KR20120038406A - 인간 항?ＴＮＦ?α 항체의 안정한 고 단백질 농도 제형 - Google Patents

인간 항?ＴＮＦ?α 항체의 안정한 고 단백질 농도 제형 Download PDF

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Abstract

본 발명은 NaCl을 포함하지 않고 20 mg 초과의 폴리올과 약 100 mg/mL 이상의 인간 항-TNF-α 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는, 액체 약제학적 제형을 제공한다. 본 발명은 장기간 안정성 및 피하 투여에 유리한 특성을 갖는 고농도 항체 제형을 제공한다.

Description

인간 항?ＴＮＦ?α 항체의 안정한 고 단백질 농도 제형 {STABLE HIGH PROTEIN CONCENTRATION FORMULATIONS OF HUMAN ANTI-TNF-ALPHA ANTIBODIES}
관련 출원
본원은 전체 내용이 본원에서 참조로서 도입되는 2009년 5월 4일자로 출원된 미국 가출원 제61/175,380호를 우선권으로 주장한다.
항체 등의 치료학적 단백질의 제형은 종종 당해 제형이 경제학적 및 치료학적으로 성공적이어야 하는 다수의 바람직한 특성, 예를 들면, 안정성, 투여 적합성, 농도를 제공하는 것이 과제이다. 제조, 저장 및 전달 동안, 치료학적 단백질은 물리적 및 화학적 열화를 겪는 것으로 공지되어 있다. 이들 불안정성은 단백질의 효능을 감소시키고 환자에서 부작용 발생 위험을 증가시킬 수 있고, 따라서 규정 승인에 현저하게 영향을 미칠 수 있다[참조: Wang, et al. (2007) J Pharm Sci 96:1]. 이와 같이, 안정한 단백질 제형은 치료학적 단백질의 성공에 필수적이다.
유효하게 하기 위해, 다수의 치료학적 단백질은 바람직하게는 고농도 제형으로 제형화되는 고용량의 투여를 필요로 한다. 고 단백질 농도 제형은 이들이 피검체에 대한 약물의 투여 방식(예: 정맥내 대 피하) 및 투여 빈도에 영향을 줄 수 있기 때문에 바람직하다.
고 단백질 농도 제형의 이점에도 불구하고, 고농도 치료학적 단백질의 제형화는 다수의 과제를 나타낸다. 예를 들면, 단백질 농도의 증가는 종종 단백질 응집, 용해도, 안정성 및 점도에 악영향을 미친다[참조: Shire, et al. (2004) J Pharm Sci 93:1390]. 고단백질 용액에 대한 매우 통상적인 과제인 점도 증가는 당해 제형의 투여에 대한 부정적인 분파, 예를 들면, 통증 감지 및 화상 증후군, 및 제조, 처리, 충전 가공시의 제한 및 약물 전달 장치 옵션 제한을 가질 수 있다[참조: Shire, et al. (2004) J Pharm Sci 93:1390]. 퉁상의 구조적 특징을 갖는 치료학적 단백질, 예를 들면, 항체의 경우에도, 현재까지 승인된 제형은 상이한 성분 또는 다양한 농도를 갖는다. 예를 들면, 항-CD20 항체 리툭산(Rituxan)은 10 mg/mL의 농도로 정맥내 투여를 위해 제형화되고, 항-RSV 항체 시나기스(Synagis)는 100 mg/mL의 농도로 근육내 투여를 위해 제형화된다. 따라서, 치료학적 목적을 위해 사용될 수 있는 고단백질 제형, 특히 항체 제형은 과제가 남아 있다. 따라서, 용량화 및 투여 이점을 제공하는 안정한 고 단백질 농도 제형이 요구되고 있다.
본 발명은, 적어도 부분적으로, 인간 항-TNF-α 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들면, 아달리무맙의 신규한 고농도 제형의 발견에 기초한다. 본 발명의 제형은 고농도 항체를 제공하는 다수의 놀라운 특성을 제공한다. 예를 들면, 본 발명의 제형은 고농도의 단백질에도 불구하고 장기간에 걸쳐 물리적 및 화학적 안정성을 유지하고, 피하 투여에 적합한 점도를 갖는다. 본 발명의 제형은, 적어도 부분적으로, 인간 항-TNF-α 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 고농도(예: 100 mg/mL)에서 가용성 상태를 유지하고 주사(예: 피하 투여)에 적합한 점도를 유지하면서 비응집 상태를 유지할 수 있다는 놀라운 발견에 기초한다. 본 발명의 제형은 또한 인간 항-TNF-α 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 가용성 상태를 유지하고 광범위한 pH 범위, 예를 들면, 약 pH 5.2 내지 약 pH 6.0에 걸쳐 비응집 상태를 유지하고 화학적으로 안정(예: 산화 또는 탈아미드화되지 않음)할 수 있다는 점에서 놀라운 것이다. 이들 유리한 특성은 안정화제로서 NaCl을 필요로 하지 않고서 당 알콜 부형제의 증가로 달성된다.
본 발명의 한 가지 양태는 40 mg 초과의 폴리올과 약 100 mg/mL 이상의 인간 항-TNF-α 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는, 액체 약제학적 제형을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 20 mg 초과의 폴리올과 약 100 mg/mL 이상의 인간 항-TNF-α 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는, 액체 약제학적 제형을 제공한다. 한 가지 양태에서, 본 발명의 제형은 NaCl을 함유하지 않는다.
본 발명은 또한 pH가 약 5.0 내지 6.4이고, 약 100 mg/mL 이상의 인간 항-TNF-α 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하며, NaCl을 함유하지 않고, 표준 24시간 교반-스트레스 분석 또는 액체로서 24개월의 장기간 저장 후의 탁도가 60 NTU 미만인, 액체 약제학적 제형을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 pH가 약 5.0 내지 6.4이고, 약 100 mg/mL 이상의 인간 항-TNF-α 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하고, NaCl을 함유하지 않고, 표준 48시간 교반-스트레스 분석 후의 탁도가 100 NTU 미만인, 액체 약제학적 제형을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 pH가 약 5.0 내지 6.4이고, 약 100 mg/mL 이상의 인간 항-TNF-α 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하며, NaCl을 함유하지 않고, 5℃, 25℃ 또는 40℃에서 3개월 저장 후의 탁도가 40 NTU 미만인, 액체 약제학적 제형을 포함한다.
본 발명은 또한 약 100 mg/mL 이상의 인간 항-TNF-α 항체 또는 이의 항원 결합 부분; 약 20 mg/mL 초과의 폴리올; 약 0.1 내지 2.0 mg/mL의 계면활성제; 약 1.15 내지 1.45 mg/mL의 시트르산＊H2O; 약 0.2 내지 0.4 mg/mL의 나트륨 시트레이트 탈수화물; 약 1.35 내지 1.75 mg/mL의 Na2HPO4＊2 H2O; 약 0.75 내지 0.95 mg/mL의 NaH2PO4＊2 H2O를 포함하고, pH가 약 4.7 내지 6.5이며, NaCl을 포함하지 않는, 액체 약제학적 제형을 제공한다.
본 발명의 제형은 피하 투여에 적합하다. 이와 같이, 본 발명은 또한 피검체에서 유해한 TNF α 활성과 관련된 장애를 치료하기 위한, 인간 TNF α 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 본 발명의 제형의 용도를 포함한다.
한 가지 양태에서, 본 발명의 제형은 소정 농도의 인간 TNF α 항체 또는 이의 항원 결합 부분 및 약 3.1 내지 3.3 mPas＊s의 점도를 갖는다.
한 가지 양태에서, 본 발명의 제형은 20 mg 초과의 폴리올을 포함한다. 본 발명의 제형에 포함될 수 있는 추가량의 폴리올은 30 mg 초과의 폴리올이다. 또는, 40 mg 초과의 폴리올이 본 발명의 제형에 사용될 수 있고, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 40 내지 45 mg 또는 약 42 mg을 포함한다.
한 가지 양태에서, 본 발명의 제형에 사용된 폴리올은 당 알콜, 예를 들면, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 만니톨 또는 솔비톨이다. 한 가지 양태에서, 당해 제형은 약 40 내지 45 mg/mL의 만니톨 또는 솔비톨을 포함한다.
당해 기술분야에 공지된 다양한 계면활성제를 본 발명의 제형에 사용할 수 있다. 한 가지 양태에서, 당해 계면활성제는 폴리솔베이트 80이다. 추가의 양태에서, 약 0.1 내지 2.0 mg/mL의 폴리솔베이트 80이 본 발명의 제형에 사용된다.
본 발명의 한 가지 양태에서, 당해 제형은 약 1.30 내지 1.31 mg/mL의 시트르산＊H2O를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 당해 제형은 약 0.30 내지 0.31 mg/mL의 나트륨 시트레이트 탈수화물을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 당해 제형은 1.50 내지 1.56 mg/mL의 Na2HPO4＊2 H2O를 포함한다.
본 발명의 추가의 양태에서, 당해 제형은 약 0.83 내지 0.89 mg/mL의 NaH2PO4＊2 H2O를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 제형의 pH는 약 4.8 내지 약 6.4이다. 예를 들면, 본 발명의 제형의 pH는 약 5.0 내지 약 5.4(예: 약 5.2)의 범위일 수 있거나, 약 5.8 내지 약 6.4(예: 약 6.0)의 범위일 수 있다.
본 발명의 제형의 이점은 통상 단백질 농도를 증가시키는 단백질 응집을 증가시키지 않고서 고농도의 항체를 제공하는 것이다. 한 가지 양태에서, 본 발명의 제형은 약 1% 미만의 응집 단백질을 갖는다.
또한, 본 발명의 일부로서 인간 항-TNF α 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 농도가 약 50 mg/mL 이상인 본원에 기재된 제형이 포함된다.
한 가지 양태에서, 인간 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 서열번호 3으로서 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 및 서열번호 4로서 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함한다.
본 발명의 한 가지 양태에서, 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나 위치 1, 4, 5, 7 또는 8에서의 단일 알라닌 치환에 의해 또는 위치 1, 3, 4, 6, 7, 8 및/또는 9에서의 1 내지 5개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호 3으로부터 변형된 경쇄 CDR3 도메인을 갖고, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 위치 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 또는 11에서의 단일 알라닌 치환에 의해 또는 위치 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 및/또는 12에서의 1 내지 5개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호 4로부터 변형된 중쇄 CDR3 도메인을 갖는다.
본 발명의 항체는 특정한 기능적 특성을 가질 수 있다. 예를 들면, 인간 항체 또는 이의 항원 결합 부분은, 표면 플라스몬 공명으로 측정하여, 1 × 10-8 M 이하의 Kd로 인간 TNFα를 해리시킬 수 있고, 1×10-3 s-1 이하의 Koff 속도 상수로 인간 TNFα를 해리시킬 수 있고/있거나, 1×10-7 M 이하의 IC50으로 표준 시험관내 L929 분석에서 인간 TNFα 세포독성을 중화시킬 수 있다.
한 가지 양태에서, 인간 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 인간 IgG1 카파 항체이다.
본 발명의 한 가지 양태에서, 인간 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 경쇄는 서열번호 5로서 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 서열번호 7로서 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 추가로 포함하고/하거나, 인간 항체의 중쇄는 서열번호 6으로서 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 서열번호 8로서 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함한다. 또 다른 양태에서, 인간 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 경쇄는 서열번호 1로서 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 인간 항체의 중쇄는 서열번호 2로서 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 또한, 본 발명에는 본원에 기재된 서열번호와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 인간 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 포함된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 인간 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 아달리무맙이다.
도 1은 0.1% 솔루톨을 함유하는 용액에서 고분자량(hmw) 단백질 시료의 존재를 나타내는 그래프이다. MALS(회색 라인)에 따르면, 응집물 몰 질량은 대략 109 g/mol 이하이고, 이는 총 단백질의 2.6%를 차지한다(UV280, 검은색 라인). 12주 동안 40℃에서 저장.
도 2a 및 2b는 40℃에서 저장 동안 나타나는 고분자량(hmw) 응집물의 초기 단계 검출을 나타내는 그래프이다. 어떠한 응집물도 UV280(검은색 곡선)을 통해 검출할 수 없었고, MALS(회색 곡선)은 hmw 시료의 존재를 명백하게 입증했다. 1주 저장(A) 대 본래의 샘플(B).
도 3은 제형 F1-F6의 탁도 대 동결/해동 사이클을 나타내는 그래프이다.
도 4는 제형 F1-F6의 다분산도 지수 대 동결/해동 사이클을 나타내는 그래프이다.
도 5는 제형 F1-F6의 SEC에 의한 응집물 수준 대 동결/해동 사이클을 나타내는 그래프이다.
도 6은 T0에서 제형 F1-F6의 DSC에 의한 Tm(℃)을 나타내는 그래프이다.
도 7은 제형 F1-F6의 SEC에 의한 응집물 수준 대 교반 시간을 나타내는 그래프이다.
도 8은 F2, F6 및 F7(3개의 대표적인 배치 01032-0134)의 3개월 저장 후의 안정성 검사로 수득한 탁도 값의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 9는 F2, F6 및 F7(3개의 대표적인 배치 01032-0134)의 3개월 저장 후의 안정성 검사로 수득한 DAC 스코어에 의한 가시 입자 값의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 10은 F2, F6 및 F7(3개의 대표적인 배치 01032-0134)의 3개월 저장 후의 안정성 검사로 수득한 서브-가시성 입자 값(≥10㎛)의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 11은 F2, F6 및 F7(3개의 대표적인 배치 01032-0134)의 3개월 저장 후의 안정성 검사로 수득한 서브-가시적 입자 값(≥25㎛)의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 12는 F2, F6 및 F7(3개의 대표적인 배치 01032-0134)의 3개월 저장 후의 안정성 검사로 수득한 잔류 단량체 함량의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 13은 F2, F6 및 F7(3개의 대표적인 배치 01032-0134)의 3개월 저장 후의 안정성 검사로 수득한 리신 변이체의 합계의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 14는 24시간 후 상이한 교반 속도에서의 교반 스트레스에 대한 안정성 측면에서 F2, F6 및 F7을 비교하는 탁도 데이터를 나타내는 그래프이다.
도 15는 24시간 후 상이한 교반 속도에서의 교반 스트레스에 대한 안정성 측면에서 F2, F6 및 F7을 비교하는 DLS 데이터(Z-평균 값)를 나타내는 그래프이다.
도 16은 수개의 펌프 사이클 전후에 스트레스에 대한 안정성 측면에서 F2, F6 및 F7을 비교하는 탁도 데이터를 나타내는 그래프이다.
도 17은 수개의 펌프 사이클 전후에 스트레스에 대한 안정성 측면에서 F2, F6 및 F7을 비교하는 DLS 데이터(Z-평균)를 나타내는 그래프이다.
도 18은 수개의 펌프 사이클 전후에 스트레스에 대한 안정성 측면에서 F2, F6 및 F7을 비교하는 SEC 데이터(응집 수준)를 나타내는 그래프이다.
도 19는 연동 펌프를 사용하여 충전한 100 mg/mL 제형의 가시적 스코어를 나타내는 그래프이다.
도 20은 피스톤 펌프를 사용하여 충전한 100 mg/mL 제형의 가시적 스코어를 나타내는 그래프이다.
도 21은 연동 펌프를 사용하여 충전한 100 mg/mL 제형의 탁도를 나타내는 그래프이다.
도 22는 피스톤 펌프를 사용하여 충전한 100 mg/mL 제형의 탁도를 나타내는 그래프이다.
도 23은 제형 F8 내지 F11에 대한 T0 및 5℃에서 4주 저장 후의 탁도를 나타내는 그래프이다.
도 24는 제형 F8 내지 F11에 대한 T0 및 5℃에서 4주 저장 후의 단량체 함량을 나타내는 그래프이다.
도 25는 제형 F8 내지 F11에 대한 F0 및 5℃에서 4주 저장 후의 응집 수준을 나타내는 그래프이다.
도 26은 제형 F8 내지 F11에 대한 T0 및 5℃에서 4주 저장 후의 서브-가시적 입자 계수를 나타내는 그래프이다.
I. 정의
본 발명을 보다 용이하게 이해할 수 있도록 하기 위해, 특정한 용어들이 먼저 정의된다. 또한, 파라미터 수치 또는 수치 범위가 인용되는 경우, 이는 인용된 값의 중간 수치 및 중간 범위도 또한 본 발명의 일부인 것으로 의도됨을 주목해야 한다.
용어 "약제학적 제형"은 활성 성분의 생물학적 활성이 명백하게는 효과적이도록 하는 형태로 존재하고 제형이 투여되는 피검체에게 현저하게 독성이 있는 추가 성분들을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
문구 "약제학적으로 허용되는 담체"는 당해 분야에서 인식되어 있고, 포유동물에게 적합한 약제학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클을 포함한다. 담체는 당해 제제를 신체의 한 기관 또는 부분으로부터 신체의 또 다른 기관 또는 부분으로 운반 또는 전송하는 것과 관련된 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질을 포함한다. 각각의 담체는 당해 제형의 다른 성분들과 혼화성이라는 측면에서 "허용"되어야 하고, 환자의 안전성을 손상시키거나 영향을 미쳐서는 안된다.
"약제학적으로 허용되는 부형제"(비히클, 첨가제)는 피검체 포유동물에게 상당하게 투여되어 사용된 활성 성분의 유효량을 제공할 수 있는 것들이다.
용어 "부형제"는 목적하는 일관성, 예를 들면, 벌크 특성의 변화, 안정성의 개선 및/또는 삼투압 조절을 제공하기 위해 제형에 첨가될 수 있는 제제를 지칭한다. 통상 사용되는 부형제의 예로는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 당, 폴리올, 아미노산, 계면활성제 및 중합체가 포함된다.
통상 사용되는 부형제는 폴리올이다. 본원에 사용된 바와 같이, "폴리올"은 다중 하이드록실 그룹을 갖는 물질이고, 당(환원 및 비환원 당), 당 알콜 및 당 산을 포함한다. 본원에서 바람직한 폴리올은 분자량이 약 600 kD 미만(예: 약 120 내지 약 400 kD 범위)이다. 폴리올의 비제한적 예는 푸룩토오스, 만노오스, 말토오스, 락토오스, 아라비노오스, 자일로오스, 리보오스, 람노오스, 갈락토오스, 글루코오스, 수크로오스, 트레할로오스, 소르보오스, 멜레지토오스, 라피노오스, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 트레이톨, 솔비톨, 글리세롤, L-글루코네이트 및 이의 금속성 염이다.
본원에 사용된 바와 같이, "완충제"는 이의 산-염기 접합 성분의 작용에 의한 pH 변화에 내성이 있는 완충 용액을 지칭한다. 본 발명의 완충제는 pH 범위가 약 4 내지 약 8, 바람직하게는 약 4.5 내지 약 7, 가장 바람직하게는 pH가 약 5.0 내지 약 6.5의 범위이다. 이러한 범위에서 pH를 조절할 수 있는 완충제의 예에는 포스페이트, 아세테이트(예: 나트륨 아세테이트), 석시네이트(예: 나트륨 석시네이트), 글루코네이트, 글루타메이트, 히스티딘, 시트레이트 및 기타 유기 산 완충제가 포함된다. 한 가지 양태에서, 본 발명의 제형에 사용하기에 적합한 완충제는 시트레이트 및 포스페이트 완충제이다.
용어 "계면활성제"는 일반적으로 공기/용액 계면 유도된 스트레스 및 용액/계면 유도된 스트레스로부터 당해 제형 중의 단백질을 보호하는 제제를 포함한다. 예를 들면, 계면활성제는 단백질이 응집되는 것을 보호할 수 있다. 적합한 계면활성제는, 예를 들면, 폴리솔베이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르(예: Brij 35.RTM.), 또는 폴록사머(예: Tween 20, Tween 80 또는 폴록사머 188)을 포함할 수 있다. 바람직한 붕해제는 폴록사머(예: 폴록사머 188, 폴록사머 407); 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르(예: Brij 35.RTM., 크레모포어 A25, 심파텐스 ALM/230) 및 폴리솔베이트/Tweens[예: 폴리솔베이트 20, 폴리솔베이트 80, Mirj 및 폴록사머(예: 폴록사머 188)] 및 Tweens(예: Tween 20 및 Tween 80)이다.
"안정한" 제형은 본원 항체가 제조 공정 동안 및/또는 저장시에 이의 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 실질적으로 보유하는 것이다. 단백질 안정성을 측정하는 다양한 분석학적 기술은 당해 기술분에서 이용가능하고, 문헌[참조: Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) and Jones, A. (1993) Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90]에서 검토되어 있다. 예를 들면, 한 가지 양태에서, 단백질의 안정성은 낮은 비율의 분해된(예: 단편화된) 및/또는 응집된 단백질과 함께 용액 중의 단량체 단백질의 백분율에 따라 결정된다. 바람직하게는, 제형은 실온(약 30℃)에서 또는 40℃에서 적어도 1개월 동안 안정하고/하거나 약 2 내지 8℃에서 적어도 1년 또는 적어도 2년 동안 안정하다. 추가로, 제형은 바람직하게는 당해 제형의 동결(예: -70℃까지) 및 해동 후에 안정하고, 이하 "동결/해동 사이클"이라 지칭한다.
항체는 착색 및/또는 투명도의 시각적 검사 또는 UV 광 산란 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정하여 응집, 침전 및/또는 변성의 징후를 실질적으로 나타내지 않는 경우에 약제학적 제형에서 "이의 물리적 안정성을 보유한다". 응집은 개개 분자 또는 복합체가 공유 또는 비공유 결합하여 응집물을 형성하는 공정이다. 응집은 가시적 침전물이 형성되는 정도까지 진행시킬 수 있다.
제형의 물리적 안정성 등의 안정성은 당해 기술분야에 공지된 방법으로 평가할 수 있으며, 이러한 방법은 광(흡광 또는 광학 밀도)의 샘플 외관 감쇠의 측정을 포함한다. 광 감쇠의 이러한 측정은 제형의 탁도와 관련된다. 제형의 탁도는 부분적으로는 용액에 용해된 단백질의 고유 특성이고, 통상 비탁검사(nephelometry)에 의해 측정되고, 비탁계 탁도 단위(NTU)로 측정된다.
예를 들면, 용액 중의 하나 이상의 성분의 농도, 예를 들면, 단백질 및/또는 염 농도의 함수로서 탁도는 또한 제형의 "유백광" 또는 "유백 외관"으로서 지칭된다. 탁도는 공지된 탁도의 현탁액을 사용하여 생성한 표준 곡선을 기준으로 계산할 수 있다. 약제학적 조성물의 탁도를 측정하는 참조 표준은 유럽 약학 표준(European Pharmacopoeia, Fourth Ed., Directorate for the Quality of Medicine of the Council of Europe (EDQM), Strasbourg, France)에 기초할 수 있다. 유럽 약학 표준에 따르면, 투명한 용액은 유럽 약학 표준에 따라 약 3의 탁도를 갖는 참조 현탁액보다 작거나 동등한 탁도를 갖는 것으로 정의된다. 비탁계 탁도 측정은 결합 또는 비이상적 효과의 부재하에, 농도에 따라 통상 선형으로 변화하는, 레일리(Rayleigh) 산란을 검출할 수 있다. 물리적 안정성을 평가하는 다른 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다.
항체는 당해 항체가 하기 정의한 바와 같이 이의 생물학적 활성을 여전히 보유하는 것으로 간주되도록 소정 시간에서의 화학적 안정성이 존재하는 경우에 약제학적 제형에서 "이의 화학적 안정성을 보유한다". 화학적 안정성은, 예를 들면, 화학적으로 변경된 형태의 항체를 검출하고 정량함으로써 평가할 수 있다. 화학적 변경은 크기 변형(예: 클립핑)을 포함하며, 이는, 예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피, SDS-PAGE 및 매트릭스 보조된 레이저 탈착 이온화/비행 시간 질량 분광분석(MALDI/TOF MS)를 사용하여 평가할 수 있다. 다른 형태의 화학적 변경은, 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피에 의해 평가할 수 있는 전하 변화(예: 탈아미드화 또는 산화의 결과로서 발생)를 포함한다.
항체는 약제학적 제형 중의 당해 항체가 이의 의도된 목적을 위해 생물학적으로 활성인 경우에 약제학적 제형에서 "이의 생물학적 활성을 보유한다". 예를 들면, 생물학적 활성은 약제학적 제형 중의 항체의 생물학적 활성이 당해 약제학적 제형을 제조하는 시점에서 나타난 생물학적 활성의 약 30%, 약 20% 또는 약 10%(분석 오차 이내)인 경우에 보유된다(항원 결합 분석으로 측정됨).
약력학적 측면에서, 본 발명과 관련하여, 항체의 "치료학적 유효량" 또는 "유효량"은 항체가 효과적인 치료에 있어서 장애 징후의 예방 또는 치료 또는 완화에 효과적인 양을 지칭한다. "장애"는 항체를 사용한 치료가 유리할 수 있는 임의의 상태이다. 이는 피검체가 당해 장애에 걸리기 쉬운 병리학적 상태를 포함하는 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다.
"치료"는 치료학적 처리 및 예방 또는 방지 수단 둘 다를 언급한다. 치료를 필요로 하는 것들은 이미 당해 장애를 앓는 것들 뿐만 아니라 장애가 예방되어야만 하는 것들을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여된"은 장내 투여 및 국소 투여 이외에 보통 주사에 의한 투여방식을 의미하고, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관지내, 피하내, 각피내, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "전신 투여", "전신적으로 투여된", "말초 투여" 및 "말초적으로 투여된"은 중추신경계내로 직접 투여하는 것 외에 화합물, 약제 또는 기타 물질이 환자의 순환계로 진입하여 대사에 적용되는 투여 및 기타 유사 과정, 예를 들면, 피하 투여를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인간 TNFα"(본원에서 hTNF-알파, TNFα 또는 단순히 hTNF로서 언급됨)는, 생리학적 활성 형태가 비공유적으로 결합된 17kD 분자의 삼량체로 이루어진, 17kD의 분비성 형태 및 26kD 막 연합 형태로서 존재하는 인간 사이토킨을 언급한다. hTNFα의 구조는 추가로, 예를 들면, 문헌[참조: Pennica, D., et al. (1984) Nature 312:724-729; Davis, J.M., et al. (1987) Biochem 26:1322-1326; and Jones, E.Y., et al. (1989) Nature 338:225-228]에 기재되어 있다. 용어 인간 TNFα는 표준 재조합 발현 방법에 의해 제조될 수 있거나 시판되는(R & D Systems, Catalog No. 210-TA, Minneapolis, Minn) 재조합 인간 TNFα(rhTNFα)를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "항체"는 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄가 서로 디설파이드 결합에 의해 연결되어 있는 4개의 폴리펩타이드 쇄로 이루어진 면역글로불린 분자를 나타낸다. 변화된 구조의 기타 자연 발생 항체, 예를 들면, 카멜리드 항체도 또한 이러한 정의에 포함된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 VH로서 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3과 같은 3개의 도메인으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 LCVR 또는 VL로서 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인 CL로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 추가로 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역(CDR)으로 호칭되고 골격 영역(FR)으로 호칭되는 초가변성 영역으로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어지고, 이들은 아미노 말단에서 카복시 말단까지 하기의 순서로 배열되어 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 본 발명의 한 양태에서, 당해 제형은 본원에 참조문헌으로서 인용된 미국 특허 제6,090,382호 및 제6,258,562호에 기재된 것들과 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 갖는 항체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "CDR"은 항체 가변 서열 내의 상보성 결정 영역을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 각각에는 3개의 CDR이 존재하고, 이들은 가변 영역 각각에 대해 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 지정된다. 이들 CDR의 정확한 경계는 상이한 시스템에 따라 상이하게 정의되어 있다. 카밧(Kabat, Id.)에 의해 기재된 시스템은 항체의 임의의 가변 영역에 적용가능한 명확한 잔기 넘버링 시스템을 제공할 뿐만 아니라, 3개 CDR을 규정하는 정확한 잔기 경계를 제공한다. 이들 CDR은 카밧 CDR로서 지칭될 수 있다. 코티아(Chothia) 등은 카밧 CDR 내의 특정한 서브-부분이 아미노산 서열의 수준에서 큰 다양성을 가짐에도 불구하고 거의 동일한 펩타이드 골격 형태를 채용함을 발견했다[참조: Chothia et al. (1987) Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342:877-883]. 이들 서브-부분은 L1, L2 및 L3 또는 H1, H2 및 H3으로서 지정되었고, 여기서 "L" 및 "H"는 각각 경쇄 및 중쇄 영역을 나타낸다. 이들 영역은 코티아 CDR로서 지칭될 수 있고, 이는 카밧 CDR과 중첩되는 경계를 가질 수 있다. 카밧 CDR과 중첩하는 CDR을 규정하는 기타 경계는 문헌[참조: Padlan (1995) FASEB J. 9:133-139 and MacCallum (1996) J. Mol. Biol. 262(5):732-45]에 기재되어 있다. 기타 CDR 경계 정의는 본원에 기재된 시스템 중의 하나를 엄격하게 따르지 않고, 카밧 CDR과 중첩할 것이지만, 이들은 특정한 잔기 또는 잔기 그룹 또는 전체 CDR이 항원 결합에 현저하게 영향을 미치지 않는 예상 또는 실험적 발견에 비추어 짧아지거나 길어질 수 있다. 본원에 사용된 방법은 특정한 양태가 카밧 또는 코티아 규정 CDR을 사용할지라도, 이들 시스템의 어느 하나에 따라 규정된 CDR을 사용할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 항체의 "항원 결합 부위"(또는 단순히 "항체 부분")는 특이적으로 항원(예를 들면, hTNFα)에 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 용어 항체의 "항원 결합 부분"내에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편, (ii) 힌지(hinge) 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편, (iv) 단일 암(arm)의 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편[참조: Ward et al., (1989) Nature 341:544-546] 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 추가로, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH가 분리된 유전자에 의해 암호화되어 있지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여 VL 및 VH 영역이 서로 쌍을 이루어 1가 분자(단일쇄 Fv(scFv)로서 공지됨)[참조: Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 제조될 수 있도록 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다. 당해 단일쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원 결합 부분"내에 포함되는 것으로 의도된다. 이특이적 항체 단편(디아바디(diabody))과 같은 단일쇄 항체의 기타 형태가 또한 포함된다. 디아바디는 2가 이특이적 항체이고, 여기서 VH 및 VL 도메인은 단일 폴리펩타이드 쇄상에 발현되지만, 동일한 쇄상에 2개의 도메인 사이가 쌍을 이루기에는 너무 짧은 링커를 사용하여 도메인이 기타 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 이루도록 하여 2개의 항원 결합 부위를 생성한다[참조: Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123]. 본 발명의 한 양태에서, 당해 제형은 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 제6,090,382호 및 제6,258,562호에 기재된 항원 결합 부분을 포함한다.
추가로, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 항체 또는 항체 부분이 하나 이상의 기타 단백질 또는 펩타이드와 공유 또는 비공유 연합에 의해 형성되는 대형 면역접착 분자의 일부일 수 있다. 당해 면역접착 분자의 예는 사량체성 scFv 분자를 작제하기 위한 스트렙트아비딘 코어 영역의 사용[참조: Kipriyanov, S.M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101] 및 2가 및 비오티닐화된 scFv 분자를 작제하기 위한 시스테인 잔기, 마커 펩타이드 및 C 말단 폴리히스티딘 태그의 사용[참조: Kipriyanov, S.M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058]을 포함한다. Fab 및 F(ab')2 단편과 같은 항체 부분은 각각 온전한 항체의 파파인 또는 펩신 분해와 같은 통상적인 기술을 사용하여 온전한 항체로부터 제조될 수 있다. 더욱이, 항체, 항체 부분 및 면역접착 분자는 본원에 기재된 바와 같은 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 수득될 수 있다.
본원에 사용된 "인간 항체"란 용어는 인간 생식계열(germline) 면역글로불린 서열 유래의 가변 및 불변 영역을 보유하는 항체를 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 인간 항체는 CDR 및 특히 CDR3과 같은 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화된 것이 아닌 아미노산 잔기(예: 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 하지만, 본원에 사용된 "인간 항체"란 용어는 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 생식계열에서 유래하는 CDR 서열을 인간 프레임워크 서열에 접목시킨 항체를 포함하는 것을 의미하는 것은 아니다.
본원에 사용된 "재조합 인간 항체"란 용어는, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생산 또는 분리된 모든 인간 항체를 포함하는 것으로서, 예를 들면, 숙주 세포로 형질감염된 재조합 발현 벡터에 의해 발현된 항체(이하에 섹션 II에서 더 상세히 설명됨), 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리에서 분리된 항체(이하에 섹션 III에서 더 상세히 설명됨), 인간 면역글로불린 유전자에 대해 돌연변이성인 동물(예: 마우스)에서 분리된 항체[참조: Taylor, L.D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287] 또는 다른 DNA 서열에 인간 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생산 또는 분리된 항체를 포함하는 것을 의미한다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열 유래의 가변 및 불변 영역을 보유한다. 하지만, 특정 양태에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발로 처리되고(또는, 인간 Ig 서열에 대해 돌연변이성인 동물이 사용된 경우에는 생체내 체세포 돌연변이유발로 처리됨), 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식계열 VH 및 VL 서열에서 유래되고 관련이 있기는 하지만, 생체내 인간 항체 생식계열 목록 내에는 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다.
본원에 사용된 "분리된 항체"는, 항원 특이성이 상이한 다른 항체를 실질적으로 함유하지 않는 항체를 의미하는 것이다(예: hTNFα에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 hTNFα 외에 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 실질적으로 함유하지 않는다). 하지만, hTNFα에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 종 유래의 TNFα 분자와 같은 다른 항원에 대해 교차 반응성을 나타낼 수 있다. 또한, 분리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질을 실질적으로 함유하지 않을 수 있다.
본원에 사용된 "중화 항체"(또는 hTNFα 활성을 중화시킨 항체")는, hTNFα에 대한 결합이 hTNFα의 생물학적 활성을 억제하는 항체를 의미하는 것이다. 이러한 hTNFα의 생물학적 활성의 억제는 hTNFα 유도 세포독성(시험관내 또는 생체내), hTNFα 유도 세포 활성화 및 hTNFα 수용체에 대한 hTNFα 결합과 같은 hTNFα 생물학적 활성의 하나 이상의 지시인자를 측정하여 평가할 수 있다. hTNFα 생물학적 활성의 상기 지시인자는 당업계에 공지되고 본원에서 참조로서 인용되는 미국 특허 제6,090,382호 및 제6,258,562호에 기재된 하나 이상의 여러 표준 시험관내 또는 생체내 분석법을 통해 평가될 수 있다. hTNFα 활성을 중화시키는 항체의 능력은 L929 세포의 hTNFα 유도 세포독성의 억제를 통해 평가하는 것이 바람직하다. hTNFα 활성의 추가 또는 대안적인 파라미터로서, hTNFα 유도 세포 활성화의 척도로서 HUVEC에서 ELAM-1의 hTNFα 유도 발현을 억제하는 항체의 능력을 평가할 수도 있다.
본원에 사용된 "표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)"이란 용어는 바이오센서 매트릭스 내에서 단백질 농도의 변경을 검출하여 실시간 생물특이적 상호작용을, 예를 들면, BIAcore 시스템(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway NJ) 등을 사용하여 분석할 수 있게 하는 광학 현상을 지칭한다. 더 상세한 설명은 문헌[참조: Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; 및 Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277]을 참조한다.
본원에 사용된 "Kon"이란 용어는 당해 분야에 공지된 바와 같이, 예를 들면, 항체/항원 복합체를 형성하기 위해 항원에 대한 결합 단백질(예: 항체)의 속도 상수를 지칭하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 "Koff"란 용어는 항체/항원 복합체로부터 항체가 해리되는 속도 상수를 지칭하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 "Kd"란 용어는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 지칭하는 것으로 의도되고, 평형시의 역가 측정 또는 해리 속도 상수(koff)를 연합 속도 상수(kon)로 나누어 수득한 값을 지칭한다.
본 발명의 다양한 양태는 하기 하위 섹션에서 보다 상세히 기재되어 있다.
II . 본 발명의 제형
본 발명은 종래 기술에서 인식된 제형과 비교하여 개선된 특성을 갖는 액체 약제학적 제형(예: 항체 제형)을 특징으로 한다. 본 발명은 NaCl을 제거하고 20 mg/mL 초과의 폴리올(예: 당 알콜)을 첨가함으로써 제형 중의 인간 TNFα 항체의 농도를 약 100 mg/mL로 증가시킬 수 있는 놀라운 발견에 기초한 것이다. 고농도의 항체에도 불구하고, 본 발명의 제형은 예를 들면 제조, 저장 및/또는 반복된 동결/해동 처리 단계 또는 증가된 공기-액체 계면에 대한 연장된 노출 동안 단백질의 용해도 및 안정성을 유지할 수 있다. 또한, 본 발명의 제형은 약 100 mg/mL의 항체를 가짐에도 불구하고 낮은 수준의 단백질 응집(예: 1% 미만)을 유지한다. 또한, 본 발명의 제형은 놀랍게도 약 100 mg/mL의 항체를 가짐에도 불구하고 피하 주사에 적합한 범위 내의 낮은 점도를 유지한다. 추가로, 본 발명의 제형, 예를 들면, 고농도의 TNFα 항체는 용해도를 거의 하나의 pH 범위(예: pH 5.2 내지 pH 6.0)에 걸쳐 유지하고 피하 주사에 적합한 낮은 점도를 유지하며 안정성을 유지한다. 한 가지 양태에서, 당해 제형의 탁도는 표준 48시간 교반-스트레스 분석 후에 100 NTU 미만이다. 따라서, 본 발명의 고농도 항체 제형은 안정성, 점도, 탁도 및 물리적 열화 과제를 포함하는 제형에 대해 공지된 다수의 과제를 해결한다.
본 발명의 제형의 놀라운 특징은 NaCl의 부재하에 당해 제형의 전체 점도가 낮게(예: 약 3.1 내지 3.3 mPas*s, 예를 들면, 약 3.00, 3.05, 3.10, 3.15, 3.20, 3.25, 3.30, 3.35 또는 약 3.40 mPas*s) 유지되고, 항체 농도가 높다(예: 100 mg/mL 이상)는 점이다. 일반적으로, 점도는 단백질 농도가 증가함에 따라 증가한다[참조: Shire et al. (2004) J Pharm Sci 93:1390 for review]. 이러한 증가는 거의 언제나 이온성 부형제(예: NaCl 및 MgCl2)를 첨가함으로써 중화되지만, 이러한 부형제의 첨가는 또한 불용성 단백질 응집물, 침전물 또는 단백질 입자(예: 응집)의 형성과 관련된다. 따라서, 본 발명의 액체 약제학적 제형은 NaCl을 첨가할 필요 없이 피하 투여에 적합한 점도와 함께 고농도 항체(예: 100 mg/mL 이상)를 제공한다.
한 가지 양태에서, 본 발명의 제형은 고농도의 단백질을 포함하여, 당해 액체 제형은 현저한 유백광, 응집 또는 침전을 나타내지 않는다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 제형은, 예를 들면, 현저한 통각(예: 가시적 동등 규모(VAS) 스코어에 의해 측정됨) 없이 피하 투여에 적합한 고농도의 단백질을 포함한다.
본 발명의 제형은 고 단백질 농도을 포함하며, 예를 들면, 단백질 농도 약 50 mg/mL 또는 약 100 mg/mL의 인간 항-TNF-α 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 따라서, 하기 실시예 1에 기재된 바와 같이, 본 발명의 한 가지 양태에서, 액체 약제학적 제형은 약 50 mg/mL의 인간 항-TNF α 항체 농도를 포함한다. 하기 실시예 2 내지 6에 기재된 바와 같이, 본 발명의 또 다른 양태에서, 액체 약제학적 제형은 약 100 mg/mL의 인간 항-TNFα 항체 농도를 포함한다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 액체 약제학적 제형은 약 150 mg/mL의 인간 항-TNFα 항체 농도를 포함한다. 본 발명의 바람직한 양태는 고 단백질 농도을 포함하는 제형이지만, 또한 본 발명의 제형은 약 1 mg/mL 내지 약 150 mg/mL 또는 약 40 mg/mL 내지 125 mg/mL의 항체 농도를 포함할 수 있다. 농도 및 상기 인용된 농도의 중간 범위는 또한 본 발명의 일부분인 것으로 의도된다(예: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199 또는 200 mg/mL).
또 다른 양태에서, 본 발명은, 예를 들면, 약 100 mg/mL 초과의 농도로 치료학적으로 사용하기 위해, 폴리올, 계면활성제 및 완충 시스템을 항체의 아달리무맙의 제형화에 충분한 양으로 포함하는 액체 약제학적 조성물을 포함한다. 한 가지 양태에서, 액체 약제학적 조성물은 NaCl을 함유하지 않는다.
그러나, 본 발명의 바람직한 제형이 NaCl을 포함하지 않더라도, 소량의 NaCl이 당해 제형에, 예를 들면, 약 0.01 mM 내지 약 300 mM로 존재할 수 있다. 또한, 상기 인용된 값의 중간인 NaCl의 양이 포함되는 것으로 의도된다.
한 가지 양태에서, 본 발명은 치료학적으로 사용하기 위한 항체의 제형화에 적합한 양으로, NaCl의 첨가 없이, 인간 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예: 아달리무맙), 폴리올을 포함하는 액체 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 NaCl의 첨가 없이 약 5.0 내지 약 6.4의 pH 및 표준 24시간 교반-스트레스 분석 후에 약 60 NTU 미만의 탁도에서 인간 항-TNF-α 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 액체 약제학적 제형을 제공한다(예: 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 또는 63 NTU). 또 다른 양태에서, 본 발명은 NaCl의 첨가 없이 약 5.0 내지 6.4의 pH 및 표준 48시간 교반-스트레스 분석 후에 약 100 NTU 미만의 탁도에서 인간 항-TNF-α 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 액체 제형을 제공한다(예: 약 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100 NTU). 또 다른 양태에서, 본 발명은 NaCl의 첨가 없이 약 5.0 내지 6.4의 pH 및 5℃, 25℃ 및 40℃에서 3개월 저장 후에 약 40 NTU 미만의 탁도에서 인간 항-TNF-α 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 액체 제형을 제공한다(예: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 NTU).
본 발명의 제형의 특징은 폴리올, 예를 들면, 당 알콜을 20 mg/mL 초과의 농도로 포함하는 것이다. 한 가지 양태에서, 폴리올은 솔비톨 또는 만니톨이다. 단백질 용액에 솔비톨 또는 만니톨의 첨가는 항상 단백질 안정성의 증가와 관련되는 것은 아님을 주목해야 한다. 예를 들면, 솔비톨은 각각 트윈 20 및 하이드록시프로필-β 사이클로덱스트린과는 대조적으로 열적 또는 계면 스트레스 조건 동안 평가하는 경우에 돼지 성장 호르몬의 침전에 대해 어떠한 이점도 제공하지 않는다[참조: Charman et al. (1993) Pharm Res.10(7):954-62].
한 가지 양태에서, 본 발명의 제형에서 사용하기에 적합한 폴리올은 당 알콜, 예를 들면, 만니톨 또는 솔비톨이다. 폴리올을 포함하는 본 발명의 액체 제형은 통상적으로 약 20 mg 초과의 폴리올을 포함한다. 한 가지 양태에서, 당해 제형은 약 30 mg/mL 초과의 폴리올을 포함한다. 또 다른 양태에서, 당해 제형은 약 40 mg/mL 초과의 폴리올을 포함한다. 또 다른 양태에서, 당해 제형은 약 40 내지 45 mg/mL의 폴리올, 예를 들면, 약 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 또는 55 mg/mL의 폴리올을 포함한다. 또한, 상한치 및/또는 하한치로서 상기 인용된 값의 조합을 사용하는 값의 범위도 포함되는 것으로 의도된다.
본 발명의 특정한 양태에서, pH 완충된 용액에 항체를 포함하는 액체 제형이 제조된다. 본 발명의 완충제는 pH 범위가 약 4 내지 8, 바람직하게는 약 4.5 내지 약 7.0, 보다 바람직하게는 약 4.5 내지 약 6.0, 보다 더 바람직하게는 약 4.8 내지 5.5, 및 가장 바람직하게는 약 5.0 내지 약 6.4이다. 한 가지 양태에서, 본 발명의 제형의 pH는 약 5.2이다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 제형의 pH는 약 6.0이다. 상기 인용된 pH에 대한 중간 범위도 또한 본 발명의 일부인 것으로 의도된다(예: 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4). 상한치 및/또는 하한치로서 상기 인용된 값의 임의의 조합을 사용하는 수치 범위, 예를 들면, 5.2 내지 5.8도 포함되는 것으로 의도된다. 이러한 범위로 pH를 조절할 수 있는 완충제의 예는 포스페이트, 아세테이트(예: 나트륨 아세테이트), 석시네이트(예: 나트륨 석시네이트), 글루코네이트, 글루타메이트, 히스티딘, 시트레이트 및 기타 유기 산 완충제를 포함한다.
본 발명의 특정한 양태에서, 당해 제형은 pH를 약 5.0 내지 약 6.4로 유지하기 위해 시트레이트 및/또는 포스페이트를 함유하는 완충제 시스템을 포함한다. 한 가지 양태에서, 당해 제형의 pH는 약 5.2이다. 또 다른 양태에서, 당해 제형의 pH는 6.0이다.
또 다른 바람직한 양태에서, 완충제 시스템은 시트르산 1수화물, 나트륨 시트레이트, 2나트륨 포스페이트 2수화물 및/또는 인산2수소나트륨 2수화물을 포함한다. 추가의 바람직한 양태에서, 완충제 시스템은 약 1.15-1.45 mg/ml의 시트르산(예: 약 1.15, 1.20, 1.25, 1.30, 1.35, 1.40 또는 1.45), 약 0.2-0.4 mg/mL의 나트륨 시트레이트 탈수화물(예: 약 0.2, 0.25, 0.3, 0.35 또는 0.4), 약 1.35-1.75 mg/mL의 인산2나트륨 탈수화물(예: 1.35, 1.40, 1.45, 1.50, 1.55, 1.60, 1.65, 1.70 또는 1.75), 약 0.75-0.95 mg/mL의 인산2수소나트륨 탈수화물(예: 약 0.75, 0.80, 0.85, 0.9 또는 0.95)을 포함한다.
상기 인용된 농도의 값 및 중간 범위도 본 발명의 일부인 것으로 의도된다. 또한, 상한치 및/또는 하한치로서 상기 인용된 값의 임의의 조합을 사용하는 값의 범위, 예를 들면, 1.20 내지 1.40 mg/mL도 포함되는 것으로 의도된다.
다른 양태에서, 완충제 시스템은 1.3-1.31 mg/mL의 시트르산(예: 약 1.305 mg/mL)을 포함한다. 또 다른 양태에서, 완충제 시스템은 약 0.27-0.33 mg/mL의 나트륨 시트레이트 탈수화물(예: 약 0.305 mg/mL)을 포함한다. 한 가지 양태에서, 완충제 시스템은 약 1.5-1.56 mg/mL의 인산2나트륨 탈수화물(예: 약 1.53 mg/mL)을 포함한다. 또 다른 양태에서, 완충제 시스템은 약 0.83-0.89 mg/mL의 인산2수소나트륨 탈수화물(예: 약 0.86 mg/mL)을 포함한다.
세정제 또는 계면활성제를 또한 본 발명의 항체 제형에 첨가할 수 있다. 예시적 세정제는 비이온성 세정제, 예를 들면, 폴리솔베이트(예: 폴리솔베이트 20, 80, 등) 또는 폴록사머(예: 폴록사머 188)를 포함한다. 세정제의 첨가량은 제형화된 항체의 응집을 감소시키고/시키거나 제형 중에 입자의 형성을 최소화시키고/시키거나 흡수를 감소시키는 양이다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 당해 제형은 폴리솔베이트인 계면활성제를 포함한다. 또 다른 바람직한 양태에서, 당해 제형은 세정제 폴리솔베이트 80을 함유한다. 바람직한 양태에서, 당해 제형은 약 0.1 내지 약 2.0 mg/mL의 폴리솔베이트 80, 예를 들면, 1 mg/mL의 폴리솔베이트 80을 함유한다.
상기 인용된 농도의 값 및 중간 범위, 예를 들면, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9도 본 발명의 일부인 것으로 의도된다. 또한, 상한치 및/또는 하한치로서 상기 인용된 값의 임의의 조합을 사용하는 값의 범위, 예를 들면, 0.3 내지 1.1 mg/mL도 포함되는 것으로 의도된다.
한 가지 양태에서, 본 발명의 제형은 약 100 mg/mL 이상의 농도로 인간 TNF α 항체 또는 이의 항원 결합 부분, 계면활성제(폴리솔베이트 80), 폴리올(예: 20 mg/mL 초과의 솔비톨 또는 만니톨) 및 완충 시스템(예: 시트르산 1수화물, 나트륨 시트레이트, 인산2나트륨 2수화물 및/또는 인산2수소나트륨 2수화물)로 실질적으로 구성되고, NaCl을 함유하지 않는다.
한 가지 양태에서, 당해 제형은 상기 확인된 제제(즉, 약 100 mg/mL 이상 농도의 항체, 완충 시스템, 폴리올 및 계면활성제, NaCl 부재)를 함유하고, 방부제, 예를 들면, 벤질 알콜, 페놀, m-크레졸, 클로로부탄올 및 벤즈에토늄 Cl을 실질적으로 함유하지 않는다. 또 다른 양태에서, 방부제는 당해 제형에 포함될 수 있다. 하나 이상의 기타 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제, 예를 들면, 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재된 것들이 제형에 포함될 수 있으며, 단 이들은 당해 제형의 목적하는 특성에 현저한 부작용을 나타내지 않아야 한다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 용량 및 농도에서 수용체에 무독성이고, 추가의 완충제; 공용매; 산화방지제(아스코르브산 및 메티오닌 포함); 킬레이트제(예: EDTA); 금속 착물(예: 아연-단백질 착물); 생물분해성 중합체(예: 폴리에스테르) 및/또는 염 형성 카운터이온(예: 나트륨)을 포함한다.
본원의 제형은 필요에 따라 치료되는 특정 징후를 위해 하나 이상의 기타 치료학적 제제, 바람직하게는 당해 제형의 항체에 부작용을 갖지 않는 상보성 활성을 갖는 것들과 조합될 수 있다. 이러한 치료학적 제제는 적합하게는 의도된 목적에 효과적인 양으로 배합하여 존재한다. 본 발명의 제형과 조합될 수 있는 추가의 치료학적 제제는 각각 본원에서 참조로서 인용되는 미국 특허 제6,090,382호 및 제6,258,562호에 추가로 기재되어 있다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 멸균성이어야 한다. 이는 당해 제형의 제조 전 또는 후에 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
상기 기재한 바와 같이, 본 발명의 액체 제형은 유리한 안정성 및 저장 특성을 갖는다. 액체 제형의 안정성은 용량 형태에 의존적이지 않으며, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 동결, 동결건조, 분무 건조되는 제형 또는 활성 성분이 현탁되어 있는 제형을 포함한다. 안정성은 선택된 기간 동안 선택된 온도에서 측정할 수 있다. 본 발명의 한 가지 양태에서, 액체 제형 중의 단백질은 약 3개월 이상; 약 4개월 이상; 약 5개월 이상; 약 6개월 이상; 약 12개월 이상; 약 18개월 이상 동안 액체 형태로서 안정하다. 상기 인용된 시간 값 및 이의 중간 범위, 예를 들면, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 약 24개월도 본 발명의 일부인 것으로 의도된다. 또한, 상한치 및/또는 하한치로서 상기 인용된 값의 임의의 조합을 사용하는 값 범위도 포함되는 것으로 의도된다. 바람직하게는, 당해 제형은 실온에서(약 30℃) 또는 40℃에서 약 1개월 이상 동안 안정하고/하거나 약 2 내지 8℃에서 약 1년 이상 동안 안정하고, 또는 보다 바람직하게는 약 2 내지 8℃에서 약 2년 이상 동안 안정하다. 추가로, 당해 제형은 바람직하게는 동결(예: -80℃까지) 및 당해 제형의 해동 후에 안정하다(이하 "동결/해동 사이클"로서 지칭됨).
액체 제형 중의 단백질의 안정성은 단량체, 응집물, 또는 이의 단편 또는 조합물로서 정의될 수 있다. 단백질은 착색 및/또는 투명도의 가시적 검사 또는 UV 광 산란 또는 크기 배제 크로마토그피에 의해 측정한 바와 같이 응집, 침전 및/또는 변성의 어떠한 징후도 실질적으로 나타내지 않는 경우에 제형에서 "이의 물리적 안정성을 보유한다". 본 발명의 한 가지 양태에서, 안정한 액체 제형은 단백질이 제형 중의 응집물로서 약 10% 미만 및 바람직하게는 약 5% 미만 존재하는 제형이다.
한 가지 양태에서, 액체 제형의 물리적 안정성은 교반-스트레스 분석, 예를 들면, 24시간 또는 48시간 교반-스트레스 분석에 따라 제형의 탁도를 측정함으로써 결정된다. 예를 들면, 교반 스트레스 분석은 적합한 용적의 액체 제형을 자기 교반기를 갖는 비이커(다분기점 HP, 550 rpm)에 위치시키고, 분액을 임의의 시간(예: T0-T48(시간))에서 제거하고, 분액에 대해 필요한 적합한 분석을 수행함으로써 실시할 수 있다. 교반시키지 않고서 동일한 조건하의 제형의 샘플을 대조군으로서 사용한다.
탁도 측정은 하쉬(Hach, Germany)로부터의 실험실 탁도 측정 시스템을 사용하여 수행하고, 비탁계 단위(NTU)로 기록한다.
본 발명의 액체 제형은 또한 유리한 내성 특성을 갖는다. 내성은 통증 가시적 규모(VAS)를 사용하여 피검체 인지 주사 부위의 평가에 기초하여 평가된다.
(VAS)는, 예를 들면, 무통증으로부터 극단 양의 통증까지 연속 값 범위로 통증을 측정하는 측정 장치이다. 임의로, VAS는 임의로 극단(예: 온건, 중간, 심함; 또는 1 내지 9) 사이의 추가의 단어 또는 수치적 기재와 함께 수치적 및/또는 단어 기술어, 예를 들면, 0 또는 10, 또는 "무통증" 또는 "극도의 통증"으로 고정된 길이 약 100 mm의 수평 라인이다[참조: Lee JS, et al. (2000) Acad Emerg Med 7:550].
측정될 수 있는 내성의 추가의 지시인자는, 예를 들면, 드레이즈 규모(출혈, 점상 출혈, 홍반, 부종, 소양) 및 통증을 포함한다.
III. 본 발명의 제형에 사용하기 위한 항체
본 발명의 제형에 사용될 수 있는 항체는 항원 TNF-α에 대해 유도된 항체이고, 인간 TNF-α(또는 hTNF-α)를 포함한다.
한 가지 양태에서, 본 발명은 고도의 친화성 및 낮은 해리 속도로 인간 TNF-α에 결합하는 분리된 인간 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 특징으로 하고, 또한 높은 중화능을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명에 사용된 인간 항체는 재조합 중화 인간 항-hTNF-α 항체이다. 본 발명의 가장 바람직한 재조합 중화 항체는 본원에서 D2E7로서 지칭되며, 또한 HUMIRATM 또는 아달리무맙이다(D2E7 VL 영역의 아미노산 서열은 서열번호 1에 제시되어 있고; D2E7 VH 영역의 아미노산 서열은 서열번호 2에 제시되어 있다). D2E7의 특성(아달리무맙/HUMIRA？)은 문헌[참조: Salfeld 등의 미국 특허 제6,090,382호, 제6,258,562호 및 제6,509,015호, 이들 각각은 본원에서 참조로서 인용됨]에 기재되어 있다.
한 가지 양태에서, 인간 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 표면 플라스몬 공명으로 각각 측정했을 때 1 x 10-8 M 이하의 Kd 및 1 x 10-3 s-1 이하의 Koff 속도 상수로 인간 TNFα로부터 해리되고, 표준 시험관내 L929 검정에서 1 x 10-7 M 이하의 IC50으로 인간 TNFα 세포독성을 중화시킨다. 보다 바람직하게는, 분리된 인간 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 5 x10-4 s-1 이하의 Koff, 보다 더 바람직하게는 1x10-4 s-1 이하의 Koff 속도로 인간 TNFα로부터 해리된다. 보다 바람직하게는, 분리된 인간 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 표준 시험관내 L929 검정에서 1 x 10-8 M 이하, 보다 더 바람직하게는 1 x 10-9 M 이하, 보다 바람직하게는 1 x 10-10 M 이하의 IC50으로 인간 TNFα 세포독성을 중화한다. 바람직한 양태에서, 항체는 분리된 인간 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다.
항체 중쇄 및 경쇄 CDR3 도메인은 항원에 대한 항체의 결합 특이성/친화성에 중요한 역할을 한다는 것이 당업계에 공지된 사실이다. 따라서, 다른 관점으로서, 본 발명은 인간 항체를 투여하여 크론병을 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 항체는 hTNFα와의 결합에서 느린 해리 동력학을 갖고 D2E7과 구조적으로 동일하거나 관련 있는 경쇄 및 중쇄 CDR3 도메인을 보유한다. D2E7 VL CDR3의 위치 9번에는 Koff에 실질적으로 영향을 미침이 없이 Ala 또는 Thr이 위치할 수 있다. 따라서, D2E7 VL CDR3의 컨센서스 모티프(consensus motif)는 아미노산 서열 Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A)(서열번호 3)을 포함한다. 또한, D2E7 VH CDR3의 위치 12에는 Koff에 실질적으로 영향을 미침이 없이 Tyr 또는 Asn이 위치할 수 있다. 따라서, D2E7 VH CDR3의 컨센서스 모티프는 아미노산 서열: V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-E-(Y/N)(서열번호 4)을 포함한다. 더욱이, 미국 특허 제6,090,382호의 실시예 2에서 증명되어 있듯이, D2E7 중쇄 및 경쇄의 CDR3 도메인은 Koff에 실질적으로 영향을 미침이 없이 단일 알라닌 잔기로 치환될 수 있다(VL CDR3 내의 위치 1, 4, 5, 7 또는 8번, 또는 VH CDR3 내의 위치 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 또는 11번). 또한, 당업자는, D2E7 VL 및 VH CDR3 도메인이 알라닌으로 치환되기 쉽다면, CDR3 도메인 내의 다른 아미노산도, 항체의 낮은 해리 상수를 유지하면서 치환될 수 있을 것이며, 특히 보존적 아미노산 치환이 가능할 것이라는 것을 인식할 것이다. 바람직하게는, D2E7 VL 및/또는 VH CDR3 도메인 내에는 1 이하부터 5개의 보존적 아미노산 치환이 이루어진다. D2E7 VL 및/또는 VH CDR3 도메인 내에는 1개 내지 5개 이하의 보존적 아미노산 치환이 이루어진 것이 보다 바람직하다. 또한, 보존적 아미노산 치환은 hTNFα에 대한 결합에 중요한 아미노산 위치에서는 이루어지지 않아야 한다. D2E7 VL CDR3의 위치 2 및 5번 및 D2E7 VH CDR3의 위치 1 및 7번은 hTNFα와의 상호작용에 중요한 것으로 보이며, 이에 따라 이들 위치에서는 보존적 아미노산 치환이 이루어지지 않는 것이 바람직하다(D2E7 VL CDR3의 위치 5번에서의 알라닌 치환은 상기한 바와 같이 허용될지라도)(미국 특허 제6,090,382호 참조).
따라서, 다른 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 다음과 같은 특징을 포함하는 것이 바람직하다:
a) 표면 플라스몬 공명으로 측정했을 때 1 x 10-3 s-1 이하의 Koff 속도 상수로 인간 TNFα로부터 해리되고;
b) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나, 위치 1, 4, 5, 7 또는 8번에서의 단일 알라닌 치환 또는 위치 1, 3, 4, 6, 7, 8 및/또는 9번에서의 1개 내지 5개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호 3으로부터 변형된, 경쇄 CDR3 도메인을 보유하며;
c) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 4로부터 위치 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 또는 11번에서의 단일 알라닌 치환 또는 위치 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 및/또는 12번에서의 1개 내지 5개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호 4로부터 변형된 중쇄 CDR3 도메인을 보유한다.
보다 바람직하게는, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 5 x 10-4 s-1 이하의 Koff로 인간 TNFα로부터 해리된다. 보다 더 바람직하게는, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 1 x 10-4 s-1 이하의 Koff로 인간 TNFα로부터 해리된다.
또 다른 양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 3으로부터 위치 1, 4, 5, 7 또는 8번에서의 단일 알라닌 치환에 의해 변형된 CDR3 도메인을 보유하는 경쇄 가변 영역(LCVR), 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 4로부터 위치 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 또는 11번에서의 단일 알라닌 치환에 의해 변형된 CDR3 도메인을 보유하는 중쇄 가변 영역(HCVR)을 포함하는 것이 바람직하다. LCVR은 추가로 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인(즉, D2E7 VL CDR 2)을 보유하고, HCVR은 추가로 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인(즉, D2E7 VH CDR2)을 보유하는 것이 바람직하다. LCVR은 추가로 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인(즉, D2E7 VL CDR1)을 보유하고, HCVR은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인(즉, D2E7 VH CDR1)을 보유하는 것이 보다 더 바람직하다. VL의 프레임워크 영역은 바람직하게는 VκI 인간 생식계열로부터의 것이고, 보다 바람직하게는 A20 인간 생식계열 Vk 유전자에서 유래하는 것이며, 가장 바람직하게는 미국 특허 제6,090,382호의 도 1A 및 1B에 제시된 D2E7 VL 프레임워크 서열에서 유래하는 것이다. VH의 프레임워크 영역은 바람직하게는 VH3 인간 생식계열로부터 유래하는 것이고, 보다 바람직하게는 DP-31 인간 생식계열 VH 유전자에서 유래하는 것이며, 가장 바람직하게는 미국 특허 제6,090,382호의 도 2A 및 도 2B에 제시된 D2E7 VH 프레임워크 서열에서 유래하는 것이다.
따라서, 다른 양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)(즉, D2E7 VL) 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR)(즉, D2E7 VH)을 포함하는 것이 바람직하다. 특정 양태에서, 항체는 중쇄 불변 영역, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 IgG1 중쇄 불변 영역 또는 IgG4 중쇄 불변 영역인 것이 바람직하다. 더욱이, 항체는 카파 경쇄 불변 영역 또는 람다 경쇄 불변 영역인 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 항체는 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는 것이 바람직하다. 또는, 항체 부분은, 예를 들면, Fab 단편 또는 단일쇄 Fv 단편일 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 D2E7 관련 VL 및 VH CDR3 도메인을 포함하는 분리된 인간 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 용도를 포함한다. 예를 들면, 서열번호 3, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 보유하는 경쇄 가변 영역(LCVR), 또는 서열번호 4, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34 및 서열번호 35로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 보유하는 중쇄 가변 영역(HCVR)을 보유하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 있다.
본 발명의 방법 및 조성물에 사용된 항체 또는 항체 부분은 숙주 세포에서 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 유전자의 재조합 발현을 통해 제조할 수 있다. 재조합적으로 항체를 발현시키기 위해, 숙주 세포는 항체의 면역글로불린 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA 단편을 보유하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터로 형질감염시켜, 이 숙주 세포에서 경쇄 및 중쇄가 발현되도록 하고, 바람직하게는 숙주 세포가 배양되는 배지로 분비되어, 이 배지로부터 항체를 회수할 수 있게 한다. 표준 재조합 DNA 방법을 사용하여 항체 중쇄 및 경쇄 유전자를 수득하고, 이 유전자를 재조합 발현 벡터에 혼입시킨 다음, 이 벡터를 숙주 세포에 도입시킨다[참조: Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F. M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) 및 미국 특허 제4,816,397호(Boss et al.)].
아달리무맙(D2E7) 또는 아달리무맙(D2E7) 관련 항체를 발현시키기 위해, 먼저 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 암호화하는 DNA 단편을 수득한다. 이러한 DNA는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용한 생식계열 경쇄 및 중쇄 가변 서열의 증폭 및 변형을 통해 수득할 수 있다. 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자의 생식계열 DNA 서열은 당업계에 공지되어 있다[참조: "Vbase" 인간 생식계열 서열 데이터베이스; Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M. et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; 및 Cox, J.P.L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line V78 Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836; 각 문헌의 내용은 본 발명에 참조로서 인용된 것이 분명하다]. D2E7 또는 D2E7 관련 항체의 중쇄 가변 영역을 암호화하는 DNA 단편을 수득하기 위해, 인간 생식계열 VH 유전자의 VH3 계열의 구성원은 PCR로 증폭시킨다. DP-31 VH 생식계열 서열을 증폭시키는 것이 가장 바람직하다. D2E7또는 D2E7 관련 항체의 경쇄 가변 영역을 암호화하는 DNA 단편을 수득하기 위해, 인간 생식계열 VL 유전자의 VκI 계열의 구성원을 표준 PCR로 증폭시킨다. A20 VL 생식계열 서열을 증폭시키는 것이 가장 바람직하다. DP-31 생식계열 VH 및 A20 생식계열 VL 서열의 증폭에 사용하기에 적당한 PCR 프라이머는 표준 방법을 사용하여, 상기 인용된 참고문헌에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 기초로 하여 설계할 수 있다.
생식계열 VH 및 VL 단편이 수득되면, 이 서열들을 본 명세서에 개시된 D2E7 또는 D2E7 관련 아미노산 서열을 암호화하도록 돌연변이시킬 수 있다. 생식계열 VH 및 VL DNA 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열은 먼저 D2E7 또는 D2E7 관련 VH 및 VL 아미노산 서열과 비교하여, 생식계열과 다른 D2E7 또는 D2E7 관련 서열에 존재하는 아미노산 잔기를 확인한다. 그 다음, 생식계열 DNA 서열의 적당한 뉴클레오타이드는 돌연변이된 생식계열 서열이 D2E7 또는 D2E7 관련 아미노산 서열을 암호화하도록 유전자 코드를 사용하여 돌연변이시켜, 변화가 이루어져야 하는 뉴클레오타이드를 측정한다. 생식계열 서열의 돌연변이유발은 표준 방법, 예를 들면, PCR 매개 돌연변이유발(PCR 산물이 돌연변이를 포함하도록 PCR 프라이머 내에 돌연변이된 뉴클레오타이드를 포함시키는 방법) 또는 부위 지시된 돌연변이유발 등을 통해 수행한다.
더욱이, PCR 증폭에 의해 수득한 "생식계열" 서열이 진정한 생식계열 배열로부터 프레임워크 영역에서 상이한 아미노산을 암호화하는 경우(즉, 예를 들면, 체세포 돌연변이의 결과로서 진정한 생식계열 서열과 비교하여 증폭된 서열에서 상이), 상이한 이들 아미노산을 진정한 생식계열 서열로 다시 변화시키는 것이 바람직할 수 있다(즉, 프레임워크 잔기의 생식계열 배열로의 "역돌연변이").
D2E7 또는 D2E7 관련 VH 및 VL 단편을 암호화하는 DNA 단편이 수득되면(상기한 바와 같이 생식계열 VH 및 VL 유전자의 증폭 및 돌연변이유발을 통해), 이 DNA 단편을 표준 재조합 DNA 기술로 추가 조작하여, 예를 들면, 가변 영역 유전자를 전장 항체 사슬 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 변환시킨다. 이러한 조작에서, VL 또는 VH를 암호화하는 DNA 단편은 다른 단백질을 암호화하는 다른 DNA 단편, 예를 들면, 항체 불변 영역 또는 유연한(flexible) 링커에 작동적으로 결합시킨다. 이와 관련하여 사용된 "작동적으로 결합된"이란 용어는 2개의 DNA 단편이 암호화한 아미노산 서열이 프레임내에 존재하도록 결합시킨다는 것을 의미한다.
VH 영역을 암호화하는 분리된 DNA는 VH 암호화 DNA를 중쇄 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3)을 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동적으로 결합시킴으로써 전장 중쇄 유전자로 변환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자 서열은 당업계에 공지되어 있고[참조: Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242], 이 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있으나, IgG1 또는 IgG4 불변 영역이 가장 바람직하다. Fab 단편 중쇄 유전자를 위해, VH 암호화 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만을 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동적으로 결합될 수 있다.
VL 영역을 암호화하는 분리된 DNA는 VL 암호화 DNA를 경쇄 불변 영역 CL을 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동적으로 결합시켜 전장 경쇄 유전자(뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 변환시킬 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고[참조: Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242], 이 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있으나, 카파 불변 영역인 것이 가장 바람직하다.
scFv 유전자를 생산하기 위해, VH 및 VL 암호화 DNA 단편은 유연한 링커, 예를 들면, 아미노산 서열 (Gly4-Ser)3을 암호화하는 다른 단편에 작동적으로 결합시켜, VH 및 VL 서열이 상기 유연한 링커에 의해 결합되어 연속적인 단일쇄 단백질로서 발현될 수 있도록 한다[참조: Bird et al (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554].
본 발명에 사용된 항체 또는 항체 부분을 발현시키기 위해, 상기한 바와 같이 수득한 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA를 이 유전자가 전사 및 해독 조절 서열에 작동적으로 결합되도록 발현 벡터에 삽입한다. 이와 관련하여, "작동적으로 결합된"이란 용어는 벡터 내의 전사 및 해독 조절 서열이 항체 유전자의 전사 및 해독을 조절하는 계획된 기능을 수행하도록 벡터 내에 연결된다는 것을 의미하는 것이다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 사용된 발현 숙주 세포에 적합한 것으로 선택한다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 다른 벡터에 삽입할 수도 있으나, 두 유전자를 동일한 발현 벡터에 삽입하는 것이 더욱 일반적이다. 항체 유전자는 표준 방법(예를 들면, 항체 유전자 단편 및 벡터의 상보성 제한 부위에 연결 또는 제한 부위가 존재하지 않는다면 평활말단 연결)에 의해 발현 벡터 내로 삽입한다. D2E7 또는 D2E7 관련 경쇄 또는 중쇄 서열을 삽입하기 전에, 발현 벡터는 이미 항체 불변 영역 서열을 보유할 수 있다. 예를 들면, D2E7 또는 D2E7 관련 VH 및 VL 서열을 전장 항체 유전자로 변환시키는 한가지 시도는, VH 단편은 벡터 내의 CH 단편(들)에 작동적으로 결합하고 VL 단편은 벡터 내의 CL 단편에 작동적으로 결합하도록 상기 서열들을, 이미 중쇄 불변 및 경쇄 불변 영역을 각각 암호화하고 있는 발현 벡터 내로 삽입하는 것이다. 추가로 또는 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 사슬의 분비를 촉진하는 신호 펩타이드를 암호화할 수 있다. 항체 사슬 유전자는 신호 펩타이드가 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 프레임내(in-frame) 결합되도록 벡터에 클로닝될 수 있다. 신호 펩타이드는 면역글로불린 신호 펩타이드 또는 이종 신호 펩타이드(즉, 비면역글로불린 단백질 유래의 신호 펩타이드)일 수 있다.
항체 사슬 유전자 외에, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포 내에서 항체 사슬 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 보유한다. "조절 서열"이란 용어는 프로모터, 인핸서 및 항체 사슬 유전자의 전사 또는 해독을 조절하는 다른 발현 조절 인자(예: 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것을 의미한다. 이러한 조절 서열에 대해서는, 예를 들면, 문헌[참조: Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990)]에 기술되어 있다. 조절 서열의 선택을 포함하는 발현 벡터의 설계는 형질전환되어야 하는 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 정도 등과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다는 것을 당업자라면 잘 알고 있을 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현에 바람직한 조절 서열에는 포유동물 세포에서 높은 단백질 발현 수준을 유도하는 바이러스 인자, 예를 들면, 사이토메갈로바이러스(CMV) 유래의 프로모터 및/또는 인핸서(예를 들면, CMV 프로모터/인핸서), 시미안 바이러스 40(SV40) 유래의 프로모터 및/또는 인핸서(예를 들면, SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스 유래 프로모터 및/또는 인핸서(예: 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP)) 및 폴리오마 유래 프로모터 및/또는 인핸서가 있다. 바이러스 조절 인자 및 이의 서열에 대한 더 상세한 설명은 문헌[참조: 미국 특허 제5,168,062호(Stinski), 미국 특허 제4,510,245호(Bell et al.) 및 미국 특허 제4,968,615호(Schaffner et al.)]에 기술되어 있다.
항체 사슬 유전자 및 조절 서열 외에도, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가 서열, 예를 들면, 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예: 복제 오리진) 및 선별가능 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선별가능 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다[참조: 미국 특허 제4,399,216호, 제4,634,665호 및 제5,179,017호(모두 Axel et al.)]. 예를 들면, 일반적으로 선별가능 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선별가능 마커 유전자에는 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선택/증폭과 함께 dhfr-숙주 세포에 사용) 및 neo 유전자(G418 선택용)가 포함된다.
경쇄 및 중쇄 발현을 위하여, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 벡터(들)를 표준 기술에 의해 숙주 세포 속으로 형질감염시킨다. "형질감염"이란 용어의 다양한 형태는 일반적으로 외인성 DNA를 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포 속으로 도입시키는데 사용되는 광범위한 기술, 예를 들면, 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함하는 의미이다. 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 본 발명의 항체를 발현하는 것은 이론적으로 가능하지만, 진핵생물 세포, 가장 바람직하게는 포유동물 숙주 세포에서의 항체의 발현은, 이러한 진핵생물 세포, 특히 포유동물 세포가 원핵생물 세포보다 적당히 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 어셈블리하여 분비할 가능성이 크기 때문에 가장 바람직하다. 항체 유전자의 원핵생물 발현은 활성 항체를 고수율로 생산하는 데에는 비효과적인 것으로 보고되었다[참조: Boss and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6: 12-13].
본 발명의 재조합 항체를 발현시키기에 바람직한 포유동물 숙주 세포에는 중국 햄스터 난소(CHO 세포)[예를 들면, DHFR 선별가능 마커, 예를 들면, 문헌[참조: R. J. Kaufman and P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621]에 기술된 것과 함께 사용되는 문헌[참조: Urlaub and Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기술된 dhfr- CHO 세포], NS0 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포가 포함된다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포에 도입되면, 이 숙주 세포에서 항체가 발현하기에 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양하거나, 보다 바람직하게는 숙주 세포가 증식된 배양 배지로 항체가 분비되기에 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양하여 생산한다. 항체는 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
숙주 세포는 Fab 단편 또는 scFv 분자와 같이 완전 항체의 부분을 생산하는 데에도 사용될 수 있다. 상기한 절차의 변형도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 이해하여야 한다. 예를 들면, 숙주 세포를 본 발명에 따른 항체의 경쇄 또는 중쇄(둘 모두는 아니다)를 암호화하는 DNA로 형질감염시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 재조합 DNA 기술을 사용하여, hTNFα에 결합하는데 필요하지 않은 경쇄 및 중쇄 중 어느 하나 또는 둘 모두를 암호화하는 DNA의 일부 또는 전체를 제거할 수도 있다. 이러한 절단된 DNA 분자로부터 발현된 분자도 역시 본 발명의 항체에 속하는 것이다. 또한, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄가 본 발명의 항체이고 다른 중쇄 및 경쇄가 hTNFα 외에 다른 항원에 특이적인 이기능성 항체는 본 발명의 항체를 표준 화학적 가교 방법에 의해 제2 항체에 가교시킴으로써 생산할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 재조합 발현시키기에 바람직한 시스템에서, 항체 중쇄 및 항체 경쇄를 모두 암호화하는 재조합 발현 벡터를 인산칼슘 매개의 형질감염에 의해 dhfr-CHO 세포 속으로 도입시킨다. 재조합 발현 벡터 내에서 항체 중쇄와 경쇄 유전자는 각각 이 유전자의 높은 전사 수준을 유도하는 CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 인자에 작동적으로 결합되어 있다. 재조합 발현 벡터는 또한 DHFR 유전자를 보유하여, 메토트렉세이트 선별/증폭을 통해 그 벡터로 형질감염된 CHO 세포를 선별할 수 있게 한다. 선별된 형질전환된 숙주 세포를 항체 중쇄 및 경쇄가 발현되도록 배양하고, 이 배양 배지로부터 완전한 항체를 회수한다. 재조합 발현 벡터의 제조, 숙주 세포의 형질감염, 형질전환체의 선별, 숙주 세포 배양 및 배양 배지로부터 항체의 회수에는 표준 분자생물학 기술을 사용한다.
상기에 비추어, 본 발명에 사용된 항체 및 항체 부분의 재조합 발현에 사용될 수 있는 상기 핵산, 벡터 및 숙주 세포 조성물은 인간 TNF α 항체 아달리무맙(D2E7)을 포함하는 핵산 및 상기 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다. D2E7 경쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 36에 제시되어 있다. LCVR의 CDR1 도메인은 뉴클레오타이드 70 내지 102번을 포함하고, CDR2 도메인은 뉴클레오타이드 148 내지 168번을 포함하며, CDR3 도메인은 뉴클레오타이드 265 내지 291번을 포함한다. D2E7 중쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 37에 제시되어 있다. HCVR의 CDR1 도메인은 뉴클레오타이드 91 내지 105번을 포함하고, CDR2 도메인은 뉴클레오타이드 148 내지 198번을 포함하며, CDR3 도메인은 뉴클레오타이드 295 내지 330번을 포함한다. D2E7 관련 항체 또는 이의 부분을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(예: CDR3 도메인 등의 CDR 도메인)이 유전자 코드 및 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 D2E7 LCVR 및 HCVR을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로부터 유도될 수 있음은 당업자에게 인식될 것이다.
한 가지 양태에서, 액체 약제학적 제형은 인간 TNF α 항체, 또는 즉 항체 아달리무맙에 생물등가 또는 생물유사의 이의 항원 결합 부분을 포함한다. 한 가지 양태에서, 생물유사 항체는 참조 항체(예: 아달리무맙)과 비교하는 경우 임상적으로 의미있는 차이를 나타내지 않는 항체이다. 생물유사 항체는 참조 항체(예: 아달리무맙)과 동등한 안전성, 순도 및 효능을 갖는다.
IV. 본 발명의 제형의 투여
본 발명의 제형의 이점은 고농도의 인간 항-TNF α 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예: 아달리무맙)을 피검체에게 피하 전달하는데 사용될 수 있다는 것이다. 따라서, 한 가지 양태에서, 본 발명의 제형은 피검체에게 피하 전달된다. 한 가지 양태에서, 피검체는 당해 제형을 자신이 투여한다.
한 가지 양태에서, 당해 양태의 유효량이 투여된다. 당해 제형의 문구 "유효량"은 TNF-α 활성을 억제하는데 필요하거나 충분한 양이, 예를 들면, 유해한 TNF-α 활성 관련 상태의 다양한 형태학적 및 체세포 징후를 방지하는 것이다. 또 다른 양태에서, 당해 제형의 유효량은 목적하는 결과를 달성하는데 필요한 양이다.
당해 제형의 유효량의 예는 유해한 TNF-α 활성을 억제하거나 TNF α 활성이 유해한 장애를 치료하는데 충분한 양이다. 본원에 사용된 바와 같이, "TNF-α 활성이 유해한 장애"는 당해 장애를 앓고 있는 환자에서 TNF-α의 존재가 당해 장애의 병태생리에 관여하거나 당해 질환의 악화에 관여하는 인자인 것으로 밝혀지거나 의심되는 장애 및 기타 질환을 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, TNF-α 활성이 유해한 장애는 TNF-α 활성의 억제가 당해 장애의 증상 및/또는 진행을 완화시킬 것으로 예상되는 장애이다. 이러한 장애는, 예를 들면, 항-TNF-α 항체를 사용하여 검출할 수 있는, 장애를 앓고 있는 피검체의 생물학적 유체에서 TNF-α의 농도의 증가(예를 들면, 혈청, 혈장, 활액 등에서 TNF-α의 농도의 증가)에 의해 증명될 수 있다.
첨부된 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 본 발명의 제형의 한 가지 이점은 당해 제형의 점도를 증가시키지 않고서 고농도의 항체를 포함하는 제형을 제조하는 능력이다. 따라서, 하기에 기재된 바와 같이, 신규한 제형은 종래 시판되는 제형과 비교하여 보다 작은 용적으로 높은 양(예: 유효량)의 항체를 투여하여 통증을 감소시키게 한다.
한 가지 양태에서, 항체의 유효량은 엄격한 중량 기준 투약 스케쥴(예: mg/kg)에 따라 결정될 수 있거나, 중량과 독립적인 총 신체 용량(또한 고정 용량으로도 지칭됨)일 수 있다. 한 가지 예에서, 제형의 유효량은 총 신체 용량 약 80 mg의 항체를 함유하는 제형의 0.8 mL(즉, 본 발명의 항체 제형 100 mg/mL 중의 0.8 mL)이다. 또 다른 예에서, 유효량의 제형은 총 신체 용량 약 40 mg의 항체를 함유하는 본 발명의 제형 0.8 mL(즉, 본 발명의 항체 제형 100 mg/mL 중의 0.4 mL)이다. 또 다른 예에서, 유효량의 제형은 총 신체 용량 약 160 mg의 항체를 함유하는 2회의 제형 0.4 mL(즉, 본 발명의 항체 제형 100 mg/mL 중의 각각 0.8 mL를 함유하는 2회 단위)이다. 추가의 예에서, 유효량의 제형은 총 신체 용량 약 20 mg의 항체를 함유하는 본 발명의 제형 0.2 mL(즉, 본 발명의 항체 제형 100 mg/mL 중의 0.2 mL)이다. 또는, 유효량은 중량 기준 고정 투약 섭생에 따라 결정될 수 있다(참조: 본원에서 참조로서 인용되는 국제 공개공보 제WO2008/154543호).
본 발명은 저장 수명이 연장된 안정한 고농도 제형을 제공하고, 한 가지 양태에서, 이는 본 발명의 제형을 피검체에서의 TNF-α 활성이 억제되도록 피검체에게 투여함을 포함하여, TNF-α 활성이 유해한 질환을 앓고 있는 피검체에서 TNF-α 활성을 억제하는데 사용된다. 바람직하게는 TNF-α는 인간 TNF-α이고, 피검체는 인간 피검체이다. 또는, 피검체는 본 발명의 항체가 교차 반응하는 TNF-α를 발현하는 포유동물일 수 있다. 추가로, 피검체는 hTNF-α가 도입된 포유동물일 수 있다(예를 들면, hTNF-α의 투여 또는 hTNF-α의 유전자이식에 의해).
본 발명의 제형은 치료학적 목적으로 인간 피검체에 투여될 수 있다(하기에 추가로 언급됨). 본 발명의 한 가지 양태에서, 액체 약제학적 제형은 용이하게 투여가능하고, 이는, 예를 들면, 환자에 의해 자가 투여되는 제형이다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 제형은 피하 주사, 바람직하게는 단일 사용을 통해 투여된다. 더욱이, 본 발명의 제형은 가축 목적 또는 인간 장애의 동물 모델로서 당해 항체가 교차 반응하는 TNF-α를 발현하는 비인간 포유동물(예: 영장류, 돼지 또는 마우스)에게 투여될 수 있다. 후자와 관련하여, 이러한 동물 모델은 본 발명의 항체의 치료학적 효능을 평가하는데 유용할 수 있다(용량 및 투여의 시간 과정의 시험).
한 가지 양태에서, 본 발명의 액체 약제학적 제형은 예비충전된 시린지, 자가주사 펜 또는 니들 비함유 투여 장치를 통해 피검체에게 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 액체 약제학적 제형을 포함하는 자가주사 펜, 예비충전된 시린지 또는 니들 비함유 투여 장치를 특징으로 한다. 한 가지 양태에서, 본 발명은 100 mg/mL의 인간 TNF α 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 제형의 용량을 포함하는 전달 장치를 특징으로 하며, 예를 들면, 자가주사 펜 또는 예비충전된 시린지는 약 19 mg, 20, mg, 21 mg, 22 mg, 23 mg, 24 mg, 25 mg, 26 mg, 27 mg, 28 mg, 29 mg, 30 mg, 31 mg, 32 mg, 33 mg, 34 mg, 35 mg, 36 mg, 37 mg, 38 mg, 39 mg, 40 mg, 41 mg, 42 mg, 43 mg, 44 mg, 45 mg, 46 mg, 47 mg, 48 mg, 49 mg, 50 mg, 51 mg, 52 mg, 53 mg, 54 mg, 55 mg, 56 mg, 57 mg, 58 mg, 59 mg, 60 mg, 61 mg, 62 mg, 63 mg, 64 mg, 65 mg, 66 mg, 67 mg, 68 mg, 69 mg, 70 mg, 71 mg, 72 mg, 73 mg, 74 mg, 75 mg, 76 mg, 77 mg, 78 mg, 79 mg, 80 mg, 81 mg, 82 mg, 83 mg, 84 mg, 85 mg, 86 mg, 87 mg, 88 mg, 89 mg, 90 mg, 91 mg, 92 mg, 93 mg, 94 mg, 95 mg, 96 mg, 97 mg, 98 mg, 99 mg, 100 mg, 101 mg, 102 mg, 103 mg, 104 mg, 105 mg 등의 제형의 용량을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 제형은 TNF α 활성이 유해한 장애의 치료에 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "TNF-α 활성이 유해한 장애"은 당해 질환을 앓고 있는 피검체에서 TNF-α의 존재가 당해 질환의 병태생리에 관여하거나 당해 장애의 악화에 관여하는 인자인 것으로 밝혀지거나 의심되는 질환 및 기타 장애를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, TNF-α 활성이 유해한 장애는 TNF-α 활성의 억제가 당해 장애의 증상 및/또는 진행을 완화시킬 것으로 예상되는 장애이다. 이러한 장애는 예를 들면, 상기한 바와 같이 항-TNF-α 항체를 사용하여 검출할 수 있는, 장애를 앓고 있는 피검체의 생물학적 유체에서 TNF-α의 농도의 증가(예를 들면, 혈청, 혈장, 활액 등에서 TNF-α의 농도 증가)에 의해 증명될 수 있다.
TNF-α 활성이 유해한 장애는 다수의 예가 있다. TNF-α 활성이 유해한 예는 또한 미국 특허 제6,015,557호; 제6,177,077호; 제6,379,666호; 제6,419,934호; 제6,419,944호; 제6,423,321호; 제6,428,787호 및 제6,537,549호; 및 국제 공개공보 제WO 00/50079호 및 제WO 01/49321호가 있으며, 이들의 전체 내용은 본원에서 참조로서 도입된다. 본 발명의 제형은 또한 본원에서 전체 내용이 참조로서 도입되는 미국 특허 제6,090,382호, 제6,258,562호 및 미국 특허 공개번호 제US20040126372호에 기재된 바와 같이 TNF α가 유해한 장애의 치료에 사용될 수 있다.
특정한 예시적 장애의 치료에서 본 발명의 제형의 사용은 하기에 추가로 언급되어 있다:
A. 패혈증
종양 괴사 인자는 저혈압, 심근억제, 혈관 누출 증후군, 기관 괴사, 독성 2차 매개인자의 방출 자극 및 응고 캐스캐이드의 활성화를 포함하는 생물학적 효과가 있는 패혈증의 병태생리에 입증된 역할을 갖고 있다[참조: Tracey, K.J. and Cerami, A. (1994) Annu. Rev. Med. 45:491-503; Russell, D and Thompson, R.C. (1993) Curr. Opin. Biotech. 4:714-721]. 따라서, 본 발명의 제형은 패혈 쇼크, 내독성 쇼크, 그람 음성 패혈증 및 독성 쇼크 증후군을 포함하는 임의의 임상적 환경의 패혈증을 치료하는데 사용될 수 있다.
또한, 패혈증의 치료를 위해, 본 발명의 제형은 인터루킨-1 억제제(예: PCT 공개번호 WO 92/16221 및 WO 92/17583에 기술된 것), 사이토카인 인터루킨-6(예: PCT 공개번호 WO 93/11793) 또는 혈소판 활성화 인자의 길항물질(예: 유럽 특허출원 공개 EP 374 510)과 같은 하나 이상의 다른 치료제와 함께 공동투여될 수 있다.
추가로, 바람직한 양태에서, 본 발명의 제형은 IL-6의 혈청 또는 혈장 농도가 500pg/ml 이상, 보다 바람직하게는 1000pg/ml인 패혈증 환자의 서브그룹에 속하는 인간 피검체에게 치료시에 투여한다(참조: PCT 공개번호 WO 95/20978).
B. 자가면역 질환
종양 괴사 인자는 다양한 자가면역 질환의 병태생리에 역할을 하는 것으로 연루되어 있다. 예를 들면, TNFα는 류마티스 관절염에서 조직 염증의 활성화 및 관절 파괴를 유발하는데 연루되어 있다[참조: Tracey and Cerami, supra; Arend, W. P. and Dayer, J-M. (1995) Arth. Rheum. 38:151-160; Fava, R. A., et al. (1993) Clin. Exp. Immunol. 94:261-266]. TNFα는 또한 당뇨병에서 섬 세포의 사멸을 촉진하고 인슐린 내성을 매개하는데 연루되어 있다[참조: Tracey and Cerami, 상기 문헌 참조; PCT 공개번호 WO 94/08609 참조]. TNFα는 또한 다발성 경화증에서 희소돌기아교세포에 대한 세포독성 및 염증성 플라크의 유도를 매개하는데 연루되어 있다[참조: Tracey and Cerami, 상기 문헌 참조). 또한, 본 발명의 제형을 사용하여 치료될 수 있는 자가면역 질환에는 청소년 특발성 관절염(JIA)가 포함된다(또한, 청소년 류마티스성 관절염으로도 지칭됨)[참조: Grom et al. (1996) Arthritis Rheum. 39: 1703; Mangge et al. (1995) Arthritis Rheum. 8:211].
본 발명의 제형은 자가면역질환, 특히 염증과 관련된 자가면역질환을 치료하는데 사용될 수 있고, 여기에는 류마티스 관절염, 류마티스 척추염(또한 강직성 척수염으로도 지칭됨), 골관절염 및 통풍 관절염, 알러지, 다발성 경화증, 자가면역 당뇨병, 자가면역 포도막염, 청소년 특발성 관절염(또한 청소년 류마티스성 관절염으로도 지칭됨) 및 신장증후군이 포함된다.
C. 감염 질환
종양 괴사 인자는 다양한 감염질환에서 관찰되는 생물학적 효과를 매개하는데 연루되어 있다. 예를 들면, TNFα는 말라리아에서 뇌염증 및 모세혈관 혈전증 및 경색을 매개하는데 연루되어 있다[참조: Tracey and Cerami, 상기 참조]. TNFα는 또한 수막염에서 뇌염증의 매개, 혈액-뇌 장벽의 파괴, 패혈 쇼크 증후군의 유발 및 정맥 경색의 활성화에 연루되어 있다[참조: Tracey and Cerami, 상기 참조]. 또한, TNFα는 후천적 면역결핍증후군(AIDS)에서 악액질 유도, 바이러스 증식 자극 및 중추신경계 손상 매개에 연루되어 있다[참조: Tracey and Cerami, 상기 참조]. 따라서, 본 발명의 항체 및 이의 항체 부분은 세균 수막염(예를 들면, 유럽특허출원공개 EP 585 705), 뇌말라리아, AIDS 및 AIDS 관련 복합체(ARC)(예: 유럽특허출원공개 EP 230 574), 뿐만 아니라 이식 후의 사이토메갈로바이러스 감염[참조: Fietze E., et al.(1994) Transplantation 58: 675-680]을 포함하는 감염 질환의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 제형은 또한 감염 질환과 관련된 증후군, 예를 들면, 감염으로 인한 열 및 근육통(예: 인플루엔자) 및 감염에 이차적인(예: AIDS 또는 ARC에 이차적인) 악액질을 경감시키는데 사용될 수 있다.
D. 이식
종양 괴사 인자는 T 세포 수용체 CD3 복합체에 대해 유도된 래트 항체 OKT3이 신장 이식의 거부를 억제하는데 사용될 때 관찰된 부작용을 매개하고 동종이식거부 및 이식편대숙주 질환(GVHD)의 주요 매개인자로 연루되어 있다[참조: Tracey and Cerami, 상기 참조; Eason, J. D., et al. (1995) Transplantation 59:300-305; Suthanthiran, M. and Strom, T. B. (1994) New Engl. J. Med. 331:365-375]. 따라서, 본 발명의 제형은 동종이식 및 이종이식 거부를 포함하는 이식 거부를 억제하고, GVHD를 억제하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항체 부분은 단독 사용되기도 하지만, 동종이식에 대한 면역반응을 억제하거나 GVHD를 억제하는 하나 이상의 다른 제제와 함께 사용되는 것이 보다 바람직하다. 예를 들면, 한가지 양태에서, 본 발명의 제형은 OKT3과 함께 OKT3 유도 반응을 억제하는데 사용된다. 다른 양태에서, 본 발명의 제형은 면역반응을 조절하는데 관련된 다른 표적들, 예를 들면, 세포표면분자 CD25(인터루킨-2 수용체-α), CD11a(LFA-1), CD54(ICAM-1), CD4, CD45, CD28/CTLA4, CD80(B7-1) 및/또는 CD86(B7-2) 등에 대해 유도된 하나 이상의 항체와 함께 사용된다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 제형은 사이클로스포린 A 또는 FK506과 같은 하나 이상의 일반 면역억제제와 함께 사용된다.
E. 암
종양 괴사 인자는 암에서 악액질 유도, 종양 성장 자극, 전이 잠재성 증가 및 세포독성 매개에 연루되어 있다[참조: Tracey and Cerami, 상기 참조]. 따라서, 본 발명의 제형은 암 치료, 종양 성장 또는 전이의 억제 및/또는 암에 이차적인 악액질을 경감시키는데 사용될 수 있다.
F. 폐 장애
종양 괴사 인자는 성인호흡곤란증후군(ARDS)의 병태생리, 예를 들면, 백혈구 내피세포 활성화 자극, 폐포세포에 대한 세포독성 유도 및 혈관 누출 증후군 유도 등에 연루되어 있다[참조: Tracey and Cerami, 상기 참조]. 따라서, 본 발명의 제형은 다양한 폐 장애, 예를 들면, 성인호흡곤란증후군(예: PCT 공개번호 WO 91/04054), 쇼크 폐, 만성 폐염증 질환, 폐 사르코이드증, 폐섬유증 및 규폐증 등을 치료하는데 사용될 수 있다.
G. 위장 장애
종양 괴사 인자는 염증성 장 질환의 병태생리에 연루되어 있다[참조: Tracy, K. J., et al. (1986) Science 234:470-474; Sun, X-M., et al. (1988) J. Clin. Invest. 81:1328-1331; MacDonald, T. T., et al. (1990) Clin. Exp. Immunol. 81:301-305]. 키메라 쥐 항-hTNF-α 항체는 크론병의 치료를 위한 임상적 시험에 제공되어 왔다[참조: van Dullemen, H. M., et al. (1995) Gastroenterology 109:129-135]. 본 발명의 제형은 또한 2가지 증후군, 크론병 및 궤양성 대장염을 포함하는 특발성 염증성 장 질환 등의 위장 장애의 치료에 사용될 수 있다.
H. 심장 장애
본 발명의 제형은 또한 심장의 허혈증(참조: 유럽 특허출원 공개번호 제EP 453 898호) 및 심장 부전(심장 근육의 약화)(참조: PCT 공개공보 제WO 94/20139호)를 포함하는 다양한 심장 장애의 치료에 사용될 수 있다.
I. 척추관절염
TNFα는 척추관절염 등의 염증성 질환을 포함하는 다양한 장애의 병태생리에 연루되어 있다[참조: Moeller, A., et al. (1990) Cytokine 2:162-169; U.S. Patent No. 5,231,024 to Moeller et al.; European Patent Publication No. 260 610 B1 by Moeller, A]. 본 발명의 제형으로 치료될 수 있는 척추관절염의 예는 간경변 관절염을 포함한다. 종양 괴사 인자는 간경변 관절염의 병태생리에 연루되어 있다[참조: Partsch et al. (1998) Ann Rheum Dis. 57:691; Ritchlin et al. (1998) J Rheumatol. 25:1544].
J. 피부 및 손톱 장애
한 가지 양태에서, 본 발명의 제형은 피부 및 손톱 장애의 치료에 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "TNFα 활성이 해로운 피부 및 손톱 장애"는 당해 장애를 앓고 있는 피검체 중의 TNF α의 존재가 당해 장애의 병리생태에 관여하거나 당해 장애(예: 건선)의 악화에 관여하는 것으로 밝혀지거나 의심되는 피부 및/또는 손톱 장애 또는 기타 장애를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 제형을 사용하여 치료될 수 있는 피부 장애의 예는 건선이다. 한 가지 양태에서, 본 발명의 제형은 플라크 건선의 치료에 사용된다. 종양 괴사 인자는 건선의 병태생리에 연루되어 있다[참조: Takematsu et al. (1989) Arch Dermatol Res. 281:398; Victor and Gottlieb (2002) J Drugs Dermatol. 1(3):264].
한 가지 양태에서, 본 발명의 제형은 류마티스성 관절염, 간경변 관절염 또는 강직성 척추염의 치료에 사용된다. 분리된 인간 TNFα 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예: 아달리무맙)을 포함하는 본 발명의 제형은 류마티스성 관절염, 간경변 관절염 또는 강직성 척추염의 치료에 효과적인 투약 스케쥴 또는 투약량에 따라 인간 피검체에 투여될 수 있다. 한 가지 양태에서, 본 발명의 제형에서 약 40 mg 용량의 인간 TNF α 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예: 아달리무맙)(예: 본 발명의 제형 100 mg/mL의 0.4 mL)이 류마티스성 관절염, 간경변 관절염 또는 강직성 척추염을 치료하기 위해 매주 인간 피검체에게 투여된다. 한 가지 양태에서, 당해 제형은 류마티스성 관절염, 간경변 관절염 또는 강직성 척추염을 치료하기 위해 매주 피하 투여된다(또한 격주로서 지칭됨, 본원에 참조로서 도입되는 미국 특허 공개공보 제US20030235585호에 기재된 투여 방법 참조).
한 가지 양태에서, 본 발명의 제형은 크론병의 치료에 사용된다. 분리된 인간 TNF α 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예: 아달리무맙)을 포함하는 본 발명의 제형은 크론병의 치료에 효과적인 투약 스케쥴 및 투약량에 따라 인간 피검체에게 투여될 수 있다. 한 가지 양태에서, 본 발명의 제형에서 약 160 mg 용량의 인간 TNF α 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예: 아달리무맙)(예: 본 발명의 제형 100 mg/mL의 1.6 mL)은 크론병을 치료하기 위해 약 1일에서 초기에 인간 피검체에게 투여된 다음, 2주 후에 80 mg의 후속 용량의 항체(예: 본 발명의 제형 100 mg/mL의 0.8 mL)를 투여한 다음, 매주 약 40 mg(예: 본 발명의 제형 100 mg/mL의 0.4 mL)을 격주로 투여한다. 한 가지 양태에서, 당해 제형은 크론병을 치료하기 위해 유도 용량 및 유지 용량(들)을 포함하는 다중 가변 용량 섭생에 따라 피하 투여된다(참조: 크론병을 치료하기 위해, 각각 본원에서 참조로서 인용되는, 미국 특허 공개번호 제US20060009385호 및 제US20090317399).
한 가지 양태에서, 본 발명의 제형은 건선의 치료에 사용된다. 분리된 인간 TNF α 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예: 아달리무맙)을 포함하는 본 발명의 제형은 건선의 치료에 효과적인 투약 스케쥴 및 투약량에 따라 인간 피검체에게 투여될 수 있다. 한 가지 양태에서, 본 발명의 제형에서 초기 용량 약 80 mg의 인간 TNF α 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예: 아달리무맙)(예: 본 발명의 제형 100 mg/mL의 0.8 mL)을 인간 피검체에 투여한 다음, 후속 용량 40 mg의 항체(본 발명의 제형 100 mg/mL의 0.4 mL)를 초기 투여 후 1주에서 시작하여 매주 투여한다. 한 가지 양태에서, 당해 제형은 건선을 치료하기 위해 유도 용량 및 유지 용량(들)을 포함하는 다중 가변 용량 섭생에 따라 피하 투여된다(참조: 본원에서 참조로서 인용되는 미국 특허 제20060009385호 및 국제공개공보 제WO 2007/120823호).
한 가지 양태에서, 본 발명의 제형은 청소년 특발성 관절염(JIA)의 치료에 사용된다. 분리된 인간 TNF α 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예: 아달리무맙)을 포함하는 본 발명의 제형은 JIA의 치료에 효과적인 투약 스케쥴 및 투약량에 따라 인간 피검체에게 투여될 수 있다. 한 가지 양태에서, 본 발명의 제형에서 20 mg의 인간 TNF α 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예: 본 발명의 제형 100 mg/mL의 0.2 mL)는 JIA를 치료하기 위해 체중 15 kg(약 33 lbs) 내지 30 kg(66 lbs) 미만의 피검체에게 매주 투여된다. 다른 양태에서, 본 발명의 제형에서 40 mg 의 인간 TNF α 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예: 본 발명의 제형 100 mg/mL의 0.4 mL)는 JIA를 치료하기 위해 체중 30 kg(66 lbs) 이하의 피검체에게 매주 투여된다. 한 가지 양태에서, 당해 제형은 체중 기반 고정 용량에 따라 피하 투여된다(참조: 본원에 참조로서 인용되는 미국 특허 공보 제20090271164).
한 가지 양태에서, 분리된 인간 TNF α 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예: 아달리무맙)은 월간 투약 스케쥴에 따라 유해한 TNFα 활성과 관련된 장애를 치료하기 위해 인간 피검체에게 투여될 수 있고, 이에 의해 당해 항체는 매월 또는 4주마다 1회 투여된다. 상기 기재된 바와 같이, 월간 투약 스케쥴에 따라 치료될 수 있는 장애의 예로는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 류마티스성 관절염, 강직성 척추염, JIS, 건선, 크론병 또는 간경변 관절염이 포함된다. 따라서, 분리된 인간 TNF α 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예: 아달리무맙)을 포함하는 본 발명의 제형은 월간 투약 스케쥴에 따라 유해한 TNFα 활성과 관련된 장애를 치료하기 위해 인간 피검체에게 투여될 수 있다. 한 가지 양태에서, 본 발명의 제형에서 80 mg의 인간 TNF α 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예: 본 발명의 제형 100 mg/mL의 0.8 mL)는 유해한 TNFα 활성과 관련된 장애를 갖는 환자에게 투여된다.
본원에 기재된 투약량은 단일 용량(예: 0.4 mL 중의 40 mg 또는 0.8 mL 중의 80 mg 용량의 단일 용량)으로 전달될 수 있거나, 또는 다중 용량(예: 160 mg 용량을 전달하기 위해 40 mg 4회 용량 또는 80 mg 2회 용량)으로 전달될 수 있다.
분리된 인간 TNF α 항체 또는 이의 항원 결합 부분(아달리무맙)을 포함하는 본 발명의 제형은 또한 추가의 치료제와 조합하여 피검체에 투여될 수 있다. 한 가지 양태에서, 당해 제형은 메토트렉세이트 또는 기타 질환 개질 항-류마티스성 약물(DMARD)와 조합하여 류마티스성 관절염을 치료하기 위해 인간 피검체에 투여된다. 또 다른 양태에서, 당해 제형은 메토트렉세이트 또는 기타 질환 개질 항-류마티스성 약물(DMARD)와 조합하여 JIA를 치료하기 위해 인간 피검체에 투여된다. 추가의 병용 치료는 전체 내용이 본원에서 참조로서 도입되는 미국 특허 제6,258,562호 및 제7,541,031호 및 미국 특허 공개공보 제US20040126372호에 기재되어 있다.
인간 TNF α 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 본 발명의 제형은 또한 이전에 TNF 억제제 치료가 실패했던 피검체, 예를 들면, 인플리시맙에 대한 반응성이 소실되거나 이에 내성이 있는 피검체를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에서 설명되며, 이는 추가로 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
실시예 1: 인간 항-TNF α 항체 액체 약제학적 제형의 안정성 향상
이 실시예는 항체 아달리무맙의 약제학적 제형의 안정성을 향상시킴을 목적으로 하는 실험 결과를 제공한다.
재료 및 방법
아달리무맙(하위 그룹 G1, 약 47kDa)를 50 mg/mL 최종 약물 농도에서 액체 비경구 투여 형태를 생성하기 위해 변형된 약제학적 제형으로 제형화했다. 사전 제형화 실험은 포스페이트/시트레이트 완충제 시스템이 아달리무맙의 단백질 안정화의 관점에서 기타 완충제 시스템에 비해 우수하다고 측정되었다. 결과적으로, 개선된 안정성은 50 mg/mL 용량의 액체에 대해 부형제를 첨가하여 처리되었다. 사용된 모든 부형제는 최고 순도("pro 분석" 등급)였고, 독일 다름슈타트 소재의 머크 카게아(Merck KGaA)로부터 시판되었다. 만니톨은 네덜란드 데벤터 소재의 말린크로드츠 베이커 베.파우.((Mallinckrodt Baker B.V.)로부터 공급되었다.
가시성 미립자 물질의 분석은 Ph. Eur. 2002의 규정(§ 2.9.20 미립자 물질-가시성 입자에 의한 오염)에 따라 수행했다. 서브가시성 미립자 물질 분석은 광 불명료화에 의해 측정되었다(SVSS-C40, PAMAS GmbH, Rutesheim, Germany). 슈퍼로즈(Superose) TM6 10/30 컬럼(Amersham Pharmacia Europe GmbH, Freiburg, Germany)을 SE-HPLC 분석(단백질 단량체 함량의 평가)용으로 사용하여 pH 7.5의 PBS 완충제의 0.5mL/분 유속을 적용하고, 굴절률 검출을 위해 UV280 분광광도계에, 온-라인 검출을 위해 MALS에 결합시켰다. 각 샘플의 분석은 적어도 3중으로 수행했다. 다르게 기술되는 것을 제외하고, 모든 SE-HPLC에 대해, 데이터 Srel은 0.13 이하이고, 모든 광 불명료화에 대해 2.3 이하였다.
개별적 단백질 제형은 부형제 저장 용액에 의한 아달리무맙 농축물(약 70 mg/mL)의 희석을 통해 제조했다. 70 mg/mL 아달리무맙 저장 용액은 표 16에 나열된 바와 같은 시트레이트 및 포스페이트 완충제 성분의 조성(즉, 시트르산 * H2O, 나트륨 시트레이트 탈수화물, Na2HPO4 * 2 H2O, NaH2PO4 * 2 H2O)을 사용하여 제조했다.
부형제 저장 용액은 표 16에 나열된 바와 같은 시트레이트 및 포스페이트 완충제 성분의 조성(즉, 시트르산 * H2O, 나트륨 시트레이트 탈수화물, Na2HPO4 * 2 H2O, NaH2PO4 * 2 H2O)을 사용하여 포스페이트/시트레이트 완충제 배지에서의 부형제 용해에 의해 생성시켰다. 멸균 여과(0.2㎛,분isart？ Sartorius AG, Goettingen, Germany) 전에, 완충제 성분의 산/염기 표본을 첨가하여 pH 조정을 수행했다. 모든 제형은 최소한 이중으로 제조하고, 무균 박판 공기 유동 조건하에 가열 멸균된(180℃, 25분) 2R 유리 바이알(Schott Glas, Mainz, Germany) 속에서 용액 배치의 최종 멸균 여과를 통해 생성시켰다. 테플론 코팅된 부틸-고무 폐쇄는 사용 전에 Ph. Eur.에 따라 습식 가열(121℃)에 의해 멸균시켰다.
각종 제형을 3개의 상이한 온도(5℃, 25℃, 40℃)에서 3개월 단시간 저장에 적용했다.
아달리무맙 농축물은 완충제 교환용 포스페이트/시트레이트 완충제 배지를 사용하여 비바플로우(Vivaflow) 50 유닛(컷-오프 50kDa, Vivascience G, Hannover, Germany)을 통해 아달리무맙 벌크 용액의 정용여과에 의해 제공했다. 생물약제학적 용액의 농축화 및 완충제 교환을 위한 현재 공정은 IEX, SE-HPLC, 한외-/정용여과 및 접선 유동 여과를 토대로 한다[참조: Christy et al. (2002) Desalination, 144:133-136]. 정용여과가, 정제, 농축화 및 완충제 교환이 가변적인 유동 역학으로 단일-유닛 작동 내에서 가능하기 때문에, 적용되어 단백질 스트레스를 최소화한다(표 1).
[표 1]
단백질 손실 및 정용여과 사이클 수의 상관 관계
Figure pct00001
수행된 각 사이클은 총 단백질의 약 25%의 단백질 손실을 차지한다. 일반적으로, 단백질 손실은 농축물 제조 과정에서 7%를 초과하지 않았다.
하나의 정용여과 사이클 내에서, 단백질 농도는 2배로 하고, 최종 농축화 단계를 제외하고는 원래 농도로 재희석시켰다. 따라서, 존재에 대해 의도되지 않은 바람직하지 않은 용해된 물질은 효과적으로 제거할 수 있다(예: 1.00% 농도는 10개의 정용여과 사이클내에서 0.00098%로 축소될 수 있다). 정제 및 농축화에 이어, 아달리무맙 농축물을 원심분리했다(5℃, 3000 g, 20분).
최적 pH의 평가
최적 용액 pH(즉, pH 5.2 또는 pH 6.0)를 평가하기 위해, 2개의 상이한 아달리무맙 제형을 유일하게 pH를 변화시켜 분석했다. 1 mg/mL의 Tween 80을 함유하는 제형의 안정성 데이터는 표 2a 및 2b에 예시된다.
[표 2a]
40℃ 저장 동안 단량체 함량에 대한 제형 pH의 영향
Figure pct00002
[표 2b]
저장 동안 서브가시성 미립자 물질 형성에 대한 제형 pH의 영향
Figure pct00003
단량체 함량과 관련하여, 두 제형이 40℃ 저장에서 비교할 만한 단량체 손실을 나타내기 때문에 pH가 다른 하나에 비해 우수하다는 것은 밝혀지지 않았다. 25℃ 저장 조건의 데이터는 40℃ 데이터와 유사했지만, 5℃에서 이 연구 과정에서 분석된 모든 단백질 용액은 단백질 함량에 있어 어떤 중요한 변경도 경험하지 않았다.
그러나, 탁도에서의 차이가 발견되었다. 용액 pH 6.0은 저장 온도와 무관하게 12주 저장 동안 서브가시성 미립자 물질의 형성을 유도했다. 미립자 물질 형성 강도가 저온과 관련되기 때문에, 입자 기원은 단백질분해적인 것으로 추정되지 않는다. 이와 관련하여, 격심한 미립자 물질 형성이 단지 단백질 불안정성에 기인한다면, 이는 저장 시험 동안 증가된 온도에의 노출과 관련된다[참조: Constantino, et al. (1994b) J. Pharm. Sci. 83: 1662-1669].
Tween 80 대신 6.16 mg/mL NaCl을 함유하는 50 mg/mL 아달리무맙 제형과 관련하여, 염의 첨가는 1㎛ 초과 입자의 수가 두 용액에서 유사한 정도로 증가되었기 때문에(참조: 표 3a 및 3b), 서브가시성 입자의 형성을 유도한다. 또한, 12주 후, SE-HPLC 데이터는, 차이가 최소였고(약 0.3%) 25℃ 결과에 의해 확증되지 않았지만, pH 6.0 용액이 pH 5.2 용액보다 큰 단량체 함량을 가졌음을 나타냈다.
[표 3a]
40℃ 저장 동안 단량체 함량에 대한 pH의 영향
Figure pct00004
[표 3b]
저장 동안 서브가시성 미립자 물질 형성(B)에 대한 pH의 영향
Figure pct00005
입자 형성은 NaCl 첨가 및 pH 6.0 저장에 의해 촉진되고, Tween 80 첨가 및 용액 pH 5.2에 의해 개선되는 것으로 나타났다. 따라서, Tween 80은 염, 예를 들면, NaCl을 함유하는 용액 중에서 입자 오염을 경감시킬 수 있는 성분으로서 제안되었다(표 4a 및 4b). 이어서, 6.16 mg/mL NaCl 및 1 mg/mL Tween 80 모두를 함유하는 용액을 시험했다.
[표 4a]
저장 동안 단량체 함량에 대한 pH의 영향
Figure pct00006
[표 4b]
40℃ 저장 동안 서브가시성 미립자 물질 형성에 대한 pH의 영향
Figure pct00007
표 4b에 도시된 바와 같이, 염 및 계면활성제를 함유하는 제형의 경우, 계면활성제의 첨가는 서브가시성 입자가 Tween 80의 첨가에도 불구하고 명백하기 때문에, 서브가시성 입자 형성과 관련하여 어떤 영향도 미치지 않았다. 흥미롭게도, 모든 샘플에서, 입자 수는 최저 저장 온도(5℃)에서 최대여서 입자 기원이 무기 재료에 기인하여 잠재적임을 지시했다. 또한, 염을 함유하는 용액의 육안 조사는 저장 온도와 무관하게 4주 저장 후 약간의 탁도를 나타냈다. 저장이 일시적, 예를 들면, 인산나트륨 완충제가 4℃에서 비교적 불용성 Na2HPO4*12H2O를 수득할 수 있지만, 가시성 무기 성분의 침전은 차가운 온도에서의 저장 결과일 수 있다[참조: Borchert et al. (1986) PDA J. Pharm. Sci. Technol., 40:212-241]. 그러나, 평가 기준인 미립자 물질과 관련하여, 용액 pH 5.2는 시험된 용액에 대해 pH 6.0에 비해 이점을 가졌다.
그러나, 단량체 함량과 관련하여, 두 용액 pH 값은 저장 동안 동일한 단량체 함량을 제공했고, NaCl-함유 제형(Tween 80 부재)의 경우, pH 6.0은 심지어 약간 높은 안정성을 나타내는 것으로 나타났다. 이 유사한 단량체 프로파일에도 불구하고, 중성 또는 심지어 염기성 조건을 향한 pH 값에서, 단백질은 보다 광범위한 잠재적 열화 메카니즘의 경향이 있는 것으로 일반적으로 허용되고[참조: Wang (1999) Int. J. Pharm., 185:129-188], 예를 들면, 비이온화 단백질 아민의 카보닐-아민 반응, (염기 촉매된) β-제거 및 탈아민화는 높은 pH 값 및 각종 산화 반응에 의해 촉진된다[참조: Akers and DeFelippis, Peptides and proteins as parenteral solutions, in Pharmaceutical formulation development of peptides and proteins, ed. by Frokjaer, S; Hovgaard, L. (2000) 145-177]. 따라서, 요약하면, 용액 pH 5.2는 아달리무맙 50 mg/mL 장기간 안정성과 관련하여 6.0 값에 비해 우수한 것으로 간주되었다.
부형제인 계면활성제에 의한 안정화
50 mg/mL 아달리무맙 제형의 안정화 전위를 측정하기 위해, 여러가지 양의 Tween 80(0.%, 0.03%, 0.1%)을 6.16 mg/mL NaCl을 함유하는 단백질 용액에 첨가했다. 일반적으로, Tween 80은, 예를 들면, 소수성 표면 상호작용을 통해 결합함으로써 단백질을 안정화시키는 것으로 추정된다. 단백질 표면 특성이 염의 존재에 의해 영향을 받기 때문에, NaCl의 부재 효과가 추가로 조사되었다(표 5에서 NaCl 없는 0.1% Tween 80 용액으로서 기술됨)[참조: Kheirolomoom et al.(1998) Biochem. Eng. J., 2:81-88].
[표 5]
6.16 mg/mL NaCl을 함유하는 단백질 제형에 대한 Tween 80의 영향(저장 온도 40℃)
Figure pct00008
NaCl의 존재 및 부재하에 가변량의 Tween 80으로부터의 결과는 표 5에 제시된다. 제시된 바와 같이, Tween 80은 NaCl을 포함하거나 포함하지 않는 제형에 안정성을 제공할 수 없었다. 0.03% Tween 80/NaCl과 관련하여, 조합은 40℃에서 12주 저장 후에 단량체 함량을 감소시켰다. 이 결과는, Tween 80의 안정화 영향은 계면활성제의 농도의 증가와 관련되었기 때문에(0.001 내지 1% 범위가 유효함), 이 논제를 해결하기 위한 대부분의 논문에 모순된다[참조: Arakawa et al. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev., 46:307-326].
NaCl의 존재 및 부재하에 가변적인 Tween 80%에서 단량체 농도 이외에, 서브가시성 입자 형성도 또한 가변 온도에서 시험했다(참조: 표 6). 모든 저장 온도에서, Tween 80의 첨가는 특히 SE-HPLC 분석 결과가 확인되는 0.03% 농도에서 서브가시성 입자 수의 상당한 증가를 초래했다. 흥미롭게도, NaCl의 부재는 저장 온도와 무관하게 서브가시성 입자 형성을 현저하게 감소시키는 것으로 입증되었다.
[표 6]
6.16 mg/mL NaCl을 함유하는 용액의 40℃ 저장 동안 서브가시성 미립자 물질 형성에 대한 Tween 80의 영향
Figure pct00009
여러가지 농도의 Tween 80을 또한 동결/해동 사이클 후 미립자 형성에 대해 시험했다. 저장 동안 액체 용액에 대한 최소 안정화 영향과 대조적으로, Tween 80은 동결-해동 사이클 동안 아달리무맙에 현저한 안정성을 제공하는 것으로 입증되었다(표 7).
[표 7]
동결-해동 사이클에 의한 Tween 80의 가변 함량을 갖는 단백질 용액의 스트레스화
Figure pct00010
용액을 동결(-80℃, 12시간) 및 해동(5℃, 12시간)을 통해 스트레스에 반복적으로 적용하여 Tween 80의 효과를 또한 측정했다. 적용된 동결-해동(동결/해동) 사이클 수를 밀접하게 서로 관련시켜 서브가시성 미립자 물질을 수득했다. 그러나, 0 또는 0.03% Tween 80 함량을 갖는 용액에 대한 5회 동결/해동 사이클의 효과가 입자 오염(입자 ≥ 1㎛)에 있어 약 10배 증가를 유도하는 반면, 0.1% Tween 80 용액에서는 상황이 실질적으로 변하지 않았다. SE-HPLC 분석이 이들 결과를 확인했다(표 8).
[표 8]
발휘된 동결-해동 사이클의 수와 무관한 Tween 80 함량이 가변적인 아달리무맙 용액에서 단량체의 손실
Figure pct00011
기타 단백질에 대한 동결/해동 사이클의 효과에 대해 공표된 다수의 연구 결과에 근접하게 일치하여, 50 mg/mL 아달리무맙의 안정성은 계면활성제가 존재하지 않을 경우 반복된 동결/해동 스트레스에 노출시 감소된다. 반대로, 계면활성제의 첨가는 본래의 단량체의 함량(다중 각도 광 산란(MALS)을 사용하여 입증됨)이 변하지 않았기 때문에, 동결/해동과 관련된 유해한 변수에 대해 단백질을 보호했다.
요약하면, 아달리무맙 50 mg/mL 용액에 0.1% Tween 80의 첨가가 바람직했다. 0.1% Tween이 저장된 액체에서의 단백질 안정성을 단지 약간 개선시켰지만, 동결 및 해동과 같은 공정 동안 안정화 효과는 상당했다. 그럼에도 불구하고, 동결이 단백질 약제의 생산, 저장 및 수송에서 공통 유닛 조작이기 때문에, Tween 80의 첨가가 큰 이점으로서 나타날 수 있다[참조: Cao et al.(2003) Biotechnol. Bioeng., 82:684-690]. 추가로, 약제에서 0.1% Tween 80의 사용은 이미 1986년에 OrthocloneTM(쥐 IgG2a)의 FDA 승인에 의해 입증되어 익히 허용된다.
Tween 80 이외에, 비이온성 계면활성제 Solutol？ HS15를 아달리무맙을 안정화시키는 이의 잠재성에 대해 조사했다. 0.03 및 0.1%의 농도에서 Solutol？의 보호 특성이 최근에 아비스쿠민 비경구 약물에 대해 제시되었다[참조: Steckel et al. (2003) Int. J. Pharm., 257:181-194]. 따라서, 미립자 물질 오염 형성과 관련하여 아딜리무맙 용액에 대한 Solutol？의 영향을 0.1% Tween 80을 함유하는 단백질 용액과 비교했다(표 9).
[표 9]
0.1% Tween 80을 함유하는 아달리무맙 용액과 비교하여 12주 저장 후 미립자 물질의 형성에 대한 각종 Solutol？ 농도를 함유하는 아달리무맙 용액의 영향
Figure pct00012
0.03% 및 0.1% Solutol？을 포함하는 용액과 대조적으로, 각각 1% Solutol？ 및 0.1% Tween 80을 포함하는 아달리무맙 용액은 저장 동안 미립자 물질의 현저한 증가를 나타냈다. 저 Solutol？농도의 이러한 긍정적인 영향은 SE-HPLC 분석 데이터에 반영되지 않았다. 12주 저장(40℃) 후, Solutol？을 함유하는 모든 용액은 참조(0.1% Tween 80)와 비교하여 약 0.5%의 단량체 함량의 손실을 나타냈다(도 1).
이 실험은 또한 고분자량(hmw) 단백질 응집물의 초기 단계 검출에서 MALS에 의해 제공된 큰 이점을 예시한다(도 2a 및 2b). 이의 큰 분석물에 대한 높은 감도에 기인하여, 최소 농도가 MALS에 의한 응집물을 검출하기에 충분하고, 예를 들면, 1주 저장(40℃) 후 hmw 응집물의 형성은 MALS에 의해 입증되지만- UV280-검출에 의해서는 실질적으로 검출되지 않았다.
결과적으로, 가속화된 저장 기간 연구의 초기 단계에서 이미 hmw 응집물의 형성은 일반적으로 허용되지 않았기 때문에, Solutol은 잠재적인 안정화제의 목록으로부터 제거되었다. 심지어, 최소량의 단백질(<0.1%)이 침전을 차지하는 것으로 공지되었다[참조: Hoffman, Analytical methods and stability testing of biopharmaceuticals, in Protein formulation and delivery, ed. by McNally, E. J., 3 (2000) 71-110]. 상기 발견은 고농도(>1%)의 Solutol？HS15가 세르핀 관련 프로테아제 억제제의 용액을 불안정하게 하고, 가시성 미립자 물질 현상에 도움이 된다는 것을 나타내는 이전 연구를 확인한다(참조: 국제공개공보 제WO 2006037606호).
부형제인 폴리올에 의한 안정화
다수의 당(예: 슈크로스, 글루코스, 라피노스, 트레할로스) 및 폴리올(예: 글리세롤, 솔비톨, 만니톨)을 단백질 안정화 공용매의 범주하에 포함시킨다. 이러한 물질들은 주로 입체 배제 메카니즘을 통해 작용한다고 널리 믿어진다. 예를 들면, 폴리올, 예를 들면, 솔비톨은 흔히 비경구 물질, 예를 들면, 얼마간의 동결건조된 백신 약제, 예를 들면, MumpsvaxTM, MeruvaxTM II 및 AttenuvaxTM 또는 정맥내 투여가능한 용액, 예를 들면, CardeneTM을 안정화시키는데 사용된다.
기타 부형제, 예를 들면, 계면활성제와 대조적으로, 당 및 폴리올은 이들의 완전한 안정화 전위를 전개하기 위해 고농도(> 0.5M)로 첨가해야 한다. 결과적으로, 50 및 100 mg/mL의 농도에서 솔비톨을 아달리무맙 용액에 첨가하고, 12주 저장에 적용했다(표 10).
[표 10]
12주 저장 동안 아달리무맙 용액 중의 미립자 물질 형성에 대한 솔비톨의 영향
Figure pct00013
솔비톨은, 솔비톨이 전혀 존재하지 않는 용액과 비교하여, 저장 동안 입자 형성 경향을 감소시킨다. 솔비톨 첨가량은 실질적으로 임의의 차이를 유도하지 않았다. 단량체 함량과 관련하여, 솔비톨의 안정화 효과는 밀접하게 농도 의존적인 것으로 밝혀졌다. NaCl의 존재는 단백질 안정성을 감소시킨다(표 11).
[표 11]
단백질 단량체의 함량에 의해 반영된, 솔비톨 농도에 의존적인 아달리무맙 안정성(수는 mg/mL로의 농도를 나타냄; 40℃에서 저장)
Figure pct00014
표 11에 따라서, 100 mg/mL의 솔비톨의 첨가는 단량체 내용물의 함량을 40℃에서 12주 저장 동안 약 1.5% 증가시켰다. 부형제의 양을 감소시키면 아달리무맙 안정성의 감소를 유도한다. 이러한 발견은 말 면역글로불린의 안정성에 대한 최근 조사를 확증하고, 여기서 180 mg/mL 솔비톨은 열 스트레스에 대해 단백질 안정화와 관련하여 90 mg/mL의 첨가에 비해 우수한 것으로 나타났다[참조: Rodrigues-Silva et al., 1999 Toxicon 37(1), 33-45]. 당 및 당 유도된 폴리올의 안정화의 농도 의존성이 보고되었다[참조: Chan et al. (1996) Pharm. Res., 13:756-761; Fatouros et al. (1997b) Pharm. Res., 14:1679-1684]. 흥미롭게도, 4 mg/mL 염의 첨가는 표 11에 제시된 바와 같이, 솔비톨의 안정화 전위(약 0.25% 단량체)를 현저하게 손상시킨다. 한편, 0.1% Tween 80을 함유하는 아달리무맙 용액에 NaCl의 부재는 저장 기간 실험 동안 단량체 함량에서 단지 최소한의 증가를 유도했다(표 11에 제시된 바와 같음).
표 12에 제시된 바와 같이, 실험은 솔비톨 대신 만니톨로 반복했다. 솔비톨에 대한 발견은 만니톨을 아달리무맙 용액에 첨가함으로써 확증되었다: (1) 80 mg/mL의 만니톨 풍부 용액은 단백질 단량체 함량이 12주 저장(40℃) 후 만니톨 부재 용액을 약 1.5% 초과하고, (2) 만니톨의 안정화 유입은 농도 의존 프로파일을 향해 배향되고, (3) NaCl은 만니톨 단독의 감소 단량체 함량을 감소시킨다. 흥미롭게도, 이들 데이터는 25℃에서 수행된 동일한 실험에 의해 확증되었다.
[표 12]
단백질 단량체의 함량에 의해 반영된, 만니톨 농도에 의존적인 아달리무맙 안정성(수는 mg/mL의 농도를 나타냄; 40℃에서 저장)
Figure pct00015
요약하면, 50 mg/mL의 농도에서 아달리무맙은 솔비톨 및 만니톨 모두에 의해 안정화되었다. 이 안정화는 NaCl에 의해 방해된다. NaCl이 0.1% Tween 80을 함유하는 단백질 용액에 첨가될 경우 아달리무맙 안정성을 방해하지 않는다는 발견은 상기 결론과 일치했다.
표 13에 제시된 바와 같이, 각 아달리무맙 제형 중의 본래의 단량체의 양은 폴리올의 첨가 및 부형제 복합체에 의존적이었다. 적당하게, 응집물 및 단편의 양은 가변적이다. 단량체 손실량을 공유하는 응집물은, 존재할 경우, 첨가된 부형제와 무관하에 일정하게 잔류했다. 즉, 아달리무맙:단편의 비는 균형을 이루었고(즉, 약 38% 응집물 및 약 72% 단편), 이 평형 상태는 폴리올 및 염의 첨가에 의해 영향을 받지 않았다. 솔비톨 및 만니톨이 단지 본래 상태 안정화를 통해 아달리무맙 안정성에 기여했다면, 이는 응집물 공유의 변경에 반영되어야 한다. 이것이 그렇지 않았기 때문에, 분할 공정의 방해를 유도하는 솔비톨/만니톨에 의한 아달리무맙 안정화의 추가의 메카니즘이 존재해야 한다.
[표 13]
40℃에서 12주 저장 후 아달리무맙 안정성에 대한 부형제 첨가의 영향(SE-HPLC를 통해 유도된 데이터)
Figure pct00016
결론적으로, 50 mg/mL의 농도에서의 아달리무맙은 만니톨 또는 솔비톨을 제형에 첨가함으로써 효과적으로 안정화되었다. 본래 상태 보호에 의한 단백질 안정성에 기여하는 것 이외에, 만니톨 및 솔비톨은 추가의 메카니즘을 통해 단백질을 안정화시키고, 이에 의해 장기간 저장 동안 분할을 감소시킨다.
부형제인 염에 의한 안정화
NaCl은 단백질 비경구 약물의 제형화에 가장 사용되는 염이다. 그럼에도 불구하고, 상기 결과는 50 mg/mL의 아달리무맙 농도에서, NaCl이 폴리올의 존재하에 아달리무맙 안정성을 방해하고, 유일한 부형제로서 단백질 안정성을 증가시키지 않았음을 나타낸다. 염의 잠재적 안정화 효과를 고려할 경우, 호프마이스터 소액성 계열(Hoffmeister lyotropic series)에 따르는 이들 거동의 고려는 개략적인 법칙(a rough rule of thumb)을 제공한다. 따라서, 나트륨 염 중에 카운터이온으로서 클로라이드 대신 음이온성 아세테이트의 사용이 조사되었다.
표 14에 예시된 바와 같이, 개별적인 용액(즉, 50 mg/mL 솔비톨/4 mg/mL Na-아세테이트, 50 mg/mL 솔비톨/4 mg/mL NaCl, 및 50 mg/mL 솔비톨, 염 불포함)은 상이한 단백질 안정성을 나타냈다. 단지 4주 저장(40℃) 후, NaCl 또는 나트륨 아세테이트를 함유하는 제형의 비교는 나트륨 아세테이트 풍부 배치 중의 단량체 함량이 NaCl 함유 제형의 단량체 함량보다 약 0.25% 크고, 12주 후 합해서 0.4% 초과의 차이에 달함을 보여주기 때문에, NaCl을 함유하는 아달리무맙 용액은 단백질 안정성에 필적했다. 결과적으로, 나트륨 아세테이트가 염화나트륨에 비해 아달리무맙 안정성에 더 기여했다. 그럼에도 불구하고, 염 부재 제형이 동일한 단량체 함량을 가졌기 때문에, 나트륨 아세테이트의 첨가는 단백질 안정화를 증가시키지 않았다.
[표 14]
염 첨가에 의존적인 솔비톨을 함유하는 용액 중의 아달리무맙의 안정성(수는 mg/mL의 농도를 나타냄; 40℃에서 저장)
Figure pct00017
두 기타 제형(50 mg/mL 솔비톨을 포함하는 제형 및 4 mg/mL NaCl의 염이 없는 제형)과 비교하여, 아세테이트 함유 제형은 1㎛를 초과하는 많은 수의 입자 (약 180,000/mL 대 <6,000/mL)를 나타냈다.
완충제 시스템을 또한 시험했고, 이에 의해 나트륨 및 칼륨 완충제 시스템이 가변 농도의 솔비톨과 비교했다. 표 15에 예시된 바와 같이, 인산칼륨 완충제에 용해된 아달리무맙의 안정성은 인산나트륨 완충제 중에서 측정된 바와 동일했다. 25℃에서 수행된 저장 시험 데이터는 이들 발견을 실증했다. 추가로, 두 완충제 시스템은 미립자 물질 오염에서 동일했다. 따라서, 인산칼륨은 액체 단백질 제형에서 바람직한 것으로 간주되었다.
[표 15]
양이온성 카운터 이온으로서 나트륨 및 칼륨을 사용하는 인산염 완충제 시스템 중의 아달리무맙 안정성(완충제 농도 약 10Mm, 수는 솔비톨 농도(mg/mL)를 나타냄; 40℃에서 저장)
Figure pct00018

요약하면, NaCl의 첨가는 50 mg/mL에서 아달리무맙 용액을 제형화하는 데에서 피해야 한다. 염의 존재가, 예를 들면, 삼투질 농도 때문에 바람직할 경우- 나트륨 아세테이트가 염화나트륨에 비해 이점을 갖는다. 유사하게, 칼륨계 인산염 완충제 시스템은 아달리무맙 안정성과 관련하여 인산나트륨 완충제 시스템과 동일했다.
요약하면, pH 5.2 용액 및 0.1% Tween 80의 첨가가 약 50 mg/mL에서 아달리무맙 용액에 대해 기타 대안에 비해 바람직했다. 동결/해동 연구 및 (가속화된) 저장 시험 후 단백질 안정성 및 미립자 물질 오염을 평가 기준으로서 사용했다. 또한, 폴리올, 예를 들면, 만니톨 및 솔비톨은 실질적으로 사실상 동일한 효능과 함께 단백질 안정성에 기여했다. 단백질 응집 및 분할 양쪽이 방해되었기 때문에, 본래 상태 단백질에서 우선적 축적이 유일한 안정화 경로가 아니었다. NaCl은 폴리올의 존재하에 단백질 안정성을 방해했다. 나트륨 아세테이트의 첨가는 단백질 안정성에 유해하게 영향을 미치지 않았다.
이러한 데이터는 50 mg/mL의 아달리무맙 농도에 대해 최종 삼투질 농도 약 300mosM/kg을 목적으로 하는 인산칼륨 완충제, pH 5.2, 0.1% Tween 80 및 약 50 mg/mL 만니톨 또는 솔비톨을 포함하는 제형을 제시했다.
실시예 2: 고농도 아달리무맙 제형
다음 실시예는 항-TNFa 항체 아달리무맙을 포함하는 약간의 고 단백질 농도 제형의 성분을 제공한다. 놀랍게도, 이하 기술된 제형은 고농도의 항체, 즉, 약 100 mg/mL에도 불구하고 약간의 유리한 특성을 가졌다.
탁도를 포함하는 제형의 다수의 특성(F1 내지 F6으로서 나타냄)을 통상의 50 mg/mL 아달리무맙 제형(F7)에 대해 연구했다. 용액의 탁도는 희석되지 않은 용액을 분석하여 측정했다. 탁도는 NTU 값(비탁계 탁도 단위; Nephelometric Turbidity Units)으로서 기록된다.
가시성 입자 오염은 독일 약물 코덱스(German Drug Codex)에 기술된 바와 같이 육안 검사로 측정했다. 서브가시성 입자는 USP에 따르는 광 불명료화 방법에 의해 모니터했다. 묽은 용액의 동적 광 산란 분석을 사용하여 수력학적 직경(입자의 크기 분포의 DLS 측정 세기 자기 상관 함수 및 다분산도 지수, PDI의 누적율 분석에 의해 계산된 평균 또는 Z-평균 크기로서 기록됨)을 평가했다.
제형의 물리화학적 안정성은 단편 및 응집물의 검출을 허용하는 SEC로 평가했다. 화학적 안정성을 모니터하기 위해, SE-HPLC(단편의 검출 및 가수분해 표본) 및 CEX-HPLC(양이온 교환 HPLC)을 사용했다. CEX-HPLC는 저장 도중 형성될 수 있는 상이한 리신 아이소폼 및 저품질 제품(예: 탈아미드화 및 산화된 종)을 분해한다.
시험된 제형은 상이한 폴리올과 염화나트륨으로 제형화되거나 염화나트륨 없이 제형화된, pH 5.2 내지 pH 6.0에 이르는 상이한 매트릭스에 100 mg/mL의 아달리무맙을 함유하는 F1-F6(표 16)으로서 참조된다.
[표 16]
아달리무맙 제형 F1-F7의 성분
Figure pct00019
상기 100 mg/mL 제형(F1-F7)을 추가로 연구하여 실시예 3 내지 6에서 이하 기술된 바와 같이, 전체 안정성 및 점도를 특성화했다.
다음은 특히 예시적 용액 F2 및 F6과 관련하여 고농도 아달리무맙 제형을 제조하는 방법에 대한 설명이다. 출발 용액은 액체 완충제, 예를 들면, 선행하는 제조 공정 단계로부터 생성되는 완충제 중의 저농도(본 발명의 고농도 이하)에서 정제된 항체의 용액이다. 이러한 경우, 아달리무맙 용액은 pH 5.2에서 계면활성제 없는 F7과 동일한 완충제 시스템에 약 70 mg/mL의 농도로 제공했다. 이어서, 출발 용액을 농축시키고, 한외여과에 의해, 바람직하게는 접선-유동 여과 시스템 중에서 항체를 정량적으로 유지시킬 수 있는 막을 사용하여, 예를 들면, 10kD의 컷오프로 정용여과했다.
예로써, 대표적인 제형 F2 및 F6은 농축물을 정용여과 완충제로서 계면활성제가 없는 상응하는 매트릭스를 사용하여 약 50mg/L로 희석시켜 제조했다. 연속 완충제 교환을 접선 유동 여과 시스템을 사용하여 수행했다. 정용여과는 일반적으로 일정한 보유물 용적에서 적어도 5용적, 또는 바람직하게는 8용적의 정용여과 완충제로 수행했다. 최종 단계에서, 정용여과 용액을 고농도로, 예를 들면, 150 mg/mL 이상으로 추가로 농축시켰다. 이어서, 튜브를 정용여과 완충제로 플러싱하여 한외여과 시스템으로부터 회수했다. 각각의 양의 폴리솔베이트 80을 첨가하고 정용여과 완충제를 사용하여 표적 단백질 농도로 조정한 후, 고농도 액체를 수득하고, 이는 투명 내지 약간 유백광이었다. 0.22㎛ 필터를 통해 여과 후, 용액은 약 2-8℃에서 저장할 경우, 적어도 약 12개월 동안 안정했다.
실시예 3: 동결/해동 스트레스에 대한 고농도 아달리무맙 제형의 안정성
아달리무맙 제형이 100 mg/mL 단백질 농도에서 안정하다는 것을 입증하기 위해, 동결/해동 스트레스(동결은 -80℃에서 수행하고, 해동은 25℃에서 수행함) 실험을 수행했다.
입자 형성에 민감한 다수의 분석 방법은 잠재적인 물리적 불안정성을 검출하는데 사용되었다. 탁도는 콜로이드성 또는 가시 영역 중의 입자 응집물의 전개의 지표로서 측정되었다. 탁도(NTU 값으로 기록됨)는 동결/해동의 제4 사이클 후에도 현저하게 변하지 않았다(도 3). 고 pH 용액의 증가된 탁도는 단백질의 pI(아달리무맙 8.5)에 근접하는 pH에서 저하된 전하 반발작용에 기인하는 증가된 단백질-단백질 상호작용에 기인할 수 있다[참조: Wang et al. (2007) J Pharm Sci 96 (1) 2457-2468].
동적 광 산란을 서브마이크론 범위의 입자 크기를 측정하는 방법으로서 사용했다. 크기 분포 측정 도중에 수득된 다분산도 지수 값을 콜로이드성 또는 ㎛ 크기 범위에서의 응집의 또다른 민감한 지표로서 사용했다. 탁도 데이터와 유사하게, 시험된 제형 중의 어떤 것도 임의의 물리적 불안정성의 신호를 나타내지 않았다(도 4).
또한, 크기 배제 데이터를 평가했다. 도 5는 응집물 수준을 도시한다. 어떤 물리-화학적 불안정성의 신호도 반복된 동결/해동 스트레스와 관련하여 검출되지 않았다.
동결/해동 처리가 상당한 단백질 변성 및 응집을 유도하여 가용성 및 불용성 응집물 형성을 유도할 수 있다는 것이 익히 공지되어 있다[참조: Parborji et al. (1994) Pharm Res 11 (5)764-771]. 본원에 제시된 모든 제형을 반복 동결 해동 처리에 적용했고, 결과는 제형 중의 어떤 것도 반복/해동 사이클(-80℃/25℃)에 민감하지 않았음을 입증했다. 모든 제형은 아달리무맙의 pI(즉, 8.5)에 근접한 제형의 높은 pH에도 불구하고, (초기 값과 비교하여 상당한 변화가 없는 모든 경우에) 이들의 pH와 무관하게 유사하게 안정했다.
상이한 완충제 용액과 비교하는 개별적인 연구로부터의 데이터는 이들 결과를 확인했다. 동결-해동 후 균질한 용액(즉, pH, 삼투질 농도, 밀도에서의 최소 구배를 갖는 용액)과 관련하여 가장 유리한 완충제 시스템 및 동결-해동 동안 최소 pH 이동은 NaCl이 첨가되지 않은 완충제 조성물임이 입증되었다(참조: 실시예 1). pH 6에서 제형화된 NaCl-부재 완충제 시스템은 평가된 모든 pH 수준의 최소 pH-이동을 갖는 것으로 입증되었다.
실시예 4: 아이소토나이저로서 상이한 폴리올을 함유하는 100 mg/mL 제형의 안정성
시차 주사 열량측정법(DSC)을 사용하여 일반적으로 안정성에 대해 100 mg/mL 아달리무맙 제형 모두를 시험했다. DSC 데이터는 VP 모세관 DSC 폼 마이크로칼을 사용하여 수득했다. 모든 실험은 다음 표준화 절차를 사용하여 1회 가열 작동으로 수행했다: 온도 범위: 20℃-90℃, 가열 속도: 1K/분, 단백질 농도 1 mg/mL).
높은 Tm 값은 일반적으로 증가된 배좌 안정성의 지표이다[참조: Singh et al. (2003) AAPS PharmSciTech 4 (3) article 42]. 도 6은 100 mg/mL 아달리무맙 제형에 대한 Tm 값을 제공한다. 이러한 데이터는 모든 제형이 높은 Tm 값을 달성한다는 것을 보여준다. 그러나, 염화나트륨 부재 제형(F2, F3, F5, F6)은 이러한 제형의 강건함을 지시하는 상당히 증가된 Tm 값을 나타냈다. 제형이 1 mg/mL에서 시험되었기 때문에, F1의 Tm 데이터는 F7의 데이터와 동일하고, 이에 의해 F7 제형에 비해 염화나트륨 없는 100 mg/mL 제형 또는 pH 6.0에서 개선된 안정성을 확인한다.
마그네틱 교반 바를 사용하는 교반 스트레스 모델을 사용하여 신규 아달리무맙 제형의 물리-화학적 불안정성을 검출했다. 이 익히 공지된 모델은 아달리무맙을 장기간 공기-액체 계면 전시에 적용할 뿐만 아니라 예상가능한 방식으로 가용성 및 불용성 단백질 응집물의 형성을 유도하는 관련 캐비테이션을 교반하여 스트레스를 유도한다.
일반적으로, 이들 각각의 pI(아달리무맙 pI 8.5, 저 순전하, 최소 정전 반발력)의 범위 중의 pH에서 제형화된 단백질은 감소된 반발력에 기인하여 공기-액체 계면 관련 응집에 더 민감하다. 추가로, 이온성 부형제, 예를 들면, 염화나트륨은 이들의 이온 차폐성에 기인하여 단백질 응집에서 역할을 한다. 소수성 유인력은 염화나트륨의 존재에 의해 감소되어 단백질-단백질 상호작용을 감소시키고, 콜로이드성 안정성을 증가시킬 수 있다[참조: Shire et al. (2004) J Pharm Sci, 93 (6)1390-1402].
탁도 데이터를 평가하여 교반 스트레스에 의해 유도된 응집물 형성을 검출했다. 표 17은 제형 조성 및 교반 시간과 관련하여 비탁계 값을 도시한다. F1-F3(낮은 pH 5.2에서 제형화됨)에 대한 초기 탁도 값은 (F1)을 함유하는 염화나트륨 및 NaCl 부재(F2, F3) 용액 사이의 차이를 입증했다. 대조적으로, 높은 pH 6.0의 조정된 용액(F4-F6)은 높은 탁도를 특징으로 했다. NaCl이 교반과 같은 기계적 스트레스 후 mAb 용액의 투명함을 감소시킬 수 있다고 당해 기술 분야에 공지되었다[참조: Fesinmeyer et al. (2009) Pharm Res, 26 (4)903-913].
[표 17]
제형 F1-F6의 탁도(NTU) 대 교반 시간
Figure pct00020
48시간 이상 동안 교반은 모든 시험 제형에서 탁도 값을 증가시켰다. 낮은 pH에서 NaCl-부재 제형은 교반에 의해 탁도를 증가시키는 극소의 경향이 있었다. 놀랍게도, 시험된 모든 100 mg/mL 제형은 저농도(50 mg/mL) 아달리무맙 제형에 비해 교반 후 상당히 감소된 탁도를 나타냈다(표 18).
일반적으로, AN 유백광 외관은 간단한 레일리 산란(Rayleigh scatter) 결과이고, 단백질 농도에 선형으로 관련된다. 그러나, 유백광 외관은 물리적 불안정을 유도하지 않는다[참조: Sukumar et al. (2004) Pharm Res 21 (7)1087-1093]. 50 mg/mL 아달리무맙 제형은 24시간 교반 후 63-130NTU 및 48시간 후 109-243NTU의 탁도를 나타내는 반면, 100 mg/mL 아달리무맙 제형은 27-63(24시간) 및 40-87(48시간) 범위의 값을 유도한다. 트로하이트 등(Treuheit et al.)의 문헌[참조: (2002) Pharm Res 19 (4)511-516]에 따라, 증가된 단백질 농도는 10 mg/mL 미만의 범위에서 OPC-Fc 용액에서의 공기-액체 계면 유도 응집을 감소시킨다. 유사한 결과가 키스 등(Kiese et al.)의 문헌[참조: (2008) J Pharm Sci 97 (10)4347 - 4366]에 의해 보고되었다. 예기치 않게, 신규 아달리무맙 제형은 보다 높은 단백질 농도 범위 100 mg/mL에서 증가된 교반 스트레스 안정성을 특징으로 한다.
따라서, 신규 제형의 안정성은 50 mg/mL 제형에 비해 증가되었다.
[표 18]
상이한 로트의 50 mg/mL 아달리무맙 제형(F7)을 사용하여 수행된 교반 스트레스 실험으로부터의 데이터
Figure pct00021

추가로, 크기 배제 크로마토그래피 데이터는 모든 100 mg/mL 제형이 48시간 저장 후 1% 미만의 응집물 수준을 갖는다는 것을 나타내어 신규 제형의 안정성의 청구항을 지지한다(도 7). 낮은 pH 및 염화나트륨의 부재가 또한 유리했다. 이 데이터는 신규 제형이 아달리무맙의 pI에 근접하는 pH 값에도 불구하고 안정하고, 높은 pH에서 낮은 순 전하가 일반적으로 불안정에서 첨가되는 것으로 간주되지만, NaCl의 부재가 유리하다는 놀라운 발견을 입증한다.
실시예 5: 염화나트륨, pH 5.2 및 6.0, 2개의 상이한 폴리올의 존재 및 부재하의 100 mg/mL 아달리무맙 제형의 장기간 안정성
신규 100 mg/mL 아달리무맙 제형을 장기간 저장에 적용하여 50 mg/mL 표준 제형에 비해 우수한 안정성을 입증했다. 5℃(통상 제품에 대해 권장된 저장 온도)에서 12개월 동안 안정성 데이터를 평가했다. 데이터는 사실 신규 제형이 감소된 안정성을 전혀 나타내지 않음을 제시한다(표 19).
SEC 및 IEX와 관련하여, 단량체 함량의 상당한 손실 또는 측정가능한 분해는 전혀 발생하지 않았다.
또한, 신규 아달리무맙 제형의 고단백질 농도에도 불구하고, 50 mg/mL 시판 아달리무맙 제형의 12M 데이터와 비교하여 서브가시성 범위에서 입자 오염과 관련하여 상당한 향상이 수득되었다. 서브가시성 미립자 오염(응집, 침전 및 일반적 물리적 불안정성 현상)에 대한 시험은 신규 아달리무맙 제형이 실질적으로 서브가시성 입자 부재로 존재한다는 것을 나타냈다. 최대 28(≥10) 및 최대 3(≥25)의 초기 입자는 50 mg/mL 제형 F7보다 상당히 적었다(각각 703 및 38).
추가로, 입자 수준은 12개월 안정성 시험 전반에 걸쳐 상당히 변하지 않았고, F7보다 상당히 낮은 수준에서 유지되었다.
약물 생성물 배치는 실질적으로 시험되는 모든 저장 조건에서 이들의 물리화학적 안정성과 관련하여 동등했다. 이는, 예를 들면, 물리적 안정성이 높은 단백질 농도에서 감소되는 경향이 있다는 것이 익히 허용되었기 때문에, 놀랍다[참조: Wang W. (1999) Int J Pharm 185:129-188].
[표 19]
F1-F7의 안정성 연구(T0/12M)의 분석 데이터의 비교
Figure pct00022
신규 100 mg/mL 제형의 증가된 저장 안정성의 결과를 입증하기 위해, 2개의 대표적인 제형 F2 및 F6을 가속화된 안정성 시험(5℃, 25℃, 40℃에서 3개월)에 적용하고, 시판되는 50 mg/mL 제형(등록 수행으로부터 대표적인 배치)와 비교했다. 이들 시험 결과를 도 8-13에 요약한다.
이들 배치로부터의 탁도 데이터는 100 mg/mL에서, 특히 낮은 pH 5.2에서 NaCl 부재 제형의 우수한 거동을 입증한다. 용액 중의 단백질 농도의 증가는 일반적으로 유백광을 증가시키는 것으로 공지되었고, 이에 의해 레일리 산란에 기인하는 탁도를 판독한다[참조: Sukumar et al. (2004) Pharm Res 21 (7)1087-1093]. 놀랍게도, 염화나트륨을 포함하지 않는 신규 제형은 50 mg/mL 제형의 동일 pH에서 유사한 탁도 수준을 나타냈다(도 8).
도 9-11은 신규 제형의 미립자 형성(가시성 및 서브가시성 입자)의 상세한 데이터를 제공한다. 안정성이 증가하는 놀라운 발견이 입증되었다. 사실, 승온에서 3개월 저장 후에도 서브가시성 및 가시성 입자 스코어 모두를 감소시킬 수 있었다.
도 12-13에 제공된 데이터는 SEC 분석 및 IEX를 사용하여 시험된 화학적 안정성 둘 다에 대한 임의의 안정성 문제를 나타내지 않기 때문에 100 mg/mL 제형의 안정성을 추가로 입증했다.
실시예 6: 50 mg/mL 아달리무맙 제형에 비해 100 mg/mL 아달리무맙 제형의 증가된 제조 가능성
이 실시예는 현재 시판되는 50 mg/mL 생성물에 비해 신규 100 mg/mL 아달리무맙 제형(대표적인 제형 F2 및 F6)의 개선된 가공 안정성에 관련된 데이터를 요약한다.
펌핑, 여과, 혼합, 충전-마무리 공정, 선적 또는 진탕에 의해 생성된 기계적 스트레스는 단백질을 공기-물 계면, 물질 표면 및 전단력에 노출시킴에 기인하는 변성 및 후속적인 응집을 유발할 수 있다[참조: Mahler at al. (2005) Eur J Pharm Biopharm 59:407-417; Shire et al. (2004) J Pharm Sci, 93 (6)1390-1402].
점도 값은 단백질 용액의 가공성을 특성화하는 기본적인 변수로서 초기에 측정했다. 표 20은 F1-F7 제형에 대해 수득된 점도 데이터를 제공한다. 단백질 농도를 증가시키면 50 mg/mL 제형(F7)에 비해 증가된 점도를 유도했다.
정전기 보호제 NaCl의 제거는, 특히 아달리무맙의 pI에 근접하는 pH에서 소수성 단백질 상호작용을 증가시키고, 이에 의해 점도를 증가시킬 것으로 기대된다. 이 효과는 NaCl 농도 < 200mM에서 가장 현저한 것으로 보고되었다[참조: Shire et al. (2004) J Pharm Sci, 93 (6)1390-1402].
그러나, 예기치 않게, 제형으로부터 NaCl(F1은 약 105mM NaCl을 함유한다)의 제거는 약 3.1-3.3mPas*s(F2, F3, F5 및 F6)의 비교적 낮은 점도 값을 유도했다. 이는 특히 높은 pH 값 6.0에서의 용액(F5 및 F6)에 대해 놀랍다.
요약하면, 모든 제형은 액체 충전-마무리 제조 작업에 최적인 범위의 점도를 특징으로 한다.
[표 20]
F1-F7의 25℃에서의 점도의 비교
Figure pct00023

무균 제조 공정 동안 멸균 여과에 의해 유도된 스트레스를 모방하는 실험실 모델에서, 100 mg/mL 아달리무맙을 함유하는 두 대표적인 신규 제형은 모든 제형이 여과 관련 전단 스트레스에 대해 안정했다는 것을 나타내는 분석 데이터를 제공했다. DLS 데이터는 고분자량 아집단의 저수준에 대한 민감한 지표인 다분산성 지수가 상당히 증가하지 않기 때문에, 어떤 고분자량 응집물의 전개 신호를 나타내지 않았다. DLS 측정이 구체적으로 크기 분포에서 고분자량 종, 예를 들면, 응집물의 적은 양을 검출하는데 사용되는데, 이는 이들 종이 높은 산란 세기(d6에 비례)를 포함하고, 이에 의해 ZAve 크기 분포의 지표로서 ZAve 및 다분산성 지수에 상당히 영향을 미칠 수 있기 때문이다. 추가로, SEC 데이터는 여과에 의한 응집 유도를 전혀 입증하지 않는다.
놀랍게도, 100 mg/mL 제형 조차 임의의 불안정성을 나타내지 않았다. 최악의 시나리오로서 다수의 멸균 여과후에도 가공가능성은 증가된 단백질 함량에도 불구하고 고수준에서 유지되었다.
[표 21]
멸균 여과 스트레스에 대한 안정성과 관련하여 F2, F6 및 F7를 비교하는 DLS 및 SEC 데이터
Figure pct00024

가공 관련 스트레스에 대한 신규 아달리무맙 제형의 높은 안정성을 추가로 입증하기 위해, 제형은 자기 교반 바의 상이한 교반 속도에 대한 이들의 거동을 비교하는 교반 스트레스 모델에서 시험했다(교반 스트레스는 혼합 공정 단계에서 제조 조건하에 발생한다).
교반 스트레스 내성의 비교는 100 mg/mL 단백질 농도에서 탁도의 증가를 전혀 나타내지 않았다(도 14). 염화나트륨 및 증가된 폴리올 함량이 없는 두 대표적인 100 mg/mL 제형은 모든 시험 교반 속도에서 pH 5.2에서 통상의 제형과 유사하게 거동한다. 높은 교반 속도에서, 모든 제형은 24시간 교반 후 약간 증가된 탁도 값을 나타내지만, 100 mg/mL에서 전단 스트레스에 기인하는 불안정성에 대한 현저하게 증가된 민감성은 전혀 검출되지 않았다.
DLS 측정에 의해 수득된 수력학적 변수의 변화의 비교는 유사한 결과를 유도했다. 두 100 mg/mL 제형은, 보다 높은 단백질 농도를 갖는 제형이 교반 스트레스에 보다 더 민감한 것으로 간주되지만, 50 mg/mL 제형과 유사하게 거동한다. 놀랍게도, 최고 pH를 갖는 제형 F2는 탁도 및 수력학적 직경 분석 모두에서 최저의 상대적 증가를 나타냈다(도 15).
보다 높은 단백질 농도에서 조차, 이러한 유사한 가공 안정성의 놀라운 발견은 펌핑 공정에 의해 유도된 스트레스를 모방하는 기계적 스트레스 모델로 추가로 확인되었다. 이러한 제조 공정의 최종 단계는 연동 펌핑에 의한 전단 스트레스를 포함하고, 이에 의해 용액 불안정성 위험을 증가시킨다. 또한, 탁도(도 16) 및 DLS(도 17)을 사용하여 수득된 데이터는 신규 100 mg/mL 제형이 입자 전개 반응을 경험하지 않고, 50 mg/mL 제형과 유사하게 안정하게 유지된다는 것을 확인했다. 응집물 형성을 유도하는 펌프 스트레스에 대한 민감성은 전혀 검출되지 않았다. 이 발견은 추가로 SEC 데이터에 의해 확인되었고, 이는 펌프 사이클과 관련하여 시험된 제형의 임의의 차이를 나타내지 않았다(도 18).
[표 22]
다수의 펌프 사이클 전 및 후의 F2, F6 및 F7 안정성을 비교하는 DLS 데이터(PDI)
Figure pct00025

다양한 충전 장치(회전 피스톤 및 연동 펌프)를 사용하여, 100 mg/mL 제형의 안정성 차이를 평가했다.
이러한 연구는 피스톤 펌프에서 발생된 높은 전단 스트레스가 특히 높은 pH에서 염화나트륨 함유 제형(F1 및 F4)에 대해 증가된 가시성 입자 계수를 유도한다는 것을 보여주었다. 유사한 결과는 최근 보슈, 우르슐라 제이.(Bausch, Ursula J.)[참조: Impact of filling processes on protein solutions. 2008, PhD Thesis, University of Basel, Faculty of Science; http://edoc.unibas.ch/845/1/DissB_8427.pdf]로부터, 그러나 단지 10 mg/mL의 리툭시맙 용액의 단백질 농도에서 보고되었다. 놀랍게도, 100 mg/mL 아달리무맙을 포함하는 염화나트륨 제형은 피스톤 펌프를 사용하는 고전단 조건하에 향상된 가공가능성을 나타냈다.
도 19-22는 증가된 가공 스트레스 조건에 대한 NaCl-함유 아달리무맙 용액의 증가된 민감도를 입증하는 입자 계수 및 탁도 데이터를 제공하고; DSC 시각적 스코어 방법에 따라 입자 크기 범위 ≥ 10㎛ 및 ≥ 25㎛의 측정은 비경구 약물에 대한 본질적인 품질 속성이다. 따라서, NaCl-부재 제형에서 서브가시성 입자의 감소는 상당한 제형 개선을 제공한다.
도 19에 도시된 바와 같이, 연동 충전은 충전(T0) 직후 및 저장 후 가시성 입자 생성을 유도하지 않았다. 대조적으로, 피스톤 충전은 pH 6.0에서 제형화된 용액에 대해 T0에서조차 상당한 입자 계수를 유도했다(도 20). 최고 값은 염화나트륨을 함유하는 F4에서 측정되는 반면, F5-F6은 상당한 낮은 스코어를 유도하여 가공 스트레스에 대한 염화나트륨 부재 제형의 개선된 안정성을 입증했다.
지지 결과는 탁도 측정에 의해 수득되었다(도 21-22). 피스톤 펌프를 사용하여 충전된 용액의 초기 값은 연동 충전 공정을 사용하여 충전된 값보다 더 높았다. 염화나트륨 부재 제형은 염화나트륨을 함유하는 제형보다 낮은 탁도를 유도했다. 또한, 피스톤 충전에 의한 전단 스트레스는 탁도와 관련하여 F4(염화나트륨 포함)를 F5 및 F6(염화암모늄을 포함하지 않음)으로부터 구별하도록 했다.
실시예 7: 염화나트륨 부재 제형에서 상이한 폴리올 농도의 비교
다음 100 mg/mL 아달리무맙을 함유하는 염화나트륨 부재 제형을 5℃에서 단기간 안정성에 대한 폴리올 농도의 영향에 대해 시험했다.
제형을 응집 및 입자 형성 경향과 관련하여 불량한 조건을 나타내기 위해 pH 6.0으로 조정했다.
[표 23]
실시예 6에서 시험된 제형의 개관
Figure pct00026

만니톨 또는 솔비톨을 42 mg/mL의 농도로 사용하여 염화나트륨 부재 용액의 긴장력 요건을 충족시켰다. 데이터는 이전에 사용된 농도 12 mg/mL와 비교하여, 두 폴리올은 용액의 삼투질 농도에 기여할 뿐만 아니라, 추가로 단백질 안정성에 상당한 영향을 가졌다는 것을 나타냈다.
안정성 데이터는 폴리올의 종류와 독립적으로, 높은 폴리올 농도에 대해 개선된 투명성을 제안했다. 일반적으로 최적이 아닌 것으로 등급화되는 조건하(예: 아달리무맙의 pI에 근접한 pH 6.0)에, 고 폴리올 농도의 제형은 5℃에서 4주의 짧은 저장 후 조차 개선된 투명성을 나타냈다. 이는 다수의 분석 방법으로 관찰되었다.
도 23은 시험된 제형의 투명성이 폴리올 농도를 증가시킴으로써 상당히 감소되었고, 시험 기간 동안 낮은 수준으로 유지시킬 수 있음을 나타낸다. 추가로, 5℃에서 4주 후, 높은 폴리올 농도에서 높은 단량체 함량을 유도하는 약간의 응집 감소가 관찰되었다(도 24 및 25). ≥10㎛ 범위의 서브가시성 입자가 높은 폴리올 농도에서 감소되었다(예: T0에서).
실시예 8: 인간 항-TNF-α 항체의 안정한 고 단백질 농도 제형 .
다양한 아달리무맙 제형은 가속 안정성 시험 조건 및 장기간 저장하에 권장된 저장 온도 조건에서 아달리무맙의 물리적 및 화학적 안정성을 유지하는 지속력에 대해 시험한다(하기 표 1 참조). 제형은 pH(pH 5.2 대 pH 6), 부형제 조건(예: 만니톨 또는 솔비톨 농도), 염/이온 세기 조건(예: NaCl 농도) 및 단백질 농도(50 mg/mL 대 100 mg/mL)가 상이한다.
[표 24]
하기 실시예에서 참조된 제형의 개관(모든 농도는 mg/mL를 나타냄)
Figure pct00027
표 2는 스트레스 온도 및 샘플 채취 시점의 개관을 제공한다. 제형 F2 및 F6은 각각 18개월 이상 및 12개월 이상에 대한 아달리무맙의 물리적 및 화학적 안정성을 유지하는 제형으로서 확인되었다. 제형의 부형제 NaCl을 만니톨(제형 F2) 및 솔비톨(제형 F6)으로 교환하는 것은 단백질 농도의 100% 증가(제형 F7의 50 mg/mL에서 제형 F2 및 F6의 100 mg/mL로)에도 불구하고 높은 안정화 효능을 전달한다. 놀랍게도, 두 제형에서의 물리적 안정성은 각각 12개월 및 18개월 이상 동안 유지되었다. 12개월 저장 후에도, 두 제형은 99% 이상의 단량체(SEC 데이터)를 함유했고, 응집 수준은 1% 미만이었다.
유사하게는, 단백질 약물 생성물에서 매우 종종 저장 수명 제한 인자인 화학적 안정성은 안정성 모니터링을 통해 유지되었는데, 이는 리신 변이체의 합계(L0+L1+L2)를 나타내는 안정성이 80%를 초과하기 때문이다.
단백질 제형의 물리적 및/또는 화학적 안정성의 모니터링에 적합한 것으로 당해 분야에서 인정되는 추가의 시험은 제형 F2 및 F6의 안정화 효능, 예를 들면, 이러한 안정성은 서브가시적(subvisible) 입자 시험, 탁도 측정, 시각 검사, 투명도 또는 착색 모니터링을 확인했다.
중요하게는, 항-TNF 중화 시험을 나타내는 효능은 두 제형이 완전 샘플 채취 스케쥴 전체에 걸쳐 아달리무맙의 효능을 유지했고, 데이터는 75 내지 125%의 높은 품질 수준 내에 존재함을 나타냈다.
[표 25]
다양한 개월 동안 다양한 온도에서 F2 및 F6 제형에 대해 수득한 안정성 데이터.
Figure pct00028
[표 26]
제형 F2 및 제형 F6의 선택된 안정성 시험 데이터 - 9개월 이하의 장기간
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
[표 27]
제형 F2 및 제형 F6의 선택된 안정성 시험 데이터 - 18개월 이하의 장기간
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036

실시예 9: 고농도 아달리무맙의 통증 연구
피하 주사에 의해 모노클로날 항체 치료를 제공한 환자는 주사 부위에 통증 또는 불쾌감을 경험할 수 있다[참조: Fransson, J.; Espander-Jansson, A. (1996) Journal of Pharmacy and Pharmacology 48(10), 1012-1015; Parham, S. M.; Pasieka, J. L. (1996) Can. J. Surg. 39, 31-35; Moriel E Z; Rajfer J (1993) The Journal of urology 149(5 Pt 2), 1299-300]. 환자 경험과 유사한 동물 모델을 사용하여 통증 및 내성 효과를 평가하고, 인체 사용 전에 가능한 제형 변형을 평가한다. 이용가능한 동물 모델은 단백질 제형의 특성 분화에 대한 이들의 적합성에 대해 평가한다. 측정은 주사 부위 상의 발 위축(주사 후 0 내지 10분에서), 기계적 이질통의 시험 및 온열성 통각(주사 후 30분)을 포함한다. 또한, 동물은 영향을 받은 발을 핥거나 흔드는 자극성 거동 및 주사 부위의 홍조 또는 팽윤에 대해 관찰한다.
위축 모델은 주사 부위 통증을 평가하기 위해 선택되고, 이를 사용하여 내성 및 통각에 대한 제형 조성물의 영향을 평가한다.
다양한 아달리무맙 100 mg/mL 제형의 내성을 제형 F7(50 mg/mL 아달리무맙 제형)과 비교했다. 생성된 데이터는 50 mg/mL 제형(F7)과 비교하여 피하 주사 후에 주사 부위에서 100 mg/mL 제형의 개선된 내성에 대한 놀라운 발견을 뒷받침했다.
신규한 100 mg/mL 제형을 최적화하여 주사 부위에서와 같은 피하 주사 관련 부작용을 감소시켰다. 주사 부위 통증은 니들로 찌르는 것과 관련된 통증 및 서브Q 디포트 내로 용액의 주입과 관련된 감각 둘 다를 포함한다. 문헌에서 입수가능한 데이터는 특정한 니들 설계가 주사 부위 불쾌감의 감소에 유리할 수 있음을 시사하지만, 제형 관여에 대한 어떠한 명백한 데이터도 이용할 수 없다[참조: Chan, G.C.F., et al. (2003) American Journal of Hematology 76(4):398 - 404].
랫트 통증 모델을 사용하는 본원 발명의 데이터는 신규한 100 mg/mL 제형이 현재 시판되는 Humira？제형과 비교하여 유사한 치료학적 용량의 피하 주사 후에 주사 부위 통증의 감소에 효과적임을 암시했다. 이는 신규한 100 mg/mL 제형의 감소된 주사 용적에 의해 달성되며, 환자 치료의 최적화 및 환자 순응도의 증가에 대한 매우 유용한 이점을 나타낸다.
동시에, 본 발명자들은 100 mg/mL 제형의 제형화에 허용되는 범위의 제형 pH가 주사 부위 통증에 영향을 미치지 않음을 관찰했다. 흥미롭게는, 생리학적 pH 범위로부터 유래하는 pH 값이 보다 낮을 수록 유사한 내성으로 투여될 수 있다.
내성 시험에 적용된 방법:
발 위축 및 자극 거동 분석
성장한 암컷 스프라그 다울리 랫트를 우측 뒷발에 시험 용액의 족저내(s.c.) 주사 전에 20 내지 30분 동안 시험 조건에 순응시켰다. 발 위축의 수는 자극 거동(발 보호 또는 핥기)에 소비된 시간을 주사 후 처음 10분 동안 정량화했음에 주목했다. 모든 시험 용액은 달리 명시하지 않는 한 총 150 ㎕ 용적으로 주사했다. 실험을 코드화하고, 블라인드 랜덤화 방식으로 수행했다. 염수 및 캡사이신(2.5 ㎍)을 각각 음성 및 양성 대조군으로서 사용했다.
용적 효과
발 위축 반응에 대한 주사 용적의 효과를 위약 및 시험 제형 F7 모두에서 시험했다. 반응이 물리적 용적의 저하에 의해 완화되는지를 측정하기 위해, 위축 결과에 대한 상이한 주사 용적(10 ㎕, 50 ㎕ 및 150 ㎕ 족저내)의 효과를 시험했다.
시험 데이터는 용적 효과의 하기 요약을 가능하게 한다: 위축은 염수(4±2)와 비교하여 위약 (32±12) 및 F7 둘 다에서 150㎕에서 현저히 증가했지만, 보다 작은 용적의 염수로부터 구별할 수 없었다. 150㎕의 보다 높은 주사 용적은 보다 높은 위축 반응을 일정하게 생성하는 반면, 보다 낮은 용적(10㎕ 및 50㎕)는 현저히 낮은 반응을 생성했다.
이러한 결과는 주사물 용적의 감소가 덜 자극적임을 암시하고, 이는 F2 및 F6과 같은 고농도 제형이 보다 저농도 제형(예: F7)과 비교하여 내성 및 통각과 관련하여 유리함을 암시한다.
ㆍ 위약 주사에 대한 주사 0 내지 10분 후의 발 위축 수:
ㆍ
Figure pct00037

ㆍ 활성 주사에 대한 주사 0 내지 10분 후의 발 위축 수:
Figure pct00038

실시예 10: 내성/통증에 대한 아달리무맙 함유 용액의 pH 효과
추가의 실험은 아달리무맙 함유 활성 용액으로 수행했다. 시험된 제형은 생리학적 조건에 보다 근접한 pH 값의 상응하는 제형인 F2(pH 5.2), F5 및 F7이었다.
데이터는 pH가 발 위축 반응 및 자극 거동에 소비된 시간을 사용하여 측정한 동물 반응에 영향을 미치지 않음을 암시했다. 양성 및 음성 대조군 데이터는 예상된 범위 내에 포함된다. 보다 낮은 제형 pH(즉, 산성)이 비경구 투여, 특히 피하 주사시에 불내성 및 통각의 위험을 증가시킬 수 있음은 문헌에 기재되어 있다. 따러서, F2 및 F5 아달리무맙 제형의 경우, 제형 pH가 내성 및/또는 통각에 영향을 미치지 않았음은 놀라운 것이다. 이는 제형 pH, 물리적 안정성 및 응집 수준(면역원성 위험과 잠재적으로 관련됨) 등의 다른 파라미터를 제형 결정과 관련하여 높은 우선순위로 하기 때문에 매우 유리하다.
ㆍ 자극 거동에 소비된 시간 데이터[초]:
Figure pct00039
ㆍ 주사 0 내지 10분 후에 발 위축 수:
ㆍ
Figure pct00040
실시예 11: 아달리무맙 비함유 용액의 제형 pH 효과의 영향
제형 조성의 영향(예를 들면, 포스페이트 등의 완충제, 만니톨 등의 부형제 또는 폴리솔베이트 80 등의 계면활성제의 영향)을 시험하기 위해, 유사한 데이터를 단백질 비함유 제형으로 수득하는 추가의 실험을 수행했다. 상이한 pH를 갖는 제형에 대해 관찰된 위축 반응이 유사했기 때문에, 약 5 내지 7의 범위로 상이한 위약 용액의 pH는 놀랍게도 통증의 완화에 영향을 갖지 않았다. 앞서 설명한 바와 같이, 이는 제형업자가 제형 pH, 물리적 안정성 및 응집물 수준(면역원성 위험과 잠재적으로 관련됨) 등의 다른 파라미터를 제형 결정과 관련하여 높은 우선순위로 하기 때문에 생물학적 약물 제품 제형 개발에 매우 유리하다.
ㆍ 위약 주사에 대한 주사 10분 후의 발 위축 수:
Figure pct00041
요약하면, 상기 제시된 데이터는 이들 고 단백질 농도의 점성 용액이 내성의 감소 및/또는 통각의 증가 없이 pH 범위에 걸쳐 보다 낮은 용적으로 투여될 수 있다는 점에서 100 mg/mL 아달리무맙 제형의 이점을 명백히 증명한다.
참조에 의한 도입
본원 전체에 걸쳐 인용될 수 있는 모든 인용 문헌(예를 들면, 문헌 참조, 특허, 특허원 및 웹사이트 포함)의 내용은 이에 의해 임의 목적을 위해 이들의 전체가 참조로서 명백히 도입된다. 본 발명의 실시는, 달리 명시되지 않는 한, 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상의 단백질 제형 기술을 사용할 것이다.
등가물
본 발명은 이의 정신 또는 실질적인 특징을 벗어나지 않고도 다른 특정한 형태로 실시될 수 있다. 따라서, 상기 양태는 본원에 기재된 본원 발명을 한정하는 것이 아니라 모든 점에서 예시적인 것으로 간주되어야 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명에 의하기보다는 첨부된 특허청구범위에 의해 나타내어지며, 특허청구범위의 등가의 의미 및 범위 내에 포함되는 모든 변화도 본원에 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Abbott Biotechnology Ltd. <120> STABLE HIGH PROTEIN CONCENTRATION FORMULATIONS OF HUMAN ANTI-TNF-ALPHA ANTIBODIES <130> 117813-90620 <150> US 61/175380 <151> 2009-05-04 <160> 37 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> adalimumab light chain variable region <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> adalimumab heavy chain variable region <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 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Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr 85 90 95 Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 10 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2SD4 heavy chain variable region <400> 10 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Ala Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ala Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Lys Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Asn Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2SD4 light chain variable region CDR3 <400> 11 Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Ala 1 5 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Claims (42)

  1. 약 20 mg 초과의 폴리올과 약 100 mg/mL 이상의 인간 항-TNF-α 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 액체 약제학적 제형으로서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 서열번호 3으로서 기재된 아미노산 서열 또는 위치 1, 4, 5, 7 또는 8에서의 단일 알라닌 치환에 의해 서열번호 3으로부터 변형되거나 위치 1, 3, 4, 6, 7, 8 및/또는 9에서의 1 내지 5개의 보존적 아미노산 치환에 의해 변형된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 4로서 기재된 아미노산 서열 또는 위치 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 또는 11에서의 단일 알라닌 치환에 의해 서열번호 4로부터 변형되거나 위치 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 및/또는 12에서의 1 내지 5개의 보존적 아미노산 치환에 의해 변형된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하고,
    상기 제형은 부형제 NaCl을 함유하지 않는, 액체 약제학적 제형.
  2. 제1항에 있어서, 약 30 mg 초과의 폴리올을 포함하는, 액체 약제학적 제형.
  3. 제1항에 있어서 약 40 mg 초과의 폴리올을 포함하는, 액체 약제학적 제형.
  4. 제1항에 있어서, 약 40 내지 45 mg의 폴리올을 포함하는, 액체 약제학적 제형.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 폴리올이 당 알콜인, 액체 약제학적 제형.
  6. 제5항에 있어서, 당 알콜이 만니톨 또는 솔비톨인, 액체 약제학적 제형.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 항체가 인간 IgG1 카파 항체인, 액체 약제학적 제형.
  8. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 항체의 경쇄가 서열번호 5로서 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 서열번호 7로서 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 추가로 포함하고/하거나, 상기 인간 항체의 중쇄가 서열번호 6으로서 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 서열번호 8로서 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는, 액체 약제학적 제형.
  9. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 항체의 경쇄가 서열번호 1로서 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 인간 항체의 중쇄가 서열번호 2로서 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 액체 약제학적 제형.
  10. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 아달리무맙인, 액체 약제학적 제형.
  11. pH가 약 5.0 내지 6.4이고,
    서열번호 3으로서 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 4로서 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 약 100 mg/mL 이상의 인간 항-TNF-α 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하고,
    NaCl을 함유하지 않으며, 표준 24시간 교반-스트레스 분석 후의 탁도가 약 60 NTU 미만인, 액체 약제학적 제형.
  12. pH가 약 5.0 내지 6.4이고,
    서열번호 3으로서 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 및 서열번호 4로서 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 약 100 mg/mL 이상의 인간 항-TNF-α 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하고,
    NaCl을 함유하지 않으며, 표준 48시간 교반-스트레스 분석 후의 탁도가 약 100 NTU 미만인, 액체 약제학적 제형.
  13. pH가 약 5.0 내지 6.4이고,
    서열번호 3으로서 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 및 서열번호 4로서 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 약 100 mg/mL 이상의 인간 항-TNF-α 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하고,
    NaCl을 함유하지 않으며, 5℃, 25℃ 또는 40℃에서 3개월 저장 후의 탁도가 약 40 NTU 미만인, 액체 약제학적 제형.
  14. 제11항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 약 20 mg 초과의 폴리올을 추가로 포함하는, 액체 약제학적 제형.
  15. 제11항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 약 30 mg 초과의 폴리올을 추가로 포함하는, 액체 약제학적 제형.
  16. 제11항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 약 40 mg 초과의 폴리올을 추가로 포함하는, 액체 약제학적 제형.
  17. 제11항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 약 40 내지 45 mg의 폴리올을 추가로 포함하는, 액체 약제학적 제형.
  18. 제13항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 폴리올이 당 알콜인, 액체 약제학적 제형.
  19. 제18항에 있어서, 당 알콜이 만니톨 또는 솔비톨인, 액체 약제학적 제형.
  20. 제11항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, pH가 약 5.0 내지 5.4 또는 약 5.8 내지 6.4인, 액체 약제학적 제형.
  21. 제11항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 있어서, 약 1% 미만의 응집 단백질을 갖는, 액체 약제학적 제형.
  22. 제11항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 항체가 인간 IgG1 카파 항체인, 액체 약제학적 제형.
  23. 제11항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 항체의 경쇄가 서열번호 5로서 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 서열번호 7로서 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 추가로 포함하고/하거나, 상기 인간 항체의 중쇄가 서열번호 6으로서 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 서열번호 8로서 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는, 액체 약제학적 제형.
  24. 제11항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 항체의 경쇄가 서열번호 1로서 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 인간 항체의 중쇄가 서열번호 2로서 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 액체 약제학적 제형.
  25. 제11항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 아달리무맙인, 액체 약제학적 제형.
  26. 서열번호 3으로서 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 및 서열번호 4로서 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는, 약 100 mg/mL 이상의 인간 항-TNF-α 항체 또는 이의 항원 결합 부분;
    약 20 mg/mL 초과의 당 알콜;
    약 0.1 내지 2.0 mg/mL의 계면활성제;
    약 1.15 내지 1.45 mg/mL의 시트르산＊H2O;
    약 0.2 내지 0.4 mg/mL의 나트륨 시트레이트 탈수화물;
    약 1.35 내지 1.75 mg/mL의 Na2HPO4＊2 H2O;
    약 0.75 내지 0.95 mg/mL의 NaH2PO4＊2 H2O를 포함하고,
    pH가 약 4.7 내지 6.5이며, NaCl을 포함하지 않는, 액체 약제학적 제형.
  27. 제26항에 있어서, 당 알콜이 만니톨 또는 솔비톨인, 액체 약제학적 제형.
  28. 제27항에 있어서, 약 40 내지 45 mg/mL의 만니톨 또는 솔비톨을 포함하는, 액체 약제학적 제형.
  29. 제26항에 있어서, 계면활성제가 폴리솔베이트 80인, 액체 약제학적 제형.
  30. 제29항에 있어서, 약 1 mg/mL의 폴리솔베이트 80을 포함하는, 액체 약제학적 제형.
  31. 제26항에 있어서 약 1.30 내지 1.31 mg/mL의 시트르산＊H2O를 포함하는, 액체 약제학적 제형.
  32. 제26항에 있어서, 약 0.30 내지 0.31 mg/mL의 나트륨 시트레이트 탈수화물을 포함하는, 액체 약제학적 제형.
  33. 제26항에 있어서, 약 1.50 내지 1.56 mg/mL의 Na2HPO4＊2H2O를 포함하는, 액체 약제학적 제형.
  34. 제26항에 있어서, 약 0.83 내지 0.89 mg/mL의 NaH2PO4＊2 H2O를 포함하는, 액체 약제학적 제형.
  35. 제26항에 있어서, pH가 약 5.2인, 액체 약제학적 제형.
  36. 제26항에 있어서, pH가 약 6.0인, 액체 약제학적 제형.
  37. 제26항 내지 제36항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 항체가 인간 IgG1 카파 항체인, 액체 약제학적 제형.
  38. 제26항 내지 제36항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 항체의 경쇄가 서열번호 5로서 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 서열번호 7로서 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 추가로 포함하고/하거나, 상기 인간 항체의 중쇄가 서열번호 6으로서 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 서열번호 8로서 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인을 포함하는, 액체 약제학적 제형.
  39. 제26항 내지 제36항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 항체의 경쇄가 서열번호 1로서 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 인간 항체의 중쇄가 서열번호 2로서 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 액체 약제학적 제형.
  40. 제26항 내지 제36항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 아달리무맙인, 액체 약제학적 제형.
  41. 제1항 내지 제40항 중의 어느 한 항에 있어서, 피하 투여에 적합한, 액체 약제학적 제형.
  42. 제1항 내지 제41항 중의 어느 한 항에 따르는 제형을 피검체에게 투여함을 포함하는, 피검체의 유해한 TNF α 활성과 관련된 장애를 치료하는 방법.
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