CN105051064A

CN105051064A - 抗TNF-α抗原结合蛋白

Info

Publication number: CN105051064A
Application number: CN201480017852.XA
Authority: CN
Inventors: G.科罗茨; S.莫拉尔-米特里卡
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd; GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Ltd
Priority date: 2013-01-24
Filing date: 2014-01-22
Publication date: 2015-11-11
Also published as: JP2016505633A; CA2898262A1; BR112015017619A2; RU2015130100A; WO2014114651A1; AU2014209994A1; KR20150110659A; US20150368333A1; EP2948473A1; WO2014114651A9; AU2014209994B2

Abstract

本发明提供了包含特异性结合TNF-α的抗原结合蛋白和组氨酸缓冲剂的液体制剂。例如，抗TNF抗体诸如阿达木单抗的新型变体，其相比阿达木单抗显示增加的对FcRn受体的结合或增加的半衰期。还提供了包含抗原结合蛋白的组合物以及这些组合物在治疗疾病和病症中的用途。

Description

抗TNF-α抗原结合蛋白

技术领域

本发明涉及抗TNF抗体的新型变体和这些抗原结合蛋白的制剂。

发明背景

在成年哺乳动物中FcRn也称为新生儿Fc受体，通过充当结合并挽救IgG同种型抗体不被降解的保护性受体在维持血清抗体水平中起重要作用。IgG分子被内皮细胞内吞，并且如果它们结合FcRn，则被回收出来进入循环。相反，不结合FcRn的IgG分子进入细胞并且靶向溶酶体途径，在那里它们被降解。

新生FcRn受体被认为涉及抗体清除和跨组织的转胞吞作用（参见，Junghans R.P (1997) Immunol.Res 16. 29-57和Ghetie 等(2000) Annu.Rev.Immunol. 18, 739-766）。

WO 9734631公开了包含具有增加的血清半衰期并且在Fc铰链区具有至少一个氨基酸替换的突变IgG分子的组合物。公开了在选自CH2结构域中编号252、254、256、309、311或315或CH3结构域中433或434的一个或多个氨基酸处的氨基酸替换。

WO 00/42072公开了包含具有改变的FcRn结合亲和力的变体Fc区域的多肽，其中所述多肽在Fc区的下列任意一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰：Fc区的238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、386,388、400、413、415、424,433、434,435、436、439和447。

WO 02/060919公开了包含在下列一个或多个位置含有氨基酸修饰的IgG恒定区的修饰的IgG：251、253、255、285-290、308-314、385-389和428-435。

WO 2004035752公开了IgG类的修饰的抗体，其中来自重链恒定区的选自氨基酸残基250、314和428的至少一个氨基酸残基与未修饰的IgG类抗体中存在的不同。

Shields 等 (2001, J Biol Chem ; 276:6591-604)使用丙氨酸扫描诱变以改变人IgG1抗体的Fc区中的残基并然后评价与人FcRn的结合。当变为丙氨酸时有效废除与FcRn的结合的位置包括I253、S254、H435和Y436。显示较不显著的结合减少的其它位置如下：E233-G236、R255、K288、L309、S415和H433。几个氨基酸位置当变为丙氨酸时展示FcRn结合的改善。

Dall'Acqua 等(2002, J Immunol.;169:5171-80)描述了人IgG1铰链-Fc片段噬菌体展示库相对小鼠FcRn的随机诱变和筛选。他们公开了位置251、252、254-256、308、309、311、312、314、385-387、389、428、433、434和436的随机诱变。

WO2006130834公开了修饰的IgG，所述IgG包含在下列一个或多个位置含有氨基酸修饰的IgG恒定区：252、254、256、433、434和436。

因此，已讨论将IgG抗体的Fc结构域的修饰作为增加治疗性抗体血清半衰期的手段。但是，很多这些修饰已表明具有变化并且有时相反导致不同的抗体。

作为治疗剂的抗原结合蛋白的施用需要以与蛋白的清除率和半衰期特征相关的规定的频率注射。

阿达木单抗是针对TNF-α的单克隆抗体，其用于治疗类风湿性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎和克罗恩病。其通过使用哺乳动物细胞表达系统的重组DNA技术生产。其由330个氨基酸组成并且具有约148千道尔顿的分子量。参见美国专利6090382。以0.5 mg/kg (~40 mg)的剂量，阿达木单抗的清除率据说是11至15mL/小时的范围，分布体积(V_ss)范围是5-6升，并且平均末期半衰期是约2周（产品特征总结可得自www.medicines.org.uk）。这些半衰期和清除率性质意味着目前的阿达木单抗需要每两周施用一次。在一些患者中，取决于疾病，可能必须施用负荷剂量（loading dose），诸如例如在银屑病患者中。此剂量可以不同于维持剂量（maintenance dose）。

阿达木单抗难以配制并且需要使用基于柠檬酸的缓冲剂。发明人已经发现本发明的抗体可以更容易配制入非基于柠檬酸的缓冲剂并且因此可以减少注射部位反应和注射疼痛的不良作用概况。

发明概述

在一个方面，本发明涉及包含TNF-α抗原结合蛋白和组氨酸缓冲剂的液体制剂。在进一步的方面，所述制剂不包含盐，并且又进一步所述缓冲剂可以包含下列的一种或多种、下列的组合，或所有下列：表面活性剂、螯合剂、多元醇、抗氧化剂和氨基酸。

在一方面，本发明涉及特异性结合TNF-α的包含CDRH1 (SEQ ID NO: 27)、CDRH2 (SEQ ID NO: 28)、CDRH3 (SEQ ID No: 29)、CDRL1 (SEQ ID NO: 30)、CDRL2 (SEQ ID NO: 31)和CDRL3 (SEQ ID NO: 32)的抗原结合蛋白，或其变体，其中所述变体相比CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3可以含有1、2、3或4个氨基酸替换、插入或缺失；以及相比人IgG1恒定区包含一个或多个氨基酸替换的人IgG1恒定区的新生儿Fc受体（FcRn）结合部分。

在进一步的方面，所述抗原结合蛋白相比包含SEQ ID No. 2的轻链序列和SEQ ID No. 12的重链序列的IgG具有增加的在pH6的FcRn结合亲和力和/或增加的半衰期。

说明书全文中，术语“人IgG1恒定区”涵盖本领域技术人员已知的所有同种异型和其变体。

在一方面，本发明涉及特异性结合TNF-α的包含CDRH1 (SEQ ID NO: 27)、CDRH2 (SEQ ID NO: 28)、CDRH3 (SEQ ID No: 29)、CDRL1 (SEQ ID NO: 30)、CDRL2 (SEQ ID NO: 31)和CDRL3 (SEQ ID NO: 32)的抗原结合蛋白，或其变体，其中所述变体相比CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3可以含有1、2、3或4个氨基酸替换、插入或缺失；以及相比人IgG1恒定区包含一个或多个氨基酸替换的人IgG1恒定区的新生儿Fc受体（FcRn）结合部分，其中所述抗原结合蛋白相比包含SEQ ID No. 2的轻链序列和SEQ ID No. 12的重链序列的IgG具有增加的半衰期，并且所述抗原结合蛋白可以每4周施用不超过1次以实现与通过相同剂量的包含SEQ ID No. 2的轻链序列和SEQ ID No. 12的重链序列的IgG每两周施用1次所实现的相当的平均稳态谷浓度。

在一方面，本发明涉及特异性结合TNF-α的包含CDRH1 (SEQ ID NO: 27)、CDRH2 (SEQ ID NO: 28)、CDRH3 (SEQ ID No: 29)、CDRL1 (SEQ ID NO: 30)、CDRL2 (SEQ ID NO: 31)和CDRL3 (SEQ ID NO: 32)的抗原结合蛋白，或其变体，其中所述变体相比CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3可以含有1、2、3或4个氨基酸替换、插入或缺失；以及相比人IgG1恒定区包含一个或多个氨基酸替换的人IgG1恒定区的FcRn结合部分，其中所述抗原结合蛋白相比具有相同的CDR而无这些修饰的抗TNF抗原结合蛋白在pH6具有2倍，或3倍，或4倍，或5倍，或6倍，或8倍或更多的对于FcRn的亲和力，如在25℃通过ProteOn XPR36蛋白相互作用阵列系统所评价，所述阵列系统具有固定化在芯片上的抗原结合蛋白。

在一个方面，本发明涉及抗原结合蛋白，其是包含SEQ ID No. 2的轻链序列和SEQ ID No. 12的重链序列的IgG的变体，其中所述抗原结合蛋白变体在IgG恒定区的Fc受体（FcRn）结合部分包含一个或多个替换，以增加抗原结合蛋白变体相比不含这些替换的IgG的半衰期，其中当所述变体以40 mg的单一剂量，以每4-8周的间隔施用给患者时，患者群体中的平均稳态谷浓度在给药间隔之间不落到4µg/mL以下或不落到5µg/mL以下。优选地，患者群体中的平均血清谷抗体浓度在给药间隔之间不落到6 μg /mL以下。优选地，当所述变体以40mg的单一剂量以每8周间隔施用给患者时，患者群体中的平均血清谷抗体浓度在给药间隔之间不落到5μg /mL以下。优选地，当所述变体以40mg的单一剂量以8周间隔施用给患者时，患者群体中的平均血清谷抗体浓度在给药间隔之间不落到4μg /mL以下，同时仍然提供最佳功效。优选地，当所述变体以40mg的单一剂量以每8周间隔施用给患者时，患者群体中的平均血清谷抗体浓度在给药间隔之间不落到3μg /mL以下，同时仍然提供最佳功效。

在一个方面，本发明涉及用于治疗疾病的如本文公开的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白可以施用给患者每4周不超过一次，以实现与通过相同剂量的包含SEQ ID No. 2的轻链序列和SEQ ID No. 12的重链序列的IgG每两周施用1次所实现的相当的平均稳态谷浓度。

在一个方面，本发明涉及治疗具有疾病的患者的方法，所述方法包括施用根据本发明的抗原结合蛋白。

在一个方面，本发明涉及编码根据本发明的抗原结合蛋白或其部分诸如重或轻链的核酸序列。在一个方面，本发明涉及编码根据本发明的抗原结合蛋白或其部分诸如重或轻链的表达载体。

在一个方面，本发明涉及包含编码根据本发明的抗原结合蛋白的核酸序列的宿主细胞。在一个方面，本发明涉及用于在治疗银屑病或类风湿关节炎中使用的根据本发明的抗原结合蛋白。

在一个方面，本发明涉及试剂盒，所述试剂盒包含本发明的抗原结合蛋白，并且任选地包含氨甲喋呤用于根据本发明的抗原结合蛋白与氨甲喋呤的伴随递送。

在一个方面，本发明涉及用于治疗早已用氨甲喋呤治疗的个体中类风湿关节炎的如本文公开的抗原结合蛋白，并涉及与氨甲喋呤组合用于治疗类风湿关节炎的抗原结合蛋白，其中所述组合同时、基本同时或顺序递送。

在一个方面，本发明涉及用于治疗早已用氨甲喋呤治疗的个体中银屑病的如本文公开的抗原结合蛋白，并涉及与氨甲喋呤组合用于治疗银屑病的抗原结合蛋白，其中所述组合同时、基本同时或顺序递送。

附图简述

图1——抗TNFα抗体与人TNFα的结合

图2——加速的应激研究后抗TNFα抗体与人TNFα的结合活性的分析

图3——在25%人血清中孵育2周后抗TNFα抗体与人TNFα的结合

图4——冻融后抗TNFα抗体与人TNFα的结合

图5——抗TNFα抗体对FcγRIIIa受体（a）结合人FcγRIIIa（缬氨酸158变体）（b）结合人FcγRIIIA（苯丙氨酸158变体）的分析

图6——BPC2604在雌性食蟹猴和pascolizumab在雄性食蟹猴中在单次静脉内注射（1小时输注）后平均剂量标准化的血浆浓度

图7——主要峰稳定性研究。

图8——Tm失稳。

图9——Tm稳定性研究

图10（A）物理稳定性[cIEF]：与热稳定性非线性相关。

图10（B）化学稳定性[SEC]：

图10（C）热力学/构象稳定性[DSC]:

图11——与NaCl的稳定性情况。

发明详述

在一个方面，本发明涉及包含TNF-α抗原结合蛋白和组氨酸缓冲剂的液体制剂。

在本发明的一个方面，所述液体制剂包含如本文所述的TNF-α抗原结合蛋白。

在进一步的方面，本发明涉及特异性结合TNF-α的新型抗原结合蛋白。特别是，本发明涉及抗TNF抗体诸如阿达木单抗的新型变体，其相比阿达木单抗显示增加的对FcRn受体的结合和/或增加的半衰期。阿达木单抗是包含SEQ ID No. 2的轻链序列和SEQ ID No. 12的重链序列的IgG单克隆抗体。

发明人已经发现如本文所述的对阿达木单抗的特定修饰显示在FcRn结合中特别的改善，如下面实施例所示。阿达木单抗的亲和力成熟的变体显示抗TNF-α结合和/或中和活性方面的改善。

本发明的新型抗原结合蛋白具有增加的对FcRn受体的结合和/或增加的半衰期和/或增加的平均滞留时间和/或减少的清除率。认为结合FcRn导致更长的体内血清保留。为了增加Fc蛋白的体内保留，在约pH6观察到结合亲和力的增加。在一个方面，本发明因此提供了具有优化的对FcRn的结合的抗原结合蛋白。

在一个方面，本发明的抗原结合蛋白的半衰期相比包含SEQ ID No. 2的轻链序列和SEQ ID No. 12的重链序列的IgG增加2-6倍，诸如2倍、3倍、4倍、5倍或6倍。优选地，本发明的抗原结合蛋白的半衰期相比包含SEQ ID No. 2的轻链序列和SEQ ID No. 12的重链序列的IgG增加3倍、4倍或更多。例如如果IgG是具有10天或10-20天范围的半衰期的阿达木单抗，则在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白显示约40-80天的半衰期。例如，抗原结合蛋白包含选自SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:163或SEQ ID NO:165或SEQ ID NO:167或SEQ ID NO:169的重链序列。

在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白在患者中施用每4周不超过一次，实现约2 μg/mL至约7 μg/mL之间的平均稳态谷浓度。优选地，所述平均稳态谷浓度是约4 μg/mL至约7 μg/mL之间，并且更优选约5 μg/mL至约6 μg/mL之间.

在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白在患者中施用每28天不超过一次，实现约2 μg/mL至约7 μg/mL之间的平均稳态谷浓度。优选地，所述平均稳态谷浓度是约4 μg/mL至约7 μg/mL之间，并且更优选约5 μg/mL至约6 μg/mL之间。

在本发明的一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白可以每4、5、6、7或8周施用1次以实现与通过阿达木单抗当以相同剂量每两周施用一次实现的平均稳态谷浓度相当的平均稳态谷浓度。

在本发明的所有方面的优选实施方案中，本发明的抗原结合蛋白可以每7或8周施用一次。

在本发明的一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白可以每25-80天，例如每40-60天，或例如每28、35、42、49或56天施用一次以实现与通过阿达木单抗当以相同剂量每14天施用一次实现的平均稳态谷浓度相当的平均稳态谷浓度。

在本发明的一个实施方案中，所述抗原结合蛋白可以每49-60天，例如每56天施用一次。

在本发明的所有方面的一个实施方案中，所述抗原结合蛋白在pH6具有2倍，或4倍，或6倍，或8倍或更多的对于人FcRn的亲和力，如在25℃通过ProteOn XPR36蛋白相互作用阵列系统所评价，其中所述抗体固定化在芯片上。优选地，所述抗原结合蛋白对于人FcRn具有约100至约500KD（nM）之间，诸如约130至约360KD（nM）之间，或约140至约250KD（nM）之间，或约140至约210KD（nM）之间的亲和力。

在一个实施方案中，所述抗原结合蛋白的清除率为约2至约10mL/小时，优选约2至约5mL/小时或2至4mL/小时，或2至3mL/小时，诸如约2、约2.5、3、4或5mL/小时。在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白显示比阿达木单抗低2倍、3倍、4倍或5倍的清除率。在一个实施方案中，对于根据本发明的抗原结合蛋白的清除率是在上文规定的范围或比约40mg人剂量的阿达木单抗低2倍、3倍、4倍或5倍。

在一个方面，本发明抗原结合蛋白是阿达木单抗（包含SEQ ID No. 2的轻链序列和SEQ ID No. 12的重链序列的IgG）的变体，所述变体在IgG恒定区的FcRn结合部分包含一个或多个替换，以增加所述变体相比阿达木单抗的半衰期，其中当所述变体以40 mg的单一剂量，以每4-8周的间隔优选每8周间隔施用给患者时，患者群体中的平均稳态谷浓度不落到5µg/mL以下。在一个实施方案中，患者群体中的平均稳态谷抗体浓度在给药间隔之间不落到6 μg /mL以下。

在一个进一步的实施方案中，所述抗原结合蛋白在所述抗原结合蛋白的Fc区包含至少一个氨基酸修饰，其中所述修饰相比阿达木单抗序列中相同位置在Fc区的250、252、254、256、257、259、308、428或434位中的一个或多个，其中Fc区中的氨基酸编号是Kabat中的EU索引。

野生型人IgG1在位置308-314具有氨基酸残基Val-Leu-His-Gln-Asp-Trp-Leu，在位置251-256具有氨基酸残基Leu-Met- Ile-Ser-Arg-Thr，在位置428-436具有氨基酸残基Met-His-Glu-Ala-Leu-His-Asn-HisTyr，在位置385-389具有氨基酸残基Gly-Gln-Pro-Glu-Asn。对于IgG2-4，残基编号可以不同。

在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白相比包含SEQ ID No. 13序列的人IgG1恒定区包含一个或多个氨基酸替换。

在一个实施方案中，人IgG1重链恒定区的FcRn结合部分中一个或多个氨基酸替换是在根据Kabat的EU索引编号的氨基酸残基252、254和256，并且在残基252的aa替换是用tyr、phe、tryp 或thr替换met；在残基254的aa替换是用thr替换ser；并且在残基256的aa替换是用ser、arg、glu、asp或thr替换thr。优选地，在残基252的aa替换是用thr替换；在残基254的aa替换是用thr替换，并且在残基256的替换是用glu替换。优选地，IgG1恒定区如SEQ ID No: 7所示。

在一个实施方案中，人IgG1恒定区的FcRn结合部分中一个或多个氨基酸替换是在根据Kabat的EU索引编号的氨基酸残基250和428，并且在残基250的aa替换是用glu或gln替换thr；在残基428的aa替换是用leu或phe替换met。优选地，在残基250的aa替换是用glu替换，并且在残基428的替换是用leu替换。优选地，IgG1恒定区如SEQ ID No: 16所示。

在一个实施方案中，人IgG1恒定区的FcRn结合部分中一个或多个氨基酸替换是在根据Kabat的EU索引编号的氨基酸残基428和/或434。优选地，在残基428的aa替换是用leu替换met，并且在残基434的替换是用ser替换asn。优选地，IgG1恒定区如SEQ ID No: 10所示。

在一个实施方案中，人IgG1恒定区的FcRn结合部分中一个或多个氨基酸替换是在根据Kabat的EU索引编号的氨基酸残基259或308。优选地，在残基259的替换是用ile替换val，并且在残基308的aa替换是用phe替换val。优选地，IgG1恒定区如SEQ ID No: 19或SEQ ID No: 22所示。

在一个实施方案中，人IgG1重链恒定区的FcRn结合部分中一个或多个氨基酸替换是如SEQ ID No: 25所示，在根据Kabat的EU索引编号的氨基酸残基257或434。

在一个实施方案中，人IgG1重链恒定区的FcRn结合部分中一个或多个氨基酸替换是在根据Kabat的EU索引编号的氨基酸残基433或434，例如所述残基是H433K和N434F。优选地，IgG1恒定区如SEQ ID No: 165或SEQ ID No: 167所示。

在一个实施方案中，所述抗原结合蛋白包含表A中所列的任意IgG1恒定区修饰。

在一个实施方案中，所述抗原结合蛋白是抗体。

在一个实施方案中，所述抗原结合蛋白包含SEQ ID NO: 6和/或SEQ ID NO: 3的可变区，或其变体，所述变体包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸替换、插入或缺失和/或在跨SEQ ID NO: 6和/或SEQ ID NO: 3的长度上共享至少90%的同一性。

在一个实施方案中，所述抗原结合蛋白包含如SEQ ID No: 5, 9或15所示的重链序列，任选地具有如SEQ ID No: 2所示的轻链序列。

在一个实施方案中，所述抗原结合蛋白包含如SEQ ID No: 78或80所示的重链可变区序列。

在一个实施方案中，所述抗原结合蛋白包含如SEQ ID No: 145或SEQ ID No: 146所示的重链序列，任选地具有如SEQ ID No: 148、150或152所示的轻链序列。

在一个实施方案中，所述抗原结合蛋白包含如SEQ ID No: 18或21所示的重链序列，任选地具有如SEQ ID No: 2所示的轻链序列。

在一个实施方案中，根据本发明的抗原结合蛋白包含表A中指定的任意可变区。在一个实施方案中，根据本发明的抗原结合蛋白包含具有表A所示的下列序列的重链可变区：cb1-3-VH、cb2-44-VH、cb1-39-VH、cb1-31-VH、cb2-11-VH、cb2-40-VH、cb2-35-VH、cb2-28-VH、cb2-38-VH、cb2-20-VH、cb1-8-VL或cb1-43-VL。

在一个实施方案中，根据本发明的抗原结合蛋白包含具有表A所示的下列序列的轻链可变区：cb1-45-VL、cb1-4-VL、cb1-41-VL、cb1-37-VL、cb1-39-VL、cb1-33-VL、cb1-35-VL、cb1-31-VL、cb1-29-VL、cb1-22-VL、cb1-23-VL、cb1-12-VL、cb1-10-VL、cb2-1-VL、cb2-11-VL、cb2-40-VL、cb2-35-VL、cb2-28-VL、cb2-20-VL、cb1-3-VL、cb2-6-VL或cb2-44-VL。

例如，根据本发明的抗原结合蛋白包含具有如表A所示cb1-3VH、cb2-44VH或cb2-6VL序列的可变区。

在一个实施方案中，根据本发明的抗原结合蛋白包含表A中指定的任意可变区。在一个实施方案中，根据本发明的抗原结合蛋白包含具有选自SEQ ID NO: 170或SEQ ID NO: 174或SEQ ID NO:178序列的重链可变区。

在一个实施方案中，根据本发明的抗原结合蛋白包含具有选自SEQ ID NO: 171或SEQ ID NO: 175或SEQ ID NO:179序列的轻链可变区。

在一个进一步的实施方案中，所述抗原结合蛋白包含表A中所列的任意IgG1恒定区修饰。

所有上述可变区或重链序列或轻链序列的变体也在本发明的范围之内，所述变体包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸替换、插入或缺失和/或跨任意这些序列的长度共享至少90%的同一性。

在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白包含CDRH3（SEQ ID No: 29）的变体，所述变体相比SEQ ID No: 29具有1、2、3或4个氨基酸替换。在一个实施方案中，变体CDRH3可具有如SEQ ID No. 40至49的任一所示的序列。

在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白包含CDRH1（SEQ ID No: 27）的变体，所述变体相比SEQ ID No: 27具有1或2个氨基酸替换。在一个实施方案中，变体CDRH1可具有如SEQ ID No. 33至38的任一所示的序列。

在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白包含CDRL1（SEQ ID No: 30）的变体，所述变体相比SEQ ID No: 30具有1、2或3个氨基酸替换。在一个实施方案中，变体CDRL1可具有如SEQ ID No. 50至61的任一所示的序列。

在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白包含CDRL2（SEQ ID No: 31）的变体，所述变体相比SEQ ID No: 31具有1、2或3个氨基酸替换。在一个实施方案中，变体CDRL2可具有如SEQ ID No. 62至72的任一所示的序列。

在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白包含CDRL3（SEQ ID No: 32）的变体，所述变体相比SEQ ID No: 32具有1、2或3个氨基酸替换。在一个实施方案中，变体CDRL3可具有如SEQ ID No. 73至76的任一所示的序列。

在一个实施方案中，本发明涉及这样的抗原结合蛋白，其特异性结合TNF-α，其包含选自下列的一个或多个或所有CDR：CDRH1 (SEQ ID NO: 27)、CDRH2 (SEQ ID NO: 28)、CDRH3 (SEQ ID No: 29)、CDRL1 (SEQ ID NO: 30)、CDRL2 (SEQ ID NO: 31)和 CDRL3 (SEQ ID NO: 32)；其中任意CDR可以是变体CDR，其相比CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3包含1、2、3或4个氨基酸替换、插入或缺失。在一个方面，本发明的抗原结合蛋白包含CDRH1、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中任意CDR可以是相比CDRH1、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3包含1、2、3或4个氨基酸替换、插入或缺失。在一个方面，本发明的抗原结合蛋白包含CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中任意CDR可以是相比CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3包含1、2、3或4个氨基酸替换、插入或缺失的变体CDR。

在一个方面，本发明涉及治疗具有疾病的人患者的方法，所述方法包括施用根据本发明的抗原结合蛋白。

本发明还涉及如本文公开的用于治疗人中的疾病的抗原结合蛋白。

本发明还涉及如本文公开的抗原结合蛋白在制造用于治疗疾病的药物中的用途，以及如本文公开的用于在疾病治疗中使用的抗原结合蛋白。

在一个实施方案中，通过本发明的抗原结合蛋白治疗的疾病是类风湿关节炎、多关节幼年特发性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎、脊椎关节病、克罗恩病或银屑病。

在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白与氨甲喋呤一起施用。氨甲喋呤可以在抗原结合蛋白之前、之后或同时或基本上同时递送。在一个优选实施方案中，本发明的抗原结合蛋白与氨甲喋呤一起施用给患有类风湿关节炎的患者。在一个实施方案中，将氨甲喋呤施用给接受本发明的抗原结合蛋白的患者以减少所述抗原结合蛋白的免疫原性效应。在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白施用给早已接受氨甲喋呤的患者。氨甲喋呤可以被另一种可接受的化合物替换，所述化合物减少对抗原结合蛋白的免疫应答，例如皮质类固醇。

在一个方面，本发明涉及治疗具有疾病的患者的方法，所述方法包括施用本发明的抗原结合蛋白。在一个实施方案中，所述方法包括以单一20、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80 mg剂量每4周不超过一次，优选每5、6、7或8周一次并且最优选每8周一次将所述抗原结合蛋白施用给患者。优选地，所述剂量是40至80mg，例如40mg。

本发明还提供编码本文公开任何氨基酸序列（包括本文所述任何抗原结合构建体的重链）的多核苷酸序列，和编码文所述任何抗原结合构建体的轻链的多核苷酸序列。这些多核苷酸表示对应等价多肽序列的编码序列，但是将明白这些多核苷酸序列可以与起始密码子、适当的信号序列和终止密码子一起克隆进表达载体。所述多核苷酸可以是DNA或RNA。

本发明还提供宿主细胞，例如重组、转化或转染的细胞，所述宿主细胞包括一种或多种编码本文所述任何抗原结合构建体的重链和/或轻链的多核苷酸。

本发明进一步提供包含如本文所述的抗原结合构建体和药学可接受的载体的药物组合物。

本发明进一步提供用于生产本文所述任何抗原结合构建体的方法，所述方法包括在无血清/化学上明确的/不含动物衍生组分的培养基中培养宿主细胞的步骤，所述宿主细胞包括第一和第二载体，所述第一载体包括编码本文所述任何抗原结合构建体的重链的多核苷酸并且所述第二载体包括编码本文所述任何抗原结合构建体的轻链的多核苷酸。或者，方法可以包括合适地在无血清/化学上明确的/不含动物衍生的组分的培养基中培养宿主细胞，所述宿主细胞包含载体，所述载体包含编码本文所述任意抗原结合构建体的重链的多核苷酸和编码本文所述任意抗原结合构建体的轻链的多核苷酸。

在另一个实施方案中，本发明包括通过根据本文所述修饰来修饰Fc而增加抗体半衰期的方法。

在另一个实施方案中，本发明包括如本文所述的抗原结合蛋白，其具有增强的FcRn结合并具有调节另一种效应器功能性质的一个或多个额外的替换、缺失或插入。

一旦通过所希望的方法表达，则随后通过使用适当的测定来检查本发明的抗原结合蛋白的体外活性。采用目前常规的ELISA和Biacore测定形式以评价所述抗原结合构建体对其靶的定性和定量结合。额外地，在后续人临床研究之前也可以使用其它体外测定验证中和效力，进行所述人临床研究以评价所述抗原结合蛋白在机体中的持续，不论通常的清除机制如何。

治疗的剂量和持续时间涉及本发明的分子在人循环中的相对持续时间，并且可以通过本领域技术人员基于本文提供信息根据治疗条件和患者的一般健康状况调整。为了实现最大治疗效力，预想可能需要在延长的时期内（例如4-6个月）重复给药（例如每4周、5周、6周、7周或8周一次）。

本发明的治疗剂的施用模式可以是任何合适的路线，其将试剂递送至宿主。所述抗原结合蛋白和本发明的药物组合物特别地可用于胃肠外施用，即，皮下（s.c.)、鞘内、腹膜内、肌内（i.m.）、静脉内（i.v.）或鼻内。在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白和药物组合物经由皮下自动注射器笔或皮下预填充注射器施用。

本发明的抗原结合蛋白可以制备成包含作为活性成分在药学可接受的载体中的有效量的本发明的抗原结合蛋白的药物组合物。在本发明的预防剂中，优选包含以即用于注射形式的抗原结合构建体优选在生理pH缓冲的水悬液或溶液。用于胃肠外施用的组合物将通常包含溶于药学可接受载体优选含水载体的本发明的抗原结合构建体或其混合物的溶液。可以采用各种水载体，例如0.9%盐水、0.3%甘氨酸等。这些溶液可以制成无菌的并且通常无微粒物质。这些溶液可以通过常规、熟知的灭菌技术（例如，过滤）灭菌。根据需要该组合物可包含药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，如pH调节剂和缓冲剂等。根据所选择的特定施用模式，在该药物制剂中的本发明抗原结合蛋白的浓度可以变化很大，即，从少于约0.5%，通常在或至少约1%到多如15或20wt%，并将主要基于流体体积、粘度等进行选择。

已有报道阿达木单抗难以以高浓度配制。WO2004016286描述了包含柠檬酸盐-磷酸盐缓冲剂和包括多元醇和去垢剂的其它成分的阿达木单抗制剂。2005年10月25日在PDA会议中陈述的口头报告“Humira® - from Development to Commercial Scale Production”报道了包含下列的制剂：（i）柠檬酸盐-磷酸盐缓冲剂；（ii）醋酸盐-磷酸盐缓冲剂；和（iii）磷酸盐缓冲剂。所测试的醋酸盐-磷酸盐缓冲剂展示对阿达木单抗最差的稳定效果。Curtis 等(2008) Current Medical Research and Opinion, Volume 27, p71-78报告使用可注射阿达木单抗在类风湿关节炎患者中的注射部位灼烧和刺痛感的发生。灼烧和刺痛感已部分归因于基于柠檬酸盐缓冲剂的制剂（Basic and Clinical Pharmacology & Toxicology, Volume 98, p218-221, 2006；和Journal of Pharmaceutical Sciences, Volume 97, p3051-3066, 2008）。但是，WO20100129469描述了仍然包含柠檬酸盐-磷酸盐缓冲剂和包括多元醇的其它组分而无氯化钠的高阿达木单抗浓度制剂。更近期的WO2012065072描述了包含表面活性剂和多元醇而无缓冲剂的阿达木单抗制剂，从而有效避免任何柠檬酸盐缓冲剂注射时的作用。

在一个实施方案中，提供了包含TNF-α抗原结合蛋白和组氨酸缓冲剂的液体制剂。

在进一步的实施方案中，TNF-α结合蛋白包含下列：选自SEQ ID NO:27或SEQ ID NO: 33-38的CDRH1和/或SEQ ID NO:28的CDRH2和/或选自SEQ ID NO:29或SEQ ID NO: 40-49的CDRH3和/或选自 SEQ ID NO:30或SEQ ID NO: 50-61的CDRL1和/或选自 SEQ ID NO:31或SEQ ID NO: 62-72的CDRL2和/或选自SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:73-76的CDRL3。例如，TNF-α抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:27的CDRH1和SEQ ID NO:28的CDRH2和SEQ ID NO:29的CDRH3和SEQ ID NO:30的CDRL1和选自SEQ ID NO:31的CDRL2和SEQ ID NO:32的CDRL3或其变体。

TNF-α抗原结合蛋白可以是阿达木单抗。TNF-α抗原结合蛋白可以是BPC1494。TNF-α抗原结合蛋白可以是BPC1496。

本文所述TNF-α抗原结合蛋白配制在组氨酸缓冲剂中。该制剂可以是以液体形式。该制剂可以进一步包含下列的一种或多种、下列的组合，或所有下列：表面活性剂、螯合剂、多元醇、抗氧化剂和氨基酸。TNF-α抗原结合蛋白以高浓度配制，例如以50 mg/mL。在一个实施方案中，所述制剂不包含盐。在另一个实施方案中，所述制剂不包含进一步的缓冲剂组分，例如柠檬酸盐，和/或磷酸盐，和/或醋酸盐。因此，本文所述制剂解决了以高浓度在稳定制剂中提供TNF-α抗原结合蛋白，特别是如表A所述TNF-α抗原结合蛋白的问题，并且避免基于柠檬酸盐的缓冲剂的灼烧和刺痛感效应，并且进一步地比目前描述的制剂更稳定。

在一个实施方案中，所述组氨酸缓冲剂制剂进一步包含表面活性剂和螯合剂。在另一个实施方案中，所述组氨酸缓冲剂制剂进一步包含表面活性剂和多元醇。在另一个实施方案中，所述组氨酸缓冲剂制剂进一步包含表面活性剂和氨基酸。在另一个实施方案中，所述组氨酸缓冲剂制剂进一步包含表面活性剂和抗氧化剂。在另一个实施方案中，所述组氨酸缓冲剂制剂进一步包含螯合剂和表面活性剂。在另一个实施方案中，所述组氨酸缓冲剂制剂进一步包含螯合剂和多元醇。在另一个实施方案中，所述组氨酸缓冲剂制剂进一步包含螯合剂和氨基酸。在另一个实施方案中，所述组氨酸缓冲剂制剂进一步包含多元醇和氨基酸。在另一个实施方案中，所述组氨酸缓冲剂制剂进一步包含抗氧化剂和多元醇。在另一个实施方案中，所述组氨酸缓冲剂制剂进一步包含抗氧化剂和螯合剂。在另一个实施方案中，所述组氨酸缓冲剂制剂进一步包含抗氧化剂和氨基酸。在另一个实施方案中，所述组氨酸缓冲剂制剂进一步包含多元醇和氨基酸。

在一个实施方案中，所述组氨酸缓冲剂制剂进一步包含表面活性剂、螯合剂和多元醇。在另一个实施方案中，所述组氨酸缓冲剂制剂进一步包含表面活性剂、螯合剂和氨基酸。在另一个实施方案中，所述组氨酸缓冲剂制剂进一步包含表面活性剂、多元醇和氨基酸。在另一个实施方案中，所述组氨酸缓冲剂制剂进一步包含螯合剂、多元醇和氨基酸。在另一个实施方案中，所述组氨酸缓冲剂制剂进一步包含螯合剂、多元醇和抗氧化剂。在另一个实施方案中，所述组氨酸缓冲剂制剂进一步包含氨基酸、多元醇和抗氧化剂。在另一个实施方案中，所述组氨酸缓冲剂制剂进一步包含表面活性剂、多元醇和抗氧化剂。在另一个实施方案中，所述组氨酸缓冲剂制剂进一步包含表面活性剂、多元醇和抗氧化剂。在另一个实施方案中，所述组氨酸缓冲剂制剂进一步包含表面活性剂、螯合剂和抗氧化剂。在另一个实施方案中，所述组氨酸缓冲剂制剂进一步包含表面活性剂、氨基酸和抗氧化剂。

在一个实施方案中，所述组氨酸缓冲剂制剂进一步包含表面活性剂、螯合剂、氨基酸和抗氧化剂。

在一个实施方案中，所述缓冲剂是组氨酸。这可以是以5至100mM组氨酸的浓度。组氨酸可以以10-80mM、10-50mM、20-40mM，或约20mM、约25mM、约30mM、约35mM或约40mM的量存在。在一个实施方案中，组氨酸以约30mM的浓度。

组氨酸缓冲液可以是单一缓冲剂。换句话说，所述制剂可以不包含另一种缓冲剂组分，诸如磷酸盐和/或柠檬酸盐和/或醋酸盐缓冲剂。由于一些原因，柠檬酸盐缓冲剂可对于所述制剂是有害的：（i）其可能不是良好的缓冲剂因为3个解离常数太接近，以至于不允许区别3个质子受体相；（ii）柠檬酸盐可以充当金属螯合剂，并且从而影响金属离子平衡；（iii）柠檬酸盐是柠檬酸循环的代谢物并且具有影响细胞代谢的潜力。

合适的表面活性剂（也称为去垢剂）可以包括，例如,聚山梨醇酯（例如聚山梨醇酯20或80），聚氧乙烯烷基醚诸如Brij35.RTM.，泊洛沙姆（例如泊洛沙姆188，泊洛沙姆407），吐温20，吐温80，克列莫佛A25，Sympatens ALM/ 230，和Mirj。在一个实施方案中，所述表面活性剂是聚山梨醇酯80。所述制剂可以包含0-0.1%浓度的聚山梨醇酯80。可选地，所述制剂可以包含0.01-0.1%浓度的聚山梨醇酯80（0.1-1mg/mL）。聚山梨醇酯80可以以0-0.04%、0.01-0.05%或0.01-0.03%，或约0.015%、约0.02%、约0.025%、约0.03%或约0.04%的量存在。在一个实施方案中，组氨酸以约0.02%的浓度。高浓度的聚山梨醇酯80，例如超过0.1%，可以对制剂是有害的，因为此表面活性剂可以包含高水平的氧化剂，其可以增加制剂储存时的氧化水平并且因此减少保质期。

合适的螯合剂可以包括EDTA和金属复合物（例如Zn-蛋白复合物）。在一个实施方案中，所述螯合剂是EDTA。所述制剂可以包含0-0.2mMEDTA的浓度。可选地，所述制剂可以包含0.02-0.2mMEDTA的浓度（0.00748-0.0748mg/mL）。EDTA可以以0.02-0.15 mM、0.02-0.1 mM、0.03-0.08 mM、或0.04-0.06 mM、或约0.03 mM、约0.04 mM、约0.05 mM、或约0.06 mM的量存在。在一个实施方案中，EDTA以约0.05mM的浓度（0.018mg/mL）。

在一个实施方案中，所述制剂不包含盐。但是，如果添加盐，则合适的盐可以包括任何形成盐的平衡离子，诸如钠。例如，可以使用氯化钠，或阴离子型醋酸盐代替氯作为钠盐中的平衡离子。在一个实施方案中，所述盐是氯化钠。所述制剂可以包含0-150mM浓度的氯化钠。可选地，所述制剂可以包含25-150mM浓度的氯化钠（1.461-5.84mg/mL）。氯化钠可以以35-150 mM、45-80 mM、25-70 mM、或45-60mM、或45mM、46mM、47mM、48mM、49mM、50mM、51mM、52mM、53mM、54mM、55mM的量存在。在一个实施方案中，氯化钠以约51mM的浓度（2.98mg/mL）。

合适的氨基酸可包括精氨酸和/或甘氨酸。所述制剂可以包含0.5-5%浓度的精氨酸游离碱（5-50mg/mL）。在其它实施方案中，精氨酸游离碱可以是0.5-4.0%、0.5-3.5%、0.5-3.0%、0.5-2.5%之间，或约0.5%、约0.75%、约1%、约1.5%、约2%或约3%。在一个实施方案中，精氨酸以约1%的浓度（10mg/mL）。1%的精氨酸是约57mM。在另一个实施方案中，精氨酸可以以0-100mM的量存在。精氨酸可以以25-75mM、40-80mM或50-75mM；约50mM，或约75mM的量存在。在一个实施方案中，精氨酸以50mM的浓度。在另一个实施方案中，精氨酸以75mM的浓度。可选地，或除了精氨酸之外，还可以在制剂中包含甘氨酸。如果使用甘氨酸作为精氨酸的替代物，则上述浓度范围可以同等地应用于甘氨酸。如果除了精氨酸之外还使用甘氨酸，则上述浓度范围应当是精氨酸加甘氨酸以所需变化比例的叠加量。

合适的多元醇可包括具有多个羟基的物质，和包括糖（还原性和非还原性糖），糖醇和糖酸。多元醇的例子包括果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖、棉子糖、甘露糖醇、木糖醇、赤藓醇、苏糖醇、山梨醇、甘油、L-葡糖酸和它们的金属盐。在一个实施方案中，本发明的制剂包括海藻糖。所述制剂可以包含0-300mM海藻糖的浓度。海藻糖可以以50-250mM、100-250mM或150-225mM；约150mM，或约225mM的量存在。在一个实施方案中，海藻糖以150mM的浓度。在另一个实施方案中，海藻糖以225mM的浓度。

合适的抗氧化剂可以包括甲硫氨酸、组氨酸、EDTA、硫代硫酸钠、过氧化氢酶或铂。组氨酸和EDTA的合适的浓度如上所述。所述制剂可以包含0-30mM浓度的甲硫氨酸。甲硫氨酸可以以1-20mM，或5-15mM，约5mM，约10mM，或约15mM的量存在。在一个实施方案中，甲硫氨酸以10mM的浓度。

在一个实施方案中，所述组氨酸缓冲剂制剂进一步包含下列的一种或多种，下列的组合，或所有下列：海藻糖、甲硫氨酸、聚山梨醇酯80、EDTA和精氨酸游离碱。例如，所述组氨酸缓冲剂制剂进一步包含海藻糖、甲硫氨酸和精氨酸。

制剂的pH可以调节到pH5.0-7.0。在一个实施方案中，所述制剂在pH5.0-6.5。在其它实施方案中，pH可以是pH5.0、5.5、6.0、6.5或7.0。可以使用NaOH或HCl调节pH至5.0、5.5、6.0、6.5或7.0。在一个实施方案中，所述pH是约6.0。

本文所述TNF-α抗原结合蛋白可以以20-300mg/mL的浓度范围配制。例如所述抗原结合蛋白可以以20-200 mg/mL或50-100 mg/mL或约40 mg/mL或约45 mg/mL或约50 mg/mL或约55 mg/mL或约60 mg/mL或约70 mg/mL或约80 mg/mL或约90 mg/mL或约100mg/mL的浓度存在。在一个实施方案中，TNF-α抗原结合蛋白以约50 mg/mL的浓度。

在一个实施方案中，所述制剂稳定至少1年、至少18个月，或至少2年，或至少3年。例如，所述制剂在约5℃的温度稳定至少1年，至少18个月，或至少2年。在另一个实施方案中，所述制剂在室温（约25℃）下稳定。例如，所述制剂在约25℃的温度稳定至少14周、至少12周、至少8周、至少2周、至少1周、至少6天、至少5天、至少4天、至少3天、至少2天或至少1天。在另一个实施方案中，所述制剂在约40℃的温度下稳定。例如，所述制剂在约40℃的温度稳定至少9周或至少4周。

因此，存在最小的可在室温下放置超过建议的时间用于注射的预填充装置中形成聚集物或低分子量片段的风险。聚集物是潜在的免疫原性的（参见The AAPS Journal 2006; 8 (3) Article 59 Themed Issue: Proceedings of the 2005 AAPS Biotec Open Forum on Aggregation of Protein Therapeutics, Guest Editor - Steve Shire, Effects of Protein Aggregates: An Immunologic Perspective）并且低分子量片段可以引发预先存在的自身抗体（参见J Immunol 2008; 181:3183-3192; Human Anti-IgG1 Hinge Autoantibodies Reconstitute the Effector Functions of Proteolytically Inactivated IgGs1）。

TNF-α抗原结合蛋白在液体制剂中的稳定性可以通过下列的任一或组合来进行评价：通过目视观察的外观、蛋白浓度（A280nm）、大小排阻层析（SEC）、毛细管等电聚焦（c-IEF），以及通过功能结合测定（ELISA）。例如可以使用单体、聚集物或片段或其组合的百分比来确定稳定性。在一个实施方案中，稳定的液体制剂是具有少于约10%，或少于约5%在制剂中作为聚集物存在的TNF-α抗原结合蛋白。制剂可以具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％的单体含量。所述制剂可在室温（约25℃）约2周后具有上述单体含量。所述制剂可在室温（约25℃）约1周后具有上述单体含量。所述制剂可在室温（约25℃）约1天后具有上述单体含量。应当理解最终单体含量将取决于开始材料的纯度而变化。因此在一个实施方案中，%聚集物的每年增加不超过1%。

BPC1494抗原结合蛋白是不多见的，因为其显示多种降解途径。这些包括聚集、片段化、脱酰胺和氧化。

因此使用基于组氨酸的缓冲剂被证明是非常有利的。

在本发明的一个方面，提供了一种液体制剂，其包含TNF-α抗原结合蛋白，其中所述TNF-α抗原结合蛋白包含根据SEQ ID No: 5的重链和根据SEQ ID No: 2的轻链，并且其中所述制剂含有：30 mM浓度的组氨酸；150mM浓度的海藻糖；50mM浓度的精氨酸；10mM浓度的甲硫氨酸；0.05mM浓度的EDTA；0.02%浓度的PS80；并且其中pH调节到约pH6.0。

在本发明的另一个方面，提供了一种液体制剂，其包含TNF-α抗原结合蛋白，其中所述TNF-α抗原结合蛋白包含根据SEQ ID No: 5的重链和根据SEQ ID No: 2的轻链，并且其中所述制剂含有：30 mM浓度的组氨酸；225mM浓度的海藻糖；75mM浓度的精氨酸；10mM浓度的甲硫氨酸；0.05mM浓度的EDTA；0.02%浓度的PS80；并且其中pH调节到约pH6.0。

因此，本发明用于注射的药物组合物可以制备成含有1mL无菌缓冲水，和约1mg至约100mg，例如约30mg至约100mg，或更优选地，约35mg至约80mg之间，诸如40、50、80或90mg的本发明的抗原结合构建体。用于制备可胃肠外施用的组合物的实际方法是熟知的，或将对于本领域技术人员是显而易见的，并且更详细地描述于，例如，Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania。对于可静脉内施用的本发明的抗原结合构建体制剂的制备，参见Lasmar U and Parkins D “The formulation of Biopharmaceutical products”, Pharma. Sci.Tech.today, page 129-137, Vol.3 (3^rd April 2000), Wang, W “Instability, stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals”, Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188, Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and B ed Ahern T.J., Manning M.C., New York, NY: Plenum Press (1992), Akers,M.J. “Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations”, J.Pharm Sci 91 (2002) 2283-2300, Imamura, K 等 “Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state”, J Pharm Sci 92 (2003) 266-274,Izutsu, Kkojima, S. “Excipient crystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying”, J Pharm. Pharmacol, 54 (2002) 1033-1039, Johnson, R, “Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein lyophilization”, J. Pharm. Sci, 91 (2002) 914-922。

优选地，以约40mg的剂量提供或使用本发明的抗原结合蛋白。优选地，所述抗原结合蛋白适合用于皮下递送并被皮下递送。也可以使用其它给药或施用路线，如本文公开的。

在一个实施方案中，根据本发明任何方面的抗原结合蛋白相比包含SEQ ID No. 2的轻链序列和SEQ ID No. 12的重链序列的IgG显示增加的平均停留时间。

可以通过各种体外测定表征修饰的IgG和包含IgG恒定区或其FcRn结合部分的分子的结合能力。Ward的PCT公开WO 97/34631详细公开了各种方法。例如，为了比较修饰的IgG或其片段结合FcRn的能力与野生型IgG结合FcRn的能力，所述修饰的IgG或其片段和野生型IgG可以是放射标记的并与FcRn表达细胞在体外反应。然后可以计数并比较结合细胞级分的放射活性。此测定使用的表达FcRn的细胞可以是内皮细胞系，包括衍生自B10.DBA/2小鼠的肺的小鼠肺毛细血管内皮细胞（B10，D2.PCE）和衍生自C3H/ HeJ小鼠的SV40转化的内皮细胞（SVEC）（Kim等，J Immunol., 40: 457-465,1994）。但是，也可以使用表达足够数目FcRn的其它类型的细胞，包括表达选择的品种的重组FcRn的哺乳动物细胞。可选地，对修饰的IgG的结合级分的放射活性或未修饰的IgG的结合级分的放射活性计数后，可以然后用去垢剂提取结合的分子，并且可以计算并比较每单位细胞数释放的百分比。

本发明的抗原结合蛋白对于FcRn的亲和力可以通过表面等离子共振（SPR）测量使用例如BIAcore2000（BIAcore Inc.）如先前所述（Popov 等, Mol. Immunol., 33: 493-502,1996; Karlsson 等, J Immunol. Methods, 145: 229-240,1991，两者均通过引用整体并入本文）进行测量。在此方法中，FcRn分子偶联到BIAcore传感芯片（例如，Pharmacia的CM5芯片）并且修饰的IgG对固定化的FcRn的结合以特定流速进行测量以获得传感图，使用BIA评价2.1软件，基于该软件可以计算修饰的IgG、恒定区、或其片段对FcRn的结合-和解离-速率。也可以通过简单的竞争结合测定来测量本发明的抗原结合蛋白和未修饰的IgG对于FcRn的相对亲和力。此外，还可以通过饱和研究和Scatchard分析来测量修饰的IgG或其片段以及野生型IgG对于FcRn的亲和力。

修饰的IgG或其片段通过FcRn跨细胞的转运可以在体外转运测定中使用放射标记的IgG或其片段和FcRn表达细胞并比较细胞单层一侧的放射活性与另一侧的放射活性来进行测量。可选地，这种转运可以在体内测量，通过用放射标记的修饰的IgG饲养10-14天龄的乳鼠并定期计数血液样品中的放射活性，其指示IgG通过小肠到循环（或任何其它靶组织，例如肺）的转运。为了测试IgG转运通过肠道的剂量依赖性抑制，将放射标记的和未标记的IgG以特定比例的混合物给予小鼠，并且可以定期测量血浆的放射活性（Kim 等, Eur. R Immunol., 24: 2429-2434,1994）。

抗原结合蛋白的半衰期可以通过药代动力学研究根据Kim等描述的方法（Eur. J. of Immuno. 24: 542,1994，其通过引用整体并入本文）进行测量。根据此方法，将放射标记的抗原结合蛋白静脉内注射入小鼠并且定期测量其血浆浓度作为时间的函数，例如注射后3分钟至72小时。这样获得的清除曲线应当是双相的。对于修饰的IgG或其片段的体内半衰期的确定，计算β-相的清除率并与未修饰的IgG的清除率比较。

可以测定本发明的抗原结合蛋白免疫特异性结合抗原的能力。这种测定可以在溶液中(例如，Houghten, BiolTechniques, 13: 412-421,1992)，在珠子上(Lam, Nature, 354: 82-84,1991），在芯片上(Fodor, Nature, 364: 555-556,1993)，在细菌上(美国专利号5,223,409)，在孢子上(美国专利号5,571,698; 5,403,484; 和5,223,409)，在质粒上(Cull 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 1865-1869,1992)或在噬菌体上(Scott and Smith, Science, 249: 386-390,1990; Devlin, Science, 249: 404-406,1990; Cwirla 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6378-6382, 1990; 和Felici, J : Mol. Biol., 222: 301-310, 1991) (这些参考文献的每一个通过引用以其整体并入本文)进行。然后可以测定已鉴定为免疫特异性结合抗原或其片段的抗体对于抗原的特异性亲和力。

可以通过本领域已知的方法测定本发明的抗原结合蛋白对于抗原的免疫特异性结合，和与其它抗原的交叉反应性。可以用于分析免疫特异性结合和交叉反应的免疫测定包括但不限于使用下列技术的竞争性和非竞争性测定系统：例如蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA（酶联免疫吸附测定）、“三明治”免疫测定、免疫沉淀测定法、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定法、凝集测定法、补体结合测定法、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定，仅举几例。这些测定是常规的和本领域熟知的（参见，例如Ausubel 等, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York，其通过引用整体并入本文）。下面简单描述了示例性的免疫测定（但不意欲限制）。

在优选的实施方案中，使用BIAcore动力学分析确定抗体对抗原的结合和解离速率。BIAcore动力学分析包括分析抗原从在其表面固定化抗体的芯片上结合和解离。

抗原结合蛋白：如本文所用的术语“抗原结合蛋白”包括指抗体、抗体片段和其它蛋白构建物，其能够结合TNF-α。

抗体：术语“抗体”在最广泛的意义下用于本文并包括指具有免疫球蛋白样结构域的分子，并且包括单克隆的、重组的、多克隆的、嵌合的、人源化的、双特异性的和异源缀合的抗体。

人IgG1重链恒定区：指自然发现的（包括等位变异）IgG1重链恒定区的人氨基酸序列。

“半衰期（t1/2）”指对于抗原结合蛋白的浓度达到其初始值一半所需的时间。蛋白的血清半衰期可以通过药代动力学研究根据Kim等描述的方法（Eur. J. of Immuno. 24: 542，）进行测量。根据此方法，将放射标记的蛋白静脉内注射入小鼠并且定期测量其血浆浓度作为时间的函数，例如注射后约3分钟至约72小时。药代动力学分析和确定分子半衰期的其它方法对于本领域技术人员会是熟悉的。详细可见于Kenneth, A 等: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Peters et al, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996)。参考文献还提及“Pharmacokinetics”, M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. ex edition (1982)，其描述药代动力学参数，诸如t α和t β半衰期和曲线下面积（AUC），以及“Clinical Pharmacokinetics: Concepts and Applications”, Rowland and Tozer, Third Edition (1995)。

“清除率（CL）”指每单位时间蛋白被不可逆清除的血浆的体积。清除率计算为剂量/AUC（AUC是曲线下面积或血浆药物浓度时间曲线下面积）。还可以通过将药物清除速率除以药物血浆浓度计算清除率（清除速率=CL*浓度）。

“平均停留时间（MRT）”是抗原结合蛋白在被不可逆消除之前停留在体内的平均时间。计算为MRT=AUMC/AUC。

“稳态浓度”（Css）是当由于连续的药物施用导致药物消除速率变得等于药物施用速率时达到的浓度。Css在峰和谷水平之间波动并以毫克/mL测量。“平均稳态谷浓度”指在给定时间整个患者群体中谷水平的平均。

“相当的平均稳态谷浓度”指与所述值相同或在所述值约10%-30%之内的平均稳态谷浓度。对于本发明的抗原结合蛋白相当的平均稳态谷浓度可以被认为是那些平均稳态谷浓度，其是用包含SEQ ID No. 2的轻链和SEQ ID No. 12的重链的IgG实现的平均稳态谷浓度的0.8至1.25倍。

可以从药物（例如，本发明的抗原结合蛋白）的血清浓度相对时间的曲线确定半衰期和AUC。可以通过房室或者非房室分析确定半衰期。例如可以使用WINNONLIN™分析包（可得自Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, USA）对曲线建模。在一个实施方案中，“半衰期”指终末半衰期。

特异性结合：在整个本说明书中使用的涉及本发明的抗原结合蛋白的术语“特异性结合”，指所述抗原结合蛋白结合TNF-α而与其它不相关蛋白无或不显著结合。但是该术语不排除这样的事实，抗原结合蛋白还可以与紧密相关的分子交叉反应。本文所述的抗原结合蛋白可以以比它们结合紧密相关分子高至少2、至少5、至少10、至少50、至少100或至少1000倍的亲和力结合TNF-α。

CDRs:

“CDR”定义为抗原结合蛋白的互补决定区氨基酸序列。这些是免疫球蛋白重和轻链的高变区。在免疫球蛋白的可变部分中有三个重链和三个轻链CDR（或CDR区）。因此，如本文所用的“CDR”可以指所有三种重链CDR，所有三种轻链CDR、所有重和所有轻链CDR、或至少两种CDR。

在整个此说明书中，可变区序列和全长抗体序列中的氨基酸残基根据Kabat编号规则编号。类似地，实施例中使用的术语“CDR”、“CDRL1”、“CDRL2”、、“CDRL3”、“CDRH1”、“CDRH2”、“CDRH3”按照Kabat编号规则。对于进一步的信息，参见Kabat 等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)。

变体的%同一性：术语“相同”或“序列同一性”指示当与适当插入或缺失进行最佳排列和比较时，两条核酸或氨基酸序列之间同一性的程度。本文所述变体可以与天然CDR或可变区序列在氨基酸水平具有90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性。

可以理解，本文所述特定实施方案以举例说明的方式显示，并且不作为本发明的限制。本发明的原理特征可以在不同实施方案中采用而不偏离本发明的范围。使用不超过常规研究，本领域技术人员将认识到或能够查明很多本文所述特定程序的等价方案。这些等价方案被认为在本发明的范围内并被权利要求所涵盖。说明书中提及的所有公开物和专利申请均指示本发明涉及的本领域技术人员的技术水平。所有这些公开物和专利申请通过引用并入本文，达到如同每个个别公开物或专利申请具体和个别地被指示通过引用并入的程度。当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”一起使用时，词语“一”或“一个”的使用指“一”，但是其也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或超过一个”的含义一致。权利要求中使用术语“或”用于指“和/或”，除非明确指示仅指替代物，或替代物被互相排除，尽管公开内容支持仅指替代物和“和/或”的定义。贯穿本申请，术语“约”用于表示数值包括对于装置误差的固有变化，所采用的确定值的方法，或者在研究受试者中存在的变化。

如在本说明书和权利要求中所使用的，词语“包含”（以及任何形式的包含，诸如“包含”和“包括”），“具有”（以及任何形式的具有，例如“具有”和“有”），“包括”（以及任何形式的包括，例如“包括”和“包括”）或“含有”（以及任何形式的含有，例如“包含”和“含有”）是包容性的或末端开放的并且不排除额外的，未陈述的要素或方法步骤。在一个方面，这些末端开放的术语也在它们的范围内包含限制的或封闭的定义，例如诸如“基本上由...组成”或“由...组成”。

如本文所用术语“或其组合”指该术语前所列举的术语的所有排列和组合。例如“A、B、C或其组合”意在包括A、B、C、AB、AC、BC或ABC的至少之一，并且如果在特定背景下顺序是重要的，则还有BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续此实例，明确包括的是包含一种或多种项目或术语的重复的组合，诸如 BB、AAA、AB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。本领域技术人员将理解在任何组合中通常对于项目或术语的数目没有限制，除非从上下文以其它方式显而易见。

本文所有公开的和请求保护的组合物和/或方法可以根据本公开制造和执行而无需过度实验。虽然本发明的组合物和方法已在优选的实施方案进行了描述，但对于本领域技术人员显而易见的是，各种变化可以应用于所述组合物和/或方法，以及本文所述方法的步骤或步骤的顺序，而不脱离本发明的概念，精神和范围。所有这些对于本领域技术人员显而易见的类似的替代和修改被认为是在本发明的精神，范围和概念之内，如由所附权利要求所限定的。

本文提到的所有文献通过引用以允许的最大程度并入。

公开内容的任何元素明确地预期，结合公开内容的任何其它元素，除非根据本申请的上下文以其它方式显而易见。

本发明进一步通过参考以下实施例进行描述，而不是限制本发明。

实施例

实施例1：抗体表达载体的克隆

编码抗TNFα抗体的可变重（VH）和可变轻（VL）结构域的DNA表达构建体先前从头制备，并且包括限制性位点用于克隆到哺乳动物表达载体中。重链和轻链可变区序列两者进行序列优化用于在哺乳动物细胞中表达（对于方法学，参见WO2009024567和Kotsopoulou 等, J Biotechnol (2010) 146: 186-193）。描述重和轻链可变区序列的信息可见于美国专利US6090382。为了生成本研究中使用的构建体，使用PCR扩增可变重结构域（VH）序列。PCR引物含有HindIII 和SpeI限制性位点以形成包含用于克隆入pTT哺乳动物表达载体的信号序列的VH结构域框架，所述哺乳动物表达载体包含人γ1恒定区。类似地，通过PCR扩增VL结构域序列，使用包含HindIII和BsiWI限制性位点的引物，以帮助克隆入包含人kappa恒定区的pTT哺乳动物表达载体。给予重链表达质粒编码SJC322，并给予轻链表达质粒质粒编码SJC321。

通过建立重叠的寡核苷酸和与上述那些类似的分子生物学技术从头制备编码在CDR区具有修饰的抗TNFα抗体的替代可变重和轻链区的DNA表达构建体（如Rajpal 等 PNAS (2005) 102(24): pg 8466-8471中所述）。所获得的编码变体cb1-3、cb2-6和cb2-44的重和轻链的质粒在表1中描述。

实施例2：Fc区的工程改造

使用Quikchange方案(Promega)，使用正向和反向引发引物以在编码pascolizumab（抗IL-4抗体）重链的质粒的人γ1恒定区引入修饰(M252Y/S254T/T256E和T250Q/M428L)。

如上文实施例1中所述，使用先前构建的密码子优化的载体作为模板生成编码抗TNFα抗体的VH结构域的PCR片段。所获得的片段使用HindIII 和 SpeI克隆到包含上面段落所述修饰的人γ1恒定区的pTT表达载体中。具有M252Y/S254T/T256E修饰的编码抗TNFα抗体的重链的质粒命名为SJC324。编码具有T250Q/M428L修饰的重链的质粒命名为SJC323。

使用Quikchange方案(Promega)，使用正向和反向引发引物以在抗TNFα重链表达载体SJC322的人γ1恒定区引入修饰。质粒SJC326编码在人γ1恒定区中包含M428L/N434S修饰的抗TNFα重链。质粒SJC328编码在人γ1恒定区中包含V308F修饰的抗TNFα重链。

实施例3：使用pTT附加型载体在HEK2936细胞中的抗体表达

编码上述重和轻链的表达质粒被瞬时共转染到HEK 2936E细胞。表达的抗体从上清液使用1mL HiTrap蛋白A柱（GE Healthcare）通过亲和层析纯化。下表1显示了产生的抗体的清单。

一些抗体也使用一组不同的表达载体在CHO细胞中表达。参见实施例13、14和15，关于用于分子生物学、表达和纯化的描述。

表1：表达的抗体的清单

实施例4：在直接结合ELISA中抗体对肿瘤坏死因子α的结合

进行结合ELISA以测试使用蛋白A纯化的所表达的抗体与重组肿瘤坏死因子α（TNFα）的结合。用重组人TNFα在0.1µg/mL包被ELISA板并用封闭溶液（4％BSA）封闭。加入纯化的抗体的各种稀释液（稀释在含0.05％吐温20 pH8.0的在T Tris缓冲盐水中的4％BSA中）并将板在室温下孵育1小时然后在去离子水中洗涤。通过加入在封闭溶液中的过氧化物酶标记的抗人κ轻链抗体（Sigma A7164）检测结合。将板在室温下孵育1小时然后在去离子水中洗涤。通过加入OPD底物（Sigma P9187）和显色液对板进行显色并通过加入2M HCl停止。在490nm用酶标仪测量吸光度并将平均吸光度相对浓度作图。结果显示在图1并证实所有抗体具有类似概况。

实施例5：在体外中和测定中L929中的抗体分析

使用该测定来测试抗体对中和TNF-α和抑制细胞死亡的中和能力。简而言之，L929细胞以10,000/孔接种到96孔平底板在100µl RPMI 1640 (w/o 酚红)中并在37℃，5％CO₂中孵育过夜。细胞用1.25µg/mL放线菌素D敏化1小时。对于中和实验，0.001-60µg/mL (0.0067- 400 nM)抗-TNF-α mAb与约2ng/mL (约0.05nM) TNF-α以1：1比例在室温下预孵育1小时。对于对照组，使用RPMI替代抗体。与放线菌素D预孵育1小时后，每孔加入20 µl抗体-抗原复合物。单独向孔加入10 µl培养基作为阴性对照。板在37℃，5％CO₂中孵育18小时。在此处理期后，通过细胞滴度-Glo发光测定试剂盒根据制造商的指导（Promega, Madison USA）确定细胞活力。对于L929测定，未知的细胞活力百分比表示为未处理组（作为100%）的百分比，并且IC50值通过Graphpad prism确定。抗体IC50值的差异通过单因素ANOVA（Newman–Keuls post hoc测试）评价并在P值小于0.05时认为是显著的。数据表示为一式两份测量的n=4个实验的平均± SEM。确定对于每个抗体的IC50值并列举在下表2中。结果显示所有测试的抗体的效价都是相当的。

表2：在L929中和测定中各种TNFα抗体的IC₅₀值

表3显示衍生自实验的IC50值。结果表明改进的抗TNFα 抗体(BPC1499, BPC1500, BPC1501)在此测定中显示相比BPC1492和阿达木单抗增加的效价。

表3：在L929中和测定中改进的TNFα抗体的IC₅₀值

实施例6：抗体对体外IL-6释放的效果

通过测量抗体对抑制TNF-α介导的IL-6从全血细胞释放的效果来确定抗体的中和活性。简而言之，将130 µL全血添加到每孔中并将板在37℃在湿化的5%CO₂培养箱中孵育1小时。对于中和实验，0.001-30µg/mL (0.0067- 200 nM)TNF-α mAb与10ng/mL (约0.4nM) TNF-α以1：1比例在4℃预孵育1小时。对于对照组，使用RPMI替代抗体。在此预孵育后，将20µl抗原-抗体复合物或RPMI（阴性对照）添加到每孔，并且板在37℃5%CO₂中孵育24小时。向每孔中加入100 µL PBS (w/o MgCl₂或CaCl₂)并置于板摇床上在500rpm 10分钟。然后将板在2000rpm离心5分钟。小心取出120 µL上清液并转到新的96孔圆底板并使用基于MSD的测定试剂盒（Meso Scale Diagnostics, Maryland USA）确定IL-6的释放。对于全血测定，对于每个样品的MSD信号使用MSD SECTOR® Imager 2400 读出，并且从细胞释放的IL-6使用PRISM 4.00软件（GraphPad. San Diego, USA）中标准数据分析包进行定量。每种抗体的IL-6抑制百分比表示为TNF-α单独处理组的百分比。因此，对于每种抗体获得剂量应答曲线并确定IC50值。使用IC50值的log，通过单因素ANOVA（Newman–Keuls post hoc测试）确定抗体效价的差异并在对于每种供体（n=3）少于0.05的P值认为是显著的。数据表示为一式两份测量的3个供体的平均± SEM。

下表4显示衍生自这些数据的IC50值。这些结果表明在所测试的抗体之间没有显著的效价差异。

表4：在TNFα–诱导的IL-6释放测定中各种抗TNF抗体的IC₅₀值

IC50值示于表5中。结果表明改进的抗TNFα 抗体(BPC1499, BPC1500, BPC1501)在此测定中显示增加的效价。

表5：在TNFα–诱导的IL-6释放测定中各种改进的抗TNF抗体的IC50值

实施例7：加速的应激研究

在研究之前，要测试的抗体在分光光度计上在OD280nm定量并在PBS（pH7.4）中稀释到1.1mg/mL。移出等分试样并加入10% v/v的500mM醋酸钠，以在pH5.5给出1mg/mL的终浓度并检查样品沉淀。在PBS中剩余的样品加入10%PBSv/v到1mg/mL的终浓度在pH7.4，并且移出此样品的等分试样以提供基线聚集水平（如通过大小排阻层析所监测的）。然后将样品在培养箱内在37℃孵育两周，之后将样品在分光光度计上在OD280nm重新定量并评价（通过大小排阻层析）聚集。在直接结合ELISA中测试样品的人TNFα结合。结果显示在图2中，并且证实所有测试的抗体的结合活性在加速的应激研究之后是相当的。

实施例8：25%人血清中的稳定性研究

在研究之前，要测试的抗体在分光光度计上在OD280nm定量并在PBS（pH7.4）中稀释到1.25mg/mL。移出等分试样并加入25%v/v的人血清以给出1mg/mL的终浓度。在PBS中剩余的样品加入25%PBSv/v到1mg/mL的终浓度，并且移出此样品的等分试样以提供基线聚集水平。然后将样品在培养箱内在37℃孵育两周，之后在直接结合ELISA中测试样品的人TNFα结合。结果显示在图3中，并且证实所有测试的抗体的结合活性在25%人血清中孵育两周之后是相当的。

实施例9：冻融后结合人TNFα的分析

抗体样品在包含50mM 醋酸盐和150mM NaCl (pH6.0)的缓冲液中稀释到1mg/mL，在干冰上速冻并然后在4℃融化过夜。测试抗体对人TNFα的结合并与没有被速冻的抗体进行比较。为了评价冻融后的结合活性，用1µg/mL的重组人TNFα包被ELISA板并用封闭液（在Tris缓冲盐中的4% BSA）封闭。将各种浓度添加到包被的板，并将板在室温下孵育1小时然后在去离子水中洗涤。通过加入在封闭溶液中的过氧化物酶标记的抗人κ轻链抗体（Sigma A7164）检测结合。将板在室温下孵育1小时然后在去离子水中洗涤。通过加入OPD底物（Sigma P9187）和显色液对板进行显色并通过加入2M HCl停止。在490nm用酶标仪测量吸光度并将平均吸光度相对浓度作图。结果显示在图4中，并且证实所有测试的抗体的结合活性在冻融后是相当的。

实施例10抗TNFα抗体对FcγRIIIa的结合分析

将ELISA板用1µg/mL的重组FcγRIIIa (V158和F158变体)包被并用封闭液（在Tris缓冲盐水中的4% BSA）封闭。将各种浓度添加到包被的板，并将板在室温下孵育1小时然后在去离子水中洗涤。通过加入在封闭溶液中的过氧化物酶标记的抗人κ轻链抗体（Sigma A7164）检测结合。将板在室温下孵育1小时然后在去离子水中洗涤。通过加入OPD底物（Sigma P9187）和显色液对板进行显色并通过加入2M HCl停止。在490nm用酶标仪测量吸光度并将平均吸光度相对浓度作图。结果显示在图5a和5b中，并且证实了BPC1494相比BPC1492和BPC1496具有减少的结合FcγRIIIa(V158和F158变体)的能力。

实施例11：ProteOn分析：FcRn结合

用于测试的抗体在GLC生物传感器芯片(BioRad 176-5011)上通过伯胺偶联固定化到类似的水平。使用在2048nM、512nM、128nM、32nM和8nM的重组人和食蟹猴FcRn作为分析物，使用单独的缓冲液注射（即，0nM）以双重参考结合曲线。FcRn注射后抗体表面的再生使用pH9.0的HBS-N，然后在ProteOn XPR36蛋白相互作用阵列系统在25℃运行测定，并且在HBS-N pH7.4和HBS-N pH6.0中用稀释在适当缓冲液中的FcRn运行。使用ProteOn分析软件固有的平衡模型计算亲和力，使用“Global R-max”用于在pH6.0的结合，并且来自pH6.0的结合的R-max用于在pH7.4的亲和力计算。因为结合曲线在pH7.4没有达到饱和，所获得的值不可能是真实的亲和力，但是它们可以用于对构建体排序。结果显示在表6中，并且证实BPC1494和BPC1496相比BPC1492对于人和食蟹猴FcRn在pH6.0具有改善的亲和力。

表6：抗TNFα构建体结合人和食蟹猴FcRn的亲和力

实施例12：人FcRn转基因小鼠中的PK研究。

在单独的剂量药代动力学研究中，BPC1494或BPC1492以1 mg/kg静脉内（IV）施用到FcRn人源化小鼠的不同品系中，并且一个品系是FcRn缺乏的（Petkova 等 Int. Immunol (2010) 18(12): 1759-1769）。根据需要使用验证的Gyrolab荧光免疫测定分析BPC1494或BPC1492的血浆样品。

该方法使用生物素化的人TNFα作为捕获抗原和Alexa标记的抗人IgG（Fc特异性）抗体作为检测抗体。使用用测定缓冲液1：10稀释的小鼠血浆的等分试样，定量低限（LLQ）为100 ng/mL，并且定量高限（HLQ）是100000 ng/mL。低于最低标准的血浆浓度被认为是不可定量的。以三个不同浓度制备并与研究样品储存的QC样品用针对分开制备的校正标准品的每个样品批次进行分析。对于可接受的分析，在每个浓度至少一个QC必须不能偏离标称浓度超过20%。来自此研究的QC结果符合这些接受标准。

通过非房室药代动力学分析使用WinNonLin, 版本6.1进行PK分析。所有计算使用标称血液取样时间。通过计算从给药开始直至最后可定量时间点（AUC_0-t）的血浆浓度时间曲线下面积（AUC）使用线性log梯形计算方法确定对BPC1494和BPC1492的系统暴露。由于样品标记的差异不能从样品衍生出进一步的PK参数。

表7——以1 mg/kg的目标剂量对转基因小鼠进行单次静脉内施用（推注）后对于BPC1494和BPC1492的药代动力学参数的总结

品系 1 = mFcRn-/- hFcRn (32) Tg/Tg

品系 2 = mFcRn-/- hFcRn (276) Tg/Tg Rag1-/-

品系 3 = mFcRn -/-/Rag1-/-。

对于所有组获得类似的C_max浓度。在两个人FcRn敲入小鼠品系中，BPC1494比BPC1492具有更高的暴露（AUC_0-t），尽管此差异不明显（1.3倍）。在不存在人和小鼠FcRn两者的情况下，BPC1492比BPC1494具有更高的暴露。

实施例13：抗体表达载体克隆入pEF载体

在一些情况下，对于重和轻链，编码表达盒的DNA使用标准的分子生物学技术使用HindIII和EcoRI从实施例3中描述的载体切下，并克隆到pEF载体中，其中从hEF1a启动子发生表达（对于载体的描述，参见Kotsopoulou 等 J. Biotechnol (2010) 146: 186-193）。

表8

实施例14：使用pEF表达载体在CHO细胞中的抗体表达

将编码重和轻链的表达质粒共转染到CHO DG44细胞中并规模表达以产生抗体。对于BPC1492的产生，使用质粒SJC329和SJC330。对于BPC1494的表达，使用质粒SJC329和SJC331。对于BPC1496的表达，使用质粒SJC332。

简而言之，将30µg DNA (15µg 重链和15µg轻链)用Not1限制性酶线性化过夜。然后将所获得的限制性酶切的DNA进行乙醇沉淀并重新溶解在TE缓冲液中。从培养物中，获得了6X10⁶CHO DG44细胞并在10mLPBS中洗涤。然后将细胞沉淀重新悬浮在300µl Amaxa 溶液V中。然后将上述细胞悬浮液100µl加入到3个Amaxa杯中的每一个，所述Amaxa杯还包含3µg线性化的DNA。将小杯插入Amaxa nucleofector II装置并用预先设置的程序U-023电转化。将电转化细胞的3个Amaxa杯中的内容物（300µl）添加到10mL温热的MR14培养基（包含核苷和BSA）中并在T75烧瓶中孵育48小时。在此阶段后，将培养基换为不含核苷的MR14（仅含BSA的MR14）。每3-4天，去除条件培养基并用新鲜的选择培养基替换。一旦细胞经历恢复，将培养基替换为2xMR14并通过nephlometry证实IgG表达。用1L以0.6X10⁶/mL表达IgG的细胞接种2L摇瓶并生长7天。通过离心从上清液分离细胞并将上清液用于蛋白质纯化。

1升细胞培养物上清液使用2步自动化过程在AKTA Xpress系统上纯化。抗体捕获在一个5mL MabSelectSure柱上，并然后在洗脱前先洗涤。然后将洗脱的抗体加载到440mL葡聚糖200凝胶过滤柱上，并将2mL级分收集到96孔块中。合并纯化的抗体的级分并经0.2µm过滤并然后使用Amicon旋转浓缩器浓缩到~5mg/mL。最终材料再一次用0.2µm过滤并然后分散到无菌试管中用于递送。最终材料进行分析型SEC，以确定聚集，内毒素测定，LC-MS用于精确质量确定（包括PNGaseF和未处理材料来确定糖基化），SDS PAGE电泳，PMF用于序列验证和A280用于浓度测定。

实施例15：使用pEF表达载体在CHO细胞中的抗体表达的替代方法

不含DHFR的CHO DG44细胞获自Columbia University的Chasin博士。这些细胞随后改造用于化学上确定的培养基。这些改造的宿主细胞称为DG44-c并且在补充有Glutamax和HT-增补剂专有化学上确定的培养基中培养。

多克隆合并物的产生：对于方案的更多细节参见WO2009024567和Kotsopoulou 等 J. Biotechnol (2010) 164(4): 186-193。简而言之，DG44-c细胞用编码重链和轻链和DHFR和neoR的质粒分别通过电转化（使用Amaxa nucleofector系统）转染。在转染后48小时，通过添加G418（以400µg/mL的终浓度）并去除HT开始选择。当活力和细胞计数增加足够（在此情况下，转染后2个月）时，以5nM的终浓度添加氨甲喋呤（MTX）。扩大细胞规模并在添加MTX后9-16天开始生产曲线。对于这些生产曲线，以0.6-0.8x10⁶个细胞/mL将细胞接种到化学上确定的培养基中，并在第6、9或10、12或13和/或16天补料。当活力下降到约50%时收集上清液，并且通过在4000g离心30分钟随后通过sartobran胶囊过滤去除细胞。

使用两步层析方法在室温纯化抗体：使用50mLMabSelect SuRe柱（GE Healthcare），随后通过大小排阻色谱法（SEC）用1.5L Superdex200 pg SEC（GE Healthcare）上进行初始捕获。以9cm/h的流速将条件培养基加载到预平衡的MabSelect SuRe柱上。用平衡缓冲液（50mm Tris pH 8.0, 2M NaCl）洗涤到基线后，柱用低盐缓冲剂缓冲液（50mM NaCl Tris pH 8.0, 150mM NaCl）洗涤，直至电导稳定。然后用洗脱缓冲液（25mM柠檬酸盐pH2.5）洗脱柱。对应于峰蛋白洗脱的级分立即用1/10 vol. 1.0M Tris pH 8.0中和，其然后合并并过滤通过0.2µm bottletop滤器。以21cm/h将回收的样品加载到SEC柱上，所述柱用SEC缓冲液（50mM 醋酸钠、150mM NaCl）预平衡。合并包含主要（单体）蛋白峰的级分并将滤器灭菌。

使用通过此方法制备的抗体用于下列实施例中总结的分析可比性研究。

实施例16：在应激的和对照样品上的分析可比性

进行大小排阻层析以确定蛋白的聚集水平。优选的方法涉及将样品注射到TOSOH TSK G3000SWXL柱上，所述柱已在100mM磷酸钠，400 mM NaCl，pH 6.8中平衡。在280nm和214nm测量吸收。反相HPLC基于疏水性分离蛋白和它们的同种型。将蛋白注射到PLRP-S 1000 °A 8µm 柱上，并使用通过50％甲酸和95％乙腈产生的梯度洗脱。在280nm测量吸收。该分子的纯度被报告为主要峰面积相对于总峰面积的百分比。使用毛细管等电聚焦（CIEF）基于它们的pI值分离mAb的不同同种型。在10cm，UV280透明盒毛细管柱进行IEF分离。优化的方法涉及含有5％的pH3-10的两性电解质，10mM氢氧化钠，目的蛋白和内部pI标记物（7.05和9.5）的溶液，通过压力注射将其加载到毛细管上。

使用MSD确定抗体（阿达木单抗，BPC1494，BPC1496）的比活性。简而言之，用每孔50µL在PBS中稀释到1 µg/mL的TNFα包被96孔板。将板在工作台上在环境温度下不摇动孵育2小时。去除包被液，并且用每孔50µL在PBS中的1%BSA与0.05%聚山梨醇酯20封闭板。板在24℃以400rpm摇动孵育1小时并然后用洗涤缓冲液洗涤4次。抗体稀释在PBS中的0.1%BSA与0.05%聚山梨醇酯20中，并且将30µl每种样品添加到板上。板在24℃以400rpm摇动孵育1小时。然后将板用洗涤缓冲液洗涤4次。将抗人IgG sulfotag1：5000稀释在测定缓冲液中。将30μL添加到板的每个孔，并且然后在24℃孵育1.5小时，并以400rpm摇动。然后将板用洗涤缓冲液洗涤4次。使用去离子水将4xMSD读出缓冲液浓缩物稀释到1x。然后将100µL加入到板的每孔中。然后使用MSD Sector 成像设备对板进行读数。根据从测定获得的信号，计算分子的比活性。

脱酰胺分析

脱酰胺是可以发生在天冬酰胺和谷氨酰胺残基上的常规翻译后修饰，但最经常在天冬酰胺残基观察到，特别是邻近甘氨酸残基的时候。为了检查这些残基如何易感，并确定脱酰胺对效价的影响，将阿达木单抗、BPC1494和BPC1496暴露于应激研究。通过在1％碳酸氢铵中在pH9.0孵育48小时的条件执行应激，所述条件先前已显示导致脱酰胺。应激样品与旁边的对照（在PBS中）一起孵育，并使用c-IEF，SEC和结合ELISA分析与该对照以及未应激的参考进行比较。在所有样品上在存在和不存在EDTA的情况下也完成了强制的脱酰胺。先前已经显示，强制的脱酰胺条件导致脱酰胺以及片段化。EDTA阻止和或最小化片段化。

氧化分析

各种残基的氧化可以在蛋白的整个加工和储存过程中发生；但是最经常氧化的残基是甲硫氨酸，其是此筛选的焦点。通过在5mM和50 mM H₂O₂中孵育30分钟暴露于应激条件检查这些残基的氧化易感性并使用RP-HPLC、SEC和ELISA评价。

结果总结

相比阿达木单抗，如通过分析可比性在应激和对照样品中所显示，BPC1494和BPC1496两者表现非常有利。如通过所有采用的分析技术所显示的，对于所有测试的抗体，在强制的氧化条件下没有观察到显著的降解。如通过c-IEF所测量在pH9.0观察到显著的脱酰胺，如对于所有测试的抗体所预期的。此外，如通过SEC在pH9.0所显示的，在无EDTA的样品中，我们看到所有测试的抗体显著的片段化，这也是如预期的。当与阿达木单抗相比时，在BPC1494的pI值中存在减少（约0.2）。这是归因于在BPC1494的重链序列中存在额外的谷氨酸残基从而使其更加酸性。强制的脱酰胺和氧化对结合具有最小的影响，这对于BPC1494、BPC1496 和阿达木单抗观察到。

实施例17：通过ELISA的改进抗体的结合分析

如实施例4所述通过ELISA评价了抗体BPC1499、1500和1501的结合活性。使用两种不同的抗原包被浓度（0.1和1.0 µg/mL），当与BPC1492相比时，所述抗体在它们的结合概况中不显示任何差异。在所测试的条件下，看起来ELISA在具有不同的报告的结合活性的抗体间没有区别。使用实施例18、5和6中所述的方法学（其被认为是更敏感的测定）评价了相同的抗体。在这些测定中，当与BPC1492相比时，抗体BPC1499、1500和1501显示改善的结合亲和力和改善的效价。

实施例18：使用捕获表面的TNFα结合的Biacore分析

蛋白A和抗人IgG（GE Healthcare BR-1008-39）偶联到CM3生物传感器芯片上的分开的流通池上。这些表面用于捕获抗体用于结合分析。使用在64nM、21.33nM、7.11nM、2.37nM、0.79nM的重组人和食蟹猴TNFα作为分析物，使用单独的缓冲液注射（即，0nM）以双重参考结合曲线。使用100mM磷酸和3M MgCl₂进行捕获表面的再生。在Biacore T100机器上在37℃执行运行，使用HBS-EP作为运行缓冲液。BPC1494和BPC1496构建体显示减少的对蛋白A和抗人IgG表面的结合，使这些表面不适合用于产生那些分子的动力学。

表9 人和食蟹猴TNFα结合到捕获的抗TNFα抗体的动力学分析。

实施例19：ProteOn反向测定结合分析

生物素化的TNFα与生物素化的BSA以1：49的比例，以20µg/mL (即，0.4µg生物素化的TNFα和19.6µg 生物素化的BSA)的最终总蛋白浓度混合。此混合物捕获在NLC生物传感器芯片（单一流通池）（Biorad 176-5021）上。芯片表面用10mM甘氨酸pH3.0条件化，直至获得稳定的信号。使用在256nM、64nM、16nM、4nM和1nM和0nM的要被测试的抗体作为分析物。相对单独用生物素化的BSA包被的流通池参考结合曲线。使用10mM甘氨酸pH3.0实现再生。将数据拟合到ProteOn分析软件固有的1：1模型。

表10 抗TNFα抗体结合到中性亲和素捕获的TNFα的表观动力学

此数据是进行的两个实验的一组（第二组没有显示）。数据的KD排序代表两个数据。

实施例20：结合人TNFα的替代抗体的构建

通过建立重叠的寡核苷酸和与实施例1中所述类似的分子生物学技术从头制备编码在CDR区具有修饰的额外可变重链区（如Rajpal 等 PNAS (2005) 102(24): pg 8466-8471中所述）的DNA表达构建体。编码这些变体抗体的可变重结构域的DNA序列的实例在SED IQ NO: 81、83、85、87、89、91、93和95中给出。通过建立重叠的寡核苷酸和与实施例1中所述类似的分子生物学技术从头制备编码在CDR区具有修饰的额外可变轻链区（如Rajpal 等 PNAS (2005) 102(24): pg 8466-8471中所述）的DNA表达构建体。编码这些变体抗体的可变轻结构域的DNA序列的实例在SED IQ NO: 97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135和137中给出。一旦构建，编码上述重和轻链的表达质粒被瞬时共转染到HEK 293 6E细胞。从上清液中纯化表达的抗体并使用与实施例6中所述类似的方法评价活性。

实施例21：用于BPC2604的表达载体的构建（Pascolizumab-YTE）

使用Quikchange方案(Promega)对编码pascolizumab的重链的基于pTT的DNA表达构建体进行改造以包括下列变化M252Y/S254T/T256E（EU索引编号）。

实施例22：Pasco和Pasco-YTE载体的表达/纯化

编码BPC2604的重和轻链的表达质粒被瞬时共转染到HEK 293 6E细胞。使用两步纯化从批量上清液纯化表达的抗体，所述两步纯化通过亲和层析和SEC使用5mL MabSelectSure柱和Superdex 200柱在AKTA Xpress上进行。

实施例23：Pasco vs. Pasco YTE对于FcRn结合的BIAcore分析

通过伯胺偶联将抗体固定化到GLM芯片上（20µg/mL在醋酸盐中 pH4.5）。以2048、512、128、32和8nM使用人、食蟹猴、大鼠和小鼠FcRn受体。使用0 nM用于双重参考。在HBS-EP pH7.4和HBS-EP pH6.0（对于每个pH，FcRn受体稀释在适当的运行缓冲液中）中进行测定。用200mMTris pH9.0再生表面用于FcRn结合。将数据拟合到平衡模型，同时R-max设置为任何构建体获得的最高R-max。下表11中显示结果并证实YTE修饰的pascolizumab (BPC2604)显示相比pascolizumab在pH6.0对FcRn改善的结合。

表11：抗IL-4抗体构建体对于人和食蟹猴FcRn的亲和力（n.a.b.是无可分析的结合）

实施例24：Pasco vs. Pasco-YTE的PK研究

图6显示pascolizumab-YTE (BPC2604))在雌性食蟹猴和pascolizumab在雄性食蟹猴中在以1 mg/kg的目标剂量单次静脉内注射（1小时输注）施用后平均剂量标准化的血浆浓度。在分开的研究中生成BPC2604和pascolizumab的数据。通过化学发光ELISA使用IL-4作为捕获试剂和抗人IgG（Fc特异性）-HRP缀合物作为检测试剂评价pascolizumab和BPC2604的血浆抗体浓度。对于测定验证的范围是50-5000 ng/mL。结果示于表6中。两种化合物均具有类似的Cmax但是BPC2604具有低3倍的血浆清除率，导致AUC增加3倍和半衰期（T½）增加2倍。

实施例25：BPC1494在雄性食蟹猴中皮下施用后的血浆浓度

在重复剂量的药代动力学研究中，BPC1494以30或100 mg/kg每周或每两周皮下施用，持续4周，给雄性食蟹猴。对组别2（n=3），在第1天对动物施用2x 30mg/kg剂量（约1小时间隔），随后在第8、15和22天施用30 mg/kg单一剂量。对组别3（n=3），在第1天对动物施用2x 30mg/kg剂量（约1小时间隔），随后在第15天施用30 mg/kg单一剂量。对组别4（n=3），在第1天对动物施用2x 100mg/kg剂量（约1小时间隔），随后在第15天施用100 mg/kg单一剂量。在研究的整个给药和恢复期期间以间隔取血浆样品。

基于样品稀释随后是免疫测定分析使用合格的分析方法分析BPC1494血浆样品。分析BPC1494或BPC1492的血浆样品。所述方法使用10 µg/mL生物素化的重组人TNFα作为捕获抗原以及1：100稀释的AlexaFluor 647标记的抗人IgG（Fc特异性）抗体作为检测抗体（G18-145）。对于BPC1494的定量低限（LLQ）是1 µg/mL，使用50µL等分试样的100倍稀释的猴血浆，后者具有100µg/mL的定量高限（HLQ）。此研究用于获得和定量数据的计算机系统包括Gyrolab Workstation 版本 5.2.0、Gyrolab Companion 版本 1.0和SMS2000 版本 2.3。通过非房室药代动力学分析使用WinNonlin Enterprise Pheonix 版本6.1进行PK分析。

药代动力学数据显示在表12中，具有根据下列确定的参数：对于30 mg/kg/周剂量组（2），从在第4周接受的最后一次剂量到时间点（t）给药后840小时，以及对于对于30 & 100 mg/kg/两周剂量组（3和4），从第3周接受最后一次剂量到时间点（t）给药后1008小时。

表12：在BPC1494以30 mg/kg/周或30和100 mg/kg/两周皮下给药持续4周的研究日后，雄性食蟹猴中BPC1494的个别和平均药代动力学参数

a）组别2的动物接受每周30 mg/kg持续4周

b）对于30 mg/kg/周，从在第4周接受的最后一次剂量到时间点（t）给药后840小时，以及对于30 & 100 mg/kg/两周，从第3周接受最后一次剂量到时间点（t）给药后1008小时，确定药代动力学参数

c）Cl_F和Vz_F是估计值，由于多剂量后的消除期以及稳定状态尚未达到。已经根据下列计算参数估计值：i）使用AUC0-168或336，ii）从第1周基于半衰期数据外推和iii）使用相对用AUC0-inf限定的取样的总剂量。

d）从平均药代动力学计算排除动物274和277基于这样的科学判断：这些动物可能展示抗药抗体应答。括号中显示的平均数据包括这些动物。

实施例26：FcRn对蛋白L捕获的抗TNFα mAb的SPR结合分析

使用ProteOnTM XPR36 (BioRadTM)生物传感器机器进行该研究，基于表面等离子共振的机器设计用于无标记的动力学/亲和力测量。通过伯胺偶联将蛋白L固定化在GLM芯片(BioRad, 目录号: 176-5012)上。然后使用该表面捕获人源化的抗体，然后使用在2048nM、512nM、128nM、32nM和8nM的人和食蟹猴FcRn（两者均为内部材料）作为分析物，使用单独的缓冲液注射（即，0nM）以双重参考结合曲线。蛋白L表面的再生使用甘氨酸-HCl pH1.5进行。在25℃运行测定并在HBS-EP pH7.4和HBS-EP pH6.0中用稀释在适当缓冲液中的人和食蟹猴FcRn运行。使用ProteOn分析软件固有的平衡模型计算亲和力，使用“Global R-max”用于在pH6.0的结合，并且来自pH6.0的结合的R-max用于在pH7.4的亲和力计算。因为结合曲线在pH7.4没有达到饱和，所获得的值不可能是真实的亲和力，但是它们可以用于对所测试的抗体的结合进行排序。

BPC1492、BPC1494和BPC1496的不同批次对于人FcRn的结合亲和力使用被蛋白L的抗体捕获进行比较。表17显示使用此形式来自一系列实验的结果。该数据证实BPC1494和BPC1496相比BPC1492在pH6.0和pH7.4均具有对于重组人FcRn改善的亲和力。BPC1494相比BPC1492对于FcRn的结合亲和力的倍数改善在实验到实验之间不同，由于在捕获上蛋白L活性的变化。但是，在表13中显示的实验中，在pH6.0的结合亲和力的倍数改善范围在3.5倍和16.3倍之间。不可能确定在pH7.4的结合亲和力的倍数改善，由于人IgG对于FcRn在中性pH的弱结合活性。

BPC1492、BPC1494和BPC1496的不同批次对于食蟹猴FcRn的结合亲和力也使用蛋白L捕获的抗体进行了比较。表14显示了使用此模式的实验的结果。该数据证实BPC1494相比BPC1492在pH6.0和pH7.4均具有对于重组食蟹猴FcRn改善的亲和力。BPC1494对于食蟹猴FcRn的结合亲和力（范围41.8-46.8 nM）相比BPC1492（范围394-398 nM）的倍数改善在pH6是约9倍。不可能确定在pH7.4的结合亲和力的倍数改善，由于BPC1492对于FcRn的弱结合活性。

表13 使用蛋白L捕获方法的重组人FcRn结合亲和力

** -在此实验中，尽管数据点已被报道，还是应当慎重对待该值，因为这些数据与从相同分子的其它批次获得的数据不一致。

NAB = 无可分析的结合

ND = 在此实验中未测试

## = 高亲和力结合 – 超出机器的灵敏度。

表14 使用蛋白L捕获方法的重组食蟹猴FcRn结合亲和力

实施例 27

在BPC1494的商业制造中采用的最终生产细胞系的开发、检查和选择期间，观察到细胞系在平台到平台间变化。产品质量取决于用于表达产品的细胞系平台而变化。例如，在用于产生材料的初始平台中，主要同种型%（通过cIEF分析）是60%，而在用于选择最终生产细胞系的第二平台中，主峰同种型的%取决于克隆，在49%到36%间变化。此外，在第二平台中产生的克隆在延长的细胞培养期间分泌更一致的概况。第二平台的时间依赖的一致性（参见图7）在获得能够以一致的方式符合目标规定的制造过程的所要求的批次至批次产物概况稳健性和重现性中是重要的特征。因此，在用于开发该产品的细胞系平台之间观察到的变化使我们能够鉴定能够产生用于临床制造活动的一致和稳健的产品概况的更优选的克隆。

实施例 28

BPC1494的制剂挑战是至少二个方面：（i）首先，鉴定在商业演示中能够支持和保持目标30-45％主要同种型产物概况的制剂和（ii）其次，鉴定这样的制剂，具有这样的pH，所述pH对于这类抗TNF抗体的分切递送提供令人愉快患者体验。特别是，此第二点对于保证在非临床，家庭环境中完全的患者依从性是重要的。

在发现这样的制剂的尝试中，进一步令我们感兴趣的是BPC1494表现出比典型的Ch2熔解曲线更低的观察结果。与在一般制剂中其它mAb相比，BPC1494出现热力学不稳定。

表15

对于BPC1494，YTE三突变似乎使CH2失稳到低的Tonset和Tm1，其可以与低稳定性相关联。参见图8A。聚集似乎与CH2结构域中显著的结果改变相关。

因此，然后将第三方面添加到制剂挑战——鉴定会增加CH2结构域的Tm并由此为我们提供更稳定的产品概况和延长的半衰期的制剂。

由于这些原因，我们探讨了很多途径和想法，它们最终，并且令人惊讶的是，导致了确实可以满足所有三种要求的制剂配方发现；即能够稳定地维持我们的目标和期望主要产品峰形％的制剂，对于患者在非临床环境中自我施用适宜的pH的制剂，和能够增加并稳定比观察到的一般Ch2解折叠性质较低的性质的制剂。

对于BPC1494似乎存在多种降解途径：例如下列全部或一些潜在的组合。

- 聚集

- 片段化：Cu切割位点（LT）=7；水解位点（NP，NY）=2；易于酸催化切割的位点（DG、DP、DY）=8 [一个Asp-Pro位点]

- 脱酰胺：可能的脱酰胺位点（NG、NN、NS、NT或NP）=10；更可能的脱酰胺位点（SNG、LNG、LNN、ENN）=3；天冬氨酰异构化位点（GD）的总数=1

- 氧化：CH2失稳预测氧化倾向增加（注意 4个Met残基）。

实施例29——pH——缓冲液研究：材料和方法

以50 mg/mL的mAb浓度进行该研究。DOE设计是3×5全因子。样品在40℃下在以每瓶1mL填充的玻璃小瓶中应激1个月。测试包括DSC (初始, i)、SEC和cIEF (应激的)。所测试的因子显示在表16中并且所有测试的样品在表17中。

如图9A和9B所示，Tm1和Tm2随pH增加。此DSC实验预测在pH ≤ 6增加的热力学/构象稳定性。

实施例30——可逆的热和物理/化学稳定性倾向：

构象稳定性随降低的pH而降低，而针对聚集的抗性改善。pH 5.25 – 6.25可以鉴定为稳定&稳健的pH范围。组氨酸pH值6.0同时表现稳定和稳健（构象稳定性和低聚化倾向之间的折衷）；提出这个缓冲系统，基于的理解是Tm可以通过加入赋形剂后好转。

图10（A）物理稳定性[cIEF]：具有热稳定性的非线性关系。最好的物理稳定性是在组氨酸pH5.0-6.5观测到

图10（B）化学稳定性[SEC]：在pH5.5 - 6.5的组氨酸缓冲液表现稳健＆相当的。在pH6.0的组氨酸中观察到增加的物理稳定性&制剂稳健性

图10（C）热力学/构象稳定性[DSC]：稳定性是pH依赖性的，如所预测的。随着pH增加而增加，不管缓冲液。在较低pH值范围观察到对缓冲类型显著的依赖。

总之：组氨酸pH6.0表现稳定和稳健。

实施例 31

赋形剂筛选研究的HTF（高通量制剂）方法：材料和方法。以50 mg/mL的mAb浓度进行该研究。DOE设计是中心复合设计（CCD）。样品在应激下在40℃在96孔聚丙烯板中1个月。测试包括pH和在280nm、360nm、50nm的吸光度测量，SEC和cIEF。测试的因子示于表18中。

用于最大化可取性的统计解决方案指示下列组合物，掺入海藻糖、精氨酸、甲硫氨酸的基于组氨酸的缓冲剂。对于BPC1494产品制剂的HTF统计解决方案是基于四个响应（同样重要），如下：％SEC-单体、％SEC-HMW、％SEC-LMW、％cIEF-主要。这三种辅料提供增加的稳定性和扩展的稳定性空间。对于[- NaCl]的HTF统计解决方案显示具有NaCl的稳定状况的转变，具有稳健性范围的缩小。参见图11：

-图11A：0和300mM的海藻糖；

-图11B：100mM的精氨酸；

-图11C：0和50mM的NaCl；

对于甲硫氨酸数据未显示。

实施例32-经由摇动研究的PS80水平的优化

50 mg/mL BPC1494 配制在30 mM His pH 6.0 + 150 mM 海藻糖，50 mM Arg, 10 mM Met, 0.05 mM EDTA中，并包含不同浓度的表面活性剂（0.01%、0.02%、0.04%PS80）。在玻璃高有机硅PFS（0.8mL填充）和玻璃小瓶（1mL填充）两者中以250rpm在25℃摇动72小时。所述摇动样品通过各种分析方法进行测试。

通过GA、pH、A280、SEC和cIEF在产品质量中没有检测到显著摇动引起的变化。然而，经由MFI的亚可见粒子测试支持含PS80-制剂。参见表19

实施例33——在预填充指示器（PFS）中的制剂稳定性研究

进行研究以评价BPC1494在50mg/mL制剂中的稳定性。所使用的制剂总结在表20中：

表20总结了在此研究中评价的制剂组合物。

上面的前4个制剂保存在高有机硅预填充注射器（PFS）中。包括使用PFS无有机硅的对照作为对照制剂E。

将样品保存在-20℃、2-8℃、25℃和40℃。将PFS存储在每个温度条件下托盘中的水平位置。

这项研究中的结果（见表21）证实了产物在所有测试的制剂中的长期稳定性。此外，当目标制剂与具有从采样缓冲器去除精氨酸和甲硫氨酸的样品相比时，观察到精氨酸和甲硫氨酸提供保护避免在升高的温度下的聚集（参见表21中的SEC结果）。此外，使用卡尺方法生成数据并且结果与SEC数据一致。质谱数据（见表22）也显示通过向制剂添加游离甲硫氨酸相比不含甲硫氨酸的制剂氧化降低2倍。数据还表明，有机硅没有影响BPC1494的稳定性。

实施例34——在PFS中的制剂稳健性

本研究的主要目的是评估BPC1494等渗制剂（实施例33中详述）的稳健性。

这项研究的设计是基于部分因子的实验设计（DOE）。该研究评估和监测在所选择范围内mAb的稳定性，以支持该制剂组合物的稳健性。

相比于目标制剂，表23总结了测试mAb浓度、pH和赋形剂浓度的范围。

表23——评价制剂稳健性的所测试因子的范围

如下表24中所示，包括9种制剂和三种对照。

所使用的对照是缓冲剂对照（制剂1）、目标制剂（制剂2）和醋酸盐缓冲剂（制剂12）。包括缓冲剂对照以充当通过使用微流成像（MFI）的颗粒测试的对照，其中在光暴露后观察到的任何变色表明赋形剂降解，并且最终包括醋酸盐缓冲剂对照仅用于相对比较目的。

表24：样品总结

制剂	条件	制剂
			1	缓冲剂对照	30 mM His pH 6.0 + 150 mM 海藻糖，50 mM Arg, 10 mM Met, 0.05 mM EDTA，0.02% PS80
2	目标	50 mg/mL BPC1494 在30 mM His pH 6.0 + 150 mM 海藻糖，50 mM Arg, 10 mM Met, 0.05 mM EDTA，0.02% PS80中
			3	低mAb	45 mg/mL BPC1494 在30 mM His pH 6.2 + 180 mM 海藻糖，40 mM Arg, 4 mM Met, 0.025 mM EDTA，0.03% PS80中
4	低mAb	45 mg/mL BPC1494 在30 mM His pH 5.8 + 180 mM 海藻糖，40 mM Arg, 12 mM Met, 0.075 mM EDTA，0.01% PS80中
			5	低mAb	45 mg/mL BPC1494 在30 mM His pH 6.2 + 120 mM 海藻糖，60 mM Arg, 4 mM Met, 0.075 mM EDTA，0.01% PS80中
6	低mAb	45 mg/mL BPC1494 在30 mM His pH 5.8 + 120 mM 海藻糖，60 mM Arg, 12 mM Met, 0.025 mM EDTA，0.03% PS80中
			7	中心点	50 mg/mL BPC1494 在30 mM His pH 6.0 + 150 mM 海藻糖，50 mM Arg, 8 mM Met, 0.05 mM EDTA，0.02% PS80中
8	高mAb	55 mg/mL BPC1494 在30 mM His pH 5.8 + 180 mM 海藻糖，60 mM Arg, 4 mM Met, 0.025 mM EDTA，0.01% PS80中
			9	高mAb	55 mg/mL BPC1494 在30 mM His pH 6.2 + 120 mM 海藻糖，40 mM Arg, 12 mM Met, 0.025 mM EDTA，0.01% PS80中
10	高mAb	55 mg/mL BPC1494 在30 mM His pH 6.2 + 180 mM 海藻糖，60 mM Arg, 12 mM Met, 0.075 mM EDTA，0.03% PS80中
			11	高mAb	55 mg/mL BPC1494 在30 mM His pH 5.8 + 120 mM 海藻糖，40 mM Arg, 4 mM Met, 0.075 mM EDTA，0.03% PS80中
12	醋酸盐对照	50 mg/mL BPC1494 在50 mM 醋酸钠 pH 5.5，51 mM 氯化钠，57 mM Arg, 0.05 mM EDTA，0.02% PS80中

所有样品储存在-20℃，2-8℃，25℃，25℃+800 lux/小时（光）和40℃。在含有正常有机硅水平的1mLHYPAK预填充注射器（PFS）中进行研究，其基于来自BD获得的信息，每注射器0.4mg，围绕注射器有+/-0.3个单位规格。该产品的稳定性以0.8mL填充在PFS中进行评价。将样品水平储存用于稳定性目的，使得所有组件（针、塞子和注射器壁）会被制剂接触。

从该研究的结果证实了BPC1494mAb在测试范围内的长期稳定性。结果展示50 mg/mL的其目标浓度的+/-10%和目标pH+/-0.2单位的范围内mAb的稳定性。当在+/-20%的精氨酸和海藻糖的浓度内以及+/-50％蛋氨酸、EDTA和PS80浓度内时，这种制剂的长期稳定性也被证实。

实施例36——100mg/mL冻融和长期稳定性研究

此研究的目的是评价当配制在5mLFlexboy (EVA)袋中在组氨酸缓冲液（在先前表格中的制剂2）中时，100mg/mL BPC1494抗体的稳健性和稳定性。研究并入两个因子：mAb浓度（从100 mg/mL目标+/-20%）和pH范围（从pH6.0目标+/-0.2单位）。该研究还使100 mg/mL mAb经历5个循环的冻融应激，从≤-60℃（本文-70℃）至2-8℃。

填充5 mLEVA袋，并在-70℃、-40℃、-20℃、2-8℃、25℃和25℃+800 lux/小时静置观察稳定性持续1、3、6个月。袋经受5个冻融循环，从-70℃到2-8℃。

从该研究的结果证实了mAb产品在测试范围内的长期稳定性。结果展示100mg/mL的其目标浓度的+/-10%和目标pH+/-0.2单位的范围内mAb的稳定性。

Claims

1.包含TNF-α抗原结合蛋白和组氨酸缓冲剂的液体制剂。

2.权利要求1的制剂，其中所述制剂不包含盐。

3.权利要求1或2任一项的制剂，其中所述缓冲剂进一步包含下列的一种或多种、下列的组合，或所有下列：表面活性剂、螯合剂、多元醇、抗氧化剂和氨基酸。

4.权利要求1-3任一项的制剂，其中TNF-α抗原结合蛋白是以20-300 mg/mL浓度。

5.权利要求1-4任一项的制剂，其中所述制剂包含：

（a）5-100 mM 组氨酸；和/或

（b）0-150 mM氯化钠；和/或

（c）0-100 mM精氨酸游离碱；和/或

（d）0-0.2 mM EDTA；和/或

（e）0-0.01%聚山梨醇酯80，和/或

（f）0-300 mM 海藻糖；和/或

（g）0-30 mM 甲硫氨酸，

并调节到pH5.0-7.0。

6.权利要求5的制剂，其中：

（a）组氨酸以约30mM的浓度；和/或

（b）海藻糖以150 mM-225 mM的浓度；和/或

（c）精氨酸游离碱以50 mM-75 mM的浓度；和/或

（d）EDTA以约0.05mM的浓度；和/或

（e）聚山梨醇酯80以约0.02%的浓度，和/或

（f）甲硫氨酸以约10mM的浓度。

7.根据权利要求1-6任一项的方法，其中所述制剂调节pH至约pH6.0。

8.权利要求1-7任一项的制剂，其中所述TNF-α抗原结合蛋白是以50 mg/mL浓度。

9.权利要求1-8任一项的制剂，其中所述制剂在室温下（约25℃）约1周后具有至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％的单体含量。

10.权利要求1到9任一项的制剂，其中所述制剂包含：

（a）30mM浓度的组氨酸；

（b）150mM浓度的海藻糖；

（c）50mM浓度的精氨酸；

（d）10mM浓度的甲硫氨酸；

（e）0.05mM浓度的EDTA；

（f）0.02%浓度的PS80；

并且其中pH调节到约pH6.0。

11.权利要求1到9任一项的制剂，其中所述制剂包含：

（a）30mM浓度的组氨酸；

（b）225mM浓度的海藻糖；

（c）75mM浓度的精氨酸；

（d）10mM浓度的甲硫氨酸；

（e）0.05mM浓度的EDTA；

（f）0.02%浓度的PS80；

并且其中pH调节到约pH6.0。

12.根据权利要求1-11任一项的制剂，其中所述TNF-α抗原结合蛋白包含：

（i）CDRH1 (SEQ ID NO: 27)、CDRH2 (SEQ ID NO: 28)、CDRH3 (SEQ ID No: 29)、CDRL1 (SEQ ID NO: 30)、CDRL2 (SEQ ID NO: 31)和CDRL3 (SEQ ID NO: 32)；或其CDR变体，其相比CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3包含1、2、3或4个氨基酸替换、插入或缺失，和

（ii）相比人IgG1恒定区包含一个或多个氨基酸替换的人IgG1恒定区的新生儿Fc受体（FcRn）结合部分。

13.根据权利要求12的制剂，其中所述TNF-α抗原结合蛋白包含：

（i）CDRH1 (SEQ ID NO: 27)、CDRH2 (SEQ ID NO: 28)、CDRH3 (SEQ ID No: 29)、CDRL1 (SEQ ID NO: 30)、CDRL2 (SEQ ID NO: 31)和CDRL3 (SEQ ID NO: 32)；和

14.根据权利要求12或13的制剂，其中所述TNF-α抗原结合蛋白相比包含SEQ ID No. 2的轻链序列和SEQ ID No. 12的重链序列的IgG具有增加的在pH6的FcRn结合亲和力和/或增加的半衰期。

15.根据权利要求12-14任一项的制剂，其中所述抗原结合蛋白可以施用每4周不超过一次，以实现与通过相同剂量的包含SEQ ID No. 2的轻链序列和SEQ ID No. 12的重链序列的IgG每两周施用1次所实现的相当的平均稳态谷浓度。

16.根据前述权利要求任一项的制剂，其中所述TNF-α抗原结合蛋白比具有相同CDR而无这些修饰的抗TNF-α抗原结合蛋白在pH6.0具有高4倍的FcRn的亲和力，如通过ProteOn XPR36蛋白相互作用阵列系统在25℃所评价，所述阵列系统具有固定化在芯片上的抗原结合蛋白。

17.根据权利要求1-11任一项的制剂，其中所述TNF-α抗原结合蛋白是包含SEQ ID No. 2的轻链序列和SEQ ID No. 12的重链序列的IgG的变体，其中所述抗原结合蛋白变体在IgG恒定区的Fc受体（FcRn）结合部分包含一个或多个替换，以增加抗原结合蛋白变体相比IgG的半衰期，其中当所述变体以40 mg的单一剂量，以每4-8周的间隔施用给患者时，患者群体中的平均稳态谷抗体浓度在给药间隔之间不落到5µg/ml以下或优选不落到6µg/ml以下。

18.根据任一前述权利要求的制剂，其中所述TNF-α抗原结合蛋白的人IgG1恒定区在引入氨基酸替换之前具有SEQ ID No. 13的序列。

19.根据前述权利要求任一项的制剂，其用作治疗疾病的药物，其中所述抗原结合蛋白可以施用给患者每4周不超过一次，以实现与通过相同剂量的包含SEQ ID No. 2的轻链序列和SEQ ID No. 12的重链序列的IgG每两周施用1次所实现的相当的平均稳态谷浓度。

20.根据前述权利要求任一项的制剂，其用于治疗疾病，其中所述制剂以约35-约45mg之间的单一剂量以每4-8周间隔施用给患者。

21.根据前述权利要求任一项的制剂，其中所述制剂作为40mg单一剂量皮下施用给患者每4周不超过一次。

22.根据前述权利要求任一项的制剂，其中所述制剂的施用在患者中每4周不超过一次，在患者群体中实现平均稳态谷浓度在约4 μg/ml-约7 μg/ml之间。

23.权利要求22所述制剂，其中所述平均稳态谷浓度在约5 μg/ml至约6 μg/ml之间。

24.根据权利要求21-23任一项的制剂，其中所述制剂作为40mg单一剂量皮下施用给患者每8周不超过一次。

25.根据前述权利要求任一项的制剂，其中所述TNF-α抗原结合蛋白的半衰期相比天然IgG增加2倍、3倍、4倍或5倍。

26.前述权利要求任一项所述制剂，其中TNF-α抗原结合蛋白的清除率是约2 ml/小时至约4 ml/小时。

27.根据前述权利要求任一项的制剂，其中所述TNF-α抗原结合蛋白相对人IgG1恒定区在根据Kabat的EU索引编号的一个或多个位置250、252、254、256、257、259、308、428或434包含氨基酸替换。

28.如权利要求12-27任一项所述制剂，其中所述TNF-α抗原结合蛋白的一个或多个氨基酸替换是在根据Kabat的EU索引编号的氨基酸残基252、254和256并且在残基252的替换是用tyr、phe、trp或thr替换；在残基254的替换是用thr替换；并且在残基256的替换是用ser、arg、glu、asp或thr替换。

29.权利要求28所述制剂，其中在残基252的替换是用tyr替换met；在残基254的替换是用thr替换ser，并且在残基256的替换是用glu替换thr。

30.根据前述权利要求任一项的制剂，其中所述TNF-α抗原结合蛋白包含如SEQ ID No：7所示的恒定区。

31.如权利要求12-27任一项所述制剂，其中一个或多个氨基酸替换是在根据Kabat的EU索引编号的氨基酸残基250和428并且在残基250的替换是用glu或gln替换；在残基428的替换是用leu或phe替换。

32.根据权利要求31的制剂，其中在残基250的替换是用glu替换thr，并且在残基428的替换是用leu替换met。

33.根据权利要求32的制剂，其中所述TNF-α抗原结合蛋白包含如SEQ ID No：16所示的恒定区。

34.如权利要求12-27任一项所述制剂，其中所述TNF-α抗原结合蛋白的一个或多个氨基酸替换是在根据Kabat的EU索引编号的氨基酸残基428和434并且在残基428的替换是用leu替换替换met并且在残基434的替换是用ser替换asn。

35.根据权利要求34的制剂，其中所述TNF-α抗原结合蛋白包含如SEQ ID No：10所示的恒定区。

36.根据前述权利要求任一项的制剂，其中所述抗原结合蛋白是抗体。

37.根据前述权利要求任一项的制剂，其中所述TNF-α抗原结合蛋白与氨甲喋呤一起施用，优选其中施用所述抗原结合蛋白用于治疗类风湿关节炎。

38.根据前述权利要求任一项的制剂，其中所述TNF-α抗原结合蛋白包含SEQ ID NO: 6和/或SEQ ID NO: 3的可变区，或其变体，所述变体包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸替换、插入或缺失或在跨SEQ ID NO: 6和/或SEQ ID NO: 3的长度上共享至少90%的同一性。

39.根据前述权利要求任一项的制剂，其中所述TNF-α抗原结合蛋白包含如SEQ ID No: 5, 9或15所示的重链序列，任选地具有如SEQ ID No: 2所示的轻链序列。

40.根据权利要求1-37任一项的制剂，其中所述TNF-α抗原结合蛋白包含如SEQ ID No：78或80所示的重链可变区序列。

41.根据权利要求1-37任一项所述的制剂，其中所述TNF-α抗原结合蛋白包含如SEQ ID No：145或146所示的重链可变区序列。

42.治疗具有疾病的患者的方法，所述方法包括施用如前述权利要求任一项所述的制剂。

43.治疗具有疾病的患者的方法，所述方法包括以约35-约45mg的单一剂量以每4-8周间隔将如权利要求1-42任一项所述制剂皮下施用给所述患者。

44.根据权利要求42或43的方法，其中所述疾病是类风湿性关节炎、多关节幼年特发性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩氏病或银屑病。

45.权利要求1-41任一项所述制剂在用于制造药物中的用途，所述药物用于治疗类风湿性关节炎、多关节幼年特发性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩氏病或银屑病。

46.试剂盒，其包含前述权利要求任一项的制剂，并且任选地包含氨甲喋呤用于TNF-α抗原结合蛋白和氨甲喋呤的伴随递送。

47.包含TNF-α抗原结合蛋白的液体制剂，其中所述TNF-α抗原结合蛋白包含根据SEQ ID No: 5的重链和根据SEQ ID No: 2的轻链，并且其中所述制剂含有：

（a）30mM浓度的组氨酸；

（b）150mM浓度的海藻糖；

（c）50mM浓度的精氨酸；

（d）10mM浓度的甲硫氨酸；

（e）0.05mM浓度的EDTA；

（f）0.02%浓度的PS80；

并且其中pH调节到约pH6.0。