ES2791333T3

ES2791333T3 - Anticuerpos anti-MIF para su uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias

Info

Publication number: ES2791333T3
Application number: ES16183733T
Authority: ES
Inventors: Randolf Kerschbaumer; Friedrich Scheiflinger; Manfred Rieger; Michael Thiele; C Geert Mudde; Jürgen Muellberg; Rene Hoet
Original assignee: Baxalta GmbH; Dyax Corp; Baxalta Inc
Current assignee: Baxalta GmbH; Dyax Corp; Baxalta Inc
Priority date: 2008-01-04
Filing date: 2008-12-30
Publication date: 2020-11-03
Anticipated expiration: 2028-12-30
Also published as: HK1147762A1; EP2231707A1; US8668909B2; EP2754671A3; NZ596409A; PT2231707E; KR20100102197A; CN101983207A; JP2011510616A; EP3118223B1; CN103724430A; CN103724430B; AU2008346517B2; HRP20150224T1; EP3118223B8; NZ586600A; EP2548890A1; PL3118223T3; CA2711029A1; NZ611117A

Abstract

Anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la región que abarca los aa 50-68 o la región que abarca los aa 86-102 de MIF humano, e inhibe la función biológica de MIF humano, para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-MIF para su uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales y a partes de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a la región C-terminal o central del factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF) para su uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio. Estos anticuerpos anti-MIF y partes de unión a antígeno de los mismos inhiben además la función biológica de MIF humano.

Antecedentes

El factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF) es una citocina aislada inicialmente basándose en su capacidad para inhibir la migración de macrófagos aleatoria in vitro (Bloom et al. Science 1966, 153, 80-2; David et al. PNAS 1966, 56, 72-7). Aunque se ha conocido MIF desde 1966, no se conoce su función exacta en la mayoría de células, pero parece que MIF es un regulador posterior crítico de la respuesta inmunitaria innata y adquirida.

El ADNc de MIF humano se clonó en 1989 (Weiser et al., PNAS 1989, 86, 7522-6), y su ubicación genómica se mapeó en el cromosoma 22. El producto del gen de MIF es una proteína de aminoácidos con una masa molecular de 12,5 kDa. La proteína está altamente conservada con una homología de secuencia entre MIF humano, de ratón, de rata y bovino de entre el 90 - 96%. Sin embargo, MIF no tiene ninguna homología de secuencia significativa con ninguna otra proteína. La estructura tridimensional de MIF es distinta de cualquier otra citocina u hormona hipofisaria. La proteína cristaliza como un trímero de subunidades idénticas. Cada monómero contiene dos hélices alfa antiparalelas que se empaquetan frente a una lámina beta de cuatro hebras. El monómero tiene dos hebras beta adicionales que interaccionan con las láminas beta de subunidades adyacentes para formar la superficie de contacto entre monómeros. Las tres láminas beta se disponen para formar un barril que contiene un canal accesible por disolvente que discurre a través del centro de la proteína a lo largo de un eje molecular de tres pliegues (Sun et al. PNAS 1996, 93, 5191-5196).

Se notificó que se indujo la secreción de MIF a partir de macrófagos a concentraciones muy bajas de glucocorticoide (Calandra et al. Nature 1995, 377, 68-71). Sin embargo, como una citocina proinflamatoria, MIF también contrarregula los efectos de glucocorticoides y estimula la secreción de otras citocinas tales como el factor de necrosis tumoral TNF -a e interleucina IL-1 p (Baugh et al, Crit Care Med 2002, 30, S27-35) asumiendo por tanto un papel en la patogenia de enfermedades inflamatorias e inmunitarias. MIF también se asocia directamente con el crecimiento de linfoma, melanoma y cáncer de colon (Nishihira et al. J Interferon Cytokine Res. 2000, 20: 751-62).

MIF es un mediador de muchos estados patológicos y por tanto se asocia con una variedad de enfermedades incluyendo enfermedad inflamatoria del intestino (EII), artritis reumatoide (AR), síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), asma, glomerulonefritis, nefropatía por IgA, cáncer, infarto de miocardio (IM) y septicemia.

Se han desarrollado anticuerpos anti-MIF monoclonales y policlonales frente a MIF humano recombinante (Shimizu et al., FEBS Lett. 1996; 381, 199-202; Kawaguchi et al., J. Leukoc. Biol. 1986, 39, 223-232 y Weiser et al., Cell. Immunol.

1985, 90, 167-78).

Se han sugerido anticuerpos anti-MIF para su uso terapéutico para inhibir la liberación de TNF-a. Se notifica que Calandra et al., (J. Inflamm. 1995. 47, 39-51) usaron anticuerpos anti-MIF para proteger animales frente a choque séptico inducido experimentalmente por bacterias Gram-negativas y Gram-positivas. Se sugirieron anticuerpos anti-MIF como un medio de terapia para modular la producción de citocinas en choque séptico y otros estados patológicos inflamatorios.

El documento US 6.645.493 da a conocer anticuerpos anti-MIF monoclonales derivados de células de hibridoma, que neutralizan la actividad biológica de MIF. Pudo mostrarse en un modelo animal que estos anticuerpos anti-MIF derivados de ratón tenían un efecto beneficioso en el tratamiento de choque inducido por endotoxinas. Algunos de los anticuerpos anti-MIF descritos (III.D.9, XIV.14.3 y XIV.15.5) se usaron en la presente invención para experimentos comparativos.

El documento US 2003/0235584 da a conocer métodos de preparación de anticuerpos de alta afinidad frente a MIF en animales en los que se ha desactivado de manera homocigótica el gen de MIF.

El factor inhibidor de la glicosilación (GIF) es una proteína descrita porGalat et al. (Eur. J. Biochem. 1994, 224, 417-21). Se reconoce ahora que MIF y GIF son idénticos. Watarai et al. (PNAS 2000, 97, 13251-6) describieron anticuerpos policlonales que se unen a diferentes epítopos de GIF para identificar la naturaleza bioquímica de la modificación postraduccional de GIF en células T. Watarai et al (PNAS 2000, 97, 13251-6) notificaron que GIF se produce en diferentes isoformas conformacionales in vitro. Un tipo de isómero se produce mediante modificación química de un único residuo de cisteína. La modificación química conduce a cambios conformacionales dentro de la proteína GIF y cambia su función biológica.

Se conocen en general anticuerpos anti-MIF, por ejemplo de los documentos WO 2007/134538 o US 2003/0235584. Se hace referencia, a modo de ejemplo, al documento Us 2003/0099653 que da a conocer, por ejemplo, el anticuerpo IIi.D.9.

Este anticuerpo también se conoce de varios documentos adicionales. Véanse, por ejemplo, el documento US 2004/0156848 y el documento WO 98/17314 así como el documento USA 6.030.615. Los documentos también se refieren, por ejemplo, al anticuerpo XIV.14.3. Estos anticuerpos no se unen al mismo epítopo que los anticuerpos de la invención actualmente reivindicados.

Incluso basándose en esta documentación, existe la necesidad de anticuerpos anti-MIF adicionalmente mejorados, que sean útiles para el tratamiento de trastornos inflamatorios.

Dada la complejidad de la participación de MIF en diversas enfermedades, se desea sumamente una aclaración de la función de anticuerpos anti-MIF específicos de epítopo y de su uso para enfoques terapéuticos. Por tanto, existe una necesidad de anticuerpos anti-MIF específicos de epítopo, que inhiban la función biológica de MIF humano para el tratamiento de enfermedades y estados mediados por MIF.

Sumario de la invención

La presente invención está definida por las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-MIF humano de la invención.

Figura 2: muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-MIF humano de la invención.

Figura 3: muestra la secuencia de ADN y su traducción de la región variable de la cadena ligera de anticuerpos anti-MIF humano de la invención.

Figura 4: muestra la secuencia de ADN y su traducción de la región variable de la cadena pesada de anticuerpos anti-MIF humano de la invención.

Figura 5: Experimento de competencia de IM.D.9 murino frente a un anticuerpo control (C3) y anticuerpo anti-MIF Bax94. Puede observarse una clara competencia mediante cantidades crecientes de anticuerpo Bax94.

Figura 6: El anticuerpo Bax94 (línea de puntos) y el anticuerpo Bax152 (línea de rayas) mostraron supervivencia aumentada y tiempo a la muerte retardado en el modelo animal de peritonitis en comparación con un anticuerpo control (C3).

Figura 7: Unión diferencial del anticuerpo Bax94 a MIF activo y MIF no activo. El anticuerpo Bax94 se une a MIF activo en un formato de ELISA directo, mientras que no se une a MIF no activo.

Figura 8: Tabla que resume las propiedades in vitro de anticuerpos anti-MIF humano.

Figura 9: Efectos proapoptóticos de anticuerpos anti-MIF en un ensayo basado en células. Se muestran las actividades de caspasa-3 celular (caspasa efectora) tras el tratamiento de células PC-3 con anticuerpos. Se realizan los ensayos por triplicado y se presentan los datos como media DE.

Figura 10: Efectos antiinvasivos de anticuerpos anti-MIF. Se examina la invasión de células de cáncer de próstata PC-3 a través de poros de insertos Transwell™ recubiertos con Matrigel. Se cuenta el número de células invadidas por campo visual (microscopio con un aumento de 400 veces). Se presentan los datos como media DE recuentos de 3 10 campos visuales y se muestran las diferencias significativas.

Descripción detallada de la invención

Definiciones y técnicas generales

A menos que se defina lo contrario en el presente documento, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente invención tendrán los significados que entienden comúnmente los expertos habituales en la técnica. En general, las nomenclaturas usadas en relación con, y técnicas de, cultivo celular y tisular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química de proteínas y ácidos nucleicos descritas en el presente documento son las que se conocen bien y se usan comúnmente en la técnica. Los métodos y las técnicas de la presente invención se realizan generalmente según métodos convencionales bien conocidos en la técnica y tal como se describen en diversas referencias generales y más específicas que se citan y se comentan a lo largo de la totalidad de la presente memoria descriptiva a menos que se indique lo contrario. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), y Harlow y Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990).

“MIF” o “factor inhibidor de la migración de macrófagos” se refiere a la proteína que se conoce como un mediador crítico en la respuesta inmunitaria e inflamatoria, especialmente como contrarregulador de glucocorticoides. MIF incluye MIF de mamífero, específicamente MIF humano (número de registro primario de Swiss-Prot: P14174), en el que la forma monomérica se codifica como proteína de 115 aminoácidos pero se produce como proteína de 114 aminoácidos debido a escisión de la metionina inicial. “MIF” también incluye “GlF” (factor inhibidor de la glicosilación) y otras formas de MIF tales como proteínas de fusión de MIF. La numeración de los aminoácidos de MIF comienza con la metionina N-terminal (aminoácido 1) y termina con la alanina C-terminal (aminoácido 115).

El término “MIF activo” se refiere a isoformas conformacionales de MIF que se producen de manera natural, que son relevantes para su función biológica. MIF activo incluye isoformas que pueden observarse en la superficie de células (tales como THP1 o similar). MIF activo también incluye isoformas de MIF que se producen en suero de mamíferos tras la exposición con bacterias.

Un “anticuerpo” se refiere a un anticuerpo intacto o una parte de unión a antígeno que compite con el anticuerpo intacto para la unión específica. Véase en general, Fundamental Immunology, Cap. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989)). El término anticuerpo incluye formas modificadas por ingeniería genética tales como anticuerpos quiméricos o humanizados.

El término “parte de unión a antígeno” de un anticuerpo se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad para unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, MIF). Pueden producirse partes de unión a antígeno mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Las partes de unión a antígeno incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')², Fv y de región determinante de complementariedad (CDR), anticuerpos de cadena sencilla (scFv), anticuerpos quiméricos, diacuerpos y polipéptidos que contienen al menos una parte de un anticuerpo que es suficiente para conferir unión a antígeno específico al polipéptido. Desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal, los dominios variables de cadena tanto ligera como pesada madura comprenden las regiones FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio es según las definiciones de Kabat, Secuences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), Chothia et. al. J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987) o Chothia et al., Nature 342: 878-883 (1989). Un anticuerpo o una parte de unión a antígeno del mismo puede derivatizarse o unirse a otra molécula funcional (por ejemplo, otro péptido o proteína). Por ejemplo, un anticuerpo o una parte de unión a antígeno del mismo puede unirse de manera funcional a una o más de otras entidades moleculares, tales como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o un diacuerpo), un agente detectable, un agente citotóxico, un agente farmacéutico y/o una molécula de unión.

El término “anticuerpo humano” se refiere a cualquier anticuerpo en el que las secuencias de dominio variable y constante son secuencias humanas. El término abarca anticuerpos con secuencias derivadas a partir de genes humanos, pero que se han cambiado, por ejemplo, para disminuir una posible inmunogenicidad, aumentar la afinidad, eliminar cisteínas que pueden provocar plegamiento indeseable, etc. El término abarca tales anticuerpos producidos de manera recombinante en células no humanas, que pueden conferir glicosilación no típica de células humanas.

El término “anticuerpo humanizado” se refiere a inmunoglobulinas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como fragmentos Fv, Fab, Fab', F(ab')², u otras partes de unión a antígeno de anticuerpos), que contienen secuencias derivadas a partir de una inmunoglobulina no humana.

El término “anticuerpo quimérico” se refiere a un anticuerpo que comprende regiones de dos o más especies diferentes.

El término “anticuerpo aislado” o “parte de unión a antígeno aislada del mismo” se refiere a un anticuerpo o una parte de unión a antígeno del mismo que se ha identificado y seleccionado a partir de una fuente de anticuerpos tal como una biblioteca de presentación en fagos o un repertorio de células B.

El término “K^d” se refiere a la constante de disociación en equilibrio de una parte Fab de un anticuerpo particular con el antígeno respectivo.

Los términos “región central” y “región C-terminal” de MIF se refieren a la región de MIF humano que comprende los aminoácidos 35-68 y 86-115, respectivamente.

El término “epítopo” incluye cualquier determinante de proteína que puede unirse específicamente a un fragmento de inmunoglobulina o anticuerpo. Los determinantes epitópicos consisten habitualmente en agrupaciones de moléculas de superficie químicamente activa tales como aminoácidos expuestos, aminoazúcares, u otras cadenas laterales de hidratos de carbono y habitualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específica.

El término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. En algunas realizaciones, el vector es un plásmido, es decir, un bucle de ADN bicatenario circular en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales.

El término “célula huésped” se refiere a una línea celular que puede producir una proteína recombinante tras introducir un vector de expresión. El término “línea celular recombinante”, se refiere a una línea celular en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Debe entenderse que “ línea celular recombinante” significa no sólo la línea celular objeto particular sino también la progenie de una línea celular de este tipo. Dado que pueden producirse determinadas modificaciones en generaciones subsiguientes debidas o bien a mutación o bien a influencias del entorno, tal progenie puede no ser, de hecho, idéntica a la célula madre, pero todavía se incluyen dentro del alcance del término “ línea celular recombinante” tal como se usa en el presente documento.

El término “portador farmacéuticamente aceptable” se refiere a todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles.

Anticuerpos anti-MIF

La invención se refiere a anticuerpos monoclonales aislados o partes de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a la región que abarca los aa 50-68 o la región que abarca los aa 86-102 de MIF humano e inhiben además la función biológica de MIF humano para su uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio. En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales son anticuerpos monoclonales humanos. En otras realizaciones, los anticuerpos monoclonales son anticuerpos monoclonales humanizados.

En algunas realizaciones, la cadena ligera del anticuerpo anti-MIF comprende la secuencia de aminoácidos que es igual a la secuencia de aminoácidos de la V^ldel anticuerpo Bax8 (SEQ ID NO: 1), el anticuerpo Bax69 (SEQ ID NO: 2), el anticuerpo Bax74 (SEQ ID NO: 3), el anticuerpo Bax94 (Se Q ID NO: 4), el anticuerpo Bax152 (SEQ ID NO: 5), el anticuerpo BaxA10 (SEQ ID NO: 6), o una secuencia de aminoácidos que tiene el 85%, preferiblemente el 90% de homología de secuencia con respecto a dichas secuencias de aminoácidos. En algunas realizaciones, la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos desde el principio de la CDR1 hasta el final de la CDR3 de uno cualquiera de dichos anticuerpos. En algunas realizaciones, la cadena ligera del anticuerpo anti-MIF comprende al menos la CDR1, la CDR2 o la CDR3 de cadena ligera de las secuencias de aminoácidos mostradas en la figura 1.

En algunas realizaciones, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable (V^h) del anticuerpo Bax8 (SEQ ID NO: 7), el anticuerpo Bax69 (SEQ ID NO: 8), el anticuerpo Bax74 (SEQ ID NO: 9), el anticuerpo Bax94 (SEQ ID NO: 10), el anticuerpo Bax152 (SEQ ID NO: 12), el anticuerpo BaxA10 (SEQ ID NO: 12), o una secuencia de aminoácidos que tiene el 85%, preferiblemente el 90% de homología de secuencia con respecto a dichas secuencias de aminoácidos. En algunas realizaciones, la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos desde el principio de la CDR1 hasta el final de la CDR3 de uno cualquiera de dichos anticuerpos. En algunas realizaciones, la cadena pesada del anticuerpo anti-MIF comprende al menos la CDR1, la CDR2 o la CDR3 de cadena pesada de las secuencias de aminoácidos mostradas en la figura 2.

Clase y subclase de anticuerpos anti-MIF

El anticuerpo anti-MIF de la invención es un anticuerpo monoclonal aislado. El anticuerpo anti-MIF puede ser una molécula de IgG, IgM, IgE, IgA o IgD. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-MIF es una IgG y es de una subclase IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En otras realizaciones, el anticuerpo es de subclase o bien IgG1 o bien IgG4. En otras realizaciones, el anticuerpo es de subclase IgG4. En algunas realizaciones, el anticuerpo IgG4 tiene una única mutación que cambia la serina (serina228, según el esquema de numeración de Kabat) por prolina. Por consiguiente, la subsecuencia CPSC en la región Fc de IgG4 se vuelve CPPC, que es una subsecuencia en IgG1 (Angal et al. Mol Immunol. 1993, 30, 105-108).

Epítopos de MIF reconocidos por anticuerpos anti-MIF

La invención se refiere a anticuerpos anti-MIF o partes de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a las regiones que abarcan desde los aminoácidos 50-68 u 86-102 de MIF humano, respectivamente, de manera preferible los anticuerpos anti-MIF se unen específicamente a las regiones que abarcan desde los aminoácidos 50 hasta 68, o del 86 al 102, respectivamente, e inhiben la función biológica de MIF humano.

En otras realizaciones, la invención se refiere a anticuerpos anti-MIF, que se unen adicionalmente a MIF activo e inhiben además la función biológica de MIF humano. En algunas realizaciones, MIF activo está unido a membrana. Se encontró sorprendentemente que los anticuerpos anti-MIF de la invención tenían la propiedad sorprendente de competir con el anticuerpo anti-MIF III.D.9 en estudios de unión con MIF humano. Puede determinarse la competencia de III.D.9 tal como se describe en el ejemplo 5.

Afinidad de unión de anticuerpos anti-MIF frente a MIF humano

La invención se refiere a anticuerpos anti-MIF o partes de unión a antígeno de los mismos, que se unen a MIF humano con una Kd de 5 x 1°'7 M o menos. En otras realizaciones, los anticuerpos se unen a MIF humano con una Kd de 5 x 10'8 M o menos, 5 x 1°'9 M o menos o 5 x 10'1° M o menos.

La afinidad de unión de anticuerpos anti-MIF o partes de unión a antígeno de los mismos frente a MIF humano puede determinarse mediante métodos conocidos en la técnica. La afinidad de unión puede medirse, por ejemplo, mediante resonancia de plasmón superficial (BIACORE). El ejemplo 1° muestra a modo de ejemplo un método para determinar constantes de afinidad de anticuerpos anti-MIF mediante tecnología BIACORE.

En algunas realizaciones, la invención se refiere además a anticuerpos anti-MIF o a partes de unión a antígeno de los mismos, que se unen a MIF activo con una Kd de menos de 50° nM e inhiben además la función biológica de MIF humano. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-MIF o partes de unión a antígeno de los mismos se unen a MIF activo con una Kd de menos de 5° nM.

Producción de anticuerpos anti-MIF

Pueden prepararse anticuerpos anti-MIF o partes de unión a antígeno de los mismos según la presente invención mediante muchos métodos conocidos por el experto en la técnica, tales como examen de bibliotecas de presentación en fagos de fragmentos de anticuerpo. Pueden usarse diferentes formatos de bibliotecas de presentación en fagos, por ejemplo, bibliotecas de fragmentos scFv o Fab, o similares. Se examina una biblioteca de presentación en fagos para detectar fragmentos de anticuerpo con afinidades deseadas para determinados epítopos de MIF y se recupera el material genético del clon apropiado. En rondas consecutivas de generación y examen de bibliotecas, puede aislarse un fragmento de anticuerpo con una afinidad aumentada en comparación con la afinidad del fragmento de anticuerpo original aislado. La afinidad de un fragmento de anti-MIF identificado puede potenciarse adicionalmente mediante maduración de afinidad.

Ácidos nucleicos, vectores, células huésped y métodos recombinantes de preparación de anticuerpos anti-MIF

Aspectos de referencia se refieren a moléculas de ácido nucleico que codifican para anticuerpos anti-MIF o partes de unión a antígeno de los mismos según la presente invención, así como a vectores que comprenden un ácido nucleico de este tipo y a células huésped que comprenden un vector de este tipo, así como a métodos de producción de manera recombinante de un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico.

En algunas realizaciones, la secuencia de ADN que codifica para la región Vl del anticuerpo anti-MIF comprende la secuencia de nucleótidos que es igual a la secuencia de la Vl del anticuerpo Bax8 (SEQ ID NO: 13), el anticuerpo Bax69 (SEQ ID NO: 14), el anticuerpo Bax74 (SEQ ID NO: 15), el anticuerpo Bax94 (SEQ ID NO: 16), el anticuerpo Bax152 (SEQ ID NO: 17), el anticuerpo BaxA1° (SEQ ID NO: 18) tal como se muestra en la figura 3, o una secuencia que tiene el 85%, preferiblemente el 9°% de homología de secuencia con respecto a cualquiera de dichas secuencias de nucleótidos.

En algunas realizaciones, la secuencia de ADN que codifica para la región Vh del anticuerpo anti-MIF comprende la secuencia de nucleótidos que es igual a la secuencia de la Vh del anticuerpo Bax8 (SEQ ID NO: 19), el anticuerpo Bax69 (SEQ ID NO: 2°), el anticuerpo Bax74 (SEQ ID NO: 21), el anticuerpo Bax94 (SEQ ID NO: 22), el anticuerpo Bax152 (SEQ ID NO: 23), el anticuerpo BaxA1° (SEQ ID NO: 24) tal como se muestra en la figura 4, o una secuencia que tiene el 85%, preferiblemente el 9°% de homología de secuencia con respecto a cualquiera de dichas secuencias de nucleótidos.

La producción de los anticuerpos anti-MIF para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria según la presente invención incluye cualquier método para la generación de ADN recombinante mediante ingeniería genética, por ejemplo, mediante transcripción inversa de ARN y/o amplificación de ADN y clonación en vectores de expresión. En algunas realizaciones, el vector es un vector viral, en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. En algunas realizaciones, el vector puede replicarse de manera autónoma en una célula huésped en la que se introduce (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamífero episómicos). En otras realizaciones, el vector (por ejemplo, vectores de mamífero no episómicos) puede integrarse en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped, y replicarse de ese modo junto con el genoma huésped. Además, determinados vectores pueden dirigir la expresión de genes a los que están operativamente unidos. Tales vectores se denominan “vectores de expresión recombinante” (o simplemente, “vectores de expresión”) en el presente documento.

Pueden producirse anticuerpos anti-MIF por medio de vectores de expresión convencionales, tales como vectores bacterianos (por ejemplo, pBR322 y sus derivados) o vectores eucariotas. Aquellas secuencias que codifican para el anticuerpo pueden dotarse de secuencias reguladoras que regulan la replicación, la expresión y/o la secreción a partir de la célula huésped. Estas secuencias reguladoras comprenden, por ejemplo, promotores (por ejemplo, CMV o SV40) y secuencias señal. Los vectores de expresión también pueden comprender marcadores de selección y amplificación, tales como el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR), higromicina-B-fosfotransferasa y timidina-cinasa. Los componentes de los vectores usados, tales como marcadores de selección, replicones, potenciadores, pueden o bien obtenerse comercialmente o bien prepararse por medio de métodos convencionales. Los vectores pueden construirse para la expresión en diversos cultivos celulares, por ejemplo, en células de mamífero tales como c Ho , COS, HEK293, NSO, fibroblastos, células de insecto, levadura o bacterias tales como E. coli. En algunos casos, se usan células que permiten la glicosilación óptima de la proteína expresada.

El gen de cadena ligera del anticuerpo anti-MIF y el gen de cadena pesada del anticuerpo anti-MIF pueden insertarse en vectores separados o se insertan ambos genes en el mismo vector de expresión. Los genes de anticuerpo se insertan en el vector de expresión mediante métodos convencionales, por ejemplo, ligamiento de sitios de restricción complementarios en el fragmento de gen de anticuerpo y vector, o ligamiento de extremos romos si no están presentes sitios de restricción.

La producción de anticuerpos anti-MIF o partes de unión a antígeno de los mismos puede incluir cualquier método conocido en la técnica para la introducción de ADN recombinante en células eucariotas mediante transfección, por ejemplo, mediante electroporación o microinyección. Por ejemplo, la expresión recombinante del anticuerpo anti-MIF puede conseguirse mediante la introducción de un plásmido de expresión que contiene la secuencia de ADN que codifica para el anticuerpo anti-MIF bajo el control de una o más secuencias reguladoras tales como un promotor fuerte, en una línea celular huésped adecuada mediante un método de transfección apropiado que da como resultado células que tienen las secuencias introducidas integradas de manera estable en el genoma. El método de lipofección es un ejemplo de un método de transfección que puede usarse según la presente invención.

La producción de anticuerpos anti-MIF también puede incluir cualquier método conocido en la técnica para el cultivo de dichas células transformadas, por ejemplo, de una manera continua o discontinua, y la expresión del anticuerpo anti-MIF, por ejemplo, constitutiva o tras la inducción.

El tipo de célula huésped puede ser cualquier célula eucariota. En un ejemplo, la célula es una célula de mamífero con la capacidad para realizar modificaciones postraduccionales de anticuerpos anti-MIF. Por ejemplo, dicha célula de mamífero se deriva a partir de una línea celular de mamífero, tal como, por ejemplo, una línea celular seleccionada del grupo que consiste en células SkHep, CHO, HEK293 y BHK. En una realización, el anticuerpo anti-MIF se expresa en una línea celular CHO con déficit de DHFR, por ejemplo, DXB11, y la adición de G418 como un marcador de selección. Cuando se introducen vectores de expresión recombinantes que codifican para genes de anticuerpo en células huésped de mamífero, se producen los anticuerpos cultivando las células huésped durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped o la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que se hacen crecer las células huésped.

Pueden recuperarse anticuerpos anti-MIF a partir del medio de cultivo usando métodos de purificación de proteínas convencionales.

Adicionalmente, la producción de anticuerpos anti-MIF puede incluir cualquier método conocido en la técnica para la purificación de un anticuerpo, por ejemplo, mediante cromatografía de intercambio aniónico o cromatografía de afinidad. En una realización, el anticuerpo anti-MIF puede purificarse a partir de sobrenadantes de cultivo celular mediante cromatografía de exclusión molecular.

Propiedades de anticuerpos anti-MIF

La invención se refiere a anticuerpos anti-MIF o una parte de unión a antígeno de los mismos tal como se describe en las reivindicaciones. Además presentan al menos una de las siguientes propiedades:

a) inhiben la actividad de anulación de glucocorticoides (GCO),

b) inhiben la proliferación de líneas celulares tales como fibroblastos o células cancerosas (por ejemplo, NIH/3T3 o PC-3),

c) se unen a MIF activo,

d) no se unen a MIF no activo,

MIF activo es una isoforma de MIF activo que se produce mediante el tratamiento de MIF humano con reactivos oxidantes leves, tales como cistina o mediante la inmovilización de MIF humano sobre un soporte tal como una placa de ELISA o perlas. MIF activo es una isoforma de MIF activo que se produce in vivo tras la exposición de animales con bacterias. MIF activo es una isoforma de MIF activo que se produce in vivo sobre la superficie de células (por ejemplo, THP1, CFB). MIF no activo es MIF reducido (por ejemplo, tal como se describe en el ejemplo 7) o MIF almacenado intracelular.

En otras realizaciones, los anticuerpos anti-MIF o parte de unión a antígeno de los mismos se unen a MIF activo con una Kd de menos de 500 nM.

Composiciones farmacéuticas de anticuerpos anti-MIF y métodos de tratamiento

La invención también se refiere a composiciones que comprenden un anticuerpo anti-MIF o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a la región que abarca los aa 50-68 u 86-102, para su uso en el tratamiento de un sujeto que necesita tratamiento para estados relacionados con MIF, concretamente enfermedades inflamatorias parte de unión a antígeno del mismo, para el tratamiento de un sujeto que necesita tratamiento para.

En algunas realizaciones, el sujeto que necesita tratamiento es un humano.

Los anticuerpos según la reivindicación 1 para su uso en la invención abarcan el tratamiento de enfermedades inflamatorias tales como vasculitis, artritis, septicemia, choque séptico, choque endotóxico, síndrome del choque tóxico, síndrome de dificultad respiratoria adquirida, glomerulonefritis, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, peritonitis, nefritis, dermatitis atópica, asma, conjuntivitis, fiebre, malaria o psoriasis en un sujeto, incluyendo un humano, que comprende la etapa de administrar a dicho sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-MIF o parte de unión a antígeno del mismo.

En otras realizaciones, la composición que comprende dicho anticuerpo anti-MIF de la invención es para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en glomerulonefritis, enfermedad inflamatoria del intestino, nefritis y peritonitis.

El tratamiento también puede implicar la administración de uno o más anticuerpos anti-MIF de la invención, o un fragmento de unión a antígeno de los mismos, solos o con un portador farmacéuticamente aceptable. Algunos ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables son agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composición. Ejemplos adicionales de sustancias farmacéuticamente aceptables son agentes humectantes o cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian la vida útil de almacenamiento o eficacia del anticuerpo.

El anticuerpo anti-MIF y las composiciones farmacéuticas que lo comprenden pueden administrarse en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos, de diagnóstico o profilácticos. Los agentes terapéuticos adicionales incluyen otros agentes antineoplásicos, antitumorales, antiangiogénicos, quimioterápicos o esteroides, dependiendo de la enfermedad que va a tratarse.

Las composiciones farmacéuticas pueden estar en una variedad de formas, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, tales como disoluciones líquidas (por ejemplo, disoluciones inyectables y para infusión), dispersiones o suspensiones, comprimidos, pastillas, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende de la aplicación terapéutica y el modo de administración previstos. Composiciones preferidas típicas están en forma de disoluciones inyectables o para infusión, tales como composiciones similares a las usadas para la inmunización pasiva de seres humanos. El modo de administración preferido es parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular). En una realización preferida, el anticuerpo se administra mediante infusión o inyección intravenosa. En otra realización preferida, el anticuerpo se administra mediante inyección intramuscular o subcutánea. Tal como apreciará el experto en la técnica, la vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados.

El anticuerpo anti-MIF puede administrarse una vez, pero más preferiblemente se administra múltiples veces. Por ejemplo, el anticuerpo puede administrarse desde tres veces al día hasta una vez cada seis meses o más. La administración puede realizarse en un programa tal como de tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses y una vez cada seis meses.

La invención abarca el uso de un anticuerpo anti-MIF o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a la región que abarca los aa 50-68 u 86-102 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades inmunológicas, concretamente enfermedades inflamatorias.

La memoria descriptiva abarca además un anticuerpo anti-MIF o un fragmento de unión a antígeno del mismo, para su uso en métodos de diagnóstico. En un aspecto, el anticuerpo anti-MIF o parte de unión a antígeno del mismo puede usarse para detectar MIF humano en una muestra biológica.

Los anticuerpos anti-MIF o las partes de unión a antígeno de los mismos también pueden usarse para determinar el nivel de MIF en superficie celular en un tejido o en células derivadas a partir del tejido. En algún aspecto, el tejido es tejido enfermo. Entonces puede usarse el tejido en un inmunoensayo para determinar, por ejemplo, niveles de MIF total, niveles de MIF en superficie celular o ubicación de MIF.

La memoria descriptiva se refiere además a kits que comprenden un anticuerpo anti-MIF o una parte de unión a antígeno de la invención o una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o una parte de este tipo. Un kit puede incluir, además del anticuerpo o la composición farmacéutica, agentes de diagnóstico o terapéuticos. Un kit también puede incluir instrucciones para su uso en un método de diagnóstico o terapéutico.

La memoria descriptiva se refiere además a un procedimiento para la identificación de anticuerpos anti-MIF capaces de inhibir la función biológica de MIF humano e inducir un efecto beneficioso en un modelo animal mediante la realización de las siguientes etapas:

a) seleccionar un anticuerpo que se une a MIF activo y no se une a MIF no activo

b) someter a prueba dicho anticuerpo en ensayos in vitro, tales como el ensayo de anulación de glucocorticoides (GCO) o ensayos de proliferación celular

c) seleccionar un anticuerpo, que inhibe GCO y/o la proliferación celular.

Los resultados han mostrado que un anticuerpo anti-MIF que sólo se une a MIF activo y no se une a MIF no activo e inhibe además GCO y/o la proliferación celular induce un efecto beneficioso en un modelo animal (por ejemplo, el ejemplo 6).

La presente invención se ilustrará adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, sin ninguna limitación a los mismos.

Parte experimental

Ejemplo 1: Selección de anticuerpo

Se usa tecnología de presentación en fagos para generar fragmentos de anticuerpo anti-MIF humano. A partir de una biblioteca de presentación en fagos, se realizan diferentes campañas de examen, tres de ellas usando MIF de longitud completa (MIF humano recubierto/MIF humano en disolución/MIF humano-murino alternante). Las otras usando seis péptidos derivados de MIF alternantes con MIF de longitud completa. Estos seis péptidos se diseñan dividiendo la proteína MIF en seis péptidos de aproximadamente 30 aminoácidos con tramos solapantes de aproximadamente 15 aminoácidos. Tras varias rondas de selección, se identifican agentes de unión únicos, se expresan todos los agentes de unión únicos y se purifican como anticuerpos frente a IgG4 humana. Se someten a prueba estos anticuerpos en varios ensayos para demostrar la inhibición in vitro de MIF. Se lleva a cabo un mapeo de epítopos para determinar la región de unión dentro de la proteína MIF. Se someten a prueba 193 anticuerpos y se clasifican según su actividad in vitro de inhibición de MIF. A continuación se describen ensayos in vitro. Se usan tres anticuerpos anti-MIF murino como control (III.D.9, XIV.14.3 y XIV.15.5).

Ejemplo 2: Inhibición de actividad de anulación de glucocorticoides de MIF (GCO).

Este método se basa en la inhibición de MIF endógeno, es decir, MIF que es producido por la línea celular usada. Este método se aplica para la selección de anticuerpo y para la determinación de curvas de dosis-respuesta.

Ensayo de GCO para selección de anticuerpos:

Se centrifuga un cultivo en suspensión de THP1 y se resuspenden las células en medio completo nuevo a una densidad celular de 10⁶células por ml. Se transfiere este cultivo a pocillos de una microplaca de 96 pocillos (90 |il/pocillo) y se añade anticuerpo anti-MIF para dar una concentración final de 75 |ig/ml. Se somete a prueba cada anticuerpo por triplicado. Tras incubación durante la noche a 37°C se añade dexametasona para dar una concentración de 2 nM y tras una incubación de una hora a 37°C se añade LPS (concentración final de 3 ng/ml). Tras una incubación de seis horas adicionales a 37°C se recoge el sobrenadante y se determinan las concentraciones de IL-6 en un ELISA (kit Cytoset, disponible comercialmente). Se calcula el promedio de los resultados de las pruebas por triplicado y se determina el porcentaje de secreción de IL-6 en comparación con los anticuerpos de control. Se evalúan como positivos los anticuerpos que dan como resultado una secreción de IL-6 de menos del 75%.

Ensayo para la determinación de valores de Ckⁿ

Se lleva a cabo el procedimiento experimental tal como se describe para el ensayo de selección con la excepción de que se usan cantidades crecientes de anticuerpo (normalmente desde 1-125 nM). Se expresa la curva de dosisrespuesta resultante como el % de inhibición en comparación con un anticuerpo control negativo. Se usa esta curva para el cálculo del efecto inhibidor máximo del anticuerpo (% de inhib. máx.) y la concentración de anticuerpo que muestra el 50% del efecto inhibidor máximo (CI⁵⁰).

En la figura 8, columna 3 (CI⁵⁰) y columna 4 (inhibición máxima), se resumen los resultados. Para comparación, el anticuerpo murino XIV.14.3 sólo muestra el 36% de inhibición de GCO (datos no mostrados).

Ejemplo 3: Inhibición de la proliferación celular

El suero estimula la secreción de MIF en células NIH/3T3 quiescentes y MIF a su vez estimula la proliferación celular. Por tanto, anticuerpos que inhiben este MIF endógeno disminuyen la proliferación de células NIH/3T3 quiescentes. Se determina la reducción de la proliferación mediante la incorporación de 3H-timidina.

Se incuban 1000 células NIH/3T3 por pocillo en una placa de 96 pocillos a lo largo del fin de semana a 37°C en medio que contiene el 10% de suero. Entonces se privan las células de nutrientes durante la noche a 37°C mediante incubación en medio que contiene el 0,5% de suero. Se retira el medio al 0,5% y se reemplaza por medio nuevo que contiene el 10% de suero, anticuerpo 75 |ig/ml y 5 |iCi/ml de 3H-timidina. Tras 16 horas incubación en un incubador de CO²a 37°C se lavan las células dos veces con 150 |il de PBS fría por pocillo. Usando una pipeta de múltiples canales se añaden 150 |il de una disolución de TCA al 5% (p/v) por pocillo y se incuban durante 30 minutos a 4°C. Se lavan las placas con 150 |il de PBS. A cada pocillo se le añaden 75 |il de una disolución de NaOH 0,5 M con SDS al 0,5%, se mezclan y se almacenan a temperatura ambiente. Se miden las muestras en un contador p mezclando 5 ml de Ultima Gold (Packard) y 75 |il de disolución de muestra. Se realiza cada determinación por triplicado y se comparan los valores con los valores del anticuerpo control mediante una prueba de la t. Se evalúan como positivos los anticuerpos que reducen significativamente la proliferación (P < 0,05). En la figura 8, columna 5, se resumen los resultados.

Ejemplo 4: Estudios de unión: Determinación de epítopos de anticuerpos anti-MIF

Se diluye cada péptido en tampón de acoplamiento para dar una concentración de péptido de normalmente 5 |ig/ml, se añade a microplacas (NUNC Immobilizer™ Amino Plate F96 Clear) y se incuban durante la noche a 4°C (100 |il/pocillo). Se usan MIF de longitud completa recombinante y PBS como controles. Se lava la placa 3 veces con 200 |il de PBST y se añaden anticuerpos (4 |ig/ml en PBS) (100 |il/pocillo) y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación suave. Se lava la placa 3 veces con 200 |il de PBST y se añade anticuerpo de detección (por ejemplo, anti-IgG humana específico de Fc/marcado con HRP, Sigma) (100 |il/pocillo). Tras una incubación durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave, se lava la placa 3 veces con 200 |il de PBST. Se incuba cada pocillo con 100 |il de disolución de TMB (T-0440, Sigma) durante 30 minutos en la oscuridad. Se detiene la reacción de tinción añadiendo 100 |il de disolución de H²SO⁴1,8 M por pocillo. Se miden las muestras a 450 nm.

Ejemplo 5: Competencia de anticuerpos anti-MIF humano con anticuerpo anti-MIF murino III.D.9

Se usa el anticuerpo Bax94 para la competencia con anticuerpos anti-MIF de ratón III.D.9. Se recubren placas de 96 pocillos (NUNC Maxisorp) con MIF humano recombinante. Se diluyen el anticuerpo anti-MIF murino II.D.9 y los anticuerpos anti-MIF humano en TBST/BSA al 2% y se mezclan, mientras que se mantiene la concentración final de III.D.9 a 2 |ig/ml y se aumenta la concentración de anticuerpos anti-MIF humano desde 0 |ig/ml hasta normalmente 32 |ig/ml. Tras el lavado de la microplaca, se aplican los anticuerpos y se incuban a temperatura ambiente durante normalmente 2 horas. Tras el lavado, se incuba la placa con conjugado de anticuerpo anti-IgG de ratón (espec. de Fc) con peroxidasa y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras el lavado, se incuba la placa con disolución de TMB y se detiene la reacción de tinción añadiendo disolución de H²SO⁴. El ajuste de la curva de competencia resultante permite el cálculo de la inhibición máxima de la unión a III.D.9. En la figura 8, columna 6, se resumen los resultados.

Ejemplo 6: Supervivencia aumentada de anticuerpos anti-MIF en el modelo en animal vivo de peritonitis por E. coli

Se llevan a cabo los experimentos según Calandra et al. (Nature Immunology, 2000) usando ratones NMRI hembra (25-30 g, 6-10 semanas de edad) a los que se les inyecta por vía intraperitoneal 6000 UFC de una suspensión de E. coli 0111:B4 en mucina al 15% y hemoglobina al 4%. Se inoculan dos o tres colonias (E. coli 0111:B04) a partir de un cultivo en placa de agar de nutrientes en 10 ml de TSB y se incuban durante la noche a 36°C con agitación. Se diluye el cultivo en solución salina fisiológica hasta la(s) concentración/concentraciones requerida(s), durante la noche el cultivo alcanza normalmente 2*109 UFC/ml, y se mezcla con mucina y hemoglobina (1 volumen de inóculo diluido, 2 volúmenes de mucina al 15%, 2 volúmenes de hemoglobina al 4%). Puesto que la mezcla de inóculo tiende a sedimentarse, se mezcla entre inyecciones. Se usa una aguja grande (por ejemplo, de calibre 23) para las inyecciones para evitar el bloqueo de la aguja por material particulado en la mezcla de inyección. Se administran por vía intraperitoneal anticuerpo Bax94 (IgG4) y un anticuerpo control de isotipo correspondiente 2 horas antes de la exposición bacteriana. La dosificación de anticuerpo es normalmente de 800 |ig/ratón y se usan 20 ratones para cada grupo. Pudo mostrarse un efecto estadísticamente significativo sobre la supervivencia/tiempo hasta la muerte para los isotipos IgG1 e IgG4 de anticuerpos anti-MIF humano. La figura 6 muestra los resultados obtenidos para el anticuerpo Bax94 y el anticuerpo Bax152 (IgG4). Se usan datos estadísticos de Kaplan-Meier para la evaluación de las curvas de supervivencia.

Ejemplo 7: Especificidad de unión para MIF activo

Los anticuerpos anti-MIF descritos en esta invención pueden distinguir entre MIF activo y no activo, que se generan mediante oxidación o reducción leve, respectivamente. Se valora la distinción entre estos confórmeros mediante ELISA o resonancia de plasmón superficial.

ELISA para la valoración de la unión diferencial de los anticuerpos:

• Transformación de MIF en su conformación activa mediante oxidación leve.

Se incuba MIF humano recombinante (0,5 mg/ml en PBS) durante 3 h a 37°C con un exceso de 3 veces (volumen) de una disolución saturada de L-cistina en PBS (L-cistina ~ 0,4-0,5 mM). Entonces se dializa el MIF dos veces frente a PBS en un casete de diálisis Slide-A-Lyzer® con un punto de corte de peso molecular de 7 kDa (Pierce).

• Transformación de MIF en su conformación no activa.

Se reduce MIF a una concentración de 0,5 mg/ml mediante incubación durante la noche con ditiotreitol 8-16 mM (concentración final) a 4°C.

• Protocolo de ELISA.

Se recubren los anticuerpos anti-MIF en microplacas de 96 pocillos (NUNC Maxisorp™) a una concentración de 5 |ig/ml (dilución en tampón de recubrimiento). Tras el lavado de la placa con TBST (solución salina tamponada con Tris con Tween-20 al 0,1% (v/v)) y el bloqueo con TBST/BSA al 2% (TBST y albúmina sérica bovina al 2% (p/v)), se añaden series de diluciones de MIF o bien activo o bien no activo y se incuban a temperatura ambiente durante 1-2 h. Se detecta MIF unido usando un anticuerpo anti-MIF de conejo policlonal y un anticuerpo de cabra anti-conejo marcado con peroxidasa del rábano (Biorad). Se usa TBST/BSA al 2% para diluir MIF, el anticuerpo anti-MIF de conejo y el conjugado de peroxidasa para reducir la unión no específica. La figura 7 muestra los resultados de ELISA obtenidos con el anticuerpo Bax94.

Valoración de la unión diferencial de los anticuerpos por Biacore.

Se examina la cinética de unión de MIF activo y no activo al anticuerpo Bax94 mediante análisis de resonancia de plasmón superficial usando un sistema Biacore 3000. Por tanto, se inmovilizan 10000 unidades de respuesta de Bax94 en un chip sensor con una matriz de CM5 (= dextrano carboximetilado) y se incuban con MIF activo o no activo, MIFhu en tampones redox de glutatión prorreductores y prooxidantes, que oscilan entre GSH 4,8 mM/GSSG 0,2 mM (g Ss G = glutatión oxidado) y Gs SG 5 mM en tampón HBS-EP (GE Healthcare). Como control, se usa MIF para el análisis de unión en una segunda célula de flujo que contiene un anticuerpo control de isotipo inmovilizado. Se extraen las unidades de respuesta de unión de anticuerpo control y anticuerpo Bax94 para la evaluación.

Ejemplo 8: Detección de MIF activo en la superficie de células THP-1

Se incuban células con el anticuerpo anti-MIF Bax94. Se lavan las células con PBS helada y se resuspenden en tampón de lisis celular frío (Cell Signaling Technology®). Se bloquean perlas magnéticas de proteína G Dynabeads® (Invitrogen) con TBST leche en polvo desnatada al 5% (p/v), se lavan y se añaden a las células lisadas. Se lleva a cabo inmunoprecipitación a 4°C durante la noche. Entonces se lavan las perlas con tampón de lisis celular y TBST y se someten a ebullición en tampón de muestra de SDS-PAGE (sin agentes reductores). Se someten las muestras a SDS-PAGE no reductora para el análisis de inmunotransferencia de tipo Western.

Ejemplo 9: Unión de anticuerpos anti-MIF a MIF unido a membrana

Se lavan células THP-1 con PBS helada y se resuspenden en tampón de tinción celular frío (Biolegend) complementado con IgG de ratón 200 |ig/ml. Se añaden anticuerpos anti-MIF marcados con FITC o TRITC para dar una concentración final de normalmente 200-500 nM y se realiza la incubación a 4°C. Se lavan posteriormente las células con tampón de tinción celular helado y se resuspenden en tampón de tinción celular complementado con la disolución de viabilidad celular Via-Probe™ (Bd Biosciences). Se miden las células en un sistema de citometría de flujo FACS Canto™ II (BD Biosciences) y se compara la mediana del desplazamiento de FITC/TRITC de las poblaciones celulares viables con el anticuerpo control de isotipo marcado con colorante.

Ejemplo 10: Determinación de la afinidad de fragmentos Fab de anticuerpos anti-MIF mediante Biacore Normalmente, se inmovilizan 40 unidades UR de MIF recombinante humano en un chip sensor con una matriz de CM5 (= dextrano carboximetilado) (Biacore). Se inyectan fragmentos Fab a un intervalo de concentración de normalmente 6-100 nM diluidos en HBS-EP. Tras cada ciclo, se regenera el chip con NaOH 50 mM NaCI 1 M. Se calculan las afinidades según el modelo de Langmuir 1:1. En la figura 8, columna 7, se resumen los resultados.

Ejemplo 11: Efecto beneficioso de anticuerpos anti-MIF en un modelo animal de glomerulonefritis semilunar

Se someten a prueba los anticuerpos anti-MIF en un modelo de rata de glomerulonefritis semilunar descrito por Frederick W. K. Tam et. al. (Nephrol Dial Transplant, 1999, 1658-1666). Se induce nefritis nefrotóxica en ratas Wistar Kyoto macho mediante una inyección intravenosa individual de suero de membrana basal glomerular anti-rata. En la configuración preventiva del experimento, se comienza el tratamiento con anticuerpos anti-MIF y un anticuerpo control de isotipo correspondiente en el momento de la inducción de nefritis (día 0) mediante inyección intraperitoneal del anticuerpo. Normalmente se repite el tratamiento cada dos días y se sacrifican los animales en el día 7 para análisis histológicos. Se recoge orina antes del experimento (nivel inicial) y antes de la terminación del experimento (día 7). En una configuración terapéutica, se comienza el tratamiento con anticuerpo anti-MIF 4 días tras la inducción de la enfermedad y se repite cada dos días. Normalmente se sacrifican las ratas en el día 8. Se recoge orina antes del experimento (nivel inicial), antes del comienzo del tratamiento (día 4) y antes del sacrificio de los animales (día 8). La dosificación de anticuerpo es normalmente de 1-20 mg/kg por inyección y se usan de 6 a 8 ratas para cada grupo. Se determina la gravedad de la enfermedad midiendo proteinuria, infiltración de macrófagos en el glomérulo y daño histológico (formación semilunar). En un experimento preventivo, el tratamiento con anticuerpo anti-MIF Bax69 (10 mg/kg por dosis) durante 7 días da como resultado una reducción de proteinuria del 47% en comparación con animales tratados con anticuerpo control. El tratamiento de una enfermedad establecida (experimento terapéutico) da como resultado una reducción de proteinuria dependiente de la dosis del 16% (10 mg/kg de Bax69 por dosis) y del 34% (20 mg/kg de Bax69 por dosis) en comparación con animales tratados con anticuerpo control.

Ejemplo 12: Efecto beneficioso de anticuerpos anti-MIF en un modelo animal para colitis ulcerosa (transferencia adoptiva de células T vírgenes en ratones Rag-/-)

Se sacrificaron ratones C57BL/6 y se aíslan células CD45RBhi (células T vírgenes) mediante clasificación FACS de la población de células de bazo. Se inyectan i.p. células CD45RBhi (5 x 105) en ratones C57BL/6 Rag-/- (de 7-9 semanas de edad), que desarrollan colitis ulcerosa tras aproximadamente 2 semanas (de Jong et al., Nature immunology, 2001, 1061-1066). Se inyectan por vía intraperitoneal anticuerpos anti-MIF y el anticuerpo control de isotipo dos veces a la semana (1 mg/ratón/dosis). En una configuración preventiva, se comienza el tratamiento en el momento de la inyección de células T. En una configuración terapéutica, se comienza el tratamiento 4 semanas tras la inducción de la enfermedad. Se monitorizan los ratones semanalmente para determinar el peso y el desarrollo de la enfermedad. Normalmente ocho semanas tras la transferencia de células CD4CD45RBhi a receptores C57BL/6 Rag-/-, se calcula el índice de actividad de enfermedad (DAI) y se recogen secciones del colon para determinar la puntuación del índice de histología (HI). Se determinan el índice de actividad de la enfermedad (DAI) y el índice de histología (HI) al final del modelo animal (DAI se basa en cuatro parámetros: encorvamiento y debilitamiento (puntuado con 0 ó 1), engrosamiento del colon (0-3) y consistencia de las deposiciones (0-3)). En un experimento terapéutico, se usan anticuerpos anti-MIF Bax69 y BaxA10 para el tratamiento de una enfermedad establecida y se reduce significativamente el DAI medio en aproximadamente el 60% (Bax69) y aproximadamente el 40% (BaxA10) en comparación con ratones tratados con control de isotipo. Además, se reduce la puntuación de HI medio en aproximadamente el 33% tras el tratamiento con Bax69.

Ejemplo 13: Efecto beneficioso de anticuerpos anti-MIF en un modelo animal para colitis ulcerosa (modelo anti-CD40 agonista)

Este modelo se basa en la activación de macrófagos y células dendríticas mediante un anticuerpo anti-CD40 agonista, que induce una patología intestinal que se parece a EII en ratones Rag1-/-.

Se adquieren ratones Rag-1-/- de edad/sexo coincidentes (de 4-5 semanas) de Jackson Laboratories y se mantienen durante dos semanas antes del experimento en la instalación para animales. Se disuelven el anticuerpo monoclonal frente a CD40 agonista (FGK45, IgG2a) o IgG2a de rata control de isotipo en PBS a 1 mg/ml. A cinco grupos (cada grupo de 10 ratones) se les inyectan i.p. 200 |ig de anticuerpo monoclonal anti-CD40 agonista y de esos grupos se tratan cuatro con anticuerpos anti-MIF en el día 0 y el día 1 ( 2x 1 mg/ratón). Al sexto grupo (10 ratones) sólo se le inyecta control de isotipo (IgG2a de rata, control sano). Se pesan los ratones durante los siguientes 7 días. En el día 7, se calculó el índice de actividad de enfermedad (DAI) y se recogieron secciones del colon para determinar la puntuación del índice de histología (HI). La puntuación de DAI se basa en: encorvamiento (0-1); debilitamiento (0-1), consistencia de las deposiciones (0-3) y engrosamiento del colon (0-3). La puntuación de histología se basó en grosor (0-3), elongación de criptas, inflamación (0-3) y absceso (0-1). El tratamiento con anticuerpos anti-MIF Bax94, BaxA10 y Bax69 reduce significativamente la puntuación de DAI (BaxA10: reducción del ~48%; Bax94: reducción del ~62%; Bax69: reducción del ~73%) en comparación con ratones tratados con control de isotipo. Además, también se reducen las puntuaciones de HI medio mediante estos anticuerpos.

Ejemplo 14: Inhibición de crecimiento tumoral en ratones desnudos Mf1 por anticuerpos anti-MIF

Se recogen células de adenocarcinoma de próstata humanas (PC-3) a partir de cultivos en crecimiento exponencial y

Claims

REIVINDICACIONES

i. Anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la región que abarca los aa 50-68 o la región que abarca los aa 86-102 de MIF humano, e inhibe la función biológica de MIF humano, para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria.
2. Anticuerpo monoclonal para el uso según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo o parte de unión a antígeno posee al menos una de las siguientes propiedades:

a) inhibe la actividad de anulación de glucocorticoides (GCO)

b) inhibe la proliferación de células cancerosas o fibroblastos

c) se une a MIF activo

d) no se une a MIF no activo.
3. Anticuerpo monoclonal para el uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho anticuerpo o parte de unión a antígeno se une a MIF humano con una Kd de menos de 500 nM.
4. Anticuerpo monoclonal para el uso según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo o parte de unión a antígeno se une a MIF activo.
5. Anticuerpo monoclonal para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en anticuerpo Bax69, que se define como que tiene una secuencia de ácido nucleico en Vl de SEQ ID NO: 14 y una secuencia de ácido nucleico en Vh de SEQ ID NO: 20, anticuerpo Bax94, que se define como que tiene una secuencia de ácido nucleico en Vl de SEQ ID NO: 16 y una secuencia de ácido nucleico en Vh de SEQ ID NO: 22, anticuerpo Bax152, que se define como que tiene una secuencia de ácido nucleico en Vl de SEQ ID NO: 17 y una secuencia de ácido nucleico en Vh de SEQ ID NO: 23, y anticuerpo BaxA10, que se define como que tiene una secuencia de ácido nucleico en Vl de SEQ ID NO: 18 y una secuencia de ácido nucleico en Vh de SEQ ID NO: 24.
6. Anticuerpo monoclonal para el uso según la reivindicación 5, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo de subformato IgG4, y en el que dicho subformato IgG4 tiene una única mutación, mediante lo cual la subsecuencia CPSC en la región Fc de IgG4 se vuelve CPPC.
7. Anticuerpo monoclonal para el uso según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo o parte de unión a antígeno comprende:

a) una CDR1, una CDR2 y una CDR3 de cadena pesada, tal como se muestra en la figura 2, seleccionadas independientemente de la cadena pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en anticuerpo Bax69, anticuerpo Bax94, anticuerpo Bax152 y anticuerpo BaxA10, todos tal como se definieron anteriormente,

b) una CDR1, una CDR2 y una CDR3 de cadena ligera, tal como se muestra en la figura 1, seleccionadas independientemente de la cadena ligera de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en anticuerpo Bax69, anticuerpo Bax94, anticuerpo Bax152 y anticuerpo BaxA10, todos tal como se definieron anteriormente, o en el que el anticuerpo comprende:

c) una secuencia de Vh que es idéntica en al menos el 90% a la secuencia de aminoácidos de cadena pesada del anticuerpo Bax69, el anticuerpo Bax94, el anticuerpo Bax152 y el anticuerpo BaxA10, todos tal como se definieron anteriormente,

d) una secuencia de V^Lque es idéntica en al menos el 90% a la secuencia de aminoácidos de cadena ligera del anticuerpo Bax69, el anticuerpo Bax94, el anticuerpo Bax152 y el anticuerpo BaxA10, todos tal como se definieron anteriormente.
8. Anticuerpo monoclonal para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que dicha enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en vasculitis, artritis, septicemia, choque séptico, choque endotóxico, síndrome del choque tóxico, síndrome de dificultad respiratoria adquirida, glomerulonefritis, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, peritonitis, nefritis y psoriasis.