逆的に固定化されるように、適切な条件（ｐＨ／伝導度）下でイオン交換物質へ分子を曝露させることを意味する。
「疎水性相互作用工程」という用語は、望ましくない物質（例えば、ＨＣＰ又はプロカテプシンＬ）が、疎水性物質との、目的の抗体及び望ましくない物質の疎水的相互作用の差に基づいて、目的の抗体が分離される工程を表す。
「疎水性相互作用物質」という用語は、望ましくない物質（例えば、ＨＣＰ又はプロカテプシンＬ）及び抗体を分離するための基礎として使用される疎水性物質を表す。疎水性相互作用物質の例には、約２から約８個の炭素原子を有するアルキル基又はフェニルなどのアリール基などの疎水性リガンドが含まれる。
「洗浄」又は「洗浄工程」という用語には、所定の物質（例えば、イオン交換物質又は疎水性相互作用物質）を通して、又は所定の物質上に適切な緩衝液を通過させることが含まれる。
「複数の洗浄工程」という用語は、２以上の連続する洗浄工程を含む。連続的緩衝液は、所定の物質（例えば、イオン交換物質又は疎水性相互作用物質）と非特異的に会合している不純物の様々な種類を解離させ、取り除くように設計された、ｐＨ、伝導度、溶媒濃度などの変動する特性を有し得る。一実施形態において、複数の洗浄工程は、約４０から５０％の溶出緩衝液をさらに含む、中間洗浄を含む。
分子（例えば、抗体又はきょう雑物質）を物質から「溶出する」とは、物質周囲の緩衝液を変化させることによって、分子と物質の相互作用を減少させることにより、分子を物質から取り外すことを意味する。一実施形態において、イオン交換物質上の帯電した部位に関して、緩衝液が抗体と競合するイオン交換カラムから抗体が溶出される。
「溶出液」という用語は、目的の抗体のクロマトグラフィー物質への結合及び抗体を解離させるための溶出緩衝液の添加後に得られた分子（例えば、抗体又はきょう雑物質）を含む液体を表す。溶出液は、精製プロセス中の工程に関連して言及され得る。例えば、「第一の溶出液」という用語は、第一のクロマトグラフィー工程からの溶出液を表し、「第二の溶出液」という用語は第二のクロマトグラフィー工程からの溶出液などを表す。
「貫流」という用語は、分子が結合せずにクロマトグラフィー材料上を通過するように、分子を含む混合物を材料上に通過させることによって得られた分子（例えば、抗体又はきょう雑物質）を含む液体を表す。
「緩衝液」とは、溶液中に存在することによって、ｐＨの単位変化を引き起こすために添加されなければならない酸又はアルキルの量を増加させる物質を表す。緩衝化された溶液は、その酸−塩基連血清分の作用によるｐＨの変化に抵抗する。生物学的試薬とともに使用するための緩衝化された溶液は、一般に、溶液のｐＨが生理的範囲内にあるように、水素イオンの一定濃度を維持することができる。伝統的な緩衝液成分には、有機及び無機の、塩、酸及び塩基が含まれるが、これらに限定されない。生物分子（例えば、抗体）の精製において使用するための典型的な緩衝液には、双性イオンの緩衝液又は「Ｇｏｏｄ」緩衝液が含まれる。例えば、「Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９６６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５：４６７」及び「Ｇｏｏｄ ａｎｄ Ｉｚａｗａ（１９７２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４：６２」を参照されたい。典型的な緩衝液には、ＴＥＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＴＲＩＣＩＮＥ及びＢＩＣＩＮＥが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書において使用される「洗浄緩衝液」は全て、本明細書において、抗体が結合されている所定の物質（例えば、イオン交換物質又は疎水性相互作用物質）から不純物を取り除くための物質を表す。
「溶出緩衝液」とは、１つ又はそれ以上の洗浄物質で所定の物質（例えば、イオン交換物質又は疎水性相互作用物質）が洗浄された後に、所定の物質から抗体を解離させるために使用される物質を表す。溶出緩衝液は、抗体を解離させるように作用する。典型的な溶出物質は本分野において周知であり、塩、遊離のアフィニティーリガンド若しくは類縁体又は標的物質の解離（例えば、所定の物質から抗体）を促進するその他の物質のより高い濃度を有し得る。溶出緩衝液の伝導度及び／又はｐＨは、イオン交換又は疎水性相互作用物質から抗体が溶出されるような伝導度及び／又はｐＨである。
「伝導度」という用語は、２つの電極間に電流を伝導させる水溶液の能力を表す。溶液中では、電流は、イオンの輸送によって流れる。従って、水溶液中に存在するイオンの量が増加するにつれて、溶液はより高い伝導度を有する。伝導度に対する測定の単位はｍｍｈｏ（ｍＳ／ｃｍ）であり、例えば、Ｏｒｉｏｎによって販売されている伝導度測定器を用いて測定することができる。溶液の伝導度は、溶液中のイオンの濃度を変化させることによって変化され得る。例えば、所望の伝導度を達成するために、溶液中の緩衝剤の濃度及び／又は塩（例えば、ＮａＣｌ又はＫＣｌ）の濃度を変化させ得る。一実施形態において、クロマトグラフィーにおいて使用される洗浄緩衝液又は他のいずれかの水溶液の塩濃度は、所望の伝導度を達成するために改変される。
抗体などのポリペプチドの「ｐＩ」又は「等電点」とは、ポリペプチドの正電荷がその負電荷と釣り合うｐＨを表す。ｐＩは、ポリペプチドのアミノ酸残基の正味の電化から計算することが可能であり、又は等電点電気泳動によって測定することが可能である。
「ウイルス不活化」という用語には、混合物中に含有されるウイルスを非機能的にすること、又は精製されるべき混合物からウイルスを除去することが含まれる。ウイルスは、抗体作製源、下流の処理工程又は製造条件に由来し得る。ウイルスを非機能的にする方法又はウイルスを除去する方法には、熱活性化、ｐＨ不活化、化学的不活化剤などが含まれる。「ｐＨウイルス不活化」という用語には、ウイルスを非機能的にするのに十分なｐＨにウイルスを供することが含まれる。
本明細書において使用される「ヒトＴＮＦα（本明細書では、ｈＴＮＦα又は単にｈＴＮＦと略称される。）」という用語は、１７ｋＤの分泌型及び２６Ｋｄの膜会合型として存在し、その生物学的に活性な形態が、非共有結合された１７ｋＤ分子の三量体から構成されるヒトサイトカインを表すものとする。ｈＴＮＦαの構造は、例えば、「Ｐｅｎｎｉｃａ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ３１２：７２４−７２９；Ｄａｖｉｓ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２６：１３２２−１３２６；ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ，Ｅ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３８：２２５−２２８」にさらに記載されている。ヒトＴＮＦαという用語には、標準的な組換え発現法によって調製し、又は商業的に購入する（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．２１０−ＴＡ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）ことが可能な組換えヒトＴＮＦα（ｒｈＴＮＦα）が含まれるものとする。ＴＮＦαは、ＴＮＦとも称される。
本明細書において使用される「抗体」という用語は、４つのポリペプチド鎖（ジスルフィド結合によって相互に接続された２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖）から構成される免疫グロブリン分子を表すものとする。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書において、ＨＣＶＲ又はＶＨと略称される。）及び重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書において、ＬＣＶＲ又はＶＬと略称される。）及び軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬから構成される。ＶＨ及びＶＬ領域は、より保存された領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と称される。）が散在された超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される。）へ、さらに細分割することが可能である。各ＶＨ及びＶＬは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で、アミノ末端からカルボキシ末端へ配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。本発明の抗体は、米国特許第６，０９０，３８２号、同第６，２５８，５６２号及び同第６，５０９，０１５号（これらの各々の全体は、参照により、本明細書に組み込まれる。）に、さらに詳しく記載されている。一実施形態において、本発明の抗体はＴＮＦα活性を妨害する抗ＴＮＦαである。抗ＴＮＦα抗体の例には、本明細書に記載されている抗ＴＮＦαヒト抗体及び抗体部分並びに米国特許第６，０９０，３８２号、同第６，２５８，５６２号、同第６，５０９，０１５号および米国特許出願０９／８０１１８５号及び１０／３０２３５６号（これらの各々は、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているものが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、本発明で使用されるＴＮＦα阻害剤は、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（Ｒ）Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ；米国特許第５，６５６，２７２号（参照により本明細書に組み込まれる。）に記載されている。）、ＣＤＰ５７１（ヒト化されたモノクローナル抗ＴＮＦ−αＩｇＧ４抗体）、ＣＤＰ８７０（ヒト化されたモノクローナル抗ＴＮＦ−α抗体断片）、抗ＴＮＦｄＡｂ（Ｐｅｐｔｅｃｈ）、ＣＮＴＯ１４８（ゴリムマブ；Ｍｅｄａｒｅｘ ａｎｄ Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）ＷＯ０２／１２５０２号中に記載されている抗体及びアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（Ｒ）、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ヒト抗ＴＮＦｍＡｂ、米国特許第６，０９０，３８２号に、Ｄ２Ｅ７として記載されている。）などの抗ＴＮＦα抗体又はその断片である。本発明で使用可能なさらなる抗体又はその断片は、米国特許第６，５９３，４５８号；同第６，４９８，２３７号；同第６，４５１，９８３号；及び同第６，４４８，３８０号（これらの各々は、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。本用語は、本発明の方法の標的である抗体である「目的の抗体」を含む。
本明細書において使用される抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えば、ｈＴＮＦα）に特異的に結合する能力を保持する、抗体の断片の１つ又はそれ以上の断片を表す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって実行可能であることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片）、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片（ヒンジ領域において、ジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片）、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−５４６）及び（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは別個の遺伝子によってコードされているが、これらは、ＶＬ及びＶＨ領域が対合して一価分子を形成している単一のタンパク質鎖として、これらの作製を可能とする合成リンカーによって、組み換え法を用いて連結することが可能である（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている。例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；ａｎｄ Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３）。このような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されるものとする。ダイアボディなどの一本鎖抗体の他の形態も包含される。ダイアボディは、ＶＨ及びＶＬドメインが一本鎖ポリペプチド鎖上に発現されているが、同一鎖上にある２つのドメイン間での対合を可能とするには短すぎるリンカーを使用することにより、両ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合するように強制し、２つの抗原結合部位を作出する二価の二重特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ２：１１２１−１１２３を参照）。本発明の抗体部分は、米国特許第６，０９０，３８２号、同第６，２５８，５６２号及び同第６，５０９，０１５号（これらの各々の全体は、参照により、本明細書に組み込まれる。）に、さらに詳しく記載されている。
結合断片は、組換えＤＮＡ技術によって、又は完全な状態の免疫グロブリンの酵素的若しくは化学的切断によって産生される。結合断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆｖ、一本鎖及び一本鎖抗体が含まれる。「二重特異的」又は「二機能性」免疫グロブリン又は抗体を除くと、免疫グロブリン又は抗体は、その結合部位の各々が同一であると理解される。「二重特異的」又は「二機能性抗体」は、２つの異なる重／軽鎖対及び２つの異なる結合部位を有する人工のハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合又はＦａｂ’断片の連結など、様々な方法によって作製することが可能である。例えば、「Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ＆ Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１５４７−１５５３（１９９２）」を参照されたい。
本明細書において使用される「保存的アミノ酸置換」とは、１つのアミノ酸置換が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基で置換される置換である。塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非帯電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐した側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）など、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが、本技術分野において定義されている。
「キメラ抗体」は、重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列のそれぞれの一部が特定の種に由来する又は特定の綱に属する抗体中の対応する配列と相同であるが、鎖の残りのセグメントが別の種由来の対応する配列と相同である抗体を表す。一実施形態において、本発明は、軽鎖及び重鎖の両方の可変領域が哺乳動物のある種に由来する抗体の可変領域を模倣するのに対して、定常部分は別の種に由来する抗体中の配列と相同であるキメラ抗体又は抗原結合断片に関する。本発明の好ましい実施形態において、キメラ抗体は、マウス抗体からのＣＤＲをヒト抗体のフレームワーク領域上に植え付けることによって作製される。
「ヒト化抗体」は、実質的にヒト抗体鎖（アクセプター免疫グロブリン又は抗体と称される。）に由来する可変領域フレームワーク残基を含む少なくとも１つの鎖と及び実質的に非ヒト抗体（例えば、マウス）に由来する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む抗体を表す。ＣＤＲの植え付けの他に、ヒト化抗体は、通例、親和性及び／又は免疫原性を改善するためにさらなる変化を受ける。
「多価抗体」という用語は、２以上の抗原認識部位を含む抗体を表す。例えば、「二価」抗体は２つの抗原認識部位を有するのに対して、「四価」抗体は４つの抗原認識部位を有する。「一重特異的」、「二重特異的」、「三重特異的」、「四重特異的」などの用語は、（抗原認識部位の数ではなく）多価抗体中に存在する異なる抗原認識部位の特異性の数を表す。例えば、「一重特異的」抗体の抗原認識部位は、全て同一のエピトープを結合する。「二重特異的」又は「デュアル特異的」抗体は、第一のエピトープを結合する少なくとも１つの抗原認識部位及び第一のエピトープとは異なる第二のエピトープを結合する少なくとも１つの抗原認識部位を有する。「多価一重特異的」抗体は、全て同一のエピトープを結合する複数の抗原認識部位を有する。「多価二重特異的」抗体は、複数の抗原認識部位を有し、そのうちの幾つかは第一のエピトープを結合し、及びそのうちの幾つかは第一のエピトープとは異なる第二のエピトープを結合する。
本明細書において使用される「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むものとする。本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＥ３中に、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムな突然変異導入若しくは部位特異的突然変異導入によって、又はインビボでの体細胞変異によって導入された変異）を含み得る。しかしながら、本明細書において使用される「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に植え付けられた抗体を含まないものとする。
本明細書において使用される「組換えヒト抗体」という用語は、宿主細胞中に形質移入された組換え発現ベクターを用いて発現された抗体（以下で、さらに記載されている。）、組換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリー（以下で、さらに記載されている。）から単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対して遺伝子導入される動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０：６２８７を参照。）など、組換え手段によって、調製され、発現され、作製され、若しくは単離された全てヒト抗体、又はヒト免疫グロブリン遺伝子配列の、他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う他の何れかの手段によって調製され、発現され、作製され、若しくは単離された抗体を含むものとする。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する。しかしながら、ある種の実施形態において、このような組換えヒト抗体は、インビトロ突然変異導入（又は、ヒトＩｇ配列に対して遺伝子導入された動物が使用される場合には、インビボ体細胞突然変異導入）に供され、従って、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ及びＶＬ配列に由来し、これらの配列に関連しつつも、インビボで、ヒト抗体生殖系列レパートリー内には、天然に存在しない場合があり得る配列である。
このようなキメラ、ヒト化、ヒト及び二重特異的抗体は、例えば、ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；欧州特許出願１８４，１８７；欧州特許出願１７１，４９６；欧州特許出願１７３，４９４；ＰＣＴ国際公開ＷＯ８６／０１５３３；米国特許第４，８１６，５６７号；欧州特許出願１２５，０２３；Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）J.Ｉｍｍｕｎｏｌ１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６−４４９；Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．（１９８８）J.Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉ ｅｔ ａｌ．（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４：２１４；米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１:５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；ａｎｄ Ｂｅｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）J.Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１:４０５３−４０６０，Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ８６：１００２９−１００３３（１９８９），ＵＳ５，５３０，１０１，ＵＳ５，５８５，０８９，ＵＳ５，６９３，７６１，ＵＳ５，６９３，７６２，Ｓｅｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ，ＷＯ９０／０７８６１及びＷｉｎｔｅｒ，ＵＳ５，２２５，５３９に記載されている方法を用いて、本分野で公知の組み換えＤＮＡ技術によって作製することができる。
本明細書において使用される「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体（例えば、ｈＴＮＦαを特異的に結合する単離された抗体は、ｈＴＮＦα以外の抗原を特異的に結合する抗体を実質的に含まない）を表すものとする。しかしながら、ｈＴＮＦαを特異的に結合する単離された抗体は、他の種から得られるＴＮＦα分子など、他の抗原への交叉反応性を有し得る（以下に、さらに詳しく論述されている。）。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まないことができる。
本明細書において使用される「中和抗体」（又は「ｈＴＮＦα活性を中和した抗体」）は、ｈＴＮＦαへのその結合が、ｈＴＮＦαの生物学的活性の阻害をもたらす抗体を表すものとする。ｈＴＮＦαの生物学的活性のこの阻害は、ｈＴＮＦαによって誘導された細胞毒性（インビトロ又はインビボの何れか）、ｈＴＮＦαによって誘導された細胞活性化及びｈＴＮＦα受容体へのｈＴＮＦαの結合など、ｈＴＮＦα生物活性の１つ又はそれ以上の指標を測定することによって評価することが可能である。ｈＴＮＦα生物活性のこれらの指標は、本分野で公知の幾つかの標準的なインビトロ又はインビボアッセイの１つ又はそれ以上によって評価することが可能である（米国特許第６，０９０，３８２号参照）。好ましくは、抗体がｈＴＮＦα活性を中和する抗体の能力は、ｈＴＮＦαによって誘導されるＬ９２９細胞の細胞毒性の阻害によって評価される。ｈＴＮＦα活性のさらなるパラメータ又は別のパラメータとして、ｈＴＮＦαによって誘導されたＥＬＡＭ−ＩのＨＵＶＥＣ上への発現を阻害する抗体の能力を、ｈＴＮＦαによって誘導された細胞活性化の指標として評価することが可能である。
本明細書において使用される「表面プラズモン共鳴」という用語は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ ａｎｄ Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによって、リアルタイムな生物特異的相互作用の分析を可能とする光学現象を表す。さらなる記述については、米国特許第６，２５８，５６２号の実施例１及び「Ｊｏｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９；Ｊｏｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：６２０−６２７；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９９５）J.Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５；ａｎｄ Ｊｏｈｎｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９８：２６８」を参照されたい。
本明細書において使用される「Ｋｏｆｆ」という用語は、抗体／抗原複合体からの抗体の解離に対する解離速度定数を表すものとする。
本明細書において使用される「Ｋｄ」という用語は、特定の抗体抗原相互作用の解離定数を表すものとする。
本明細書において使用される「ＩＣ５０」という用語は、対象とする生物学的評価項目（例えば、細胞毒性活性の中和）を阻害するのに必要とされる阻害剤の濃度を表すものとする。
本明細書において使用される「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むものとする。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
ｈＴＮＦαを結合する抗体又は抗体部分（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ３）をコードする核酸に対して本明細書で使用される「単離された核酸分子」という用語は、抗体又は抗体部分をコードするヌクレオチド配列が、ｈＴＮＦα以外の抗原を結合する抗体又は抗体部分をコードする他のヌクレオチド配列（この他の配列は、天然の状態で、ヒトゲノムＤＮＡ中の核酸に隣接し得る。）を含まない核酸分子を表すものとする。従って、例えば、抗ｈＴＮＦα抗体のＶＨ領域をコードする本発明の単離された核酸は、ｈＴＮＦα以外の抗原を結合する他のＶＨ領域をコードする他の配列を含有しない。
本明細書において使用される「ベクター」という用語は、当該核酸分子に連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を表すものとする。ベクターの１つの種類は「プラスミド」であり、これは、その中にさらなるＤＮＡセグメントを連結し得る環状二本鎖ＤＮＡループを表す。ベクターの別の種類はウイルスベクターであり、ここにおいて、追加のＤＮＡセグメントはウイルスゲノム中に連結され得る。ある種のベクターは、当該ベクターがその中に導入された宿主細胞中で自律的複製を行うことができる（例えば、細菌の複製起点及びエピソーム哺乳動物ベクターを有する細菌ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入時に、宿主細胞のゲノム中に組み込まれることが可能であり、これにより、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが作用可能に連結されている遺伝子の発現を誘導することが可能である。このようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」（又は単に、「発現ベクター」）と称される。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしば、プラスミドの形態である。本明細書において、プラスミドは、最も一般的に使用されるベクターの形態であるので、本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は互換的に使用され得る。しかしながら、本発明は、均等な機能を果たす、ウイルスベクターなどの（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）発現ベクターのこのような他の形態を含むものとする。
本明細書において使用される「組換え宿主細胞」（又は単に、「宿主細胞」）という用語は、組換え発現ベクターがその中に導入されている細胞を表すものとする。このような用語は、当該細胞を表すのみならず、このような細胞の子孫も表すことを理解すべきである。突然変異又は環境的な影響のために、後続の世代中にある種の修飾が生じ得るので、このような子孫は、実際には、親細胞と同一でないことがあり得るが、本明細書において使用される「宿主細胞」という用語の範囲に、なお含まれる。
本明細書において使用される「キット」という用語は、構成要素を含む、梱包された生産品又は製品を表す。キットは、好ましくは、キットの構成要素を収容する箱又は容器を含む。箱又は容器には、ラベル又は食品医薬品局によって認可されたプロトコールが貼付される。箱又は容器は、プラスチック、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン又はプロピレン容器内に好ましく含有される本発明の構成要素を収容する。容器は、蓋をしたチューブ又は瓶とすることが可能である。キットは、本発明のＴＮＦα抗体を投与するための指示書も含むことができる。一実施形態において、本発明のキットは、ＰＣＴ／ＩＢ０３／０４５０２及び米国特許出願１０／２２２１４０号に記載されているヒト抗体Ｄ２Ｅ７を含む製剤を含む。
本発明の様々な態様は、以下でさらに詳しく記載されている。
ＩＩ．抗体の作製
本明細書において、本発明は、抗体及び１つ又はそれ以上のＨＣＰを含む混合物から抗体を精製するための方法を提供する。当初混合物は、一般に、抗体の組み換え産生から得られる混合物である。あるいは、当初混合物は、ペプチド合成（又は他の合成手段）による抗体の作製から得ることができ、又は抗体は当該抗体の当初の源から精製され得る。
本発明の抗体又は抗体部分を発現させるために、遺伝子が転写調節配列及び翻訳調節配列へ作用可能に連結されるように、部分又は完全長軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡは発現ベクター中に挿入される。この文脈において、「作用可能に連結された」という用語は、ベクター内の転写調節配列及び翻訳調節配列が、抗体遺伝子の転写及び翻訳を制御するという所期の機能を果たすように、抗体遺伝子がベクター中に連結されていることを意味するものとする。発現ベクター及び発現調節配列は、使用される発現宿主細胞と適合的であるように選択される。抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、別個のベクター中に挿入することが可能であり、又は、より典型的には、両遺伝子は同一の発現ベクター中に挿入される。抗体遺伝子は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片及びベクター上の相補的制限部位の連結、又は制限部位が存在しなければ、平滑末端連結）によって発現ベクター中に挿入される。抗体又は抗体関連軽鎖又は重鎖配列の挿入の前に、発現ベクターは、既に、抗体定常領域配列を担持し得る。例えば、アダリムマブ又はアダリムマブ関連ＶＨ及びＶＬ配列を完全長抗体遺伝子へと変換するための１つのアプローチは、ＶＨセグメントが、ベクター内のＣＨセグメントへ、作用可能に連結され、及びＶＬセグメントが、ベクター内のＣＬセグメントへ、作用可能に連結されるように、それぞれ、既に重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をコードする発現ベクター中にそれらを挿入することである。これに加えて又はこれに代えて、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることが可能である。シグナルペプチドが、抗体鎖遺伝子のアミノ末端へ、インフレームに連結されるように、抗体鎖遺伝子はベクター中にクローニングすることが可能である。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種のシグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）とすることが可能である。
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中の抗体鎖遺伝子の発現を調節する制御配列を担持する。「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー及び抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を調節する他の発現調節要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むものとする。このような制御配列は、例えば、「Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）」に記載されている。制御配列の選択など、発現ベクターの設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現レベルなどの要因に依存し得ることが、当業者によって理解される。哺乳動物の宿主細胞発現のために好ましい制御配列には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））及びポリオーマに由来するプロモーター及び／又はエンハンサーなど、哺乳動物細胞中でタンパク質発現の高いレベルを誘導するウイルス要素が含まれる。ウイルス制御要素及びその配列のさらなる記述については、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉによる米国特許第５，１６８，０６２号、Ｂｅｌｌらによる米国特許４，５１０，２４５号及びＳｃｈａｆｆｎｅｒらによる米国特許第４，９６８，６１５号を参照されたい。
抗体鎖遺伝子及び制御配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中でのベクターの複製を制御する配列（例えば、複製起点）及び選択可能なマーカー遺伝子など、さらなる配列を担持し得る。選択可能なマーカー遺伝子は、その中にベクターが導入される宿主細胞の選択を容易にする（例えば、全てＡｘｅｌによる米国特許第４，３９９，２１６号、米国特許第４，６３４，６６５号及び米国特許第５，１７９，０１７号を参照されたい。）。例えば、典型的には、選択可能なマーカー遺伝子は、その中にベクターが導入される宿主細胞に対して、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択可能なマーカー遺伝子には、（メトトレキサート選択／増幅とともに、ｄｈｆｒ−宿主細胞中で使用するための）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）が含まれる。
軽鎖及び重鎖を発現させるために、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターは、標準的な技術によって、宿主細胞中に形質移入される。「形質移入」という用語の様々な形態は、原核又は真核宿主細胞中への外来ＤＮＡの導入のために一般に使用される多様な技術、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン形質移入などを包含するものとする。原核又は真核宿主細胞の何れの中でも、本発明の抗体を発現することは理論的に可能であるが、真核細胞、特に、哺乳動物細胞は、原核細胞に比べて、適切に折りたたまれ、免疫学的に活性な抗体を集合及び分泌する傾向がより大きいので、真核細胞中での抗体の発現、最も好ましくは哺乳動物宿主細胞中での抗体の発現が最も好ましい。抗体遺伝子の原核生物発現は、活性な抗体の高い収率の産生には有効でないことが報告されている（Ｂｏｓｓ ａｎｄ Ｗｏｏｄ（１９８５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ６：１２−１３）。
本明細書において、ベクター中のＤＮＡをクローニングし、又は発現させるための適切な宿主細胞は、上に記載されている原核生物、酵母又は高等真核生物細胞である。この目的のための適切な原核生物には、グラム陰性又はグラム陽性生物などの真正細菌、例えば、エシェリヒア（例えば、イー・コリ）、エンテロバクター、エルウィニア、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ（サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））、セラチア（例えば、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）及びシゲラなどの腸内細菌科並びにＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｕｔｉｌｉｓ）及びＢ．リシェニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６，７１０に開示されているＢ．リシェニフォルミス４１Ｐ）、Ｐ．エルジノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）などのシュードモナス及びストレプトミセスなどの桿菌が含まれる。１つの好ましいイー・コリクローニング宿主はイー・コリ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、イー・コリＢ、イー・コリＸ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）及びイー・コリＷ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）などのその他の株が適切である。これらの例は、限定的なものではなく、例示的なものである。
原核生物の他に、糸状菌又は酵母などの真核微生物は、ポリペプチドをコードするベクターに対する適切なクローニング又は発現宿主である。下等真核宿主微生物のうち、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、すなわち、一般的なパン酵母が最も一般的に使用されている。しかしながら、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）；例えば、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラジリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）、（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ブルガリカス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ウィッケルアミ（ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ワルチイ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィララム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）及びＫ．マルキサヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）；ヤロウイア（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ４０２，２２６）などのクルイベロミセス宿主；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ１８３，０７０）；カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）（ＥＰ２４４，２３４）；ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）；シュワニオミセス・オクチデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）などのシュワニオミセス；並びに、例えば、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）及びＡ．ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）などのアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）などの糸状菌など、多数の他の属、種及び株が本発明において一般的に利用可能であり、有用である。
グリコシル化された抗体の発現のための適切な宿主細胞は、多細胞生物から得られる。無脊椎生物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株及び変異株並びにスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモムシ）、アエデス・アエジプチ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、アエデス・アルボピクタス（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）及びボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）などの宿主由来の対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。形質移入のための様々なウイルス株（例えば、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変種及びボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）ＮＰＶのＢｍ−５株）が公的に入手可能であり、このようなウイルスは、特に、スポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質移入のために、本発明に従い、本明細書においてウイルスとして使用し得る。綿、トウモロコシ、芋、大豆、ペチュニア、トマト及びタバコの植物細胞培養物も、宿主として使用することができる。
本発明の組換え抗体を発現するための好ましい哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）ＰＮＡＳＵＳＡ７７：４２１６−４２２０に記載されており、例えば、Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載されているようにＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに使用されるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む。）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞が含まれる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞中に導入されると、宿主細胞中で抗体の発現を可能とするのに十分な期間にわたって、又は、より好ましくは、宿主細胞がその中で増殖されている培地中への抗体の分泌を可能とするのに十分な期間にわたって、宿主細胞を培養することによって抗体が産生される。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）；ヒト胎児由来腎臓株（懸濁液培養中での増殖のためにサブクローニングされた２９３又は２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＧｅｎＶｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝細胞腫株（Ｈｅｐ Ｇ２）である。
宿主細胞は、抗体産生用の上記発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように修飾された慣用の栄養素培地中で培養される。
抗体を作製するために使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養され得る。ＨａｍのＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）及びダルベッコの改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地が、宿主細胞を培養するのに適している。さらに、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９），Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０），米国特許４，７６７，７０４；４，６５７，８６６；４，９２７，７６２；４，５６０，６５５；又は５，１２２，４６９；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；又は米国特許再審査３０，９８５に記載されている培地の何れをも、宿主細胞に対する培地として使用し得る。これらの培地の何れにも、必要に応じて、ホルモン及び／又は他の増殖因子（インシュリン、トランスフェリン又は上皮増殖因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びホスファートなど）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗体（ゲンタマイシン薬など）、微量元素（通常μＭ範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される。）並びにグルコース又は均等なエネルギー源を補充し得る。他の何れの必要な補充物も、当業者に公知である適切な濃度で含め得る。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞とともに以前に用いられた培養条件であり、当業者に自明である。
Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖ分子など、完全な状態の抗体の部分を作製するために、宿主細胞を使用することも可能である。上記操作に対する改変は、本発明の範囲に属することが理解される。例えば、本発明の抗体の軽鎖又は重鎖の何れか（両鎖ではない。）をコードするＤＮＡで宿主細胞を形質移入することが望ましい場合があり得る。ｈＴＮＦαに結合するために必要でない軽鎖及び重鎖の一方又は両方をコードするＤＮＡの一部又は全部を除去するために、組換えＤＮＡ技術も使用し得る。このような末端切断されたＤＮＡ分子から発現された分子も、本発明の抗体によって包含される。さらに、１つの重鎖及び１つの軽鎖が本発明の抗体であり、他の重鎖及び軽鎖が、ｈＴＮＦα以外の抗原に対して特異的である二機能性抗体は、標準的な化学架橋法によって、本発明の抗体を第二の抗体に架橋することによって作製し得る。
本発明の抗体又はその抗原結合部分の組換え発現用の好ましいシステムでは、リン酸カルシウムによって媒介された形質移入によって、抗体重鎖及び抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターが、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞中に導入される。組換え発現ベクター内で、抗体重鎖及び軽鎖遺伝子は、遺伝子の転写の高いレベルを誘導するために、各々、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＰＬプロモーター制御要素へ作用可能に連結されている。組換え発現ベクターは、メトトレキサート選択／増幅を用いて、ベクターで形質移入されたＣＨＯ細胞の選択を可能とするＤＨＦＲ遺伝子も担持する。選択された形質転換体宿主細胞は、抗体重鎖及び軽鎖の発現を可能とするために培養され、完全な状態の抗体が培地から回収される。組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞を形質移入し、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、培地から抗体を回収するために、標準的な分子生物学的技術が使用される。
アダリムマブ若しくはその抗原結合部分又は本明細書に開示されているアダリムマブ関連抗体などの、本発明の組換えヒト抗体は、ヒトリンパ球から得られたｍＲＮＡから調製されたヒトＶＬ及びＶＨｃＤＮＡを用いて調製された組換えコンビナトリアル抗体ライブラリー、好ましくはｓｃＦｖファージディスプレイのスクリーニングによって単離することが可能である。このようなライブラリーを調製及びスクリーニングする方法は、本分野において公知である。ファージディスプレイライブラリーを作製するための市販のキット（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ，ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．２７−９４００−０１；及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＳｕｒｆＺＡＰＴＭ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｋｉｔ，ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．２４０６１２）の他に、抗体ディスプレイライブラリーを作製及びスクリーニングする上での使用に特に好ましい方法及び試薬の例は、例えば、Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．米国特許第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１８６１９；Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．ＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ９１／１７２７１；Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／２０７９１；Ｍａｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１５６７９；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／０１２８８；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０１０４７；Ｇａｒｒａｒｄ ｅｔ ａｌ ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０９６９０；Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ３：８１−８５；Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５−１２８１；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ １２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＪＭｏｌＢｉｏｌ２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＰＮＡＳ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ１９：４１３３−４１３７；及びＢａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）ＰＮＡＳ８８：７９７８−７９８２に見出される。
組み換え技術を使用する場合には、抗体は、細胞内、細胞膜周辺腔中に産生され、又は培地中に直接分泌され得る。第一の工程として、抗体が細胞内で産生されれば、粒子状破砕物（（例えば、均質化によって生じた）宿主細胞又は溶解された細胞）は、例えば、遠心又は限外ろ過によって除去される。抗体が培地中に分泌される場合、このような発現系から得られる上清は、一般に、まず、市販のタンパク質濃縮フィルター（例えば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅＰｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過ユニット）を用いて濃縮される。
本発明の方法の前に、細胞破砕物由来の抗体の精製操作は、第一に、抗体の発現の部位に依存する。幾つかの抗体は、周囲の増殖培地中へ細胞から直接分泌させるようにすることが可能であるが、他の抗体は細胞内で作製される。後者の抗体に関しては、精製方法の第一の工程では、細胞の溶解を行い、これは、機械的な剪断、浸透圧ショック又は酵素的処理などの様々な方法によって行うことができる。このような破壊は、細胞の内容物全体をホモジネート中へ放出し、さらに、サイズが小さいために除去することが困難な細胞内断片を生成する。これらは、一般に、分画遠心法又はろ過によって除去される。抗体が培地中に分泌される場合、このような発現系から得られる上清は、一般に、まず、市販のタンパク質濃縮フィルター（例えば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅＰｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過ユニット）を用いて濃縮される。抗体が培地中に分泌される場合には、組み換え宿主細胞は、細胞培地から、例えば、接線流ろ過によって分離することも可能である。さらに、抗体は、本発明の抗体精製方法を用いて、培地から回収することが可能である。
一実施形態において、本発明の方法は、高い親和性及び低い解離速度を有し、並びに高い中和能を有する、ヒトＴＮＦαに結合する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分を含む。好ましくは、ヒト抗体は、組換え、中和ヒト抗ｈＴＮＦα抗体である。本発明の方法において使用される、最も好ましい組換え中和抗体は、アダリムマブとして本明細書で表記される（アダリムマブ、Ｈｕｍｉｒａ（Ｒ）及びＤ２Ｅ７とも称される（Ｄ２Ｅ７ＶＬ領域のアミノ酸配列は配列番号１に示されており、Ｄ２Ｅ７ＶＨ領域のアミノ酸配列は配列番号２に示されている。）。）。Ｄ２Ｅ７（アダリムマブ；Ｈｕｍｉｒａ（Ｒ））の特性は、Ｓａｌｆｅｌｄらの米国特許第６，０９０，３８２号、第６，２５８，５６２号及び第６，５０９，０１５号（各々、参照により、本明細書に組み込まれている。）に記載されている。ＴＮＦα抗体の他の例には、関節リウマチの治療について、臨床試験が行われたキメラ及びヒト化マウス抗ｈＴＮＦα抗体が含まれる（例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｌａｎｃｅｔ３４４：１１２５−１１２７；Ｅｌｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｌａｎｃｅｔ３４４：１１０５−１１１０；Ｒａｎｋｉｎ，Ｅ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂｒ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．３４：３３４−３４２参照。）。別の実施形態において、本発明で使用されるＴＮＦα抗体は、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（Ｒ）Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ；米国特許第５，６５６，２７２号（参照により本明細書に組み込まれる。）に記載されている。）、ＣＤＰ５７１（ヒト化されたモノクローナル抗ＴＮＦ−αＩｇＧ４抗体）、ＣＤＰ８７０（ヒト化されたモノクローナル抗ＴＮＦ−α抗体断片）、抗ＴＮＦｄＡｂ（Ｐｅｐｔｅｃｈ）、ＣＮＴＯ１４８（ゴリムマブ；Ｍｅｄａｒｅｘ ａｎｄ Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，ＷＯ０２／１２５０２号も参照。）である。
一実施形態において、本発明の方法は、アダリムマブ抗体及び抗体の一部、アダリムマブ関連抗体及び抗体の一部、並びに低い解離速度と高い中和能でのｈＴＮＦαへの高親和性結合のような、アダリムマブと均等な特性を有するその他のヒト抗体及び抗体のいつ部を含む。一実施形態において、本発明は、１×１０−８Ｍ又はそれ以下のＫｄ及び１×１０−３ｓ−１又はそれ以下のＫｏｆｆ速度定数でヒトＴＮＦαから解離し（何れも、表面プラズモン共鳴によって測定される。）、並びに、標準的なインビトロＬ９２９アッセイにおいて、１×１０−７Ｍ又はそれ以下のＩＣ５０でヒトＴＮＦα細胞毒性を中和する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分を用いた治療を提供する。より好ましくは、単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分は、５×１０−４ｓ−１又はそれ以下のＫｏｆｆで、又はより好ましくは、１×１０−４ｓ−１若しくはそれ以下のＫｏｆｆで、ヒトＴＮＦαから解離する。より好ましくは、単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分は、１×１０−８Ｍ若しくはそれ以下のＩＣ５０、より好ましくは、１×１０−９Ｍ若しくはそれ以下のＩＣ５０、さらにより好ましくは、１×１０−１０Ｍ若しくはそれ以下のＩＣ５０で、標準的なインビトロＬ９２９アッセイにおいて、ヒトＴＮＦα細胞毒性を中和する。好ましい実施形態において、抗体は、単離されたヒト組換え抗体又はその抗原結合部分である。
抗体重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３ドメインは、抗原に対する抗体の結合特異性／親和性において重要な役割を果たしていることが分野において周知である。従って、別の態様において、本発明は、ｈＴＮＦαとの会合に対して遅い解離速度を有し、並びに、アダリムマブと構造的に同一であり又は関連した軽鎖及び重鎖ＣＤＲ３ドメインを有する本発明の方法を用いて得られたヒト抗体を投与することによって、関節リウマチを治療する方法に関する。アダリブマブＶＬＣＤＲ３の９位は、Ｋｏｆｆに対して実質的に影響を与えずに、Ａｌａ又はＴｈｒによって占拠されることが可能である。従って、アダリムマブＶＬＣＤＲ３に対するコンセンサスモチーフは、アミノ酸配列Ｑ−Ｒ−Ｙ−Ｎ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｙ−（Ｔ／Ａ）（配列番号３）を含む。さらに、アダリムマブＶＨＣＤＲ３の１２位は、Ｋｏｆｆに対して実質的に影響を与えずに、Ｔｙｒ又はＡｓｎによって占拠されることが可能である。従って、アダリムマブＶＬＣＤＲ３に対するコンセンサスモチーフは、アミノ酸配列Ｖ−Ｓ−Ｙ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｄ−（Ｙ／Ｎ）（配列番号４）を含む。さらに、米国特許第６，０９０，３８２号の実施例２に示されているように、アダリムマブ重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３ドメインは、Ｋｏｆｆに対して実質的に影響を与えずに、（ＶＬＣＤＲ３内の１、４、５、７若しくは８位に、又はＶＨＣＤＲ３内の２、３、４、５、６、８、９、１０若しくは１１位に）単一のアラニン残基での置換を行いやすい。さらに、アダリムマブＶＬ及びＶＨＣＤＲ３ドメインは、アラニンによる置換を行いやすいことに鑑みれば、当業者は、抗体の低い解離速度定数を保持しながら、ＣＤＲ３ドメイン内に他のアミノ酸の置換（特に、保存的アミノ酸での置換）が可能であり得ることを理解する。好ましくは、アダリムマブＶＬ及び／又はＶＨＣＤＲ３ドメイン内に、１個から５個以下の保存的アミノ酸置換が施される。より好ましくは、アダリムマブＶＬ及び／又はＶＨＣＤＲ３ドメイン内に、１個から３個以下の保存的アミノ酸置換が施される。さらに、保存的アミノ酸置換は、ｈＴＮＦαへの結合に対して重要なアミノ酸位置で行われるべきでない。アダリムマブＶＬＣＤＲ３の２位及び５位並びにアダリムマブＶＨＣＤＲ３の１位及び７位は、ｈＴＮＦαとの相互作用について重要であると思われるので、保存的アミノ酸置換は、好ましくは、これらの位置において行われない（但し、上記のように、アダリムマブＶＬＣＤＲ３の５位におけるアラニン置換は許容される。）（米国特許第６，０９０，３８２号参照）。
従って、別の実施形態において、抗体又はその抗原結合部分は、好ましくは、以下の特徴を含有する。
ａ）表面プラズモン共鳴によって測定した場合に、１×１０−３ｓ−１又はそれ以下のＫｏｆｆ速度定数でヒトＴＮＦαから解離する；
ｂ）配列番号３のアミノ酸配列又は位置１、４、５、７若しくは８において、単一のアラニン置換によって配列番号３から修飾されたアミノ酸配列又は位置１、３、４、６、７、８及び／又は９において、１個から５個の保存的アミノ酸置換によって配列番号３から修飾されたアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを有する；
ｃ）配列番号４のアミノ酸配列又は位置２、３、４、５、６、８、９、１０若しくは１１において、単一のアラニン置換によって配列番号４から修飾されたアミノ酸配列又は位置２、３、４、５、６、８、９、１０、１１及び／又は１２において、１個から５個の保存的アミノ酸置換によって配列番号４から修飾されたアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメインを有する。
より好ましくは、抗体又はその抗原結合部分は、５×１０−４ｓ−１又はそれ以下のＫｏｆｆでヒトＴＮＦαから解離する。さらに好ましくは、抗体又はその抗原結合部分は、１×１０−４ｓ−１又はそれ以下のＫｏｆｆでヒトＴＮＦαから解離する。
さらに別の実施形態において、抗体又はその抗原結合部分は、好ましくは、配列番号３のアミノ酸配列又は位置１、４、５、７若しくは８において、単一のアラニン置換によって配列番号３から修飾されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインを有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含有し、及び配列番号４のアミノ酸配列又は位置２、３、４、５、６、８、９、１０又は１１において単一のアラニン置換によって配列番号４から修飾されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインを有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含有する。好ましくは、ＬＣＶＲは、さらに、配列番号５のアミノ酸配列（すなわち、アダリムマブＶＬＣＤＲ２）を含むＣＤＲ２ドメインを有し、ＨＣＶＲは、さらに、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン（すなわち、アダリムマブＶＨＣＤＲ２）を有する。さらに好ましくは、ＬＣＶＲは、さらに、配列番号７のアミノ酸配列（すなわち、アダリムマブＶＬＣＤＲ１）を含むＣＤＲ１ドメインを有し、ＨＣＶＲは、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメイン（すなわち、アダリムマブＶＨＣＤＲ１）を有する。ＶＬに対するフレームワーク領域は、好ましくは、ＶκＩヒト生殖系列ファミリーから、より好ましくは、Ａ２０ヒト生殖系列Ｖκ遺伝子から、最も好ましくは、米国特許第６，０９０，３８２号の図１Ａ及び１Ｂに示されているアダリムマブＶＬフレームワーク配列から得られる。ＶＨに対するフレームワーク領域は、好ましくは、ＶＨ３ヒト生殖系列ファミリーから、より好ましくは、ＤＰ−３１ヒト生殖系列ＶＨ遺伝子から、最も好ましくは、米国特許第６，０９０，３８２号の図２Ａ及び２Ｂに示されているアダリムマブＶＨフレームワーク配列から得られる。
従って、別の実施形態において、抗体又はその抗原結合部分は、好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列（すなわち、アダリムマブＶＬ）を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）及び配列番号２のアミノ酸配列（すなわち、アダリムマブＶＨ）を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含有する。ある種の実施形態において、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域などの重鎖定常領域を含む。好ましくは、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１重鎖定常領域又はＩｇＧ４重鎖定常領域である。さらに、抗体は、軽鎖定常領域（κ軽鎖定常領域又はλ軽鎖定常領域の何れか）を含むことが可能である。好ましくは、抗体は、κ軽鎖定常領域を含む。あるいは、抗体部分は、例えば、Ｆａｂ断片又は一本鎖Ｆｖ断片であり得る。
さらに別の実施形態において、抗体又はその抗原結合部分は、好ましくは、配列番号３、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインを有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）とともに、又は配列番号４、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４及び配列番号３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインを有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）とともに、アダリムマブ関連ＶＬ及びＶＨＣＤＲ３ドメイン、例えば、抗体又はその抗原結合部分を含有する。
本発明において使用されるＴＮＦα抗体は、修飾することも可能である。幾つかの実施形態において、ＴＮＦα抗体又はその抗原結合部分は、所望の効果を提供するために化学的に修飾される。例えば、本発明の抗体及び抗体断片のＰＥＧ化は、例えば、以下の参考文献：Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ３：４−１０（１９９２）；ＥＰ ０ １５４ ３１６；及びＥＰ ０４０１ ３８４（各々、その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているように、本分野で公知のＰＥＧ化反応の何れかによって実施され得る。好ましくは、ＰＥＧ化は、反応性ポリエチレングリコール分子（又は類似の反応性の水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応を介して実施される。本発明の抗体及び抗体断片のＰＥＧ化のために好ましい水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。本明細書において使用される「ポリエチレングリコール」は、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−又はアリールオキシポリエチレングリコールなどの他のタンパク質を誘導体化するために使用されてきたＰＥＧの形態の全てを包含するものとする。
本発明のＰＥＧ化された抗体及び抗体断片を調製する方法は、一般的に、（ａ）抗体又は抗体断片が１つ又はそれ以上のＰＥＧ基に付着された状態となる条件下で、抗体又は抗体断片をポリエチレングリコール（ＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体など）と反応させる工程、及び（ｂ）反応産物を取得する工程を含む。公知のパラメータ及び所望の結果に基づいて、最適な反応条件又はアシル化反応を選択することが、当業者に自明である。
ＰＥＧ化された抗体及び抗体断片は、一般に、本明細書に記載されているＴＮＦα抗体及び抗体断片の投与によって、本発明のＴＮＦα関連疾患を治療するために使用し得る。一般的に、ＰＥＧ化された抗体及び抗体断片は、ＰＥＧ化されていない抗体及び抗体断片と比べて、増加した半減期を有する。ＰＥＧ化された抗体及び抗体断片は、単独で、一緒に、また他の医薬組成物と組み合わせて使用され得る。
本発明のさらに別の実施形態において、ＴＮＦα抗体又はその断片は、改変することが可能であり、この場合、非修飾抗体に比べて、定常領域を介した少なくとも１つの生物学的エフェクター機能を低下させるように抗体の定常領域が修飾される。抗体がＦｃ受容体への低下した結合を示すように、本発明の抗体を修飾するために、抗体の免疫グロブリン定常領域セグメントは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）相互作用に必要な領域において変異させることが可能である（例えば、Ｃａｎｆｉｅｌｄ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９９１）J.Ｅｘｐ．Ｍｅｄ.１７３：１４８３−１４９１；及びＬｕｎｄ ｅｔ ａｌ．（１４７）J.ｏｆＩｍｍｕｎｏｌ．１４７：２６５７−２６６２参照）。抗体のＦｃＲ結合能の減少は、オプソニン化及び貪食作用及び抗原依存性細胞毒性など、ＦｃＲ相互作用に依存するその他のエフェクター機能も低下させ得る。
本発明の抗体又は抗体部分は、別の機能的分子（例えば、別のペプチド又はタンパク質）へ誘導体化し、又は連結させることが可能である。従って、本発明の抗体及び抗体部分には、免疫接着分子など、本明細書に記載されているヒト抗ｈＴＮＦα抗体の誘導体化された形態及びその他修飾された形態が含まれるものとする。例えば、本発明の抗体又は抗体部分は、別の抗体（例えば、二重特異的抗体又はダイアボティ）、検出可能な因子、細胞毒性因子、薬剤及び／又は抗体若しくは抗体部分の、別の分子（ストレプトアビジンコア領域又はポリヒスチジンタグなど）との会合を媒介可能なタンパク質若しくはペプチドなどの１つ又はそれ以上の別の分子団へ、（化学的カップリング、遺伝的融合、非共有会合又はその他によって）機能的に連結することが可能である。
誘導体化された抗体の１つの種類は、（例えば、二重特異的抗体を作製するために、同一の種類の、又は異なる種類の）２つ又はそれ以上の抗体を架橋することによって作製される。
適切な架橋剤には、適切なスペーサー（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）によって隔てられた反応性が異なる２つの基を有するヘテロ二官能性又はホモ二官能性（例えば、ジスクシンイミジルスベラート）である架橋剤が含まれる。このようなリンカーは、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬから購入可能である。
本発明の抗体又は抗体部分を誘導体化し得る有用な検出可能因子には、蛍光化合物が含まれる。典型的な蛍光検出可能因子には、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリンなどが含まれる。抗体は、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどの検出可能な酵素でも誘導体化され得る。抗体が検出可能な酵素で誘導体化される場合には、検出可能な反応産物を生成させるために、本酵素が使用するさらなる試薬を添加することによって抗体が検出される。例えば、検出可能因子である西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合には、過酸化水素及びジアミノベンジジンの添加は、検出可能な発色した反応産物をもたらす。抗体は、ビオチンを用いて誘導体化し、アビジン又はストレプトアビジン結合の間接的な測定を通じて検出され得る。
本発明の抗体又は抗体部分は、宿主細胞中での、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子の組換え発現によって調製することが可能である。抗体を組換え的に発現させるために、軽鎖及び重鎖が宿主細胞中で発現されるように、及び、好ましくは、宿主細胞がその中で培養されている培地（抗体は、この培地から回収することが可能である。）中に分泌されるように、抗体の免疫グロブリン軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡ断片を担持する１つ又はそれ以上の組換え発現ベクターで、宿主細胞が形質移入される。抗体重鎖及び軽鎖遺伝子を取得し、これらの遺伝子を組換え発現ベクター中に組み込み、ベクターを宿主細胞中に導入させるために、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９），Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９）及びＢｏｓｓらによる米国特許第４，８１６，３９７号」に記載されているものなどの標準的な組換えＤＮＡ法が使用される。
アダリムマブ又はアダリムマブ関連抗体を発現させるために、まず、軽鎖及び重鎖可変領域をコードするＤＮＡ断片を取得する。これらのＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、生殖系列軽鎖及び重鎖可変配列の増殖及び修飾によって取得することが可能である。ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子に対する生殖系列ＤＮＡ配列は、本分野において公知である（例えば、「Ｖｂａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベースを参照されたい。Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）“Ｔｈｅ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｒｍｌｉｎｅ ＶＨ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｒｅｖｅａｌｓ ａｂｏｕｔ Ｆｉｆｔｙ Ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ＶＨ Ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ Ｌｏｏｐｓ” Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；ａｎｄ Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．（１９９４）“Ａ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ Ｖ７８ Ｓｅｇｍｅｎｔｓ Ｒｅｖｅａｌｓ ａ Ｓｔｒｏｎｇ Ｂｉａｓ ｉｎ ｔｈｅｉｒ Ｕｓａｇｅ” Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６も参照されたい。これらの各々の内容は、参照により、本明細書に明示的に組み込まれる。）。アダリムマブ又はアダリムマブ関連抗体の重鎖可変領域をコードするＤＮＡ断片を取得するために、ヒト生殖系列ＶＨ遺伝子のＶＨ３ファミリーのメンバーは、標準的なＰＣＲによって増幅される。最も好ましくは、ＤＰ−３１ＶＨ生殖系列配列が増幅される。アダリムマブ又はアダリムマブ関連抗体の軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ断片を取得するために、ヒト生殖系列ＶＬ遺伝子のＶκＩファミリーのメンバーは、標準的なＰＣＲによって増幅される。最も好ましくは、Ａ２０ＶＬ生殖系列配列が増幅される。ＤＰ−３１生殖系列ＶＨ及びＡ２０生殖系列ＶＬ配列を増幅する際に使用するのに適したＰＣＲプライマーは、標準的な方法を使用して、上に引用されている参考文献中に開示されているヌクレオチド配列に基づいて設計することが可能である。
生殖系列ＶＨ及びＶＬ断片が得られたら、これらの配列は、本明細書に開示されているアダリムマブ又はアダリムマブ関連アミノ酸配列をコードするように変異させることが可能である。生殖系列ＶＨ及びＶＬＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列は、まず、生殖系列とは異なるアダリムマブ又はアダリムマブ関連配列中のアミノ酸残基を同定するために、アダリムマブ又はアダリムマブ関連ＶＨ及びＶＬアミノ酸配列に対して比較される。次いで、生殖系列ＤＮＡ配列の適切なヌクレオチドは、変異された生殖系列配列がアダリムマブ又はアダリムマブ関連アミノ酸配列をコードするように、どのヌクレオチド変化を行うべきかを決定するために遺伝コードを用いて変異される。生殖系列配列の突然変異導入は、ＰＣＲを介した突然変異導入（ＰＣＲ産物が変異を含有するように、変異されたヌクレオチドがＰＣＲプライマー中に取り込まれる。）又は部位指定突然変異導入などの標準的な方法によって実施される。
（上述のように、生殖系列ＶＨ及びＶＬ遺伝子の増幅及び突然変異導入によって）アダリムマブ又はアダリムマブ関連ＶＨ及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が取得されたら、これらのＤＮＡ断片は、例えば、可変領域遺伝子を、完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子又はｓｃＦｖ遺伝子へ変換するために、標準的なＤＮＡ技術によってさらに操作することが可能である。これらの操作では、ＶＬ又はＶＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域又は柔軟なリンカーなど、別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片に作用可能に連結されている。本明細書において使用される「作用可能に連結された」という用語は、２つのＤＮＡ断片によってコードされたアミノ酸配列がインフレームの状態に保たれるように、２つのＤＮＡ断片が連結されることを意味するものとする。
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを重鎖定常領域をコードする別のＤＮＡ分子（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）に作用可能に連結することによって、完全長重鎖遺伝子へと変換することが可能である。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、本分野において公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって取得することが可能である。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域であり得るが、最も好ましくは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子の場合、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子へ作用可能に連結することが可能である。
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作用可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子（及びＦａｂ軽鎖遺伝子）へと変換することが可能である。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、本分野において公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって取得することが可能である。軽鎖定常領域は、κ又はλ定常領域とすることが可能であるが、最も好ましくは、κ定常領域である。
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶＨ及びＶＬ配列が連続する一本鎖タンパク質として発現可能であり、ＶＬ及びＶＨ領域が柔軟なリンカーによって連結されるように、ＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ断片は、柔軟なリンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする別の断片へ、作用可能に連結される（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４参照）。
本発明の抗体又は抗体部分を発現させるために、遺伝子が転写調節配列及び翻訳調節配列へ作用可能に連結されるように、部分又は完全長軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡ（上述のように得られる。）は発現ベクター中に挿入される。この文脈において、「作用可能に連結された」という用語は、ベクター内の転写調節配列及び翻訳調節配列が、抗体遺伝子の転写及び翻訳を制御するという所期の機能を果たすように、抗体遺伝子がベクター中に連結されていることを意味するものとする。発現ベクター及び発現調節配列は、使用される発現宿主細胞と適合的であるように選択される。抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、別個のベクター中に挿入することが可能であり、又は、より典型的には、両遺伝子は同一の発現ベクター中に挿入される。抗体遺伝子は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片及びベクター上の相補的制限部位の連結、又は制限部位が存在しなければ、平滑末端連結）によって発現ベクター中に挿入される。アダリムマブ又はアダリムマブ関連軽鎖又は重鎖配列の挿入の前に、発現ベクターは、既に、抗体定常領域配列を担持し得る。例えば、アダリムマブ又はアダリムマブ関連ＶＨ及びＶＬ配列を完全長抗体遺伝子へと変換するための１つのアプローチは、ＶＨセグメントが、ベクター内のＣＨセグメントへ、作用可能に連結され、及びＶＬセグメントが、ベクター内のＣＬセグメントへ、作用可能に連結されるように、それぞれ、既に重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をコードする発現ベクター中にそれらを挿入することである。これに加えて又はこれに代えて、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることが可能である。シグナルペプチドが、抗体鎖遺伝子のアミノ末端へ、インフレームに連結されるように、抗体鎖遺伝子はベクター中にクローニングすることが可能である。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種のシグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）とすることが可能である。
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中の抗体鎖遺伝子の発現を調節する制御配列を担持する。「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー及び抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を調節する他の発現調節要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むものとする。このような制御配列は、例えば、「Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）」に記載されている。制御配列の選択など、発現ベクターの設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現レベルなどの要因に依存し得ることが、当業者によって理解される。哺乳動物の宿主細胞発現のために好ましい制御配列には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））及びポリオーマなどに由来するプロモーター及び／又はエンハンサーなど、哺乳動物細胞中でタンパク質発現の高いレベルを誘導するウイルス要素が含まれる。ウイルス制御要素及びその配列のさらなる記述については、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉによる米国特許第５，１６８，０６２号、Ｂｅｌｌらによる米国特許４，５１０，２４５号及びＳｃｈａｆｆｎｅｒらによる米国特許第４，９６８，６１５号を参照されたい。
抗体鎖遺伝子及び制御配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中でのベクターの複製を制御する配列（例えば、複製起点）及び選択可能なマーカー遺伝子など、さらなる配列を担持し得る。選択可能なマーカー遺伝子は、その中にベクターが導入される宿主細胞の選択を容易にする（例えば、全てＡｘｅｌによる米国特許第４，３９９，２１６号、米国特許第４，６３４，６６５号及び米国特許第５，１７９，０１７号を参照されたい。）。例えば、典型的には、選択可能なマーカー遺伝子は、その中にベクターが導入される宿主細胞に対して、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択可能なマーカー遺伝子には、（メトトレキサート選択／増幅とともに、ｄｈｆｒ−宿主細胞中で使用するための）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）が含まれる。
軽鎖及び重鎖を発現させるために、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターは、標準的な技術によって、宿主細胞中に形質移入される。「形質移入」という用語の様々な形態は、原核又は真核宿主細胞中への外来ＤＮＡの導入のために一般に使用される多様な技術、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン形質移入などを包含するものとする。原核又は真核宿主細胞の何れの中でも、本発明の抗体を発現することは理論的に可能であるが、真核細胞、特に、哺乳動物細胞は、原核細胞に比べて、適切に折りたたまれ、免疫学的に活性な抗体を集合及び分泌する傾向がより大きいので、真核細胞中での抗体の発現、最も好ましくは哺乳動物宿主細胞中での抗体の発現が最も好ましい。抗体遺伝子の原核生物発現は、活性な抗体の高い収率の産生には有効でないことが報告されている（Ｂｏｓｓ ａｎｄ Ｗｏｏｄ（１９８５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ６：１２−１３）。
本発明の組換え抗体を発現するための好ましい哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）ＰＮＡＳＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０に記載されており、例えば、Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載されているようにＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに使用されるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む。）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞が含まれる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞中に導入されると、宿主細胞中で抗体の発現を可能とするのに十分な期間にわたって、又は、より好ましくは、宿主細胞がその中で増殖されている培地中への抗体の分泌を可能とするのに十分な期間にわたって、宿主細胞を培養することによって抗体が産生される。抗体は、タンパク質精製方法を用いて、培地から回収することが可能である。
Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖ分子など、完全な状態の抗体の部分を作製するために、宿主細胞を使用することも可能である。上記手技に対する改変は、本発明の範囲に属することが理解される。例えば、本発明の抗体の軽鎖又は重鎖の何れか（両鎖ではない。）をコードするＤＮＡで宿主細胞を形質移入することが望ましい場合があり得る。ｈＴＮＦαに結合するために必要でない軽鎖及び重鎖の一方又は両方をコードするＤＮＡの一部又は全部を除去するために、組換えＤＮＡ技術も使用し得る。このような末端切断されたＤＮＡ分子から発現された分子も、本発明の抗体によって包含される。さらに、１つの重鎖及び１つの軽鎖が本発明の抗体であり、他の重鎖及び軽鎖が、ｈＴＮＦα以外の抗原に対して特異的である二機能性抗体は、標準的な化学架橋法によって、本発明の抗体を第二の抗体に架橋することによって作製し得る。
本発明の抗体又はその抗原結合部分の組換え発現用の好ましいシステムでは、リン酸カルシウムによって媒介された形質移入によって、抗体重鎖及び抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターが、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞中に導入される。組換え発現ベクター内で、抗体重鎖及び軽鎖遺伝子は、遺伝子の転写の高いレベルを誘導するために、各々、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＰＬプロモーター制御要素へ作用可能に連結されている。組換え発現ベクターは、メトトレキサート選択／増幅を用いて、ベクターで形質移入されたＣＨＯ細胞の選択を可能とするＤＨＦＲ遺伝子も担持する。選択された形質転換体宿主細胞は、抗体重鎖及び軽鎖の発現を可能とするために培養され、完全な状態の抗体が培地から回収される。組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞を形質移入し、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、培地から抗体を回収するために、標準的な分子生物学的技術が使用される。
アダリムマブ若しくはその抗原結合部分又は本明細書に開示されているアダリムマブ関連抗体などの、本発明の組換えヒト抗体は、ヒトリンパ球から得られたｍＲＮＡから調製されたヒトＶＬ及びＶＨｃＤＮＡを用いて調製された組換えコンビナトリアル抗体ライブラリー、好ましくはｓｃＦｖファージディスプレイのスクリーニングによって単離することが可能である。このようなライブラリーを調製及びスクリーニングする方法は、本分野において公知である。ファージディスプレイライブラリーを作製するための市販のキット（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ，ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．２７−９４００−０１；及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＳｕｒｆＺＡＰＴＭ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｋｉｔ，ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．２４０６１２）の他に、抗体ディスプレイライブラリーを作製及びスクリーニングする上での使用に特に好ましい方法及び試薬の例は、例えば、Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．米国特許第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１８６１９；Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１７２７１；Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／２０７９１；Ｍａｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１５６７９；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／０１２８８；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０１０４７；Ｇａｒｒａｒｄ ｅｔ ａｌ ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０９６９０；Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ３：８１−８５；Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５−１２８１；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ １２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＪＭｏｌＢｉｏｌ２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＰＮＡＳ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ１９：４１３３−４１３７；及びＢａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）ＰＮＡＳ８８：７９７８−７９８２に見出される。
好ましい実施形態において、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍらのＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／０６２１３に記載されているエピトープインプリンティング法を用いて、ｈＴＮＦαに対して類似の結合活性を有するヒト重鎖及び軽鎖配列を選択するために、ｈＴＮＦαに対して高い親和性と低い解離速度定数を有するヒト抗体、ｈＴＮＦαに対して高い親和性及び低い解離速度定数を有するマウス抗ｈＴＮＦα抗体（例えば、ＭＡＫ１９５、寄託番号ＥＣＡＣＣ８７ ０５０８０１を有するハイブリドーマ）が、まず使用される。本方法で使用される抗体ライブラリーは、好ましくは、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらのＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０１０４７、「ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらのＮａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４」及び「Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓらの（１９９３）ＥＭＢＯＪ１２：７２５−７３４」に記載されているように、調製及びスクリーニングされたｓｃＦｖライブラリーである。ｓｃＦｖ抗体ライブラリーは、好ましくは、組換えヒトＴＮＦαを抗原として使用してスクリーニングされる。
最初のヒトＶＬ及びＶＨセグメントが選択されたら、好ましいＶＬ／ＶＨ対の組み合わせを選択するために、最初に選択されたＶＬ及びＶＨセグメントの異なる対をｈＴＮＦα結合についてスクリーニングする「ミックス＆マッチ」実験が行われる。さらに、ｈＴＮＦ結合に対する親和性をさらに向上させ、及び／又はｈＴＮＦ結合に対する解離速度定数をさらに低下させるために、天然の免疫応答内に抗体の親和性成熟のために必要とされるインビボ体細胞変異プロセスと類似のプロセスにおいて、好ましくはＶＨ及び／又はＶＬのＣＤＲ３領域内で、好ましいＶＬ／ＶＨ対のＶＬ及びＶＨセグメントをランダムに変異させることが可能である。このインビトロ親和性成熟は、それぞれ、ＶＨＣＤＲ３又はＶＬＣＤＲ３に対して相補的なＰＣＲプライマーを用いてＶＨ及びＶＬ領域を増幅することによって達成することが可能であり、得られるＰＣＲ産物が、ＶＨ及び／又はＶＬＣＤＲ３領域中にランダムな変異が導入されたＶＨ及びＶＬセグメントをコードするように、プライマーは、ある位置において、４つのヌクレオチド塩基のランダムな混合物で「スパイク」されている。これらのランダムに変異されたＶＨ及びＶＬセグメントは、ｈＴＮＦαへの結合に関して再スクリーニングすることが可能であり、ｈＴＮＦα結合に対して高い親和性と低い解離速度を示す配列を選択することが可能である。
組換え免疫グロブリンディスプレイライブラリーから得られた本発明の抗ｈＴＦＮα抗体のスクリーニング及び単離に続いて、選択された抗体をコードする核酸を、ディスプレイパッケージから（例えば、ファージゲノムから）回収し、標準的な組換えＤＮＡ技術によって、他の発現ベクター中にサブクローニングすることが可能である。所望であれば、本発明の他の抗体形態を作製するために、核酸にさらに操作（例えば、さらなる定常領域などの、さらなる免疫グロブリンドメインをコードする核酸への連結）を施すことが可能である。コンビナトリアルライブラリーのスクリーニングによって単離された組換えヒト抗体を発現させるために、上でさらに詳しく記載されているように、組換え発現ベクター中に、抗体をコードするＤＮＡをクローニングし、哺乳動物宿主細胞中に導入される。
ｈＴＮＦαに対して高い親和性と低い解離速度定数を有するヒト抗体を単離する方法は、米国特許第６，０９０，３８２号、同第６，２５８，５６２号及び同第６，５０９，０１５号にも記載されており、これらの各々は、参照により、本明細書に組み込まれる。
ＩＩＩ．抗体の精製
本発明は、抗体及び少なくとも１つのＨＣＰを含む混合物からＨＣＰが減少した抗体調製物を作製するための方法を提供する。本発明は、抗体及び少なくとも１つのプロカテプシンＬを含む混合物からプロカテプシンＬが減少した抗体調製物を作製するための方法も提供する。本発明の精製方法は、第ＩＩ節に記載されている方法及び本分野における慣用方法を用いて抗体が作製された時点で、分離工程において開始する。典型的には、本分野において、抗体はプロテインＡに結合するのに対して、ＨＣＰは流出するので、抗体−ＨＣＰ混合物は、最初の精製工程として、プロテインＡ捕捉（例えば、プロテインＡカラム）に供される。本発明の精製方法は、最初の工程として、又は精製方法中の何れかの工程として、抗体及び少なくとも１つのＨＣＰを含む混合物をプロテインＡ捕捉（例えば、プロテインＡカラム）に供することが必要でないという利点を有する。
抗体を含む清澄化された溶液又は混合物が得られたら、細胞によって産生された他のタンパク質（ＨＣＰなど）からのタンパク質の分離が、イオン交換分離工程及び疎水性相互作用分離工程を含む異なる精製技術の組み合わせを用いて実施される。分離工程は、タンパク質の電荷、疎水性の程度及び／又はサイズに基づいて、タンパク質の混合物を分離する。本発明の一実施形態において、分離は陽イオン、陰イオン及び疎水性を含むクロマトグラフィーを用いて行われる。これらの各技術に対して、幾つかの異なるクロマトグラフィー樹脂が利用可能であり、関与する具体的なタンパク質に適合するように精製スキームを正確に調整することが可能である。各分離方法の本質は、長いカラムに異なる速度でタンパク質を移動させ、カラムをさらに通過するにつれて増加する物理的な分離を達成させることが可能であること、又は分離媒体に選択的に付着させた後、異なる溶媒によってタンパク質を分別的に溶出させることが可能であることである。幾つかの事例では、抗体は、不純物がカラムへ特異的に接着し、抗体が接着しない場合には、抗体は不純物から分離される。すなわち、抗体は貫流中に存在する。
望ましくないタンパク質から抗体を精製する方法は、以下に記載されている（例えば、プロセスＡ）。一実施形態において、本発明は、プロセスＡにおいて以下に記載されている工程を個別的に又は組み合わせて含む。プロセスＡは、イオン交換分離（陽イオン交換クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィー）及び疎水性相互作用分離を用いて、医薬組成物中での使用に適した抗体調製物を得る、抗体を含む混合物を精製する方法を提供する。プロセスＡは、抗体精製における最初の工程として、プロテインＡ捕捉を行う必要なしに実施できるという利点を有する。一実施形態において、プロセスＡを用いて精製された抗体はアダリムマブである。プロセスＡは、一般的には、以下のものを含む。
抗体及び不純物（例えば、ＨＣＰ）を含む混合物は、陽イオン交換カラムなどのイオン交換カラム上に装填される。混合物は、約３０ｇ以下の抗体／Ｌ／サイクルの装填量で装填され得る。陽イオンカラム上に装填された混合物は、続いて、洗浄緩衝液（平衡化緩衝液）を用いて洗浄される。次いで、抗体をカラムから溶出し、第一の溶出液を得る。
次いで、第一の溶出液は、多くの場合、陰イオン交換クロマトグラフィーに備えて、ウイルス的に不活化され、及びｐＨ調整される。第一の溶出液は、溶出緩衝液に比べてｐＨを低ｐＨになるように調整することによって、ウイルス的に不活化される（節ＩＩＩＣにさらに記載されている。）。ウイルス的に不活化された溶出液のｐＨは、続いて、２以上の工程において、約７．６の最終ｐＨになるように調整され、これは、その後続いて行われる陰イオン交換カラムのｐＨである。
ウイルス不活化に続いて、第一の溶出液は、しばしば、第二のイオン交換分離工程に供せられ、本工程では、第一の溶出液は陰イオン交換カラム（例えば、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅカラム）上に装填される。カラムは洗浄緩衝液で洗浄され、抗体を含む第一の貫流が得られる。
貫流は、貫流を疎水性相互作用カラム（フェニルセファロース）上に装填することによってさらに精製される。カラムを洗浄し、第二の溶出液が得られるように、抗体をカラムから溶出させる。
プロセスＢが以下に記載されており、抗体を含む混合物から、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）が減少した抗体調製物を作製する改良された方法を提供する。ＨＣＰ又はプロカテプシンＬに対して言及する場合の「減少した」という用語には、プロセスＡ中の同等の地点において、ＨＣＰ又はプロカテプシンＬのレベル（例えば、濃度又は活性）が向上していることを含む。一実施形態において、プロセスＢの第一の溶出液は、プロセスＡの第一の溶出液に比べて、ＨＣＰ又はプロカテプシンＬの減少したレベルを含む。一実施形態において、プロセスＢの第一の貫流は、プロセスＡの第一の貫流に比べて、ＨＣＰ又はプロカテプシンＬの減少したレベルを含む。一実施形態において、プロセスＢの第二の溶出液は、プロセスＡの第二の溶出液に比べて、ＨＣＰ又はプロカテプシンＬの減少したレベルを含む。別の実施形態において、プロセスＢから得られた抗体調製物は、プロセスＡから得られた抗体調製物に比べて、ＨＣＰ又はプロカテプシンＬの減少したレベルを含む。
プロセスＢは、一般的には、以下のものを含む。
抗体及び不純物（例えば、ＨＣＰ）を含む混合物は、陽イオン交換カラムなどのイオン交換カラム上に装填される。混合物は、ｐＨ７において、約３５ｇ以下の抗体／Ｌ／サイクルの装填量で、又はｐＨ５において、約７０ｇ以下の抗体／Ｌ／サイクルの装填量で装填され得る。陽イオンカラム上に装填された混合物は、続いて、洗浄緩衝液（平衡化緩衝液）を用いて洗浄される。平衡化洗浄緩衝液に続いて、中間洗浄工程が行われ、本工程において、溶出緩衝液と類似の伝導度を有する中間緩衝液でカラムが洗浄される。この中間洗浄工程は、プロセスに関連する不純物の除去を改善する。次いで、溶出緩衝液を用いて抗体をカラムから溶出し、第一の溶出液を得る。
次いで、第一の溶出液は、陰イオン交換クロマトグラフィーに備えて、ウイルス的に不活化され、及びｐＨ調整される。第一の溶出液は、溶出緩衝液に比べてｐＨを低ｐＨになるように調整することによって、ウイルス的に不活化される。ウイルス的に不活化された溶出液のｐＨ及び伝導度は、続いて、１つの工程において、約７．８から８．２の最終ｐＨになるように調整され、これは、その後続いて行われる平衡化された陰イオン交換カラムのｐＨである。
ウイルス不活化に続いて、第一の溶出液は、第二のイオン交換分離工程に供せられ、本工程では、第一の溶出液は陰イオン交換カラム（例えば、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅカラム）上に装填される。カラムは洗浄緩衝液で洗浄され、抗体を含む第一の貫流が得られる。
貫流は、貫流を疎水性相互作用カラム（フェニルセファロース）上に装填することによってさらに精製される。カラムを洗浄し、第二の溶出液が得られるように、抗体をカラムから溶出させる。プロセスＢの結果は、減少したＨＣＰ（プロカテプシンＬなど）を有する調製物である。プロセスＢのさらなる結果には、ＨＣＰの排除をプロセスの先頭部分に移動させることによる、プロセスのボトルネックの除去（例えば、細胞培養のスケールアップにおいてもたらされるより高い生産性）及び抗体収率の全体的な向上が含まれる。本発明の改善されたプロセスに関するさらなる詳細は、以下に提供されている。
ＩＩＩ．Ａ．イオン交換分離
本発明は、抗体を含む第一の溶出液が得られるように、抗体及び少なくとも１つのＨＣＰを含む混合物を少なくとも１つのイオン交換分離工程に供することによって、混合物からＨＣＰが減少した抗体調製物を作製するための方法を特徴とする。イオン交換分離には、２つの物質が、それらの各イオン電荷の差に基づいて分離されるあらゆる方法が含まれる。
分離を実施する際には、抗体混合物は、例えば、バッチ精製技術又はクロマトグラフィーを用いて、イオン交換物質と接触され得る。例えば、バッチ精製のために、イオン交換物質は、所望の初発緩衝液中で調製され、又は所望の初発緩衝液に対して平衡化される。イオン交換物質のスラリーが得られる。分離されるべき抗体をイオン交換物質に吸着させるために、抗体溶液をスラリーと接触させる。イオン交換物質に結合しないＨＣＰを含む溶液は、例えば、スラリーを沈降させ、上清を除去することによって、スラリーから分離される。スラリーは、１つ又はそれ以上の洗浄工程に供することが可能である。所望であれば、スラリーは、イオン交換物質に結合されたＨＣＰを脱離させるために、より高い伝導度の溶液と接触させることができる。結合されたポリペプチドを溶出するために、塩濃度を増加させ得る。
イオン交換クロマトグラフィーは、イオン交換分離技術としても使用され得る。イオン交換クロマトグラフィーは、分子の総電荷間の差に基づいて分子を分離する。抗体の精製に関して、抗体は、結合のために、イオン交換物質（例えば、樹脂）に付着された官能基の電荷とは反対の電荷を有さなければならない。例えば、一般に、そのｐＩを下回る緩衝液ｐＨ中で正味の正電荷を有する抗体は、負に帯電した官能基を含有する陽イオン交換物質に良好に結合する。
イオン交換クロマトグラフィーにおいて、溶質の表面上の帯電した区画は、周囲の緩衝液のイオン強度が低ければ、クロマトグラフィーマトリックスに付着された反対電荷によって引き付けられる。溶出は、一般に、イオン交換マトリックスの帯電した部位に関して溶質と競合する緩衝液のイオン強度（すなわち、伝導度）を増加させることによって達成される。ｐＨを変化させること、及び、これにより、溶質の電荷を変化させることは、溶質の溶出を達成するための別の方法である。伝導度又はｐＨの変化は、漸次（グラジエント溶出）又は段階的（段階溶出）であり得る。
陰イオン又は陽イオン置換基は、クロマトグラフィーに対する陰イオン性又は陽イオン性支持体を形成するために、マトリックスに付着され得る。陰イオン交換置換基には、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、四級アミノエチル（ＱＡＥ）及び四級アミン（Ｑ）基が含まれる。陽イオン置換基には、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、ホスファート（Ｐ）及びスルホナート（Ｓ）が含まれる。ＤＥ２３、ＤＥ３２、ＤＥ５２、ＣＭ−２３、ＣＭ−３２及びＣＭ−５２などのセルロースイオン交換樹脂は、Ｗｈａｔｍａｎ Ｌｔｄ．Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ，Ｋｅｎｔ、Ｕ．Ｋ．から入手することができる。ＳＥＰＨＡＤＥＸ（Ｒ）をベースとする架橋されたイオン交換体も公知である。例えば、ＤＥＡＥ−、ＱＡＥ−、ＣＭ−及びＳＰ−ＳＥＰＨＡＤＥＸ（Ｒ）及びＤＥＡＥ−、Ｑ−、ＣＭ−及びＳ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）及びＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）ＦａｓｔＦｌｏｗは全て、ＰｈａｒｍａｃｉａＡＢから入手可能である。さらに、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＤＥＡＥ−６５０Ｓ又はＭ及びＴＯＹＯＰＥＡＲＬＣＭ−６５０Ｓ又はＭなどのＤＥＡＥ及びＣＭによって誘導体化されたエチレングリコール−メタクリラート共重合体は、ＴｏｓｏＨａａｓＣｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａから入手可能である。
本発明の一実施形態において、抗体及び少なくとも１つのＨＣＰを含む混合物は、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーカラム上に装填される。混合物は、カラムを平衡化させるために使用される平衡化緩衝液と同一であり得る装填緩衝液中のＣＥＸカラム上に装填される。ＨＣＰを含む混合物がＣＥＸカラム上を通過するにつれて、標的タンパク質はＣＥＸ樹脂に吸着され、様々なＨＣＰ（宿主細胞タンパク質（標的タンパク質が組み換え宿主細胞中で産生される場合）又はプロセスに由来するその他の不純物）は流出し、又はＣＥＸ樹脂に弱く若しくは非特異的に結合する。様々な実施形態において、ＣＥＸ樹脂は、スルホナート基に付着された、合成メタクリラートをベースとしたポリマー性樹脂（ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳＯ３（ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳ））である。一実施形態において、平衡化緩衝液は、２０ｍＭＮａ２ＰＯ４、２５ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．８を含む。他の適切な平衡化緩衝液は、５．０から９．０のｐＨで、例えば、生理的濃度、例えば、約０．５ｍＭと約１００ｍＭの間の範囲の濃度（例えば、１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭなど）及び生理的塩濃度（例えば、約０．１５ｍＭＮａＣｌ）でＢＩＳ及びＨＥＰＥＳを含む。
典型的な実施形態において、ＣＥＸクロマトグラフィーはＦｒａｃｔｏｇｅｌＳカラムである。一実施形態において、約３０グラム（ｇ）抗体／リットル（Ｌ）樹脂から約４０ｇ抗体／リットル樹脂が、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳカラム条に装填される。別の実施形態において、約３５ｇ抗体／リットル樹脂が、ｐＨ７でＦｒａｃｔｏｇｅｌＳカラム上に装填される。ｐＨ７での約３５ｇ抗体／リットル樹脂の装填量は、不純物（例えば、ＨＣＰ及びプロカテプシンＬ）の排除を増大させることが発見された。本発明の方法において使用されるべきＦｒａｃｔｏｇｅｌＳカラムの許容される稼動域は、以下の表１に記載されている。
Figure 0006367277
さらに、ｐＨ５でクロマトグラフィーを実施することによって、カラムの装填能力を増大させることが可能であることが発見された。特に、ｐＨ５での約７０ｇ抗体／リットル樹脂の装填量は、不純物（例えば、ＨＣＰ及びプロカテプシンＬ）の排除を増大させることが発見された。従って、約ｐＨ５から約ｐＨ７のｐＨ範囲では、約３５ｇから約７０ｇ抗体／リットル樹脂の装填量を使用することができる。
カラム上への抗体混合物の装填後、次いで、洗浄緩衝液でＣＥＸ樹脂を洗浄する。特に、異なる洗浄緩衝液での複数の洗浄工程が、さらにＨＣＰが減少した抗体調製物をもたらすことが発見された。具体的には、それぞれ、洗浄緩衝液及び中間洗浄緩衝液を用いる、第一の洗浄工程及び中間洗浄工程の使用によって、プロカテプシンＬのレベルを減少させ得ることが発見された。一実施形態において、まず、平衡化緩衝液と同一の洗浄緩衝液でＣＥＸ樹脂を洗浄する。ある種の実施形態において、洗浄緩衝液は、２０ｍＭＮａ２ＰＯ４、２５ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．８である。他の適切な洗浄緩衝液は、５．０から９．０のｐＨで、例えば、生理的濃度、例えば、約０．５ｍＭと約１００ｍＭの間の範囲の濃度（例えば、１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭなど）及び生理的塩濃度（例えば、約０．１５ｍＭＮａＣｌ）でＢＩＳ及びＨＥＰＥＳを含む。
本発明の好ましい実施形態において、中間洗浄工程が行われる。ＣＥＸ溶出緩衝液と同一の緩衝液を一部含む中間洗浄緩衝液を使用することによって、ＨＣＰ全般、特にプロカテプシンＬの減少したレベルを達成できることが発見された。ＨＣＰ全般及び特に、プロカテプシンＬの改善された低下は、１つには、中間洗浄緩衝液の増加した伝導度からもたらされる。中間洗浄緩衝液の伝導度を増加させることによって、ＨＣＰの電荷が除去され、これは、抗体のｐＩと比べてより低いｐＩを有するので、より弱く結合するＨＣＰをカラムから洗浄させる。より弱い結合の不純物、例えば、プロカテプシンＬなどのＨＣＰの増加した除去率が、次いで、標的物質、例えば抗体に対するより大きな結合領域を与える。他の実施形態において、中間洗浄緩衝液は、約４０％から約５０％の溶出緩衝液及び約５０％から約６０％の注射用水を含有する。さらなる実施形態において、中間洗浄緩衝液は４５％溶出液及び５５％注射用水を含有する。一実施形態において、使用される洗浄緩衝液は、２０ｍＭＮａ２ＰＯ４、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７である。
複数の洗浄の後、ＨＣＰの減少したレベルを有する第一の溶出液が得られるように、第一の陽イオン交換物質から抗体を溶出する。第一の溶出液は、中間洗浄工程に照らして、プロカテプシンＬの減少したレベルも有する。一実施形態において、本発明の方法を用いて得られた第一の溶出液は、プロセスＡの同等の工程と比べて、ＨＣＰレベルの約３から約５倍の減少を含む。別の実施形態において、本発明の方法を用いて得られた第一の溶出液は、プロセスＡの同等の工程と比べて、カテプシンＬ活性の約２から約３倍の減少を含む。一実施形態において、第一の溶出液は、ＨＣＰＥＬＩＳＡによって測定された場合に、混合物より約９０から約１００倍の範囲少ないＨＣＰを含む。別の実施形態において、第一の溶出液は、カテプシンＬ速度論アッセイによって測定された場合に、約２５から約６０ＲＦＵ／秒／ｍｇ抗体の範囲のカテプシンＬ活性を含む。
好ましい実施形態において、抗体を含む最初の溶出液は第二のＩＥ物質上を通過し、ＨＣＰのさらに減少したレベルを含む貫流が得られる。幾つかの実施形態において、第二のＩＥ工程は、下記のようにバッチ精製であり得る。他の実施形態において、第二のＩＥ工程は、第二のイオン交換クロマトグラフィー上に第一の溶出液を装填すること、カラムを洗浄すること及び第一の貫流を取得することを含む。第二のＩＥ物質が、陰イオン交換（ＡＥＸ）樹脂、例えば、Ｑセファロースカラムであり得る。幾つかの実施形態において、抗体約３０グラムｇ／樹脂１リットルから抗体約４０ｇ／樹脂１リットルが、陰イオン交換カラム上に装填される。抗体約４０ｇ／樹脂１リットルと抗体約５０ｇ／樹脂１リットルの間の装填量に増加させることにより、不純物、例えば、ＨＣＰの排除率の減少をもたらす。ＨＣＰを含む混合物がＡＥＸカラム上を通過するにつれて、様々なＨＣＰがＡＥＸ樹脂に結合し、抗体はＡＥＸ樹脂を通過し、又はＡＥＸ樹脂へ非特異的に結合する。ある種の実施形態において、陰イオン交換樹脂はＱＳｅｐｈａｒｏｓｅである。
しばしば、精製されるべき抗体混合物は、先行の精製工程由来の緩衝液中に存在する。多くの緩衝液を利用することが可能であり、定型的な実験操作によって選択することができる。例えば、２５ｍＭトロラミン、４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８の平衡化緩衝液を使用し得る。一実施形態において、第二のＥＢ物質上に最初の溶出液を通過させる前に、第二のＩＥ物質を平衡化緩衝液で平衡化させ得る。これは、例えば、第一の溶出液のｐＨ及び伝導度が平衡化された第二のＩＥ物質のｐＨ及び伝導度と実質的に同様であり、又は平衡化された第二のＩＥ物質のｐＨ及び伝導度に対応するように、第一の溶出液のｐＨ及び伝導度を変化させることによって、すなわち、第一の溶出液のｐＨ及び伝導度が平衡化された第二のイオン交換物質のｐＨ及び伝導度と対応するように、第一の溶出液のｐＨ及び伝導度を変化させることによって行い得る。幾つかの実施形態において、ＡＥＸ物質（例えば、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ）のｐＨは、約７．７から約８．３の範囲になるように、平衡化緩衝液で調整される。さらなる実施形態において、ＣＥＸ溶出液（例えば、最初の溶出液）のｐＨは、約７．７から約８．３の範囲になるように調整される。ある種の実施形態において、ＡＥＸ物質及び最初の溶出液の両者のｐＨは約８である。幾つかの実施形態において、ＡＥＸ物質の伝導度は約３．５ｍＳ／ｃｍから約４．９ｍＳ／ｃｍの範囲である。さらなる実施形態において、最初の溶出液の伝導度は約３．５ｍＳ／ｃｍから約４．９ｍＳ／ｃｍの範囲である。第二のイオン交換物質の伝導度及びｐＨに、装填伝導度及びｐＨを調整することは、不純物の排除率を増大させることが発見された。プロセスＡに関連して、第一の溶出液及び／又は平衡化された第二のイオン交換物質の伝導度の全体的な減少及び／又はｐＨの増加は増加したＨＣＰ排除率をもたらすことが発見された。
カラム上への抗体混合物の装填後、次いで、洗浄緩衝液でＡＥＸ樹脂を洗浄する。洗浄緩衝液は、平衡化緩衝液と同一であり得、例えば、２５ｍＭトロラミン、４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８であり得る。一実施形態において、抗体を含む及びＨＣＰの減少したレベルを有する第一の貫流が得られるように、貫流とともに洗浄物がプールされ得る。さらなる実施形態において、第一の貫流はプロカテプシンＬの減少したレベルを有する。一実施形態において、本発明の方法を用いて得られた第一の貫流は、プロセスＡの同等の工程と比べて、ＨＣＰレベルの約７から約７００倍の減少を含む。別の実施形態において、本発明の方法を用いて得られた第一の貫流は、プロセスＡの同等の工程と比べて、カテプシンＬ活性の約６から約２５倍の減少を含む。別の実施形態において、第一の貫流は、ＨＣＰＥＬＩＳＡによって測定された場合に、第一の溶出液より約８４０から約８５０倍の範囲少ないＨＣＰを含む。さらに別の実施形態において、第一の貫流は、カテプシンＬ速度論アッセイによって測定された場合に、約０．４から約４ＲＦＵ／秒／ｍｇ抗体の範囲のカテプシンＬ活性を含む。
本発明の方法において使用されるべきＱセファロースクロマトグラフィーの許容される稼動域は、以下の表２に記載されている。
Figure 0006367277
陰イオン交換物質と比較した陽イオン交換物質の使用は、上述のように、タンパク質の総電荷に基づいている。したがって、陽イオン交換物質の使用前に、陰イオン交換物質を使用することが本発明の範囲に属する。さらに、陽イオン交換物質のみ又は陰イオン交換物質のみを使用することが本発明の範囲に属する。
本発明の方法は、場合によって、さらなる精製工程を含むことができる。イオン交換クロマトグラフィー法の前、最中又は後に実施され得るさらなる精製操作の例には、疎水性相互作用クロマトグラフィー上（例えば、フェニルセファロース上）での分画、エタノール沈殿、等電点電気泳動、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でクロマトグラフィー、ヘパリンセファロース上でのクロマトグラフィー、さらなる陰イオン交換クロマトグラフィー及び／又はさらなる陽イオン交換クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫安沈殿、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析及び（プロテインＡ，プロテインＧ、抗体、特異的基質、リガンド又は抗原を捕捉試薬として使用する。）アフィニティークロマトグラフィーが含まれる。
ＩＩＩ．Ｂ．疎水性相互作用分離
本発明は、抗体及び少なくとも１つのＨＣＰを含む混合物からＨＣＰが減少した抗体調製物を作製するための方法であり、ＨＣＰの低下したレベルを有する第二の溶出液が得られるように、第一の疎水性相互作用材料に第一の貫流が供される、疎水性相互作用分離工程をさらに含む、方法に関する。
分離を実施する際には、ポリペプチド混合物は、例えば、バッチ精製技術を用いて又はカラムを用いて、ＨＩＣ物質と接触され得る。ＨＩＣ精製の前に、例えば、混合物をプレカラムに通すことによって、一切のカオトロピック因子又は極めて疎水性の高い物質を除去することが望ましい場合があり得る。
例えば、バッチ精製のために、ＨＩＣ物質は、所望の平衡化緩衝液中で調製され、又は所望の平衡化緩衝液に対して平衡化される。ＨＩＣ物質のスラリーが得られる。分離されるべき抗体をＨＩＣ物質に吸着させるために、抗体溶液をスラリーと接触させる。ＨＩＣ物質に結合しないＨＣＰを含む溶液は、例えば、スラリーを沈降させ、上清を除去することによって、スラリーから分離される。スラリーは、１つ又はそれ以上の洗浄工程に供することが可能である。所望であれば、スラリーは、ＨＩＣ物質に結合された抗体を脱離させるために、より低い伝導度の溶液と接触させることができる。結合された抗体を溶出するために、塩濃度を減少させ得る。
他の実施形態において、疎水性相互作用分離工程は、第一の疎水性相互作用材料を含むカラム上に第一の貫流を装填すること、及び、第二の溶出液が得られるように、第一の疎水性相互作用材料を洗浄することを含む。
疎水性相互作用分離工程は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程を含み得る。イオン交換クロマトグラフィーは、タンパク質（例えば、抗体）を単離するために、タンパク質の電荷に依拠しているのに対して、疎水性相互作用クロマトグラフィーは、幾つかのタンパク質（例えば、抗体）の疎水的特性を使用している。抗体上の疎水性基は、カラム上の親水性基に結合する。タンパク質がより疎水性になるほど、タンパク質はより強固にカラムへ結合する。ＨＩＣ工程は、例えば、宿主細胞由来の不純物（例えば、ＤＮＡ並びに産物に関連するその他の高分子量及び低分子量種）を除去する。
疎水性相互作用は高いイオン強度において最強であり、したがって、分離のこの形態は、塩析又はイオン交換操作の後に、都合よく実施される。ＨＩＣカラムへの抗体の吸着は、高い塩濃度によって好まれるが、実際の濃度は、抗体の性質及び選択される具体的なＨＩＣリガンドに応じて、幅広い範囲にわたって変動することが可能である。様々なイオンが疎水的相互作用（塩析効果）を促進し、又は水の構造を破壊し（カオトロピック効果）、及び疎水性相互作用の弱化をもたらすかどうかに応じて、いわゆる疎溶解性（ｓｏｌｕｐｈｏｂｉｃ）系列で、様々なイオンを配置することができる。陽イオンは、増加する塩析効果の観点で、Ｂａ＋＋＜；Ｃａ＋＋＜；Ｍｇ＋＋＜；Ｌｉ＋＜；Ｃｓ＋＜；Ｎａ＋＜；Ｋ＋＜；Ｒｂ＋＜；ＮＨ４ ＋の順に配置されるのに対して、陰イオンは、増加するカオトロピック効果の観点で、ＰＯ−−−＜；ＳＯ４ −−＜；ＣＨ３ＣＯＯＯ−＜；Ｃｌ−＜；Ｂｒ−＜；ＮＯ３ −＜；ＣｌＯ４ −＜；Ｉ−＜；ＳＣＮ−の順に配置され得る。
一般に、硫酸Ｎａ、Ｋ又はＮＨ４は、ＨＩＣ中のリガンド−タンパク質相互作用を効果的に促進する。以下の関係：（ＮＨ４）２ＳＯ４＞；Ｎａ２ＳＯ４＞；ＮａＣｌ＞；ＮＨ４Ｃｌ＞；ＮａＢｒ＞；ＮａＳＣＮによって与えられるように、相互作用の強度に影響を与える塩を調合し得る。一般に、約０．７５と約２Ｍの間の硫酸アンモニウム又は約１Ｍと４ＭＮａＣｌの間の塩濃度が有用である。
ＨＩＣカラムは、通常、疎水性リガンド（例えば、アルキル又はアリール基）が結合されている基礎マトリックス（例えば、架橋されたアガロース又は合成共重合体物質）を含む。好ましいＨＩＣカラムは、フェニル基で置換されたアガロース樹脂（例えば、ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭカラム）を含む。多くのＨＩＣカラムが市販されている。例には、低い置換又は高い置換を有するＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓＴＭ６ ＦａｓｔＦｌｏｗカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）；Ｐｈｅｎｙｌ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭＨｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）；Ｏｃｔｙｌ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭＨｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）；ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＥＭＤ Ｐｒｏｐｙｌ又はＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＥＭＤＰｈｅｎｙｌカラム（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；Ｍａｃｒｏ−ＰｒｅｐＴＭＭｅｈｙｌ又はＭａｃｒｏ−ＰｒｅｐＴＭｔ−Ｂｕｔｙｌ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；ＷＰＨＩ−Ｐｒｏｐｙｌ（Ｃ３）ＴＭカラム（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）；及びＴｏｙｏｐｅａｒｌＴＭエーテル、フェニル又はブチルカラム（ＴｏｓｏＨａａｓ，ＰＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
何れかの予備的精製工程の後に、目的の抗体及びＨＣＰを含む混合物をＨＩＣに供し得る。しばしば、精製されるべき抗体組成物は、先行する精製工程由来の緩衝液中に存在する。しかしながら、ＨＩＣ工程前に、緩衝液を抗体組成物に添加することが必要であり得る。多くの緩衝液を利用することが可能であり、定型的な実験操作によって選択することができる。一実施形態において、装填緩衝液中の精製されるべき抗体及び少なくとも１つのＨＣＰを含む混合物のｐＨは、最初のｐＨに応じて、酸又は塩基の何れかを用いて、約７のｐＨ、及び約１３６から約１５８ｍＳ／ｃｍの伝導度になるように調整される。一実施形態において、抗体混合物は、４０ｍＭリン酸ナトリウム、２．２Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７を含む緩衝液で希釈される。
抗体混合物を装填する前に、カラムは、平衡化緩衝液で平衡化され得る。幾つかの実施形態において、平衡化緩衝液は、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１．１Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７である。
一実施形態において、混合物（例えば、抗体を含む第一の貫流）は、フェニルセファロースＨＩＣカラム上に装填される。ある種の実施形態において、この工程に対するタンパク質装填量は、タンパク質約２０と約４０ｇ／樹脂１リットルの間の範囲である。別の実施形態において、この工程に対するタンパク質装填量は、タンパク質約３５ｇ／樹脂１リットルである。幾つかの実施形態において、利用可能な物質の総量を処理するために、２つ又は３つのクロマトグラフィーサイクルが必要とされ得る。
疎水性相互作用カラムへのタンパク質の結合後に、カラムは、平衡化緩衝液と同一であり得る洗浄緩衝液、例えば、１．１Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７で洗浄され得る。
第二の溶出液が得られるように、溶出緩衝液を用いて抗体をカラムから溶出する。溶出緩衝液は、定型的な実験操作を用いて選択することが可能である。溶出緩衝液のｐＨは、約６と約８の間の範囲にあり、低い硫酸アンモニウム濃度を有する（すなわち、約１Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４未満）を有する。溶出緩衝液の伝導度は、約８７から約１０１ｍＳ／ｃｍの範囲である。一実施形態において、溶出緩衝液は、１１ｍＭリン酸ナトリウム、０．６２５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７を含有する。より低い塩濃度は、樹脂へのより低いアダリムマブの結合をもたらすことが発見された。ＨＣＰの減少したレベルを有する第二の溶出液が得られるように、第二のイオン交換物質から抗体を溶出する。第二の溶出液は、プロカテプシンＬの減少したレベルも有する。一実施形態において、本発明の方法を用いて得られた第二は、プロセスＡの同等の工程と比べて、ＨＣＰレベルの約１０から約９６倍の減少を含む。別の実施形態において、本発明の方法を用いて得られた第二の溶出液は、プロセスＡの同等の工程と比べて、カテプシンＬ活性の約５から約１５倍の減少を含む。一実施形態において、第二の溶出液は、ＨＣＰＥＬＩＳＡによって測定された場合に、第一の貫流より約３から約５倍の範囲少ないＨＣＰを含む。別の実施形態において、第二の溶出液は、カテプシンＬ速度論アッセイによって測定された場合に、約０．５から約１．５ＲＦＵ／秒／ｍｇ抗体の範囲のカテプシンＬ活性を含む。
本発明の方法において使用されるフェニルセファロースクロマトグラフィーカラムの許容される稼動域は、以下の表３に示されている。
Figure 0006367277
さらなる精製工程には、本明細書に記載されているような、ウイルス除去工程並びにナノろ過、限外ろ過及び／又は透析ろ過工程が含まれ得る。
ＩＩＩ．Ｃ．ウイルスの不活化
安全域を与えるために、検出されなかった可能性があるウイルスは、精製工程の間に不活化される。ウイルスの不活化法は本分野において公知であり、熱不活化（低温殺菌）、ｐＨ不活化、溶媒／界面活性剤処理、ＵＶ及びγ線照射並びにβ−プロピオラクトン又は、例えば、米国特許第４，５３４，９７２に記載されているような銅フェナントロリンなどのある種の化学的不活化剤の添加が含まれる。幾つかの実施形態において、混合物をウイルス不活化に供することには、ｐＨウイルス不活化が含まれ得る。ｐＨウイルス不活化技術の方法も、本分野において周知である。例えば、ウイルス不活化の典型的な方法には、低ｐＨで、一定の時間にわたって混合物を温置し、続いて、ｐＨを中和し、ろ過によって粒状物を除去することが含まれる。ｐＨレベルの選択は、概ね、抗体産物及び緩衝液成分の安定性特性に依存する。低ｐＨウイルス不活化中の標的抗体の品質は、ｐＨ及び低ｐＨでの温置時間によって影響を受けることが知られている。ウイルス不活化は、高い濃度において不活化を低下させ得るタンパク質濃度の他に、これらの同じパラメータに依存する。従って、タンパク質濃度、ｐＨ及び不活化の期間の適切なパラメータは、定型的な実験操作によって選択され得る。
混合物のｐＨは、クエン酸、酢酸、カプリル酸又はその他の適切な酸を含む（但し、これらに限定されない。）あらゆる適切な酸によって低下させ得る。好ましい実施形態において、混合物のｐＨは、１Ｍクエン酸で調整される。
幾つかの実施形態において、混合物は、約２．９から約３．９のｐＨで、約１５分から約１８０分にわたって温置される。さらなる実施形態において、混合物は、約３．５のｐＨで、約６０分から約１２０分にわたって温置される。さらなる実施形態において、混合物は、約３．５のｐＨで、約６０分から約１８０分にわたって温置される。
一実施形態において、抗体及びＨＣＰを含む混合物が、イオン交換分離の前に、ウイルスの不活化に供せられる。他の実施形態において、最初の溶出液が、イオン交換分離の前に、ウイルスの不活化に供せられる。ある種の実施形態において、最初の溶出液が、陰イオン交換クロマトグラフィーの前に、ウイルスの不活化に供せられる。
ウイルスの不活化に続いて、混合物は、必要に応じて、さらなる精製工程のために調整される。例えば、ｐＨ調整されたプールがろ過に供され得る。一実施形態において、低ｐＨウイルス不活化及び／又はろ過に続いて、混合物のｐＨは、典型的には、より中性のｐＨ、例えば、約６．５から約８．５になるように調整される。例えば、混合物は、所望のｐＨを得るために、注射用水（ＷＦＩ）とともに流され得る。
本発明の方法において使用される低ｐＨウイルス不活化のパラメータは、以下の表４に示されている。
Figure 0006367277
本発明は、第二のイオン交換クロマトグラフィー工程の前に、イオン交換カラムから得られた第一の溶出液がウイルスの不活化に供される方法を含む。一実施形態において、ウイルスの不活化はｐＨウイルス不活化を通じて達成される。
ＩＶ．宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）レベルを測定するための方法
本発明は、精製された抗体組成物中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）濃度の残存レベルを測定するための方法も提供する。上述のように、望ましくは、ＨＣＰは、最終標的物質製品、例えば、抗体から除外される。典型的なＨＣＰは、抗体作製源に起因するタンパク質を含む。標的抗体からのＨＣＰを同定できず、十分に除去できないことは、低下した効力及び／又は有害な患者反応を引き起こし得る。
本明細書において使用される「ＨＣＰＥＬＩＳＡ」という用語は、アッセイにおいて使用される第二の抗体が、抗体、例えば、アダリムマブを作製するために使用された細胞、例えばＣＨＯ細胞から産生されたＨＣＰに対して特異的であるＥＬＩＳＡを表す。第二の抗体は、当業者に公知の慣用の方法に従って作製され得る。例えば、第二の抗体は、偽作製及び精製の実行によって（すなわち、目的の抗体を作製するために使用した同一の細胞株が使用されるが、細胞株は抗体ＤＮＡで形質移入されていない。）得られたＨＣＰを用いて作製され得る。典型的な実施形態において、選択された細胞発現系（すなわち、標的抗体を産生するために使用された細胞発現系）中で発現されるものと類似のＨＰＣを用いて、第二の抗体が産生される。
一般に、ＨＣＰＥＬＩＳＡは、抗体の２つの層（すなわち、第一の抗体及び第二の抗体）の間にＨＣＰを含む液体試料を挟むことを含む。試料を温置し、その間に、試料中のＨＣＰが第一の抗体（例えば、アフィニティー精製されたヤギ抗ＣＨＯ（Ｃｙｇｎｕｓ））によって捕捉される。抗体（例えば、抗ＣＨＯＨＣＰＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）を作製するために使用される細胞から産生されたＨＣＰに対して特異的な標識された第二の抗体が添加され、細胞内のＨＣＰに結合する。試料中に含有されるＨＣＰの量は、第二の抗体の標識に基づいて、適切な検査を用いて測定される。
ＨＣＰＥＬＩＳＡは、上記セクションＩＩＩに記載されている方法を用いて得られた溶出液又は貫流など、抗体組成物中のＨＣＰのレベルを測定するために使用され得る。本発明は、ＨＣＰ酵素結合免疫吸着検定法（「ＥＬＩＳＡ」）によって測定された場合にＨＣＰの検出可能なレベルを有さない、抗体を含む組成物も提供する。一実施形態において、第一の溶出液は、ＨＣＰの約１２，０００から約１９，５００ｎｇ／ｍｇの間を含む。一実施形態において、第二の溶出液は、ＨＣＰの約１．０と約０．０ｎｇ／ｍｇの間を含む。
Ｖ．プロカテプシンＬのレベルを測定するための方法
本発明は、試料中のプロカテプシンＬの量を測定するための速度論アッセイ（又はカテプシンＬ速度論アッセイ）を提供する。プロカテプシンＬは、ある種の発現系から得られる宿主細胞タンパク質であり、カテプシンＬへ活性化されると、アダリムマブなどの抗体を含むタンパク質の断片化を引き起こすことが知られている。
プロカテプシンＬが不活性なチモーゲンとして合成され、後に、活性なカテプシンＬ形態へ加工されることが、研究によって示されている。プロカテプシンＬの活性化は、カテプシンＤなどの他のプロテアーゼによって、又は酸性条件内でのリソゾームの自己触媒活性化によって、Ｎ末端プロペプチド領域のタンパク質分解的除去によって生じる（Ｔｕｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ２５９：９２９）。さらに、Ｍａｓｏｎら（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ １８９：１６５９参照）は、より低いｐＨ条件において硫酸デキストランなどの負に帯電した分子を添加することによって、ｐＨ５．５で、より高い程度まで、カテプシンＬの活性化が達成され得ることを報告する。
プロカテプシンＬ（又は活性形態カテプシンＬ）のレベルを検出する従来の方法には、弱陰イオン交換クロマトグラフィーなどの分析方法が含まれた。しかしながら、製造過程の試料（すなわち、セクションＩＩＩに上記されている方法から得られた試料）を検査する場合には、緩衝液系の妨害及びマトリックス効果のために、このような方法は限定される。従って、本発明は、例えば、プロセスをモニタリングする目的で、プロカテプシンＬをよりよくモニターするために、高処理量の蛍光酵素法を提供する。
本発明の速度論アッセイは、標準的なエンドポイントアッセイによって容易に検出することができないレベルでプロカテプシンＬを測定する方法を提供する。速度論アッセイは、プロカテプシンＬのレベルが再現可能に低いかどうかを決定する手段も提供する。一実施形態において、プロカテプシンＬのレベルが方法全体において減少されることを確認し、又は決定するために、セクションＩＩＩに記載されている方法中のあらゆる点から試料を取得し得る。プロカテプシンＬは、タンパク質からアミノ末端を除去することによって活性化される。一実施形態において、活性化は、カテプシンＤなどの（但し、これに限定されない。）ペプチダーゼを用いて達成される。一旦活性化されると、カテプシンＬは、基質を選択的に加水分解することができる。基質は試料と接触され、基質への変化に基づき、カテプシンＬ活性に関してモニターされる。
好ましい実施形態において、カテプシンＬに対する基質は標識を含む。標識は、カテプシン活性の測定を可能とするあらゆる因子を含み得る。カテプシンＬが選択的に加水分解することができる標識された基質の例には、Ｚ−ロイシン−アルギニン−ＡＭＣ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）などの合成基質が含まれる。ペプチド基質は、ＡＭＣのアミノ基とアルギニンのカルボキシル基の間のアミド結合によって消光される蛍光性の７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）基を含有し得る。カテプシンＬによってアミド結合が切断されると、放出されたＡＭＣ基は蛍光性であり、それぞれ、３８０ｎｍ及び４６０ｎｍの蛍光波長及び発光波長によって測定することができる。カテプシンＬ活性のレベルを測定するために、この励起を測定し、使用し得る。基質の代謝回転速度は、試料中に存在するカテプシンＬの量に正比例する。この測定は、既知のカテプシンＬ活性及びカテプシンＬの既知量を有する参照試料と組み合わせて使用される。次いで、試料中のカテプシンＬ活性は、試料中に存在する抗体の量と相関付けられる。一実施形態において、第一の溶出液は、約２５から約６０ＲＦＵ／秒／ｍｇ抗体の範囲のカテプシンＬ活性を含む。別の実施形態において、第一の貫流は、約０．４から約４ＲＦＵ／秒／ｍｇ抗体の範囲のカテプシンＬ活性を含む。一実施形態において、第二の溶出液は、約０．５から約１．５ＲＦＵ／秒／ｍｇ抗体の範囲のカテプシンＬ活性を含む。
一実施形態において、速度論アッセイは、カテプシンＬ試料が得られるように、哺乳動物細胞発現系に由来する物質を、プロカテプシンＬを活性なカテプシンＬ形態へ加工するための酵素と接触させることによることを含む、物質中のプロカテプシンＬの量を測定することを含む。一旦活性化されると、カテプシンＬは、Ｚ−ロイシン−アルギニン−ＡＭＣなどの合成基質などの基質を選択的に加水分解することができる。次いで、例えば、ＡＭＣのアミノ基とアルギニンのカルボキシル基の間のアミド結合によって消光される蛍光性の７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）基を含有するＺ−ロイシン−アルギニン−ＡＭＣなどの合成などの基質が試料に添加される。カテプシンＬによってアミド結合が切断されると、放出されたＡＭＣ基は蛍光性であり、それぞれ、３８０ｎｍ及び４６０ｎｍの蛍光波長及び発光波長によって測定することができる。測定されたカテプシン活性は、哺乳動物細胞発現系（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）に由来する物質中のプロカテプシンＬの量の指標として使用される。
一実施形態において、第一の溶出液は、約２５から約６０ＲＦＵ／秒／ｍｇ抗体の範囲のカテプシンＬ活性を含む。別の実施形態において、第一の貫流は、約０．４から約４ＲＦＵ／秒／ｍｇ抗体の範囲のカテプシンＬ活性を含む。一実施形態において、第二の溶出液は、約０．５から約１．５ＲＦＵ／秒／ｍｇ抗体の範囲のカテプシンＬ活性を含む。
本発明は、上記量の中間に位置する範囲も包含し、本発明の一部であるものとする。例えば、上記値の何れかの組み合わせを上限及び／又は下限として使用する値の範囲並びに記載されている範囲の間にある全ての数値が含まれるものとする。
本発明は、上記修飾の何れか単独、又は互いに組み合わせたものを含む。
ＶＩ．医薬組成物
本発明の方法を用いて得られた抗体は、対象に投与するのに適した医薬組成物中に取り込ませ得る。典型的には、医薬組成物は、抗体又はその抗原結合部分と及び医薬として許容される担体とを含む。本明細書において使用される「医薬として許容される担体」には、生理的に適合性がある、全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。医薬として許容される担体の例には、水、生理的食塩水、リン酸緩衝化された生理的食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの１つ又はそれ以上及びこれらの組み合わせが含まれる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マニトール、ソルビトールなどの多価アルコール又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。医薬として許容される担体は、抗体又はその抗原結合部分の保存期間又は有効性を増強する、湿潤剤又は乳化剤、防腐剤又は緩衝剤などの補助物質の微量をさらに含み得る。
本発明の方法を用いて精製された抗体又はその抗原結合部分を含む医薬組成物は、様々な形態で見出され得る。これらには、例えば、液体溶液（例えば、注射可能及び注入可能な溶液）、分散液又は懸濁液、錠剤、丸薬、粉末、リポソーム及び坐剤などの液体、半固体及び固体剤形が含まれる。好ましい形態は、予定される投与の様式及び治療用途に依存する。典型的な好ましい組成物は、他の抗体又は他のＴＮＦα阻害剤を用いたヒトの受動免疫に対して使用される組成物と同様の組成物など、注射可能溶液又は注入可能溶液の形態である。投与の好ましい様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。好ましい実施形態において、抗体は、静脈内注入又は注射によって投与される。別の好ましい実施形態において、抗体は、筋肉内又は皮下注射によって投与される。
治療組成物は、典型的には、製造及び保存の条件下で、無菌及び安定でなければならない。組成物は、溶液、ミクロエマルジョン、分散液、リポソーム又は高薬物濃度に適したその他の秩序化された構造として製剤化することが可能である。無菌注射可能溶液は、上に列記されている成分の１つ又は組み合わせを加えた適切な溶媒中に、必要な量で活性化合物（すなわち、抗体又はその抗原結合部分）を取り込ませ、必要に応じて、ろ過滅菌によって調製することが可能である。一般的に、分散液は、塩基性分散溶媒及び上に列記されたものから得られる必要なその他の成分を含有する無菌ビヒクル中に活性化合物を取り込ませることによって調製される。無菌注射可能溶液の調製のための無菌粉末の場合には、調製の好ましい方法は、予め滅菌ろ過されたその溶液から、あらゆる追加の所望される成分を加えた活性成分の粉末を与える真空乾燥及び凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合に必要な粒径を維持することによって、及び界面活性剤を使用することによって維持することができる。注射可能組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物中に含めることによって実現することができる。
補助的活性化合物も、組成物中に取り込ませることが可能である。ある実施形態において、本発明の方法で使用するための抗体又はその抗体結合部分は、１つ又はそれ以上のさらなる治療剤とともに共製剤化され、及び／又は同時投与される。例えば、本発明の抗ｈＴＮＦα抗体又はその抗体部分は、１つ若しくはそれ以上のＤＭＡＲＤ又は１つ若しくはそれ以上のＮＳＡＩＤ又は他の標的を結合する１つ若しくはそれ以上の追加の抗体（例えば、他のサイトカインを結合し、又は細胞表面分子を結合する抗体）、１つ若しくはそれ以上のサイトカイン、可溶性ＴＮＦα受容体（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／０６４７６参照）及び／又はｈＴＮＦα産生若しくは活性を阻害する１つ若しくはそれ以上の化学的因子（ＰＣＴ公開ＷＯ０３／１９７５１に記載されているシクロヘキサンイリデン誘導体など）又はこれらのあらゆる組み合わせとともに共製剤化され、及び／又は同時投与され得る。さらに、本発明の１つ又はそれ以上の抗体は、先述の治療剤の２つ又はそれ以上と組み合わせて使用され得る。このような組み合わせ療法は、投与される治療剤のより低い投薬量を有利に使用し得るので、生じ得る副作用、合併症又は様々な単独療法に伴う、患者により応答の低いレベルが回避される。
一実施形態において、本発明は、ＴＮＦα阻害剤又はその抗原結合部分の有効量及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物を含み、ＴＮＦα阻害剤の抗体は、例えば、クローン病などのＴＮＦ関連疾患を治療するために有効であり得る。一実施形態において、抗体又は抗体部分は、ＰＣＴ／ＩＢ０３／０４５０２及び米国特許出願１０／２２２１４０号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）に記載されているように医薬製剤中に取り込まれる。本製剤は、抗体アダリムマブの濃度５０ｍｇ／ｍＬを含み、ここにおいて、予め充填された１つの注射器は、皮下注射のための抗体４０ｍｇを含有する。
多くの治療用途に関して、好ましい投与経路／様式は皮下注射であるが、本発明の方法を用いて得られた抗体又は抗体部分は、本分野で公知の様々な方法によって投与することが可能である。別の実施形態において、投与は、静脈内注射又は注入を介する。当業者によって理解されるように、投与の経路及び／又は様式は、所望される結果に応じて変動する。ある種の実施形態において、活性化合物は、インプラント、経皮パッチ及び微小封入された送達系を含む徐放製剤など、迅速な放出に対して化合物を保護する担体とともに調製され得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸などの生物分解可能な生体適合性ポリマーを使用することが可能である。このような製剤の多くの調製方法は、特許が付与されているか、又は、一般的に当業者に公知である。例えば、「Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８」を参照されたい。
本発明の方法を用いて得られた抗体又はその抗原結合部分は、被覆された粒子を形成するためにポリマー性担体内に封入されたタンパク質結晶の組み合わせを含むタンパク質結晶製剤の形態でも投与することができる。タンパク質結晶製剤の被覆された粒子は、球状形態を有し、及び最大５００μｍの直径の小球体であり得、又はそれらは、他の何らかの形態を有し、及び微粒子であり得る。タンパク質結晶の増加された濃度は、本発明の抗体を皮下送達することを可能とする。一実施形態において、本発明の抗体は、タンパク質送達系を介して送達され、タンパク質結晶製剤又は組成物の１つ又はそれ以上が、ＴＮＦα関連疾患を有する患者に投与される。完全な抗体結晶又は抗体断片結晶の組成物及びこれらの安定化された製剤を調製する方法は、ＷＯ０２／７２６３６号（参照により、本明細書に組み込まれる。）にも記載されている。一実施形態において、ＰＣＴ／ＩＢ０３／０４５０２及び米国特許出願１０／２２２１４０号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている結晶化された抗体断片を含む製剤は、本発明の複数可変投薬法を用いて、ＴＮＦα関連疾患を治療するために使用される。
ある種の実施形態において、本発明の方法を用いて得られた抗体又はその抗原結合部分は、例えば、不活性希釈剤又は同化可能な食用担体とともに、経口投与され得る。また、化合物（及び、所望であれば、その他の成分）は、硬若しくは軟殻ゼラチンカプセル中に封入され、錠剤へと圧縮され、又は患者の食事中に直接取り込ませ得る。経口治療的投与の場合、化合物は、賦形剤とともに取り込ませることができ、摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウェハースなどの形態で使用され得る。非経口投与以外によって本発明の化合物を投与するために、その不活化を妨げるための物質で化合物を被覆し、又はその不活化を妨げるための物質とともに化合物を同時投与することが必要であり得る。
本発明の医薬組成物には、本発明の抗体又はその抗原結合部分の「治療的有効量」又は「予防的有効量」が含まれ得る。「治療的有効量」は、必要な投薬量と期間において、所望の治療結果を達成するのに有効な量を表す。抗体又はその抗原結合部分の治療的有効量は、個体の病状、年齢、性別及び体重並びに抗体、抗体部分、他のＴＮＦα阻害剤が、個体内で所望の応答を惹起する能力などの因子に従って変動し得る。治療的有効量は、抗体又はその抗原結合部分のあらゆる毒性効果又は有害効果が、治療的に有益な効果によって凌駕される量でもある。「予防的有効量」は、必要な投薬量及び期間において、所望の予防的結果を達成するのに有効な量を表す。疾病のより初期段階の前に又は疾病のより初期段階では、予防的投薬が対象に使用されるので、通例、予防的有効量は、治療的有効量より少ない。
投薬計画は、最適な所望の応答（例えば、治療的応答又は予防的応答）を与えるように調整され得る。例えば、単一のボーラスを投与することができ、複数の分割された用量を経時的に投与することができ、又は、治療状況の緊急性によって示されるように、用量を比例的に減少若しくは増加させ得る。投与の容易さ及び投薬量の均一性のために、投薬単位形態で非経口組成物を製剤化することが特に有利である。本明細書において使用される投薬単位形態は、治療されるべき哺乳動物対象に対する統一された投薬として適した、物理的に分離された単位を表し、各単位は、必要とされる医薬担体とともに、所望される治療効果を生じるように計算された活性化合物の所定量を含む。本発明の投薬単位形態に対する規格は、（ａ）活性化合物の特有の特徴及び達成されるべき具体的な治療効果又は予防効果並びに（ｂ）個体における過敏症の治療用のこのような活性化合物を配合する分野に固有の制約によって規定され、これらに直接依存する。
抗体又はその抗原結合部分の治療的又は予防的有効量に対する典型的な非限定的範囲は、１０から２００ｍｇ、より好ましくは２０から１６０ｍｇ、より好ましくは４０から８０ｍｇ、最も好ましくは８０ｍｇである。一実施形態において、抗体又はその抗原結合部分の治療的有効量は約２０ｍｇである。別の実施形態において、抗体又はその一部の治療的有効量は約４０ｍｇである。さらに別の実施形態において、抗体又はその抗原結合部分の治療的有効量は約８０ｍｇである。一実施形態において、本発明の方法において使用するための抗体又はその一部の治療的有効量は約１２０ｍｇである。さらに別の実施形態において、抗体又はその抗原結合部分の治療的有効量は約１６０ｍｇである。上記投薬量の中間の範囲、例えば、約７８．５から約８１．５、約１５から約２５、約３０から約５０、約６０から約１００、約９０から約１５０、約１２０から約２００も、本発明の一部であるものとする。例えば、上記値の何れかの組み合わせを、上限及び／又は下限として用いる値の範囲も含まれるものとする。
緩和されるべき症状の種類及び重度に応じて、投薬量の値が変化し得ることに注意すべきである。何れの患者についても、当該個人の要求に従って、及び組成物の投与を行い又は監督している者の専門的判断に従って、特異的投薬計画を経時的に調整すべきこと、並びに本明細書に記載されている投薬量の範囲は典型的なものに過ぎず、特許請求の範囲に記載されている組成物の範囲又は実施に限定することを意図したものではないことをさらに理解すべきである。
本発明の方法を用いて得られた抗体又はその抗体部分は、ＷＯ０２／１００３３０に記載されているように、隔週投薬計画で、ＷＯ０４／０３７２０５に記載されているように低用量投薬計画で及びＷＯ０５／１１０４５２に記載されているような複数可変投薬計画で投与され得る（これらの各々は、参照により、本明細書に組み込まれる。）。
本発明は、本発明の方法を用いて得られた抗体又はその抗原結合部分を含む梱包された医薬組成物、製品又はキットにも関する。製品は、本発明の方法を用いて得られた抗体又はその抗原結合部分及び同封物を含み得る。製品は、抗体又はその抗原結合を含む製剤又は組成物がＨＣＰ及び／又はプロカテプシンＬの減少したレベルを有することを示すラベル又は同封物も含み得る。製品は、アダリムマブ製剤がＨＣＰの約７０ｎｇ／ｍｇ以下を含むことを示す梱包材料内に含有されたラベル若しくは同封物又はダリムマブ製剤が約１３ｎｇ／ｍｇ以下を含むことを示す梱包材料内に含有されたラベル若しくは同封物を含み得る。製品は、アダリムマブ製剤が約５ｎｇＨＣＰ／ｍｇアダリムマブ以下を含むことを示す包装材料内に含有されるラベル又は同封物を含み得る。製品は、アダリムマブ製剤が、約３．０ＲＦＵ／秒／ｍｇアダリムマブのカテプシンＬ活性によって示されるものを上回らないプロカテプシンＬのレベルを含むことを示す包装材料も含み得る。
ＶＩＩ．治療の方法
本発明は、ＴＮＦα活性が有害である疾患に罹患している対象において、ＴＮＦα活性を阻害するために使用することができる、ＨＣＰ又はプロカテプシンＬが減少した抗体調製物を作製する方法。ＴＮＦαは、様々な疾患の病態生理に関与していると推測されている（例えば、Ｍｏｅｌｌｅｒ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ２：１６２−１６９；Ｕ．Ｓ．ＰａｔｅｎｔＮｏ．５，２３１，０２４ ｔｏ Ｍｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ，；Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２６０６１０ Ｂ１ ｂｙ Ｍｏｅｌｌｅｒ，Ａ．を参照）。ＴＮＦαは、敗血症、感染症、自己免疫疾患、移植拒絶及び移植片対宿主病を含む多様なＴＮＦα関連疾患の病態生理に関与していると推定されている（例えば、Ｍｏｅｌｌｅｒ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ２：１６２−１６９；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，２３１，０２４ ｔｏ Ｍｏｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌｌ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２６０ ６１０ Ｂ１ ｂｙ Ｍｏｅｌｌｅｒ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｖａｓｉｌｌｉ，Ｐ．（１９９２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：４１１−４５２；Ｔｒａｃｅｙ，Ｋ．Ｊ．ａｎｄ Ｃｅｒａｍｉ，Ａ．（１９９４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４５：４９１−５０３参照。）。本発明は、ＴＮＦα関連疾患に罹患している対象中のＴＮＦα活性を阻害するのに有益である、ＨＣＰ又はプロカテプシンＬが減少した抗体調製物を作製する方法であり、初期誘導用量を対象に投与すること、及び続いて、ＴＮＦα活性が阻害されるように、抗体又はその抗原結合断片の治療用量を投与することを含む方法。好ましくは、ＴＮＦαはヒトＴＮＦαであり、対象はヒト対象である。一実施形態において、ＴＮＦα阻害剤はアダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（Ｒ）（Ｄ２Ｅ７）とも称される。）である。
本明細書において使用される「ＴＮＦα活性が有害である疾患」という用語は、本疾患に罹患している対象中でのＴＮＦαの存在が、疾患の病態生理の原因であるか、又は疾患の悪化に寄与している因子であることが示されており、又は疑われている疾病及びその他の疾患を含むものとする。したがって、ＴＮＦα活性が有害である疾患は、ＴＮＦα活性の阻害が疾患の症候及び／又は進行を緩和することが予測される疾患である。このような疾患は、例えば、本疾患に罹患している対象の生体液中のＴＮＦα濃度の増加（例えば、対象の血清、血漿、滑液中などのＴＮＦα濃度の増加）によって明らかとされ得、生体液中のＴＮＦα濃度の増加は、例えば、上記抗ＴＮＦα抗体を用いて検出することが可能である。ＴＮＦα活性が有害である疾患の多数の例が存在する。特異的な疾患の治療のための、本発明の方法を用いて得られたＴＮＦα抗体及び抗体部分の使用が、以下でさらに論述されている。
Ａ．敗血症
腫瘍壊死因子は、低血圧、心筋抑制、血管漏出症候群（ｖａｓｃｕｌａｒ ｌｅａｋａｇｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、臓器壊死、有毒な二次的媒介物質の放出の刺激及び凝固カスケードの活性化を含む生物効果を伴う、敗血症の病態生理学において確立された役割を有する（例えば、Ｍｏｅｌｌｅｒ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ２：１６２−１６９；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，２３１，０２４ ｔｏ Ｍｏｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ；Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２６０ ６１０ Ｂ１ ｂｙ Ｍｏｅｌｌｅｒ，Ａ．；Ｔｒａｃｅｙ，ＫＪ．ａｎｄ Ｃｅｒａｍｉ，Ａ．（１９９）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４５：４９１−５０３；Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｃ．（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．４：１１４−７２１参照）。本発明の複数可変投薬法は、敗血症性ショック、内毒素ショック、グラム陰性敗血症及び毒素性ショック症候群など、その臨床状態の何れにおける敗血症を治療するためにも使用することが可能である。
さらに、敗血症を治療するために、本発明の方法を用いて得られた抗ｈＴＮＦα抗体又は抗体部分は、インターロイキン−１阻害剤（ＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｓ．ＷＯ９２／１６２２１及びＷＯ９２／１７５８３に記載されているものなど）、サイトカインインターロイキン−６（例えば、ＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ９３／１１７９３参照）又は血小板活性化因子のアンタゴニスト（例えば、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．ＥＰ３７４ ５１０参照）など、敗血症をさらに改善させ得る１つ又はそれ以上のさらなる治療剤とともに同時投与することができる。好ましい実施形態において、抗ＴＮＦα抗体又は抗体部分は、治療の時点で、５００ｐｇ／ｍＬを超える、より好ましくは１０００ｐｇ／ｍＬを超えるＩＬ−６の血清又は血漿濃度を有する敗血症患者の亜群内のヒト対象に投与される（ＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ９５／２０９７８ ｂｙ Ｄａｕｍ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ参照）。
Ｂ．自己免疫疾患
腫瘍壊死因子は、様々な自己免疫疾患の病態生理学において役割を果たしていると推定されている。例えば、ＴＮＦαは、関節リウマチにおいて、組織炎症を活性化させ、関節破壊を引き起こすことに関与していると推定されている（例えば、Ｍｏｅｌｌｅｒ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ２：１６２−１６９；Ｍｏｅｌｌｅｒらに対する米国特許第５，２３１，０２４号；Ｍｏｅｌｌｅｒ，Ａ．による欧州特許公開２６０ ６１０ Ｂ１；Ｔｒａｃｅｙ ａｎｄ Ｃｅｒａｍｉ，上記；Ａｒｅｎｄ，Ｗ．Ｐ ａｎｄ Ｄａｙｅｒ，Ｊ−Ｍ．（１９９５）Ａｒｔｈ．Ｒｈｅｕｍ．３８：１５１−１６０；Ｆａｖａ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９４：２６１−２６６参照）。ＴＮＦαは、膵島細胞の死を促進すること、及び糖尿病におけるインシュリン抵抗性を媒介することにも関与していると推定されている（例えば、Ｔｒａｃｅｙ ａｎｄ Ｃｅｒａｍｉ、上記；ＰＣＴ公開ＷＯ９４／０８６０９号を参照。）。ＴＮＦαは、乏突起膠細胞への細胞毒性の媒介及び多発性硬化症における炎症性斑の誘導にも関与していると推定されている（例えば、Ｔｒａｃｅｙ ａｎｄ Ｃｅｒａｍｉ、上記を参照。）。ＴＮＦαは、乏突起膠細胞への細胞毒性の媒介及び多発性硬化症における炎症性斑の誘導にも関与していると推定されている（例えば、Ｔｒａｃｅｙ ａｎｄ Ｃｅｒａｍｉ、上記を参照。）。キメラ及びヒト化マウス抗ＴＮＦα抗体は、関節リウマチの治療について、臨床試験が行われた（例えば、Ｅｌｌｉｏｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｌａｎｃｅｔ ３４４：１１２５−１１２７；Ｅｌｌｉｏｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｌａｎｃｅｔ ３４４：１１０５−１１１０；Ｒａｎｋｉｎ，Ｅ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂｒ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．３４：３３４−３４２参照。）。
アダリムマブなどのＴＮＦα抗体は、自己免疫疾患、特に、炎症を伴う自己免疫疾患を治療するために使用し得る。このような自己免疫症状の例には、関節リウマチ、リウマチ様脊椎炎、骨関節炎及び通風性関節炎、アレルギー、多発性硬化症、自己免疫性糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎及びネフローゼ症候群が含まれる。自己免疫症状の他の例には、多臓器自己免疫疾患及び自己免疫性難聴が含まれる。
典型的には、抗体又は抗体部分は、全身的に投与されるが、ある種の疾患に関しては、炎症部位への抗体又は抗体部分の局所投与が有益であり得る（例えば、単独での、又はＰＣＴＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．ＷＯ９３／１９７５１に記載されているようなシクロヘキサン−イリデン誘導体と組み合わせた）、関節リウマチ中の関節中への局所投与又は糖尿病性潰瘍への局所適用）。Ｄ２Ｅ７などのヒト抗体及び抗体部分を含むＴＮＦα阻害剤も、以下でさらに記載されているように、自己免疫疾患の複数可変投薬治療において有用な１つ又はそれ以上のさらなる治療剤とともに投与することが可能である。
本発明の一実施形態において、本発明の方法を用いて得られたＴＮＦα抗体は、狼瘡などの自己免疫疾患を治療するために使用される。狼瘡は、ＴＮＦ活性と関連していることが示されている（Ｓｈｖｉｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｈｅｍａｔｏｌ Ｊ．３：３２；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ−Ｂｅｎｋｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｒ Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．３５：１０６７）。本明細書において使用される、「狼瘡」という用語は、皮膚、関節及び内臓を含む多くの臓器系に影響を与え得る紅斑性狼瘡と呼ばれる慢性の炎症性自己免疫疾患を表す。狼瘡とは、全身性狼瘡、ループス腎炎及びループス脳炎など、狼瘡の多数の特異的種類を含む一般的な用語である。全身性狼瘡（ＳＬＥ）では、身体の天然の防御が身体に向けられ、異常な免疫細胞が身体の組織を攻撃する。身体の血液細胞、臓器及び組織に対して反応し得る抗体が産生され得る。この反応は、影響を受けた系を攻撃する免疫細胞を誘導して、慢性的な疾患をもたらす。ループス腎炎（ループス糸球体疾患とも称される。）は、通常、ＳＬＥの合併症であり、糸球体への損傷及び腎機能の進行性の喪失によって特徴付けられる腎疾患である。ループス脳炎は、ＳＬＥの別の合併症を表し、これは、脳及び／又は中枢神経系の炎症である。
ＴＮＦα抗体を用いて治療することができる別の自己免疫疾患は、腸疾患の節において、以下にさらに詳しく記載されているクローン病である。
Ｃ．感染性疾患
腫瘍壊死因子は、様々な感染性疾患において観察される生物学的効果を媒介すると推定されている。例えば、ＴＮＦαは、マラリアにおける脳の炎症及び毛細血管の血栓症及び梗塞を媒介すると推定されている。ＴＮＦαは、脳の炎症を媒介し、血液脳関門の破壊を誘導し、敗血症性ショック症候群の引き金を引き、髄膜炎において静脈梗塞を活性化させることも推測されている。ＴＮＦαは、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）において、悪液質を誘導し、ウイルス増殖を刺激し、中枢神経系の傷害を媒介することも推定されている。従って、ＴＮＦに対して誘導された抗体及び抗体部分は、細菌性髄膜炎（例えば、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＥＰ ５８５ ７０５参照）、脳マラリア、ＡＩＤＳ及びＡＩＤＳ関連複合体（ＡＲＣ）（例えば、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＥＰ ２３０５７４参照）及び移植に付随するサイトメガロウイルス感染（例えば、Ｆｉｅｔｚｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５８：６７５参照）などの感染性疾患を治療するために使用することができる。本発明の抗体及び抗体部分は、感染（インフルエンザなど）による発熱及び筋肉痛及び感染症に続発する（例えば、ＡＩＤＳ又はＡＲＣに続発する。）悪液質を含む感染性疾患と関連する症候を改善するためにも使用することができる。
Ｄ．移植
腫瘍壊死因子は、同種移植片拒絶及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の中心的媒介物質として、及び、腎移植の拒絶を阻害するために、Ｔ細胞受容体ＣＤ３複合体に対して誘導されたラット抗体ＯＫＴ３が使用される場合に観察されている有害な反応を媒介することが推定されている（例えば、Ｅａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ５９：３００；Ｓｕｔｈａｎｔｈｉｒａｎ ａｎｄ Ｓｔｒｏｍ（１９９４）ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３１：３６５参照）。従って、本発明の抗体及び抗体部分は、複数可変用量治療を用いて、同種移植片及び異種移植片の拒絶などの移植拒絶を阻害し、ＧＶＨＤを阻害するために使用することができる。抗体又は抗体部分は単独で使用され得るが、より好ましくは、異種移植片に対する免疫応答を阻害し、又はＧＶＨＤを阻害する１つ又はそれ以上の他の因子と組み合わせて使用される。例えば、一実施形態において、本発明の抗体又は抗体部分は、ＯＫＴ３によって誘導される反応を阻害するために、ＯＫＴ３と組み合わせて使用される。別の実施形態において、本発明の抗体又は抗体部分は、細胞表面分子ＣＤ２５（インターロイキン−２受容体−α）、ＣＤ１１ａ（ＬＦＡ−１）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４、ＣＤ８０（Ｂ７−１）及び／又はＣＤ８６（Ｂ７−２）などの免疫応答の制御に関与している他の標的に誘導された１つ又はそれ以上の抗体と組み合わせて使用される。さらに別の実施形態において、本発明の抗体又は抗体部分は、シクロスポリンＡ又はＦＫ５０６などの１つ又はそれ以上の一般的な免疫抑制因子と組み合わせて使用される。
Ｅ．悪性腫瘍
腫瘍壊死因子は、悪性腫瘍において、悪液質を誘導し、腫瘍増殖を刺激し、転移能を増強し、細胞毒性を媒介すると推定されている。従って、ＴＮＦに対して誘導された抗体及び抗体部分は、腫瘍増殖又は転移を阻害し、及び／又は悪性腫瘍に続発する悪液質を改善する悪性腫瘍の治療において使用することができる。抗体又は抗体部分は、全身的に投与し得、又は腫瘍部位へ局所的に投与され得る。
Ｆ．肺疾患
腫瘍壊死因子は、白血球内皮活性化を刺激すること、肺細胞へ細胞毒性を誘導すること及び血管漏出症候群を誘導することなど、成人呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）の病態生理への関与が推定されている。本発明の方法を用いて得られた抗体は、成人呼吸促迫症候群（例えば、ＰＣＴＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．ＷＯ９１／０４０５４参照）、ショック肺、慢性肺炎症性疾患、肺サルコイドーシス、肺繊維症及び珪肺症などの様々な肺疾患を治療するために使用され得る。抗体又は抗体部分は、全身的に投与し得、又は、例えば、エアロゾルとして、肺表面へ局所的に投与され得る。抗体又は抗体部分は、以下でさらに論述されているように、肺疾患の治療において有用な１つ又はそれ以上の追加の治療剤とともに投与することも可能である。
ＴＮＦαが病態生理に関与していると推定されている肺疾患の他の例には、突発性間質性肺疾患及び慢性閉塞性気道疾患が含まれる（例えば、Ｐｉｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１７０：６５５；Ｗｈｙｔｅ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａｍ ＪＲｅｓｐｉｒＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ．１６２：７５５；Ａｎｔｉｃｅｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２８４：２２１参照）。さらに、本発明は、このような肺疾患に罹患している対象中のＴＮＦα活性を治療するための方法であり、突発性間質性肺疾患又は慢性閉塞性気道疾患罹患している対象中のＴＮＦα活性が阻害されるように、抗体又は抗体部分を対象に投与することを含む方法を提供する。ＴＮＦα活性が有害である突発性間質性肺疾患及び慢性閉塞性気道疾患罹患の例は、以下でさらに論述されている
Ｉ．突発性間質性肺疾患
一実施形態において、本発明の方法を用いて得られたＴＮＦα抗体は、突発性間質性肺疾患を有する対象を治療するために使用される。「突発性肺繊維症」又は「ＩＰＦ」という用語は、炎症及び最終的に、息切れをもたらす肺深部組織の瘢痕によって特徴付けられる疾患の群を表す。ＩＰＦ中の肺胞（気嚢）及びそれらの支持構造（間質）の瘢痕は、最終的に、機能的な肺胞単位の喪失及び空気から血液への酸素の輸送の低下をもたらす。ＩＰＦは、びまん性実質性肺疾患、肺胞炎、原因不明の繊維化肺胞炎（ＣＦＡ）、突発性肺炎（ＩＰＰ）及び通常型間質性肺炎（ＵＩＰ）とも称される。ＵＩＰは、ＩＰＦの病理学的診断において見られる最も一般的な細胞パターンであるので、ＩＰＦは、しばしば、ＵＩＰ（「ＩＰＦ／ＵＩＰ」と同義的に使用される。
突発性間質性肺疾患は、３通りに、肺を冒す。第一に、肺組織は、何らかの公知又は非公知の様式で損傷を受ける。第二に、肺内の気嚢の壁に炎症状態となる。最後に、間質（すなわち、気嚢の間の組織）中に瘢痕（又は繊維症）が始まり、肺が硬くなる。突発性間質性肺疾患の例には、突発性肺繊維症（ＩＰＦ）が含まれる。腫瘍壊死因子は、突発性肺繊維症（ＩＰＦ）の病態生理への関与が推定されている（Ｐｉｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１７０：６５５；Ｗｈｙｔｅ ｅｔ ａｌ（２０００）Ａｍ ＪＲｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １６２：７５５ Ｃｏｒｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ａｍ ＪＲｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１６５：６９０参照）。例えば、ＩＰＦ患者はマクロファージ及びＩＩ型上皮細胞中にＴＮＦ発現の増加したレベルを有することが明らかとなっている（Ｐｉｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １４３：６５１；Ｎａｓｈ ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２２：３４３；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５０：４１８８）。ある種の遺伝子多型も、増加したＴＮＦ発現と関連しており、ＩＰＦ及び珪肺症において役割を果たしていることが推定されている（Ｗｈｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，上記；Ｃｏｒｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ，上記）。
ＩＰＦを有する患者は、しばしば、乾性咳、胸部痛及び／又は息切れなどのある種の症候を示す。ＩＰＦの治療のために一般的に使用されている薬物は、プレドニゾン及びシトキサンであるが、患者のごく僅かが、これらの薬物の継続的な使用によって改善するに過ぎない（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｓｏｃｉｅｔｙ（２０００）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．ＣａｒｅＭｅｄ．１６１：６４６）。酸素投与及び肺の移植が、治療のための他の選択肢である。一実施形態において、本発明の方法を通じて得られた抗体は、突発性肺繊維症の治療のための別の治療剤、例えば、酸素と組み合わせて使用され得る。
突発性間質性肺疾患及び慢性閉塞性気道疾患を研究するために使用される動物モデルの例には、オボアルブミン（ＯＶＡ）によって誘導されたアレルギー性喘息マウス及び喫煙によって誘導された慢性閉塞性肺疾患マウスが含まれる（Ｈｅｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９３：４０１；Ｋｅａｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３５：２４９参照）。
２．慢性閉塞性気道疾患
一実施形態において、ＴＮＦα抗体は、慢性閉塞性気流疾患を有する対象を治療するために使用される。これらの疾患において、気流閉塞は慢性及び持続性であり得、又は一過性及び再発性であり得る。気流閉塞は、通常、最大呼気中の時間に対する呼気容積の記録である強制呼気肺活量測定によって決定される。閉塞された気流を有しない対象では、完全な強制呼気は、通常、３秒と４秒の間を要する。気流が閉塞されている慢性閉塞性気流疾患を有する患者では、通常、最大１５から２０秒を要し、息をこらえる時間によって制約され得る。呼気の最初の秒（ＦＥＶ１）における通常の強制呼気容量は容易に測定され、年齢、性別及び身長に基づいて正確に予測される。努力肺活量に対するＦＥＶ１の比（ＦＥＶ１／ＦＶＣ）は、通常、０．７５を超える。主に、下気道狭窄から上気道狭窄を区別するために、強制呼気及びその後の強制吸気の間に容量に対して気流を記録すること（フロー−容量ループ）も有用である。慢性閉塞気道疾患の例は、以下に記載されている。
ａ．喘息
腫瘍壊死因子は、喘息の病態生理に関与していると推測されている（Ａｎｔｉｃｅｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２８４：２２１；Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ １９９５．Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１５２：７６；Ｔｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｈｅｙｗｏｏｄ（２００２）Ｔｈｏｒａｘ．５７：７７４）。例えば、急性の喘息発作は、肺好中球増加症及び上昇したＢＡＬＴＮＦレベルを伴うことが見出されている（Ｏｒｄｏｎｅｚ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａｍ ＪＲｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １６１：１１８５）。喘息症候の重度は、ハウスダスト中の内毒素のレベルと相関していることが見出されている。ラットにおいて、抗ＴＮＦ抗体は内毒素によって誘導された気道の変化を低下させた（Ｋｉｐｓ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ａｍ Ｒｅｖ ＲｅｓｐｉｒＤｉｓ １４５：３３２）。
本明細書において使用される「喘息」という用語は、気道の炎症が肺に流入及び流出する気流を制限する疾患を表す。喘息は、気管支喘息、運動によって誘導される喘息、気管支及び気道過敏症（ＲＡＤ）とも称される。幾つかの事例において、喘息は、アレルギーを伴い、及び／又は家族性である。喘息は、短期間にわたる気管支気道の直径又は内径の広範囲の変動によって特徴付けられ、肺機能の変化をもたらす症状を含む。生じた、気流に対する増加した抵抗は、罹患した対象中に、息切れ（呼吸困難）、胸部狭窄又は「圧迫感」及び喘鳴などの症候をもたらす。
喘息を有する患者は、ＮＩＨのガイドラインに従って特徴付けられ、軽度断続的、軽度持続的、中度持続的及び重度持続的と記載される（ＮＡＥＰＰ Ｅｘｐｅｒｔ Ｐａｎｅｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ａｓｔｈｍａ−Ｕｐｄａｔｅ ｏｎ Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｔｏｐｉｃｓ ２００２．ＪＡＣＩ ２００２；１１０：Ｓ１４１−Ｓ２０９；Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ａｓｔｈｍａ．ＮＥＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９７−４０５１，Ｊｕｌｙ １９９７参照）。中度の持続的喘息を有すると診断された患者は、しばしば、吸入コルチコステロイドで治療される。重度の持続的喘息を有すると診断された患者は、しばしば、高用量の吸入コルチコステロイド及び経口コルチコステロイドで治療される。
ｂ．慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）
腫瘍壊死因子は、慢性閉塞性肺疾患の病態生理に関与していると推定されている（Ｋｅａｔｉｎｇｓ（２０００）Ｃｈｅｓｔ．１１８：９７１；Ｓａｋａｏ ｅｔ ａｌ．（２００１ ）Ａｍ ＪＲｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１６３：４２０；Ｓａｋａｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｈｅｓｔ．１２２：４１６）。本明細書において互換的に使用される「慢性閉塞性肺疾患」又は「ＣＯＰＤ」という用語は、気嚢の拡大及び肺組織の破壊の変動する程度を伴う限定された気流によって特徴付けられる肺疾患の群を表す。ＣＯＰＤという用語には、慢性気管支炎（杯細胞小唾液腺過形成を伴う粘膜過剰分泌）、慢性閉塞性気管支炎又は肺気腫（気道実質の破壊）又はこれらの症状の組み合わせが含まれる。肺気腫及び慢性気管支炎は、慢性閉塞性肺疾患の最も一般的な形態である。ＣＯＰＤは、不可逆的な気流閉塞によって定義される。
ＣＯＰＤでは、慢性的な炎症が小さな気道の固定的狭窄並びに肺実質及び肺胞壁の破壊（肺気腫）をもたらす。これは、肺胞マクロファージ、好中球及び細胞傷害性リンパ球の増加した数及び複数の炎症媒介物質（脂質、ケモカイン、サイトカイン、増殖因子）の放出によって特徴付けられる。この炎症は、小さな気道の狭窄及び肺実質の破壊を伴う繊維症を引き起こす。この炎症を増殖し得る酸化的ストレスの高いレベルも存在する。
Ｇ．腸疾患
腫瘍壊死因子は、クローン病を含む炎症性腸疾患の病態生理に関与すると推定されている（例えば、Ｔｒａｃｙ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：４７０；Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８１：１３２８；ＭａｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８１：３０１参照）。キメラマウス抗ｈＴＮＦα抗体は、クローン病の治療のための臨床試験を受けた（ｖａｎ Ｄｕｌｌｅｍｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１０９：１２９）。本発明には、ヒト抗体又はその抗原結合断片を用いて、突発性炎症性腸疾患などの腸疾患を治療するために、本発明の方法を用いて得られたＴＮＦα抗体を投与することを含む治療が含まれる。突発性炎症性腸疾患には、クローン病及び潰瘍性大腸炎という２つの症候群が含まれる。一実施形態において、本発明の方法を用いて得られた抗体は、しばしばＩＢＤ及びクローン病を伴う疾患を治療するためにも使用される。本明細書において互換的に使用される「炎症性腸疾患（ＩＢＤ）関連疾患」又は「クローン病関連疾患」という用語は、一般にＩＢＤ及びクローン病を伴う症状及び合併症を記載するために使用される。
本発明には、クローン病を治療するためにＴＮＦα抗体を投与することを含む複数可変投薬計画が含まれる。クローン病の治療は、疾病の位置、程度及び重度に基づく。薬理学的な介入には、抗炎症剤（アミノサリチラート及びコルチコステロイド）及び免疫調節剤（アザチオプリン及び６−メルカプトプリン［６−ＭＰ］、シクロスポリン、メトトレキサート［ＭＴＸ］、抗生物質剤及び生物学的因子）が含まれる。Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及び赤血球沈降速度（ＥＳＲ）レベルは、非特異的な急性期反応を反映する。内視鏡検査は、クローン病を診断する主要な手段である。バリウム検査によって示されるクローン病の放射線学的な特徴には、粘膜浮腫、アフタ性及び直線状の潰瘍、非対照的な狭小化及び狭窄並びに腸間膜の肥厚によって引き起こされた腸の隣接するループの分離が含まれる。異常は局所的であり、非対照的である。主要な組織学的病変は、アフタ性の潰瘍である。クローン病を有する患者は、より高いスコアがより重い疾病活性を表す疾病の重度の標準的指標であるクローン病活性指数（ＣＤＡＩ）を用いて評価することができる。
本発明の方法を用いて治療することができるクローン病関連疾患の例には、膀胱、膣及び皮膚中の痩孔、腸閉塞、膿瘍、栄養欠乏、コルチコステロイドの使用に由来する合併症、関節の炎症、結節性紅斑（ｅｒｙｔｈｅｍ ｎｏｄｏｓｕｍ）、壊疽性膿皮症並びに目の病変が含まれる。クローン病に一般的に伴われる他の疾患には、クローン病関連関節痛、痩形成性クローン、確定的でない大腸炎及び回腸嚢炎が含まれる。
Ｈ．心臓病
本発明の方法を用いて得られた抗体又はその抗原結合断片は、心臓の虚血を含む様々な心疾患又は冠疾患（例えば、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＥＰ４５３８９８参照）及び心不全（心筋の弱化）（例えば、ＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ ９４／２０１３９参照）を治療するためにも使用することができる。ＴＮＦαは、再狭窄の病態生理にも関与していると推定されている（例えば、Ｃｌａｕｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９４），上記；Ｍｅｄａｌｌ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｈｅａｒｔ ７８：２７３）。
本明細書において使用される「ＴＮＦα活性が有害である心疾患」という用語は、本疾患に罹患している対象中でのＴＮＦαの存在が、心血管疾患（例えば、再狭窄）などの疾患の病態生理の原因であるか、又は疾患の悪化に寄与している因子であることが示されており、又は疑われている冠疾患及び心血管疾患を含むものとする。本明細書において互換的に使用される「心血管疾患」又は「冠疾患」という用語は、心血管系、例えば、心臓、血管及び／又は血液が関与するあらゆる疾病、疾患又は状態を表す。冠疾患は、一般に、心臓に血液と酸素を供給する血管（冠動脈）の狭窄によって特徴付けられる。冠疾患は、脂肪性物質とプラークの蓄積から生じ得る。冠動脈が狭くなるにつれて、心臓への血流が遅くなり、又は停止し得る。本発明の冠疾患は、構造的、組織学的、生化学的又は他の何れの異常であるか否かを問わず、動脈のあらゆる異常に適用され得る。冠動脈心疾患の例は、再狭窄である。一実施形態において、冠疾患は、心臓の虚血及び心不全を除く、心血管系を伴うあらゆる疾病、疾患又は状態を表す。
ＴＮＦα活性が有害である冠動脈疾患は、しばしば、動脈中の封鎖から生じる。このような封鎖は、通常、アテローム製動脈硬化症に関連する変化から以前に狭窄化された冠動脈中に通常形成する血餅によって引き起こされ得る。例えば、動脈壁内部の動脈硬化性プラークに亀裂が生じると、血栓又は血餅の形成の引き金を引き得る。このような疾患は、例えば、本疾患に罹患している対象の生体液中のＴＮＦα濃度の増加（例えば、対象の血清、血漿、滑液中などのＴＮＦα濃度の増加）によって明らかとされ得、生体液中のＴＮＦα濃度の増加は、例えば、上記抗ＴＮＦα抗体を用いて検出することが可能である。冠疾患は、動脈の圧力の不均衡、心臓の機能不全、又は、例えば血栓による血管の閉塞によっても引き起こされ得る。冠疾患には、冠動脈疾患及び末梢血管疾患の両方が含まれる。
再狭窄など、ＴＮＦα活性が有害である心疾患の多数の例が存在する。特異的な冠疾患の治療のための抗体、抗体部分の使用は、以下でさらに論述されている。ある種の実施形態において、抗体、抗体部分は、以下に記載されているように、別の治療剤と組み合わせて対象に投与される。
本発明の方法を用いて得られた抗体は、心疾患を有する対象中のＴＮＦα活性を阻害するためにも使用され得る。本発明は、冠疾患を有する対象中のＴＮＦα活性を阻害又は減少させるための方法であり、対象中のＴＮＦα活性が阻害又は減少されるように、本発明の抗体、抗体部分又はその他のＴＮＦα阻害剤を対象に投与することを含む方法を提供する。好ましくは、ＴＮＦαはヒトＴＮＦαであり、対象はヒト対象である。あるいは、対象は、本発明の抗体が交叉反応するＴＮＦαを発現する哺乳動物であり得る。さらに、対象は、（例えば、ｈＴＮＦαの投与によって、又はｈＴＮＦα導入遺伝子の発現によって）ｈＴＮＦαがその中に導入された哺乳動物であり得る。本発明の抗体は、治療目的のために、ヒト対象に投与され得る。
さらに、本発明の抗体は、獣医学的目的のために、又はヒト疾患の動物モデルとして、抗体が交叉反応するＴＮＦαを発現している非ヒト哺乳動物（例えば、霊長類、ブタ又はマウス）に投与することができる。後者に関して、このような動物モデルは、複数可変投薬治療の効力を評価する（例えば、投薬量及び投与の時間を検査する。）ために有用であり得る。再狭窄を含む冠疾患を研究するための一般的に使用される動物モデルには、ラット又はマウスの頚動脈結紮モデル及び頚動脈傷害モデルが含まれる（Ｆｅｒｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１１２９；Ｃｌｏｗｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．４９：２０８；Ｌｉｎｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．７３：７９２）。頚動脈結紮モデルでは、遠位の分岐付近での血管の結紮によって、動脈の血流が破壊される。Ｃｌｏｗｅｓらに記載されているように、頚動脈傷害モデルは、外頚動脈を通じて導入されたバルーンカテーテルの腔内通過によって、総頚動脈内皮が剥皮されるように実施される。２週の時点で、平滑筋細胞収縮によって、頚動脈は顕著に狭窄されるが、２週と１２週の間に、内膜の厚さが倍増し、管腔サイズを減少させる。これらのモデルの何れもが、ヒト中の再狭窄の予防及び治療における本発明のＴＮＦα抗体の潜在的な治療的作用を決定するために使用することができる。
本発明は、ＴＮＦα活性の阻害が冠疾患の症候及び／又は進行を緩和し、又は冠疾患を予防することが予想される、ＴＮＦα活性が有害である心血管疾患の治療を含む。冠疾患に罹患し、又は冠疾患を発症するリスクのある対象は、臨床的な症候を通じて同定することが可能である。冠疾患の臨床的症候には、しばしば、胸部痛、息切れ、脱力感、失神の発作、意識の変化、四肢の疼痛、発作性夜間呼吸困難、一過性虚血発作及び患者によって経験される他のこのような現象が含まれる。冠疾患の臨床的徴候には、ＥＫＧの異常、変化した末梢脈拍、動脈雑音、異常な心音、心拍数及び喘鳴、頸静脈拡張、神経学的な変化及び臨床医によって識別されるその他のこのような知見も含まれ得る。冠疾患は、例えば、本疾患に罹患している患者の生体液中のＴＮＦα濃度の増加（例えば、対象の血清、血漿、滑液中などのＴＮＦαの濃度の増加）によっても明らかとされ得る。
心血管疾患の例には、冠動脈疾患、狭心症、心筋梗塞、心停止によって引き起こされる心血管組織の損傷、心臓バイパスによって引き起こされる心血管組織の損傷、心臓性ショック及び高血圧、アテローム性動脈硬化症、冠動脈攣縮、冠動脈疾患、弁膜疾患、不整脈及び心筋症が含まれるが、これらに限定されない。特異的な心血管疾患の治療のための抗体、抗体部分の使用は、以下でさらに論述されている。ある種の実施形態において、抗体、抗体部分は、以下に記載されているように、別の治療剤と組み合わせて対象に投与される。
１．再狭窄
本明細書において使用される「再狭窄」という用語は、動脈の狭小化又は収縮である狭窄の再発を表す。再狭窄は、しばしば、患部血管中での再構築操作の後に生じる前閉塞性病変として発生する。本用語は、既存の狭窄の再発に対して適用されるのみならず、血管バイパス術後に部分的に閉塞された状態となった、以前には正常であった血管に対しても適用される。別の実施形態において、本発明は、再狭窄を有する、又は再狭窄を発症するリスクがある対象に、本発明を用いて得られた抗体又はその抗原結合部分を投与することを含む、再狭窄を治療する方法を提供する。
ＴＮＦαは、再狭窄の病態生理に関与していることが推定されている（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．１６１：１５３；Ｊａｖｅｄ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｅｘｐ ａｎｄ Ｍｏｌ Ｐａｔｈｏｌ ７３：１０４参照）。例えば、マウスのワイヤー頚動脈モデルにおいて、ＴＮＦ−／−マウスは、野生型マウスに比べて、当初の過形成の７倍の低下を示した（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ａｍ Ｊ Ｐｈｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ Ｉｎｔｅｇｒ Ｃｏｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２８３：Ｒ５０５）。再狭窄は、冠動脈の脈管構造中であるか、又は末梢中であるかを問わず、血管再構築のあらゆる種類の結果として生じ得る（Ｃｏｌｂｕｒｎ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ（１９９８）Ｍｙｏｉｎｔｉｍａｌ Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ ｐｐ．６９０−７０９ ｉｎ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｓｕｒｇｅｒｙ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｓａｕｎｄｅｒｓ）。例えば、研究は、冠動脈血管形成術後に、３０から５０％の症候性再狭窄率を報告している（Ｂｅｒｋ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ（１９９５）Ａｄｖ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．４０：４５５参照）。さらなる例として、頚動脈の動脈内膜切除術後に、研究された患者の２０％が、５０％を上回る管腔の狭小化を有していた（Ｃｌａｇｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｖａｓｅ．Ｓｕｒｇ．３：１０）。再狭窄は、関与する血管の性質、残存する疾病の程度及び局所的な血行動態を含む因子の組み合わせに起因する、異なる解剖学的位置に前梗塞的な病変を伴う症候学の様々な程度で明らかにされる。
本明細書において使用される「狭窄」とは、閉塞性疾患において、又は再狭窄において見られるような動脈の狭小化を表す。狭窄には、狭小化された動脈のセグメントを通過する血流の減少を反映する症候を伴い得、この場合には、狭窄をもたらしている疾患は疾病（すなわち、閉塞性の疾病又は再狭窄疾病）と称される。狭窄は、血管内に非症候的に存在することが可能であり、血管造影法又は血管の研究室での研究などの診断的介入によってのみ検出される。
本発明の方法を用いて得られた抗体は、再狭窄に罹患している対象又は再狭窄を発症するリスクがある対象を治療するために使用され得る。再狭窄を発症するリスクがある対象には、ＰＴＣＡを実施した対象が含まれる。対象は、再狭窄を予防するために挿入されたステントも有した場合があり得る。ＴＮＦα抗体は、心血管疾患に罹患している対象中の狭窄の再発を予防するために、単独で、又はステントと組み合わせて使用することが可能である。
２．うっ血性心不全
ＴＮＦαは、うっ血性心不全の病態生理に関与していると推定されている（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １６１：１５３参照）。ＴＮＦαの血清レベルは、疾病の重度に正比例する様式で、うっ血性心不全を有する患者中において上昇している（Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎ ＥｎｇｌＪＭｅｄ３２３：２３６；Ｔｏｒｒｅ− Ａｍｉｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）ＪＡｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ２７：１２０１）。さらに、ＴＮＦαの阻害剤は、うっ血性心不全の症候を改善することも示されている（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ１０７：３１３３）。
本明細書において使用される「うっ血性心不全」という用語には、心臓が身体の酸素消費量を供給する能力の減弱によって特徴付けられる症状が含まれる。うっ血性心不全の症候及び徴候には、身体の様々な組織への減弱した血流、様々な臓器中への過剰な血液の蓄積（例えば、心臓に戻ってきた血液を、心臓が大静脈によって拍出することができない場合）、労作性呼吸困難、疲労及び／又は末梢性浮腫（例えば、左心室の機能不全によって生じる末梢性浮腫）が含まれる。うっ血性心不全は、急性又は慢性であり得る。うっ血性心不全の徴候は、通常、心機能の一時的又は恒常的な喪失を共有する様々な心疾患又は全身疾患に続発して生じる。このような疾患の例には、高血圧、冠動脈疾患、弁膜症及び心筋症（例えば、肥大型、拡張型（ｄｉｌａｔｉｖｅ）又は拘束型心筋症が含まれる。
「うっ血性心不全を有する又はうっ血性心不全に罹患している対象」とは、心臓が代謝性組織の要求に応じるように血液を送り出すことができず、又は代謝性組織の要求に応じるように血液を上昇した充満圧から送り出すことができるに過ぎない心臓拍動障害の一般的基準によって結び付けられる多様な病因の臨床的症候群を伴う疾患を有する対象である。「うっ血性心不全を発症するリスクがある対象」とは、対象の心血管系に影響を与えるある種の因子のために、うっ血性心不全を発症する傾向を有する対象である。これらの対象中でのうっ血性心不全の発症のリスクを低減し、又はこれらの対象中でのうっ血性心不全の発症を予防することが望ましい。「うっ血性心不全を有する」という用語には、たとえ、未だうっ血性心不全に罹患していない場合があっても、リスク因子を呈しているために、一般的な集団に比べて、本症状を罹患するリスクを有する患者も含まれる。例えば、治療されていない高血圧を有する患者は、うっ血性心不全に罹患していない場合があり得るが、患者の高血圧症状の故に、うっ血性心不全のリスクを有する。本発明の一実施形態において、うっ血性心不全を発症するリスクを有する対象を治療するために、抗体アダリムマブが使用される。
３．急性冠症候群
ＴＮＦαは、急性冠症候群の病態生理に関与していると推定されている（Ｌｉｂｂｙ（１９９５）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９１：２８４４参照）。急性冠症候群には、心臓に到達する酸素が不十分となる血流制限のために、対象が疼痛を経験する疾患が含まれる。ＴＮＦαが急性冠症候群において役割を果たしていることが、研究によって見出されている。例えば、下流血行動態効果の不存在下で心筋梗塞を誘導することができる新しいラット異所性心臓移植−冠動脈結紮モデルにおいて、キメラ可溶性ＴＮＦ受容体（ｓＴＮＦＲ）の投与は、一過性のＬＶ再構築及び機能不全を消失させた（Ｎａｋａｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．４１：４１）。ｓＴＮＦＲ発現プラスミドの心筋への直接注射は、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）実験用ラットにおいて、梗塞のサイズの低下をもたらすことも見出された（Ｓｕｇａｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＦＡＳＥＢ Ｊ １６：１４２１）。
一実施形態において、ＴＮＦα抗体は、対象中の急性冠症候群の治療又は予防のために使用され、本実施形態において、急性冠症候群は心筋梗塞又は狭心症である。
本明細書中で使用される場合、「心筋梗塞」又は「ＭＩ」という用語は、心臓発作を表す。心筋梗塞は、当該部位への酸素の不十分な供給に起因する、心臓の領域の壊死又は恒常的な損傷を伴う。この壊死は、典型的には、アテローム性動脈硬化症又は塞栓症の何れかから得られた冠動脈の閉塞によって引き起こされる。本発明の方法を用いて得られたＴＮＦα抗体によって治療されるＭＩには、Ｑ波及び非Ｑ波心筋梗塞の両方が含まれる。多くの心臓発作は、冠動脈（心筋に血液及び酸素を運ぶ血管）の１つを封鎖する血餅によって引き起こされる。例えば、冠動脈中の血餅は、心筋への血液及び酸素の流れを妨げ、当該領域中の心臓細胞の死滅をもたらす。損傷を受けた心筋は、その収縮能を永久に失い、残存している心筋が収縮能を補う必要がある。ＭＩは、個体中の激しいストレスによっても引き起こされ得る。
「狭心症」という用語は、痙攣性、窒息性又は呼吸困難性の疼痛を表し、特に、最も多くは、心筋の酸欠を原因とする発作性の胸郭痛である狭心症（ａｎｇｉｎａ ｐｅｃｔｏｒｉｓ）を表す。狭心症には、異型狭心症と労作型狭心症の両方が含まれる。狭心症を有する対象は、しばしば、左肩の方へ、及び左腕に沿って広がる、突然の、重度の圧迫性胸骨下疼痛を症状とする虚血性心疾患を有する。心筋梗塞及び安定な狭心症の両方で、患者中のＴＮＦαレベルが上方制御されているので、ＴＮＦαは狭心症に関与していると推定されている（Ｂａｌｂａｙ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｇｉｏｌｏｇｙ ５２１０９）。
４．アテローム性動脈硬化症
本明細書において使用される「アテローム性動脈硬化症」とは、脂肪性物質が動脈の壁に沿って蓄積される症状を表す。この脂肪性物質は、動脈を肥厚し、硬化し、最終的には、動脈を封鎖し得る。アテローム性動脈硬化症は、動脈硬化、動脈の硬化及び動脈プラークの蓄積とも称される。ＴＮＦαに対して誘導されたポリクローナル抗体は、ウサギのアテローム性動脈硬化症モデル中の炎症及び再狭窄をもたらすＴＮＦα活性を中和するのに有効であることが示されている（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，上記）。従って、ＴＮＦα抗体は、アテローム性動脈硬化症に罹患した対象又はアテローム性動脈硬化症を有するリスクがある対象を治療又は予防するために使用され得る。
５．心筋症
本明細書において使用される「心筋症」という用語は、心臓の筋肉又は心筋が衰弱し、通常、不十分な心臓拍動をもたらす、心筋の疾病を定義するために使用される。心筋症は、ウイルス感染、心臓発作、アルコール依存症、長期の重度高血圧（高い血圧）によって、又は自己免疫原因によって引き起こされ得る。
心不全患者の約７５から８０％において、冠動脈疾患が心筋症の基礎原因であり、「虚血性心筋症」と称される。虚血性心筋症は心臓発作によって引き起こされ、心臓発作は心臓の筋肉又は心筋中に瘢痕を残す。次いで、患部の心筋は、心臓拍動機能に貢献することができなくなる。瘢痕がより大きいほど、又は心臓発作がより多くなるほど、虚血性心筋症を発症する可能性がより高くなる。
基礎を成している冠動脈疾患を原因としない心筋症は、「非虚血性心筋症」と称される。非虚血性心筋症には、突発性心筋症、肥大型心筋症、アルコール性心筋症、拡張型心筋症、周産期心筋症及び拘束型心筋症が含まれるが、これらに限定されない。
Ｉ．脊椎関節症
ＴＮＦαは、脊椎関節症などの炎症性疾患を含む様々な疾患の病態生理に関与していると推測されている（例えば、Ｍｏｅｌｌｅｒ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ２：１６２；Ｕ．Ｓ．ＰａｔｅｎｔＮｏ．５，２３１，０２４；Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２６０６１０を参照）。本発明は、脊椎関節症に罹患している対象中のＴＮＦα活性を阻害するための複数可変投薬法であり、脊椎関節症に罹患している対象中のＴＮＦα活性が阻害されるように、抗体、抗体部分を対象に投与することを含む方法を提供する。
本明細書において使用される「脊椎関節症」という用語は、脊椎の関節を冒す幾つかの疾病の何れの１つをも表すために使用され、このような疾病は、共通の臨床的、放射線学的及び組織学的特徴を共有する。多数の脊椎関節症が遺伝的特徴を共有している。すなわち、それらは、ＨＬＡ−Ｂ２７対立遺伝子と関連している。一実施形態において、脊椎関節症という用語は、強直性脊椎炎を除く、脊椎の関節を冒す幾つかの疾病の何れもの１つを表すために使用され、このような疾病は、共通の臨床的、放射線学的及び組織学的特徴を共有する。脊椎関節炎の例には、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎／脊椎炎、腸疾患性関節炎、反応性関節炎又はライター症候群及び未分化型脊椎関節炎が含まれる。脊椎関節症を研究するために使用される動物モデルの例には、ａｎｋ／ａｎｋトランスジェニックマウス、ＨＬＡ−Ｂ２７トランスジェニックラットが含まれる（Ｔａｕｒｏｇ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｔｈｅ Ｓｐｏｎｄｙｌａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ Ｏｘｆｏｒｄ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓを参照）。
本発明の複数可変投薬法は、複数可変投薬法を用いて、脊椎関節炎を発症するリスクを有する対象を治療するためにも使用することができる。脊椎関節炎を有するリスクがある対象の例には、関節炎に罹患しているヒトが含まれる。脊椎関節症は、関節リウマチなどの関節炎の他の形態を伴い得る。本発明の一実施形態において、抗体は、関節リウマチを伴う脊椎関節炎に罹患している対象を治療するために、複数可変投薬法において使用される。ＴＮＦα抗体で治療可能な脊椎関節炎の例は、以下に記載されている。
１．強直性脊椎炎（ＡＳ）
腫瘍壊死因子は、強直性脊椎炎の病態生理に関与すると推定されている（Ｖｅｒｊａｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．３４：４８６；Ｖｅｒｊａｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．９７：４５；Ｋａｉｊｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６０：１４０参照）。強直性脊椎炎（ＡＳ）は、１つ又はそれ以上の脊椎の炎症を伴う炎症性疾患である。ＡＳは、軸骨格及び／又は末梢関節（脊椎の脊骨と仙腸関節の間の関節及び脊椎と骨盤の間の関節など）を冒す慢性の炎症性疾患である。ＡＳは、最終的には、冒された脊骨を一緒に融合又は増殖させる。ＡＳなどの脊椎関節炎は、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）及び／又は潰瘍性大腸炎及びクローン病などの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を伴い得る。
ＡＳの初期の徴候は、ＣＴスキャン及びＭＲＩスキャンを含む放射線学的検査によって測定することが可能である。ＡＳの初期の症候には、しばしば、軟骨下骨（ｓｕｂｃｈｒｏｎｄｒａｌ ｂｏｎｅ）の皮質端のぼやけ、これに続く、浸食及び硬化によって明らかとなる、仙腸関節炎（ｓｃｒｏｉｌｌｉｔｉｓ）及び仙腸関節の変化が含まれる。疲労も、ＡＳの一般的症候として認められる（Ｄｕｆｆｙ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＡＣＲ ６６ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ａｂｓｔｒａｃｔ）。従って、ＡＳを治療するために、本発明の抗体又はその抗原結合断片を投与することを含む複数可変投薬法を使用することができる。
一実施形態において、本発明の複数可変投薬法は、ＡＳなど、ＩＢＤを伴う脊椎関節症を治療するために使用される。ＡＳは、しばしば、アスピリン又はインドメタシンなどの非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を用いて治療される。従って、本発明の複数可変投薬法において使用されたＴＮＦα抗体は、強直性脊椎炎に一般的に伴われる炎症及び疼痛を低減するために一般的に使用される薬剤と組み合わせても投与され得る。
２．乾癬性関節炎
腫瘍壊死因子は、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）の病態生理に関与すると推定されている（Ｐａｒｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ．５７：６９１；Ｒｉｔｃｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２５：１５４４）。本明細書において、乾癬性関節炎又は皮膚と関連する乾癬とは、身体上に赤い斑点を生じる一般的な慢性皮膚症状である乾癬を伴う慢性炎症性関節炎を表す。乾癬を有する個体２０人のうち約１人が皮膚症状とともに関節炎を発症し、症例の約７５％において、乾癬が関節炎に先行する。ＰｓＡは、軽度から重度の関節炎に至るまで、それ自体、様々な態様で現れ、関節炎は、通常、指及び脊椎を冒す。脊椎が冒される場合、症候は、上記されている、強直性脊椎炎の症候と類似している。本発明を用いて得られたＴＮＦα抗体又はその抗原結合断片は、ＰｓＡの治療のために使用することが可能である。
ＰｓＡは、時々、破壊性関節炎を伴う。破壊性関節炎は、関節を破壊する全般的なびらん性の変形をもたらす過度な骨浸食によって特徴付けられる疾患を表す。一実施形態において、本発明の方法を用いて得られた抗体は、破壊性関節炎を治療するために使用される。
３．反応性関節炎／ライター症候群
腫瘍壊死因子は、ライター症候群とも称される反応性関節炎の病態生理に関与していると推定されている（Ｂｒａｕｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４２（１０）：２０３９）。反応性関節炎（ＲｅＡ）とは、しばしば、腸内感染又は泌尿生殖器感染後に、体内の他の場所に感染を合併する関節炎を表す。ＲｅＡは、しばしば、関節の炎症（関節炎）、尿道炎、結膜炎並びに皮膚及び粘膜の病変を含むある種の臨床症候によって特徴付けられる。さらに、ＲｅＡは、クラミジア、カンピロバクター、サルモネラ又はエルシニアなど、性病への感染又は赤痢感染後に発生し得る。従って、本発明の方法を用いて得られた抗体は、ＲｅＡを治療するために使用され得る。
４．未分化型脊椎関節症
一実施形態において、本発明の方法を用いて得られた抗体は、未分化型脊椎関節症に罹患している対象を治療するために使用される（Ｚｅｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．１８：１８７）。未分化型脊椎関節症を記載するために使用されるその他の用語には、血清反応陰性型少関節炎及び未分化型少関節炎が含まれる。本明細書において使用される未分化型脊椎関節症とは、対象が脊椎関節症に伴う将校の一部のみを示す疾患を表す。この症状は、通常、ＩＢＤ、乾癬又はＡｓ若しくはロイター症候群の古典的な症候を有しない若年成人に観察される。幾つかの事例において、未分化型脊椎関節症は、ＡＳの初期の指標であり得る。一実施形態において、本発明は、未分化型脊椎関節症を治療するために、特許請求の範囲に記載されている方法を用いて得られたＴＮＦα抗体又はその抗原結合断片を投与することを含む。
Ｊ．代謝性疾患
ＴＮＦαは、糖尿病及び肥満などの代謝性疾患を含む様々な疾患の病態生理に関与していると推定されている（Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ ａｎｄ Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ（１９９３）Ｃｅｌｌ ７３：６２５；Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ（２０００；Ｉｎｔ Ｊ Ｏｂｅｓ Ｒｅｌａｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｏｒｄ．２４：１０８５；Ｉｓｈｉｉ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．４９：１６１６）。本明細書において使用される「代謝性疾患」という用語は、生理的機能を実施するために必要とされる物質を身体が処理する態様に影響を与える疾病又は疾患を表す。代謝性疾患の例には、糖尿病及び肥満が含まれるが、これらに限定されない。本発明の一実施形態において、「代謝性疾患」という用語は、生理的機能を実施するために必要とされる物質を身体が処理する態様に影響を与える疾患（自己免疫性糖尿病を除く。）を表すために使用される。
本発明は、このような代謝性疾患に罹患している対象中のＴＮＦα活性を阻害するための方法であり、代謝性疾患に罹患している対象中のＴＮＦα活性が阻害されるように、抗体、抗体部分を対象に投与することを含む方法を提供する。ＴＮＦα抗体は、代謝性疾患を発症するリスクがある対象を治療するためにも使用することができる。
代謝性疾患は、しばしば、関節リウマチなどの関節炎の形態を伴い得る。一実施形態において、抗体などのＴＮＦα阻害剤は、関節リウマチを伴う代謝性疾患に罹患している対象中で、複数可変投薬計画において使用される。別の実施形態において、本発明は、糖尿病又は肥満を伴う疾患を治療するために、ＴＮＦα抗体を投与することを含む。
代謝性疾患の治療に関するＴＮＦα抗体の効力を評価するための動物モデルの例には、ＮＯＤトランスジェニックマウス、Ａｋｉｔａマウス、ＮＳＹトランスジェニックマウス及びｏｂ／ｏｂマウスが含まれる（Ｂａｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．８９：１７４；Ｈａｓｅｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｔｏｈｏｋｕ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９８：２３３；Ｍａｋｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９８０）：Ｅｘｐ．Ａｎｉｍ．２９：１；Ｋｏｌｂ（１９８７）Ｄｉａｂｅｔｅｓ／Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３：７５１；Ｈａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．５０：１２８２；Ｃｏｌｅｍａｎ，（１９７８）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，１４：１４１；Ｂａｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｂｅｓｉｔｙ ６：１１参照）。血管炎を研究するために使用される動物モデルの例には、マウスＨＳＶモデル（ベーチェット病）、マウスＬ．カゼイモデル（川崎病）及びマウスＡＮＣＡモデル（川崎病）が含まれる。血管炎の他のモデルには、マウスのＭｃＨ５−ｌｐｒ／ｌｐｒ系統（Ｎｏｓｅ ｅｔ ａｌ（１９９６）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１４９：１７６３）及びＳＣＧ／Ｋｊ系統（Ｋｉｎｊｏｈ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ９０：３４１３）が含まれる。これらのマウス系統は、半月体形成性糸球体腎炎並びに脾臓、胃、心臓、子宮及び卵巣の小動脈及び細動脈の壊死性血管炎を自発的に発症する。これらの動物は、高ガンマグロブリン血症及びミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）と反応するＡＮＣＡ自己抗体を生じる。さらに、ヒトＭＰＯによるラットの免疫化は、ＡＮＣＡ関連の壊死性半月体形成性糸球体腎炎をもたらす（Ｂｒｏｕｗｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：９０５）。
代謝性疾患は、生理的機能を実施するために必要とされる物質を身体が処理する態様に影響を与える。本発明の多数の代謝疾患は、ある種の特徴を共有する。すなわち、それらは、インシュリン抵抗性、血糖を制御する能力の欠如、体重増加及び肥満度指数の増加を伴う。代謝性疾患の例には、糖尿病及び肥満が含まれる。糖尿病の例には、１型糖尿病、２型糖尿病、糖尿病性神経障害、末梢性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性潰瘍、網膜症潰瘍、糖尿病性脈管障害及び肥満が含まれる。ＴＮＦα抗体の投与を含む複数可変投薬法を用いて治療することができる代謝性疾患の例は、以下でより詳しく記載されている。
１．糖尿病
腫瘍壊死因子は、糖尿病の病態生理への関与が推定されている（例えば、Ｎａｖａｒｒｏ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ．４２：５３；Ｄａｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）ＤｉａｂｅｔｅｓＣａｒｅ．２６：２０１５；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＪＴｏｎｇｊｉ Ｍｅｄ Ｕｎｉｖ．１９：２０３；Ｂａｒｂｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｍ ＪＨｙｐｅｒｔｅｎｓ．１６：５３７参照）。例えば、ＴＮＦαは、インシュリン抵抗性に関する生態病理への関与が推測されている。胃腸の癌を有する患者中の血清ＴＮＦレベルはインシュリン抵抗性と相関することが見出されている（例えば、ＭｃＣａＩｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．７９：１３６１参照）。
本明細書において互換的に使用される「糖尿病」又は「糖尿病性疾患」又は「真性糖尿病」という用語は、血液中の糖（グルコース）の上昇したレベルを特徴とする疾病を表す。糖尿病は、少なすぎるインシュリン（血糖を制御するために、膵臓によって産生される化学物質）、インシュリンへの抵抗性又は両者によって引き起こされ得る。糖尿病には、本疾患の２つの最も一般的な種類（すなわち、１型糖尿病と２型糖尿病）が含まれ、何れも、身体がインシュリンを制御できないことに起因する。インシュリンは、血中の血糖（グルコース）の増加したレベルに応答して、すい臓によって放出されるホルモンである。
本明細書において使用される「１型糖尿病」という用語は、血糖レベルを適切に制御するには、すい臓のインシュリン産生が少なすぎる場合に発生する慢性疾患を表す。１型糖尿病は、インシュリン依存性真性糖尿病、ＩＤＭＭ、若年発症糖尿病及び糖尿病１型とも称される。１型糖尿病は、その後にインシュリン欠損を伴う、すい臓のβ細胞の進行性自己免疫性破壊の結果である。
「２型糖尿病」という用語は、多くの場合、身体がインシュリンに良好に反応しなくなるために、すい臓が血液のグルコースレベルを正常に保つのに十分なインシュリンを産生しなくなる場合に起こる慢性疾患を表す。２型糖尿病は、非インシュリン依存性真性糖尿病ＮＤＤＭ及び糖尿病２型とも称される。
糖尿病は、糖負荷試験を施すことによって診断することができる。臨床的には、糖尿病は、しばしば、幾つかの基礎的カテゴリーに分類される。これらのカテゴリーの主な例には、自己免疫性真性糖尿病、非インシュリン依存性真性糖尿病（１型ＮＤＤＭ）、インシュリン依存性真性糖尿病（２型ＩＤＤＭ）、非自己免疫真性糖尿病、非インシュリン依存性真性糖尿病（２型ＮＩＤＤＭ）及び若年成人発症型糖尿病（ＭＯＤＹ）が含まれる。しばしば二次的と称されるさらなるカテゴリーは、糖尿病の症候群を発症させる又は発症を可能とする幾つかの識別可能な症状によってもたらされる糖尿病を表す。二次的カテゴリーの例には、すい臓病によって引き起こされる糖尿病、ホルモン異常、薬物又は化学物質によって誘導される糖尿病、インシュリン受容体異常によって引き起こされる糖尿病、遺伝的症候群を伴う糖尿病及び他の原因の糖尿病が含まれる（例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ（１９９６）１４ｔｈ ｅｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ参照）。
糖尿病は、しばしば、食事制限、インシュリン投薬及び本明細書に記載されている様々な薬物療法を用いて治療される。従って、ＴＮＦα抗体は、一般に糖尿病と関連する代謝性疾患及び疼痛を治療するために一般的に使用される薬剤と組み合わせて投与することもできる。
さらに、本明細書において使用される「糖尿病と関連する疾患」という用語は、糖尿病に一般的に付随し又は糖尿病と関連する症状及びその他の疾病を表す。糖尿病に付随する疾患の例には、例えば、高血糖、高インシュリン血症、高脂血症、インシュリン抵抗性、グルコース代謝障害、肥満、糖尿病性網膜症、黄斑変性、白内障、糖尿病性腎症、糸球体硬化症、糖尿病性神経障害、勃起不全、月経前緊張症、血管再狭窄、潰瘍性大腸炎、冠動脈心疾患、高血圧、狭心症、心筋梗塞、発作、皮膚及び結合組織の疾患、足部潰瘍、代謝性アシドーシス、関節炎及び骨粗しょう症が含まれる。
糖尿病は、前述のカテゴリー中に現れ、以下の節で論述されている幾つかの合併症を引き起こし得る。従って、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、糖尿病を治療するために使用することができる。一実施形態において、ＴＮＦα抗体又はその抗原結合断片は、上記カテゴリーと関連する糖尿病を治療するために使用される。別の実施形態において、本発明は、糖尿病を伴う疾患を治療するために、ＴＮＦα抗体を投与することを含む。糖尿病は、以下のカテゴリーを含む、糖尿病と関連する多くの合併症及び症状として現れる。
ａ．糖尿病性神経障害及び末梢性神経障害
腫瘍壊死因子は、糖尿病性神経障害及び末梢性神経障害の病態生理に関与していると推定されている（Ｂｅｎｊａｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ．２４：７５３；Ｑｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ４１：１３２ｌ；Ｐｆｅｉｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｈｏｒｍ Ｍｅｔａｂ Ｒｅｓ．２９：１１１）。
本明細書において使用される「神経障害」という用語（糖尿病性の神経損傷とも称される。）は、高血糖（高い血糖レベル）の結果として神経が損傷される糖尿病の一般的な合併症を表す。遠位の感覚運動性多発性神経障害、局所的運動性神経障害及び自律神経障害などの様々な糖尿病性神経障害が認められる。
本明細書において使用される「末梢性神経障害」という用語（末梢性神経炎及び糖尿病性神経障害としても知られる。）は、神経が脳及び脊髄から情報を伝達できないこと、並びに神経が脳及び脊髄へ情報を伝達できないことを表す。末梢性神経障害は、疼痛、感覚の喪失及び筋肉の調節不能などの症候を引き起こす。幾つかの事例では、神経が血管、腸機能及びその他の臓器を調節できないことによって、異常な血圧、消化及び他の基本的な非随意的プロセスの喪失がもたらされる。末梢性神経障害は単一の神経若しくは神経群に対する損傷を伴い得（単神経障害）、又は複数の神経に影響を冒し得る（多発性神経障害）。
交感神経及び副交感神経の小さな有髄繊維及び無髄繊維に影響を与える神経障害は、「末梢性神経障害」として知られている。さらに、末梢性神経障害（末梢性神経炎及び糖尿病性神経障害としても知られる。）の関連疾患は、神経が脳及び脊髄へ情報を伝達できないこと、並びに神経が脳及び脊髄から情報を伝達することができないことを表す。これは、疼痛、感覚の喪失及び筋肉の調節不能などの症候を引き起こす。幾つかの事例では、神経が血管、腸機能及びその他の臓器を調節できないことによって、異常な血圧、消化及び他の基本的な非随意的プロセスの喪失がもたらされる。末梢性神経障害は単一の神経若しくは神経群に対する損傷を伴い得（単神経障害）、又は複数の神経を冒し得る（多発性神経障害）。
「糖尿病性神経障害」という用語は、高血糖（高い血糖レベル）の結果として神経が損傷を受ける糖尿病の一般的な合併症を表す。糖尿病性神経障害は、神経障害及び糖尿病性の神経損傷とも称される。遠位の感覚運動性多発性神経障害、局所的運動性神経障害及び自律神経障害などの様々な糖尿病性神経障害が認められる。
ｂ．糖尿病性網膜症
腫瘍壊死因子は、糖尿病性網膜症の病態生理に関与していると推定されている（Ｓｃｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ ＭｉｃｒｏＢｉｏｌ．１１：１７１）。本明細書において使用される「糖尿病性網膜症」という用語は、長期の糖尿病によって引き起こされる眼の網膜に対する進行性の損傷を表す。糖尿病性網膜症には、増殖性網膜症が含まれる。次いで、増殖性神経障害は、新血管新生、網膜周囲の出血（ｐｅｒｔｉｎａｌ ｈｅｍｍｏｒｒｈａｖｅ）及び網膜剥離を含む。
進行した網膜症では、網膜の表面上で、小血管が増殖する。これらの血管は脆く、出血する傾向があり、網膜周囲（ｐｅｒｅｔｉｎａｌ）の出血を引き起こし得る。出血は、視界をぼやけさせる場合があり、出血が再吸収されるにつれて、繊維性組織が形成され、網膜剥離及び失明が起こりやすくなる。さらに、糖尿病性網膜症には、新血管新生、網膜周囲の出血及び網膜剥離を含む増殖性網膜症が含まれる。糖尿病性網膜症は、網膜の層とともに起こる変化を伴う「非増殖性網膜症（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）」も含まれる。
ｃ．糖尿病性潰瘍及び網膜症潰瘍
腫瘍壊死因子は、糖尿病性潰瘍の病態生理に関与すると推定されている（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６４：６１４；Ｎａｖａｒｒｏ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ．４２：５３；Ｄａｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ．２６：２０１５；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ ＴｏｎｇｊｉＭｅｄＵｎｉｖ．１９：２０３；Ｂａｒｂｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｍ ＪＨｙｐｅｒｔｅｎｓ．１６：５３７；Ｖｅｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．３６：８１９；Ｗｅｓｔａｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２１：１７１０参照）。
本明細書において使用される「糖尿病性潰瘍」という用語は、糖尿病の合併症の結果として起こる潰瘍を表す。潰瘍は、炎症性、感染性、悪性症状又は代謝性疾患によって引き起こされる、皮膚又は粘膜上のクレーター様病変である。典型的には、糖尿病性潰瘍は、手足及び四肢、より典型的には、足に見出され得る。神経障害及び血行不全などの糖尿病性症状によって引き起こされるこれらの潰瘍は、虚血及び創傷治癒不良をもたらし得る。より大規模な潰瘍は、骨髄炎へ進行し得る。一旦、骨髄炎が発症したら、抗生物質のみで根絶することは困難であり得、切断が必要である場合があり得る。
本明細書において使用される「網膜症潰瘍」という用語は、眼及び眼の網膜への損傷を引き起こし、又はもたらす潰瘍を表す。網膜症潰瘍は、網膜出血などの症状を含み得る。
ｄ．糖尿病性大脈管障害（Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｍａｃｒｏｖａｓｃｕｌｏｐａｔｈｙ）
腫瘍壊死因子は、糖尿病性大脈管障害の病態生理に関与すると推定されている（Ｄｅｖａｒａｊ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１０２：１９１；Ｈａｔｔｏｒｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ．４６：１８８；Ｃｌａｕｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｐａｔｈｏｌ．８：１４５）。「大血管性疾患（ｍａｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｅａｓｅ）」とも称される本明細書において使用される「糖尿病性大脈管障害」という用語は、糖尿病の結果として起こる血管の病気を表す。糖尿病性大脈管障害合併症は、例えば、巨大な血管中に脂肪及び血餅が蓄積し、血管壁に付着した場合に起こる。糖尿病性大脈管障害には、冠疾患、脳血管疾患及び末梢性血管疾患、高血糖及び心血管疾患並びに発作などの疾病が含まれる。
２．肥満
腫瘍壊死因子は、肥満の病態生理に関与すると推定されている（例えば、Ｐｉｈｌａｊａｍａｋｉ Ｊ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｏｂｅｓ Ｒｅｓ．１１：９１２；Ｂａｒｂｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｍ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．１６：５３７；Ｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．（２００３）ＪＮｕｔｒ．１３３：２１２５参照）。本明細書において使用される「肥満」という用語は、対象が除脂肪体重に比して体脂肪を過剰に有する状態を表す。一実施形態において、肥満は、個体の体重が、個体の身長に対して望ましい最大値を少なくとも約２０％又はそれ以上上回る状態を表す。成人が１００ポンドを超えて太りすぎている場合には、「病的肥満」と考えられる。別の実施形態において、肥満は３０ｋｇ／ｍ２を超えるＢＭＩ（肥満度指数）として定義される。肥満は、ヒトが病気になるリスク並びに糖尿病、発作、冠動脈疾患、高血圧、高コレステロール及び腎臓及び胆嚢疾患による死を増加させる。肥満は、癌の幾つかの種類に対するリスクも増大させ得、骨関節炎及び睡眠時無呼吸の発症に対するリスク因子であり得る。
Ｋ．貧血
ＴＮＦαは、幅広い貧血の病態生理に関与していると推定されている（例えば、Ｊｏｎｇｅｎ−Ｌａｖｒｅｎｃｉｃ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２４：１５０４；Ｄｅｍｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ａｎｎ Ｈｅｍａｔｏｌ．８１：５６６；ＤｉＣａｔｏ（２００３）Ｔｈｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ ８（ｓｕｐｐｌ １）：１９）。本発明は、貧血に罹患している対象中のＴＮＦα活性を阻害するための方法であり、貧血に罹患している対象中のＴＮＦα活性が阻害されるように、抗体、抗体部分を対象に投与することを含む方法を提供する。一実施形態において、貧血は関節リウマチを伴う。
本明細書で使用される「貧血」という用語は、循環している赤血球の異常に低い数又は血液中のヘモグロビンの減少した濃度を表す。関節リウマチに関連する貧血の例には、例えば、慢性疾患の貧血、鉄欠乏性貧血及び自己免疫性溶血性貧血が含まれる。一実施形態において、本発明は、関連する貧血、例えば、関節リウマチに関連する貧血、感染及び慢性炎症性疾患の貧血、鉄欠乏性貧血、自己免疫性溶血性貧血、骨髄癆性貧血、再生不良性貧血、低形成性貧血、赤芽球癆及び腎不全又は内分泌疾患を伴う貧血、巨赤芽球貧血、ヘム又はグロビン合成の欠損、赤血球の構造的欠陥によって引き起こされる貧血（例えば、鎌形赤血球貧血）並びに鉄芽球性貧血などの不明な起源の貧血、マラリア、トリパノソーマ症、ＨＩＶ、肝炎ウイルス又はその他のウイルスなどの慢性的感染症を伴う貧血、並びに骨髄欠乏によって引き起こされる骨髄癆性貧血を治療する方法を提供する。
貧血を研究するために使用される動物モデルの例には、ペプチドグリカン−多糖ポリマーを接種されたラットが含まれる（Ｃｏｃｃｉａ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ．２９：１２０１−１２０９参照）。疼痛を研究するために使用される動物モデルの例は本分野において周知であり、ラット坐骨神経結紮モデル及びラット分節状脊髄神経結紮モデルが含まれる（Ｂｅｎｎｅｔｔ ａｎｄ Ｚｉｅ，（１９８８）Ｐａｉｎ．３３：８７−１０７；Ｋｉｍ ａｎｄ Ｃｈｕｎｇ，（１９９２）Ｐａｉｎ ５０：３５５−３６３参照）。
Ｌ．疼痛
ＴＮＦαは、様々な疼痛症候群の病態生理に関与していると推定されている（例えば、Ｓｏｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．８１：２５５；Ｈｕｙｇｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ Ｉｎｆｌａｍｍ．１１：４７；Ｐａｒａｄａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：１８４７参照）．本明細書において使用される「疼痛」という用語は、疼痛の全ての種類を表す。本用語は、神経因性疼痛及び術後痛、慢性腰痛、群発性頭痛、ヘルペス神経痛、幻肢痛、中枢性疼痛、歯痛、オピオイド抵抗性疼痛、内臓痛、手術痛、骨損傷痛、分娩及び出産時の痛み、やけどに起因する疼痛（日焼けを含む。）、産後痛、偏頭痛、狭心症の痛み、及び膀胱炎を含む泌尿生殖路関連痛などの急性及び慢性疼痛を表すものとする。本用語は、侵害受容性疼痛又は侵害受容も含む。
本発明は、このような疼痛疾患に罹患している対象中のＴＮＦα活性を阻害するための方法であり、疼痛に罹患している対象中のＴＮＦα活性が阻害されるように、抗体、抗体部分を対象に投与することを含む方法を提供する。疼痛は、侵害受容性疼痛及び神経因性疼痛など、様々な方法で定義されてきた。最も一般的に経験される疼痛の形態は、神経末端に対する刺激の効果として定義され得、これは、大脳への活動電位の伝達をもたらす。疼痛には、一般に、例えば、関節リウマチなどの炎症性疾患も伴う。一実施形態において、本発明の抗体は、関節リウマチを伴う疼痛に罹患している対象を治療するために使用される。ＴＮＦα活性が有害である疼痛罹患の例は、以下でさらに論述されている。
１．神経因性疼痛
腫瘍壊死因子は、神経因性疼痛の病態生理に関与していると推定されている（Ｓｏｍｍｅｒ（１９９９）Ｓｃｈｍｅｒｚ．１３：３１５；Ｅｍｐｌ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．５６：１３７１；Ｓｃｈａｆｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ．２３：３０２８参照）。本明細書において使用される「神経因性疼痛」という用語は、神経、脊髄又は脳への傷害に起因し、しばしば、神経の過敏を伴う疼痛を表す。神経因性疼痛の例には、慢性腰痛、関節炎を伴う疼痛、癌関連の疼痛、ヘルペス神経痛、幻肢痛、中枢性疼痛、オピオイド抵抗性神経因性疼痛、骨損傷疼痛並びに分娩及び出産時の疼痛が含まれる。神経因性疼痛の他の例には、術後痛、群発性頭痛、歯痛、手術痛、重度の（例えば、第３度の）やけどから生じる疼痛、出産後の疼痛、狭心症の痛み、泌尿生殖路関連の疼痛（膀胱炎を含む。）が含まれる。
神経因性疼痛は、侵害受容性疼痛とは区別される。侵害受容機構を伴う疼痛の持続時間は、通常、組織修復の期間に限定され、一般に、利用可能な鎮痛剤又はオピオイドによって緩和される（Ｍｙｅｒｓ（１９９５）Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ２０：１７３）。神経因性疼痛は、典型的には、長期間持続し、又は慢性であり、しばしば、最初の急性組織傷害から何日も又は何ヶ月も後に発症する。神経因性疼痛は、持続的で、自発的な疼痛及び（通常は、痛みを感じない刺激に対する有痛性の応答）異痛症を含み得る。神経因性疼痛は、ピンの穿刺など、通常はささいな有痛性刺激に対して、増強された応答が存在する過敏症によっても特徴付けられ得る。侵害受容性疼痛とは異なり、神経因性疼痛は、一般に、オピオイド治療に対して抵抗性である（Ｍｙｅｒｓ、上記、１９９５）。従って、本発明の方法を用いて得られた抗体は、神経因性疼痛を治療するために使用され得る。
２．侵害受容性疼痛
本明細書において使用される「侵害受容性疼痛」という用語は、正常な神経経路を通じて伝達される疼痛、すなわち、身体への傷害によって引き起こされる疼痛を表す。侵害受容性疼痛には、体性感覚及び疼痛の正常な機能が含まれ、差し迫った組織損傷を対象に知覚させる。侵害受容経路は、対象の保護のために存在する（例えば、やけどに応答して経験される疼痛）。侵害受容性疼痛には、骨痛、内臓痛及び軟組織に伴われる疼痛が含まれる。
腫瘍壊死因子は、内臓の疼痛の病態生理に関与すると推定されている（Ｃｏｅｌｈｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７９：Ｇ７８１；Ｃｏｅｌｈｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｂｕｌｌ．５２：２２３参照）。内臓痛は、Ａδ及びＣ神経線維上の受容体によって媒介される侵害受容性疼痛を表すために使用される。Ａδ及びＣ神経線維とは、皮膚、骨、結合組織、筋肉及び内臓中に位置する神経線維である。内臓痛の分布は曖昧であり、痙攣性であり得、通常、深い、疼くような、絞るような、疝痛性と記載される。内臓痛の例には、心臓発作と関連する疼痛（この場合、内臓痛は腕、首及び／又は背中に感じられ得る。）及び肝皮膜痛（この場合、内臓痛は、背中及び／又は右の肩に感じられ得る。）が含まれる。従って、本発明を用いて得られた抗体は、内臓痛を治療するために使用され得る。
Ｍ．肝疾患
ＴＮＦαは、様々な肝疾患の病態生理に関与していると推測されている（例えば、Ｃｏｌｌｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．８５：１９３６；Ｔｉｅｇｓ（１９９７）Ａｃｔａ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｂｅｌｇ．６０：１７６；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｒｅｓ．６：３２１を参照）。本発明は、このような肝疾患に罹患している対象中のＴＮＦα活性を阻害するための方法を提供する。
本明細書において使用される「ＴＮＦα活性が有害である肝疾患」という用語は、本疾患に罹患している患者中でのＴＮＦαの存在が、疾患の病態生理の原因であるか、又は疾患の悪化に寄与している因子であることが示されており、又は疑われている肝臓の疾病及びその他の疾患又は肝臓細胞損傷若しくは胆管疾患に関連する症状を含むものとする。従って、ＴＮＦα活性が有害である肝疾患は、ＴＮＦα活性の阻害が肝疾患の症候及び／又は進行を緩和することが予測される疾患である。一実施形態において、肝疾患は、肝炎、アルコール性肝炎及びウイルス性肝炎を除く、ヒトの肝疾患又は肝臓細胞損傷若しくは胆管疾患に関連する症状を表す。
複数可変投薬法を用いて肝疾患を治療するための薬剤の治療的効力を評価するために使用される動物モデルの例には、チンパンジーＣ型肝炎ウイルスモデルが含まれる（Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６４４１参照）。皮膚及び爪の疾患を研究するために使用される動物モデルの例には、例えば、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスモデル（乾癬）及びスミス系統（ＳＬ）のニワトリ及び色素脱失マウス（白斑）が含まれる（Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ（２０００）Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｓｙｍｐ Ｐｒｏｃ．５：６７；Ａｕｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１４６：１５２９；Ｌｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８６）Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．８７：２９９参照）。
肝疾患には、肝臓が不適切に機能し、又は機能を停止する多くの疾病及び疾患が含まれる。肝細胞傷害には、アルコール性肝硬変、α１アンチトリプシン欠損症、自己免疫性肝硬変、原因不明の肝硬変、劇症肝炎、Ｂ型及びＣ型肝炎並びに脂肪性肝炎が含まれ得る。胆管疾患の例には、嚢胞性繊維症、原発性胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎及び胆管閉塞が含まれる（Ｗｉｅｓｎｅｒ（１９９６）“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｏｎｔｒａ Ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｔｉｍｉｎｇ ｆｏｒ Ｌｉｖｅｒ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ” ｉｎ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｉｖｅｒ，Ｓａｕｎｄｅｒｓ（ｐｕｂｌ．）；Ｂｕｓｕｔｔｉｌ ａｎｄ Ｋｌｉｎｔｍａｌｍ（ｅｄｓ．）Ｃｈａｐｔｅｒ ６；Ｋｌｅｉｎ（１９９８）Ｐａｒｔｉａｌ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ：Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｌｉｖｅｒ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｍｕｓｂｙ（ｐｕｂｌ．）ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ６．ｓｕｐ．ｔｈ Ｅｄ．Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｊ．（ｅｄ））。
「肝炎」という用語は、肝臓の炎症を表す。肝炎は、細菌、ウイルス（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型肝炎など）又は寄生生物を含む様々な生物による感染によって引き起こされ得る。アルコール、薬物又は毒キノコなどの化学的毒素も肝臓を損傷させ、肝臓を炎症状態にすることができる。まれであるが、極めて危険な肝炎の原因は、アセトアミノフェン（Ｔｙｌｅｎｏｌ）の過量服用に由来し、これは致死的であり得る。さらに、体内の免疫細胞は肝臓を攻撃し、自己免疫性肝炎を引き起こし得る。肝炎は、急速に回復し得（急性肝炎）又は長期の病気を引き起こし得る（慢性肝炎）。幾つかの事例では、進行性の肝障害又は肝不全が生じ得る。肝炎の発生率及び重度は、肝障害の原因及び根底に存在する患者中のあらゆる病気など、多くの因子に応じて変動する。
一実施形態において、本発明は、ＴＮＦα活性が有害である肝疾患を治療する方法であり、疾患が治療されるように、誘導用量で、続いて、治療用量で、ＴＮＦα阻害剤の有効量を対象に投与することを含む、方法に関する。一実施形態において、肝疾患は、Ｃ型肝炎ウイルス、自己免疫性肝炎、脂肪肝疾患、Ｂ型肝炎ウイルス、肝毒性及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を含む非アルコール性肝炎からなる群から選択される。肝疾患の例は、以下でさらに記載されている。
１．Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）
腫瘍壊死因子は、Ｃ型肝炎ウイルスの病態生理に関与していると推定されている（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ａｍａｒｏ．（１９９４）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１７９：８４１；Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）ＤｉｇＤｉｓＳｃｉ４２：２４８７；Ｋａｌｌｉｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１１：２６９参照）。「Ｃ型肝炎ウイルス」又は「ＨＣＶ」という用語は、非Ａ非Ｂ型肝炎の原因因子である肝炎ウイルスを記載するために使用される。Ｃ型肝炎ウイルスは、肝臓の炎症を引き起こす。ＨＣＶ感染は、Ｃ型肝炎を引き起こす。急性期のＣ型肝炎は、一般に、Ｂ型肝炎より穏やかであるが、このような感染のより多くの割合が慢性となる。ＨＣＶは、急性肝炎並びに肝硬変及び肝臓癌を含む慢性の肝臓病の主原因である。ＨＣＶは、ウイルスの１つであり（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ）、これらを合わせると、ウイルス性肝炎の症例の大部分を占める。ＨＣＶは、狭い宿主域を有するように見受けられる、フラビウイルス科に属する外被に包まれたＲＮＡウイルスである。本ウイルスの重要な特徴は、そのゲノムの相対的な変異性であり、おそらく、この変異性が慢性的な感染を誘導する高い傾向（８０％）と関連している。ＨＣＶは、疾病の重度及び治療に対する応答を決定する上で重要であり得る幾つかの異なる遺伝子型の群を成す。一実施形態において、本発明は、ＨＣＶを治療するための複数可変投薬法を提供する。
２．自己免疫性肝炎（ＡＩＨ）
腫瘍壊死因子は、自己免疫性肝炎の病態生理に関与すると推定されている（Ｃｏｏｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３０：８５１；Ｊａｚｒａｗｉ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｌｉｖｅｒ Ｔｒａｎｓｐｌ．９：３７７参照）。本明細書において使用される「自己免疫性肝炎」とは、肝臓の正常な細胞を外来組織又は病原体（病原因子）と間違える異常な免疫細胞によって引き起こされる肝臓の炎症によって特徴付けられる肝疾患を表す。自己免疫性肝炎は、治療せずに放置されると、しばしば、高い死亡率を伴う肝実質の進行性破壊の原因となる（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１８：９９８）。自己免疫性肝炎の特徴の１つは、患者血清のほぼ９０％中に循環する自己抗体が存在することである。このような抗体は、自己免疫性肝炎を有する対象を特定するために使用することができる。
患者間の臨床的及び血清学的な差により、ＡＩＨは２つの種類に分類されてきた。１型は、患者の血清中に抗平滑筋（ＳＭＡ）及び／又は抗核抗体（ＡＮＡ）が存在することによって特徴付けられるのに対して、２型患者から得られた血清は抗肝臓腎臓マイクロソーム抗体１型（ＬＫＭ１）を示す（Ｈｏｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，７：１３３３；Ｍａｇｇｉｏｒｅ ｅｔａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｎｕｔｒ．１７：３７６）。ＡＨＩ２型を有する患者の３０％中に、血清学的マーカーである抗肝臓サイトゾル１型抗体（ＬＣ１）が同定されている。さらに、ＬＣ１は、検査された患者の１０％において、唯一の血清学的マーカーであることが判明している（Ｍａｒｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，８：１６６２）．一実施形態において、本発明の方法は、ＡＩＨを治療するために使用される。
３．脂肪肝疾患
腫瘍壊死因子は、脂肪肝疾患の病態生理に関与すると推定されている（Ｖａｌｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ，（２００２）Ｇａｓｔｒｏｅｎｅｒｏｌｏｇｙ １２２：２７４；Ｌｉ ｅｔ ａｌ，（２００３）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３７：３４３参照）。脂肪肝疾患は、脂肪（肝細胞）が肝臓内に過剰に蓄積されている疾病を表す。脂肪肝疾患は、過剰栄養（ｓｕｐｅｒｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）、アルコールの過剰摂取、糖尿病及び医薬の投与による副作用によって引き起こされると考えられている。脂肪肝疾患は、慢性的な肝炎及び肝硬変などの重度の疾病を引き起こし得る。脂肪肝疾患を有する患者では、量が生理的に許容される範囲を超える程度まで、脂肪、特に、中性脂肪が肝細胞中に蓄積する。生化学的な見地から、脂肪肝の判断基準は、中性脂肪の重量が肝組織の湿重量の約１０%（１００ｍｇ/ｇ湿重量）又はそれ以上であるということである。一実施形態において、本発明の方法は、脂肪肝疾患を治療するために使用される。
４．Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）
腫瘍壊死因子は、Ｂ型肝炎ウイルスの病態生理に関与すると推定されている（Ｋａｓａｈａｒａ ｅｔ ａｌ，（２００３）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７７：２４６９；Ｗａｎｇ（２００３）Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．９：６４１ ；Ｂｉｅｒｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７７：４０３３参照）。「Ｂ型肝炎ウイルス」（ＨＢＶ）という用語は、ヒトにおいてウイルス性Ｂ型肝炎を産生するウイルス（血清ウイルス肝炎）を記載するために使用される。これは、短い潜伏期間を有するＡ型肝炎ウイルス（感染性肝炎ウイルス）とは対照的に、長い潜伏期間（約５０から１６０日）を有するウイルス性疾患である。Ｂ型肝炎ウイルスは、通常、感染した血液若しくは血液誘導体の注射によって、又は、単に、汚染された針、ランセット又はその他の機器を使用することによって伝達される。臨床的に及び病理学的に、本疾患は、ウイルス性Ａ型肝炎と似ているが、交叉保護免疫は存在しない。ウイルス抗原（ＨＢＡｇ）は、注射後に、血清中に見出される。
Ｂ型肝炎ウイルスは、極めて高い割合でヒトに感染する。Ｂ型肝炎に感染した状態となった多くの人々は、６ヶ月以内にウイルスを除去し、短い感染は、Ｂ型肝炎の「急性」症例として知られる。少なくとも約３億人がＨＢＶの慢性的保因者と推定されている。本ウイルスによる感染は、インフルエンザ様の弱い症候から死を含む、幅広い臨床的症候をもたらす。一実施形態において、本発明の複数可変投薬法は、ＨＢＶ感染を治療するために使用される。
５．肝毒性
腫瘍壊死因子は、肝毒性の病態生理に関与していると推測されている（Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２５：１３３；Ｌｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ（２０００）Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．９１９：２１４；Ｓｉｍｅｏｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｔｏｘｉｃｏｌ Ａｐｐｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１７７：１１２参照）。肝毒性という用語は、医薬及びその他の化学物質又は薬物によって引き起こされる肝障害を表す。対象中の肝毒性を特定するための最も優れた指標は、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノ転移酵素）、ＡＬＴ（アラニンアミノ転移酵素）及びＧＯＴ（グルタミン酸オキサロ酢酸転移酵素）などの、血中のある種の酵素測定値の上昇である。
肝毒性は、恒常的な傷害及び死をもたらし得る。肝毒性の初期症候には、急性の胃腸症候（例えば、重度の下痢）が含まれ得る。肝毒性の第二期は、症候の軽減によって特徴付けられる。この見かけ上の軽減の間に、肝損傷の生化学的兆候が現れる。第二期の間には、乏尿（減少した尿排出量）が一般的である。第三期（顕在的な肝障害の期間）は、化学物質の接種から３ないし５日後に、臨床的に明白となり、黄疸の出現を伴う。腎不全も起こり得る。化学的に誘導された（薬物によって誘導された）肝炎の症候は、感染性肝炎の症候と類似している。一実施形態において、本発明の方法は、肝毒性を治療するために使用される。
６．肝不全（例えば、慢性肝不全）
腫瘍壊死因子は、肝不全（例えば、慢性肝不全）の病態生理に関与すると推定されている（Ｔａｋｅｎａｋａ ｅｔ ａｌ，（１９９８）Ｄｉｇ Ｄｉｓ Ｓｃｉ．４３：８８７；Ｎａｇａｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ．３１：９９７；Ｓｔｒｅｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１１９：４４６）参照）。慢性肝不全を含む肝不全は、通常、何年もの期間にわたって発症し、臓器にゆっくり損傷を与える肝臓への反復的な損傷（アルコールの乱用又は肝炎ウイルスへの感染など）によって引き起こされる。これより一般的ではないが、肝不全は急性であり、日又は週にわたって起こる。急性肝不全の原因には、肝炎ウイルス感染、薬物、妊娠、自己免疫疾患及び肝臓への突発的な血流低下が含まれる。一実施形態において、本発明の方法は、肝不全を治療するために使用される。
７．ＮＡＳＨを含む非アルコール性肝炎
腫瘍壊死因子は、非アルコール性脂肪性肝炎を含む非アルコール性肝炎の病態生理に関与すると推定されている（Ｃｒｅｓｐｏ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．３４：１１５８ Ｊ Ｐｅｓｓａｙｒｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）２８２（２）：Ｇ１９３参照）。「非アルコール性脂肪性肝炎」又は「ＮＡＳＨ」という用語は、過剰なアルコールによって、但し、アルコール乱用の不存在下で誘導されるものと同等である肝臓中の組織学的変化の発達を表す。ＮＡＳＨは、大滴性及び／又は小滴性の脂肪肝、小葉及び門脈の炎症によって、時には、繊維症及び肝硬変を伴うマロリー体によって特徴付けられる。ＮＡＳＨは、一般に、高脂血症、肥満及び２型真性糖尿病も伴う。
脂肪肝及び炎症を特徴付けるさらなる臨床症状には、過度の絶食、空回腸バイパス、総合的な親の栄養、慢性Ｃ型肝炎、ウィルソン病並びにコルチコステロイド、カルシウムチャンネル遮断剤、高用量の合成エストロゲン、メトトレキサート及びアミオダロンから得られるものなどの有害な薬物効果が含まれる。従って、「非アルコール性脂肪肝」という用語は、（ａ）著しいアルコール消費、（ｂ）以前に行われた減量手術、（ｃ）脂肪肝を伴う薬物使用歴、（ｄ）遺伝的肝臓病の兆候又は（ｅ）慢性Ｃ型肝炎感染の不存在と相俟って、これらの生検知見を示す患者を記載するために使用することができる（例えば、Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．５５：４３４；Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｈｅｐａｔｏｌ．１１：７４参照）。一実施形態において、本発明の方法を用いて得られた抗体は、ＮＡＳＨを治療するために使用される。
Ｎ．皮膚及び爪の疾患
腫瘍壊死因子は、皮膚及び爪の疾患の病態生理に関与していると推定されている。一実施形態において、本発明の方法を用いて得られた抗体は、皮膚及び爪の疾患を治療するために投与される。本明細書において互換的に使用される「皮膚疾患」又は「皮膚病」という用語は、炎症の状態を誘導した、傷害性の創傷以外の皮膚の異常を表す。一実施形態において、本発明の皮膚疾患は、皮膚が毛細血管の拡張、白血球の浸潤、発赤、熱及び／又は疼痛によって特徴付けられる炎症性皮膚疾患である。皮膚疾患の例には、乾癬、尋常性天疱瘡、強皮症、アトピー性皮膚炎、サルコイドーシス、結節性紅斑、化膿性汗腺炎（ｈｉｄｒａｄｅｎｉｔｉｓ ｓｕｐｐｕｒａｔｉｖｅ）、扁平苔癬、スウィート症候群及び白斑が含まれるが、これらに限定されない。本明細書において使用される「ＴＮＦα活性が有害である皮膚及び爪の疾患」という用語は、本疾患に罹患している対象中でのＴＮＦαの存在が、疾患（例えば、乾癬）の病態生理の原因であるか、又は疾患の悪化に寄与している因子であることが示されており、又は疑われている皮膚及び／又は爪の疾患並びにその他の疾患を含むものとする。したがって、ＴＮＦα活性が有害である皮膚及び爪の疾患は、ＴＮＦα活性の阻害が疾患の症候及び／又は進行を緩和することが予測される疾患である。特異的な皮膚及び爪の疾患の治療における本発明の抗体、抗体部分及び他のＴＮＦα阻害剤の使用は、以下でさらに論述されている。ある種の実施形態において、本発明の治療方法は、以下に記載されているように、別の治療剤と組み合わせて実施される。一実施形態において、別の治療剤と組み合わせてＴＮＦα抗体を投与することを含む本発明の方法を用いて得られた抗体は、乾癬の治療及び関節炎と関連する乾癬の治療のために使用される。
１．乾癬
腫瘍壊死因子は、乾癬の病態生理に関与すると推定されている（Ｔａｋｅｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ａｒｃｈ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｒｅｓ．２８１：３９８；Ｖｉｃｔｏｒ ａｎｄ Ｇｏｔｔｌｉｅｂ（２００２；Ｊ Ｄｒｕｇｓ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１：２６４）。本明細書において使用される「乾癬」という用語は、上皮性過形成を伴う皮膚疾患を表す。乾癬の例には、慢性尋常性乾癬、滴状乾癬、逆乾癬、膿疱性乾癬、尋常性乾癬及び乾癬性紅皮症が含まれるが、これらに限定されない。乾癬は、しばしば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）及び関節リウマチ（ＲＡ）を含む他の炎症性疾患も伴い得る。
乾癬は、発赤、かゆみ及び皮膚上の厚く、乾燥した銀色の鱗屑の頻繁な発症を特徴とする皮膚の炎症（過敏及び発赤）として記載される。特に、表皮の増殖の一次及び二次的変化、皮膚の炎症性反応並びにリンホカイン及び炎症性因子などの制御分子の発現を伴う病変が形成される。乾癬性皮膚は、表皮細胞の増加した代謝回転、肥厚した表皮、異常な角質化、基底細胞周期の増加をもたらす、表皮中への炎症細胞の浸潤並びに表皮層中への多形核白血球及びリンパ球の浸潤によって、形態学的に特徴付けられる。乾癬は、しばしば、陥凹、爪の分離、肥厚及び脱色を示す爪を伴う。乾癬は、しばしば、他の炎症性疾患、例えば、関節リウマチ、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）及びクローン病を含む関節炎を伴う。乾癬を有する患者の約１／３が、上述のように、凝り、関節の膨潤、疼痛及び低下した可動域を引き起こす乾癬性関節炎（ＰｓＡ）も有する（Ｇｒｅａｖｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３２：５８１）。
乾癬の徴候は、胴、肘、膝、頭皮、皮膚のひだ又は指の爪に最も一般的に見られるが、皮膚の全ての部分を冒し得る。通常、新しい皮膚細胞が下部層から表面に移動するのに、約１ヶ月を要する。乾癬では、このプロセスに、数日を要するに過ぎず、死滅した皮膚細胞の蓄積及び厚い鱗屑の形成をもたらす。乾癬の症候には、銀色の鱗屑で覆われた、乾燥した又は赤い皮膚の斑点、ひび割れ、痛みを伴い得、肘、膝、胴、頭皮及び手の上に通常位置する赤い境界を伴う皮膚の隆起した斑点；吹き出物、皮膚のひび割れ及び皮膚の発赤を含む、皮膚の病変；関節炎、例えば乾癬性関節炎を伴い得る関節疼痛又は痛みが含まれる。
乾癬の治療には、しばしば、局所的なコルチコステロイド、ビタミンＤ類縁体及び局所若しくは経口レチノイド又はこれらの組み合わせが含まれる。一実施形態において、本発明のＴＮＦα抗体は、これらの一般的な治療の１つと組み合わせて、又はこれらの一般的な治療の１つの存在下で投与される。本発明の方法を用いて得られたＴＮＦα抗体と組み合わせることが可能な乾癬治療用のさらなる治療剤は、以下でさらに詳しく記載されている。
乾癬の診断は、通常、皮膚の外観に基づく。さらに、他の皮膚疾患を除外するために、皮膚の生検又は皮膚斑の掻き取り及び培養が必要であり得る。関節痛が存在し、持続的である場合には、乾癬性関節炎をチェックするために、Ｘ線を使用し得る。
対象中の感染の改善は、対象の乾癬の面積と重症度指数（ＰＡＳＩ）によってモニターすることができる。ＰＡＳＩを求めるための方法は、「Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ ａｎｄ Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ（１９７８）Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａ １５７：２３８」及び「Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ａｒｃｈ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １２５：２３５」に記載されている。簡潔に述べると、指数は、５ポイントのスケール（０＝症候なし、１＝僅か、２＝中度、３＝顕著、４＝極めて顕著）を用いて、頭、上肢、胴及び下肢を含む４つの解剖学的部位を、紅斑、硬結及び剥離に関して評価することに基づく。所定の解剖学的部位中の病変の程度に基づいて、冒された領域に、数値が割り振られる（０＝０；１＝＜１０％；２＝１０−２９％；３＝３０−４９％；４＝５０−６９％；５＝７０＝８９％；６＝９０−１００％）。次いで、ＰＡＳＩスコアが計算される（ＰＡＳＩスコアの可能な範囲は０．０から７２．０であり、最高のスコアが最も重い程度の完全な紅皮症に相当する。）。
本発明の一実施形態において、ＴＮＦα抗体は、乾癬（慢性尋常性乾癬、滴状乾癬、逆乾癬、膿疱性乾癬、尋常性天疱瘡、乾癬性紅皮症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を伴う乾癬及び関節リウマチ（ＲＡ）を伴う乾癬）を治療するために使用される。別の実施形態において、アダリムマブなどのＴＮＦα抗体は、ＰｓＡとともに乾癬を有する対象を治療するために使用される。本発明の治療方法に含まれる乾癬の具体的な種類は、以下に詳述されている。
ａ．慢性尋常性乾癬
腫瘍壊死因子は慢性尋常性乾癬の病態生理に関与していると推定されている（Ａｓａｄｕｌｌａｈ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｒ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１４１：９４）。慢性尋常性乾癬（Ｃｈｒｏｎｉｃ ｐｌａｑｕｅ ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）（尋常性乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）とも称される。）は、乾癬の最も一般的な形態である。慢性尋常性乾癬は、コインサイズからずっと大きなものまで、皮膚の上昇した赤みを帯びた斑点によって特徴付けられる。慢性尋常性乾癬では、斑点は単一又は複数であり得、それらは、数ミリメートルから数センチメートルのサイズで変動し得る。斑点は、通常赤く、うろこ状の表面を伴い、やさしく引っ掻いたときに、光を反射して、「銀状」効果をもたらす。慢性尋常性乾癬由来の病変（しばしば、対称的である。）は全身に発生するが、膝、肘、腰仙領域、頭皮及び爪を含む伸筋表面に多発する。時折、慢性尋常性乾癬は、陰茎、外陰部及び湾曲部の上に発生し得るが、通常、鱗屑は存在しない。慢性尋常性乾癬を有する患者の診断は、通常、上記の臨床的特徴に基づき、特に、慢性尋常性乾癬中の病変の分布、色、典型的な銀色の鱗屑が慢性尋常性乾癬に特徴的である。
ｂ．滴状乾癬
滴状乾癬とは、特徴的な水滴形状の鱗状斑を有する乾癬の形態を表す。滴状乾癬の紅斑の後には、一般に、感染、特に、連鎖球菌の咽喉感染が起こる。滴状乾癬の診断は、通常、皮膚の外見及び咽頭炎の最近の既往歴がしばしば存在するという事実に基づく。
ｃ．逆乾癬
逆乾癬は、患者が赤く、炎症を起こした皮膚の滑らかで、一般に水分を含んだ領域を有する乾癬の形態であり、尋常性乾癬に伴う鱗屑とは異なる。逆乾癬は、間擦性乾癬（ｉｎｔｅｒｔｉｇｉｎｏｕｓ ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）又は弯曲性乾癬（ｆｌｅｘｕｒａｌ ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）とも称される。逆乾癬は、多くは、腋窩、鼠径部、乳房の下並びに性器及び臀部周囲のその他の皮膚のひだに発生し、発症部位の故に、摩擦及び発汗は罹患部位に刺激を与え得る。
ｄ．膿疱性乾癬
膿疱性乾癬（掌蹠乾癬（ｐａｌｍａｒ ｐｌａｎｔａｒ ｐｓｏｒｉａｓｉｓ））は、サイズ及び位置が異なるが、手と足にしばしば発生する膿疱を引き起こす乾癬の形態である。水疱は限局し、又は身体の広範囲に広がり得る。膿疱性乾癬は、圧痛性及び有痛性であり得、発熱を生じ得る。
ｅ．その他の乾癬疾患。
本発明の方法を用いて得られたＴＮＦα抗体で治療することができる乾癬性疾患の他の例には、乾癬性紅皮症、尋常性、ＩＢＤを伴う乾癬及び関節リウマチを含む関節炎を伴う乾癬が含まれる。
２．尋常性天疱瘡
尋常性天疱瘡は、しばしば、経口粘膜と皮膚を冒す重篤な自己免疫性全身性皮膚病である。尋常性天疱瘡の病態生理は、皮膚及び口腔粘膜デスモソームに誘導された自己免疫性プロセスであると考えられている。その結果、細胞は、互いに接着しない。本疾患は、液体が充填された破裂しやすい大きな水疱として表れ、特徴的な組織的外観を有する。抗炎症剤は、高い死亡率を有するこの疾患に対する唯一の効果的な治療である。尋常性天疱瘡に罹患している患者に発生する合併症は、難治性の疼痛、栄養障害及び液体の喪失並びに感染である。
３．アトピー性皮膚炎／湿疹
アトピー性皮膚炎（湿疹とも称される。）は、かゆみを伴ううろこ状の斑によって分類される慢性皮膚疾患である。湿疹を有する人々は、喘息、花粉症又は湿疹のようなアレルギー性症状の家族歴を有する。アトピー性皮膚炎は、皮膚に発生する過敏症反応（アレルギーと類似する。）であり、慢性的な炎症を引き起こす。炎症によって、皮膚は、かゆみを伴い、うろこ状となる。慢性的な刺激及びひっかきは、皮膚の肥厚を引き起こし、革状外観となる。皮膚の乾燥、水への曝露、温度変化及びストレスのように、環境的刺激物質への曝露は症候を悪化させ得る。
強烈なかゆみ、滲出及び痂皮膚形成を伴う水疱、皮膚の発赤又は水疱周囲の炎症、発疹、乾燥した、革状の皮膚領域、引っ掻きによって生じる皮膚の擦り傷領域、及び耳漏／出血をしばしば含むある種の症候によって、アトピー性皮膚炎を有する対象を同定することができる。
４．サルコイドーシス
サルコイドーシスは、リンパ節、肺、肝臓、眼、皮膚及び／又はその他の組織中に肉芽腫性炎症が生じる疾病である。サルコイドーシスには、皮膚サルコイドーシス（皮膚のサルコイドーシス）及び結節性サルコイドーシス（リンパ節のサルコイドーシス）が含まれる。サルコイドーシスを有する患者は、しばしば、一般的な不快感、不快な状態又は不安感、発熱、皮膚病変を含む症候によって同定することができる。
５．結節性紅斑
結節性紅斑は、皮膚の下、典型的には、前下肢上の圧痛性の赤い結節によって特徴付けられる炎症性疾患を表す。結節性紅斑を伴う病変は、しばしば、平坦であるが堅く、熱い赤色の有痛性塊（概ね幅インチ）として始まる。２、３日以内に、病変は淡紫色となり、その後、数週にわたって、茶色っぽい平坦な斑点へ消滅し得る。
幾つかの事例では、結節性紅斑は、連鎖球菌、コクシジオイデス症、結核、Ｂ型肝炎、梅毒、猫引っ掻き病、野兎病、エルシニア、レプトスピラ症、オウム病、ヒストプラスマ症、単核球症（ＥＢＶ）などの感染症を伴い得る。他の事例では、結節性紅斑は、経口避妊薬、ペニシリン、スルホンアミド、スルホン、バルビツレート、ヒダントイン、フェナセチン、サリチラート、ヨウ化物及びプロゲスチンなどのある種の医薬に対する感受性を伴い得る。結節性紅斑は、しばしば、白血病、サルコイドーシス、リウマチ熱及び潰瘍性大腸炎を含むその他の疾患を伴う。
結節性紅斑の症候は、通常、すねの上に現れるが、病変は、臀部、ふくらはぎ、足首、腿及び上肢を含む身体の他の領域上にも発生し得る。結節性紅斑を有する対象における他の症候には、発熱及び倦怠感が含まれ得る。
６．化膿性汗腺炎
化膿性汗腺炎は、膨張した有痛性の炎症性病変又は塊が、鼠径部中に、時には、腕の下及び乳房の下に発達する皮膚疾患を表す。化膿性汗腺炎は、アポクリン腺の排出口が汗によって封鎖された状態となった場合に、又は不完全な腺の発達のために、正常に排出できない場合に起こる。腺内に捕捉された分泌物は、汗及び細菌を周囲の組織中に押し込み、皮膚の硬結、炎症及び感染を引き起こす。化膿性汗腺炎は、アポクリン腺を含有する身体の領域に限局される。これらの領域は、腋窩部、乳輪、鼠径部、会陰、肛門周囲及びへそ周囲領域である。
７．扁平苔癬
腫瘍壊死因子は、扁平苔癬の病態生理に関与していると推定されている（Ｓｋｌａｖｏｕｎｏｕ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ Ｍｅｄ．２９：３７０）。扁平苔癬は、炎症、かゆみ及び特徴的な皮膚病変をもたらす皮膚及び粘膜の疾患を表す。扁平苔癬には、Ｃ型肝炎又はある種の薬物治療が伴い得る。
８．スウィート症候群
腫瘍壊死因子を含む炎症性サイトカインは、スウィート症候群の病態生理に関与していると推定されている（Ｒｅｕｓｓ−Ｂｏｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．８４：３５６））。Ｒ．Ｄ．Ｓｗｅｅｔによって１９６４年に記載されたスウィート症候群は、突然の発熱、白血球増多及び皮疹によって特徴付けられる。皮疹は、顕微鏡的に、密な好中球浸潤を示す、圧痛性、紅斑性の、境界が明瞭な丘疹及び斑からなる。病変は、あらゆる場所に出現し得るが、顔を含む上半身が好まれる。各病変は、しばしば、偽小胞性又は偽膿疱性と記載されるが、実際には、膿疱性、水疱性又は潰瘍性であり得る。スウィート症候群を有する患者では、しばしば、口及び眼の関与（結膜炎又は上強膜炎）も報告されている。白血病も、Ｓｗｅｅｔ症候群を伴い得る。
９．白斑
白斑は、皮膚の領域からの色素の喪失が存在し、正常な皮膚の質感を伴う不規則な白い斑点をもたらす皮膚症状を表す。白斑を特徴とする病変は、扁平な脱色領域として現れる。病変の縁は、鋭く区切られているが、不規則である。白斑を有する対象中のしばしば冒される領域には、顔、ひじ及び膝、手及び足並びに生殖器が含まれる。
１０．強皮症
腫瘍壊死因子は、強皮症の病態生理に関与していると推定されている（Ｔｕｔｕｎｃｕ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２０（６ Ｓｕｐｐｌ ２８）：Ｓ１４６；Ｍａｃｋｉｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２１：４１；Ｍｕｒｏｔａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４８：１１１７）。強皮症は、皮膚、血管、骨格筋及び内臓の変化によって特徴付けられるびまん性の結合組織疾患を表す。強皮症は、ＣＲＥＳＴ症候群又は進行性全身性硬化症とも称され、一般に、３０歳から５０歳の間の人々が罹患する。女性は、男性に比べて、よりしばしば罹患する。
強皮症の原因は不明である。本疾病は、局所的又は全身的な症候をもたらし得る。本疾病の期間及び重度は、罹患者によって幅広く変動する。皮膚及び他の臓器内への過剰なコラーゲン沈着は症候を引き起こす。皮膚及び冒された臓器内の小さな血管への損傷も起こる。皮膚には、潰瘍、カルシウム沈着及び色素沈着の変化が起こり得る。全身的な特徴には、繊維症並びに心臓、肺、腎臓及び胃腸管の変性が含まれ得る。
強皮症に罹患している患者は、暑さと寒さに応じた、指及び足指の白化、青化又は発赤（レイノー現象）、疼痛、凝り、並びに指及び関節の膨張、皮膚の肥厚並びに光沢のある手及び前腕、食道逆流又は胸焼け、嚥下困難並びに息切れなど、ある種の臨床的な特徴を呈する。強皮症を診断するために使用される他の臨床症候には、上昇した赤血球沈降速度（ＥＳＲ）、上昇したリウマチ因子（ＲＦ）、陽性の抗核抗体検査、タンパク質及び顕微鏡レベルの血液を示す尿検査、繊維症を示し得る胸部Ｘ線並びに拘束性肺疾患を示す肺機能研究が含まれる。
１１．爪の疾患
爪の疾患には、爪のあらゆる異常が含まれる。本明細書において使用される「爪の疾患」又は「爪の病気」という用語は、指の爪又は足指の爪が異常な色、形状、手触り又は厚さになる症状を表す。特異的な爪疾患には、窪み、さじ状爪、ボー線、スプーン状爪、爪甲離床症、黄色爪症、翼状片（扁平苔癬中に見られる。）及び爪甲白斑症が含まれるが、これらに限定されない。窪みは、爪表面上の小さな低下の存在によって特徴付けられる。隆線又は線の上昇が爪に沿って発達し、「縦」又は「横」方向に生じ得る。ボー線は、指の爪の中に「横方向に」（横断して）発生する線状の低下である。爪甲白斑症は、爪の上の白い筋又は点を記載する。さじ状爪は、爪が盛り上がった隆線を有し、薄く、凹面状である指爪の異常な形状である。さじ状爪は、しばしば、鉄欠乏症を伴う。
本発明のＴＮＦα抗体で治療することができる爪の疾患には、乾癬性の爪も含まれる。乾癬性の爪は、乾癬を原因とする爪の変化を含む。幾つかの事例では、乾癬は、爪の中だけに生じ、身体の他の場所には生じない場合があり得る。爪の乾癬性変化は、軽度から重度の範囲にわたり、一般に、爪板、爪床（ｎａｉｌ ｍａｔｒｉｘ）（すなわち、爪がそこから増殖する組織）、爪床（ｎａｉｌ ｂｅｄ）（すなわち、爪の下の組織）及び爪の基部の皮膚の、乾癬への関与の度合いを反映する。乾癬の膿疱性の種類による爪床への損傷は、爪の喪失をもたらし得る。乾癬における爪の変化は、単一に生じ得る、又はまとめて生じ得る一般的なカテゴリーに分類される。乾癬性の爪の１つのカテゴリーでは、おそらくは乾癬によって引き起こされる爪の増殖の欠損のために、爪板は深く窪んでいる。別のカテゴリーでは、爪は、おそらくは、爪床の乾癬性の関与のために、黄色ないし黄色−桃色の脱色を有する。乾癬性の爪の第三のサブタイプは、爪板の下に出現する白色の領域によって特徴付けられる。白い領域は、実際に、空気の泡であり、爪板が爪床から剥離した状態となる地点の標識となる。爪の周囲に、発赤した皮膚にも存在し得る。第四のカテゴリーは、おそらくは、爪床（ｎａｉｌ ｍａｔｒｉｘ）における乾癬の関与のために、黄色がかった斑点中で崩壊する爪板、すなわち爪異栄養症から明らかとなる。第五のカテゴリーは、爪床（ｎａｉｌ ｍａｔｏｒｉｘ）及び爪床（ｎａｉｌ ｂｅｄ）の乾癬の関与のために、爪全体が喪失することによって特徴付けられる。
本発明の方法を用いて得られた抗体は、しばしば扁平苔癬を伴う爪の疾患を治療するためにも使用され得る。扁平苔癬を有する対象中の爪は、しばしば、縦方向の隆線又は翼状片を有する爪板の菲薄化及び表面のでこぼこを示す。
本発明を用いて得られた抗体は、本明細書に記載されているような爪の疾患を治療するために使用することができる。しばしば、爪の疾患には、皮膚疾患が伴う。一実施形態において、本発明は、ＴＮＦα抗体を用いて爪の疾患を治療する。別の実施形態において、爪の疾患には、乾癬などの皮膚疾患を含む別の疾患が伴う。別の実施形態において、爪の疾患を伴う疾患は、乾癬性関節炎を含む関節炎である。
１２．他の皮膚及び爪の疾患
本発明の方法を用いて得られた抗体は、慢性光線過敏性皮膚炎、類天疱瘡及び円形脱毛症などの他の皮膚及び爪の疾患を治療するために使用され得る。慢性光線過敏性皮膚炎（ＣＡＤ）は、光線過敏症皮膚炎／光線性類細網症症候群（ＰＤ／ＡＲ）とも称される。ＣＡＤは、特に、日光又は人工の光に曝露された領域において、皮膚が炎症状態となる症状である。一般に、ＣＡＤ患者は、皮膚と接触したある種の物質、特に、様々な花、木、香水、日焼け止め及びゴム化合物に対してアレルギーを有する。類天疱瘡は、胴体及び四肢上の大きな水疱の形成を特徴とする皮膚疾患を表す。円形脱毛症は、頭皮又はひげの完全な脱毛の丸い斑点によって特徴付けられる脱毛を表す。
Ｏ．脈管炎
ＴＮＦαは、様々な脈管炎の病態生理に関与していると推定されている（例えば、Ｄｅｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｌａｎｃｅｔ．２：７４５参照）。一実施形態において、本発明は、ＴＮＦα活性が有害である脈管炎に罹患している対象中のＴＮＦα活性を阻害するための複数可変投薬法を提供する。
本明細書において互換的に使用される「脈管炎」という用語は、血管の炎症によって特徴付けられる疾患の群を表す。体内の最も大きな血管（大動脈）から皮膚内の最も小さい血管（毛細血管）までの全てのサイズの血管が冒され得る。脈管炎の具体的な種類に従って、冒される血管のサイズは変動する。本明細書において使用される「ＴＮＦα活性が有害である脈管炎」という用語は、本疾患に罹患している対象中でのＴＮＦαの存在が、疾患の病態生理の原因であるか、又は疾患の悪化に寄与している因子であることが示されており、又は疑われている脈管炎を含むものとする。このような疾患は、例えば、本疾患に罹患している対象の生体液中のＴＮＦα濃度の増加（例えば、対象の血清、血漿、滑液中のＴＮＦα濃度の増加）によって明らかとされ得、生体液中のＴＮＦα濃度の増加は、例えば、上記抗ＴＮＦα抗体を用いて検出することが可能である。
ベーチェット病など、ＴＮＦα活性が有害である脈管炎の多数の例が存在する。特異的な脈管炎の治療のための抗体又はその抗原結合部分の使用は、以下でさらに論述されている。ある種の実施形態において、本発明を用いて得られた抗体又は抗体部分は、以下に記載されているように、別の治療剤と組み合わせて対象に投与される。
本発明を用いて得られた抗体又は抗体部分は、ＴＮＦα活性の阻害が脈管炎の症候及び／又は進行を緩和し、又は脈管炎を予防することが予想される、ＴＮＦα活性が有害である脈管炎を治療するためにも使用され得る。脈管炎に罹患し、又は脈管炎を発症するリスクのある対象は、臨床的な症候及び検査を通じて同定することが可能である。例えば、脈管炎を有する対象は、しばしば、好中球の細胞質中のある種のタンパク質に対する抗体、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）を生成する。従って、幾つかの事例において、脈管炎は、ＡＮＣＡの存在を測定する検査（例えば、ＥＬＩＳＡ）によって明らかとなり得る。
脈管炎及びその事象は、疾病の唯一の兆候であり得、又は、別の原発性疾患の続発性成分であり得る。脈管炎は、単一の臓器に限局され得、又は、幾つかの臓器を同時に冒し得、症候群に応じて、全てのサイズの動脈及び静脈が冒され得る。脈管は、体内の全ての臓器を冒し得る。
脈管炎では、通常、血管の管腔が損なわれ、関与する血管によって供給される組織の虚血を伴う。この方法から生じ得る疾患の幅広い範囲は、血管のあらゆる種類、サイズ及び位置（例えば、動脈、静脈、細動脈、細静脈、毛細血管）が関与し得るという事実に起因する。脈管炎は、以下に記載されているように、一般に、冒された血管のサイズに従って分類される。幾つかの小さな及び大きな血管の脈管炎は中型サイズの動脈を含み得るが、大型及び中型の血管脈管炎は、動脈より小さな血管を含まないことに注意すべきである。大型血管の疾患には、巨細胞動脈炎（側頭動脈炎又は頭部動脈炎としても知られる。）、リウマチ性多発性筋痛症及び高安病又は動脈炎（大動脈弓症候群、若年女性動脈炎及び脈なし病としても知られる。）が含まれるが、これらに限定されない。中型血管の疾患には、古典的な結節性多発動脈炎及び川崎病（皮膚粘膜リンパ節症候群としても知られる。）が含まれるが、これらに限定されない。小型血管の疾患の非限定的な例は、ベーチェット病、ウェグナーの肉芽腫症、顕微鏡的多発血管炎、過敏性炎（皮膚脈管炎としても知られる。）、小血管脈管炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、アレルギー性肉芽腫症及び脈管炎（チャーグ・ストラウス症候群としても知られる。）である。他の脈管炎には、単離された中枢神経系脈管炎及び閉塞性血栓血管炎（バージャー病としても知られる。）が含まれるが、これらに限定されない。古典的な結節性多発動脈炎（ＰＡＮ）、顕微鏡的ＰＡＮ及びアレルギー性肉芽腫症は、しばしば、一群にまとめられて、全身性壊死性脈管炎と称される。脈管炎のさらなる記述は、以下に記載されている。
１．巨大血管脈管炎
一実施形態において、本発明を用いて得られたＴＮＦα抗体は、巨大血管脈管炎を有する対象を治療するために使用され得る。本明細書において使用される「巨大血管」という用語は、大動脈及び主要な身体領域に向けて誘導される最大の分岐を表す。巨大血管には、例えば、大動脈及びその分岐並びに対応する静脈、例えば、鎖骨下動脈；腕頭動脈；総頚動脈；無名（ｉｎｎｏｎｉｍａｔｅ；ｉｎｎｏｍｉｎａｔｅ）静脈；内頚静脈及び外頚静脈；肺動脈及び静脈；大静脈；腎動脈及び静脈；大腿動脈及び静脈；並びに頚動脈が含まれる。巨大血管脈管炎の例は、以下に記載されている。
ａ．巨細胞性動脈炎（ＧＣＡ）
腫瘍壊死因子は、巨細胞性動脈炎の病態生理に関与していると推定されている（Ｓｎｅｌｌｅｒ（２００２）Ｃｌｅｖｅ．Ｃｌｉｎ．Ｊ．Ｍｅｄ．６９：ＳＩＩ４０；Ｓｃｈｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．６１：４６３）。巨細胞性動脈炎（ＧＣＡ）は、炎症及び血管、特に、頚部の外頚動脈から分岐する巨大な又は中型の動脈への損傷を伴う脈管炎を表す。ＧＣＡは、側頭動脈炎又は頭部動脈炎とも称され、高齢者における最も一般的な主要な脈管炎である。ＧＣＡに罹患するのは、殆どもっぱら、５０歳以上の個体であるが、４０歳及びそれより若い患者の症例も数多く文献に報告されている。ＧＣＡは、通常、頭蓋外動脈を冒す。ＧＣＡは、側頭動脈を含む頚動脈の分岐を冒し得る。ＧＣＡは、複数の位置の動脈を含み得る全身性疾病でもある。
組織病理学的に、ＧＣＡは、しばしばラングハンス型の巨細胞の形成を伴う血管壁内への炎症性単核細胞の浸潤を有する汎動脈炎である。内膜の増殖、肉芽腫性炎症及び内部の弾性薄膜の断片化が存在する。臓器内の病理学的知見は、関与する血管に関連する虚血の結果である。
ＧＣＡに罹患している患者は、発熱、頭痛、貧血及び高い赤血球沈降速度（ＥＳＲ）を含むある種の臨床症候を示す。ＧＣＡの他の典型的な徴候には、顎又は舌の跛行、頭皮の圧痛、体質的な症候、蒼白な視神経乳頭浮腫（特に、白墨のような白い乳頭浮腫）及び視覚障害が含まれる。診断は、側頭動脈の生検によって確認される。
ｂ．リウマチ性多発性筋痛
腫瘍壊死因子は、リウマチ性多発性筋痛の病態生理に関与すると推定されている（Ｓｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ）４１：４２３；Ｕｄｄｈａｍｍａｒ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｂｒ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．３７：７６６）。リウマチ性多発性筋痛は、中度から重度の筋肉痛を伴い、特に朝に、頚部、肩及び臀部に凝りを伴うリウマチ性疾患を表す。リウマチ性多発性筋痛を有する患者中に循環する単球の大半に、ＩＬ−６及びＩＬ−１β発現も検出されている。リウマチ性多発性筋痛は、血管の炎症であるＧＣＡとは独立に発生し得、又はＧＣＡとともに存在し、若しくはＧＣＡに先行し得る。
ｃ．高安動脈炎
腫瘍壊死因子は、高安動脈炎の病態生理に関与すると推定されている（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ａｎｄ Ｎｕｍａｎｏ（２００２）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．４１：４４；Ｆｒａｇａ ａｎｄ Ｍｅｄｉｎａ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．ＲｅｐＡ：３０）。高安動脈炎は、大動脈及びその主要な分岐の炎症によって特徴付けられる脈管炎を表す。高安動脈炎（大動脈弓症候群、若年女性動脈炎及び脈なし病としても知られる。）は、胸部大動脈及び腹部大動脈並びにその主要な分岐又は肺動脈を冒す。大動脈壁及びその分岐（例えば、頚動脈、無名動脈及び鎖骨下動脈）の繊維性の肥厚は、大動脈弓から生じる血管の管腔サイズの低下をもたらし得る。この症状は、典型的には、腎動脈も冒す。
高安動脈炎は、主として、通常２０から４０歳の、特にアジア家系の若年女性が罹患し、倦怠感、関節痛及び四肢の跛行のゆっくりとした開始が症状として現れ得る。多くの患者は、通常、腕の血圧差を伴う、非対称的に低下した脈を有する。冠動脈及び／又は腎動脈狭窄が起こり得る。
高安動脈炎の臨床的な特徴は、初期の炎症疾患の特徴及び後期疾患の特徴に分類され得る。高安病の初期の炎症性段階の臨床的な特徴は、倦怠感、軽度の発熱、体重減少、筋肉痛、関節痛及び多形性紅斑である。高安病の後期段階は、動脈の繊維性狭窄及び血栓によって特徴付けられる。生じる主な臨床的特徴は、虚血性現象、例えば、弱く、非対称の動脈拍動、腕の間の血圧差、視力障害（例えば、暗点（ｓｃｏｔｏｍａｔａ；ｓｃｏｔｏｍａ）及び半盲）、めまい及び失神を含む他の神経学的特長、不全片麻痺又は発作である。臨床的な特徴は、動脈の狭窄及び血栓に起因する虚血から生じる。
２．中型血管疾患
一実施形態において、本発明を用いて得られたＴＮＦα抗体は、中型血管脈管炎を有する対象を治療するために使用され得る。「中型血管（ｍｅｄｉｕｍ ｖｅｓｓｅｌ）」という用語は、主要な内臓動脈である血管を表すために使用される。中型血管の例には、腸間膜動脈及び静脈、腸骨動脈及び静脈並びに上顎骨動脈及び静脈が含まれる。中型血管脈管炎の例は、以下に記載されている。
ａ．結節性多発動脈炎
腫瘍壊死因子は、結節性多発動脈炎の病態生理に関与していると推定されている（ＤｉＧｉｒｏｌａｍｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６１：６６７）。結節性多発動脈炎又は結節性動脈周囲炎は、小型及び中型の動脈が、異常な免疫細胞によって攻撃されるために、膨潤し、損傷を受けた状態になる重篤な血管疾患である脈管炎を表す。結節性多発動脈炎には、通常、子供より成人がより頻繁に罹患する。適切な血液供給なしに、十分な酸素及び栄養を受領しないので、結節性多発動脈炎は冒された動脈によって供給されている組織に損傷を与える。
結節性多発動脈炎を有する患者において示される症候は、一般に、冒された臓器、多くの場合、皮膚、心臓、腎臓及び神経系に対する損傷から生じる。結節性多発動脈炎の汎発性の症候には、発熱、疲労、虚弱、食欲の低下及び体重減少が含まれる。筋肉の痛み（筋肉痛）及び関節の痛み（関節痛）が一般的である。結節性多発動脈炎を有する対象の皮膚は、発疹、膨潤、潰瘍及び塊（結節性病変）も示し得る。
古典的なＰＡＮ（結節性多発動脈炎）は、腎動脈及び内臓動脈の関与が一般的である小型ないし中型筋肉の動脈炎の全身性動脈炎である。腹部血管は、ＰＡＮ患者の５０％中に、動脈瘤又は閉塞を有する。古典的なＰＡＮには、肺動脈が関与しないが、気管支血管が関与し得る。肉芽腫、著しい好酸球増多症及びアレルギー性素因は、症候群の一部を成さない。あらゆる臓器系が関与し得るが、最も一般的な徴候には、末梢性神経障害、多発単神経炎、腸虚血、腎虚血、精巣痛及び網状皮斑が含まれる。
ｂ．川崎病
腫瘍壊死因子は、川崎病の病態生理に関与すると推定されている（Ｓｕｎｄｅｌ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｒｅｐ．４：４７４；Ｇｅｄａｌｉａ（２００２）Ｃｕｒｒ．ＲｈｅｕｍａｔｏｌＲｅｐ．４：２５）。川崎病の原因は不明であるが、冠動脈の急性炎症を伴い、本疾患に関連する組織の損傷がＴＮＦαなどの炎症促進性因子によって媒介され得ることを示唆している。川崎病は、粘膜、リンパ節、血管の裏打ち及び心臓を冒す脈管炎を表す。川崎病は、しばしば、皮膚粘膜リンパ節症候群、皮膚粘膜リンパ節疾患及び乳児性多発動脈炎とも称される。川崎病に罹患した対象は、しばしば、心筋炎及び心膜炎に至り得る冠動脈を巻き込む脈管炎を発症する。しばしば、急性の炎症が弱まるにつれて、冠動脈は、動脈瘤、血栓を発症し、心筋梗塞に至り得る。
川崎病は、手のひら及び足の裏の浮腫、頚部リンパ節の拡大、ひび割れた唇及び「イチゴ舌」を伴う発熱性の全身性脈管炎である。炎症反応は、全身の血管中に認められるが、標的器官の損傷の最も一般的な部位は冠動脈である。川崎病には、主に、５歳以下の子供が罹患する。発生率が最も高いのは日本であるが、西洋でも、認知数が増大しており、現在では、米国の子供における後天的な心臓病の主原因である。川崎病の最も重大な合併症は、冠動脈炎及び治療を受けていない患者の１／３に発生する動脈瘤の形成である。
３．小型血管疾患
一実施形態において、ＴＮＦα抗体は、小型血管の脈管炎を有する対象を治療するために使用される。「小型血管（ｓｍａｌｌ ｖｅｓｓｅｌ）」という用語は、小動脈、細動脈及び毛細血管を表すために使用される。小動脈は、平滑筋細胞の１又は２層のみを含有し、毛細血管ネットワークに終末し、毛細血管ネットワークと連続している動脈である。細動脈は、毛細血管ネットワークからの血液を静脈及び毛細血管に運搬し、小動脈と細動脈を接続する。小型血管脈管炎の例は、以下に記載されている。
ａ．ベーチェット病
腫瘍壊死因子は、ベーチェット病の病態生理に関与すると推定されている（Ｓｆｉｋａｋｉｓ（２００２）Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．６１：ｉｉ５１−３；Ｄｏｇａｎ ａｎｄ Ｆａｒａｈ（２００２）Ｏｆｔａｌｍｏｌｏｇｉａ．５２：２３）。ベーチェット病は、全身の血管の炎症を伴う慢性疾患である。ベーチェット病は、皮膚病変の様々な種類、関節炎、腸の炎症及び髄膜炎（脳及び脊髄の膜の炎症）も引き起こし得る。ベーチェット病の結果、本疾患を有する対象は、胃腸管、中枢神経系、血管系、肺及び腎臓を含む全身の組織及び臓器中に炎症を有し得る。ベーチェット病は、女性よりも男性に３倍多く発生し、地中海東部及び日本に最も多く見られる。
ベーチェット病を有する対象は、再発性の口腔潰瘍（口内炎に似る。）、再発性の外陰部潰瘍及び眼の炎症を含む臨床症候を示し得る。ベーチェット病患者では、ＴＮＦα、ＩＬ−８、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２の血清レベルが上昇し、ベーチェット病患者の単球中では、これらの因子の産生が上昇していることが示されている（例えば、Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｖｅｓｓｅｌｓ（２００１）Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， ｅｄｓ． Ｇ．Ｓ． Ｈｏｆｆｍａｎ ａｎｄ ＣＭ．Ｗｅｙａｎｄ，ｐ．４７３参照）。
ｂ．ウェゲナー肉芽腫症
腫瘍壊死因子は、ウェゲナー肉芽腫の病態生理に関与すると推定されている（Ｍａｒｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｒｅｐ．５：１２８；Ｈａｒｍａｎ ａｎｄ Ｍａｒｇｏ（１９９８）Ｓｕｒｖ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．４２：４５８）。ウェゲナー肉芽腫症は、上気道（鼻、洞、耳）、肺及び腎臓中に血管の炎症を引き起こす脈管炎を表す。ウェゲナー肉芽腫症は、正中肉芽腫症とも称される。ウェゲナー肉芽腫症は、気道を巻き込む肉芽腫性炎症及び小型ないし中型血管に影響を与える壊死性脈管炎を含む。
ウェゲナー肉芽腫症を有する対象は、しばしば、関節炎（関節の炎症）も有する。罹患した対象中には、糸球体腎炎も存在し得るが、実質的にあらゆる臓器が関与し得る。
ウェゲナー肉芽腫症に罹患した患者は、典型的には、再発性の副鼻腔炎又は鼻血、粘膜潰瘍、中耳炎、咳、喀血及び呼吸困難を含む臨床症候を示す。ウェゲナー肉芽腫症の第一の症候には、しばしば、上気道症候、関節痛、虚弱及び疲労が含まれる。
ｃ．チャーグ・ストラウス症候群
腫瘍壊死因子は、チャーグ・ストラウス症候群の病態生理に関与すると推定されている（Ｇｒｏｓｓ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１４：１１； Ｃｈｕｒｇ（２００１）Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．１４：１２８４）。チャーグ・ストラウス症候群は、全身性であり、喘息及び好酸球の初期の徴候を示す脈管炎を表す。チャーグ・ストラウス症候群は、アレルギー性肉芽腫症及び血管炎とも称され、アレルギー性鼻炎、喘息及び好酸球の状態において起こる。チャーグ・ストラウス症候群では、副鼻腔炎及び肺浸潤も起こり、主に、肺及び心臓を冒す。末梢性神経障害、冠動脈炎及び胃腸の関与が一般的である。
チャーグ・ストラウス症候群に罹患した患者は、米国リウマチ学会（ＡＣＲ）によって確立された基準に従って診断され得る。これらの基準は、ＣＳＳを脈管炎の他の形態と区別することを目的するものであった。全ての患者が全ての基準を満たすとは限らない。実際、一部の患者は、２又は３の基準のみを有し得るが、なお、チャーグ・ストラウス症候群として分類される。ＡＣＲは、チャーグ・ストラウス症候群を他の脈管炎から最もよく区別する特徴として、６つの病的特徴（基準）を選択した。これらの基準には、１）喘息、２）好酸球増多症［白血球百分率で１０％超］、３）単神経障害、４）胸部Ｘ線上での一過性肺浸潤、５）副鼻腔の異常及び６）血管外好酸球を有する血管を含む生検が含まれる。
Ｐ．他のＴＮＦα関連疾患
一実施形態において、本発明は、ＴＮＦα活性が有害であるＴＮＦα関連疾患を治療するための複数可変投薬法であり、ＴＮＦα関連疾患が治療されるように、ＴＮＦα抗体を対象に投与することを含む、方法を特徴とする。ＴＮＦα活性が有害であるＴＮＦα関連疾患の例は、以下でさらに論述されている。
１．若年性関節炎
腫瘍壊死因子は、若年性関節リウマチなど、若年性関節炎の病態生理に関与すると推定されている（Ｇｒｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．３９：１７０３；Ｍａｎｇｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．８：２１１）。一実施形態において、本発明のＴＮＦα抗体は、若年性関節リウマチを治療するために使用される。
本発明において使用される「若年性関節リウマチ」又は「ＪＲＡ」という用語は、関節又は結合組織の損傷を引き起こし得る、１６歳より前に発症する慢性の炎症性疾患を表す。ＪＲＡは、若年性慢性多発性関節炎及びスチル病とも称される。
ＪＲＡは、１６歳又はそれ以下の年齢の子供に、６週間を超えて、関節の炎症及び凝りを引き起こす。炎症は、関節中に発赤、膨張、温感及びひりひりするような痛みを引き起こす。あらゆる関節が冒されることができ、炎症は、冒された関節の運動性を制約し得る。ＪＲＡの１つの種類は、内部臓器にも影響を与え得る。
ＪＲＡは、しばしば、関与する関節の数、症候並びに血液検査によって見出されるある種の抗体の存在又は不存在によって、３つの種類に分類される。これらの分類は、疾病がどのように進行し、内部臓器又は皮膚が影響を受けるかどうかを医師が決定するのに役立つ。ＪＲＡの分類には、以下のものが含まれる。
ａ．小関節ＪＲＡ、患者の４つ又はそれ以下の関節が冒される。小関節は、ＪＲＡの最も一般的な形態であり、典型的には、膝などの大きな関節が冒される。
ｂ．多関節型ＨＲＡ、５つ又はそれ以上の関節が冒される。最も一般的には、手及び足の関節などの小さな関節が含まれるが、本疾病は大きな関節も冒し得る。
ｃ．全身型ＪＲＡは、関節の膨張、発熱、軽度の皮膚発疹を特徴とし、心臓、肝臓、脾臓及びリンパ節などの内臓にも影響を与え得る。全身型ＪＲＡは、スチル病とも称される。これらの子供の若干のパーセントが、多くの関節中に関節炎を発症し、成人期まで続く重度の関節炎を有し得る。
２．子宮内膜症
子宮内膜症を有する女性はＴＮＦの上昇した腹膜レベルを有するので、腫瘍壊死因子は、子宮内膜症の病態生理に関与していると推定される（Ｅｉｓｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｔｅｒｉｌ５０：５７３；Ｈａｌｍｅ（１９８９）Ａｍ ＪＯｂｓｔｅｔＧｙｎｅｃｏｌ１６１：１７１８；Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ（１９９１）Ａｍ Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２６：６２；Ｔａｋｅｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １６７：２６５； Ｏｖｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ１９９６；１１：３８０）。一実施形態において、ＴＮＦα抗体は、子宮内膜症を治療するために使用され得る。本明細書において使用される「子宮内膜症」という用語は、正常な状態では、子宮を裏打ちしている組織（子宮内膜）が身体の他の領域中で増殖し、疼痛、不規則な出血及び引き起こし、多くの場合、不妊症を引き起こす症状を表す。
３．前立腺炎
慢性的な前立腺炎及び慢性的な骨盤痛を有する男性は、対照に比べて、精液中に、ＴＮＦ及びＩＬ−１の有意により高いレベルを有するので、腫瘍壊死因子は前立腺炎の病態生理に関与していると推定されている（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｕｒｏｌｏｇｙ５２：７４４；Ｎａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｊ Ｕｒｏｌ１６４：２１４；Ｏｒｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１） ＩｎｔＪ Ｕｒｏｌ ８：４９５）。さらに、前立腺炎のラットモデルでは、対照に比較して、ＴＮＦレベルも増加していた（Ａｓａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｈｉｎｙｏｋｉｋａ Ｋｉｙｏ ４７：４５９；Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｐｒｏｓｔａｔｅ ４４：２５）。一実施形態において、本発明のＴＮＦα抗体は、前立腺炎を治療するために使用される。
本明細書において使用される「前立腺炎」という用語は、前立腺の炎症を表す。前立腺炎は、骨盤痛症候群とも称される。前立腺炎は、非細菌性前立腺炎、急性前立腺炎、細菌性前立腺炎及び急性前立腺炎などの様々な形態で現れる。急性前立腺炎は、突然発症する前立腺の炎症を表す。急性前立腺炎は、通常、前立腺の細菌感染によって引き起こされる。慢性前立腺炎は、徐々に発症する前立腺の炎症であり、長期にわたって継続し、通例、かすかな症候を有する。慢性前立腺炎は、通常、細菌感染によっても引き起こされる。
４．脈絡膜新生血管
腫瘍壊死因子は、脈絡膜新生血管の病態生理に関与していると推定されている。例えば、外科的に切除された脈絡膜新生血管膜において、新生血管は、ＴＮＦとＩＬ−１の両者に対して陽性に染色される（Ｏｈ Ｈ ｅｔ ａｌ．（１９９９） Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ４０：１８９１）。一実施形態において、ＴＮＦα抗体は、脈絡膜新生血管膜を治療するために使用される。本明細書において使用される「脈絡膜新生血管」という用語は、脈絡膜から始まり、ブルッフ膜中の裂け目を通じて、網膜下色素上皮（サブＲＰＥ）又は網膜下腔中に至る新しい血管の増殖を表す。脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）は、症状を有する患者における失明の主原因である。
５．坐骨神経痛
腫瘍壊死因子は、坐骨神経痛の病態生理に関与すると推定されている（Ｏｚａｋｔａｙ ｅｔ ａｌ．（２００２） Ｅｕｒ Ｓｐｉｎｅ Ｊ．１１：４６７；Ｂｒｉｓｂｙ ｅｔ ａｌ．（２００２） Ｅｕｒ Ｓｐｉｎｅ Ｊ．１１：６２）。一実施形態において、本発明のＴＮＦα抗体は、坐骨神経痛を治療するために使用される。本明細書において使用される「坐骨神経痛」という用語は、坐骨神経への損傷によって引き起こされる足の損傷された運動及び／又は感覚を伴う症状を表す。坐骨神経痛は、一般に、坐骨神経の神経障害及び坐骨神経機能不全とも称される。坐骨神経痛は、末梢性神経障害の形態である。坐骨神経痛は、足の裏側に位置する坐骨神経への損傷が存在する場合に起こる。坐骨神経は、膝の裏側及び下肢の筋肉を調節し、腿、下肢の一部及び足の裏に感覚を与える。坐骨神経は、腰部椎間板ヘルニア、脊髄狭窄、変性椎間板疾患、峡部脊椎すべり症（ｓｐｏｎｄｙｌｏｉｓｔｈｅｓｉｓ）及び梨状筋（ｐｉｎｉｆｏｒｍｉｓ）症候群を含む別の疾患の指標であり得る。
６．シェーグレン症候群
腫瘍壊死因子は、シェーグレン症候群の病態生理に関与すると推定されている（Ｋｏｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１９：１３１）。一実施形態において、本発明のＴＮＦα抗体は、シェーグレン症候群を治療するために使用される。本明細書において使用される「シェーグレン症候群」という用語は、口渇、減少した涙及びその他の乾燥した粘膜によって特徴付けられ、しばしば、関節リウマチなどの自己免疫性リウマチ疾患をしばしば伴う全身性炎症疾患を表す。眼及び口の乾燥は、本症候群の最も一般的な症候である。症候は単独で発生し得、関節リウマチ又はその他の結合組織の疾病を伴った症候とともに発生し得る。唾液腺の拡大が随伴して存在し得る。他の臓器も、冒され得る。本症候群は、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、強皮症、多発性筋炎及びその他の疾病を伴い得る。
７．ブドウ膜炎
腫瘍壊死因子は、ブドウ膜炎の病態生理に関与すると推定されている（Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ ａｎｄ Ｌｌｏｙｄ （１９９２） Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ４：１；Ｗｏｏｎ ｅｔ ａｌ（１９９８）ＣｕｒｒＥｙｅＲｅｓ．１７：９５５）。一実施形態において、本発明のＴＮＦα抗体は、ブドウ膜炎を治療するために使用される。本明細書において使用される「ブドウ膜炎」という用語は、虹彩、毛様体及び脈絡膜を含む、強膜と網膜の間の層であるブドウ膜の炎症を表す。ブドウ膜炎は、一般に、虹彩炎、毛様体扁平部炎、脈絡炎（ｃｈｒｏｉｄｉｔｉｓ）、脈絡網膜炎、前部ブドウ膜炎及び後部ブドウ膜炎とも称される。ブドウ膜炎の最も一般的な形態は、眼の前部の中に炎症を伴う前部ブドウ膜炎であり、これは、通常、虹彩に限局されている。この症状は、しばしば、虹彩炎と称される。一実施形態において、ブドウ膜炎とは、自己免疫疾患を伴う炎症を除く、すなわち、自己免疫性ブドウ膜炎を除く、ブドウ膜の炎症を表す。
８．湿式黄斑変性症
腫瘍壊死因子は、湿式黄斑変性症の病態生理に関与していると推定されている。一実施形態において、本発明のＴＮＦα抗体は、湿式黄斑変性症を治療するために使用される。本明細書において使用される「湿式黄斑変性症」という用語は、黄斑（眼の網膜の中央部）を冒し、減少した視力を引き起こし、中央の視覚を喪失させる可能性がある疾患を表す。湿式黄斑変性症を有する患者は、網膜の下に新しい血管を発達させ、これは、血管、膨潤及び瘢痕組織を引き起こす。
９．骨粗しょう症
腫瘍壊死因子は、骨粗しょう症の病態生理に関与していると推定されている（Ｔｓｕｔｓｕｍｉｍｏｔｏ ｅｆ αｌ．（１９９９） Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ．１４：１７５１）。骨粗しょう症は、骨密度の進行性の低下及び骨組織の菲薄化によって特徴付けられる疾患を表すために使用される。身体が十分な新しい骨を形成することができない場合に、若しくは、過度の古い骨が身体によって再吸収される場合に、又は両者の場合に、骨粗しょう症が起こる。本発明のＴＮＦα抗体又はその抗原結合断片は、骨粗しょう症を治療するために使用することができる。
１０．骨関節炎
腫瘍壊死因子は、骨関節炎の病態生理に関与すると推定されている（Ｖｅｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．３６：８１９； Ｗｅｓｔａｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２１：１７１０）。骨関節炎（ＯＡ）は、肥大性骨関節炎、変形性関節症及び変性関節疾患とも称される。ＯＡは、骨格の関節の慢性変性疾患であり、これは、全ての年齢の成人において、特定の関節、一般的には、膝、臀部、手の関節及び脊椎を冒す。ＯＡは、「潰瘍」又はクレーターの発育を伴う関節軟骨の変性及び菲薄化、骨棘の形成、周縁部の骨の肥大並びに滑膜の変化及び罹患した関節の拡大を含む多数の症候によって特徴付けられる。さらに、特に、長期の活動後に、骨関節炎には、疼痛及び凝りが伴う。本発明の抗体又はその抗原結合断片は、骨関節炎を治療するために使用することができる。骨関節炎の特徴的なＸ線検査の特徴には、関節腔の狭小化、肋軟骨下の硬化症、骨増殖症、肋軟骨下嚢胞の形成、疎性骨体（又は「関節ネズミ」）が含まれる。
骨関節炎を治療するために使用される医薬には、様々な非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が含まれる。さらに、ＯＡを治療するために、Ｃｅｌｅｂｒｅｘ、Ｖｉｏｘｘ及びＢｅｘｔｒａ及びＥｔｏｒｉｃｏｘｉｂを含むＣＯＸ２阻害剤も使用される。関節中に直接注射されるステロイドは、炎症及び疼痛を低減するためにも使用され得る。本発明の一実施形態において、本発明のＴＮＦα抗体は、ＮＳＡＩＤ、ＣＯＸ２阻害剤及び／又はステロイドと組み合わせて投与される。
１１．その他
本発明の方法は、ＴＮＦα活性が有害である様々な他の疾患を治療するためにも使用することができる。ＴＮＦα活性が病態生理に関与していると推定されており、従って、本発明の抗体又は公知の一部を用いて治療することができる他の疾病及び疾患の例には、炎症性骨疾患、骨再吸収疾患、凝固障害、やけど、最灌流傷害、ケロイド形成、瘢痕組織形成、発熱、歯周病、肥満、放射線毒性、加齢性悪液質、アルツハイマー病、脳浮腫、炎症性脳傷害、癌、慢性疲労症候群、皮膚筋炎、スティーブンス・ジョンソン症候群及びヤーリッシュ・ヘルクスハイマー反応などの薬物反応、脊髄中及び脊髄周囲の浮腫、家族性周期性発熱、フェルティ症候群、繊維症、糸球体腎炎（例えば、連鎖球菌感染後糸球体腎炎又はＩｇＡ腎症）、人工関節の緩み、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織疾患、多発性骨髄腫、癌及び悪液質、多臓器疾患、骨髄異形成症候群、精巣炎（ｏｒｃｈｉｔｉｓｍ）、骨溶解、膵炎（急性、慢性及び膵膿瘍を含む。）、多発性筋炎、進行性腎不全、偽痛風、壊疽性膿皮症、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心疾患、サルコイドーシス、硬化性胆管炎、発作、胸腹部大動脈瘤修復（ＴＡＡＡ）、ＴＮＦ受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ；ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、黄熱病ワクチン接種に関連する症候、耳に関連する炎症性疾患、慢性耳炎、真珠腫を伴う又は伴わない慢性中耳炎、小児の耳炎、筋炎（ｍｙｏｔｏｓｉｓ）、卵巣癌、結腸直腸癌、誘導性炎症症候群（例えば、ＩＬ−２投与後の症候群）に関連する治療及び再灌流傷害に伴う疾患が含まれる。
上記ＴＮＦα関連疾患の全てには、適宜、疾病の成人形態及び若年性形態の両方が含まれることが理解される。上記疾患の全てには、疾病の慢性形態及び急性形態の両方が含まれることも理解される。さらに、本発明の複数可変投薬法は、上記ＴＮＦα関連疾患のみの各々又は互いに組み合わされた上記ＴＮＦα関連疾患（例えば、ブドウ膜炎及び狼瘡に罹患している対象）を治療するために使用することが可能である。
さらなる治療剤
本発明は、複数可変投薬計画を用いて、ＴＮＦα関連疾患を治療するための医薬組成物及びその使用方法に関する。医薬組成物は、ＴＮＦα関連疾患を予防又は阻害する第一の薬剤を含む。医薬組成物及び使用方法は、活性な医薬成分である第二の薬剤を含み得る。すなわち、第二の薬剤は治療的であり、その機能は、医薬担体、防腐剤、希釈剤又は緩衝剤などの不活性成分の機能を超える。第二の薬剤は、ＴＮＦα関連疾患を治療又は予防する上で有用であり得る。第二の薬剤は、標的とされる疾病に付随する少なくとも１つの症候を減弱又は治療し得る。第一及び第二の薬剤は、類似若しくは無関係な作用機序によって、それらの生物学的効果を発揮し得、又は第一及び第二の薬剤の一方又は両方は、複数の作用機序によってそれらの生物学的効果を発揮し得る。医薬組成物は、第三の化合物も含み得、又は、さらに、第三（及び第四など）の化合物は、第二の薬剤と同一の特徴を有する。
本明細書に記載されている医薬組成物は、医薬として許容される同一の担体中に、又は記載されている各実施形態に対する医薬として許容される異なる担体中に、第一及び第二、第三又は追加の薬剤を有し得ることを理解すべきである。第一、第二、第三及びさらなる薬剤が、記載されている実施形態内で、同時に又は順次に投与され得ることをさらに理解すべきである。あるいは、第一及び第二の薬剤は、同時に投与することができ、及び第三又はさらなる薬剤は、最初の２つの薬剤の前又は後に投与され得る。
本明細書に記載されている方法及び医薬組成物内で使用される薬剤の組み合わせは、治療の目標とされる症状又は疾病に対して、治療的な加算的又は相乗的効果を有し得る。本明細書に記載されている方法又は医薬組成物内で使用される薬剤の組み合わせは、単独で投与されたときに、又は特定の医薬組成物の他の薬剤なしに投与されたときに、薬剤の少なくとも１つに伴う有害な効果も低下させ得る。例えば、１つの薬剤の副作用の毒性は、組成物の別の薬剤によって減弱され得るので、より高い投薬量を可能し、患者の服用遵守を改善し、及び治療的転帰を改善する。組成物の加算的又は相乗的効果、有益性及び利点は、治療剤のクラス（構造的クラス又は機能的クラスの何れか）に対して当てはまり、又は各化合物自体に当てはまる。
補助的活性化合物も、組成物中に取り込ませることが可能である。ある実施形態において、本発明の抗体又は抗体部分は、ＴＮＦα活性が有害であるＴＮＦα関連疾患を治療するのに有用である、１つ又はそれ以上のさらなる治療剤とともに共製剤化され、及び／又は同時投与される。例えば、本発明の抗ｈＴＮＦα抗体、抗体部分又はその他のＴＮＦα阻害剤は、他の標的を結合する１つ若しくはそれ以上の追加の抗体（例えば、他のサイトカインを結合し、又は細胞表面分子を結合する抗体）、１つ若しくはそれ以上のサイトカイン、可溶性ＴＮＦα受容体（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／０６４７６を参照）及び／又はｈＴＮＦα産生若しくは活性を阻害する１つ若しくはそれ以上の化学的因子（ＰＣＴ公開ＷＯ０３／１９７５１に記載されているシクロヘキサンイリデン誘導体など）とともに共製剤化され、及び／又は同時投与され得る。さらに、本発明の１つ又はそれ以上の抗体又は他のＴＮＦα阻害剤は、先述の治療剤の２つ又はそれ以上と組み合わせて使用され得る。このような組み合わせ療法は、投与される治療剤のより低い投薬量を有利に使用し得るので、様々な単独療法に伴って生じ得る毒性又は合併症が回避される。特異的な治療剤は、一般に、以下に論述されているように、治療されている具体的なＴＮＦα関連疾患に基づいて選択される。
本発明の治療の複数可変投薬法において、抗体、抗体部分又はその他のＴＮＦα阻害剤と組み合わせることができる治療剤の非限定的な例には、以下の非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）；サイトカイン抑制性抗炎症薬（ＣＳＡＩＤｓ）；ＣＤＰ−５７１／ＢＡＹ−１０−３３５６（ヒト化された抗ＴＮＦα抗体；Ｃｅｌｌｔｅｃｈ／Ｂａｙｅｒ）；ｃＡ２／インフリキシマブ（キメラ抗ＴＮＦα抗体；Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）；７５ｋｄＴＮＦα−ＩｇＧ／エタネルセプト（７５ｋＤＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質；イムネックス；例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９４）Ｖｏｌ．３７，Ｓ２９５；Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｍｅｄ．（１９９６）Ｖｏｌ．４４，２３５Ａを参照；５５ｋｄＴＮＦ−ＩｇＧ（５５ｋＤＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質；Ｈｏｆｆｍａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）；ＩＤＥＣ−ＣＥ９．１／ＳＢ２１０３９６（非枯渇化プライマタイズ（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）抗ＣＤ４抗体；ＩＤＥＣ／ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ；例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９５）Ｖｏｌ．３８，Ｓ１８５を参照；ＤＡＢ４８６−ＩＬ−２及び／又はＤＡＢ３８９−ＩＬ−２（ＩＬ−２融合タンパク質；Ｓｅｒａｇｅｎ；例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９３）Ｖｏｌ．３６，１２２３）参照；抗Ｔａｃ（ヒト化抗ＩＬ−２Ｒα；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ／Ｒｏｃｈｅ）；ＩＬ−４（抗炎症性サイトカイン；ＤＮＡＸ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）；ＩＬ−−１０（ＳＣＨ５２０００；組換えＩＬ−１０、抗炎症性サイトカイン；ＤＮＡＸ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）；ＩＬ−４；ＩＬ−１０及び／又はＩＬ−４アゴニスト（例えば、アゴニスト抗体）；ＩＬ−１ＲＡ（ＩＬ−１受容体アンタゴニスト；Ｓｙｎｅｒｇｅｎ／Ａｍｇｅｎ）；アナキンラ（Ｋｉｎｅｒｅｔ（Ｒ）／Ａｍｇｅｎ）；ＴＮＦ−ｂｐ／ｓ−ＴＮＦ（可溶性ＴＮＦ結合タンパク質；例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９６）Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．９（補遺），Ｓ２８４参照；Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．−Ｈｅａｒｔ ａｎｄ Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（１９９５）Ｖｏｌ．２６８，ｐｐ．３７−４２）；Ｒ９７３４０１（ホスホジエステラーゼＩＶ型阻害剤；例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９６）Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．９（補遺），Ｓ２８２参照；ＭＫ−９６６（ＣＯＸ−２阻害剤；例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９６）Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．９（補遺），Ｓ８１参照）；Ｉｌｏｐｒｏｓｔ（例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９６）Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．９（補遺），Ｓ８２参照）；メトトレキサート；サリドマイド（例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９６）Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．９（補遺），Ｓ２８２参照）及びサリドマイド関連薬（例えば、Ｃｅｌｇｅｎ）；レフノミド（抗炎症性及びサイトカイン阻害剤；例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９６）Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．９（補遺），Ｓ１３１；Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９６）Ｖｏｌ．４５，ｐｐ．１０３−１０７参照）；トラネキサム酸（プラスミノーゲン活性化の阻害剤；例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９６）Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．９（補遺），Ｓ２８４参照）；Ｔ−６１４（サイトカイン阻害剤；例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９６）Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．９（補遺），Ｓ２８２参照）；プロスタグランジンＥ１（例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９６）Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．９（補遺），Ｓ２８２参照）；Ｔｅｎｉｄａｐ（非ステロイド性抗炎症薬；例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９６）Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．９（補遺），Ｓ２８０参照）；ナプロキセン（非ステロイド性抗炎症薬；例えば、Ｎｅｕｒｏ Ｒｅｐｏｒｔ（１９９６）Ｖｏｌ．７，ｐｐ．１２０９−１２１３参照）；メロキシカム（非ステロイド性抗炎症薬）；イブプロフェン（非ステロイド性抗炎症薬）；ピロキシカム（非ステロイド性抗炎症薬）；ジクロフェナク（非ステロイド性抗炎症薬）；インドメタシン（非ステロイド性抗炎症薬）；スルファサラジン（例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９６）Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．９（補遺），Ｓ２８１参照）；アザチオプリン（例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９６）Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．９（補遺），Ｓ２８１参照）；ＩＣＥ阻害剤（酵素インターロイキン１β変換酵素の阻害剤）；ｚａｐ−７０及び／又はｌｃｋ阻害剤（チロシンキナーゼｚａｐ−７０又はｌｃｋの阻害剤）；ＶＥＧＦ阻害剤及び／又はＶＥＧＦ−Ｒ阻害剤（血管内皮細胞増殖因子又は血管内皮細胞増殖因子受容体の阻害剤；血管新生の阻害剤）；コルチコステロイド抗炎症薬（例えば、ＳＢ２０３５８０）；ＴＮＦ−コンベルターゼ阻害剤；抗ＩＬ−１２抗体；抗ＩＬ−１８抗体；インターロイキン−１１（例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９６）Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．９（補遺），Ｓ２９６参照）；インターロイキン−１３（例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９６）Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．９（補遺），Ｓ３０８参照）；インターロイキン−１７阻害剤（例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９６）Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．９（補遺），Ｓ１２０）；金；ペニシラミン；クロロキン；ヒドロキシクロロキン；クロラムブシル；シクロスポリン；シクロホスファミド；全リンパ系照射；抗胸腺細胞グロブリン；抗ＣＤ４抗体；ＣＤ５トキシン；経口投与されたペプチド及びコラーゲン；ロベンザリト二ナトリウム；サイトカイン制御因子（ＣＲＡｓ）ＨＰ２２８及びＨＰ４６６（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）；ＩＣＡＭ−１アンチセンスホスホロチオアートオリゴデオキシヌクレオチド（ＩＳＩＳ ２３０２；Ｉｓｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）；可溶性補体受容体１（ＴＰ１０；Ｔ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）；プレドニソン；オルゴテイン；グリコサミノグリカンポリサルファート；ミノサイクリン；抗ＩＬ２Ｒ抗体；マウス及び植物脂質（魚及び植物種子脂肪酸；例えば、ＤｅＬｕｃａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．Ｊ，：７５９−７７７参照）；アウラノフィン；フェニルブタゾン；メクロフェナミン酸；フルフェナミン酸；静脈内免疫グロブリン；ジレウトン；アザリビン；ミコフェノール酸（ＲＳ−６１４４３）；タクロリムス（ＦＫ−５０６）；シロリムス（ラパマイシン）；アミプリロース（テラフェクチン）；クラドリビン（２−クロロデオキシアデノシン）；メトトレキサート；抗ウイルス剤；及び免疫調節剤が含まれる。上記薬剤の何れもが、本発明の複数可変投薬治療法又は単一投薬治療法を用いて、ＴＮＦα関連疾患を治療するために、本発明のＴＮＦα抗体を組み合わせて投与することができる。
一実施形態において、本発明のＴＮＦα抗体は、本発明の治療の複数可変投薬方法を用いて、関節リウマチの治療用の以下の因子の１つと組み合わせて投与される。ＫＤＲの小分子阻害剤（ＡＢＴ−１２３）、Ｔｉｅ−２の小分子阻害剤；メトトレキサート；プレドニゾン；セレコキシブ；葉酸；硫酸ヒドロキシクロロキン；ロフェコキシブ；エタネルセプト；インフリキシマブ；アナキンラ（Ｋｉｎｅｒｅｔ（Ｒ）／Ａｍｇｅｎ）；レフルノミド；ナプロキセン；バルデコキシブ；スルファサラジン；イブプロフェン；メチルプレドニゾロン；メロキシカム；酢酸メチルプレドニゾロン、金チオマレートナトリウム；アスピリン；アザチオプリン；トリアムシノロン・アセトニド；プロポキシフェン・ナプシラート／ａｐａｐ；フォラート；ナブメトン；ジクロフェナク；ピロキシカム；エトドラク；ジクロフェナクナトリウム；オキサプロジン、塩酸オキシコドン、ヒドロコドン二酒石酸塩／ａｐａｐ；ジクロフェナクナトリウム／ミソプロストール；フェンタニル；アナキンラ、ヒト組み換え；塩酸トラマドール；サルサラート；スリンダク；シアノコバラミン／ｆａ／ピリドキシン；アセトアミノェン；アレンドロナートナトリウム；プレドニゾロン；硫酸モルヒネ；塩酸リドカイン；インドメタシン；硫酸グルコサミン／コンドロイチン；シクロスポリン；スルファジアジン;塩酸アミトリプチリン；スルファジアジン；塩酸オキシコドン／アセトアミノフェン；塩酸オロパタジン；ミソプロストール；ナプロキセンナトリウム；オメプラゾール；ミコフェノラート・モフェチル；シクロホスファミド；リツキシマブ、ＩＬ−１ＴＲＡＰ；ＭＲＡ；ＣＴＬＡ４−ＩＧ；ＩＬ−１８ＢＰ；ＡＢＴ−８７４;ＡＢＴ-３２５（抗ＩＬ−１８）；抗ＩＬ−１５；ＢＩＲＢ−７９６；ＳＣＩＯ−４６９；ＶＸ−７０２；ＡＭＧ−５４８；ＶＸ７４０；ロフルミラスト；ＩＣ−４８５；ＣＤＣ−８０１及びメソプラム。別の実施形態において、本発明のＴＮＦα抗体は、関節リウマチを治療するための上記薬剤の１つと組み合わせて、ＴＮＦα関連疾患の治療のための複数可変用量方法を用いて投与される。別の実施形態において、上記さらなる因子は、本発明の単回投薬治療法において、ＴＮＦα抗体と組み合わせて使用される。
一実施形態において、本発明のＴＮＦα抗体は、ＴＮＦα活性が有害であるＴＮＦα関連疾患の治療のための以下の薬剤：抗ＩＬ−２抗体（ＡＢＴ８７４）；抗ＩＬ−１８抗体（ＡＢＴ３２５）；ＬＣＫの小分子阻害剤；ＣＯＴの小分子阻害剤；抗ＩＬ−１抗体；ＭＫ２の小分子阻害剤；抗ＣＤ１９抗体；ＣＸＣＲ３の小分子阻害剤；ＣＣＲ５の小分子阻害剤；ＣＣＲ１１小分子阻害剤抗Ｅ／Ｌセレクチン抗体；Ｐ２Ｘ７の小分子阻害剤；ＩＲＡＫ−４の小分子阻害剤；グルココルチコイド受容体の小分子アゴニスト；抗Ｃ５ａ受容体抗体；Ｃ５ａ受容体の小分子阻害剤；抗ＣＤ３２抗体；及び治療用タンパク質としてのＣＤ３２の１つと組み合わせた複数可変投薬計画を用いて投与される。
さらに別の実施形態において、本発明を用いて得られたＴＮＦα抗体は、抗生物質又は抗感染剤と組み合わせて投与され得る。抗感染剤には、ウイルス、真菌、寄生生物又は細菌感染を治療するために、本分野で公知の薬剤が含まれる。本明細書において使用される「抗生物質」という用語は、微生物の増殖を阻害し、又は微生物を死滅させる化学物質を表す。本用語によって包含されるのは、微生物によって産生される抗生物質及び本分野で公知の合成抗生物質（例えば、類縁体）である。抗生物質には、クラリスロマイシン（Ｂｉａｘｉｎ（Ｒ））、シプロフロキサシン（Ｃｉｐｒｏ（Ｒ））及びメトロニダゾール（Ｆｌａｇｙｌ（Ｒ））が含まれるが、これらに限定されない。
別の実施形態において、本発明を用いて得られたＴＮＦα抗体は、坐骨神経痛又は疼痛を治療するためのさらなる治療剤とともに投与され得る。坐骨神経痛又は疼痛の症候を低減又は阻害するために使用することができる薬剤の例には、重い酒石酸ヒドロコドン／ａｐａｐ、ロフェコキシブ、塩酸シクロベンザプリン、メチルプレドニゾロン、ナプロキセン、イブプロフェン、塩酸オキシコドン／アセトアミノフェン、セレコキシブ、バルデコキシブ、酢酸メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、リン酸コデイン／ａｐａｐ、トラマドール塩酸塩／アセトアミノフェン、メタキサロン、メロキシカム、メトカルバモール、塩酸リドカイン、ジクロフェナクナトリウム、ガバペンチン、デキサメタゾン、カリソプロドール、ケトロラクトロメタミン、インドメタシン、アセトアミノフェン、ジアゼパム、ナブメトン、塩酸オキシコドン、塩酸チザニジン、ジクロフェナクナトリウム／ミソプロストール、ナプシル酸プロポキシフェン／ａｐａｐ、ａｓａ／オキシコドン／オキシコドンｔｅｒ、イブプロフェン／重酒石酸ヒドロコドン、塩酸トラマドール、エトドラク、塩酸プロポキシフェン、塩酸アミトリプチリン、カリソプロドール／リン酸コデイン／ａｓａ、硫酸モルヒネ、マルチビタミン、ナプロキセンナトリウム、クエン酸オルフェナドリン及びテマゼパムが含まれる。
さらに別の実施形態において、ＴＮＦα関連疾患は、血液透析と組み合わせた、本発明を用いて得られたＴＮＦα抗体で治療される。
別の実施形態において、本発明を用いて得られるＴＮＦα抗体は、本発明の複数可変投薬計画において、クローン病又はクローン関連疾患を治療するために使用される薬物と組み合わせて使用され得る。クローン病を治療するために使用することが可能な治療剤の例には、メサラミン、プレドニソン、アザチオプリン、メルカプトプリン、インフリキシマブ、ブデソニド、スルファサラジン、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、ジフェノキシラート／硫酸アトロピン、塩酸ロペラミド、メトトレキサート、オメプラゾール、フォラート、シプロフロキサシン／デキストロース−水、重酒石酸ヒドロコドン／ａｐａｐ、塩酸テトラサイクリン、フルオシノニド、メトロニダゾール、チメロサール／ホウ酸、硫酸ヒヨスチアミン、コレスチラミン／スクロース、塩酸シプロフロキサシン、塩酸メペリジン、塩酸ミダゾラム、塩酸オキシコドン／アセトアミノフェン、塩酸プロメタジン、リン酸ナトリウム、スルファメトキサゾール／トリメトプリム、セレコキシブ、ポリカルボフィル、ナプシル酸プロポキシフェン、ヒドロコルチゾン、マルチビタミン、バルサラジド二ナトリウム、リン酸コデイン／アセトアミノフェン（ａｐａｐ）、塩酸コレセベラム、シアノコバラミン、葉酸、レボフロキサシン、ナタリズマブ、メチルプレドニゾロン、インターフェロンγ及びサルゴラモスティム（ＧＳ−ＣＭＦ）が含まれる。一実施形態において、クローン病の治療のために、メトトレキサートが、２．５ｍｇから３０ｍｇ／週の用量で投与される。
別の実施形態において、ＴＮＦα抗体は、本発明の複数可変投薬計画において、喘息を治療するためのさらなる治療剤と組み合わせて投与される。喘息の症候を低減又は阻害するために使用することができる薬剤の例には、以下のもの：アルブテロール、サルメテロール／フルチカゾン、ナトリウム、プロピオン酸フルチカゾン、ブデソニド、プレドニゾン、キシナホ酸サルメテロール、塩酸レバルブテロール、硫酸／イプラトロピウム、リン酸ナトリウムプレドニゾロン、トリアムシノロンアセトニド、二プロピオン酸ベクロメタゾン、イプラトロピウム臭化物、アジスロマイシン、酢酸ピルブテロール、プレドニゾロン、テオフィリン無水物、ザフィルルカスト、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、クラリスロマイシン、フマル酸フォルモテロール、インフルエンザウイルスワクチン、メチルプレドニゾロン、三水和物、アレルギー注射、クロモリンナトリウム、セフプロジル；塩酸フェキソフェナジン、フルニソリド／メントール、レボフロキサシン、アモキシシリン／クラブラナート、吸入補助装置、グアイフェネシン、リン酸デキサメタゾンナトリウム、塩酸マキシフロキサシン、塩酸塩水和物、グアイフェネシン／ｄ−メトルファン、ガチフロキサシン、ペフェドリン／コデイン／クロルフェニル、塩酸セチリジン、フロ酸モメタゾン、キシナホ酸サルメテロール、ベンゾナテート、セファレキシン、ｐｅ／ヒドロコドンクロルフェニル、塩酸セチリジン／プソイドエフェドリン、フェニレフリン／ｃｏｄ／プロメタジン、コデイン／プロメタジン、フルニソリド、デキサメタゾン、グアイフェネシン／プソイドエフェドリン、クロルフェニラミン／ヒドロコドン、ネドクロミルナトリウム、硫酸テルブタリン、エピネフリン及びメチルプレドニゾロン、硫酸メタプロテレノールが含まれる。
別の実施形態において、本発明のＴＮＦα抗体は、ＣＯＰＤを治療するためのさらなる治療剤と組み合わせて投与される。ＣＯＰＤの症候を低減又は阻害するために使用することができる薬剤の例には、硫酸アルブテロール／イプラトロピウム；イプラトロピウム臭化物；サルメテロール／フルチカゾン；アルブテロール；サルメテロール；キシナホ酸；プロピオン酸フルチカゾン;プレドニゾ；テオフィリン無水物；レボフロキサシン；コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム；モンテルカストナトリウム；ブデソニド；フマル酸フォルモテロール；トリアムシノロンアセトニド；グアイフェネシン；アジスロマイシン；ベクロメタゾン；ジプロピオン酸；塩酸レバルブテロール；フルニソリド；ナトリウム；三水和物；ガチフロキサシン；ザフィルルカスト；フロ酸；アモキシシリン／クラブラン酸塩；フルニソリド／メントール；クロルフェニラミン／ヒドロコドン；硫酸メタプロテレノール；メチルプレドニゾロン；エフェドリン／コデイン／クロルフェニラミン；酢酸ピルブテロール、エフェドリン／ロラタジン；硫酸テルブタリン；チオトロピウム臭化物；（Ｒ，Ｒ）−フォルモテロール；ＴｇＡＡＴ；シロミラスト及びロフルミラストが含まれる。
別の実施形態において、本発明のＴＮＦα抗体は、ＩＰＦを治療するためのさらなる治療剤と組み合わせて投与される。ＩＰＦの症候を低減又は阻害するために使用することができる薬剤の例には、プレドニゾン；アザチオプリン；アルブテロール；コルヒチン；硫酸塩；ジゴキシン；γインターフェロン；コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム；フロセミド；リシノプリル；ニトログリセリン；スピロノラクトン；シクロフォスファミド；イプラトロピウム臭化物；アクチノマイシンｄ；アルテプラーゼ；プロピオン酸フルチカゾン；レボフロキサシン；硫酸メタプロテレノール；硫酸モルヒネ；塩酸オキシコドン；塩化カリウム；トリアムシノロンアセトニド；タクロリムス無水物；カルシウム；インターフェロン−α；メトトレキサート；ミコフェノール酸モフェチルが含まれる。
本発明の一実施形態において、ＴＮＦα抗体は、脊椎関節症を治療するために一般的に使用される薬剤と組み合わせて投与される。このような薬剤の例には、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）、Ｃｅｌｅｂｒｅｘ（Ｒ）、Ｖｉｏｘｘ（Ｒ）及びＢｅｘｔｒａ（Ｒ）及びエトリコキシブなどのＣＯＸ２阻害剤が含まれる。理学療法も、通常、非ステロイド性炎症薬と組み合わせて、脊椎関節症を治療するために一般的に使用されている。
別の実施形態において、本発明のＴＮＦα抗体は、強直性脊椎炎を治療するためのさらなる治療剤と組み合わせて投与され得る。強直性脊椎炎の症候を軽減又は阻害するために使用することが可能な薬剤の例には、イブプロフェン、ジクロフェナク及びミソプロストール、ナプロキセン、メロキシカム、インドメタシン、ジクロフェナク、セレコキシブ、ロフェコキシブ、スルファサラジン、プレドニゾン、メトトレキサート、アザチオプリン、ミノサイクリン、プレドニゾン、エタネルセプト及びインフリキシマブが含まれる。
別の実施形態において、本発明のＴＮＦα抗体は、乾癬性関節炎を治療するための更なる治療剤と組み合わせて投与される。乾癬性関節炎の症候を軽減又は阻害するために使用することが可能な薬剤の例には、メトトレキセート、エタネルセプト、ロフェコキシブ、セレコキシブ、葉酸、スルファサラジン、ナプロキセン、レフルノミド、酢酸メチルプレドニゾロン、インドメタシン、硫酸ヒドロキシクロロキン、スリンダク、プレドニゾン、強化されたベタメタゾンジプロピオン酸エステル、インフリキシマブ、メトトレキサート、葉酸塩、トリアムシノロンアセトニド、ジクロフェナク、ジメチルスルホキシド、ピロキシカム、ジクロフェナクナトリウム、ケトプロフェン、メロキシカム、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、ナブメトン、トルメチンナトリウム、カルシポトリエン、シクロスポリン、ジクロフェナク、ナトリウム／ミソプロストール、フルオシノニド、硫酸グルコサミン、金ナトリウムチオマレート、ヒドロコドン、重酒石酸塩／ａｐａｐ、イブプロフェン、リセドロン酸ナトリウム、スルファジアジン、チオグアニン、バルデコキシブ、アレファセプト及びエファリズマブが含まれる。
一実施形態において、ＴＮＦα阻害剤は、本発明の複数可変投薬計画において、冠動脈心疾患を治療するための初期手順の後に投与される。このような手順の例には、冠動脈バイパス術（ＣＡＢＧ）及び経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）又は血管形成術が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、狭窄の再発を予防するために、ＴＮＦα阻害剤が投与される。本発明の別の実施形態において、再狭窄を予防又は治療するために、ＴＮＦα阻害剤が投与される。本発明は、冠動脈心疾患を治療するための処置を受けている対象の動脈中にステントを挿入する前に、同時に又は後にＴＮＦα阻害剤が投与される治療の方法も提供する。一実施形態において、ステントはＣＡＢＧ又はＰＴＣＡの後に施される。
所望される治療の部位及び性質に応じて、本発明において、様々なステント内挿型人工血管を使用し得る。ステント内挿型人工血管は、例えば、二股又はチューブ人工血管、円筒状又は先細の、自己拡張型又はバルーン拡張型、ユニボディ（ｕｎｉｂｏｄｙ）又はモジュール式であり得る。さらに、ステント内挿型人工血管は、ステント内挿型人工血管の遠位末端でのみ、又はステント内挿型人工血管の全体に沿って薬物を放出するように適合させ得る。本発明のＴＮＦα阻害剤は、ステント上に投与することも可能である。一実施形態において、例えば、アダリムマブ／Ｄ２Ｅ７／ＨＵＭＩＲＡ（Ｒ）を含むＴＮＦα抗体は、薬物溶出ステントによって投与される。
ＴＮＦα抗体は、再狭窄を治療するためのさらなる治療剤と組み合わせて投与することができる。再狭窄を治療又は予防するために使用することができる薬剤の例には、シロリムス、パクリタキセル、エベロリムス、タクロリムス、ＡＢＴ−５７８及びアセトアミノフェンが含まれる。
本発明のＴＮＦα抗体は、心筋梗塞を治療するためのさらなる治療剤と組み合わせて投与されることができる。心筋梗塞を治療又は予防するために使用することができる薬剤の例には、アスピリン、ニトログリセリン、酒石酸メトプロロール、エノキサパリンナトリウム、ヘパリンナトリウム、クロピドグレル重硫酸塩、カルベジロール、アテノロール、硫酸モルヒネ、コハク酸メトプロロール、ワルファリンナトリウム、リシノプリル、一硝酸イソソルビド、ジゴキシン、フロセミド、シンバスタチン、ラミプリル、テネクテプラーゼ、エナラプリルマレイン酸、トルセミド、レタバーゼ、ロサルタンカリウム、塩酸キナプリル／炭酸マグネシウム（ｍａｇ ｃａｒｂ）、ブメタニド、アルテプラーゼ、エナラプリラート、塩酸アミダロン、塩酸チロフィバンｍ−ハイドレート、塩酸ジルチアゼム、カプトプリル、イルベサルタン、バルサルタン、塩酸プロプラノロール、フォシノプリルナトリウム、塩酸リドカイン、エプチフィバチド、セファゾリンナトリウム、硫酸アトロピン、アミノカプロン酸、スピロノラクトン、インターフェロン、塩酸ソタロール、塩化カリウム、ドクサートナトリウム、塩酸ドブタミン、アルプラゾラム、プラバスタチンナトリウム、アトルバスタチンカルシウム、塩酸ミダゾラム、塩酸メペリジン、二硝酸イソソルビド、エピネフリン、塩酸ドーパミン、ビバリルジン、ロスバスタチン、エゼチミブ／シンバスタチン、アバシミブ、アブシキシマブ及びカリポリドが含まれる。
本発明のＴＮＦα抗体は、狭心症を治療するためのさらなる治療剤と組み合わせて投与することができる。狭心症を治療又は予防するために使用することができる薬剤の例には、以下のもの：アスピリン、ニトログリセリン、一硝酸イソソルビド、アテノロール、コハク酸メトプロロール、酒石酸メトプロロール、ベシル酸アムロジピン、ジゴキシン、塩酸ジルチアゼム、二硝酸イソソルビド、重硫酸クロピドグレル、ニフェジピン、アトロバスタチンカルシウム、塩化カリウム、シンバスタチン、塩酸ベラパミル、フロセミド、塩酸プロプラノロール、カルベジロール（ｃａｒｖｅｄｉｌｏ）、リシノプリル、スピロノラクトン、ヒドロクロロチアジド、マレイン酸エナラプリル、マドロール、ラミプリル、エノキサパリンナトリウム、ヘパリンナトリウム、バルサルタン、塩酸ソタロール、フェノフィブラート、エゼチミブ、ブメタニド、ロサルタンカリウム、リシノプリル／ヒドロクロロチアジド、フェロジピン、カプトプリル及びフマル酸ビソプロロールが含まれる。
本発明の一実施形態において、ＴＮＦα抗体は、Ｃ型肝炎ウイルスを治療するために一般的に使用される薬剤と組み合わせて投与される。このような薬剤の例には、インターフェロン−α−２ａ、インターフェロン−α−２ｂ、インターフェロン−αｃｏｎ１、インターフェロン−α−ｎ１、ＰＥＧ化されたインターフェロン−α−２ａ、ＰＥＧ化されたインターフェロン−α−２ｂ、リバビリン、ＰＥＧインターフェロンα−２ｂ及びリバビリン、ウルソデオキシコール酸、グリチルレチン酸、サイマルファシン、マキサミン及びＶＸ−４９７が含まれる。
ＴＮＦα抗体は、乾癬を治療するための、局所コルチコステロイド、ビタミンＤ類縁体及び局所若しくは経口レチノイド又はこれらの組み合わせと組み合わせて投与され得る。さらに、ＴＮＦα抗体は、乾癬の治療のための以下の薬剤の１つと組み合わせて投与され得る。ＫＤＲの小分子阻害剤（ＡＢＴ−１２３）、Ｔｉｅ−２の小分子阻害剤、カルシポトリエン、プロピオン酸クロベタゾール、トリアムシノロンアセトニド、プロピオン酸ハロベタゾール、タザロテン、メトトレキサート、フルオシノニド、強化されたプロピオン酸エステルベタメタゾンジ、フルオシノロン、アセトニド、アシトレチン、タールシャンプー、吉草酸ベタメタゾン、フロ酸モメタゾン、ケトコナゾール、プラモキシン／フルオシノロン、吉草酸ヒドロコルチゾン、フルランドレノリド、尿素、ベタメタゾン、プロピオン酸クロベタゾール／ｅｍｏｌｌ、プロピオン酸フルチカゾン、アジトロマイシン、ヒドロコルチゾン、保湿処方、葉酸、デソニド、コールタール、二酢酸ジフロラゾン、エタネルセプト、フォラート、乳酸、メトキサレン、ｈｃ／ビスマスｓｕｂｇａｌ／ｚｎｏｘ／ｒｅｓｏｒ、酢酸メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、日焼け止め、サリチル酸、ハルシノニド、アンスラリン、ピバル酸クロコルトロン、石炭抽出物、コールタール／サリチル酸、コールタール／サリチル酸／硫黄、デスオキシキメタゾン、ジアゼパム、皮膚軟化剤、ピメクロリムス／皮膚軟化剤、フルオシノニド／皮膚軟化剤、鉱物油／ひまし油／ｎａ ｌａｃｔ、鉱物油／落花生油、石油／ミリスチン酸イスプロピル、ソラレン、サリチル酸、石鹸／トリブロムサラン、チメロサール／ホウ酸、セレコキシブ、インフリキシマブ、アレファセプト、エファリズマブ、タクロリムス、ピペクロリムス、ＰＵＶＡ、ＵＶＢ及び他の光療法並びにスルファサラジン。
皮膚症状を治療するために、他の薬剤と組み合わせて、抗体、抗体部分を使用し得る。例えば、本発明の抗体、抗体部分又はその他のＴＮＦα阻害剤は、ＰＵＶＡ療法と組み合わされる。ＰＵＶＡは、多くの様々な皮膚症状を治療するために使用されるソラーレン（Ｐ）と長波紫外線放射（ＵＶＡ）の組み合わせである。本発明の抗体、抗体部分又はその他のＴＮＦα阻害剤は、ピメクロリムスと組み合わせることも可能である。別の実施形態において、本発明の抗体は、乾癬を治療するために使用され、抗体は、タクロリムスと組み合わせて投与される。さらなる実施形態において、タクロリムスとＴＮＦα阻害剤は、メトトレキサート及び／又はシクロスポリンと組み合わせて投与される。さらに別の実施形態において、本発明のＴＮＦα阻害剤は、乾癬を治療するためのエキシマレーザー治療とともに投与される。
皮膚又は爪の疾患を治療するために、ＴＮＦα抗体とともに組み合わせることが可能な他の治療剤の非限定的な例には、ＵＶＡ及びＵＶＢ光治療が含まれる。ＴＮＦα阻害剤と組み合わせて使用することが可能な他の非限定的な例には、抗体を含む抗ＩＬ−１２及び抗ＩＬ−１８治療剤が含まれる。
一実施形態において、ＴＮＦα抗体は、ベーチェット病の治療において、さらなる治療剤と組み合わせて投与され得る。ベーチェット病を治療するために使用することができるさらなる治療剤には、プレドニゾン、シクロフォスファミト（シトキサン）、アザチオプリン（イムラン、メトトレキサード、トリメトプリム（ｔｉｍｅｔｈｏｐｒｉｍ）／スルファメトキサゾール（バクトリム又はセプトラとも称される。）及び葉酸が含まれるが、これらに限定されない。
上記治療剤の何れの１つも、単独で、又は組み合わせて、ＴＮＦαが有害であるＴＮＦα関連疾患に罹患している対象に、本発明の複数可変投薬治療計画を用いて、ＴＮＦα抗体と組み合わせて投与することができる。一実施形態において、上記治療剤の何れの１つも、単独で、又は組み合わせて、関節リウマチに罹患している対象に、ＴＮＦα関連疾患を治療するためのＴＮＦα抗体の他に投与することができる。さらなる治療剤は、上述のような組み合わせ療法において使用することができるのみならず、有益な効果が望まれる、本明細書において記載されているその他の適応症においても使用され得ることを理解すべきである。
本発明は、さらに、限定するもの解釈してはならない以下の実施例によって例示される。本願を通じて引用される全ての参考文献、特許及び公開された特許出願の内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。
実施例
図１Ａは、本発明の方法（図１Ａ）及び方法Ａ（１Ｂ）を含む各方法に対するＦｒａｃｔｏｇｅｌＳクロマトグラフィー工程の典型的な溶出プロファイルを示している。 図１Ｂは、本発明の方法（図１Ａ）及び方法Ａ（１Ｂ）を含む各方法に対するＦｒａｃｔｏｇｅｌＳクロマトグラフィー工程の典型的な溶出プロファイルを示している。 図２Ａは、本発明の方法（図２Ａ）及び方法Ａ（２Ｂ）を含むＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦクロマトグラフィー工程の流出洗浄特性の比較を示している。 図２Ｂは、本発明の方法（図２Ａ）及び方法Ａ（２Ｂ）を含むＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦクロマトグラフィー工程の流出洗浄特性の比較を示している。 図３Ａは、方法Ｂ（図３Ａ）及び方法Ａ（３Ｂ）を含むＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＨＰクロマトグラフィー工程の溶出特性の比較を示している。 図３Ｂは、方法Ｂ（図３Ａ）及び方法Ａ（３Ｂ）を含むＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＨＰクロマトグラフィー工程の溶出特性の比較を示している。 図４は、平均的な方法Ｂ（ダイヤモンド形）及び平均的な方法Ａ（四角形）に対するプロカテプシンＬの段階的な低下のグラフ表示を示している。 図５は、平均的な方法Ｂ（ダイヤモンド形）及び平均的な方法Ａ（四角形）に対するＨＣＰの段階的な低下のグラフ表示を示している。 図６は、活性化されたｉｎ−ｐｒｏｃｅｓｓ試料の速度論的な読み取りが、反応時間と蛍光シグナルとの線形関係を示したことを示している。
アダリムマブに対する精製操作
本実施例では、アダリムマブ及び宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の混合物を精製するための精製方法が考案され、本方法はプロセスＡと称される。プロセスＡでは、アダリムマブ−ＨＣＰ混合物は、プロテインＡクロマトグラフィー工程に供せられなかった。プロセスＡで使用される第一のカラムは、陽イオン交換樹脂であるＦｒａｃｔｏｇｅｌＳであり、アダリムマブはＦｒａｃｔｏｇｅｌＳに結合したが、ＨＣＰは流出した。次いで、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳカラムから、第一の溶出液中にアダリムマブを溶出した。次に、ウイルス的に不活化された調製物を得るために、第一の溶出液をｐＨウイルス不活化に供した。次に、ウイルス的に不活化された調製物を陰イオン交換樹脂Ｑｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにかけたが、アダリムマブはＱｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに結合せず、これにより、第一の貫流を得た。次いで、第一の貫流を疎水性相互作用カラムであるフェニルセファロースカラムにかけたが、アダリムマブはフェニルセファロースカラムに結合し、ＨＣＰは流出し、これにより、第二の溶出液を得た。瓶詰めされた最終産物を得るために、第二の溶出液のさらなる加工処理及び梱包を行った。
より詳細には、プロセスＡは、以下の工程を含む。
工程１：ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳカラム、１００×２０ｃｍ（１５７Ｌ）、ｖ＝１７５ｃｍ／時間、装填量＜３０ｇタンパク質／Ｌ樹脂／サイクル、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２５ｍＭ塩化ナトリウムで平衡化した。アダリムマブの装填後、平衡化緩衝液でカラムを一回洗浄し、第一の溶出液を得るために、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む溶出緩衝液で溶出した。
工程２：除脂肪ろ過；
工程３：限外ろ過；
工程４：ｐＨ３．５で１時間、ｐＨ不活化。不活化が完了した後に、ｐＨを６．８から７．５に調整し、５０ｍＭトロラミンの２容量でフィルタートレインを洗浄した。
工程５：ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦカラム、６０×３０ｃｍ（８５Ｌ）、ｖ＝１５０ｃｍ／時間、装填量＜４０ｇタンパク質／Ｌ樹脂／サイクル、２５ｍＭトロラミン、４０ｍＭ塩化ナトリウムを含む平衡化緩衝液ｐＨ７．６で平衡化し、貫流を得た。
工程６：フェニルセファロースＨＰカラム、８０×１５ｃｍ（７５Ｌ）、ｖ＝７５ｃｍ／時間（溶出３７．５ｃｍ／時間）、装填量２０から４０ｇタンパク質／Ｌ樹脂／サイクル、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１．１Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む平衡化緩衝液ｐＨ７で平衡化し、平衡化緩衝液で一回洗浄し、１１ｍＭリン酸ナトリウム、０．６２５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７．０への塩の段階的グラジエントを実行することによって溶出し、これにより、第二の溶出液を得、装填量が３５ｇタンパク質／リットル樹脂未満であれば、産物ピークの分画を行った。
工程７：ウイルスろ過；
工程８：最終限外ろ過；透析ろ過；
工程９：最終瓶詰め
プロセスＡのさらなる詳細は、以下の実施例２にも記載されている。
収率を向上させ、不純物を減少させるためのアダリムマブの精製
抗体アダリムマブの製造プロセス、すなわち、上の実施例１に記載されているプロセスＡ中の捕捉及び細密精製操作に改変を導入した。改変されたプロセスは、本明細書において、「プロセスＢ」と称され、以下の全工程を含む。出発材料は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞発現系を用いた発酵プロセスから得られた混合物であった。まず、この混合物を、陽イオン交換クロマトグラフィー、すなわち、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳカラムを用いて分離し、アダリムマブは、カラム上に捕捉された（「捕捉」と称する。）。ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳカラム上の装填量は、置換のために増加した。宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の量を減少させるために、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳカラムを洗浄する改良された方法を使用した。４５％溶出緩衝液及び５５％注射用水（ＷＦＩ）を含むより高い伝導度である中間洗浄を含む洗浄の複数で、結合したアダリムマブを有するＦｒａｃｔｏｇｅｌＳカラムを洗浄した。捕捉及び洗浄後に、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳカラムからアダリムマブを溶出し、陰イオン交換クロマトグラフィー、すなわち、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムに溶出液を供した。陰イオン交換カラム上に第一のアダリムマブ溶出液を走行させる前に、ｐＨ及び伝導度に基づいて、改善された方法を用いて、溶出液をウイルス的に不活化した。陰イオンカラムの貫流中にアダリムマブ調製物を集め、続いて、さらに、疎水性相互作用クロマトグラフィー、すなわち、フェニルセファロースカラムに従って分離した。本分野で標準的な方法に従って、ウイルスろ過、最終限外ろ過及び最終的な瓶詰めのために、フェニルセファロースカラムから得られた溶出液をさらに処理した。
プロセスＢは、ＨＣＰ及びプロカテプシンＬの低下したレベルを有する抗体調製物を達成するための改善された精製法である。本明細書に記載されているプロセスは、６０００Ｌの容量を用いて行われたが、プロセスＢに記載されている修飾は、あらゆる容量とともに使用され得ることに注意すべきである。プロセスＡとプロセスＢの改変の比較は、表５に記載されている（プロセスＢにおける改変は、太字で強調表示されている。）。
Figure 0006367277
プロセスＢ中の様々な工程に対する改変は、以下にさらに詳述されている。
陽イオンクロマトグラフィー
プロセスＢの最初の回収及び捕捉操作は、深層ろ過、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳＯ３ −陽イオン交換クロマトグラフィー（ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳ）を含み、後者は、清澄化された採集物由来のアダリムマブを捕捉し、プロセス関連の不純物（例えば、ＣＨＯ宿主細胞及び培地不純物）を低下させる役割を果たす。この操作に対して、直径１００ｃｍ×長さ２０ｃｍのカラム（総容積１５７Ｌ）を使用した。カラムにＦｒａｃｔｏｇｅｌＳ樹脂（ＥＭＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ，ＮＹ）を充填し、充填の質を測定するために、非対称性及び理論段数相当高さ（ＨＥＴＰ）を測定した。次いで、１．０ＭＮａＯＨで１時間、カラムを清浄化し、使用準備が整うまで、０．１ＭＮａＯＨ中に保存した。
陽イオン交換クロマトグラフィーは、タンパク質装填、イオン強度（ろ過された採集物希釈によって調節された。）、ｐＨ及び線速度によって影響を受け得る。タンパク質の装填は、選択性、分解能（純度）及び収率に影響を与え得る。イオン強度（装填物希釈によって調節される。）及び装填試料のｐＨは、結合能、選択性、分解能及び収率に影響を与えることができる。線速度は、物質輸送特性に影響を及ぼし得、極めて高い流速での減少した結合及び分離並びに極めて低い流速での軸方向分散をもたらす可能性を秘める。
ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳカラムへの最大装填量は、３５ｇタンパク質／樹脂１リットルまで増加した。２０ｍＭリン酸ナトリウム、２５ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７で、陽イオンカラムを平衡化した。平衡化後に、３５ｇタンパク質／希釈された深層ろ過液の樹脂１リットル未満をカラムに装填する。伝導度を約６．１ｍＳ／ｃｍまで低下させるために、水約１．３部で、深層ろ液１部を希釈した。次いで、平衡化緩衝液でカラムをベースラインまで洗浄した後、９ｍＭリン酸ナトリウム、６８ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７（４５％溶出緩衝液、５５％ＷＦＩと等しい。）で洗浄した。２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７（溶出緩衝液）で、産物を、カラムから単一の画分中に溶出した。前端及び後端上の産物ピークＡ２８０のフルスケール偏向の１０％から産物プールを集める。未精製アダリムマブを処理するために、必要に応じて、カラムを反復した。各カラムサイクルから得られたＦｒａｃｔｏｇｅｌＳ溶出液を、同じ収集タンク中にプールした。各サイクルの間に、２５ｍＭリン酸ナトリウム、１．０ＭＮａＣｌ、ｐＨ７で、カラムを再生した。
以前に確立された１５から３０ｇタンパク質／リットル樹脂の受容可能な操作域（ＡＯＲ；Ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｒａｎｇｅ）より高い装填域で、産物の効率的な回収及びＨＣＰの低下が達成され得ることが研究室規模で行われた研究によって示された。カラム装填量に対するアダリムマブのブレークスルーの分析は、計算された５％ブレークスルーは、ｐＨ７において、３８ｇ／リットル樹脂で起こることを示している。従って、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳクロマトグラフィー工程に対して、３５ｇタンパク質／リットル樹脂以下の改定されたＡＯＲが確立された。すなわち、装填量の限界も、３５ｇタンパク質／リットル樹脂まで増加して、処理能力を増加させた。
Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ樹脂を用いた実験の別の組では、アダリムマブブレークスルーに対するｐＨの効果をカラム装填量に対して調べた。特に、所定の装填条件下での樹脂動的結合能を決定するために、産物ブレークスルー曲線を使用した。下表６は、以前に記載されたｐＨ７の条件でのＦｒａｃｔｏｇｅｌ装填能力研究に対する回収データを要約する。１０ｇ／Ｌでの回収％を１００％になるように標準化した。
Figure 0006367277
ｐＨ７での結果は、５０ｇアダリムマブ／Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ／樹脂１リットル未満の装填条件に対して、９０％を超えるアダリムマブの回収が観察されたことを示している。アダリムマブブレークスルーを、装填能力に対してプロットして、理論ブレークスルー曲線を作成した。ｐＨ７において、理論１０％ブレークスルーは、５４ｇアダリムマブ／Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ樹脂１リットルであることが明らかとなった。同じくｐＨ７において、理論５％ブレークスルーは、３８ｇアダリムマブ／Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ樹脂１リットルであることが明らかとなり、上記の結果を確認した。
装填及び最初の洗浄ｐＨ条件がｐＨ５になるように調整されたことを除き、同様の研究を上述のように実施した。２４ｍＭクエン酸及び５１ｍＭリン酸水素二ナトリウム、ｐＨ５で、陽イオンカラムを平衡化した。平衡化後に、希釈された深層ろ過液の樹脂１リットル当り最大８０ｇのタンパク質をカラムに装填した。深層ろ過の前に、細胞培養採集物を、３Ｍ酢酸で５．０になるようにｐＨ調整した。伝導度を約８から１０ｍＳ／ｃｍまで低下させるために、水の概ね同じ容量で、深層ろ過液１部を希釈した。再度、アダリムマブブレークスルーを、装填能力に対してプロットして、理論ブレークスルー曲線を作成した。研究した条件下において、理論１０％ブレークスルーは、約７４ｇアダリムマブ／Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ樹脂１リットルであることが明らかとなった。理論５％ブレークスルーは、約７３ｇアダリムマブ／Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ樹脂１リットルであることが明らかとなった。樹脂の陽イオン交換の特性の故に、クロマトグラフィー条件のｐＨを低下させることによって、アダリムマブ動的結合能が大幅に増加した。ｐＨ５及びｐＨ７でのブレークスルー曲線を比較すると、アダリムマブ分子とＦｒａｃｔｏｇｅｌ樹脂間での結合は、より低いｐＨでずっと強いことが観察された。ｐＨ５での装填動的能力がより高くなるにつれて、よりよいＨＣＰ排除が達成することも見出された。下表７は、新たに検査されたｐＨ５の条件での溶出液中に存在するＨＣＰに対するＦｒａｃｔｏｇｅｌ装填能力研究に関するデータを要約する。データは、検査された条件下で、アダリムマブによるＨＣＰの置換が起こったことを明白に示している。
Figure 0006367277
ｐＨ５でのカラム装填に対するアダリムマブのブレークスルーの分析は、７３ｇ／Ｌ樹脂において、計算上５％のブレークスルーが起こることを示したので、ｐＨ５でＦｒａｃｔｏｇｅｌＳクロマトグラフィー工程に対して、７０ｇタンパク質／Ｌ樹脂以下の改善されたＡＯＲを確立することができる。つまり、以前に、（上述のように）ｐＨ７において、３５ｇタンパク質／リットル樹脂まで増加された装填限界が、ｐＨを５まで低下させることによって、７０ｇタンパク質／リットル樹脂までさらに増加させることができる。
中間洗浄
アダリムマブ調製物中の不純物の量をさらに低下させるために、陽イオンカラムからのアダリムマブ溶出の前に、中間洗浄工程を行った（下表８参照）。この追加の洗浄は、溶出緩衝液の伝導度に対して調整され、ＨＣＰの排除を向上させるのに役立った。溶出の前に中間洗浄工程を挿入することによって、プロセスＡに比べて６０％超、アダリムマブとともに溶出されるＨＣＰの量が低下した。調査されたパラメータには、洗浄において使用した水と溶出緩衝液の混合割合（％溶出緩衝液）、伝導度、ｐＨ、洗浄容量、流速及び樹脂の古さが含まれた。最適な洗浄は、４５％溶出緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７）及び５５％水の混合物からなる。表８は、追加の洗浄あり及びなしのＦｒａｃｔｏｇｅｌＳ溶出液中のＨＣＰのレベルを比較するデータを表している。ＨＣＰに関して、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳ溶出液の試料をアッセイし、より高い装填量と洗浄段階を取り込んだ予備的スケールのＦｒａｃｔｏｇｅｌＳプロセスからの溶出液中のＨＣＰレベルと比較した。予備的スケールのデータは、第二の洗浄工程の追加が、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳ工程によるＨＣＰの排除を大幅に改善することを示している。
Figure 0006367277
各プロセスに対するＦｒａｃｔｏｇｅｌＳクロマトグラフィー工程の典型的な溶出プロファイルが、図１に示されている。プロセスＢは、溶出前に、上記追加の中間洗浄工程を含み、従って、溶出ピークの先頭がより鋭く、以前のプロセスより少ない早期溶出種が検出された。つまり、ＨＣＰなどのプロセス関連不純物の排除を改善するために、アダリムマブの溶出直前に、中間洗浄工程がＦｒａｃｔｏｇｅｌＳ工程に導入された。
ウイルス不活化
プロセスＢの低ｐＨ不活化工程は、除脂肪ろ液中に存在する可能性を有する、外被に包まれた検出されないウイルスを不活化することによって安全域を与える。続いて、粒状物を除去し、生物負荷（ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ）を最小限に抑えるために、ウイルス不活化されたプールのｐＨを中性にし、ろ過した。低ｐＨウイルス不活化中のアダリムマブの品質は、ｐＨ及び低ｐＨでの温置時間によって影響を受け得る。ウイルス不活化は、これらの同じパラメータに依存し、高い濃度において不活化を低下させ得るタンパク質濃度によって影響を受け得る。低ｐＨでの最小温置時間を１５分から６０分に増加した。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の細胞傷害効果からマウスＬ９２９細胞を保護するアダリムマブの能力を損なうことなく、ｐＨ３．５で１時間、アダリムマブを安全に保つことが可能であることが、低ｐＨ工程前及び後に採取された製造試料の分析によって確認された。
不活化の後に、その後のカラム（例えば、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅカラム）の平衡化緩衝液に従って、ウイルスによって不活化された溶出液のｐＨ及び伝導度が調整された。８．０を目標ｐＨとして、ｐＨを７．８から８．２に調整した。つまり、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ装填物としての役割を果たすウイルス不活化されたプールのｐＨ及び伝導度は、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ平衡化緩衝液のｐＨ及び伝導度に合致するように調整された。
陰イオンクロマトグラフィー
陰イオンカラム、すなわち、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ工程は、ＨＣＰ、具体的には、プロカテプシンＬなど、並びにＤＮＡ及びインシュリンなどのプロセス関連不純物を低下させる役割を果たす。ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦクロマトグラフィーのために、直径６０ｃｍ×長さ３０ｃｍのカラム（総容積８５Ｌ）を使用した。カラムにＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を充填し、充填の質を測定するために、非対称性及びＨＥＴＰを測定した。次いで、１．０ＭＮａＯＨで１時間、カラムを清浄化し、使用準備が整うまで、２５ｍＭリン酸ナトリウム、２０％イソプロパノール中に保存した。
２５ｍＭトロラミン、４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８（平衡化緩衝液）を用いて、樹脂の平衡化を達成した。この工程に対する最大タンパク質装填量は、４０ｇタンパク質／樹脂１リットル／サイクル以下であった。プロセス関連不純物は樹脂に吸着し、アダリムマブはカラムから流出した。希釈され、ろ過され、ウイルス不活化された物質を、概ね等しい量の２つのサイクルで、典型的に処理した。全ての得られる物質を処理するためには、追加のサイクルが必要であり得る。１５０ｃｍ／時間で装填及び溶出を行い、Ａ２８０が約２％フルスケール上昇した時点で、カラム貫流を収集する。次いで、平衡化緩衝液でカラムを洗浄し、Ａ２８０が５％フルスケールに戻るまで、洗浄物を集めた。貫流とともに洗浄物をプールし、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＴＷと称する。サイクルの間に、２５ｍＭリン酸ナトリウム、１．０ＭＮａＣｌ、ｐＨ７で、カラムを再生し、次いで、平衡化緩衝液を用いて平衡化した。
流出モードで稼動された陰イオン交換クロマトグラフィーは、タンパク質装填量、イオン強度（低ｐＨ不活化ろ液の希釈によって収集され得る伝導度）、ｐＨ及び線速度によって影響を受け得る。タンパク質の装填は、選択性及び収率に影響を与え得る。装填試料のイオン強度及びｐＨは、結合能及び選択性に影響を与え得る。線速度は、物質輸送特性に影響を及ぼし得、極めて高い流速でのプロセス関連不純物の減少した結合及び極めて低い流速での軸方向分散をもたらす可能性を秘める。新しい装填伝導度及びｐＨ範囲は、研究室での研究に基づいて確立された。
ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ工程によるＨＣＰの低下が装填条件への変化によって増強され得ることが、研究室での研究によって示された。調査されたパラメータには、装填ｐＨ、伝導度及び樹脂１リットル当りの装填されたタンパク質のグラムが含まれた。装填伝導度及びｐＨをカラム平衡化緩衝液の装填伝導度及びｐＨ（５ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ８）と合致するように調整し、装填量を４０ｇアダリムマブ／リットル樹脂未以下に限定することによって、ＨＣＰ及びプロカテプシンＬの改善された排除がもたらされる。表９は、プロセスＡ（ｐＨ７．７、伝導度６．６５ｍＳ／ｃｍ）及びｐＨ８の改善されたプロセス条件及びプロセスＢの５ｍＳ／ｃｍの伝導度下におけるＨＣＰの低下を示す実験室規模のデータを表している。ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅカラム上の装填量を４０ｇ／リットル樹脂に限定することによって、ＨＣＰの排除の４倍の改善がもたらされ、装填のｐＨ及び伝導度に対するさらなる変更によって、ＨＣＰの低下がさらに３倍改善される。
Figure 0006367277
続いて、イオン交換カラムから得られた、アダリムマブを含むＨＣＰが低下した貫流を、疎水性相互作用クロマトグラフィー中で使用した。
疎水性相互作用クロマトグラフィー
ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰクロマトグラフィーカラムの目的は、それぞれ、宿主細胞タンパク質及び凝集物などのプロセス関連及び産物関連不純物をさらに低下させることであった。この操作のために、直径８０ｃｍ×長さ１５ｃｍのカラム（総容積７５Ｌ）を使用した。カラムにＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を充填し、充填の質を測定するために、非対称性及びＨＥＴＰを測定した。次いで、１．０ＭＮａＯＨで１時間、カラムを清浄化し、使用の準備が整うまで、２５ｍＭリン酸ナトリウム、２０％イソプロパノール中に保存した。
２０ｍＭリン酸ナトリウム、１．１Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７．０（平衡化緩衝液）を用いて、樹脂の平衡化を達成した。この工程に対するタンパク質の装填量は、樹脂１リットル当り２０から４０ｇタンパク質であり、利用可能な物質の全量を処理するために、２つ又は３つのクロマトグラフィーサイクルが必要であった。カラムは、７５ｃｍ／時間の線速度で動作した。４０ｍＭリン酸ナトリウム、２．２Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７．０の等容量を用いて、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ貫流を希釈した。装填後に、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１．１Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７．０を用いてカラムを洗浄した。１１ｍＭリン酸ナトリウム、０．６２５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７．０まで、塩の段階的勾配を実施することによって、産物を溶出した。吸光度が５０％ＵＶフルスケールを上回って上昇するにつれて産物を収集し、ピークが尾を引くにつれて吸光度が２０％ＵＶフルスケール未満に減少するまで継続した。
ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳ及びＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦクロマトグラフィー工程へのプロセスの改変によって、Ｐｈｅｎｙｌ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ工程に配置されたプロセス関連不純物を低減する負担が著しく軽減された。変化の結果、ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ工程の主要な機能はアダリムマブ凝集物の除去であった。
ＵＶ吸光度が５０％フルスケール偏向を上回って上昇するにつれて、３５ｇタンパク質／リットル樹脂又はそれ以上のカラム装填量で、産物が収集され、吸光度が２０％フルスケール未満に減少するまで継続することが、プロセスＡには必要であった。３５ｇタンパク質／リットル樹脂を下回るカラム装填量では、この工程でのＨＣＰ排除を改善するために、溶出液ピークの最初の０．１５カラム容積は収集されたプールから除外した。流入するＨＣＰ装填量が著しく低減したので、プロセスＢにおける前クロマトグラフィー工程に変更を取り込むことによって、３５ｇタンパク質／リットル樹脂未満の装填量でピークを除外する必要性が緩和された。ＨＣＰ装填量の低下によって、分画なしでの装填範囲の拡大が可能となった。この変化の効果によって、ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰピークを切除せずに、回収プロセスによって、各発酵から得られた全ての物質を処理することが可能となる。
ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ操作に対する線流速は、研究室スケールで調べた。アダリムマブの装填量は一定に保たれ、２５から１２５ｃｍ／時間の流速を調べた。流速は産物の回収に影響を与えたが、ＳＥＣ（％単量体）及びＨＣＰの排除（表１０）によって評価したところによれば、産物の品質に対しては影響を与えず、２５から１２５ｃｍ／時間というより幅広い範囲を正当化合した。ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ製造操作に対する目標流速は、以前に確立されたように、７５ｃｍ／時間及び溶出相に対する３７．５ｃｍ／時間のままである。
Figure 0006367277
ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰクロマトグラフィーに対して許容される操作域を調べた。疎水性相互作用クロマトグラフィーは、タンパク質装填量、イオン強度（伝導度）及び線速度によって影響を受け得る。タンパク質の装填量は、選択性及び収率に影響を与え得る。装填試料のイオン強度は、結合能、選択性及び分離に影響を与え得る。線速度は、物質輸送特性に影響を及ぼし得、極めて高い流速でのプロセス関連不純物の減少した分離及び極めて低い流速での軸方向分散をもたらす可能性を秘める。線流速の範囲は、２５から１２５ｃｍ／時間に拡張される。ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーに対して許容される他の操作域は、６０００Ｌのプロセスに対して以前に確立されたものと不変であり、表１０に列記されている。
両プロセスでの細密精製操作の同等な性能が示された。改善されたプロセスＢの一部として導入された変化には、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ装填物としての役割を果たすウイルス不活化されたプールのｐＨ及び伝導度をＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ平衡化緩衝液と合致するように調整すること、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ装填量を４０ｇタンパク質／リットル樹脂未満に限定すること、及び３５ｇタンパク質／リットル樹脂未満の装填量でＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液を分画する必要をなくしたことが含まれる。ＳＥＣ及びＷＣＸ−１０アッセイによって測定された中間体の品質は、２つのプロセス間において同等であった。
各プロセスに対するＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ及びＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰクロマトグラフィー工程の典型的な溶出プロファイルが、それぞれ、図２及び３に示されている。アダリムマブを含むＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ貫流を収集した。前クロマトグラフィー工程（ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳ）での装填量がより多く、希釈容積が増加しているために、プロセスＢに対する装填容量は以前のプロセスより高く、従って、総貫流容積も対応して、より大きくなっている。
つまり、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳ及びＱｓｅｐｈａｒｏｓｅ操作での変化から生じた不純物除去の改善のために、３５ｇタンパク質／リットル樹脂未満の装填量に対してＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液を分画する必要がなくなった。さらに、線流速の範囲は、２５から１２５ｃｍ／時間に拡張された。
ＨＣＰの低下
プロセスＢは、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、具体的には、プロカテプシンＬなどのプロセス関連不純物の調節を改善するために実行される、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳ及びＱＳｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー工程に対する改変を含んだ。これらの不純物の除去に対するプロセスＢの影響を評価するための研究を実施した。ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳ、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ及びＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラムがＣＨＯ宿主細胞タンパク質を除去する能力は、製造スケールで評価した。ＨＣＰＥＬＩＳＡによって、宿主細胞タンパク質レベルを測定し（実施例３参照）、ｎｇＨＣＰ／ｍｇアダリムマブでデータを表す。
プロセスＢの間に代表的な試料を採取し、ＨＣＰに関してアッセイを行った。結果は、表１１に表されている。クロマトグラフィー工程に対する変化は、ＨＣＰ排除を改善することが予想される、より厳格なクロマトグラフィー条件に相当する。報告されている除脂肪ろ過の結果は、プロセスＡから得られたものである。除脂肪ろ過工程は、プロセスＢにおいて不変であり、従って、この工程において達成されたＨＣＰの低下倍数は、プロセスＢの総合的な性能に含められている。平均して、プロセスＢは、ＨＣＰの４．３５ｌｏｇ１０超を除去することができる。ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳ及びＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦクロマトグラフィーは何れも、１ｌｏｇ１０ＨＣＰより多くを除去し、深層ろ過工程も１ｌｏｇ１０超を除去した。ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムによってさらなるＨＣＰが除去されたが、装填及び溶出液ＨＣＰレベルは何れも定量レベルを下回っていたので、排除値は計算できなかった。プロセスＢによって産生された薬物物質は、３つの検証ロットに関して、定量限界（ＬＯＱ）を下回るＨＣＰレベルを示した。
Figure 0006367277
それぞれ、表１２及び１３中に、ＨＣＰ及びプロカテプシンＬレベルの総合的な改善も示されており、プロセスＢは、プロセスＡに比べて、両レベルの有意な減少を示した。
プロカテプシンＬプロセスのマッピング
数段階において、プロセス中間試料を採取し、プロカテプシンＬのカテプシンＬへの活性化によって生成された蛍光を分析した。プロセスＢ及びプロセスＡの試料に対する結果が、下表１４に示されている。ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳ装填及びＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ装填及び溶出液試料は、方法を妨害するために評価できなかった。ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦクロマトグラフィー工程は、装填物中の検出可能な酵素の９０％超を除去する能力を有している。改善されたプロセスから得られたＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ流出及び洗浄物（ＦＴＷ）は、６０００Ｌの前プロセスから得られたＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＴＷより、約５０％少ない活性化可能なプロカテプシンＬを含有する。その間に除脂肪ろ過、限外ろ過による濃縮、低ｐＨウイルス不活化及び深層ろ過操作が行われる、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳとＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ工程の間にも減少が生じる。
Figure 0006367277
プロセスＡとＢにおけるプロカテプシンＬの低下の比較は、図４に示されている。プロセスＢは、各中間工程において、プロセスＡより低いプロカテプシンレベルＬを示し、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳ及びＱＳｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー工程に対する改変が、この不純物の除去に関するプロセス性能を改善することを示唆している。
ＨＣＰプロセスマッピング
プロセスＡ及びＢの両者からプロセス中間試料を収集し、ＨＣＰ含量に関して分析した。ＨＣＰの低下に関して２つのプロセスを直接比較するために、本研究を行った。ＨＣＰ分析の結果は、表１５に示されている。両プロセスにおいて、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳ及びＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ工程で、ＨＣＰの顕著な除去が起こるが、プロセスＢは、これらの両工程にわたって、改善されたＨＣＰの排除を示す。改善されたＦｒａｃｔｏｇｅｌＳ工程（産物溶出の前の第二の洗浄工程を含む。）は、９６倍（１．９６ｌｏｇ１０）の低下倍数を有するのに対して、以前のプロセスにおける同じ工程は、４８倍（１．６７ｌｏｇ１０）の低下倍数をもたらす。両プロセスは、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳ及びＱＳｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー工程の間に行われた除脂肪ろ過によって達成された５０倍の低下倍数を示した。プロセスＢ中でのＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ操作は、カラム平衡化緩衝液のｐＨ及び伝導度まで調整された装填物を用いて行われる。改善されたＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ工程によって達成されたＨＣＰ低下倍数は、前プロセスによって示されたＨＣＰ低下倍数を４倍上回る（２１ｖｓ．５）。ＨＣＰのレベルが改善されたプロセスＵＦ／ＤＦ／プール及び薬物物質中の定量レベルを下回るように、さらなる低下が、ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ工程を通じて起こる。以前の薬物物質試料は、極めて低いが測定可能なＨＣＰのレベルを示す。
Figure 0006367277
ｌｏｇ１０スケールでプロットされたプロセスＡとＢにおけるＨＣＰ低下の比較が、図５に示されている。プロセスＢは、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ工程後の１０倍の差など、各中間工程でプロセスＡより低いＨＣＰレベルを示し、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳ及びＱＳｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー工程に対する改変がＨＣＰの除去に関するプロセス性能を改善することを示唆している。
処理能力に対する捕捉及び細密精製操作の影響
プロセスＢにおける捕捉及び細密精製操作の処理能力を増加させるために２つの変化が導入された。第一の変化は、ｐＨ７で３０ｇタンパク質／リットル樹脂から３５ｇタンパク質／リットル樹脂まで、ｐＨ５で３０ｇタンパク質／リットル樹脂から７０ｇタンパク質／リットル樹脂まで、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳカラム上での許容装填限界の増加であった。これらの変化によって、バイオリアクターに由来するろ過された採集物質全てをＦｒａｃｔｏｇｅｌＳカラム上に装填することが可能となった。ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳカラム上への平均装填量は、以前のプロセスでの装填量より、改善されたプロセス（ｐＨ７において）で約９％高かった（表１６）。
第二の変化は、３５ｇタンパク質／リットル樹脂未満を装填した際にＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ産物ピークを分画する必要がなくなったことであった。宿主細胞タンパク質を十分に管理するために、分画は、産物ピークのかなりの割合の廃棄をもたらした。宿主細胞タンパク質及びプロカテプシンＬレベルを管理するために、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳ及びＱｓｅｐｈａｒｏｓｅ工程で実施された変更によって、ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅピークの分画が不要となった。この変化によって、プロセスＢに対して、より低い装填量域でＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムの３サイクルを実行することが可能となり、プロセスＡと比べて、ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅカラム上の合計装填量が１２％増加した。
表１６は、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳ及びＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｅカラム上の装填量並びに改善されたプロセス及び以前のプロセスから得られた最終薬物物質量を比較する。改善されたプロセスは、３つの検証バッチに対して、アダリムマブ収率の計約８％の増加を示す。
Figure 0006367277
抗体アダリムマブを精製する改善された方法は、（プロセスＡに比べて）ＨＣＰ及びプロカテプシンＬの排除を改善し、薬物物質の減少したレベルをもたらす。より具体的には、表１７に記載されているように、薬物物質ロット放出データの比較において、ＨＣＰ及びプロカテプシンＬの以下のレベルを測定した。
Figure 0006367277
プロセスＢを用いて産生された薬物物質の広範な性質決定を実施した。３つの検証ロットから得られた薬物物質を分析し、アミノ酸分析、円二色性、分析的遠心、ＱＳＴＡＲＬＣ質量分析、ＭＳ検出を用いた非還元トリプシン及びＬＹＳＣペプチドマッピング、遊離スルフヒドリルアッセイ、ＭＳ検出を用いたトリプシンペプチドマッピング、イムノブロット、Ｌ９２９バイオアッセイ及びＢＩＡｃｏｒｅなどのアッセイを用いて、アダリムマブ参照標準と比較した。改善されたプロセスによって製造された薬物物質の全てのバッチは許容される基準を満たし、参照標準と同等である。
つまり、プロセスＢの性能は、発酵、捕捉及び細密精製段階で、プロセスＡと同等であることが示された。しかしながら、プロセスＢは、宿主細胞タンパク質及びプロカテプシンＬの低下に関して改善された能力を示すとともに、アダリムマブの収率に関する能力の増加を示す。さらに、薬物物質放出試験及び広範な特性決定研究は、プロセスＢによって産生されるアダリムマブ薬物物質の、プロセスＡによって産生されるアダリムマブ薬物物質との同等性を示す。
Figure 0006367277
Figure 0006367277
ＨＣＰ検出に対するアッセイ
以下の実施例は、実施例２に記載されているプロセスＢから得られたアダリムマブ薬物物質試料の残留宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）濃度を測定するためのＨＣＰＥＬＩＳＡ法を記載する。特異的抗体の２つの層間にＨＣＰ抗原を含む試料を挟むために、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を使用した。この後に、カゼインで非特異的部位を封鎖した。次いで、試料を温置し、この間に、第一の抗体（アフィニティー精製されたコーティング抗体Ｃｙｇｎｕｓヤギ抗ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣））によって、抗原分子が捕捉された。次いで、抗原（ＣＨＯ宿主細胞タンパク質）に固定された二次抗体（ビオチン化された抗ＣＨＯ宿主細胞タンパク質）を添加した。重要なことに、抗体を作製するために使用された細胞からＨＣＰに対して特異的な第二の抗体を作製した。ビオチン化された抗ＣＨＯ宿主細胞タンパク質に結合するＨＲＰが連結されたニュートラビジンを添加した。この後に、Ｋブルー基質を添加した。結合された酵素連結された抗体によって発色性基質を加水分解し、青色を生成する。２ＭＨ３ＰＯ４を用いて反応を停止させ、色が黄色に変化する。色強度は、ウェルに結合された抗原の量に正比例した。ＨＣＰＥＬＩＳＡは、標準的なＥＬＩＳＡ法より、抗体調製物中のＨＣＰレベルの測定に関して改善を示した。
カテプシンＬ速度論アッセイ
プロセスＢのプロセス中間体を製造するアダリムマブに対してカテプシンＬ活性を定量するために、速度論アッセイを開発し、使用した（実施例２参照）。製造過程の試料の変動するタンパク質含量及び緩衝液組成物が方法を妨害し得るので、薬物物質放出検査に対してＨＣＰを測定するために使用された弱陰イオン交換ＨＰＬＣアッセイ（ＷＡＸ−１０ＨＰＬＣ）は本研究のために使用できなかった。プロセス中間体中のプロカテプシンＬを直接定量することができないことが、速度論的蛍光法によるカテプシンＬの活性を測定するアッセイの開発に結びついた。速度論的アッセイ、すなわち、高処理量の蛍光酵素法は、プロカテプシンＬレベルを検出するために使用される標準的な方法より、製造過程の試料に対してより少ない妨害を有する。速度論的アッセイは、実施例１及び２に記載されている製造過程のアダリムマブ試料を精製するためのプロセスの確実性を調べるための手段も提供する。
この方法は、硫酸デキストランの添加によって、試料中のプロカテプシンＬをカテプシンＬへ活性化させる。励起３８０ｎｍ及び発光４６０ｎｍでカテプシンＬ活性を検出するために、蛍光生成ペプチド基質Ｚ−ロイシン−アルギニン−ＡＭＣ（７−アミノ−４−メチルクマリン）を使用した。１秒当りの基質の切断によって生成された蛍光発生シグナルの勾配によって、試料中の蛍光活性のレベルを測定した。この蛍光活性アッセイの範囲は、０．０１４４から１．０４ＲＦＵ／秒の間であることが決定された。この活性は、検査試料中に存在するアダリムマブの量と相関していたので、結果は、ＲＦＵ／秒／ｍｇアダリムマブとして報告されている。ＪＭＰソフトウェアによって得られたＤＯＥ実験を使用して、各プロセス中間体試料に対して、最大蛍光シグナルを達成するための最適な活性化条件を開発した。本アッセイに対して推奨される活性化条件が、表１６に要約されている。
材料と方法
５００ｍＭＤＴＴ原溶液の調製物
ＵｌｔｒａｐｕｒｅＤＴＴ７．７ｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水９０ｍＬ中に添加し、均一になるまで混合した。１００ｍＬの最終容積になるまで、溶液にＭｉｌｌｉ−Ｑ水を注ぎ足した。次いで、この５００ｍＭＤＴＴ原液を分取し、−８０℃で保存した。
活性化緩衝液（２５ｍＭＮａＯＡｃ、５ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＥＤＴＡｐＨ５．５）の調製
酢酸ナトリウム３．４４ｇ（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）、ＥＤＴＡ０．３８ｇ（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）及びＭｉｌｌｉ−Ｑ水９５０ｍＬを、適切な容器に添加し、完全に均一になるまで混合した。１ＭＨＣｌを用いて、緩衝液のｐＨを５．５に調整し、メスフラスコ中で１Ｌの最終容量になるようにした。０．２２μｍフィルターを通して緩衝液をろ過し、使用前に４℃で保存した。５ｍＭの最終濃度になるように、使用当日に、ＤＴＴ原溶液５００μＬ（上記５００ｍＭ）を緩衝液５０ｍＬに添加した。
硫酸デキストラン＋０．１％アジ化ナトリウム原溶液の調製
硫酸デキストラン（ＥＭＳｃｉｅｎｃｅ）１ｇをＭｉｌｌｉ−Ｑ水９０ｍＬ中に添加し、均一になるまで混合した。１ｍｇ／ｍＬ原溶液から、アジ化ナトリウム１００μＬを添加した（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）。１００ｍＬの最終容量になるように、溶液を注ぎ足した。次いで、この溶液を分取し、−８０℃で保存した。
速度論的アッセイの設定
カテプシンＬ活性に関して検査すべき試料は、プロエンザイム（プロカテプシンＬ）の活性な酵素（カテプシンＬ）への活性化を必要とする。活性化緩衝液中に試料を希釈し、硫酸デキストランを添加し、３７℃で適切な時間温置することによって、これを達成した（以下で詳しく論述されている。）。活性化後、−８０℃で試料を保存し、安定に保つことができる。製造過程の試料に対して決定された最適な活性化条件が表１８に示されている。
Figure 0006367277
検査の当日、検査試料の分取試料を−８０℃から取り出し、氷槽中で溶かした。一旦検査試料が溶けたら、各試料の（２×）１００μＬを、黒のポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号３６５０）中に装填した。光から保護しながら、Ｚ−Ｌ−Ｒ−ＡＭＣ蛍光発生ペプチド基質ＶＩＩ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）の分取試料を溶かした。２０μＭの最終濃度まで、酢酸塩緩衝液で基質を１：１３５０希釈した。蛍光発生基質１００μＬを、各ウェルに添加した。次いで、光から保護しながら、プレートを約１秒間混合し、３７℃で３分間温置した。次いで、３７℃に設定された蛍光プレート読み取り装置中にプレートを配置した。励起波長を３８０ｎｍに設定し、発光波長を４６０ｎｍに設定した。３分ごとに、各ウェルの蛍光を３０分間測定し、基質加水分解の速度を計算した。次いで、希釈倍数を考慮に入れた結果を、比較のために、アダリムマブ濃度によって除した。この速度論的アッセイを用いる結果は、実施例２に上記されている。
１．３９の吸光係数を使用して、Ａ２８０によってアダリムマブ濃度を測定した。ＰｏｒｏｓＡ分析を用いて、研究試料に対してアダリムマブ定量を実施した。標準曲線内での読み取りを達成するために、試料の希釈を適用した。ＰｏｒｏｓＡＩｍｍｕｎｏＤｅｔｅｃｔｉｏｎセンサーカートリッジ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を用いて、ＳｈｉｍａｄｚｕＨＰＬＣシステムを構成した。カラムを周囲温度に維持した。２ｍＬ／分で、システムを実施した。自動試料回収装置のトレイ温度を４℃に設定した。吸光度を２８０ｎｍでモニターした。緩衝液Ａは１×ＰＢＳであった。緩衝液Ｂは０．１Ｍ酢酸及び１５０ｍＭ塩化ナトリウムであった。試料を注入し、１００％緩衝液Ｂを用いて、アダリムマブを溶出した。
アダリムマブのＣＨＯ細胞発現から得られた物質からの、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ装填物を用いた蛍光発光ペプチドの代謝回転（第一の溶出液実施例２；プロセスＢ参照）が図６に示されている。０．５μｇ／ｍＬ硫酸デキストランを用いて、この試料を、活性化緩衝液でアダリムマブの２００、５０及び２０μｇ／ｍＬになるように希釈し、３７℃で１６時間温置した。５０及び２０μｇ／ｍＬのこのロットは、線形の応答を示した。Ｒ２値は０．９９以上である。しかしながら、２００μｇ／ｍＬのロットは、３０分の測定時間の終了に向けて、非線形的な基質の代謝回転を示し、より低い０．９１のＲ２値をもたらす。従って、線形の加水分解速度を維持するために、注意深い試料の希釈が不可欠である。
プロカテプシンＡのレベルを測定するためにカテプシン活性を使用する速度論的アッセイが、反復性精度を含む精度分析を含むＩＣＨガイドラインに準拠していることを確認するためにもアッセイを行った。さらに、容器の種類、例えば、ガラス及びポリプロピレンバイアルが、カテプシンＬ活性に影響を与えることを決定した。この結果は、ガラス容器ではなく、ポリプロピレン容器中で温置した場合に、カテプシンＬのより高いレベルが達成されていることを示唆する。両事例において、ｐＨ５．５でのプロカテプシンＬ活性化のために、０．５μｇ／ｍＬ硫酸デキストランの添加が必要であった。
つまり、速度論的アッセイの精度は、このアッセイがアダリムマブプロセス中間体の潜在的カテプシンＬ活性の検出のために有効であることを示している。
本願は、米国特許第６，０９０，３８２号、第６，２５８，５６２号及び第６，５０９，０１５号に関連する。本願は、２００１年３月７日に出願された米国特許出願０９／８０１，１８５；２００２年１１月２２日に出願された米国特許出願１０／３０２，３５６；２００２年６月５日に出願された米国特許出願１０／１６３６５７；及び２００２年４月２６日に出願された米国特許出願１０／１３３７１５；２００２年８月１６日に出願された米国特許出願１０／２２２１４０；２００３年１０月２４日に出願された米国特許出願１０／６９３２３３；２００３年７月１８日に出願された米国特許出願１０／６２２９３２；２００３年７月１８日に出願された米国特許出願１０／６２３０３９；２００３年７月１８日に出願された米国特許出願１０／６２３０７６；２００３年７月１８日に出願された米国特許出願１０／６２３０６５；２００３年７月１８日に出願された米国特許出願１０／６２２９２８；２００３年７月１８日に出願された米国特許出願１０／６２３０７５；２００３年７月１８日に出願された米国特許出願１０／６２３０３５；２００３年７月１８日に出願された米国特許出願１０／６２２６８３；２００３年７月１８日に出願された米国特許出願１０／６２２２０５；２００３年７月１８日に出願された米国特許出願１０／６２２２１０；及び２００３年７月１８日に出願された米国特許出願１０／６２３３１８に関連する。本願は、２００５年に出願されたＰＣＴ／ＵＳ０５／ １２００７にも関連する。これらの特許及び特許公報の各々の内容全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。
均等物
当業者は、本明細書に記載されている本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識し、又は定型的な実験操作のみを用いて均等物を究明することが可能である。このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるものとする。本願を通じて引用される全ての参考文献、特許及び公開された特許出願の内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。

Claims (30)

  1. アダリムマブを含む液体組成物を医薬として許容される担体と混合することを含む、アダリムマブ製剤の調製方法であって、前記アダリムマブは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞発現系において発現され、前記組成物は、カテプシンＬ速度論アッセイによって測定されるとき、１．８４ＲＦＵ／秒／ｍｇアダリムマブ未満のカテプシンＬ活性のレベルが観察されることを特徴とし、
    カテプシンＬ速度論アッセイが、
    ｉ）前記組成物を、２５ｍＭ ＮａＯＡｃ、５ｍＭ ＤＴＴ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ．ｐＨ５．５を含む溶液に、ポリスチレン容器内で希釈すること、
    ｉｉ）デキストラン硫酸を０．０３５μｇ／ｍｌの濃度まで添加し、３７℃で６時間インキュベートすること、
    ｉｉｉ）蛍光性７−アミノ−４−メチルクマリンにＣ末端で共有結合したＺ−ロイシン−アルギニン（Ｚ−ロイシン−アルギニン−ＡＭＣ）を添加すること、ここで、前記希釈、添加及びインキュベーションが、前記Ｚ−ロイシン−アルギニン−ＡＭＣのカテプシンによる加水分解を直線範囲で測定することが可能となるのに十分であり、
    ｉｖ）ＲＦＵ／秒／ｍｇアダリムマブにおいて直線となる範囲でＺ−ロイシン−アルギニン−ＡＭＣ加水分解を測定すること、
    を含む方法。
  2. カテプシンＬ活性が、約０．４から１．０ＲＦＵ／秒／ｍｇアダリムマブ以下である、請求項１に記載の方法。
  3. カテプシンＬ活性が、約０．４から１．３ＲＦＵ／秒／ｍｇアダリムマブ以下である、請求項１に記載の方法。
  4. カテプシンＬ活性が、約０．４から０．６ＲＦＵ／秒／ｍｇアダリムマブ以下である、請求項１に記載の方法。
  5. カテプシンＬ活性が、約０．４から０．８５ＲＦＵ／秒／ｍｇアダリムマブ以下である、請求項１に記載の方法。
  6. カテプシンＬ活性が、約０．４から０．９ＲＦＵ／秒／ｍｇアダリムマブ以下である、請求項１に記載の方法。
  7. カテプシンＬ活性が、０．５から１．５ＲＦＵ／秒／ｍｇアダリムマブである、請求項１に記載の方法。
  8. カテプシンＬ活性が、０．４から１．８４ＲＦＵ／秒／ｍｇアダリムマブ未満である、請求項１に記載の方法。
  9. 製剤が、予め充填された注射器に包装されている、請求項１に記載の方法。
  10. 製剤が５０ｍｇ／ｍｌのアダリムマブを含む、請求項１に記載の方法。
  11. 製剤が皮下注射に適する、請求項１に記載の方法。
  12. 前記希釈された組成物が２０μｇ／ｍｌのアダリムマブ濃度を有する、請求項１に記載の方法。
  13. 前記希釈された組成物が５０μｇ／ｍｌのアダリムマブ濃度を有する、請求項１に記載の方法。
  14. カテプシンＬ速度論アッセイにおける工程ｉ）が、組成物を６００倍に希釈することを含む、請求項１に記載の方法。
  15. 医薬として許容される担体がマニトールを含む、請求項１に記載の方法。
  16. 医薬として許容される担体が塩化ナトリウムを含む、請求項１に記載の方法。
  17. 製剤が、予め充填された注射器に包装されている、請求項８に記載の方法。
  18. 製剤が５０ｍｇ／ｍｌのアダリムマブを含む、請求項８に記載の方法。
  19. 製剤が皮下注射に適する、請求項８に記載の方法。
  20. 希釈された組成物が２０μｇ／ｍｌのアダリムマブ濃度を有する、請求項８に記載の方法。
  21. 希釈された組成物が５０μｇ／ｍｌのアダリムマブ濃度を有する、請求項８に記載の方法。
  22. カテプシンＬ速度論アッセイにおける工程ｉ）が、組成物を６００倍に希釈することを含む、請求項８に記載の方法。
  23. 医薬として許容される担体がマニトールを含む、請求項８に記載の方法。
  24. 医薬として許容される担体が塩化ナトリウムを含む、請求項８に記載の方法。
  25. 請求項１に記載の方法で調製されたアダリムマブ製剤。
  26. 請求項８に記載の方法で調製されたアダリムマブ製剤。
  27. 患者においてＴＮＦα活性が有害である疾患の治療において使用するための医薬組成物であって、前記組成物は、請求項２５に記載のアダリムマブ製剤の治療有効量を含み、前記疾患が、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、乾癬及び若年性リウマチ関節炎からなる群より選択される、前記組成物。
  28. 患者においてＴＮＦα活性が有害である疾患の治療において使用するための医薬組成物であって、前記組成物は、請求項２６に記載のアダリムマブ製剤の治療有効量を含み、前記疾患が、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、乾癬及び若年性リウマチ関節炎からなる群より選択される、前記組成物。
  29. 患者においてＴＮＦα活性が有害である疾患の治療のための医薬の製造における請求項２５に記載のアダリムマブ製剤の使用であって、前記疾患が、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、乾癬及び若年性リウマチ関節炎からなる群より選択される、前記使用。
  30. 患者においてＴＮＦα活性が有害である疾患の治療のための医薬の製造における請求項２６に記載のアダリムマブ製剤の使用であって、前記疾患が、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、乾癬及び若年性リウマチ関節炎からなる群より選択される、前記使用。
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