CN102458469B - 人抗TNF-α抗体的稳定高蛋白质浓度制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了液体药物制剂，其不包括NaCl，并且包含超过20mg多元醇和至少约100mg/mL的人抗TNF-α抗体或其抗原结合部分。本发明提供了具有长期稳定性和用于皮下施用的有利特征的高浓度抗体制剂。

Description

人抗TNF-α抗体的稳定高蛋白质浓度制剂

相关申请

本申请要求于2009年5月4日提交的美国临时申请号61/175,380的优先权，其完整内容引入本文作为参考。

背景

已知制剂必须是经济上和治疗上成功的众多所需性质，例如稳定性、用于施用的适合性、浓度，治疗用蛋白质例如抗体的制剂通常是挑战。在制造、贮存和递送过程中，治疗用蛋白质已知经历物理和化学降解。这些不稳定性可以减少蛋白质的效力且增加在患者中的不利事件的危险，并且因此，显著影响管理机构批准（参见例如，Wang，等人（2007）J Pharm Sci 96:1）。因此，稳定蛋白质制剂是治疗用蛋白质成功必需的。

为了是有效的，许多治疗用蛋白质需要高剂量的施用，这优选以高浓度制剂进行配制。高蛋白质浓度制剂是希望的，因为它们可以影响药物对受试者的施用方式（例如静脉内与皮下比较）和频率。

尽管高蛋白质浓度制剂的利益，但配制高浓度治疗用蛋白质仍提出了众多挑战。例如，增加蛋白质浓度经常负面影响蛋白质聚集、可溶性、稳定性和粘度（参见例如，Shire，等人（2004）J Pharm Sci 93:1390）。其为关于高蛋白质溶液的非常通常挑战的粘度增加可以对制剂的施用具有负面后果，例如感觉疼痛和烧伤综合征以及在制备、加工、灌装封装（fill-finish）和药物递送设备选择中的局限性（参见例如，Shire，等人（2004）J Pharm Sci 93:1390）。即使对于具有常见结构特征的治疗用蛋白质例如抗体，迄今为止批准的制剂也具有改变的成分和浓度范围。例如，抗CD20抗体抗体Rituxan配制用于以10 mg/mL的浓度静脉内施用，而抗RSV抗体Synagis配制用于以100 mg/mL的浓度肌内施用。因此，可以用于治疗目的的高蛋白质制剂尤其是抗体制剂仍是挑战。因此，存在关于提供给药和管理优点的稳定、高浓度蛋白质制剂的需要。

发明概述

本发明至少部分基于人抗TNF-α抗体或其抗原结合片段例如阿达木单抗（adalimumab）的新高浓度制剂的发现。给定抗体的高浓度，本发明的制剂提供了许多令人惊讶的特征。例如，尽管蛋白质的高浓度，本发明的制剂在延长的时间段期间仍维持物理和化学稳定性，并且具有适合于皮下施用的粘度。本发明的制剂至少部分在下述令人惊讶的发现上确立：人抗TNF-α抗体或其抗原结合部分在高浓度（例如100 mg/mL）可以保持稳定，并且保持不聚集同时维持适合于注射（例如皮下施用）的粘度。本发明的制剂也是令人惊讶的，这是因为高浓度（例如100 mg/mL）的人抗TNF-α抗体或其抗原结合部分在广泛pH范围例如约pH 5.2 – 约pH 6.0内可以保持溶解，并且保持不聚集和化学稳定的（例如无氧化或脱酰胺作用）。这些有利特征无需NaCl作为稳定剂而达到，并且伴随糖醇赋形剂中的增加。

本发明的一个方面提供了包含超过40 mg多元醇和至少约100 mg/mL人抗TNF-α抗体或其抗原结合部分的液体药物制剂。

本发明的另一个方面提供了包含超过20 mg多元醇和至少约100 mg/mL人抗TNF-α抗体或其抗原结合部分的液体药物制剂。在一个实施方案中，本发明的制剂不含有NaCl。

本发明的特征还在于具有约5.0 - 6.4的pH且包含至少约100 mg/mL人抗TNF-α抗体或其抗原结合部分的液体药物制剂，其中所述制剂不含有NaCl，并且在标准24小时搅拌应力(stir-stress)测定后或在作为液体长期贮存24个月后具有小于60 NTU的浊度。

本发明进一步提供了具有约5.0 - 6.4的pH且包含至少约100 mg/mL人抗TNF-α抗体或其抗原结合部分的液体药物制剂，其中所述制剂不含有NaCl，并且在标准48小时搅拌应力测定后具有小于100 NTU的浊度。

本发明的另一个方面包括具有约5.0 - 6.4的pH且包含至少约100 mg/mL人抗TNF-α抗体或其抗原结合部分的液体药物制剂，其中所述制剂不含有NaCl，并且在5℃、25℃或40℃3个月贮存后具有小于40 NTU的浊度。

本发明还提供了液体药物制剂，其包含至少约100 mg/mL人抗TNF-α抗体或其抗原结合部分；

超过约20 mg/mL多元醇；0.1-2.0 mg/mL表面活性剂；约1.15-1.45 mg/mL柠檬酸* H₂O；约0.2-0.4 mg/mL脱水柠檬酸钠；约1.35-1.75 mg/mL Na₂HPO₄ * 2 H₂O；约0.75-0.95 mg/mL NaH₂PO₄ * 2 H₂O，其中所述制剂具有约4.7 - 6.5的pH，并且不包含NaCl。

本发明的制剂适合于皮下施用。因此，本发明还包括包含人TNFα抗体或其抗原结合部分的本发明的制剂用于治疗与受试者中的有害TNFα活性相关的病症的用途。

在一个实施方案中，本发明的制剂具有一定浓度的人TNFα抗体或其抗原结合部分和约3.1 – 3.3 mPas*s的粘度。

在一个实施方案中，本发明的制剂包含超过20 mg多元醇。可以包括在本发明的制剂中的另外量的多元醇是超过30 mg多元醇。可替代地，超过40 mg多元醇可以在本发明的制剂中使用，包括但不限于40-45 mg或约42 mg。

在一个实施方案中，在本发明的制剂中使用的多元醇是糖醇，例如但不限于甘露糖醇或山梨糖醇。在一个实施方案中，制剂包含约40-45 mg/mL甘露糖醇或山梨糖醇。

本领域已知的各种表面活性剂可以在本发明的制剂中使用。在一个实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯80。在进一步的实施方案中，约0.1-2.0 mg/mL聚山梨醇酯80在本发明的制剂中使用。

在本发明的一个实施方案中，制剂包含约1.30-1.31 mg/mL柠檬酸* H₂O。

在本发明的另一个实施方案中，制剂包含约0.30-0.31 mg/mL脱水柠檬酸钠。

在本发明的另外一个实施方案中，制剂包含约1.50-1.56 mg/mL Na₂HPO₄ * 2 H₂O。

在本发明的进一步实施方案中，制剂包含约0.83-0.89 mg/mL NaH₂PO₄ * 2 H₂O。

在另一个实施方案中，本发明的制剂的pH范围为约4.8 - 约6.4。例如，本发明的制剂的pH可以范围为约5.0 – 约5.4（例如约5.2）或可以范围为约5.8 – 约6.4（例如约6.0）。

本发明的制剂的优点是它提供了抗体的高浓度而无增加的蛋白质聚集，所述蛋白质聚集通常伴随增加的蛋白质浓度而发生。在一个实施方案中，本发明的制剂具有小于约1％的聚集蛋白质。

作为本发明的部分还预期的是具有至少约50 mg/mL浓度的人抗TNFα抗体或其抗原结合部分的本文描述的制剂。

在一个实施方案中，人抗体或其抗原结合部分包含轻链和重链，所述轻链包括包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的CDR3结构域，且所述重链包括包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的CDR3结构域。

在本发明的一个实施方案中，抗体具有包含SEQ ID NO：3，或通过在位置1、4、5、7或8上的单个丙氨酸取代，或通过在位置1、3、4、6、7、8和/或9上的1 – 5个保守氨基酸取代由SEQ ID NO：3修饰的氨基酸序列的轻链CDR3结构域，并且具有包含SEQ ID NO：4，或通过在位置2、3、4、5、6、8、9、10或11上的单个丙氨酸取代，或通过在位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12上的1 – 5个保守氨基酸取代由SEQ ID NO：4修饰的氨基酸序列的重链CDR3结构域。

本发明的抗体可以具有某些功能特征。例如，人抗体或其抗原结合部分可以以1 x 10^-8 M或更少的K_d与人TNFα解离，以1 x 10^-3 s^-1或更少的K_off速率常数与人TNFα解离，两者都通过表面等离振子共振进行测定，和/或在标准体外L929测定中以1 x 10^-7 M或更少的IC₅₀中和人TNFα细胞毒性。

在一个实施方案中，人抗体或其抗原结合部分是人IgG1κ抗体。

在本发明的一个实施方案中，人抗体或其抗原结合部分的轻链进一步包括包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的CDR2结构域，和包含如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的CDR1结构域，和/或人抗体的重链包括包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的CDR2结构域，和包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的CDR1结构域。在另一个实施方案中，人抗体或其抗原结合部分的轻链包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，并且人抗体的重链包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。在本发明中还包括的是具有这样的氨基酸序列的人抗体或其抗原结合部分，所述氨基酸序列与本文所述的SEQ ID NOs至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％等同。

在本发明的另外一个实施方案中，人抗体或其抗原结合部分是阿达木单抗。

附图简述

图1是描述在包含0.1％Solutol的溶液中高分子量（hmw）蛋白质样品的存在的曲线图。根据MALS（灰线），聚集体摩尔质量最高几乎等于10⁹ g/mol，占总蛋白的2.6％（UV280，黑线）。在40℃贮存12周。

图2A和2B是描述在40℃贮存过程中出现的高分子量（hmw）聚集体的早期检测的曲线图。虽然经由UV280（黑曲线）不能检测到聚集体，但MALS（灰曲线）明确地证明了hmw样品的存在。一周贮存（A）与原始样品（B）比较。

图3是描述制剂F1-F6的浊度与冻/融循环比较的曲线图。

图4是描述制剂F1-F6的多分散性指数与冻/融循环比较的曲线图。

图5是描述制剂F1-F6的通过SEC的聚集体水平与冻/融循环比较的曲线图。

图6是描述在T0时通过制剂F1-F6的DSC以℃表示的Tm的曲线图。

图7是描述制剂F1-F6的通过SEC的聚集体水平与搅拌时间比较的曲线图。

图8是描述在F2、F6和F7（3个代表性批次01032-0134）的3个月贮存后，在稳定性研究中获得的浊度值比较的曲线图。

图9是描述在F2、F6和F7（3个代表性批次01032-0134）的3个月贮存后，在稳定性研究中获得的通过DAC得分的可见粒子值比较的曲线图。

图10是描述在F2、F6和F7（3个代表性批次01032-0134）的3个月贮存后，在稳定性研究中获得的亚可见(sub-visible)粒子值（>=10µm）比较的曲线图。

图11是描述在F2、F6和F7（3个代表性批次01032-0134）的3个月贮存后，在稳定性研究中获得的亚可见粒子值（>=25µm）比较的曲线图。

图12是描述在F2、F6和F7（3个代表性批次01032-0134）的3个月贮存后，在稳定性研究中获得的残留单体含量比较的曲线图。

图13是描述在F2、F6和F7（3个代表性批次01032-0134）的3个月贮存后，在稳定性研究中获得的赖氨酸变体总和比较的曲线图。

图14是描述在24小时后就针对以不同搅拌速度的搅拌应力的稳定性而言，比较F2、F6和F7的浊度数据的曲线图。

图15是描述在24小时后就针对以不同搅拌速度的搅拌应力的稳定性而言，比较F2、F6和F7的DLS数据（Z平均值）的曲线图。

图16是描述在几个泵循环前和后就针对应力的稳定性而言，比较F2、F6和F7的浊度数据的曲线图。

图17是描述在几个泵循环前和后就稳定性而言，比较F2、F6和F7的DLS数据（Z平均值）的曲线图。

图18是描述在几个泵循环前和后就稳定性而言，比较F2、F6和F7的SEC数据（聚集体水平）的曲线图。

图19是描述使用蠕动泵填充的100 mg/mL制剂的视觉得分的曲线图。

图20是描述使用活塞泵填充的100 mg/mL制剂的视觉得分的曲线图。

图21是描述使用蠕动泵填充的100 mg/mL制剂的浊度的曲线图。

图22是描述使用活塞泵填充的100 mg/mL制剂的浊度的曲线图。

图23是描述制剂F8-F11在T0时和在5℃的4周贮存后的浊度的曲线图。

图24是描述制剂F8-F11在T0时和在5℃的4周贮存后的单体含量的曲线图。

图25是描述制剂F8-F11在T0时和在5℃的4周贮存后的聚集体水平的曲线图。

图26是描述制剂F8-F11在T0时和在5℃的4周贮存后的亚可见粒子计数的曲线图。

发明详述

I. 定义

为了本发明可以更容易理解，首先定义了某些术语。此外，应当指出每当叙述参数的值或值范围时，预期对于所述值中间的值和范围也预期是本发明的部分。

术语“药物制剂”指这样的制剂，其为此种形式以便允许活性成分的生物学活性明确有效，并且不含有对于制剂将施用于其的受试者明显有毒的另外组分。

短语“药学可接受的载体”是领域公认的，并且包括适合于施用于哺乳动物的药学可接受的材料、组合物或载体。载体包括液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或胶囊化（encapsulating）材料，涉及携带或转运主题试剂从身体的一个器官或部分到身体的另一个器官或部分。每个载体必须是在与制剂的其他成分相容的意义上“可接受的”，并且对患者的安全无害或不影响患者的安全。

“药学可接受的赋形剂”（载体、添加剂）是可以合理地施用于主题哺乳动物以提供采用的活性成分的有效剂量的那些。

术语“赋形剂”指可以加入制剂中以提供所需一致性例如改变膨胀性质，以改善稳定性和/或调整重量摩尔渗透压浓度的试剂。常用赋形剂的例子包括但不限于糖、多元醇、氨基酸、表面活性剂和聚合物。

常用赋形剂是多元醇。如本文使用的，“多元醇”是具有多个羟基的物质，并且包括糖（还原和非还原糖）、糖醇和糖酸。本文优选的多元醇具有小于约600 kD的分子量（例如在约120 - 约400 kD的范围中）。多元醇的非限制性例子是果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖、棉子糖、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、苏糖醇、山梨糖醇、甘油、L-葡糖酸及其金属盐。

如本文使用的，“缓冲液”指通过其酸碱共轭组分的作用抵抗pH中的改变的缓冲溶液。本发明的缓冲液具有在约4 – 约8范围中的pH；优选约4.5 - 约7；并且最优选具有在约5.0 - 约6.5范围中的pH。将pH控制在这个范围中的缓冲液的例子包括磷酸盐、乙酸盐（例如乙酸钠）、琥珀酸盐（例如琥珀酸钠）、葡糖酸盐、谷氨酸、组氨酸、柠檬酸盐和其他有机酸缓冲液。在一个实施方案中，适合于在本发明的制剂中使用的缓冲液是柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液。

术语“表面活性剂”一般包括保护制剂中的蛋白质不受空气/溶液界面诱导的应力和/或溶液/表面诱导的应力的那些试剂。例如，表面活性剂可以保护蛋白质不受聚集。合适的表面活性剂可以包括例如聚山梨醇酯、聚氧乙烯烷基醚例如Brij 35.RTM.，或泊洛沙姆例如Tween 20、Tween 80或泊洛沙姆188。优选去污剂是泊洛沙姆例如泊洛沙姆188、泊洛沙姆407；聚氧乙烯烷基醚例如Brij 35.RTM.、Cremophor A25、Sympatens ALM/230；和聚山梨醇酯/Tweens，例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Mirj和泊洛沙姆例如泊洛沙姆188、以及Tweens例如Tween 20和Tween 80。

“稳定”制剂是其中在制备过程期间和/或在贮存时抗体在其中基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性的那种。用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术是本领域可获得的，并且在Peptide and Protein Drug Delivery，247-301，Vincent Lee Ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Pubs.（1991）和Jones，A.（1993）Adv. Drug Delivery Rev. 10：29-90中综述。例如，在一个实施方案中，蛋白质的稳定性根据溶液中的单体蛋白质百分比进行测定，具有低百分比的降解（例如片段化的）和/或聚集的蛋白质。优选地，制剂在室温（约30℃）或在40℃稳定至少1个月和/或在约2-8℃稳定至少1年或至少2年。此外，制剂优选在制剂的冷冻（至例如-70℃）和融化后是稳定的，下文称为“冻/融循环”。

如果在颜色和/或透明度的视觉检查时，或如通过UV光散射或通过尺寸排阻层析测量的，抗体基本上未显示例如聚集、沉淀和/或变性的征兆，那么它在药物制剂中“保持其物理稳定性”。聚集是由此个别分子或复合物共价或非共价结合以形成聚集体的过程。聚集可以进行至形成可见沉淀的程度。

制剂的稳定性例如物理稳定性可以通过本领域众所周知的方法进行评估，包括样品的光表观衰减(apparent attenuation)（吸光度或光密度）的测量。光衰减的此种测量涉及制剂的浊度。制剂的浊度部分是在溶液中溶解的蛋白质的固有性质，并且通常通过比浊法进行测定，且以比浊法浊度单位（NTU）进行测量。

例如随溶液中一种或多种组分的浓度，例如蛋白质和/或盐浓度而变的浊度程度，也称为制剂的“乳光”或“乳光外观”。浊度程度可以通过参考使用已知浊度的悬浮液生成的标准曲线进行计算。用于测定关于药物组合物的浊度程度的参考标准可以基于欧洲药典标准（European Pharmacopoeia，第4版，Directorate for the Quality of Medicine of the Council of Europe（EDQM），Strasbourg，France）。根据欧洲药典标准，透明溶液定义为具有小于或等于参考悬浮液的浊度的那种，所述参考悬浮液根据欧洲药典标准具有约3的浊度。比浊法浊度测量可以检测瑞利散射（Rayleigh scatter），在不存在结合或非理想作用的情况下，这一般随着浓度线性改变。用于评估物理稳定性的其他方法是本领域众所周知的。

如果在给定时间的化学稳定性是这样的，从而抗体被视为仍保持其如下定义的生物学活性，那么抗体在药物制剂中“保持其化学稳定性”。化学稳定性可以通过例如检测且定量化学改变形式的抗体进行评估。化学改变可以涉及大小修饰（例如修剪），这可以使用例如尺寸排阻层析、SDS-PAGE和/或基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱法（MALDI/TOF MS）进行评价。其他类型的化学改变包括电荷改变（例如由于脱酰胺作用或氧化而发生），这可以通过例如离子交换层析进行评价。

如果药物制剂中的抗体对于其预期目的是生物学活性的，那么抗体在药物制剂中“保持其生物学活性”。例如，如果药物制剂中抗体的生物学活性在制备药物制剂时显示出的生物学活性的约30％、约20％或约10％内（在测定的误差内）（例如，如在抗原结合测定中测定的），那么生物学活性被保持。

在药理学意义上，在本发明的背景中，抗体的“治疗有效量”或“有效量”指在抗体对于其治疗是有效的病症症状的预防或治疗或减轻中有效的量。“病症”是将获益于用抗体治疗的任何状况。这包括慢性和急性病症或疾病，包括使受试者易患所讨论的病症的那些病理学状况。

“治疗”指治疗性处理和预防或防止措施。需要治疗的那些包括已具有病症的那些以及其中待预防病症的那些。

如本文使用的，短语“肠胃外施用”和“肠胃外施用的”意指除肠和局部施用外的施用方式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、颅内（intriacranial）、关节内、脊柱内和胸骨内注射和输注。

如本文使用的，短语“全身施用”、“全身施用的”、“外周施用”和“外周施用的”意指化合物、药物或其他材料除直接进入中枢神经系统内之外的施用，从而使得它进入患者的系统并且因此实施代谢和其他类似过程，例如皮下施用。

如本文使用的，术语“人TNF-α”（本文缩写为hTNF-α、TNFα或简单地hTNF）意指人细胞因子，其作为17 kD分泌形式和26 kD膜结合形式存在，其生物学活性形式由非共价结合的17 kD分子的三聚体组成。hTNF-α的结构在例如Pennica，D.，等人（1984）Nature 312:724-729；Davis，J. M.，等人（1987）Biochem 26:1322-1326；和Jones，E. Y.，等人（1989）Nature 338:225-228中进一步描述。术语人TNF-α意欲包括重组人TNF-α（rhTNF-α），这可以通过标准重组表达法制备或商业购买（R & D Systems，目录号210-TA，Minneapolis，Minn.）。

如本文使用的，术语“抗体”意指免疫球蛋白分子，其包含通过二硫键互连的4条多肽链――2条重（H）链和2条轻（L）链。改变结构的其他天然存在的抗体例如骆驼科动物（camelid）抗体也包括在这个定义中。每条重链包含重链可变区（本文缩写为HCVR或VH）和重链恒定区。重链恒定区包含3个结构域――CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区（本文缩写为LCVR或VL）和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域――CL。VH和VL区可以进一步再分成称为互补性决定区（CDR）的高变区，由称为构架区（FR）的更保守区域点缀。每个VH和VL由3个CDRs和4个FRs组成，从氨基末端到羧基末端以下述次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的一个实施方案中，制剂含有具有如同美国专利号6,090,382和6,258,562中所述那些的CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体，所述专利各自引入本文作为参考。

如本文使用的，术语“CDR”指在抗体可变序列内的互补决定区。在重链和轻链的可变区的每一个中存在3个CDRs，这对于每个可变区命名为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDRs的确切边界已根据不同系统不同定义。由Kabat（同上）描述的系统不仅提供了可应用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，还提供了限定3个CDRs的精确残基边界。这些CDRs可以称为Kabat CDRs。Chothia 等人发现在Kabat CDRs内的某些亚部分采用几乎等同的肽主链构象，尽管在氨基酸序列水平上具有极大多样性（Chothia 等人（1987）Mol. Biol. 196:901-917；Chothia 等人（1989）Nature 342:877-883）这些亚部分命名为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别指定轻链和重链区域。这些区域可以称为Chothia CDRs，这具有与Kabat CDRs重叠的边界。限定与Kabat CDRs重叠的CDRs的其他边界已由Padlan（1995）FASEB J. 9:133-139和MacCallum（1996）J. Mol. Biol. 262（5）:732-45描述。另外其他的CDR边界定义可能不严格遵循本文描述的系统之一，但仍将与Kabat CDRs重叠，尽管它们依照特定残基或残基组或甚至整个CDRs不显著影响抗原结合的预测或实验发现可以是缩短或加长的。本文使用的方法可以利用根据这些系统中的任何一种定义的CDRs，尽管某些实施方案使用Kabat或Chothia定义的CDRs。

如本文使用的，术语抗体的“抗原结合部分”（或简单地“抗体部分”）指保持与抗原（例如hTNF-α）特异性结合能力的抗体的一个或多个片段。已显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段执行。在术语抗体的“抗原结合部分”内包含的结合片段的例子包括（i）Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；（ii）F（ab'）₂片段，包括由铰链区的二硫键连接的2个Fab片段的二价片段；（iii）由VH和CH1结构域组成的Fd片段；（iv）由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，（v）由VH结构域组成的dAb片段（Ward等人,（1989）Nature 341:544-546）；和（vi）分离的互补决定区（CDR）。此外，尽管Fv片段的2个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可以使用重组法通过合成接头进行连接，所述合成接头使得它们能够制备为单条蛋白质链，其中VL和VH区配对以形成单价分子（称为单链Fv（scFv）；参见例如，Bird 等人（1988）Science 242:423-426；和Huston 等人（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883）。此种单链抗体也意欲包含在术语抗体的“抗原结合部分”内。还包含了其他形式的单链抗体例如双抗体。双抗体是二价、双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，但使用太短而不允许相同链上的2个结构域之间配对的接头，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，且产生2个抗原结合部位（参见例如Holliger，P.，等人（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak，R. J.，等人（1994）Structure 2:1121-1123）。在本发明的一个实施方案中，制剂包含美国专利号6,090,382和6,258,562中所述的抗原结合部分，所述专利各自整体引入本文作为参考。

再进一步地，抗体或其抗原结合部分可以是更大免疫粘附分子的部分，所述免疫粘附分子由抗体或抗体部分与一种或多种其他蛋白质或肽的共价或非共价结合形成。此种免疫粘附分子的例子包括链霉抗生物素蛋白核心区的使用，以制备四聚scFv分子（Kipriyanov，S. M.，等人（1995）Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101），以及半胱氨酸残基、标记肽和C末端聚组氨酸标签的使用，以制备二价和生物素化的scFv分子（Kipriyanov，S. M.，等人（1994）Mol. Immunol. 31:1047-1058）。抗体部分例如Fab和F（ab'）₂片段可以使用常规技术由完整抗体进行制备，例如分别地完整抗体的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。此外，抗体、抗体部分和免疫粘附分子可以使用标准重组DNA技术获得，如本文描述的。

如本文所使用的，术语“人抗体”意欲包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。在本发明中使用的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基（例如，在体外通过随机或位点专一诱变或在体内通过体细胞突变引入的突变），例如，在CDRs且特别是CDR3中。然而，如本文所使用的，术语“人抗体”不意欲包括其中衍生自另一个哺乳动物物种例如小鼠的种系的CDR序列已嫁接到人构架序列上的抗体。

如本文所使用的，术语“重组人抗体”意欲包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如使用转染到宿主细胞内的重组表达载体表达的抗体（在下文部分II中进一步描述），从重组、组合人抗体文库中分离的抗体（在下文部分III中进一步描述），从对于人免疫球蛋白基因是转基因的动物（例如小鼠）中分离的抗体（参见例如，Taylor，L. D.，等人（1992）Nucl. Acids Res. 20:6287-6295），或通过任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体，所述任何其他方法涉及人免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列的剪接。此种重组人抗体具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。然而，在特定实施方案中，对此种重组人抗体实施体外诱变（或当使用对于人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变），并且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，尽管其衍生自人种系VH和VL序列且与人种系VH和VL序列有关，但可能在体内不天然存在于人抗体种系谱内。

如本文所使用的，“分离的抗体”意指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体（例如，特异性结合hTNFα的分离的抗体基本上不含特异性结合除hTNFα外的抗原的抗体）。然而，特异性结合hTNFα的分离的抗体可以与其他抗原例如来自其他物种的TNFα分子具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学试剂。

如本文所使用的，“中和抗体”（或“中和hTNFα活性的抗体”）意指其与hTNFα的结合导致hTNFα生物学活性的抑制的抗体。hTNFα生物学活性的这种抑制可以通过测量hTNFα生物活性的一种或多种指示剂进行评估，例如hTNFα诱导的细胞毒性（在体外或在体内）、hTNFα诱导的细胞活化和hTNFα与hTNFα受体结合。hTNFα生物学活性的这些指示剂可以通过几种标准体外或体内测定中的一种或多种进行评估，所述测定是本领域已知的并且在各自引入本文作为参考的美国专利号6,090,382和6,258,562中描述。优选地，抗体中和hTNFα活性的能力通过抑制hTNFα诱导的L929细胞的细胞毒性进行评估。作为另外或可替代的hTNFα活性参数，可以评估抗体抑制hTNFα诱导的在HUVEC上的ELAM-1表达的能力，作为hTNFα诱导的细胞活化的量度。

如本文使用的，术语“表面等离振子共振”指允许通过检测生物传感器基质内蛋白质浓度中的改变分析实时生物特异性相互作用的光学现象，例如使用BIAcore系统（Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，瑞典和Piscataway，N.J.）。关于进一步描述，参见Jonsson，U.，等人（1993）Ann. Biol. Clin. 51:19-26；Jonsson，U.，等人（1991）Biotechniques 11:620-627；Johnsson，B.，等人（1995）J. Mol. Recognit. 8:125-131；和Johnnson，B.，等人（1991）Anal. Biochem. 198:268-277。

如本领域已知的，如本文使用的，术语“K_on”意指关于结合蛋白（例如抗体）与抗原结合以形成例如抗体/抗原复合物的结合速率常数。

如本文使用的，术语“K_off”意指关于抗体从抗体/抗原复合物解离的解离速率常数。

如本文使用的，术语“Kd”意指特定抗体-抗原相互作用的解离常数，并且指在滴定测量中在平衡时，或通过将解离速率常数（k_off）除以结合速率常数（k_on）获得的值。

本发明的各个方面在下文小节中进一步详细描述。

II. 本发明的制剂

本发明的特征在于与领域公认的制剂相比较具有改善的性质的液体药物制剂（例如抗体制剂）。本发明基于下述令人惊讶的发现：通过去除NaCl且添加超过20 mg/mL多元醇例如糖醇，制剂中人TNFα抗体的浓度可以增至约100 mg / mL。尽管抗体的高浓度，但例如在制备、贮存和/或反复冻/融加工步骤或延长的暴露于增加的空气-液体界面的过程中，本发明的制剂仍能够维持蛋白质的可溶性和稳定性。此外，尽管具有约100 mg / mL的抗体，但本发明的制剂维持低水平的蛋白质聚集（即小于1％）。尽管具有约100 mg / mL的抗体，但本发明的制剂还令人惊讶地维持在适合于皮下注射的范围内的低粘度。此外，本发明的制剂例如高浓度TNFα抗体维持可溶性，维持适合于皮下注射的低粘度，并且维持在几乎1的pH范围内的稳定性，例如pH 5.2 - pH 6.0。在一个实施方案中，在标准48小时搅拌应力测定后，制剂的浊度小于100 NTU。因此，本发明的高抗体制剂克服了关于制剂的许多已知挑战，包括稳定性、粘度、浊度和物理降解挑战。

本发明的制剂令人惊讶的特征是在不存在NaCl的情况下，虽然抗体浓度高（例如，100 mg/mL或更大），但制剂的总体粘度保持为低的（例如约3.1 – 3.3 mPas*s，例如约3.00、3.05、3.10、3.15、3.20、3.25、3.30、3.35或约3.40 mPas*s）。一般地，粘度随着蛋白质浓度增加而增加（关于综述参见Shire 等人（2004）J Pharm Sci 93:1390）。此种增加几乎总是通过添加离子赋形剂例如NaCl和MgCl₂来抵抗，然而，此种赋形剂的添加还可以导致溶液增加的浊度。增加的浊度经常与不溶性蛋白质聚集体、沉淀或蛋白质颗粒（例如聚集）形成相关。因此，本发明的液体药物制剂提供了具有适合于皮下施用的粘度的高抗体浓度（例如至少100 mg/ mL），而不需添加NaCl。

在一个实施方案中，本发明的制剂包括高浓度的蛋白质，从而使得液体制剂不显示显著乳光、聚集或沉淀。

在另一个实施方案中，本发明的制剂包括高浓度的蛋白质，从而使得适合于例如皮下施用而无显著感觉的疼痛（例如，如通过直观模拟标尺（visual analog scale）（VAS）得分测定的）。

本发明的制剂包含高蛋白质浓度，包括例如约50 mg/mL或约100 mg/mL人抗TNF-α抗体或其抗原结合片段的蛋白质浓度。因此，如下文实施例1中所述，在本发明的一个方面，液体药物制剂包含约50 mg/mL的人抗TNFα抗体浓度。如下文实施例2-6中所述，在本发明的另一个方面，液体药物制剂包含约100 mg/mL的人抗TNFα抗体浓度。在本发明的另外一个方面，液体药物制剂包含约150 mg/mL的人抗TNFα抗体浓度。尽管本发明的优选实施方案是包含高蛋白质浓度的制剂，但还预期本发明的制剂可以包含约1 mg/mL - 约150 mg/mL或约40 mg/mL-125 mg/mL的抗体浓度。对于上述浓度中间的浓度和范围也预期是本发明的部分（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200 mg/mL）。

在另一个方面，本发明提供了液体药物组合物，其包含多元醇、表面活性剂和缓冲系统，其量足以配制抗体例如阿达木单抗，用于以大于约例如100 mg/mL的浓度用于治疗用途。在一个实施方案中，液体药物组合物不包含NaCl。

然而，应当指出尽管本发明的优选制剂不包含NaCl，但小量NaCl可以存在于制剂中，例如约0.01 mM – 约300 mM。此外，预期包括对于所述值中间的任何量的NaCl。

在一个方面，本发明提供了液体药物组合物，其包含人抗TNF-α抗体或其抗原结合片段（例如阿达木单抗）、多元醇，而不添加NaCl，其量足以配制抗体用于治疗用途。

本发明还提供了液体制剂，其包含人抗TNF-α抗体或其抗原结合片段，处于约5.0 - 6.4的pH，和在标准24小时搅拌应力测定后小于约60 NTU的浊度，而不添加NaCl（例如约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或63 NTU）。在另一个方面，本发明提供了液体制剂，其包含人抗TNF-α抗体或其抗原结合片段，处于约5.0 - 6.4的pH，和在标准48小时搅拌应力测定后小于约100 NTU的浊度，而不添加NaCl（例如约35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 NTU）。在另外一个方面，本发明提供了液体制剂，其包含人抗TNF-α抗体或其抗原结合片段，处于约5.0 - 6.4的pH，和在5℃、25℃或40℃3个月贮存后小于约40 NTU的浊度，而不添加NaCl（例如约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60 NTU）。

本发明的制剂的特征是包括大于20 mg/mL浓度的多元醇例如糖醇。在一个实施方案中，多元醇是山梨糖醇或甘露糖醇。应当指出山梨糖醇或甘露糖醇对蛋白质溶液的添加不总是与蛋白质稳定性中的增加相关。例如，当在热应力或界面应力条件过程中评估时，山梨糖醇不提供针对猪生长激素沉淀的优点 – 分别与Tween 20和羟丙基-β-环糊精形成对比（Charman 等人（1993）Pharm Res.10（7）:954-62）。

在一个实施方案中，在本发明的制剂中使用的合适多元醇是糖醇，例如甘露糖醇或山梨糖醇。包含多元醇的本发明的液体制剂一般包含超过约20 mg的多元醇。在一个实施方案中，制剂包含超过约30 mg/mL的多元醇。在另一个实施方案中，制剂包含超过约40 mg/mL的多元醇。在另一个实施方案中，制剂包含约40-45 mg/mL的多元醇，例如约35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55 mg/mL。此外，预期包括使用任何上述值的组合作为上和/或下限的值范围。

在本发明的一些实施方案中，制备包含在pH缓冲溶液中的抗体的液体制剂。本发明的缓冲液具有范围为约4 – 约8的pH，优选约4.5 - 约7.0，更优选约4.5 - 约6.0，甚至更加优选约4.8 - 约5.5，并且最优选具有约5.0 - 约6.4的pH。在一个实施方案中，本发明的制剂的pH是约5.2。在另一个实施方案中，本发明的制剂的pH是约6.0。对于上述pH中间的范围也预期是本发明的部分（例如4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4）。预期包括使用任何上述值的组合作为上和/或下限的值范围，例如5.2 - 5.8。将控制pH在这个范围内的缓冲液的例子包括磷酸盐、乙酸盐（例如乙酸钠）、琥珀酸盐（例如琥珀酸钠）、葡糖酸盐、谷氨酸、组氨酸、柠檬酸盐和其他有机酸缓冲液。

在本发明的特定实施方案中，制剂包含含有柠檬酸盐和/或磷酸盐以维持pH在约5.0 - 约6.4的范围中的缓冲系统。在一个实施方案中，制剂的pH是约5.2。在另一个实施方案中，制剂的pH是约6.0。

在另一个优选实施方案中，缓冲系统包括柠檬酸一水合物、柠檬酸钠、磷酸氢二钠二水合物和/或磷酸二氢钠二水合物。在进一步优选的实施方案中，缓冲系统包括约1.15-1.45 mg/ml柠檬酸（例如约1.15、1.20、1.25、1.30、1.35、1.40或1.45）、约0.2-0.4 mg/mL脱水柠檬酸钠（例如约0.2、0.25、0.3、0.35或0.4）、约1.35-1.75 mg/mL脱水磷酸氢二钠（例如1.35、1.40、1.45、1.50、1.55、1.60、1.65、1.70或1.75）、约0.75-0.95 mg/mL脱水磷酸二氢钠（例如约0.75、0.80、0.85、0.9或0.95）。

对于上述浓度中间的值和范围也预期是本发明的部分。此外，预期包括使用任何上述值的组合作为上和/或下限的值范围，例如1.20-1.40 mg/mL。

在其他实施方案中，缓冲系统包括1.30-1.31 mg/mL柠檬酸（例如约1.305 mg/mL）。在另一个实施方案中，缓冲系统包括约0.27-0.33 mg/mL脱水柠檬酸钠（例如约0.305 mg/mL）。在一个实施方案中，缓冲系统包括约1.5-1.56 mg/mL脱水磷酸氢二钠（例如约1.53 mg/mL）。在另一个实施方案中，缓冲系统包括约0.83-0.89 mg/mL磷酸二氢钠二水合物（例如约0.86 mg/mL）。

去污剂或表面活性剂也可以添加到本发明的抗体制剂中。示例性去污剂包括非离子去污剂例如聚山梨醇酯（例如聚山梨醇酯20、80等）或泊洛沙姆（例如泊洛沙姆188）。添加的去污剂的量是这样的，从而使得它减少配制的抗体的聚集和/或使制剂中的微粒形成降到最低和/或减少吸附。在本发明的优选实施方案中，制剂包括其为聚山梨醇酯的表面活性剂。在本发明的另一个优选实施方案中，制剂含有去污剂聚山梨醇酯80。在一个优选实施方案中，制剂含有约0.1 – 约2.0 mg/mL聚山梨醇酯80，例如约1 mg/mL。

对于上述浓度中间的值和范围也预期是本发明的部分，例如0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9。此外，预期包括使用任何上述值的组合作为上和/或下限的值范围，例如0.3 - 1.1 mg/mL。

在一个实施方案中，本发明的制剂基本上由至少约100 mg/mL浓度的人TNFα抗体或其抗原结合部分、表面活性剂（例如聚山梨醇酯80）、多元醇例如（例如超过20 mg/mL山梨糖醇或甘露糖醇）、和缓冲系统（例如柠檬酸一水合物、柠檬酸钠、磷酸氢二钠二水合物和/或磷酸二氢钠二水合物）组成，并且不含有NaCl。

在一个实施方案中，制剂含有上文鉴定的试剂（即至少约100 mg/mL浓度的抗体、缓冲系统、多元醇和表面活性剂，不含NaCl），并且基本上不含防腐剂例如苯甲醇、酚、间甲酚、氯代丁醇和苯索氯铵Cl。在另一个实施方案中，防腐剂可以包括在制剂中。一种或多种其他药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂例如Remington's Pharmaceutical Sciences 第16版，Osol，A. Ed.（1980）中描述的那些可以包括在制剂中，条件是它们不会显著不利地影响制剂的所需特征。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度对于接受者是无毒的，并且包括；另外的缓冲剂；共溶剂；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；螯合剂例如EDTA；金属络合物（例如Zn-蛋白质络合物）；生物可降解的聚合物例如聚酯；和/或成盐抗衡离子例如钠。

本文的制剂还可以与如对于待治疗的特定适应症所必需的一种或多种其他治疗剂组合，优选具有不会不利地影响制剂的抗体的互补活性的那些。此种治疗剂以对于预期目的有效的量适当地存在于组合中。可以与本发明的制剂组合的另外治疗剂在美国专利号6,090,382和6,258,562中进一步描述，所述专利各自引入本文作为参考。

待用于体内施用的制剂必须是无菌的。这通过在制剂制备前或后经过无菌滤过膜过滤容易地完成。

如上所述，本发明的液体制剂具有有利的稳定性和贮存性质。液体制剂的稳定性不取决于贮存形式，并且包括但不限于冷冻、冻干、喷雾干燥的制剂，或活性成分悬浮于其中的制剂。稳定性可以在所选温度测量所选时间段。在本发明的一个方面，液体制剂中的蛋白质以液体形式稳定至少约3个月；至少约4个月、至少约5个月；至少约6个月；至少约12个月；至少约18个月。对于上述时间段中间的值和范围也预期是本发明的部分，例如约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或约24个月。此外，预期包括使用任何上述值的组合作为上和/或下限的值范围。优选地，制剂在室温（约30℃）或40℃稳定至少约1个月和/或在约2-8℃稳定至少约1年，或更优选在约2-8℃稳定至少约2年。此外，制剂优选在制剂的冷冻（至例如-80℃）和融化后是稳定的，下文称为“冻/融循环”。

液体制剂中蛋白质的稳定性还可以定义为制剂中蛋白质的单体、聚集体或其片段或组合的百分比。如果在颜色和/或透明度的视觉检查后，或如通过UV光散射或通过尺寸排阻层析测量的，蛋白质基本上未显示聚集、沉淀和/或变性的征兆，那么它在制剂中“保持其物理稳定性”。在本发明的一个方面，稳定液体制剂是具有小于约10％且优选小于约5％在制剂中作为聚集体存在的蛋白质的制剂。

在一个实施方案中，液体制剂的物理稳定性通过测定在搅拌应力测定，例如24小时或48小时搅拌应力测定后制剂的浊度进行测定。例如，搅拌应力测定可以通过下述执行：将合适体积的液体制剂置于具有磁搅拌器例如（多点（multipoint）HP，550 rpm）的烧杯中，在任何合适时间例如在T0-T48（小时）取出等分试样，并且根据需要对等分试样执行合适测定。在相同条件下但不含搅拌的制剂样品充当对照。

浊度测量可以使用来自Hach（德国）的实验室浊度测量系统执行，并且报道为比浊法单位（NTU）。

本发明的液体制剂还具有有利的可容许性（tolerability）性质。可容许性使用疼痛直观模拟标尺（VAS）基于受试者察觉到的注射位点疼痛评估进行评价。

（VAS）是当其范围跨越值的连续区例如从无到极度量的疼痛时测量疼痛的测量仪器。在操作上VAS是水平线，长度约100 mm，通过数字和/或词描述符例如0或10、或‘无疼痛’或‘极痛’固定，任选伴随在极端之间的另外词或数字描述符，例如轻度、中度和重度；或1到9）（参见例如，Lee JS，等人（2000）Acad Emerg Med 7:550）。

可以测量的可容许性的另外指示物包括例如Draize Scale（出血、瘀点、红斑、水肿、瘙痒）和擦伤。

III. 用于在本发明的制剂中使用的抗体

可以在本发明的制剂中使用的抗体是针对抗原TNF-α包括人TNF-α（或hTNF-α）的抗体。

在一个实施方案中，本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合部分，其以高亲和力和低解离速率与人TNF-α结合，并且还具有高中和能力。优选地，在本发明中使用的人抗体是重组、中和人抗hTNF-α抗体。本发明的最优选的重组、中和抗体在本文中称为D2E7，也称为HUMIRA^TM或阿达木单抗（D2E7 VL区的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：1中；D2E7 VH区的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：2中）。D2E7（阿达木单抗/ HUMIRA^®）的性质已在Salfeld等人，美国专利号6,090,382、6,258,562和6,509,015中描述，所述专利各自引入本文作为参考。

在一个实施方案中，人TNF-α或其抗原结合部分以1 x 10-8 M或更少的Kd和1 x 10-3 s-1或更少的Koff速率常数与人TNF-α解离，两者都通过表面等离振子共振测定，并且在标准体外L929测定中以1 x 10-7 M或更少的IC50中和人TNF-α细胞毒性。更优选地，分离的人抗体或其抗原结合部分以5 x 10-4 s-1或更少的Koff，或甚至更加优选地以1 x 10-4 s-1或更少的Koff与人TNF-α解离。更优选地，分离的人抗体或其抗原结合部分在标准体外L929测定中以1 x 10-8 M或更少的IC50，甚至更加优选地以1 x 10-9 M或更少的IC50且更加优选地以1 x 10-10 M或更少的IC50中和人TNF-α细胞毒性。在优选实施方案中，抗体是分离的人重组抗体或其抗原结合部分。

本领域众所周知抗体重和轻链CDR3结构域在抗体对于抗原的结合特异性/亲和力中起重要作用。因此，在另一个方面，本发明涉及通过施用人抗体治疗Crohn氏病，所述人抗体对于与hTNF-α的结合具有慢解离动力学，并且具有在结构上等同于D2E7的那些或与D2E7的那些相关的轻和重链CDR3结构域。D2E7 VL CDR3的位置9可以由Ala或Thr占据，而基本上不影响Koff。因此，关于D2E7 VL CDR3的共有基序包含氨基酸序列：Q-R-Y-N-R-A-P-Y-（T/A）（SEQ ID NO：3）。另外，D2E7 VH CDR3的位置12可以由Tyr或Asn占据，而基本上不影响Koff。因此，关于D2E7 VH CDR3的共有基序包含氨基酸序列：V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D-（Y/N）（SEQ ID NO：4）。此外，如美国专利号 6,090,382的实施例2中证实的，D2E7重和轻链的CDR3结构域可适合于由单个丙氨酸残基的取代（在VL CDR3内的位置1、4、5、7或8上或在VH CDR3内的位置2、3、4、5、6、8、9、10或11上），而基本上不影响Koff。再进一步地，技术人员将认识到，已知D2E7 VL和VH CDR3结构域对通过丙氨酸取代的适应性，在CDR3结构域内其他氨基酸的取代可以是可能的，同时仍保持抗体的低解离速率常数，特别是由保守氨基酸的取代。优选地，在D2E7 VL和/或VH CDR3结构域内进行不超过1 – 5个保守氨基酸取代。更优选地，在D2E7 VL和/或VH CDR3结构域内进行不超过1 – 3个保守氨基酸取代。另外，保守氨基酸取代不应在对于与hTNFα结合关键的氨基酸位置上进行。D2E7 VL CDR3的位置2和5以及D2E7 VH CDR3的位置1和7看起来对于与hTNFα的相互作用是关键的，并且因此保守氨基酸取代优选不在这些位置上进行（尽管在D2E7 VL CDR3的位置5上的丙氨酸取代是可接受的，如上所述）（参见美国专利号6,090,382）。

因此，在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分优选含有下述特征：

a）如通过表面等离振子共振测定的，以1 x 10-3 s-1或更少的Koff速率常数与人TNFα解离；

b）具有包含SEQ ID NO：3，或通过在位置1、4、5、7或8上的单个丙氨酸取代，或通过在位置1、3、4、6、7、8和/或9上的1 – 5个保守氨基酸取代由SEQ ID NO：3修饰的氨基酸序列的轻链CDR3结构域；

c）具有包含SEQ ID NO：4，或通过在位置2、3、4、5、6、8、9、10或11上的单个丙氨酸取代，或通过在位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12上的1 – 5个保守氨基酸取代由SEQ ID NO：4修饰的氨基酸序列的重链CDR3结构域。

更优选地，人抗体或其抗原结合部分以5 x 10-4 s-1或更少的Koff与人TNFα解离。甚至更加优选地，人抗体或其抗原结合部分以1 x 10-4 s-1或更少的Koff与人TNFα解离。

在另外一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分优选含有轻链可变区（LCVR）且具有重链可变区（HCVR），所述LCVR具有包含SEQ ID NO：3，或通过在位置1、4、5、7或8上的单个丙氨酸取代由SEQ ID NO：3修饰的氨基酸序列的CDR3结构域，所述HCVR具有包含SEQ ID NO：4，或通过在位置2、3、4、5、6、8、9、10或11上的单个丙氨酸取代由SEQ ID NO：4修饰的氨基酸序列的CDR3结构域。优选地，LCVR进一步具有包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR2结构域（即D2E7 VL CDR2），并且HCVR进一步具有包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR2结构域（即D2E7 VH CDR2）。甚至更加优选地，LCVR进一步具有包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR1结构域（即D2E7 VL CDR1），并且HCVR具有包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDR1结构域（即D2E7 VH CDR1）。关于VL的构架区优选来自VκI人种系家族，更优选来自A20人种系Vk基因，并且最优选来自美国专利号6,090,382的图1A和1B中所示的D2E7 VL构架序列。关于VH的构架区优选来自VH3人种系家族，更优选来自DP-31人种系VH基因，并且最优选来自美国专利号6,090,382的图2A和2B中所示的D2E7 VH构架序列。

因此，在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分优选含有包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的轻链可变区（LCVR）（即D2E7 VL）和包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链可变区（HCVR）（即D2E7 VH）。在某些实施方案中，抗体包含重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。优选地，重链恒定区是IgG1重链恒定区或IgG4重链恒定区。此外，抗体可以包含轻链恒定区，κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。优选地，抗体包含κ轻链恒定区。可替代地，抗体部分可以是例如Fab片段或单链Fv片段。

在另外其他实施方案中，本发明包括含有D2E7相关VL和VH CDR3结构域的分离的人抗体或其抗原结合部分的用途。例如，抗体或其抗原结合部分具有轻链可变区（LCVR）或具有重链可变区（HCVR），所述轻链可变区（LCVR）具有包含选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的氨基酸序列的CDR3结构域，所述重链可变区（HCVR）具有包含选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR3结构域。

在本发明的方法和组合物中使用的抗体或抗体部分可以通过免疫球蛋白轻和重链基因在宿主细胞中的重组表达而制备。为了重组表达抗体，用携带DNA片段的一种或多种重组表达载体转染宿主细胞，所述DNA片段编码抗体的免疫球蛋白轻和重链，从而使得轻和重链在宿主细胞中表达，并且优选分泌到宿主细胞在其中培养的培养基内，从所述培养基中可以回收抗体。标准重组DNA方法用于获得抗体重和轻链基因，将这些基因掺入重组表达载体内，并且将载体引入宿主细胞内，例如Sambrook，Fritsch和Maniatis（编辑），Molecular Cloning；A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.,（1989），Ausubel，F.M.等人（编辑）Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates,（1989）和Boss等人的美国专利号4,816,397中描述的那些。

为了表达阿达木单抗（D2E7）或阿达木单抗（D2E7）相关抗体，首先获得编码轻和重链可变区的DNA片段。这些DNAs可以使用聚合酶链反应（PCR）通过种系轻和重链可变序列的扩增和修饰获得。关于人重和轻链可变区基因的种系DNA序列是本领域已知的（参见例如，“Vbase”人种系序列数据库；还参见Kabat，E.A.，等人（1991）Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S. Department of Health and Human Services，NIH Publication No. 91-3242；Tomlinson，I.M.，等人（1992）"The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798；和Cox，J.P.L. 等人（1994）"A Directory of Human Germ-line V78 Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836；所述参考文献各自的内容特别引入本文作为参考）。为了获得编码D2E7或D2E7相关抗体的重链可变区的DNA片段，通过标准PCR扩增人种系VH基因的VH3家族成员。最优选地，扩增DP-31 VH种系序列。为了获得编码D2E7或D2E7相关抗体的轻链可变区的DNA片段，通过标准PCR扩增人种系VL基因的VκI家族成员。最优选地，扩增A20 VL种系序列。适合于在扩增DP-31种系VH和A20种系VL序列中使用的PCR引物可以使用标准方法基于上文引用的参考文献中公开的核苷酸序列进行设计。

一旦获得了种系VH和VL片段，这些序列就可以进行突变以编码本文公开的D2E7或D2E7相关氨基酸序列。由种系VH和VL DNA序列编码的氨基酸序列首先与D2E7或D2E7相关VH和VL氨基酸序列进行比较，以鉴定D2E7或D2E7相关序列中与种系不同的氨基酸残基。随后，种系DNA序列的合适核苷酸这样突变，从而使得突变的种系序列编码D2E7或D2E7相关氨基酸序列，其中使用遗传密码以测定应进行哪些核苷酸改变。种系序列的诱变通过标准方法执行，例如PCR介导的诱变（其中将突变的核苷酸掺入PCR引物内，从而使得PCR产物包含突变）或位点定向诱变。

此外，应当注意如果通过PCR扩增获得的“种系”序列编码构架区中与真实种系构型的氨基酸差异（即与真实种系序列相比较在扩增的序列中的差异，例如由于体细胞突变），可能希望将这些氨基酸差异改变回到真实种系序列（即构架残基到种系构型的“回复突变”）。

一旦获得了编码D2E7或D2E7相关VH和VL区段的DNA片段（例如通过种系VH和VL基因的扩增和诱变，如上所述），这些DNA片段就可以通过标准重组DNA技术进一步操作，例如以将可变区基因转变为全长抗体链基因，Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段与编码另一种蛋白质例如抗体恒定区或柔性接头的另一个DNA片段可操作地连接。如这个背景中使用的，术语“可操作地连接的”意指2个DNA片段这样连接，从而使得由2个DNA片段编码的氨基酸序列保持符合读框。

通过使编码VH的DNA与编码重链恒定区（CH1、CH2和CH3）的另一个DNA分子可操作地连接，可以使编码VH区的分离的DNA转变为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的（参见例如，Kabat，E.A.，等人（1991）Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S. Department of Health and Human Services，NIH公开号91-3242），并且包含这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但最优选是IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可以与仅编码重链CH1恒定区的另一个DNA分子可操作地连接。

通过使编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的另一个DNA分子可操作地连接，可以使编码VL区的分离的DNA转变为全长轻链基因（以及Fab轻链基因）。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的（参见例如，Kabat，E.A.，等人（1991）Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S. Department of Health and Human Services，NIH公开号91-3242），并且包含这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但最优选是κ恒定区。

为了产生scFv基因，使编码VH和VL的DNA片段与另一种片段可操作地连接，所述另一种片段编码柔性接头，例如编码氨基酸序列（Gly4-Ser）3，从而使得VH和VL序列可以表达为邻接单链蛋白质，其中VL和VH区通过柔性接头连接（参见例如，Bird等人（1988）Science 242:423-426；Huston等人（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；McCafferty等人，Nature（1990）348:552-554）。

为了表达在本发明中使用的抗体或抗体部分，将如上所述获得的编码部分或全长轻和重链的DNAs这样插入表达载体内，从而使得基因与转录和翻译控制序列可操作地连接。在这个背景中，术语“可操作地连接的”意指抗体基因这样连接到载体内，从而使得在载体内的转录和翻译控制序列发挥其调节抗体基因转录和翻译的预期功能。选择与所使用的表达宿主细胞相容的表达载体和表达控制序列。抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入分开的载体内，或一般地，2种基因都插入相同表达载体内。抗体基因通过标准方法（例如，在抗体基因片段和载体上的互补限制位点的连接，或如果不存在限制位点，那么平端连接）插入表达载体内。在插入D2E7或D2E7相关轻或重链序列前，表达载体可以已携带抗体恒定区序列。例如，使D2E7或D2E7相关VH和VL序列转变成全长抗体基因的一种方法是将其插入已分别编码重链恒定和轻链恒定区的表达载体内，从而使得VH区段与载体内的一个或多个CH区段可操作地连接，并且VL区段与载体内的CL区段可操作地连接。另外或可替代地，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞中分泌的信号肽。抗体链基因可以这样克隆到载体内，从而使得信号肽与抗体链基因的氨基末端符合读框地连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽（即，来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽）。

除抗体链基因外，本发明的重组表达载体还携带控制抗体链基因在宿主细胞中的表达的调节序列。术语“调节序列”意欲包括启动子、增强子和控制抗体链基因转录或翻译的其他表达控制元件（例如，多腺苷酸化信号）。此种调节序列例如在Goeddel；Gene Expression Technology： Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA（1990）中描述。本领域技术人员将认识到表达载体的设计，包括调节序列的选择，可以依赖于此种因素如待转化的宿主细胞的选择，所需蛋白质的表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括指导哺乳动物细胞中的高水平蛋白质表达的病毒元件，例如衍生自巨细胞病毒（CMV）（例如CMV启动子/增强子）、猿猴病毒40（SV40）（例如SV40启动子/增强子）、腺病毒（例如，腺病毒主要晚期启动子（AdMLP））和多瘤的启动子和/或增强子。关于病毒调节元件及其序列的进一步描述，参见例如，Stinski的美国专利号5,168,062，Bell等人的美国专利号4,510,245和Schaffner等人的美国专利号4,968,615。

除抗体链基因和调节序列外，在本发明中使用的重组表达载体还可以携带另外的序列，例如调节载体在宿主细胞中的复制的序列（例如，复制起点）和选择标记基因。选择标记基因促进载体已引入其内的宿主细胞的选择（参见例如，全部为Axel等人的美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017）。例如，一般地选择标记基因对载体已引入其内的宿主细胞赋予针对药物的抗性，所述药物例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶（DHFR）基因（用于利用氨甲蝶呤选择/扩增在dhfr-宿主细胞中使用）和neo基因（用于G418选择）。

对于轻和重链的表达，通过标准技术将编码重和轻链的一种或多种表达载体转染到宿主细胞内。各种形式的术语“转染”意欲包括常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞内的广泛多样的技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管理论上可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但在真核细胞且最优选哺乳动物宿主细胞中的抗体表达是最优选的，这是因为此种真核细胞且特别地哺乳动物细胞比原核细胞更可能装配且分泌正确折叠且免疫学活性的抗体。已报道抗体基因的原核表达对于活性抗体的高得率产生是无效的（Boss，M.A.和Wood，C. R.（1985）Immunology Today 6:12-13）。

用于表达本发明的重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢（CHO细胞）（包括在Urlaub和Chasin,（1980）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220中描述，与DHFR选择标记一起使用的dhfr- CHO细胞，例如，如R.J. Kaufman和P.A. Sharp（1982）Mol. Biol. 159:601-621中描述的）、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞内时，通过使宿主细胞培养足以允许抗体在宿主细胞中表达，或更优选地，抗体分泌到宿主细胞在其中生长的培养基内的时间段而产生抗体。抗体可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收。

宿主细胞还可以用于产生完整抗体的部分，例如Fab片段或scFv分子。应当理解关于上述程序的变化在本发明的范围内。例如，可能希望用编码本发明抗体的轻链或重链（但并非两者）的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术也可以用于去除对于与hTNF-α结合不必需的编码轻和重链任一或两者的一些或全部DNA。由此种截短的DNA分子表达的分子也由本发明的抗体包括。此外，通过经由标准化学交联方法使本发明的抗体与第二种抗体交联，可以产生双功能抗体，其中一条重链和一条轻链是本发明的抗体，并且另一条重和轻链对于除hTNF-α外的抗原特异。

在用于本发明的抗体或其抗原结合部分重组表达的优选系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体引入dhfr- CHO细胞内。在重组表达载体内，使抗体重和轻链基因各自与CMV增强子/AdMLP启动子调节元件可操作地连接，以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因，其允许使用氨甲蝶呤选择/扩增选择已用载体转染的CHO细胞。使所选转化体宿主细胞培养，以允许抗体重和轻链表达，并且从培养基中回收完整抗体。标准分子生物学技术用于制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化体，培养宿主细胞且从培养基中回收抗体。

由前文看来，可以用于在本发明中使用的抗体和抗体部分的重组表达的核酸、载体和宿主细胞组合物包括核酸和包含所述核酸的载体，包含人TNFα抗体阿达木单抗（D2E7）。编码D2E7轻链可变区的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：36中。LCVR的CDR1结构域包含核苷酸70-102，CDR2结构域包含核苷酸148-168，并且CDR3结构域包含核苷酸265-291。编码D2E7重链可变区的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：37中。HCVR的CDR1结构域包含核苷酸91-105，CDR2结构域包含核苷酸148-198，并且CDR3结构域包含核苷酸295-330。本领域技术人员将认识到编码D2E7相关抗体或其部分（例如CDR结构域，例如CDR3结构域）的核苷酸序列可以使用遗传密码和标准分子生物学技术衍生自编码D2E7 LCVR和HCVR的核苷酸序列。

在一个实施方案中，液体药物制剂包含人TNFα抗体或其抗原结合部分，其对于抗体阿达木单抗是生物等效或生物相似（biosimilar）的。在一个实施方案中，生物相似的抗体是当与参考抗体例如阿达木单抗相比较时，未显示临床上有意义的差异的抗体。生物相似的抗体具有与参考抗体例如阿达木单抗等价的安全、纯度和效力。

IV. 本发明的制剂的施用

本发明的制剂的优点是它可以用于对受试者皮下递送高浓度的人抗TNF-α抗体或其抗原结合部分（例如阿达木单抗）。因此，在一个实施方案中，本发明的制剂皮下递送给受试者。在一个实施方案中，受试者给他/她自己施用制剂。

在一个实施方案中，施用有效量的制剂。语言制剂的“有效量”是抑制TNF-α活性必需或足够的量，例如预防有害TNF-α活性相关状态的各种形态学和躯体症状。在另一个实施方案中，制剂的有效量是达到所需结果必需的量。

制剂的有效量的例子是抑制有害TNF-α活性或治疗其中TNFα活性有害的病症足够的量。如本文使用的，术语“其中TNFα活性有害的病症”意欲包括这样的疾病和其他病症，其中在患有病症的受试者中TNF-α的存在已显示负责或怀疑负责病症的病理生理学，或者是或怀疑是促成病症恶化的因子。因此，其中TNF-α活性有害的病症是其中TNF-α活性的抑制预期减轻病症的症状和/或进展的病症。此种病症可以例如通过患有病症的受试者的生物学流体中TNF-α浓度中的增加（例如，在受试者的血清、血浆、滑液等中TNF-α浓度中的增加）得以证明，这可以例如使用抗TNF-α抗体进行检测。

如下文附加实施例中所述，本发明的制剂的一个优点是制备包含高浓度的抗体的制剂而不增加制剂的粘度的能力。因此，也如下文所述，新制剂允许在与先前商业制剂相比较更小的体积中施用高量（例如有效量）的抗体，从而减少疼痛。

在一个实施方案中，抗体的有效量可以根据严格基于重量的给药方案（例如mg/kg）进行测定，或可以是不依赖于重量的全身剂量（也称为固定剂量）。在一个例子中，有效量的制剂是包含约80 mg抗体的全身剂量的0.8 mL制剂（即0.8 mL 100 mg/mL本发明的抗体制剂）。在另一个例子中，有效量的制剂是包含约40 mg抗体的全身剂量的0.4 mL本发明的制剂（即0.4 mL 100 mg/mL本发明的抗体制剂）。在另外一个例子中，有效量的制剂是包含约160 mg抗体的全身剂量的两倍于0.8 mL的制剂（即各包含0.8 mL 100 mg/mL本发明的抗体制剂的2个单位）。在进一步的例子中，有效量的制剂是包含约20 mg抗体的全身剂量的0.2 mL本发明制剂（即0.2 mL 100 mg/mL本发明的抗体制剂）。可替代地，有效量可以根据基于重量的固定给药方案进行测定（参见例如，引入本文作为参考的WO 2008/154543）。

本发明提供了具有延长的保存期限的稳定、高浓度制剂，其在一个实施方案中用于抑制患有其中TNF-α活性有害的病症的受试者中的TNF-α活性，包含给受试者施用本发明的制剂，从而使得受试者中的TNF-α活性得到抑制。优选地，TNF-α是人TNF-α，并且受试者是人受试者。可替代地，受试者可以是表达本发明的抗体与之交叉反应的TNF-α的哺乳动物。再进一步地，受试者可以是hTNF-α已引入其内的哺乳动物（例如通过hTNF-α的施用或通过hTNF-α转基因的表达）。

本发明的制剂可以施用于人受试者用于治疗用途（下文进一步讨论）。在本发明的一个实施方案中，液体药物制剂可容易施用，这包括例如通过患者自施用的制剂。在优选实施方案中，本发明的制剂通过皮下注射进行施用，优选单次使用。此外，本发明的制剂可以施用于表达抗体与之交叉反应的TNF-α的非人哺乳动物（例如灵长类动物、猪或小鼠）用于兽医学目的或作为人疾病的动物模型。关于后者，此种动物模型可以用于评价本发明的抗体的治疗功效（例如测试施用剂量和时间过程）。

在一个实施方案中，本发明的液体药物制剂可以经由预装注射器、自动注射器笔或无针施用设备施用于受试者。因此，本发明的特征还在于包含本发明的液体药物制剂的自动注射器笔、预装注射器或无针施用设备。在一个实施方案中，本发明的特征在于包含制剂剂量的递送设备，所述制剂包含100 mg/mL人TNFα抗体或其抗原结合部分，例如包含下述剂量的自动注射器笔或预装注射器：约19 mg、20、mg、21 mg、22 mg、23 mg、24 mg、25 mg、26 mg、27 mg、28 mg、29 mg、30 mg、31 mg、32 mg、33 mg、34 mg、35 mg、36 mg、37 mg、38 mg、39 mg、40 mg、41 mg、42 mg、43 mg、44 mg、45 mg、46 mg、47 mg、48 mg、49 mg、50 mg、51 mg、52 mg、53 mg、54 mg、55 mg、56 mg、57 mg、58 mg、59 mg、60 mg、61 mg、62 mg、63 mg、64 mg、65 mg、66 mg、67 mg、68 mg、69 mg、70 mg、71 mg、72 mg、73 mg、74 mg、75 mg、76 mg、77 mg、78 mg、79 mg、80 mg、81 mg、82 mg、83 mg、84 mg、85 mg、86 mg、87 mg、88 mg、89 mg、90 mg、91 mg、92 mg、93 mg、94 mg、95 mg、96 mg、97 mg、98 mg、99 mg、100 mg、101 mg、102 mg、103 mg、104 mg、105 mg等的制剂。

优选地，本发明的制剂用于治疗其中TNFα活性有害的病症。如本文使用的，术语“其中TNFα活性有害的病症” 意欲包括这样的疾病和其他病症，其中在患有病症的受试者中TNF-α的存在已显示负责或怀疑负责病症的病理生理学，或者是或怀疑是促成病症恶化的因子。因此，其中TNF-α活性有害的病症是其中TNF-α活性的抑制预期减轻病症的症状和/或进展的病症。此种病症可以例如通过患有病症的受试者的生物学流体中TNF-α浓度中的增加（例如，在受试者的血清、血浆、滑液等中TNF-α浓度中的增加）得以证明，这可以例如使用如上所述的抗TNF-α抗体进行检测。

存在其中TNF-α活性有害的病症的众多例子。其中TNF-α活性有害的例子也在美国专利号6,015,557；6,177,077；6,379,666；6,419,934；6,419,944；6,423,321；6,428,787；和6,537,549；以及PCT公开号WO 00/50079和WO 01/49321中描述，所有所述专利的完整内容引入本文作为参考。本发明的制剂还可以用于治疗如美国专利号6,090,382，6,258,562和美国专利申请公开号US20040126372中所述的其中TNFα活性有害的病症，所有所述专利的完整内容引入本文作为参考。

本发明的制剂在具体示例性病症的治疗中的用途在下文进一步讨论：

A. 脓毒病

肿瘤坏死因子在脓毒病的病理生理学中具有确定的作用，具有包括低血压、心肌抑制、血管渗漏综合征、器官坏死、毒性次级介质释放的刺激和凝血级联激活的生物学作用（参见例如，Tracey，K. J.和Cerami，A.（1994）Annu. Rev. Med. 45:491-503；Russell，D和Thompson，R. C.（1993）Curr. Opin. Biotech. 4:714-721）。因此，本发明的制剂可以用于治疗其临床情况的任何一种中的脓毒病，包括脓毒性休克、内毒素休克、革兰氏阴性脓毒病和中毒性休克综合征。

此外，为了治疗脓毒病，本发明的制剂可以与一种或多种另外的治疗剂共施用，所述另外的治疗剂可以进一步减轻脓毒病，例如白细胞介素-1抑制剂（例如PCT公开号WO 92/16221和WO 92/17583中所述的那些）、细胞因子白细胞介素-6（参见例如PCT公开号WO 93/11793）或血小板活化因子拮抗剂（参见例如欧洲专利申请公开号EP 374 510）。

此外，在优选实施方案中，本发明的制剂施用于在治疗时具有超过500 pg/ml且更优选1000 pg/ml的IL-6血清或血浆浓度的脓毒病患者亚群内的人受试者。

B. 自身免疫性疾病

肿瘤坏死因子已牵涉于在多种自身免疫性疾病的病理生理学中起作用。例如，TNF-α已牵涉于在类风湿性关节炎中激活组织炎症且引起关节破坏（参见例如，Tracey和Cerami，同上；Arend，W. P.和Dayer，J-M.（1995）Arth. Rheum. 38:151-160；Fava，R. A.，等人（1993）Clin. Exp. Immunol. 94:261-266）。TNF-α也已牵涉于在糖尿病中促进胰岛细胞的死亡和介导胰岛素耐受性（参见例如，Tracey和Cerami，同上；PCT公开号WO 94/08609）。TNF-α也已牵涉于在多发性硬化中介导对少突胶质细胞的细胞毒性和炎症斑的诱导（参见例如，Tracey和Cerami，同上）。在可以使用本发明的制剂治疗的自身免疫性疾病中还包括的是青少年特发性关节炎（JIA）（也称为青少年类风湿性关节炎）（参见Grom 等人（1996）Arthritis Rheum. 39:1703；Mangge 等人（1995）Arthritis Rheum. 8:211）。

本发明的制剂可以用于治疗自身免疫性疾病，特别是与炎症相关的那些，包括类风湿性关节炎、类风湿性脊椎炎（也称为强直性脊柱炎）、骨关节炎和痛风性关节炎、变态反应、多发性硬化、自身免疫性糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、青少年特发性关节炎（也称为青少年类风湿性关节炎）和肾病综合征。

C. 传染病

肿瘤坏死因子已牵涉于介导在多种传染病中观察到的生物学作用。例如，TNF-α已牵涉于在疟疾中介导脑炎症以及毛细血管血栓形成和梗死（参见例如，Tracey和Cerami，同上）。TNF-α还已牵涉于在脑膜炎中介导脑炎症，诱导血脑屏障的破坏，触发脓毒性休克综合征且激活静脉梗死（参见例如，Tracey和Cerami，同上）。TNF-α还已牵涉于在获得性免疫缺陷综合征（AIDS）中诱导恶病质，刺激病毒增殖且介导中枢神经系统损伤（参见例如，Tracey和Cerami，同上）。因此，本发明的抗体和抗体部分可以用于治疗传染病，包括细菌性脑膜炎（参见例如，欧洲专利申请公开号EP 585 705）、脑型疟、AIDS和AIDS相关复征（ARC）（参见例如，欧洲专利申请公开号EP 230 574），以及移植继发的巨细胞病毒感染（参见例如，Fietze，E.，等人（1994）Transplantation 58:675-680）。本发明的制剂还可以用于减轻与传染病相关的症状，包括由于感染（例如流行性感冒）的发热和肌痛以及感染继发的（例如AIDS或ARC继发的）恶病质。

D. 移植

肿瘤坏死因子已牵涉于作为同种异体移植排斥和移植物抗宿主病（GVHD）的关键介质，且介导当针对T细胞受体CD3复合物的大鼠抗体OKT3用于抑制肾移植排斥时观察到的不利反应（参见例如，Tracey和Cerami，同上；Eason，J. D.，等人（1995）Transplantation 59:300-305；Suthanthiran，M.和Strom，T. B.（1994）New Engl. J. Med. 331:365-375）。因此，本发明的制剂可以用于抑制移植排斥，包括同种异体移植物和异种移植物的排斥且抑制GVHD。尽管抗体或抗体部分可以单独使用，但它可以与一种或多种其他试剂组合使用，所述其他试剂抑制针对同种异体移植物的免疫应答或抑制GVHD。例如，在一个实施方案中，本发明的制剂与OKT3组合用于抑制OKT3诱导的反应。在另一个实施方案中，本发明的制剂与针对与调节免疫应答有关的其他靶的一种或多种抗体组合使用，例如细胞表面分子CD25（白细胞介素-2受体α）、CD11a（LFA-1）、CD54（ICAM-1）、CD4、CD45、CD28/CTLA4、CD80（B7-1）和/或CD86（B7-2）。在另外一个实施方案中，本发明的制剂与一种或多种一般免疫抑制剂例如环孢菌素A或FK506组合使用。

E. 恶性肿瘤

肿瘤坏死因子已牵涉于在恶性肿瘤中诱导恶病质，刺激肿瘤生长，增强转移潜力且介导细胞毒性（参见例如，Tracey和Cerami，同上）。因此，本发明的制剂可以用于治疗恶性肿瘤，抑制肿瘤生长或转移和/或减轻恶性肿瘤继发的恶病质。

F. 肺病症

肿瘤坏死因子已牵涉于成人呼吸窘迫综合征的病理生理学，包括刺激白细胞-内皮激活，指导针对肺细胞的细胞毒性且诱导血管渗漏综合征（参见例如，Tracey和Cerami，同上）。因此，本发明的制剂可以用于治疗各种肺病症，包括成人呼吸窘迫综合征（参见例如，PCT公开号WO 91/04054）、休克肺、慢性肺炎性疾病、肺结节病、肺纤维化和硅肺。

G. 肠病症

肿瘤坏死因子已牵涉于炎性肠病的病理生理学（参见例如，Tracy，K. J.，等人（1986）Science 234:470-474；Sun，X-M.，等人（1988）J. Clin. Invest. 81:1328-1331；MacDonald，T. T.，等人（1990）Clin. Exp. Immunol. 81:301-305）。嵌合鼠抗hTNF-α抗体已经历用于治疗Crohn氏病的临床测试（van Dullemen，H. M.，等人（1995）Gastroenterology 109:129-135）。本发明的制剂还可以用于治疗肠病症，例如特发性炎性肠病，这包括2种综合征，Crohn氏病和溃疡性结肠炎。

H. 心脏病症

本发明的制剂还可以用于治疗各种心脏病症，包括心脏的缺血（参见例如，欧洲专利申请公开号EP 453 898）和心机能不全（心肌虚弱）（参见例如，PCT公开号WO 94/20139）。

I. 脊椎关节病

TNFα已牵涉于广泛多样病症的病理生理学，包括炎性疾病例如脊椎关节病（参见例如，Moeller，A.，等人（1990）Cytokine 2:162-169；授予Moeller等人的美国专利号5,231,024；Moeller，A的欧洲专利公开号260 610 B1）。可以通过本发明的制剂治疗的脊椎关节病的例子包括牛皮癣性关节炎。肿瘤坏死因子已牵涉于牛皮癣性关节炎的病理生理学（Partsch 等人（1998）Ann Rheum Dis. 57:691；Ritchlin 等人（1998）J Rheumatol. 25:1544）。

J. 皮肤和甲病症

在一个实施方案中，本发明的制剂用于治疗皮肤和甲病症。如本文使用的，术语“其中TNFα活性有害的皮肤和甲病症”意欲包括皮肤和/或甲病症和其他病症，其中在患有病症的受试者中TNFα的存在已显示负责或怀疑负责病症的病理生理学，或者是或怀疑是促成病症例如牛皮癣恶化的因子。可以使用本发明的制剂治疗的皮肤病症的例子是牛皮癣。在一个实施方案中，本发明的制剂用于治疗斑块状牛皮癣（plaque psoriasis）。肿瘤坏死因子已牵涉于牛皮癣的病理生理学（Takematsu 等人（1989）Arch Dermatol Res. 281:398；Victor和Gottlieb（2002）J Drugs Dermatol. 1（3）:264）。

在一个实施方案中，本发明的制剂用于治疗类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎或强直性脊柱炎。根据对于治疗类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎或强直性脊柱炎有效的给药方案和剂量量，包含分离的人TNFα抗体或其抗原结合部分（例如阿达木单抗）的本发明的制剂可以施用于人受试者。在一个实施方案中，在本发明的制剂中约40 mg人TNFα抗体或其抗原结合部分（例如阿达木单抗）（例如0.4 mL 100 mg/mL本发明的制剂）的剂量每隔一周施用于人受试者用于治疗类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎或强直性脊柱炎。在一个实施方案中，制剂每隔一周皮下施用（也称为两周一次，参见引入本文作为参考的US20030235585中所述的施用方法）用于治疗类风湿性关节炎、强直性脊柱炎或牛皮癣性关节炎。

在一个实施方案中，本发明的制剂用于治疗Crohn氏病。根据对于治疗Crohn氏病有效的给药方案和剂量量，包含分离的人TNFα抗体或其抗原结合部分（例如阿达木单抗）的本发明的制剂可以施用于人受试者。在一个实施方案中，在本发明的制剂中约160 mg人TNFα抗体或其抗原结合部分（例如阿达木单抗）（例如1.6 mL 100 mg/mL本发明的制剂）的剂量在约第1天时开始施用于人受试者，随后为2周后80 mg抗体的后续剂量（例如0.8 mL 100 mg/mL本发明的制剂），随后为每隔一周约40 mg（例如0.4 mL 100 mg/mL本发明的制剂）的施用用于治疗Crohn氏病。在一个实施方案中，根据包含一个或多个诱导剂量和一个或多个维持剂量的多重可变剂量方案（参见例如用于治疗Crohn氏病的美国专利公开号US20060009385和US20090317399），其各自引入本文作为参考），制剂皮下施用用于治疗Crohn氏病。

在一个实施方案中，本发明的制剂用于治疗牛皮癣。根据对于治疗牛皮癣有效的给药方案和剂量量，包含分离的人TNFα抗体或其抗原结合部分（例如阿达木单抗）的本发明的制剂可以施用于人受试者。在一个实施方案中，在本发明的制剂中约80 mg人TNFα抗体或其抗原结合部分（例如阿达木单抗）（例如0.8 mL 100 mg/mL本发明的制剂）的起始剂量施用于人受试者，随后为在起始剂量后1周开始每隔一周40 mg抗体的后续剂量（例如0.4 mL 100 mg/mL本发明的制剂）。在一个实施方案中，根据包含一个或多个诱导剂量和一个或多个维持剂量的多重可变剂量方案（参见例如US 20060009385和WO 2007/120823，其各自引入本文作为参考），制剂皮下施用用于治疗牛皮癣。

在一个实施方案中，本发明的制剂用于治疗青少年特发性关节炎（JIA）。根据对于治疗JIA有效的给药方案和剂量量，包含分离的人TNFα抗体或其抗原结合部分（例如阿达木单抗）的本发明的制剂可以施用于人受试者。在一个实施方案中，在本发明的制剂中20 mg人TNFα抗体或其抗原结合部分（例如0.2 mL 100 mg/mL本发明的制剂）每隔一周施用于称重15 kg（约33 lbs）至小于30 kg（66 lbs）的受试者用于治疗JIA。在另一个实施方案中，在本发明的制剂中40 mg人TNFα抗体或其抗原结合部分（例如0.4 mL 100 mg/mL本发明的制剂）每隔一周施用于称重大于或等于30 kg（66 lbs）的受试者用于治疗JIA。在一个实施方案中，根据基于重量的固定剂量（参见例如引入本文作为参考的美国专利公开号20090271164），制剂皮下施用用于治疗JIA。

在一个实施方案中，根据每月一次的给药方案，分离的人TNFα抗体或其抗原结合部分（例如阿达木单抗）可以施用于人受试者用于治疗与有害TNFa活性相关的病症，从而抗体每个月施用一次或每4周施用一次。如上所述，可以根据每月一次的给药方案治疗的病症的例子包括但不限于类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、JIA、牛皮癣、Crohn氏病或牛皮癣性关节炎。因此，根据每月一次的给药方案，包含分离的人TNFα抗体或其抗原结合部分（例如阿达木单抗）的本发明的制剂可以施用于人受试者用于治疗与有害TNFa活性相关的病症。在一个实施方案中，在本发明的制剂中80 mg人TNFα抗体或其抗原结合部分（例如0.8 mL 100 mg/mL本发明的制剂）施用于具有与有害TNFa活性相关的病症的受试者。

本文描述的剂量量可以作为单剂（例如在0.4 mL中40 mg的单剂或在0.8mL中的80 mg剂量）递送，或可替代地可以作为多剂（例如4个40 mg剂量或2个80 mg剂量用于递送160 mg剂量）递送。

包含分离的人TNFα抗体或其抗原结合部分（例如阿达木单抗）的本发明的制剂可以与另外的治疗剂组合施用于受试者。在一个实施方案中，制剂与氨甲蝶呤或其他缓解疾病的抗风湿性药物（DMARDs）组合施用于人受试者用于治疗类风湿性关节炎。在另一个实施方案中，制剂与氨甲蝶呤或其他缓解疾病的抗风湿性药物（DMARDs）组合施用于人受试者用于治疗JIA。另外的组合疗法在美国专利号6,258,562和7,541,031；和美国专利公开号US20040126372中描述，所有所述专利的完整内容都引入本文作为参考。

包含人TNFα抗体或其抗原结合部分的本发明的制剂还可以用于治疗具有失败的先前TNF抑制剂疗法的受试者，例如已丧失对英夫单抗的应答或对英夫单抗不耐受的受试者。

本发明在下述实施例中进一步举例说明，所述实施例不应解释为进一步限制性的。

实施例

实施例1：改善人抗 TNF- α抗体液体药物制剂的稳定性

这个实施例提供了旨在改善抗体阿达木单抗的药物制剂的稳定性的实验结果。

材料与方法

阿达木单抗（亚类G₁，约47 kDa）在修饰的药物制剂中配制，以生成50 mg/mL最终药物浓度的液体肠胃外剂量形式。先前制剂实验已测定就阿达木单抗的蛋白质稳定作用而言，磷酸盐/柠檬酸盐缓冲系统优于其他缓冲系统。因此，改善的稳定性经由对于液体50 mg/mL剂量添加赋形剂得到解决。使用的所有赋形剂具有最高纯度（“精密分析用（pro analysis）”级别）且购自Merck KGaA，Darmstadt，德国。甘露糖醇源自Mallinckrodt Baker B.V.，Deventer，Holland。

可见微粒物质的分析根据Ph. Eur. 2002（§ 2.9.20由微粒物质 – 可见粒子的污染（Contamination with particulate matter – visible particles））的条例进行。通过光阻法（light obscuration）（SVSS-C⁴⁰，PAMAS GmbH，Rutesheim，德国）测定亚可见微粒物质分析。Superose TM6 10/30柱（Amersham Pharmacia Europe GmbH，Freiburg，德国）用于SE-HPLC分析（蛋白质单体含量的评估），应用具有pH 7.5的PBS缓冲液的0.5 mL/分钟流速，并且与UV₂₈₀分光光度测定法、折射率检测和用于联机（on-line）检测的MALS连接。每个样品的分析至少一式三份地执行。除非另有说明，对于所有SE-HPLC，数据S_rel低于0.13，并且对于所有光阻法，数据低于2.3。

经由用赋形剂母液稀释阿达木单抗浓缩物（~70 mg/mL）制备个别蛋白质制剂。使用如表16中列出的柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液组分的组合物（即柠檬酸* H₂O、脱水柠檬酸钠、Na₂HPO₄ * 2 H₂O、NaH₂PO₄ * 2 H₂O），制备70 mg/mL阿达木单抗母液。

使用如表16中列出的柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液组分的组合物（即柠檬酸* H₂O、脱水柠檬酸钠、Na₂HPO₄ * 2 H₂O、NaH₂PO₄ * 2 H₂O），通过在磷酸盐/柠檬酸盐缓冲介质中的赋形剂溶解生成赋形剂母液。在无菌过滤前（0.2 µm，Minisart^®，Sartorius AG，Goettingen，德国），通过添加缓冲液组分的酸/碱样品执行pH调整。所有制剂至少一式两份地进行制备，并且在无菌层流(laminar air flow)条件下经由溶液分批最后无菌过滤到热灭菌的（180℃，25分钟）2R玻璃小瓶（Schott Glas，Mainz，德国）内生成。在使用前特氟隆包被的丁基橡胶塞根据Ph. Eur.经由湿热（121℃）进行灭菌。

对各种制剂实施在3个不同温度（5℃、25℃、40℃）的3个月短期贮存。

使用磷酸盐/柠檬酸盐缓冲介质用于缓冲液更换，通过经由Vivaflow 50单元（截断50 kDa，Vivascience G，Hannover，德国）渗滤阿达木单抗本体溶液提供阿达木单抗浓缩物。用于生物药学溶液的浓缩和缓冲液更换的目前过程基于IEX、SE-HPLC、超滤/渗滤和切向流过滤（Christy 等人（2002）Desalination，144:133-136）。应用渗滤，这是因为纯化、浓缩和缓冲液更换在具有可变流动动力学的单个单元操作内是可能的，从而使蛋白质应力降到最低（表1）。

表1. 蛋白质损失和渗滤循环数目的关联。

执行的每个循环导致总蛋白质~0.25％的蛋白质损失。一般地，蛋白质损失在浓缩物生产过程中不超过7％。

在1个渗滤循环内，蛋白质浓度加倍且再稀释到原始浓度，除终末浓缩步骤外。因此，对于存在不预期的不希望有的溶解物质可以有效地去除（例如1.00％浓度可以在10个渗滤循环内减小至0.00098％）。在纯化和浓缩后，阿达木单抗浓缩物进行离心（5℃，3000 g，20分钟）。

pH最适值的评价

为了评价最佳溶液pH（即，pH 5.2或pH 6.0），分析仅仅在pH中不同的2个不同阿达木单抗制剂。包含1 mg/mL Tween 80的制剂的稳定性数据在表2A和2B中举例说明。

表2A. 制剂 pH 对在 40 ℃贮存过程中的单体含量的影响。

表2B. 制剂 pH 对在贮存过程中的亚可见微粒物质形成的影响。

就单体含量而言，未发现pH优于另一个，这是因为2个制剂在40℃贮存显示出可比较的单体损失。25℃贮存条件的数据类似于40℃数据，而在5℃在这个研究过程中分析的所有蛋白质溶液未经历单体含量中的显著改变。

然而，在浊度中发现差异。6.0溶液pH导致在12周贮存过程中亚可见微粒物质的形成，与贮存温度无关。因为微粒物质形成的强度与较低温度有关，所以颗粒的起源不假定是蛋白质的（proteineic）。在这点上，如果严重微粒物质形成仅仅是由于蛋白质不稳定性，那么这将与在贮存测试过程中暴露于升高的温度有关（Constantino，等人（1994b）J. Pharm. Sci. 83：1662-1669）。

就包含6.16 mg/mL NaCl代替Tween 80的50 mg/mL阿达木单抗制剂而言，盐的添加导致亚可见粒子的形成，这是因为大于1 µm的粒子数目在2种溶液中增加相似程度（参见表3A和3B）。此外，在12周后，SE-HPLC数据显示pH 6.0溶液具有比在pH 5.2的溶液更大的单体含量，尽管差异是最低限度的（~0.3％）并且未通过25℃结果加以确认。

表3A. pH 对在 40 ℃贮存过程中的单体含量的影响。

表3B. pH 对在贮存过程中的亚可见微粒物质形成（ B ）的影响。

粒子形成看起来通过NaCl添加和pH 6.0贮存得到促进，并且由Tween 80添加和5.2的溶液pH得到改善。因此，Tween 80建议作为可以减轻含有盐例如NaCl的溶液中的粒子污染的成分（表4A和4B）。随后检查含有6.16 mg/mL NaCl和1 mg/mL Tween 80的溶液。

表4A. pH 对在贮存过程中的单体含量的影响。

表4B. pH 对在 40 ℃贮存过程中的亚可见微粒物质形成的影响。

如表4B中所示，对于包含盐和表面活性剂的制剂，表面活性剂的添加在亚可见粒子形成方面没有影响，这是因为尽管Tween 80的添加，但亚可见粒子也是明显的。有趣的是，在所有样品中粒子数目在最低贮存温度（5℃）是最大限度的，从而指出粒子起源潜在地是由于无机材料。此外，含有盐的溶液的可见检查揭示在4周贮存后的轻微浊度，与贮存温度无关。可见无机组分的沉淀可以是在冷温度下贮存的结果，即使贮存是暂时的，例如磷酸钠缓冲液可以在4℃获得相对不溶性Na₂HPO₄*12H₂O（Borchert 等人（1986）PDA J. Pharm. Sci. Technol.，40:212-241）。然而，在微粒物质是评价标准的方面，对于检查的溶液5.2的溶液pH具有超过pH 6.0的优点。

然而，就单体含量而言，2个溶液pH值在贮存过程中致使等同的单体含量，且在含NaCl制剂（不含Tween 80）的情况下，6.0的pH看起来揭示甚至略微更高的稳定性。尽管这个相似的单体概况，但通常公认在朝向中性或甚至碱性条件的pH值，蛋白质倾向于更广泛多样的潜在降解机制（Wang（1999）Int. J. Pharm.，185:129-188），例如未电离蛋白质酰胺的羰基-胺反应、（碱催化的）β-消除和脱酰胺通过更高的pH值以及各种氧化反应得到促成（Akers和DeFelippis，Peptides and proteins as parenteral solutions，in Pharmaceutical formulation development of peptides and proteins，由Frokjaer，S；Hovgaard，L.编辑（2000）145-177）。因此，总之，在阿达木单抗50 mg/mL长期稳定性方面，5.2的溶液pH视为优于6.0值。

通过赋形剂：表面活性剂的稳定作用

为了测定表面活性剂对50 mg/mL阿达木单抗制剂的稳定潜力，将各种量的Tween 80（0.％、0.03％、0.1％）添加到含有6.16 mg/mL NaCl的蛋白质溶液中。一般地，假定Tween 80例如通过经由疏水表面相互作用的结合稳定蛋白质。因为蛋白质的表面特征受盐的存在影响，所以另外调查NaCl的不存在的作用（描述为表5中不含NaCl的0.1％Tween 80溶液）（还参见Kheirolomoom等人（1998）Biochem. Eng. J.，2:81-88）。

表5. Tween 80 对含有 6.16 mg/mL NaCl 的蛋白质制剂的影响（贮存温度 40 ℃）。

来自连同和不连同NaCal的各种量Tween 80的结果呈现于表5中。如所示的，Tween 80连同或不连同NaCl不能对制剂提供稳定性。就0.03％Tween 80 / NaCl而言，组合导致在40℃贮存12周后降低单体含量。这个结果与致力于这个课题的大多数论文相矛盾，这是因为一般地Tween 80的稳定影响与渐增浓度的表面活性剂有关（在0.001 - 1％的范围中有效）（参见Arakawa 等人（2001）Adv. Drug Deliv. Rev.，46:307-326）。

除连同和不连同NaCl的不同Tween 80百分比的单体浓度外，亚可见粒子形成也在不同温度进行检查（参见表6）。在所有贮存温度，Tween 80的添加导致亚可见粒子数目中的相当大增加，尤其是在证实SE-HPLC分析的发现的0.03％浓度时。有趣的是，NaCl的不存在证明显著降低亚可见粒子的形成，与贮存温度无关。

表6. Tween 80 对含有 6.16 mg/mL NaCl 的溶液在 40 ℃贮存过程中的亚可见微粒物质形成的影响。

各种浓度的Tween 80还就冻/融循环后的微粒形成而言进行检查。与在贮存过程中对液体溶液的较小稳定影响形成对比，Tween 80证明在冻融循环过程中针对阿达木单抗赋予显著稳定性（表7）。

表7. 借助于冻融循环用不同含量的 Tween 80 给蛋白质溶液加应力

还通过经由冷冻（-80℃，12小时）和融化（5℃，12小时）对溶液反复实施应力检查Tween 80的作用。应用的冻融（冻/融）循环数目与亚可见微粒物质中的增加紧密关联。然而，尽管5个冻/融循环对具有0或0.03％Tween 80含量的溶液的作用导致粒子污染（粒子≥1 µm）中的~10倍增加，但情况事实上在0.1％Tween 80溶液中保持未改变。SE-HPLC分析证实了这些结果（表8）。

表8. 在 Tween 80 含量中改变的阿达木单抗溶液中单体的损失不依赖于施加的冻融循环数目。

紧密依照关于冻/融循环对其他蛋白质的作用公开的众多研究结果，当不存在表面活性剂时，当暴露于反复冻/融应力时，50 mg/mL阿达木单抗的稳定性降低。相反地，表面活性剂的添加针对与冻/融有关的有害参数屏蔽蛋白质，这是因为天然单体（使用多角度光散射（MALS）证实的）的含量保持未改变。

总之，0.1％Tween 80对阿达木单抗50 mg/mL溶液的添加是优选的。通过0.1％Tween仅或多或少地改善贮存的液体中的蛋白质稳定性，在加工例如冷冻和融化期间的稳定作用是相当大的。然而，Tween 80的添加可以作为极大利益出现，这是因为冷冻是蛋白质药物的生产、贮存和转运中的常见单元操作（Cao等人（2003）Biotechnol. Bioeng.，82:684-690）。另外，在药物中0.1％Tween 80的使用是充分接受的，通过早在1986年Orthoclone^TM（鼠IgG2a）的FDA批准证实的。

除Tween 80外，对于其稳定阿达木单抗的潜力研究了非离子型表面活性剂Solutol^® HS15。在0.03和0.1％浓度中Solutol^®的保护特征近期在肠胃外aviscumin方面显示（Steckel 等人（2003）Int. J. Pharm.，257:181-194）。因此，在微粒物质污染形成方面Solutol^®对阿达木单抗溶液的影响与含有0.1％Tween 80的蛋白质溶液进行比较（表9）。

表9. 与含有 0.1 ％ Tween 80 的阿达木单抗溶液相比较，在 12 周贮存后含有各种 Solutol® 浓度的阿达木单抗溶液对微粒物质形成的影响。

与具有0.03％和0.1％Solutol^®的溶液形成对比，分别具有1％Solutol^®和0.1％Tween 80的阿达木单抗溶液显示出在贮存过程中微粒物质的显著增加。低Solutol^®浓度的这个正面影响在SE-HPLC分析的数据中未得到反映。在12周贮存（40℃）后，含有Solutol^®的所有溶液揭示与参考（0.1％Tween 80）相比较在单体含量中~0.5％的损失。（图1）。

这个实验还举例说明在高分子量（hmw）蛋白质聚集体的早期检测中通过MALS提供的极大优点（图2A和2B）。由于其对大分析物的高灵敏度，最低限度浓度足以通过MALS检测聚集体，例如在1周贮存（40℃）后hmw聚集体的形成可以通过MALS加以验证 – 但通过UV₂₈₀-检测事实上不可检测。

因此，Solutol从潜在稳定剂的列表中去除，这是因为在加速保存期限研究的早期阶段中已形成的hmw聚集体一般是不可接受的。即使最低限度量的蛋白质（<0.1％）也已知导致沉淀（Hoffman，Analytical methods and stability testing of biopharmaceuticals，in Protein formulation and delivery，由McNally，E. J.编辑，3（2000）71-110）。上文发现证实了显示更高浓度（>1％）的Solutol^® HS15使利血平相关蛋白酶抑制剂溶液去稳定且有利于可见微粒物质现象的先前研究（参见例如，WO 2006037606）。

通过赋形剂：多元醇的稳定作用

许多糖（例如蔗糖、葡萄糖、棉子糖、海藻糖）和多元醇（例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇）包含在蛋白质稳定共溶剂的范畴下。广泛认为这些物质主要通过空间排阻机制起作用。例如，多元醇例如山梨糖醇经常用于稳定肠胃外例如许多冻干的疫苗药物例如Mumpsvax^TM、Meruvax^TM II和Attenuvax^TM或可静脉内施用的溶液例如Cardene^TM。

与其他赋形剂例如表面活性剂形成对比，糖和多元醇必须以更高浓度添加（>0.5 M），以施展其完全稳定潜力。因此，50和100 mg/mL浓度的山梨糖醇添加到阿达木单抗溶液中，且实施12周贮存（表10）。

表10. 在 12 周贮存过程中山梨糖醇对阿达木单抗溶液中的微粒物质形成的影响。

与其中不存在山梨糖醇的溶液相比较，山梨糖醇降低在贮存过程中关于粒子形成的趋势。添加的山梨糖醇的量事实上不导致任何差异。关于单体含量，发现山梨糖醇的稳定作用是紧密浓度依赖性的。NaCl的存在减损蛋白质稳定性（表11）。

表11. 阿达木单抗稳定性依赖于山梨糖醇浓度，通过蛋白质单体的含量反映（数字指示以 mg/mL 表示的浓度；在 40 ℃贮存）。

根据表11，100 mg/mL山梨糖醇的添加在40℃12周贮存过程中使单体内容物的含量增加~1.5％。减少赋形剂的量导致阿达木单抗稳定性的减少。这些发现确认了关于马免疫球蛋白的稳定性的近期研究，而在针对热应力的蛋白质稳定作用方面，180 mg/mL山梨糖醇显示优于90 mg/mL的添加（Rodrigues-Silva等人，1999 Toxicon 37（1）， 33-45）。糖和糖衍生的多元醇的稳定作用的浓度依赖性已得到报道（Chan 等人（1996）Pharm. Res.，13:756-761；Fatouros 等人（1997b）Pharm. Res.，14:1679-1684）。有趣的是，4 mg/mL盐的添加显著减损山梨糖醇的稳定潜力（~0.25％单体），如表11中所示。另一方面，在含有0.1％Tween 80的阿达木单抗溶液中NaCl的不存在导致在保存期限实验过程中单体含量中仅最低限度的增加（如表11中所示）。

如表12中所示，实验用甘露糖醇代替山梨糖醇进行重复。关于山梨糖醇的发现通过甘露糖醇对阿达木单抗溶液的添加得到证明：（1）在12周贮存（40℃）后，富含80 mg/mL甘露糖醇的溶液在蛋白质单体含量中超过无甘露糖醇溶液~1.5％，（2）甘露糖醇的稳定输入朝向浓度依赖性概况定向，和（3）NaCl减少单独的甘露糖醇降低的单体含量。有趣的是，这些数据通过在25℃执行的等同实验得到确认。

表12. 阿达木单抗稳定性依赖于甘露糖醇浓度，通过蛋白质单体的含量反映（数字指示以 mg/mL 表示的浓度；在 40 ℃贮存）。

总之，50 mg/mL浓度的阿达木单抗通过山梨糖醇和甘露糖醇得到稳定。这个稳定作用被NaCl阻碍。当添加到含有0.1％Tween 80的蛋白质溶液时，NaCl不阻碍阿达木单抗稳定性的发现与上文结论一致。

如表13中所示，在每个阿达木单抗制剂中天然单体的量依赖于多元醇的添加和赋形剂复合材料。相称地，聚集体和片段的量改变。在单体损失的量中的聚集体份额保持恒定，与添加的赋形剂无关，如果存在的话。换言之，阿达木单抗聚集体 ：片段的比处于平衡（即~38％聚集体和~72％片段），并且这个平衡不受多元醇和盐的添加影响。如果山梨糖醇和甘露糖醇单独经由天然状态稳定作用促成阿达木单抗稳定性，那么这应在聚集体份额的改变中反映。因为不是这种情况，所以必须存在通过山梨糖醇/甘露糖醇的阿达木单抗稳定作用的进一步机制，从而导致片段化过程的阻碍。

表13：在 40 ℃在贮存 12 周后赋形剂添加对阿达木单抗稳定性的影响（数据经由 SE-HPLC 获得）

总之，50 mg/mL浓度的阿达木单抗通过将甘露糖醇或山梨糖醇添加到制剂得到有效稳定。除通过天然状态保护促成蛋白质稳定性外，甘露糖醇和山梨糖醇经由进一步机制稳定蛋白质，从而减少在长期贮存过程中的片段化。

通过赋形剂：盐的稳定作用

NaCl是在蛋白质肠胃外的制剂中使用最多的盐。然而，上文结果显示在50 mg/mL的阿达木单抗浓度，NaCl在多元醇的存在下阻碍阿达木单抗稳定性，并且作为唯一赋形剂不增加蛋白质稳定性。当考虑盐的潜在稳定作用时，依照Hoffmeister感胶离子序其行为的考虑提供了粗略的经验法则。因此，研究了阴离子乙酸盐代替氯化物作为钠盐中的抗衡离子的使用。

如表14中举例说明的，个别溶液（即，50 mg/mL 山梨糖醇/ 4 mg/mL 乙酸钠，50 mg/mL 山梨糖醇/ 4 mg/mL NaCal,和50 mg / mL 山梨糖醇，无盐）揭示不同的蛋白质稳定性。含有NaCl的阿达木单抗溶液针对蛋白质稳定性进行叠加，这是因为在仅贮存4周（40℃）后，含有NaCl或乙酸钠的制剂的比较显示在乙酸钠富集批次中的单体含量比含NaCl制剂的那种大~0.25％，在12周后合计达>0.4％差异。因此，乙酸钠促成比氯化钠更多的阿达木单抗稳定性。然而，乙酸钠的添加不增加蛋白质稳定作用，因为无盐制剂具有等同的单体含量。

表14： 在含有山梨糖醇的溶液中阿达木单抗的稳定性依赖于盐添加（数字指示以 mg/mL 表示的浓度；在 40 ℃贮存）。

与2种其他制剂（具有50 mg/mL 山梨糖醇和不含4 mg/mL NaCl的盐的制剂）相比较，含乙酸盐的制剂显示出更大数目的超过1 µm的粒子（~180,000/mL与<6,000/mL比较）。

还检查了缓冲系统，从而钠和钾缓冲系统与不同浓度的山梨糖醇进行比较。如表15中举例说明的，在磷酸钾缓冲液中溶解的阿达木单抗的稳定性等于在磷酸钠缓冲液中测定的那种。在25℃执行的贮存测试的数据证明了这些发现。另外，2种缓冲系统在微粒物质污染中相等。因此，磷酸钾视为在液体蛋白质制剂中是优选的。

表15. 在使用钠和钾作为阳离子抗衡离子的磷酸盐缓冲系统中的阿达木单抗稳定性（缓冲液浓度 ~10 Mm ，数字指示以 mg/mL 表示的山梨糖醇浓度；在 40 ℃贮存）。

总之，在配制50 mg/mL的阿达木单抗溶液中应避免NaCl的添加。如果盐的存在是有利的，例如由于重量摩尔渗透压浓度 – 那么乙酸钠具有超过氯化钠的优点。类似地，基于钾的磷酸盐缓冲系统在阿达木单抗稳定性方面等于磷酸钠缓冲系统。

总之，对于约50 mg/mL的阿达木单抗溶液，5.2的溶液pH和0.1％Tween 80的添加比其他替代方案有利。在冻/融研究和（加速）贮存测试后的蛋白质稳定性和微粒物质污染用作评价标准。此外，多元醇例如甘露糖醇和山梨糖醇基本上以事实上等同的效力促成蛋白质稳定性。在天然状态蛋白质的优先积累不是唯一的稳定作用途径，这是因为蛋白质聚集和片段化得到阻碍。NaCl在多元醇的存在下阻碍蛋白质稳定性。乙酸钠的添加不会有害地阻碍蛋白质稳定性。

这些数据暗示了包含磷酸钾缓冲液，pH 5.2、0.1％Tween 80和~50 mg/mL甘露糖醇或山梨糖醇的制剂 – 旨在对于50 mg/mL的阿达木单抗浓度~300 mosM/kg的最终重量摩尔渗透压浓度值。

实施例2： 高浓度阿达木单抗制剂

下述实施例提供了用于包含抗TNFα抗体阿达木单抗的许多高浓度蛋白质制剂的成分。令人惊讶的是，下文描述的制剂具有许多有利性质，尽管抗体的高浓度，即约100 mg/mL。

制剂（称为F1 - F6）的许多特征相对于商业50 mg/mL阿达木单抗制剂（F7）进行研究，包括浊度。溶液的浊度通过未稀释溶液的分析进行测定。浊度报道为NTU值（比浊法浊度单位）。

可见粒子污染通过如German Drug Codex中所述的目视检查进行测定。亚可见粒子根据USP通过光阻法进行监控。稀释的溶液的动态光散射分析用于评估流体动力学直径（报道为通过粒子大小分布的DLS测量的强度自相关函数和多分散性指数PDI的累积量分析计算的平均值或Z平均大小）。

制剂的物理化学稳定性通过SEC进行评估，所述SEC允许检测片段和聚集体。为了监控化学稳定性，使用SE-HPLC（片段和水解样品的检测）和CEX-HPLC（阳离子交换HPLC）。CEX-HPLC分辨在贮存过程中可能已形成的不同赖氨酸同种型和降解产物（例如脱酰胺和氧化的种类）。

测试的制剂作为F1-F6（表16）提及，在从pH 5.2到pH 6.0的不同基质中含有100 mg/mL阿达木单抗，用不同多元醇且连同或不同连同氯化钠配制。

表16. 阿达木单抗制剂 F1-F7 的组分。

进一步研究上文100 mg/mL制剂（F1-F7），以表征总体稳定性和粘度，如下文实施例3-6中所述。

下述是如何制备高浓度阿达木单抗制剂的描述，特别是就示例性溶液F2和F6而言。起始溶液是在液体缓冲液中，例如在起因于先前制备过程步骤的缓冲液中，低浓度（低于本发明的高浓度）的纯化的抗体溶液。在这种情况下，阿达木单抗溶液在等同于F7不含表面活性剂在pH 5.2的缓冲系统中以约70 mg/mL的浓度提供。起始溶液随后通过超滤浓缩且渗滤，优选在切向流过滤系统中，其中使用例如具有10 kD截断的能够定量保留抗体的膜。

作为例子，代表性制剂F2和F6通过使用不含表面活性剂的相应基质作为渗滤缓冲液将浓缩物稀释至约50 mg/L进行制备。使用切向流过滤系统进行连续缓冲液更换。渗滤一般以恒定保留物体积执行，用至少5体积或优选8体积的渗滤缓冲液。在最后一个步骤中，渗滤的溶液进一步浓缩至高浓度，例如高于或等于150 mg/mL。最终的混浊保留物随后通过用渗滤缓冲液冲洗管从超滤系统中回收。在添加分别量的聚山梨醇酯80且使用渗滤缓冲液调整至靶蛋白质浓度后，获得高浓度液体制剂，这是透明至轻微乳光的。在通过0.22 µm滤器过滤后，如果贮存于约2-8℃，那么溶液稳定至少约12个月。

实施例3： 高浓度阿达木单抗制剂针对冻 / 融应力的稳定性

为了证实阿达木单抗制剂在100 mg/mL蛋白质浓度是稳定的，执行冻/融应力（冷冻在-80℃执行，融化在25℃执行）实验。

对粒子形成灵敏的一批分析法用于检测潜在物理不稳定性。浊度测量为在胶体或可见范围中粒子聚集体发展的指示物。即使在4个冻/融循环后，浊度（报道为NTU值）也不显著改变（图3）。更高pH的溶液增加的浊度可以归因于增加的蛋白质-蛋白质相互作用，由于在接近蛋白质pI（阿达木单抗8.5）的pH降低的电荷排斥（Wang 等人（2007）J Pharm Sci 96（1）2457–2468）。

动态光散射用作用于测定亚微米范围中的粒子大小的方法。在大小分布测定过程中获得的多分散性指数值用作在胶体或微米大小范围中的聚集体的另一个灵敏指示物。类似于浊度数据，测试的试剂无一显示物理不稳定性的任何征兆（图4）。

此外，评价了尺寸排阻数据。图5描述聚集体水平。未检测到与反复冻/融应力有关的物理化学不稳定性的征兆。

众所周知冻/融加工可以导致相当大蛋白质变性和聚集，从而导致可溶性和不溶性聚集体形成（Parborji 等人（1994）Pharm Res 11（5）764-771）。对本文呈现的所有制剂实施反复冻融加工，并且结果证实制剂无一对反复冻/融循环（-80℃/25℃）敏感。所有制剂不依赖于其pH是类似稳定的（在所有情况下，与起始值相比较不存在显著改变），尽管更接近于阿达木单抗pI（即8.5）的制剂的更高pH。

来自比较不同缓冲溶液的分开研究的数据证实了这些结果。就在冻融后均质溶液（即具有pH、重量摩尔渗透压浓度、密度中的最小梯度的溶液）和在冻融过程中的最小pH变化而言最有利的缓冲系统证明是不添加NaCl的缓冲液组成（参见实施例1）。在pH 6配制的无NaCl缓冲系统证明具有评价的所有pH水平的最小pH变化。

实施例4： 含有不同多元醇作为等渗剂（ Isotonizer ）的 100 mg/mL 制剂的稳定性

对于一般地稳定性，示差扫描量热法（DSC）用于测试所有100 mg/mL阿达木单抗制剂。使用VP Capillary DSC形式Microcal获得DSC数据。所有实验用1个加热运行执行，其中使用下述标准化程序：温度范围：20℃ - 90℃，加热速率：1 K/分钟，蛋白质浓度1 mg/mL）。

更高的Tm值一般指示增加的构象稳定性（Singh 等人（2003）AAPS PharmSciTech 4（3）article 42）。图6提供了关于100 mg/mL阿达木单抗制剂的Tm值。这些数据显示所有制剂都达到高Tm值。然而，不含氯化钠的制剂（F2、F3、F5、F6）显示显著增加的Tm值，从而指示这些制剂的坚固性。因为制剂以1 mg/mL测试，所以F1的Tm数据与F7的Tm相同，从而证实不含氯化钠或在pH 6.0的100 mg/mL制剂超过F7制剂改善的稳定性。

使用磁搅拌棒的搅拌应力模型用于检测新阿达木单抗制剂的物理化学不稳定性。这个众所周知的模型通过对阿达木单抗实施长期空气-液体界面暴露以及搅拌相关的空化来诱导应力，这导致可溶性和不溶性蛋白质聚集体以可预测方式的形成。

一般地，在其各自pI（阿达木单抗pI 8.5，低净电荷，使静电排斥力降到最低）范围中的pH值配制的蛋白质对空气-液体界面相关的聚集更易感，这是由于减少的排斥力。另外，离子赋形剂例如氯化钠在蛋白质聚集中起作用，这是由于其离子屏蔽性质。疏水吸引力由于氯化钠的存在可以减少，从而减少蛋白质-蛋白质相互作用且增加胶体稳定性（Shire 等人（2004）J Pharm Sci，93（6）1390–1402）。

评价浊度数据以检测通过搅拌应力诱导的聚集体形成。表17描述了与制剂组成和搅拌时间有关的比浊法值。关于F1 – F3（在5.2的较低pH配制的）的起始浊度值证实了含氯化钠（F1）和不含NaCl（F2，F3）的溶液之间的差异。相比之下，调整至6.0的更高pH（F4-F6）的溶液特征在于更高的浊度。本领域已知NaCl可以减少mAb溶液在机械应力例如搅拌后的透明度（例如Fesinmeyer 等人（2009）Pharm Res，26（4）903-913）。

表17：制剂 F1-F6 的浊度（ NTU ）与搅拌时间比较。

最高达48小时的搅拌在所有测试的制剂中诱导增加的浊度值。在更低pH的不含NaCl的制剂最不倾向于通过搅拌的浊度增加。令人惊讶的是，与更低浓度（50 mg/mL）的阿达木单抗制剂相比较，测试的所有测试的100 mg/mL制剂在搅拌后显示出显著减少的浊度。（表18）。

一般地，AN乳光外观是Rayleigh散射的简单后果且与蛋白质浓度线性相关。然而，乳光外观不导致物理不稳定性（Sukumar 等人（2004）Pharm Res 21（7）1087-1093）。50 mg/mL阿达木单抗制剂显示在24小时搅拌后63-130 NTU的浊度和在48小时后的109-243 NTU，而阿达木单抗的100 mg/mL制剂导致范围在27-63（24小时）和40-87（48小时）之间的值。根据Treuheit 等人（（2002）Pharm Res 19（4）511-516），增加的蛋白质浓度在低于10 mg/mL的范围中的OPC-Fc溶液中减少空气-液体界面诱导的聚集。类似结果已由Kiese 等人（（2008）J Pharm Sci 97（10）4347 - 4366）报道。出乎意料地，新阿达木单抗制剂特征在于在100 mg/mL高得多的蛋白质浓度范围中增加的搅拌应力稳定性。

因此，与50 mg/mL制剂相比较，新制剂具有增加的稳定性。

表18：来自使用 50 mg/mL 阿达木单抗制剂（ F7 ）的不同批次进行的搅拌应力实验的数据。

另外，尺寸排阻层析数据揭示所有100 mg/mL制剂在搅拌48小时后具有聚集体水平< 1％，从而支持新制剂的稳定性的主张（图7）。更低pH和氯化钠的不存在再次是有利的。这个数据证实了令人惊讶的发现：尽管接近阿达木单抗pI的pH值，新制剂也是稳定的，并且尽管在更高pH的低净电荷一般被认为增加不稳定性，但NaCl的不存在也是有利的。

实施例5：含和不含氯化钠、 pH 5.2 和 6.0 、 2 种不同多元醇的 100 mg/mL 阿达木单抗制剂的长期稳定性

对新100 mg/mL阿达木单抗制剂实施长期贮存，以证实与50 mg/mL标准制剂相比较的优良稳定性。评价了在5℃（对于商业产物推荐的贮存温度）在12个月期间的稳定性数据。数据事实上暗示新制剂未显示减少的稳定性（表19）。

关于SEC和IEX，未出现单体含量或可测量降解中的显著损失。

此外，尽管新阿达木单抗制剂的更高蛋白质浓度，但与50 mg/ mL市场销售的阿达木单抗制剂的12 M数据相比较，获得了在亚可见范围中的粒子污染方面的显著增强。关于亚可见微粒污染（指示聚集、沉淀和一般物理不稳定性现象）的测试揭示新阿达木单抗制剂保持实际上不含亚可见粒子。最大28（>= 10）和最大3（>= 25）的起始粒子显著低于关于50 mg/mL制剂F7的（分别为703和38）。

另外，粒子水平在12个月稳定性测试自始至终不显著改变，并且保持在比F7显著更低的水平。

在测试的所有贮存条件下，就其物理化学稳定性而言药物产品分批事实上是等价的。这是令人惊讶的，因为充分公认例如物理稳定性在更高蛋白质浓度趋于降低（Wang W.（1999）Int J Pharm 185:129-188）。

表19：F1-F7 （ T0 / 12 M ）的稳定性研究的分析数据的比较。

为了证实新100 mg/mL制剂增加的贮存稳定性的结果，对2个代表性制剂F2和F6实施加速稳定性测试（在5℃、25℃、40℃3个月），并且与市场销售的50 mg/mL制剂（来自登记运行的代表性分批）进行比较。这些实验的结果概括于图8 -13中。

来自这些分批的浊度数据证实在100 mg/mL尤其是在5.2的较低pH，不含NaCl制剂的优良性能。增加溶液中的蛋白质浓度一般已知增加乳光，且从而增加浊度读数，这是由于Rayleigh散射（Sukumar 等人（2004）Pharm Res 21（7）1087-1093）。令人惊讶的是，不含氯化钠的新制剂揭示在50 mg/mL制剂的相同pH相似的浊度水平（图8）。

图9-11提供了新制剂的微粒形成（可见和亚可见粒子）的详细数据。证实了增加的稳定性令人惊讶的发现。事实上，即使在升高的温度的3个月贮存后，也可能减少亚可见和可见粒子得分。

图12-13中提供的数据进一步证实了100 mg/mL制剂的稳定性，这是因为它未揭示关于SEC分析和使用IEX测试的化学稳定性的任何稳定性问题。

实施例6： 与 50 mg/mL 阿达木单抗制剂相比较， 100 mg/mL 阿达木单抗制剂增加的可制造性

这个实施例概括了与目前市场销售的50 mg/mL产品相比较，与新100 mg/mL阿达木单抗制剂（代表性制剂F2和F6）改善的过程稳定性有关的数据。

通过泵送、过滤、混合、灌装封装过程、运输或摇动产生的机械应力可能引起变性和连续地聚集，这是由于蛋白质暴露于空气-水界面、材料表面和剪切力（Mahler等人（2005）Eur J Pharm Biopharm 59:407-417；Shire 等人（2004）J Pharm Sci，93（6）1390–1402）。

粘度值最初作为表征蛋白质溶液的加工性能的基本参数进行测定。表20提供了对于F1-F7制剂获得的粘度数据。与50 mg/mL制剂（F7）相比较，增加的蛋白质浓度导致增加的粘度。

静电屏蔽试剂NaCl的去除预期增加疏水蛋白质相互作用，尤其是在接近阿达木单抗pI的pH值，从而增加粘度。这个作用报道在NaCl浓度< 200 mM时是最显著的（Shire 等人（2004）J Pharm Sci，93（6）1390–1402）。

然而，出乎意料地，NaCl（F1含有~ 105 mM NaCl）从制剂中去除导致约3.1 – 3.3 mPas*s的仍然相对低的粘度值（F2、F3、F5和F6）。这对于在6.0的更高pH值的溶液（F5和F6）是尤其令人惊讶的。

总之，所有制剂的特征在于对于液体灌装封装的制备操作最佳的范围中的粘度。

表20： F1-F7 在 25 ℃的粘度比较。

在模拟通过在无菌制备加工过程中的无菌过滤诱导的应力的实验室模型中，含有100 mg/mL阿达木单抗的2个代表性新制剂提供了分析数据，显示所有制剂针对过滤相关剪切应力是稳定的。DLS数据未显示更高分子量聚集体发展的任何征兆，这是因为多分散性指数，关于低水平的更高分子量亚群的灵敏指示物未显著增加。DLS测量特别用于检测在大小分布中低量的更高分子量种类，例如聚集体，这是因为那些种类具有更高散射强度（与d6成比例），并且从而将显著影响作为ZAve大小分布指示物的ZAve和多分散性指数。另外，SEC数据证实通过过滤未诱导聚集。

令人惊讶的是，即使100 mg/mL制剂也未揭示任何不稳定性。即使在作为最坏情况方案的多次无菌过滤后，加工性能也维持在高水平，尽管增加的蛋白质含量。

表21：在针对无菌过滤应力的稳定性方面比较 F2 、 F6 和 F7 的 DLS 和 SEC 数据

为了进一步证实新阿达木单抗制剂针对过程相关应力的高稳定性，制剂在搅拌应力模型中进行测试，其中比较其针对磁搅拌棒的不同搅拌速度的性能（搅拌应力在配合加工步骤中的生产条件下发生）。

搅拌应力抗性的比较揭示在100 mg/mL蛋白质浓度在浊度中无增加（图14）。不含氯化钠和增加的多元醇含量的2个代表性100 mg/mL制剂在所有测试的搅拌速度在pH 5.2表现类似于商业制剂。在更高搅拌速度下，所有制剂显示在搅拌24小时后略微增加的浊度值，然而，未检测到在100 mg/mL对由于剪切应力的不稳定性显著增加的易感性。

如通过DLS测量获得的流体动力学直径改变的比较导致相似数据。2个100 mg/mL制剂表现类似于50 mg/mL制剂，即使具有更高蛋白质浓度的制剂被认为对搅拌应力更敏感。令人惊讶的是，具有最高pH的制剂F2揭示在浊度和流体动力学直径分析中的最低相对增加（图15）。

即使在更高蛋白质浓度的相似过程稳定性的这个令人惊讶的发现通过模拟通过泵送过程诱导的应力的机械应力模型进一步证实。制备过程的这个最后一个步骤包含通过蠕动泵送的剪切应力，从而增加溶液不稳定性的危险。再次，使用浊度（图16）和DLS（图17，表22）获得的数据证实新100 mg/mL制剂未经历粒子发展反应，并且保持与50 mg/mL制剂相似地稳定。不可检测到对泵应力诱导的聚集体形成的易感性。这个发现另外通过SEC数据加以证实，这未揭示测试的制剂与泵循环有关的任何差异（图 18）。

表22：在几个泵循环前和后比较 F2 、 F6 和 F7 稳定性的 DLS 数据（ PDI ）

使用多种填充设备（旋转活塞和蠕动泵），评价在100 mg/mL制剂的稳定性中的差异。

这个研究显示在活塞泵中生成的更高剪切应力导致增加的可见粒子计数，尤其是对于在更高pH含有氯化钠的制剂（F1和F4）。类似结果近期已由Bausch，Ursula J.（Impact of filling processes on protein solutions. 2008，PhD Thesis，University of Basel，Faculty of Science；http://edoc.unibas.ch/845/1/DissB_8427.pdf）报道，但仅在10 mg/mL的利妥希玛溶液的蛋白质浓度。令人惊讶的是，具有100 mg/mL阿达木单抗的氯化钠制剂显示在使用活塞泵的高剪切条件下改善的加工性能。

图19-22提供了证实含NaCl的阿达木单抗溶液对增加的加工应力条件增加的敏感性的粒子计数和浊度数据：根据DAC视觉得分法粒子大小范围>= 10µm 及>= 25 µm的测定是关于肠胃外药物的基本品质属性。因此，在不含NaCl的制剂中在亚可见粒子中的减少提供了显著的制剂改善。

如图 19中所述，蠕动填充不导致在填充（T0）后和在贮存后直接地可见粒子生成。相比之下，活塞填充导致对于在pH 6.0配制的溶液，即使在T0也显著的粒子计数（图 20）。最高值在含有氯化钠的F4中测量，而F5-F6导致显著更低的得分，从而证实不含氯化钠的制剂针对过程应力改善的稳定性。

支持结果通过浊度测量获得（图21-22）。使用活塞泵填充的溶液的起始值高于使用蠕动填充过程填充的那些。不含氯化钠的制剂导致比含有氯化钠的那些降低的浊度。此外，通过活塞填充的剪切应力允许在浊度方面区分F4（含氯化钠）与F5和F6（不含氯化钠）。

实施例7：在不含氯化钠的制剂中不同多元醇浓度的比较

含有100 mg/mL阿达木单抗的下述不含氯化钠的制剂对于在5℃短期稳定性的多元醇浓度的影响进行测试。

制剂调整至pH 6.0以代表在聚集和粒子形成趋势方面的差条件。

表23：实施例 6 中测试的制剂的概观。

甘露糖醇或山梨糖醇以42 mg/mL的浓度使用，以满足不含氯化钠的溶液的张力需求。数据显示与先前使用的12 mg/mL浓度相比较，2种多元醇不仅促成溶液的重量摩尔渗透压浓度，还另外对蛋白质稳定性具有显著影响。

稳定性数据暗示对于更高多元醇浓度改善的透明度，不依赖于多元醇的类型。在一般评定为非最佳的条件下（例如接近于阿达木单抗pI的pH 6.0），具有更高多元醇浓度的制剂显示即使在5℃4周的短贮存后改善的透明度。这用几种分析法观察到。

图 23揭示测试的制剂的透明度通过增加多元醇浓度显著减少，且在测试的时间段期间可以保持在较低水平。另外，在5℃4周后，观察到聚集的略微减少，从而导致在更高多元醇浓度的更高单体含量（图24和25）。在更高多元醇浓度在>= 10µm的范围中的亚可见粒子减少（例如在T0）。

实施例8：人抗 TNF- α抗体的稳定高蛋白质浓度制剂

在加速稳定性测试条件和在推荐的贮存温度条件的长期贮存下，各种阿达木单抗制剂就维持阿达木单抗物理和化学稳定性的适合性进行测试（参见下表1）。制剂在pH（pH 5.2与pH 6比较）、赋形剂条件（例如甘露糖醇或山梨糖醇浓度）、盐/离子强度条件（例如NaCl的浓度）和蛋白质浓度（50 mg/mL与100 mg/mL比较）中不同。

表24：在下述实施例中提及的制剂的概观（所有浓度指 mg/mL ）。

表2提供了应力温度和样品获得点（pull point）的概观。制剂F2和F6鉴定为分别维持阿达木单抗的物理和化学稳定性至少18个月和12个月的制剂。制剂赋形剂NaCl由甘露糖醇（制剂F2）和山梨糖醇（制剂F6）的更换赋予高稳定作用潜力，尽管蛋白质浓度中的100％增加（从制剂F7中的50 mg/mL到制剂F2和F6中的100 mg/mL）。令人惊讶的是，在2种制剂中的物理稳定性分别维持至少12个月和18个月。即使在12个月贮存后，2种制剂也含有超过99％单体（SEC数据），并且聚集体水平低于1％。

相似地，经常是蛋白质药物产品中的保存期限限制因素的化学稳定性在稳定性监控自始至终得到维持，这是因为指示赖氨酸变体总和（L0+L1+L2）的稳定性超过80％。

本领域公认为适合于监控蛋白质制剂的物理和/或化学稳定性的另外测试证实了制剂F2和F6的稳定作用潜力，例如亚可见粒子测试、浊度测量、目视检查、透明度或颜色监控。

重要地，功效指示抗TNF中和测试显示2种制剂在完全样品获得时间表自始至终维持阿达木单抗的功效，并且数据在75 - 125％的高品质水平范围内。

表25：对于各个月在各种温度 F2 和 F6 制剂获得的稳定性数据

表26：制剂 F2 和制剂 F6 所选择的稳定性测试数据–长期，最高达 9 个月。

表27：制剂 F2 和制剂 F6 所选择的稳定性测试数据–长期，最高达 18 个月。

实施例9：高浓度阿达木单抗的疼痛研究

接受通过皮下注射的单克隆抗体治疗的患者可能经历在注射部位的疼痛或不适（参见例如，Fransson，J.；Espander-Jansson，A.（1996）Journal of Pharmacy and Pharmacology 48（10），1012-1015；Parham，S. M.；Pasieka，J. L.（1996）Can. J. Surg. 39，31-35；Moriel E Z；Rajfer J （1993）The Journal of urology 149（5 Pt 2）， 1299-300）。模拟患者经历的动物模型用于评估疼痛和可容许性效应且评估在人使用前的可能制剂修饰。可获得的动物模型就其用于区分蛋白质制剂的特征的适合性进行评估。测量包括对注射的发声（vocalization），缩爪（在注射后0-10分钟），机械异常性疼痛的测试，和热痛觉过敏（注射后30分钟）。动物还就感受伤害行为进行观察，例如舔或摇动受累爪，以及在注射部位的发红或肿胀。

选择收缩模型以评估注射部位疼痛，并且用于评价制剂组成对可容许性和痛觉的影响。

各种阿达木单抗100 mg/mL制剂的可容许性与制剂F7（50 mg/mL阿达木单抗制剂）进行比较。生成的数据支持与50 mg/mL制剂（F7）相比较，在皮下注射后在注射部位100 mg/mL制剂改善的可容许性的令人惊讶的发现。

新100 mg/mL制剂进行最佳化以减少皮下注射相关副作用例如在注射部位的疼痛。注射部位疼痛包含与针刺相关的疼痛和与溶液输注到SubQ储库内相关的感觉。然而，在文献中可获得的数据暗示某些针设计可以有利于减少注射部位不适，但无法获得关于制剂贡献的明确数据（参见例如，Chan，G.C.F.，等人（2003）American Journal of Hematology 76（4）:398 - 404）。

我们使用大鼠疼痛模型的数据暗示与目前市场销售的Humira®制剂相比较，新100 mg/mL制剂在相似治疗剂量的皮下注射后减少注射部位疼痛中是有效的。这通过新100 mg/mL制剂减少的注射体积来达到，从而显示最佳化患者治疗且增加患者顺应性的高度有价值的利益。

同时，我们观察到在对于配制100 mg/mL制剂可接受的范围中的制剂pH不影响注射部位疼痛。有趣的是，进一步来自生理学pH范围的更低pH值可以以相似可容许性施用。

对于可容许性测试应用的方法：

缩爪和防伤害的（ nocifensive ）行为测定

成年、雄性Sprague Dawley大鼠在测试溶液足底内（s.c.）注射到右后爪内之前适应测试条件20-30分钟。记录缩爪数目并且对于注射后的前10分钟定量在防伤害的行为（爪保护或舔爪）中花费的时间。所有测试溶液以150 μL的总体积注射，除非另有说明。实验进行编码且以不知情的(blinded)、随机化方式运行。盐水和辣椒素（2.5 μg）分别用作阴性和阳性对照。

体积效应

注射体积对缩爪应答的作用在安慰剂和测试制剂F7中进行测试。为了测定应答是否可以通过减少物理体积得到改善，测试不同注射体积（足底内10µl、50µl和150µl）对退缩后果的作用。

测试数据允许体积效应的下述概括：与盐水（4 ± 2）相比较，退缩在安慰剂（32 ± 12）和F7中在150µl时明显增加，但在更小体积时与盐水不可区分。虽然150µl的更高注射体积一致地产生更高的退缩应答，但更低体积（10µL和50µL）导致明显更低的应答。

这个后果暗示减少注射液（injectate）的体积是更少刺激的，从而暗示与更低浓度制剂例如F7相比较，高浓度制剂例如F2和F6，就可容许性和痛觉而言是有利的。

• 对于安慰剂注射在注射后0-10分钟的缩爪数目：

•

• 对于主动注射（测试制剂7）在注射后0-10分钟的缩爪数目：

实施例10： 包含阿达木单抗的溶液对可容许性 / 疼痛的 pH 作用

用包含阿达木单抗的活性溶液执行另外的实验。测试的制剂是F2（在pH 5.2）、F5和F7，在更接近于生理学条件的pH值的相应制剂。

如使用缩爪应答和在防伤害的行为中花费的时间测量的，数据暗示pH看起来对动物应答没有作用。阳性和阴性对照数据在预期范围内。在文献中充分证明更低制剂pH（即酸性）可以增加在肠胃外施用时不可容许性和痛觉的危险，尤其是对于皮下注射。因此，令人惊讶的是对于F2和F5阿达木单抗制剂，制剂pH不影响可容许性和/或痛觉。这是高度有利的，因为这允许其他参数，例如制剂pH、物理稳定性和聚集体水平（与免疫原性危险潜在相关），就制剂决定做出而言的高优先级。

• 在防伤害的行为中花费的时间 [秒] 数据：

• 在注射后0-10分钟的缩爪数目：

•

Tukey 95％联立置信区间

实施例11：不含阿达木单抗的溶液的制剂 pH 作用的影响

为了测试制剂组成的影响（例如缓冲液例如磷酸盐、赋形剂例如甘露糖醇或表面活性剂例如聚山梨醇酯80的影响），进行另外的实验，其中用不含蛋白质的制剂获得相似数据。安慰剂溶液的pH在约5 – 7的范围中改变，并且令人惊讶地看起来不具有改善疼痛的作用，这是因为对于具有不同pH的制剂记录的收缩应答是相似的。如较早解释的，这在生物制品药物产品制剂开发中是高度有利的，因为这允许配方设计师（formulator）给其他参数就制剂决定做出而言的高优先级，所述其他参数例如制剂pH、物理稳定性和聚集体水平（与免疫原性危险潜在相关）。

对于安慰剂注射在注射后0-10分钟的缩爪数目：

总之，上文呈现的数据明确证实100 mg/mL阿达木单抗制剂的优点，因为这些高蛋白质浓度、粘性溶液可以以更低体积跨越一系列pHs施用而不减少可容许性和/或增加痛觉。

引入作为参考

本申请自始至终可能引用的所有引用的参考文献（包括例如文献参考、专利、专利申请和网站）的内容为了任何目的在此特别整体引入作为参考。除非另有说明，本发明的实践将采用蛋白质制剂的常规技术，这是本领域众所周知的。

等同方案

本发明可以以不背离其精神或基本特征的其他具体形式体现。前述实施方案因此在所有方面视为本文描述的本发明的举例说明而不是限制。本发明的范围因此由附加权利要求而不是前述说明书指出，并且在权利要求等同的含义和范围内的所有改变因此预期在本文中包含。

序列表

<110> Abbott Biotechnology Ltd.

<120> 人抗TNF-α抗体的稳定高蛋白质浓度制剂

<130> 117813-90620

<140> New Application

<141> Concurrently herewith

<150> US 61/175380

<151> 2009-05-04

<160> 37

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 阿达木单抗轻链可变区

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 2

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 阿达木单抗重链可变区

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 阿达木单抗轻链可变区 CDR3

<221> VARIANT

<222> 9

<223> Xaa = Thr或Ala

<400> 3

Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Xaa

1 5

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 阿达木单抗重链可变区 CDR3

<221> VARIANT

<222> 12

<223> Xaa = Tyr或Asn

<400> 4

Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Xaa

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 阿达木单抗轻链可变区 CDR2

<400> 5

Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser

1 5

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 阿达木单抗重链可变区 CDR2

<400> 6

Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Glu

1 5 10 15

Gly

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 阿达木单抗轻链可变区 CDR1

<400> 7

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 阿达木单抗重链可变区 CDR1

<400> 8

Asp Tyr Ala Met His

1 5

<210> 9

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2SD4轻链可变区

<400> 9

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ile Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr

85 90 95

Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 10

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2SD4重链可变区

<400> 10

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Ala Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ala Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Lys Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Asn Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2SD4轻链可变区CDR3

<400> 11

Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Ala

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> EP B12 轻链可变区CDR3

<400> 12

Gln Lys Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Ala

1 5

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL10E4轻链可变区CDR3

<400> 13

Gln Lys Tyr Gln Arg Ala Pro Tyr Thr

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL100A9轻链可变区CDR3

<400> 14

Gln Lys Tyr Ser Ser Ala Pro Tyr Thr

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VLL100D2轻链可变区CDR3

<400> 15

Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Thr

1 5

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VLL0F4轻链可变区CDR3

<400> 16

Gln Lys Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr

1 5

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LOE5轻链可变区CDR3

<400> 17

Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Tyr

1 5

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VLLOG7轻链可变区CDR3

<400> 18

Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Asn

1 5

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VLLOG9轻链可变区CDR3

<400> 19

Gln Lys Tyr Thr Ser Ala Pro Tyr Thr

1 5

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VLLOH1轻链可变区CDR3

<400> 20

Gln Lys Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Asn

1 5

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VLLOH10轻链可变区CDR3

<400> 21

Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Ala Tyr Ser

1 5

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL1B7轻链可变区CDR3

<400> 22

Gln Gln Tyr Asn Ser Ala Pro Asp Thr

1 5

<210> 23

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL1C1轻链可变区CDR3

<400> 23

Gln Lys Tyr Asn Ser Asp Pro Tyr Thr

1 5

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL0.1F4轻链可变区CDR3

<400> 24

Gln Lys Tyr Ile Ser Ala Pro Tyr Thr

1 5

<210> 25

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL0.1H8轻链可变区CDR3

<400> 25

Gln Lys Tyr Asn Arg Pro Pro Tyr Thr

1 5

<210> 26

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LOE7.A轻链可变区CDR3

<400> 26

Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Ala

1 5

<210> 27

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2SD4重链可变区CDR3

<400> 27

Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Asn

1 5 10

<210> 28

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH1B11重链可变区CDR3

<400> 28

Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Lys

1 5 10

<210> 29

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH1D8重链可变区CDR3

<400> 29

Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 30

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH1A11重链可变区CDR3

<400> 30

Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Asp

1 5 10

<210> 31

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH1B12重链可变区CDR3

<400> 31

Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Phe Ser Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 32

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH1E4重链可变区CDR3

<400> 32

Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu His Tyr

1 5 10

<210> 33

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH1F6重链可变区CDR3

<400> 33

Ala Ser Phe Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Glu Tyr

1 5 10

<210> 34

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3C-H2重链可变区CDR3

<400> 34

Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Glu Tyr

1 5 10

<210> 35

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH1-D2.N重链可变区CDR3

<400> 35

Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Asn

1 5 10

<210> 36

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 阿达木单抗轻链可变区

<400> 36

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtagggga cagagtcacc 60

atcacttgtc gggcaagtca gggcatcaga aattacttag cctggtatca gcaaaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccactt tgcaatcagg ggtcccatct 180

cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctacagcct 240

gaagatgttg caacttatta ctgtcaaagg tataaccgtg caccgtatac ttttggccag 300

gggaccaagg tggaaatcaa a 321

<210> 37

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 阿达木单抗重链可变区

<400> 37

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ccggcaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcgg cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120

ccagggaagg gcctggaatg ggtctcagct atcacttgga atagtggtca catagactat 180

gcggactctg tggagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag agctgaggat acggccgtat attactgtgc gaaagtctcg 300

taccttagca ccgcgtcctc ccttgactat tggggccaag gtaccctggt caccgtctcg 360

agt 363

Claims (39)

1.一种液体药物制剂，其具有5.0 – 6.4的pH，包含35-55 mg/ml多元醇、表面活性剂、柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液、和100-200 mg/mL人抗TNF-α抗体或其抗原结合部分，包含轻链和重链，所述轻链包括包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的CDR1结构域，且所述重链包括包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的CDR1结构域，其中所述制剂不含有赋形剂NaCl。

2.权利要求1的制剂，其中所述制剂包含35-50 mg/ml多元醇。

3.权利要求1的制剂，其中所述制剂包含40-50 mg/ml多元醇。

4.权利要求1的制剂，其中所述制剂包含40-45 mg/ml多元醇。

5.权利要求1的制剂，其中所述多元醇是糖醇。

6.权利要求5的制剂，其中所述糖醇是甘露糖醇或山梨糖醇。

7.权利要求1的制剂，其中所述人抗体是人IgG1κ抗体。

8.权利要求1的制剂，其中所述人抗体的轻链包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，并且所述人抗体的重链包括包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

9.权利要求1的制剂，其中所述抗体是阿达木单抗。

10.一种液体药物制剂，其具有5.0 – 6.4的pH，并且包含100-200 mg/mL人抗TNF-α抗体或其抗原结合部分，包含轻链和重链，所述轻链包括包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的CDR1结构域，且所述重链包括包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的CDR1结构域，35-55 mg/ml多元醇、表面活性剂、及柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液，其中所述制剂不含有NaCl，并且在标准24小时搅拌应力测定后具有20-60 NTU的浊度。

11.一种液体药物制剂，其具有5.0 – 6.4的pH，并且包含100-200 mg/mL人抗TNF-α抗体或其抗原结合部分，包含轻链和重链，所述轻链包括包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的CDR1结构域，且所述重链包括包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的CDR1结构域，35-55 mg/ml多元醇、表面活性剂、及柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液，其中所述制剂不含有NaCl，并且在标准48小时搅拌应力测定后具有35-100 NTU的浊度。

12.一种液体药物制剂，其具有5.0 – 6.4的pH，并且包含100-200 mg/mL人抗TNF-α抗体或其抗原结合部分，包含轻链和重链，所述轻链包括包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的CDR1结构域，且所述重链包括包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的CDR1结构域，35-55 mg/ml多元醇、表面活性剂、及柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液，其中所述制剂不含有NaCl，并且在5℃、25℃或40℃3个月贮存后具有20-40 NTU的浊度。

13.权利要求10-12任一项的制剂，其进一步包含35-50 mg/ml多元醇。

14.权利要求10-12任一项的制剂，其进一步包含40-50 mg/ml多元醇。

15.权利要求10-12任一项的制剂，其进一步包含40-45 mg/ml多元醇。

16.权利要求10-12任一项的制剂，其中所述多元醇是糖醇。

17.权利要求16的制剂，其中所述糖醇是甘露糖醇或山梨糖醇。

18.权利要求10-12任一项的制剂，其中所述pH是5.0 -5.4或5.8-6.4。

19.权利要求10-12任一项的制剂，其具有小于约1％的聚集蛋白质。

20.权利要求10-12任一项的制剂，其中所述人抗体是人IgG1κ抗体。

21.权利要求10-12任一项的制剂，其中所述人抗体的轻链包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，并且所述人抗体的重链包括包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

22.权利要求10-12任一项的制剂，其中所述抗体是阿达木单抗。

23.一种液体药物制剂，其包含

100-200 mg/mL人抗TNF-α抗体或其抗原结合部分，包含轻链和重链，所述轻链包括包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的CDR1结构域，且所述重链包括包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的CDR1结构域；

35-55 mg/mL糖醇；

0.1-2.0 mg/mL表面活性剂；

1.15-1.45 mg/mL柠檬酸· H₂O；

0.2-0.4 mg/mL脱水柠檬酸钠；

1.35-1.75 mg/mL Na₂HPO₄ · 2 H₂O；

0.75-0.95 mg/mL NaH₂PO₄ · 2 H₂O，

其中所述制剂具有4.7 - 6.5的pH，并且不包含NaCl。

24.权利要求23的制剂，其中所述糖醇是甘露糖醇或山梨糖醇。

25.权利要求24的制剂，包含40-45 mg/mL甘露糖醇或山梨糖醇。

26.权利要求23的制剂，其中所述表面活性剂是聚山梨醇酯80。

27.权利要求26的制剂，包含约1 mg/mL聚山梨醇酯80。

28.权利要求23的制剂，包含1.30-1.31 mg/mL柠檬酸· H₂O。

29.权利要求23的制剂，包含0.30-0.31 mg/mL脱水柠檬酸钠。

30.权利要求23的制剂，包含1.50-1.56 mg/mL Na₂HPO₄ · 2 H₂O。

31.权利要求23的制剂，包含0.83-0.89 mg/mL NaH₂PO₄ · 2 H₂O。

32.权利要求23的制剂，其中所述pH是约5.2。

33.权利要求23的制剂，其中所述pH是约6.0。

34.权利要求23任一项的制剂，其中所述人抗体是人IgG1κ抗体。

35.权利要求23的制剂，其中所述人抗体的轻链包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，并且所述人抗体的重链包括包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

36.权利要求23的制剂，其中所述抗体是阿达木单抗。

37.权利要求1、10-12和23任一项的制剂，其适合于皮下施用。

38.权利要求1、10-12和23任一项的制剂在制备用于治疗患有与有害TNFα活性相关的病症的受试者的药物中的用途。

39.一种液体药物制剂，其具有5.0 – 6.4的pH，包含

35-55 mg/ml多元醇，

表面活性剂，

柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液，

40-125 mg/mL人抗TNF-α抗体或其抗原结合部分，

0.01-300 mM NaCl，

其中所述抗TNF-α抗体或其抗原结合部分包含轻链和重链，所述轻链包括包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的CDR3结构域，包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的CDR1结构域；且所述重链包括包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的CDR3结构域，包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的CDR1结构域。