KR20150110659A - Tnf-알파 항원-결합 단백질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 TNF-알파에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질 및 히스티딘 완충제를 포함하는 액체 제형을 제공한다. 예를 들어, 아달리무맙과 같은 항-TNF 항체의 신규한 변이체는 아달리무맙에 비해 증가된 FcRn 수용체로의 결합 또는 증가된 반감기를 나타낸다. 항원 결합 단백질을 포함하는 조성물 및 장애 및 질병의 치료에서의 상기 조성물의 용도가 또한 제공된다.

Description

TNF-알파 항원-결합 단백질{TNF-ALPHA ANTIGEN-BINDING PROTEINS}
분야
본 발명은 신규한 항-TNF 항체의 변이체 및 상기 항원 결합 단백질의 제형에 관한 것이다.
배경
성체 포유동물에서, 신생아 Fc 수용체로도 공지된 FcRn은 IgG 아이소형(isotype)의 항체에 결합하여 분해로부터 이를 구조하는 보호 수용체로서 작용함으로써 혈청 항체 수준을 유지하는데 있어서 중요한 역할을 한다. IgG 분자는 내피 세포에 의해 세포내이입되며, 이들이 FcRn에 결합하는 경우, 순환으로 재활용된다. 대조적으로, FcRn에 결합하지 않은 IgG 분자는 세포로 진입하고, 리소좀 경로로 표적화되며, 여기서 이들은 분해된다.
신생아 FcRn 수용체는 항체 청소 및 조직을 가로지르는 트랜스사이토시스(transcytosis) 둘 모두와 관련된 것으로 생각된다(Junghans R.P (1997) Immunol.Res 16. 29-57 및 Ghetie et al (2000) Annu.Rev.Immunol. 18, 739-766 참조).
WO 9734631호에는 증가된 혈청 반감기 및 Fc-힌지 영역 내에 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 돌연변이 IgG 분자를 포함하는 조성물이 개시되어 있다. CH2 도메인 내의 번호 252, 254, 256, 309, 311 또는 315 또는 CH3 도메인 내의 433 또는 434로부터 선택된 아미노산 중 하나 이상에서의 아미노산 치환이 개시되어 있다.
WO 00/42072호에는 변경된 FcRn 결합 친화성을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드가 개시되어 있으며, 상기 폴리펩티드는 Fc 영역의 아미노산 위치 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439, 및 447 중 어느 하나 이상에서 아미노산 변형을 포함한다.
WO 02/060919호에는 위치 251, 253, 255, 285-290, 308-314, 385-389 및 428-435 중 하나 이상에서 아미노산 변형을 포함하는 IgG 불변 도메인을 포함하는 변형된 IgG가 개시되어 있다.
WO 2004035752호에는 아미노산 잔기 250, 314, 및 428로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 불변 영역으로부터의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 변형되지 않은 클래스 IgG 항체에 존재하는 것과 상이한 클래스 IgG의 변형된 항체가 개시되어 있다.
문헌[Shield et al. (2001, J Biol Chem; 276:6591-604)에서는 인간 IgG1 항체의 Fc 영역 내의 잔기를 변경시키기 위해 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 이용하였고, 이후 인간 FcRn에 대한 결합을 평가하였다. 알라닌으로 변경되는 경우 FcRn으로의 결합을 효과적으로 파괴한 위치는 I253, S254, H435, 및 Y436을 포함한다. 다음과 같은 다른 위치는 결합에 있어서 덜 현저한 감소를 나타내었다: E233-G236, R255, K288, L309, S415 및 H433. 여러 아미노산 위치는 알라닌으로 변경되는 경우 FcRn 결합에서 개선을 나타내었다.
문헌[Dall'Acqua et al. (2002, J Immunol.; 169:5171-80)에는 마우스 FcRn에 대한 인간 IgG1 힌지-Fc 단편 파지 디스플레이 라이브러리의 무작위 돌연변이유발 및 스크리닝이 기재되어 있다. 이들은 위치 251, 252, 254-256, 308, 309, 311, 312, 314, 385-387, 389, 428, 433, 434, 및 436의 무작위 돌연변이유발을 개시하였다.
WO2006130834호에는 252, 254, 256, 433, 434 및 436 중 하나 이상의 위치에서 아미노산 변형을 포함하는 IgG 불변 도메인을 포함하는 IgG를 포함하는 변형된 IgG가 개시되어 있다. 따라서, IgG 항체의 Fc 도메인의 변형이 치료 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 수단으로서 논의되어 왔다. 그러나, 다수의 상기 변형은 다양한 항체에서 다양하고 때때로 모순된 결과를 나타내었다.
치료제로서 항원 결합 단백질의 투여는 단백질의 청소 및 반감기 특징과 관련하여 처방된 빈도의 주사를 필요로 한다.
아달리무맙(adalimumab)은 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 강직척추염 및 크론병의 치료에 사용되는 TNF-알파에 대한 모노클로날 항체이다. 이는 포유동물 세포 발현 시스템을 이용한 재조합 DNA 기술에 의해 생성된다. 이는 330개의 아미노산으로 구성되며, 약 148 킬로달톤의 분자량을 갖는다. 미국 특허 6090382호를 참조하라. 0.5 ㎎/㎏의 용량(약 40 ㎎)에서, 아달리무맙에 대한 청소율은 11 내지 15 ㎖/시간의 범위로 언급되고, 분포 용적(Vss)은 5 내지 6리터 범위이고, 평균 말기 반감기는 약 2주였다(www.medicines.org.uk에서 이용가능한 제품 특징 요약). 이들 반감기 및 청소율 특성은 현재 아달리무맙이 2주마다 1회 투여될 필요가 있음을 의미한다. 일부 환자에서, 질병에 따라, 예를 들어, 건선 환자에서와 같이 부하 용량을 투여할 필요가 있을 수 있다. 이러한 투여량은 유지 용량과 상이할 수 있다.
아달리무맙은 제형화하기 어려우며, 시트레이트 기반 완충제의 사용을 필요로 하였다. 본 발명자는 이제 본 발명의 항체가 비-시트레이트 기반 완충제로 더욱 용이하게 제형화될 수 있고, 이에 따라 주사 부위 반응의 유해 효과 프로파일 및 주사시의 동통을 감소시킬 수 있는 것을 발견하였다.
발명의 개요
한 양태에서, 본 발명은 TNF-알파 항원 결합 단백질 및 히스티딘 완충제를 포함하는 액체 제형에 관한 것이다. 추가 양태에서, 제형은 염을 포함하지 않고, 또한 추가로 완충제는 계면 활성제, 킬레이트제, 폴리올, 항산화제 및 아미노산 중 하나 이상, 이들의 조합물, 또는 이들 모두를 포함할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 CDRH1(SEQ ID NO: 27), CDRH2(SEQ ID NO: 28), CDRH3(SEQ ID No: 29), CDRL1(SEQ ID NO: 30), CDRL2(SEQ ID NO: 31) 및 CDRL3(SEQ ID NO: 32), 또는 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 또는 CDRL3에 비해 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 함유할 수 있는 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3의 변이체; 및 인간 IgG1 불변 도메인에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 인간 IgG1 불변 도메인의 신생아 Fc 수용체(FcRn) 결합 부분을 포함하는, TNF-알파에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질에 관한 것이다.
추가 양태에서, 항원 결합 단백질은 SEQ ID No. 2의 경쇄 서열 및 SEQ ID No. 12의 중쇄 서열을 포함하는 IgG에 비해 pH 6에서 증가된 FcRn 결합 친화성 및/또는 증가된 반감기를 갖는다.
명세서 전체에 걸쳐, 용어 "인간 IgG1 불변 도메인"은 당업자에게 공지된 모든 동종이형 및 이의 변이체를 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 CDRH1(SEQ ID NO: 27), CDRH2(SEQ ID NO: 28), CDRH3(SEQ ID No: 29), CDRL1(SEQ ID NO: 30), CDRL2(SEQ ID NO: 31), 및 CDRL3(SEQ ID NO: 32), 또는 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 또는 CDRL3에 비해 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 함유할 수 있는 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3의 변이체; 및 인간 IgG1 불변 도메인에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 인간 IgG1 불변 도메인의 신생아 Fc 수용체(FcRn) 결합 부분을 포함하는, TNF-알파에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질에 관한 것으로, 상기 항원 결합 단백질은 SEQ ID No. 2의 경쇄 서열 및 SEQ ID No. 12의 중쇄 서열을 포함하는 IgG에 비해 증가된 반감기를 가지며, 상기 항원 결합 단백질은 2주마다 1회 투여되는 SEQ ID No. 2의 경쇄 서열 및 SEQ ID No. 12의 중쇄 서열을 포함하는 IgG의 동일 용량에 의해 달성되는 것과 동등한 평균 항정-상태 최저 농도를 달성하기 위해 4주마다 1회 이하로 투여될 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 CDRH1(SEQ ID NO: 27), CDRH2(SEQ ID NO: 28), CDRH3(SEQ ID No: 29), CDRL1(SEQ ID NO: 30), CDRL2(SEQ ID NO: 31), 및 CDRL3(SEQ ID NO: 32), 또는 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 또는 CDRL3에 비해 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 함유할 수 있는 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3의 변이체; 및 인간 IgG1 불변 도메인에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 인간 IgG1 불변 도메인의 FcRn 결합 부분을 포함하는, TNF-알파에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질에 관한 것으로, 상기 항원 결합 단백질은 25℃에서 ProteOn XPR36 단백질 상호작용 어레이 시스템에 의해 평가시 pH 6에서 상기 변형이 없는 동일한 CDR을 갖는 항-TNF 항원 결합 단백질보다 2배, 또는 3배, 또는 4배 또는 5배, 또는 6배 또는 8배 또는 그 초과의 FcRn에 대한 친화성을 갖고, 상기 어레이 시스템은 칩 상에 고정된 항원 결합 단백질을 갖는다.
한 양태에서, 본 발명은 SEQ ID No. 2의 경쇄 서열 및 SEQ ID No. 12의 중쇄 서열을 포함하는 IgG의 변이체인 항원 결합 단백질에 관한 것으로, 상기 항원 결합 단백질 변이체는 상기 치환이 없는 IgG에 비해 항원 결합 단백질 변이체의 반감기를 증가시키기 위해 IgG 불변 도메인의 신생아 Fc 수용체(FcRn) 결합 부분 내에 하나 이상의 치환을 포함하며, 변이체가 4 내지 8주 간격으로 40 ㎎의 단일 용량으로 환자에 투여되는 경우, 환자 집단에서의 평균 항정-상태 최저 농도는 투여 간격 사이에 4 ㎍/㎖ 아래로 떨어지지 않거나, 5 ㎍/㎖ 아래로 떨어지지 않는다. 바람직하게는, 환자 집단에서의 평균 혈청 최저 항체 농도는 투여 간격 사이에 6 ㎍/㎖ 아래로 떨어지지 않는다. 바람직하게는, 환자 집단에서의 평균 혈청 최저 항체 농도는 변이체가 8주 간격으로 40 ㎎의 단일 용량으로 환자에 투여되는 경우에 투여 간격 사이에 5 ㎍/㎖ 아래로 떨어지지 않는다. 바람직하게는, 환자 집단에서의 평균 혈청 최저 항체 농도는 변이체가 8주 간격으로 40 ㎎의 단일 용량으로 환자에 투여되는 경우에 최적 효능을 여전히 제공하면서 투여 간격 사이에 4 ㎍/㎖ 아래로 떨어지지 않는다. 바람직하게는, 환자 집단에서의 평균 혈청 최저 항체 농도는 변이체가 8주 간격으로 40 ㎎의 단일 용량으로 환자에 투여되는 경우에 최적 효능을 여전히 제공하면서 투여 간격 사이에 3 ㎍/㎖ 아래로 떨어지지 않는다.
한 양태에서, 본 발명은 질병의 치료를 위한 본원에 개시된 항원 결합 단백질에 관한 것으로, 상기 항원 결합 단백질은 2주마다 1회 투여되는 SEQ ID No. 2의 경쇄 서열 및 SEQ ID No. 12의 중쇄 서열을 포함하는 IgG의 동일 용량에 의해 달성되는 것과 동등한 평균 항정-상태 최저 농도를 달성하기 위해 4주마다 1회 이하로 환자에게 투여될 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항원 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하는 질병을 가진 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
한 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항원 결합 단백질, 또는 이의 일부, 예를 들어, 중쇄 또는 경쇄를 인코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다. 한 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항원 결합 단백질, 또는 이의 일부, 예를 들어, 중쇄 또는 경쇄를 인코딩하는 발현 벡터에 관한 것이다.
한 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항원 결합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 한 양태에서, 본 발명은 건선 또는 류마티스 관절염의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 항원 결합 단백질에 관한 것이다.
한 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항원 결합 단백질을 포함하고, 본 발명에 따른 항원 결합 단백질 및 메토트렉세이트의 공동 전달을 위한 메토트렉세이트를 임의로 포함하는 키트에 관한 것이다.
한 양태에서, 본 발명은 메토트렉세이트로 이미 처리되는 개체에서 류마티스 관절염의 치료를 위한 본원에 개시된 항원 결합 단백질, 및 류마티스 관절염의 치료를 위한 메토트렉세이트와 조합된 항원 결합 단백질에 관한 것으로, 상기 조합물은 동시에, 실질적으로 동시에, 또는 순차적으로 전달된다.
한 양태에서, 본 발명은 메토트렉세이트로 이미 처리되는 개체에서 건선의 치료를 위한 본원에 개시된 항원 결합 단백질, 및 건선의 치료를 위한 메토트렉세이트와 조합된 항원 결합 단백질에 관한 것으로, 상기 조합물은 동시에, 실질적으로 동시에, 또는 순차적으로 전달된다.
도면의 간단한 설명
도 1 - 인간 TNFα로의 항-TNFα 항체의 결합
도 2 - 가속화 스트레스인자 연구 후의 인간 TNFα로의 항-TNFα 항체의 결합 활성의 분석
도 3 - 2주 동안 25% 인간 혈청에서의 인큐베이션 후 인간 TNFα로의 항-TNFα 항체의 결합
도 4 - 동결-해동 후의 인간 TNFα로의 항-TNFα 항체의 결합
도 5 - FcγRIIIa 수용체에 대한 항-TNFα 항체의 분석 (a) 인간 FcγRIIIa(발린 158 변이체)로의 결합 (b) 인간 FCγRIIIA(페닐알라닌 158 변이체)로의 결합
도 6 - 단일 정맥내(1시간 주입) 후의 암컷 시노몰구스(cynomolgus) 원숭이에서의 BPC2604 및 수컷 시노몰구스 원숭이에서의 파스콜리주맙(pascolizumab)의 평균 용량 표준화 혈장 농도
도 7 - 주요 피크 안정성 연구.
도 8 - Tm 불안정화.
도 9 - Tm 안정성 연구
도 10 (A) 물리적 안정성 [cIEF]: 열 안정성과 비-선형 상관관계.
도 10 (B) 화학 안정성 [SEC]:
도 10 (C) 열역학적/입체형태적 안정성 [DSC]:
도 11 - NaCl을 이용한 안정성 전망
발명의 상세한 설명
한 양태에서, 본 발명은 TNF-알파 항원 결합 단백질 및 히스티딘 완충제를 포함하는 액체 제형에 관한 것이다.
본 발명의 한 양태에서, 액체 제형은 본원에 기재된 바와 같은TNF-알파 항원 결합 단백질을 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 TNF-알파에 특이적으로 결합하는 신규한 항원 결합 단백질에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 아달리무맙과 비교하여 FcRn 수용체에 대한 증가된 결합 및/또는 증가된 반감기를 나타내는 아달리무맙과 같은 항-TNF 항체의 신규한 변이체에 관한 것이다. 아달리무맙은 SEQ ID No. 2의 경쇄 서열 및 SEQ ID No. 12의 중쇄 서열을 포함하는 IgG 모노클로날 항체이다.
본 발명자는 본원에 기재된 바와 같은 아달리무맙에 대한 특이적 변형이 하기 실시예에 제시된 바와 같이 FcRn 결합에서 특정한 개선을 나타내는 것을 발견하였다. 아달리무맙의 친화성 성숙된 변이체는 또한 항-TNF-알파 결합 및/또는 중화 활성에서 개선을 나타낸다.
본 발명의 신규한 항원 결합 단백질은 FcRn 수용체에 대한 증가된 결합 및/또는 증가된 반감기 및/또는 증가된 평균 체류 시간 및/또는 감소된 청소율을 갖는다. FcRn으로의 결합이 생체내에서 더 긴 혈청 체류를 발생시키는 것으로 생각된다. 생체내에서 Fc 단백질의 체류를 증가시키기 위해, 결합 친화성에서의 증가가 약 pH 6에서 관찰된다. 한 양태에서, 본 발명은 따라서 FcRn으로의 최적화된 결합을 갖는 항원 결합 단백질을 제공한다.
한 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질의 반감기는 SEQ ID No. 2의 경쇄 서열 및 SEQ ID No. 12의 중쇄 서열을 포함하는 IgG에 비해 2 내지 6배, 예를 들어, 2배, 3배, 4배, 5배 또는 6배 증가된다. 바람직하게는, 본 발명의 항원 결합 단백질의 반감기는 SEQ ID No. 2의 경쇄 서열 및 SEQ ID No. 12의 중쇄 서열을 포함하는 IgG에 비해 3배, 4배, 또는 그 초과로 증가된다. 예를 들어, IgG가 10일 또는 10 내지 20일 범위의 반감기를 갖는 아달리무맙인 경우, 한 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 약 40 내지 80일의 반감기를 나타낸다. 예를 들어, 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 15 또는 SEQ ID NO: 18 또는 SEQ ID NO: 21 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 163, 또는 SEQ ID NO: 165, 또는 SEQ ID NO: 167, 또는 SEQ ID NO: 169로부터 선택된 중쇄 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 환자에서 4주마다 1회 이하로 투여되는 본 발명의 항원 결합 단백질은 약 2 ㎍/㎖ 내지 약 7 ㎍/㎖의 평균 항정-상태 최저 농도를 달성한다. 바람직하게는, 평균 항정-상태 최저 농도는 약 4 ㎍/㎖ 내지 약 7 ㎍/㎖, 더욱 바람직하게는 약 5 ㎍/㎖ 내지 약 6 ㎍/㎖이다.
한 구체예에서, 환자에서 28일마다 1회 이하로 투여되는 본 발명의 항원 결합 단백질은 약 2 ㎍/㎖ 내지 약 7 ㎍/㎖의 평균 항정-상태 최저 농도를 달성한다. 바람직하게는, 평균 항정-상태 최저 농도는 약 4 ㎍/㎖ 내지 약 7 ㎍/㎖, 더욱 바람직하게는 약 5 ㎍/㎖ 내지 약 6 ㎍/㎖이다.
발명의 한 구체예에서, 동일 용량으로 2주마다 1회 투여되는 경우에 아달리무맙에 의해 달성된 것과 동등한 평균 항정-상태 최저 농도를 달성하기 위해 본 발명의 항원 결합 단백질은 4주, 5주, 6주, 7주 또는 8주마다 1회 투여될 수 있다.
본 발명의 모든 양태의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 7주 또는 8주마다 1회 투여될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 동일 용량으로 14일마다 1회 투여되는 경우에 아달리무맙에 의해 달성된 것과 동등한 평균 항정-상태 최저 농도를 달성하기 위해 본 발명의 항원 결합 단백질은 25-80일마다 1회, 예를 들어, 40-60일마다 1회, 또는, 예를 들어, 28일, 35일, 42일, 49일 또는 56일마다 1회 투여될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 49 내지 60일, 예를 들어, 56일마다 1회 투여될 수 있다.
본 발명의 모든 양태의 구체예에서, 항원 결합 단백질은 25℃에서 항체가 칩 상에 고정된 ProteOn XPR36 단백질 상호작용 어레이 시스템에 의해 평가시 pH 6에서 인간 FcRn에 대해 2배, 또는 4배, 또는 6배, 또는 8배 또는 그 초과의 친화성을 갖는다. 바람직하게는, 항원 결합 단백질은 약 100 내지 약 500 KD(nM), 예를 들어, 약 130 내지 약 360 KD(nM) 또는 약 140 내지 약 250KD(nM) 또는 약 140 내지 약 210KD(nM)의 인간 FcRn에 대한 친화성을 갖는다.
한 구체예에서, 항원 결합 단백질의 청소율은 약 2 내지 약 10 ㎖/hr, 바람직하게는 약 2 내지 약 5 ㎖/hr 또는 2 내지 4 ㎖/hr 또는 2 내지 3 ㎖/hr, 예를 들어, 약 2, 약 2.5, 3, 4 또는 5 ㎖/hr이다. 한 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 아달리무밥보다 2배, 3배, 4배 또는 5배 낮은 청소율을 나타낸다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 항원 결합 단백질에 대한 청소율은 약 40 ㎎의 인간 용량에서 상기 특정된 범위 내이거나 아달리무맙보다 2배, 3배, 4배 또는 5배 더 낮다.
한 양태에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 아달리무맙(SEQ ID No. 2의 경쇄 서열 및 SEQ ID No. 12의 중쇄 서열을 포함하는 IgG)의 변이체이며, 상기 변이체는 아달리무맙에 비해 변이체의 반감기를 증가시키기 위해 IgG 불변 도메인의 FcRn 결합 부분에 하나 이상의 치환을 포함하고, 상기 변이체가 4 내지 8주 간격, 바람직하게는 8주 간격으로 40 ㎎의 단일 용량으로 환자에 투여되는 경우, 환자 집단에서의 평균 항정-상태 최저 항체 농도는 5 ㎍/㎖ 아래로 떨어지지 않는다. 한 구체예에서, 환자 집단에서의 평균 항정-상태 최저 항체 농도는 투여 간격 사이에 6 ㎍/㎖ 아래로 떨어지지 않는다.
추가 구체예에서, 항원 결합 단백질은 상기 항원 결합 단백질의 Fc 영역에 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하며, 상기 변형은 아달리무맙 서열 내의 동일 위치와 비교하여 Fc 영역의 위치 250, 252, 254, 256, 257, 259, 308, 428 또는 434 중 하나 이상에 존재하고, Fc 영역의 아미노산의 넘버링은 케이뱃(Kabat)의 EU 지침의 넘버링이다.
야생형 인간 IgG1은 위치 308-314에 아미노산 잔기 Val-Leu-His-Gln-Asp-Trp-Leu, 위치 251-256에 아미노산 잔기 Leu-Met-Ile-Ser-Arg-Thr, 위치 428-436에 아미노산 잔기 Met-His-Glu-Ala-Leu-His-Asn-HisTyr, 및 위치 385-389에 아미노산 잔기 Gly-Gln-Pro-Glu-Asn을 갖는다. 잔기 넘버링은 IgG2-4에 대해 상이할 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 SEQ ID No. 13의 서열을 포함하는 인간 IgG1 불변 도메인에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인의 FcRn 결합 부분에서의 하나 이상의 아미노산 치환은 케이뱃의 EU 지침에 따라 넘버링된 아미노산 잔기 252, 254 및 256에 존재하고, 잔기 252에서의 aa 치환은 tyr, phe, tryp 또는 thr에 의한 met의 치환이고, 잔기 254에서의 aa 치환은 thr에 의한 ser의 치환이고, 잔기 256에서의 aa 치환은 ser, arg, glu, asp 또는 thr에 의한 thr의 치환이다. 바람직하게는, 잔기 252에서의 aa 치환은 tyr에 의한 치환이고, 잔기 254에서의 aa 치환은 thr에 의한 치환이고, 잔기 256에서의 aa 치환은 glu에 의한 치환이다. 바람직하게는, IgG1 불변 도메인은 SEQ ID No: 7에 제시된 바와 같다.
한 구체예에서, 인간 IgG1 불변 도메인의 FcRn 결합 부분에서의 하나 이상의 아미노산 치환은 케이뱃의 EU 지침에 따라 넘버링된 아미노산 잔기 250 및 428에 존재하고, 잔기 250에서의 aa 치환은 glu 또는 gln에 의한 thr의 치환이고, 잔기 428에서의 aa 치환은 leu 또는 phe에 의한 met의 치환이다. 바람직하게는, 잔기 250에서의 aa 치환은 glu에 의한 치환이고, 잔기 428에서의 aa 치환은 leu에 의한 치환이다. 바람직하게는, IgG1 불변 도메인은 SEQ ID No: 16에 제시된 바와 같다.
한 구체예에서, 인간 IgG1 불변 도메인의 FcRn 결합 부분에서의 하나 이상의 아미노산 치환은 케이뱃의 EU 지침에 따라 넘버링된 아미노산 잔기 428 및/또는 434에 존재한다. 바람직하게는, 잔기 428에서의 aa 치환은 leu에 의한 met의 치환이고, 잔기 434에서의 aa 치환은 ser에 의한 asn의 치환이다. 바람직하게는, IgG1 불변 도메인은 SEQ ID No: 10에 제시된 바와 같다.
한 구체예에서, 인간 IgG1 불변 도메인의 FcRn 결합 부분에서의 하나 이상의 아미노산 치환은 케이뱃의 EU 지침에 따라 넘버링된 아미노산 잔기 259 또는 308에 존재한다. 바람직하게는, 잔기 259에서의 치환은 ile에 의한 val의 치환이고, 잔기 308에서의 aa 치환은 phe에 의한 val의 치환이다. 바람직하게는, IgG1 불변 도메인은 SEQ ID No: 19 또는 SEQ ID No: 22에 제시된 바와 같다.
한 구체예에서, 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인의 FcRn 결합 부분에서의 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID No: 25에 제시된 바와 같이 케이뱃의 EU 지침에 따라 넘버링된 아미노산 잔기 257 및 434에 존재한다.
한 구체예에서, 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인의 FcRn 결합 부분에서의 하나 이상의 아미노산 치환은 케이뱃의 EU 지침에 따라 넘버링된 아미노산 잔기 433 및 434에 존재하고 예를 들어, 잔기는 H433K 및 N434F이다. 바람직하게는, IgG1 불변 도메인은 SEQ ID NO: 165 또는 SEQ ID No: 167에 제시된 바와 같다
한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 표 A에 나열된 IgG1 불변 도메인 변형 중 임의의 것을 포함한다.
한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 항체이다.
한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO: 6 및/또는 SEQ ID NO: 3의 가변 도메인, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 함유하고/하거나 SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 3의 길이에 걸쳐 적어도 90%의 동일성을 공유하는 SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 3의 가변 도메인의 변이체를 포함한다.
한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 SEQ ID No 5, 9 또는 15에 제시된 바와 같은 중쇄 서열과 함께 임의로 SEQ ID No: 2에 제시된 경쇄 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO: 78 또는 80에 제시된 바와 같은 가변 중쇄 도메인 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO: 145 또는 SEQ ID NO: 146에 제시된 바와 같은 중쇄 서열과 함께 임의로 SEQ ID Nos. 148, 150 또는 152에 제시된 경쇄 변이체를 포함한다.
한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 SEQ ID No 18 또는 21에 제시된 바와 같은 중쇄 서열과 함께 임의로 SEQ ID No: 2에 제시된 경쇄 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 항원 결합 단백질은 표 A에 특정된 가변 도메인 중 임의의 것을 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 항원 결합 단백질은 표 A에 제시된 바와 같은 cb1-3-VH, cb2-44-VH, cb1-39-VH, cb1-31-VH, cb2-11-VH, cb2-40-VH, cb2-35-VH, cb2-28-VH, cb2-38-VH, cb2-20-VH, cb1-8-VL 또는 cb1-43-VL의 서열을 갖는 가변 중쇄 도메인을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 항원 결합 단백질은 표 A에 제시된 바와 같은 cb1-45-VL, cb1-4-VL, cb1-41-VL, cb1-37-VL, cb1-39-VL, cb1-33-VL, cb1-35-VL, cb1-31-VL, cb1-29-VL, cb1-22-VL, cb1-23-VL, cb1-12-VL, cb1-10-VL, cb2-1-VL, cb2-11-VL, cb2-40-VL, cb2-35-VL, cb2-28-VL, cb2-20-VL, cb1-3-VL, cb2-6-VL 또는 cb2-44-VL의 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함한다.
예를 들어, 본 발명에 따른 항원 결합 단백질은 표 A에 제시된 바와 같은 cb1-3VH, cb2-44VH 또는 cb2-6VL의 서열을 갖는 가변 도메인을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 항원 결합 단백질은 표 A에 특정된 가변 도메인 중 임의의 것을 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO: 170 또는 SEQ ID NO: 174 또는 SEQ ID NO: 178로부터 선택된 서열을 갖는 가변 중쇄 도메인을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO: 171 또는 SEQ ID NO: 175 또는 SEQ ID NO: 179로부터 선택된 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함한다.
추가 구체예에서, 항원 결합 단백질은 표 A에 나열된 IgG1 불변 도메인 변형 중 임의의 것을 포함한다.
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 함유하고/하거나, 상기 언급된 가변 도메인 또는 중쇄 서열 또는 경쇄 서열 중 임의의 것의 길이에 걸쳐 적어도 90%의 동일성을 공유하는 상기 언급된 가변 도메인 또는 중쇄 서열 또는 경쇄 서열 모두의 변이체가 또한 본 발명의 범위 내에 속한다.
한 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 CDRH3(SEQ ID No: 29)의 변이체를 포함하며, 상기 변이체는 SEQ ID No: 29에 비해 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 갖는다. 한 구체예에서, 변이체 CDRH3는 SEQ ID Nos. 40 내지 49 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 서열을 가질 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 CDRH1(SEQ ID No: 27)의 변이체를 포함하며, 상기 변이체는 SEQ ID No: 27에 비해 1 또는 2개의 아미노산 치환을 갖는다. 한 구체예에서, 변이체 CDRH1은 SEQ ID Nos. 33 내지 38 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 서열을 가질 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 CDRL1(SEQ ID No: 30)의 변이체를 포함하며, 상기 변이체는 SEQ ID No: 30에 비해 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 갖는다. 한 구체예에서, 변이체 CDRL1은 SEQ ID Nos. 50 내지 61 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 서열을 가질 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 CDRL2(SEQ ID No: 31)의 변이체를 포함하며, 상기 변이체는 SEQ ID No: 31에 비해 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 갖는다. 한 구체예에서, 변이체 CDRL2는 SEQ ID Nos. 62 내지 72 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 서열을 가질 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 CDRL3(SEQ ID No: 32)의 변이체를 포함하며, 상기 변이체는 SEQ ID No: 32에 비해 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 갖는다. 한 구체예에서, 변이체 CDRL3는 SEQ ID Nos. 73 내지 76 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 서열을 가질 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명은 CDRH1(SEQ ID NO: 27), CDRH2(SEQ ID NO: 28), CDRH3(SEQ ID No: 29), CDRL1(SEQ ID NO: 30), CDRL2(SEQ ID NO: 31), 및 CDRL3(SEQ ID NO: 32)로부터 선택된 하나 이상의 CDR 또는 모든 CDR을 포함하는, TNF-알파에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질에 관한 것으로, 여기서 CDR 중 임의의 CDR은 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 또는 CDRL3에 비해 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 함유하는 변이체 CDR일 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 CDRH1, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함하며, 여기서 CDR 중 임의의 CDR은 CDRH1, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 또는 CDRL3에 비해 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 함유하는 변이체 CDR일 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함하며, 여기서 CDR 중 임의의 CDR은 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 또는 CDRL3에 비해 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 함유하는 변이체 CDR일 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항원 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 질병을 가진 인간 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 인간에서 질병의 치료를 위한 본원에 개시된 바와 같은 항원 결합 단백질에 관한 것이다.
본 발명은 또한 질병의 치료를 위한 약제의 제조에서의 본원에 개시된 바와 같은 항원 결합 단백질, 및 질병의 치료에 사용하기 위한 본원에 개시된 바와 같은 항원 결합 단백질의 용도에 관한 것이다.
한 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질에 의해 치료되는 질병은 류마티스 관절염, 다관절 소아 특발성 관절염, 건선성 관절염, 강직척추염, 궤양성 대장염, 척추관절병증, 크론병 또는 건선이다.
한 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 메토트렉세이트와 함께 투여된다. 메토트렉세이트는 항원 결합 단백질 이전, 이후 또는 동시, 또는 실질적으로 동시에 전달될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 류마티스 관절염을 앓고 있는 환자에게 메토트렉세이트와 함께 투여된다. 한 구체예에서, 메토트렉세이트는 항원 결합 단백질의 면역원성 효과를 감소시키기 위해 본 발명의 항원 결합 단백질을 투여받는 환자에게 투여된다. 한 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 이미 메토트렉세이트를 투여받는 환자에게 투여된다. 메토트렉세이트는 항원 결합 단백질, 예를 들어, 코르티코스테로이드에 대한 면역 반응을 감소시키는 다른 허용되는 화합물에 의해 대체될 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항원 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 질병을 가진 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 한 구체예에서, 상기 방법은 4주마다 1회 이하, 바람직하게는 5, 6, 7, 또는 8주마다 1회, 가장 바람직하게는 8주마다 1회로 단일한 20, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 또는 80 ㎎ 용량으로 환자에게 항원 결합 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 용량은 40 내지 80 ㎎, 예를 들어, 40㎎이다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 항원 결합 작제물 중 임의의 항원 결합 작제물의 중쇄를 포함하는 본원에 개시된 임의의 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 본원에 기재된 항원 결합 작제물 중 임의의 항원 결합 작제물의 경쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 동등한 폴리펩티드 서열에 해당하는 코딩 서열이나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 시작 코돈, 적절한 신호 서열 및 정지 코돈과 함께 발현 벡터로 클로닝될 수 있음이 이해될 것이다. 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 항원 결합 작제물 중 임의의 항원 결합 작제물의 중쇄 및/또는 경쇄를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포, 예를 들어, 재조합 세포, 형질전환된 세포 또는 트랜스펙션된 세포를 제공한다.
본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 작제물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 추가로 제공한다.
본 발명은 본원에 기재된 항원 결합 작제물 중 임의의 항원 결합 작제물의 생성을 위한 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 혈청-비함유/화학적으로 규명된/동물 유래 성분 비함유 배양 배지에서 본원에 기재된 항원 결합 작제물 중 임의의 항원 결합 작제물의 중쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제 1 벡터 및 본원에 기재된 항원 결합 작제물 중 임의의 항원 결합 작제물의 경쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제 2 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 대안적으로, 상기 방법은 적합하게는 혈청-비함유/화학적으로 규명된/동물 유래 성분 비함유 배양 배지에서 본원에 기재된 항원 결합 작제물 중 임의의 항원 결합 작제물의 중쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 본원에 기재된 항원 결합 작제물 중 임의의 항원 결합 작제물의 경쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 본원에 기재된 변형에 따라 Fc를 변형시킴으로써 항체의 반감기를 증가시키는 방법을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 향상된 FcRn 결합을 갖고, 효과기 기능의 또 다른 특성을 조절하는 하나 이상의 추가 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질을 포함한다.
요망되는 방법에 의해 발현된 후, 본 발명의 항원 결합 단백질은 이후 적절한 검정을 이용하여 시험관내 활성에 대해 시험된다. 현재, 항원 결합 작제물의 이의 표적으로의 정성적 및 정량적 결합을 평가하기 위해 종래의 ELISA 및 비아코어(Biacore) 검정 포맷이 이용된다. 또한, 일반적인 청소 메커니즘에도 불구하고 신체 내에서의 항원 결합 단백질의 지속을 평가하기 위해 수행되는 이후의 인간 임상 연구 전에 중화 효능을 확인하기 위해 다른 시험관내 검정이 또한 이용될 수 있다.
처리 용량 및 지속기간은 인간 순환에서의 본 발명의 분자의 상대 지속기간과 관련되며, 이는 본원에 제공된 정보를 기초로 하여 치료되는 질환 및 환자의 전반적 건강에 따라 당업자에 의해 조정될 수 있다. 최대 치료 효능을 달성하기 위해 연장된 기간(예를 들어, 4 내지 6개월)에 걸친 반복 투여(예를 들어, 4주, 5주, 6주, 7주 또는 8주마다 1회)가 필요할 수 있음이 예상된다.
본 발명의 치료제의 투여 방식은 숙주로 작용제를 전달하는 임의의 적합한 경로일 수 있다. 본 발명의 항원 결합 단백질, 및 약학적 조성물은 비경구 투여, 즉, 피하(s.c.), 수마강내, 복막내, 근내(i.m.), 정맥내(i.v.), 또는 비내 투여에 특히 유용하다. 한 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질 및 약학적 조성물은 피하 자가주사기 펜 또는 피하 사전-충전 주사기를 통해 투여된다.
본 발명의 항원 결합 단백질은 약학적으로 허용되는 담체 중에 활성 성분으로서 유효량의 본 발명의 항원 결합 단백질을 함유하는 약학적 조성물로서 제조될 수 있다. 본 발명의 예방제에서, 주사 준비 형태의 바람직하게는 생리학적 pH로 완충된 항원 결합 작제물을 함유하는 수성 현탁액 또는 용액이 바람직하다. 비경구 투여용 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 바람직하게는 수성 담체 중에 용해된 본 발명의 항원 결합 작제물 또는 이의 칵테일의 용액을 일반적으로 포함할 것이다. 다양한 수성 담체, 예를 들어, 0.9% 염수, 0.3% 글리신 등이 이용될 수 있다. 이들 용액은 멸균될 수 있고, 일반적으로 미립자 물질을 비함유한다. 이들 용액은 통상적인 널리 공지된 멸균 기술(예를 들어, 여과)에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 생리학적 조건에 근접화시키기 위해 필요한 약학적으로 허용되는 보조 물질, 예를 들어, pH 조정제 및 완충제 등을 함유할 수 있다. 상기 약학적 제형 내의 본 발명의 항원 결합 단백질의 농도는 약 0.5 중량% 미만, 일반적으로 1 중량% 또는 적어도 약 1 중량% 내지 15 또는 20 중량%만큼 많게 광범위하게 다양할 수 있고, 선택된 특정 투여 방식에 따라 유체 부피, 점도 등을 주로 기초로 하여 선택될 것이다.
아달리무맙은 고농도로 제형화시키기 어려운 것으로 보고되어 왔다. WO2004016286호에는 시트레이트-포스페이트 완충제 및 폴리올 및 세제를 포함하는 다른 성분을 포함하는 아달리무맙 제형이 기재되어 있다. PDA 협의회에서 2005년 10월 25일에 프레젠테이션된 구두 발표 "Humira® - from Development to Commercial Scale Production"에는 (i) 시트레이트-포스페이트 완충제; (ii) 아세테이트-포스페이트 완충제; 및 (iii) 포스페이트 완충제를 포함하는 제형이 보고되어 있다. 시험된 아세테이트-포스페이트 완충제는 아달리무맙에 대해 최악의 안정화 효과를 나타내었다. 문헌[Curtis et al. (2008) Current Medical Research and Opinion, Volume 27, p71-78]에는 주사가능한 아달리무맙을 이용하여 류마티스 관절염을 앓고 있는 환자에서의 주사-부위 작열통 및 천자통의 발생이 보고되어 있다. 작열통 및 천자통은 시트레이트 완충제-기반 제형에 부분적으로 기인된 것이다(Basic and Clinical Pharmacology & Toxicology, Volume 98, p218-221, 2006; 및 Journal of Pharmaceutical Sciences, Volume 97, p3051-3066, 2008). 그러나, WO20100129469호에는 시트레이트-포스페이트 완충제를 여전히 포함하고, 폴리올을 포함하나 염화나트륨을 포함하지 않는 다른 성분을 포함하는 고농도 아달리무맙 제형이 기재되어 있다. 더욱 최근의 WO2012065072호에는 계면활성제 및 폴리올을 포함하고, 완충제를 포함하지 않아, 이에 따라 주사시 임의의 시트레이트 완충제 효과를 회피하는 아달리무맙 제형이 기재되어 있다.
한 구체예에서, TNF-알파 항원 결합 단백질 및 히스티딘 완충제를 포함하는 액체 제형이 제공된다.
추가 구체예에서, TNF-알파 결합 단백질은 SEQ ID NO: 27 또는 SEQ ID NO: 33-38로부터 선택 CDRH1 및/또는 SEQ ID NO: 28의 CDRH2 및/또는 SEQ ID NO: 29 또는 SEQ ID NO: 40-49로부터 선택된 CDRH3 및/또는 SEQ ID NO: 30 또는 SEQ ID NO: 50-61로부터 선택된 CDRL1 및/또는 SEQ ID NO: 31 또는 SEQ ID NO: 62-72로부터 선택된 CDRL2 및/또는 SEQ ID NO: 32 또는 SEQ ID NO: 73-76의 CDRL3를 포함한다. 예를 들어, TNF-알파 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO: 27의 CDRH1 및 SEQ ID NO: 28의 CDRH2 및 SEQ ID NO:29의 CDRH3 및 SEQ ID NO: 30의 CDRL1 및 SEQ ID NO: 31의 CDRL2 및 SEQ ID NO: 32의 CDRL3 또는 이들의 변이체를 포함한다.
TNF-알파 항원 결합 단백질은 아달리무맙일 수 있다. TNF-알파 항원 결합 단백질은 BPC1494일 수 있다. TNF-알파 항원 결합 단백질은 BPC 1496일 수 있다.
본원에 기재된 TNF-알파 항원 결합 단백질은 히스티딘 완충제에서 제형화된다. 제형은 액체 형태일 수 있다. 제형은 계면 활성제, 킬레이트제, 폴리올, 항산화제 및 아미노산 중 하나 이상, 이들의 조합물, 또는 이들 모두를 추가로 포함할 수 있다. TNF-알파 항원 결합 단백질은 고농도, 예를 들어, 50 ㎎/㎖로 제형화된다. 한 구체예에서, 제형은 염을 포함하지 않는다. 다른 구체예에서, 제형은 추가 완충제 성분, 예를 들어, 시트레이트, 및/또는 포스페이트, 및/또는 아세테이트를 포함하지 않는다. 따라서, 본원에 기재된 제형은 안정적 제형으로 고농도로 TNF-알파 항원 결합 단백질, 특히 표 A에 기재된 바와 같은 TNF-알파 항원 결합 단백질을 제공하는 문제를 해결하고, 시트레이트-기반 완충제의 작열통 및 천자통 효과를 회피하며, 또한 이제까지 기재된 제형보다 더욱 안정적이다.
한 구체예에서, 히스티딘 완충제 제형은 계면활성제 및 킬레이트제를 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 히스티딘 완충제 제형은 계면활성제 및 폴리올을 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 히스티딘 완충제 제형은 계면활성제 및 아미노산을 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 히스티딘 완충제 제형은 계면활성제 및 항산화제를 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 히스티딘 완충제 제형은 킬레이트제 및 계면활성제를 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 히스티딘 완충제 제형은 킬레이트제 및 폴리올을 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 히스티딘 완충제 제형은 킬레이트제 및 아미노산을 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 히스티딘 완충제 제형은 폴리올 및 아미노산을 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 히스티딘 완충제 제형은 항산화제 및 폴리올을 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 히스티딘 완충제 제형은 항산화제 및 킬레이트제를 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 히스티딘 완충제 제형은 항산화제 및 아미노산을 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 히스티딘 완충제 제형은 폴리올 및 아미노산을 추가로 포함한다.
한 구체예에서, 히스티딘 완충제 제형은 계면활성제, 킬레이트제, 및 폴리올을 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 히스티딘 완충제 제형은 계면활성제, 킬레이트제, 및 아미노산을 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 히스티딘 완충제 제형은 계면활성제, 폴리올, 및 아미노산을 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 히스티딘 완충제 제형은 킬레이트제, 폴리올, 및 아미노산을 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 히스티딘 완충제 제형은 킬레이트제, 폴리올, 및 항산화제를 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 히스티딘 완충제 제형은 아미노산, 폴리올, 및 항산화제를 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 히스티딘 완충제 제형은 계면활성제, 폴리올, 및 항산화제를 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 히스티딘 완충제 제형은 계면활성제, 폴리올, 및 항산화제를 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 히스티딘 완충제 제형은 계면활성제, 킬레이트제, 및 항산화제를 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 히스티딘 완충제 제형은 계면활성제, 아미노산, 및 항산화제를 추가로 포함한다.
한 구체예에서, 히스티딘 완충제 제형은 계면활성제, 킬레이트제, 폴리올, 아미노산 및 항산화제를 추가로 포함한다.
한 구체예에서, 완충제는 히스티딘이다. 이는 5 내지 100 mM 히스티딘의 농도로 존재할 수 있다. 히스티딘은 10 내지 80 mM, 10 내지 50 mM, 20 내지 40 mM, 또는 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 또는 약 40 mM의 양으로 존재할 수 있다. 한 구체예에서, 히스티딘은 약 30 mM의 농도로 존재한다.
히스티딘 완충제는 유일한 완충제일 수 있다. 즉, 제형은 또 다른 완충제 성분, 예를 들어, 포스페이트 및/또는 시트레이트 및/또는 아세테이트 완충제를 포함하지 않을 수 있다. 시트레이트 완충제는 다음과 같은 다수의 이유로 제형에 유해할 수 있다: (i) 이는 3개의 해리 상수의 값이 3개의 양성자 수용체 상의 구별을 가능케 하기에 너무 가까워서 우수한 완충제가 아닐 수 있고; (ii) 시트레이트는 금속 킬레이트제로 작용하고, 따라서 금속 이온 균형에 영향을 미칠 수 있고; (iii) 시트레이트는 시트르산 회로의 대사물이고, 세포 대사에 영향을 미칠 잠재성을 갖는다.
적합한 계면활성제(세제로도 공지되어 있음)는, 예를 들어, 폴리소르베이트(예를 들어, 폴리소르베이트 20 또는 80), 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 예를 들어, Brij 35.RTM., 폴록사머(예를 들어, 폴록사머 188, 폴록사머 407), 트윈 20, 트윈 80, 크레모포르(Cremophor) A25, 심파텐스(Sympatens) ALM/230, 및 Mirj를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다. 제형은 0 내지 0.1% 농도의 폴리소르베이트 80을 포함할 수 있다. 대안적으로, 제형은 0.01 내지 0.1% 농도의 폴리소르베이트 80(0.1 내지 1㎎/㎖)을 포함할 수 있다. 폴리소르베이트 80은 0 내지 0.04%, 0.01 내지 0.05%, 또는 0.01 내지 0.03%; 또는 약 0.015%, 약 0.02%, 약 0.025%, 약 0.03% 또는 약 0.04%의 양으로 존재할 수 있다. 한 구체예에서, 폴리소르베이트 80은 약 0.02%의 농도로 존재한다. 고농도, 예를 들어, 0.1% 초과의 폴리소르베이트 80은 제형에 해로울 수 있는데, 이는 이러한 계면활성제가 제형의 저장시 산화의 수준을 증가시키고, 이에 따라 저장기간을 감소시킬 수 있는 높은 수준의 산화제를 함유할 수 있기 때문이다.
적합한 킬레이트제는 EDTA 및 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체)를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 킬레이트제는 EDTA이다. 제형은 0 내지 0.2 mM 농도의 EDTA를 포함할 수 있다. 대안적으로, 제형은 0.02 내지 0.2 mM 농도의 EDTA(0.00748 내지 0.0748 ㎎/㎖)를 포함할 수 있다. EDTA는 0.02 내지 0.15 mM, 0.02 내지 0.1 mM, 0.03 내지 0.08 mM, 또는 0.04 내지 0.06 mM, 또는 약 0.03 mM, 약 0.04 mM, 0.05 mM, 또는 약 0.06 mM의 양으로 존재할 수 있다. 한 구체예에서, EDTA는 약 0.05 mM(0.018㎎/㎖)의 농도로 존재한다.
한 구체예에서, 제형은 염을 포함하지 않는다. 그러나, 염이 첨가되는 경우, 적합한 염은 임의의 염-형성 반대이온, 예를 들어, 소듐을 포함할 수 있다. 예를 들어, 염화나트륨이 사용될 수 있거나, 소듐 염에서 반대이온으로서 클로라이드 대신 음이온성 아세테이트가 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 염은 염화나트륨이다. 제형은 0 내지 150 mM 농도의 염화나트륨을 포함할 수 있다. 대안적으로, 제형은 25 내지 150 mM 농도의 염화나트륨(1.461 내지 5.84㎎/㎖)을 포함할 수 있다. 염화나트륨은 35 내지 150 mM, 45 내지 80 mM, 25 내지 70 mM, 또는 45 내지 60 mM, 또는 45 mM, 46 mM, 47 mM, 48 mM, 49 mM, 50 mM, 51 mM, 52 mM, 53 mM, 54 mM, 55 mM의 양으로 존재할 수 있다. 한 구체예에서, 염화나트륨은 약 51 mM의 농도(2.98 ㎎/㎖)로 존재한다.
적합한 아미노산은 아르기닌 및/또는 글리신을 포함할 수 있다. 제형은 0.5 내지 5% 농도의 아르기닌 비함유 염기(5 내지 50 ㎎/㎖)를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 아르기닌 비함유 염기는 0.5 내지 4.0%, 0.5 내지 3.5%, 0.5 내지 3.0%, 0.5 내지 2.5%, 또는 약 0.5%, 약 0.75%, 약 1%, 약 1.5%, 약 2%, 또는 약 3%로 존재할 수 있다. 한 구체예에서, 아르기닌은 약 1%(10㎎/㎖)의 농도로 존재한다. 1% 아르기닌은 약 57 mM이다. 다른 구체예에서, 아르기닌은 0 내지 100 mM의 양으로 존재할 수 있다. 아르기닌은 25 내지 75 mM, 40 내지 80 mM, 또는 50 내지 75 mM, 약 50 mM, 또는 약 75 mM의 양으로 존재할 수 있다. 한 구체예에서, 아르기닌은 50 mM의 농도로 존재한다. 또 다른 구체예에서, 아르기닌은 75 mM의 농도로 존재한다. 대안적으로, 또는 아르기닌에 더하여, 제형 내에 글리신이 포함될 수 있다. 아르기닌에 대한 대안으로 글리신이 사용되는 경우, 상기 기재된 농도 범위가 글리신에 동등하게 적용될 수 있다. 아르기닌에 더하여 글리신이 사용되는 경우, 상기 기재된 농도 범위는 필요에 따라 다양한 비의 아르기닌 + 글리신의 추가 양이어야 한다.
적합한 폴리올은 다수의 하이드록실기를 갖는 물질을 포함할 수 있으며, 당(환원 및 비-환원 당), 당 알콜 및 당 산을 포함한다. 폴리올의 예는 프룩토스, 만노스, 말토스, 락토스, 아라비노스, 자일로스, 리보스, 람노스, 갈락토스, 글루코스, 수크로스, 트레할로스, 소르보스, 멜레지토스, 라피노스, 만니톨, 자일리톨, 에리트리톨, 트레이톨, 소르비톨, 글리세롤, L-글루코네이트 및 이들의 금속 염을 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명의 제형은 트레할로스를 포함한다. 제형은 0 내지 300 mM 농도의 트레할로스를 포함할 수 있다. 트레할로스는 50 내지 250 mM, 100 내지 250 mM, 또는 150 내지 225 mM, 약 150 mM, 또는 약 225 mM의 양으로 존재할 수 있다. 한 구체예에서, 트레할로스는 150 mM의 농도로 존재한다. 또 다른 구체예에서, 트레할로스는 225 mM의 농도로 존재한다.
적합한 항산화제는 메티오닌, 히스티딘, EDTA, 소듐 티오설페이트, 카탈라제, 또는 백금을 포함할 수 있다. 히스티딘 및 EDTA의 적합한 농도는 상기 기재되어 있다. 제형은 0 내지 30 mM 농도의 메티오닌을 포함할 수 있다. 메티오닌은 1 내지 20 mM, 또는 5 내지 15 mM, 약 5 mM, 약 10 mM, 또는 약 15 mM의 양으로 존재할 수 있다. 한 구체예에서, 메티오닌은 10 mM의 농도로 존재한다.
한 구체예에서, 히스티딘 완충제 제형은 트레할로오스, 메티오닌, 폴리소르베이트 80, EDTA, 및 아르기닌 비함유 염기 중 하나 이상, 이들의 조합물, 또는 이들 모두를 추가로 포함한다. 예를 들어, 히스티딘 완충제 제형은 트레할로스, 메티오닌, 및 아르기닌을 추가로 포함한다.
제형의 pH는 pH 5.0 내지 7.0으로 조정될 수 있다. 한 구체예에서, 제형의 pH는 5.0 내지 6.5이다. 다른 구체예에서, pH는 pH 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 또는 7.0일 수 있다. NaOH 또는 HCl이 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 또는 7.0으로 pH를 조정하기 위해 사용될 수 있다. 한 구체예에서, pH는 약 6.0이다.
본원에 기재된 TNF-알파 항원 결합 단백질은 20 내지 300 ㎎/㎖ 범위의 농도로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 단백질은 20-200 ㎎/㎖ 또는 50-100 ㎎/㎖; 또는 약 40 ㎎/㎖ 또는 약 45 ㎎/㎖ 또는 약 50 ㎎/㎖ 또는 약 55 ㎎/㎖ 또는 약 60 ㎎/㎖ 또는 약 70 ㎎/㎖ 또는 약 80 ㎎/㎖ 또는 약 90 ㎎/㎖, 또는 약 100㎎/㎖의 농도로 존재한다. 한 구체예에서, TNF-알파 항원 결합 단백질은 약 50 ㎎/㎖의 농도로 존재한다.
TNF-알파 항원 결합 단백질은 아달리무맙일 수 있다. TNF-알파 항원 결합 단백질은 BPC1494일 수 있다. TNF-알파 항원 결합 단백질은 BPC 1496일 수 있다.
한 구체예에서, 제형은 적어도 1년, 적어도 18개월, 또는 적어도 2년, 또는 적어도 3년 동안 안정적이다. 예를 들어, 제형은 적어도 1년, 적어도 18개월 또는 적어도 2년 동안 약 5℃의 온도에서 안정적이다. 다른 구체예에서, 제형은 실온(약 25℃)에서 안정적이다. 예를 들어, 제형은 적어도 14주, 적어도 12주, 적어도 8주, 적어도 2주, 적어도 1주, 적어도 6일, 적어도 5일, 적어도 4일, 적어도 3일, 적어도 2일 또는 적어도 1일 동안 약 25℃의 온도에서 안정적이다. 다른 구체예에서, 제형은 약 40℃의 온도에서 안정적이다. 예를 들어, 제형은 적어도 9주 또는 적어도 4주 동안 약 40℃의 온도에서 안정적이다.
따라서, 권장 시간 초과 동안 실온에 남아있을 수 있는 주사용의 사전-충전된 장치에서 형성되는 응집물 또는 저분자량 단편의 위험이 최소이다. 응집물은 잠재적으로 면역원성이며(The AAPS Journal 2006; 8 (3) Article 59 Themed Issue: Proceedings of the 2005 AAPS Biotec Open Forum on Aggregation of Protein Therapeutics, Guest Editor - Steve Shire, Effects of Protein Aggregates: An Immunologic Perspective 참조), 저분자량 단편은 미리 존재하는 자가항체를 유도할 수 있다(J Immunol 2008; 181:3183-3192; Human Anti-IgG1 Hinge Autoantibodies Reconstitute the Effector Functions of Proteolytically Inactivated IgGs1 참조).
액체 제형에서의 TNF-알파 항원 결합 단백질의 안정성은 시각 관찰에 의한 외관, 단백질 농도(A280nm), 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 모세관 등전 포커싱(C-IEF) 및 기능적 결합 검정(ELISA) 중 어느 하나 또는 이들의 조합에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 단량체, 응집물, 또는 단편, 또는 이들의 조합의 백분율이 안정성을 결정하는데 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 안정적인 액체 제형은 제형 내에 응집물로서 존재하는 약 10% 미만, 또는 약 5% 미만의 TNF-알파 항원 결합 단백질을 갖는 제형이다. 제형은 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 단량체 함량을 가질 수 있다. 제형은 약 2주 후에 실온(약 25℃)에서 상기 단량체 함량을 가질 수 있다. 제형은 약 1주 후에 실온(약 25℃)에서 상기 단량체 함량을 가질 수 있다. 제형은 약 1일 후에 실온(약 25℃)에서 상기 단량체 함량을 가질 수 있다. 최종 단량체 함량이 시작 물질의 순도에 따라 다양할 수 있음이 이해되어야 한다. 한 구체예에서, 따라서 응집물 %에서의 연간 증가는 1% 이하이다.
BPC1494 항원 결합 단백질은 다중 분해 경로를 나타낸다는 점에서 희귀하다. 이들은 응집, 단편화, 탈아미드화 및 산화를 포함한다. 따라서, 히스티딘 기반 완충제의 사용은 매우 바람직한 것으로 제시된다.
본 발명의 한 양태에서, TNF-알파 항원 결합 단백질을 포함하는 액체 제형이 제공되며, 상기 TNF-알파 항원 결합 단백질은 SEQ ID No: 5에 따른 중쇄 및 SEQ ID No: 2에 따른 경쇄를 포함하고, 상기 제형은 30 mM 농도의 히스티딘; 150 mM 농도의 트레할로스; 50 mM 농도의 아르기닌; 10 mM 농도의 메티오닌; 0.05 mM 농도의 EDTA; 0.02% 농도의 PS80을 함유하고, pH는 약 pH 6.0으로 조정된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, TNF-알파 항원 결합 단백질을 포함하는 액체 제형이 제공되며, 상기 TNF-알파 항원 결합 단백질은 SEQ ID No: 5에 따른 중쇄 및 SEQ ID No: 2에 따른 경쇄를 포함하고, 상기 제형은 30 mM 농도의 히스티딘; 225 mM 농도의 트레할로스; 75 mM 농도의 아르기닌; 10 mM 농도의 메티오닌; 0.05 mM 농도의 EDTA; 0.02% 농도의 PS80을 함유하고, pH는 약 pH 6.0으로 조정된다.
따라서, 주사용의 본 발명의 약학적 조성물은 1 ㎖의 멸균 완충수, 및 약 1 ㎎ 내지 약 100 ㎎, 예를 들어, 약 30 ㎎ 내지 약 100 ㎎ 또는 더욱 바람직하게는 약 35 ㎎ 내지 약 80 ㎎, 예를 들어, 40, 50, 80 또는 90 ㎎의 본 발명의 항원 결합 작제물을 함유하도록 제조될 수 있다. 비경구 투여가능한 조성물을 제조하기 위한 실제 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있거나 명백할 것이며, 이는, 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania]에 더욱 상세히 기재되어 있다. 본 발명의 정맥내 투여가능한 항원 결합 작제물 제형의 제조를 위해, 문헌[Lasmar U and Parkins D "The formulation of Biopharmaceutical products", Pharma. Sci.Tech.today, page 129-137, Vol.3 (3rd April 2000), Wang, W "Instability, stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals", Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188, Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and B ed Ahern T.J., Manning M.C., New York, NY: Plenum Press (1992), Akers,M.J. "Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations", J.Pharm Sci 91 (2002) 2283-2300, Imamura, K et al "Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state", J Pharm Sci 92 (2003) 266-274,Izutsu, Kkojima, S. "Excipient crystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying", J Pharm. Pharmacol, 54 (2002) 1033-1039, Johnson, R, "Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein lyophilization", J. Pharm. Sci, 91 (2002) 914-922]을 참조하라.
바람직하게는, 발명의 항원 결합 단백질은 약 40 ㎎의 용량으로 제공되거나 투여된다. 바람직하게는, 항원 결합 단백질은 피하 전달에 적합하고, 피하 전달된다. 본원에 개시된 바와 같은 다른 투약 또는 투여 경로가 또한 이용될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 임의의 양태에 따른 항원 결합 단백질은 SEQ ID No. 2의 경쇄 서열 및 SEQ ID No. 12의 중쇄 서열을 포함하는 IgG에 비해 증가된 평균 체류 시간을 나타낸다.
IgG 불변 도메인 또는 이의 FcRn 결합 부분을 포함하는 변형된 IgG 및 분자의 결합 능력은 다양한 시험관내 검정에 의해 특성규명될 수 있다. 워드(Ward)에 의한 PCT 공보 WO 97/34631호에는 다양한 방법이 상세히 개시되어 있다. 예를 들어, FcRn에 결합하는 변형된 IgG 또는 이의 단편의 능력과 야생형 IgG의 능력을 비교하기 위해, 변형된 IgG 또는 이의 단편 및 야생형 IgG는 방사성 표지될 수 있고, 시험관 내에서 FcRn-발현 세포와 반응될 수 있다. 세포-결합 분획의 방사능은 이후 카운팅되고 비교될 수 있다. 이러한 검정에 사용되는 FcRn 발현 세포는 B10.DBA/2 마우스의 폐로부터 유래된 마우스 폐 모세혈관 내피 세포(B10, D2.PCE) 및 C3H/HeJ 마우스로부터 유래된 V40 형질전환 내피 세포(SVEC)(Kim et al., J Immunol., 40: 457-465,1994)를 포함하는 내피 세포주일 수 있다. 그러나, 선택 종의 재조합 FcRn을 발현하는 포유동물 세포를 포함하는 FcRn의 충분한 수를 발현하는 다른 유형의 세포가 또한 사용될 수 있다. 대안적으로, 변형된 IgG의 결합 분획 또는 변형되지 않은 IgG의 결합 분획 방사능을 카운팅한 후, 결합된 분자는 이후 세제를 이용하여 추출될 수 있고, 세포의 단위 수 당 방출 퍼센트가 계산되고 비교될 수 있다.
FcRn에 대한 본 발명의 항원 결합 단백질의 친화성은, 예를 들어, 이전에 기재된 바와 같이 BIAcore 2000(BIAcore Inc.)을 이용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR) 측정에 의해 측정될 수 있다(Popov et al., Mol. Immunol., 33: 493-502,1996; Karlsson et al., J Immunol. Methods, 145: 229-240,1991, 상기 두 문헌은 이들의 전체내용이 참조로서 포함됨). 이 방법에서, FcRn 분자는 BIAcore 센서 칩(예를 들어, Pharmacia사의 CM5 칩)에 커플링되고, 고정된 FcRn으로의 변형된 IgG의 결합이 BIA evaluation 2.1 소프트웨어를 이용하여 센서그램을 수득하기 위해 특정 유량에서 측정되며, 이를 기초로 하여 FcRn에 대한 변형된 IgG, 불변 도메인, 또는 이들의 단편의 결합 속도(on-rate) 및 분리 속도(off-rate)가 계산될 수 있다. FcRn에 대한 본 발명의 항원 결합 단백질 및 변형되지 않은 IgG의 상대 친화성은 간단한 경쟁 결합 검정에 의해 또한 측정될 수 있다. 또한, FcRn에 대한 변형된 IgG 또는 이의 단편, 및 야생형 IgG의 친화성은 포화 연구 및 스캐챠드 분석에 의해 또한 측정될 수 있다.
FcRn에 의한 세포를 가로지르는 변형된 IgG 또는 이의 단편의 전달은 방사선표지된 IgG 또는 이의 단편 및 FcRn-발현 세포를 이용하고, 세포 단층의 한면의 방사능과 다른 면의 방사능을 비교하는 시험관내 전달 검정에 의해 측정될 수 있다. 대안적으로, 상기 전달은 10 내지 14일령의 포유아 마우스에 방사선표지된 변형된 IgG를 먹이고, 장을 통한 순환(또는 임의의 다른 표적 조직, 예를 들어, 폐)으로의 IgG의 전달을 나타내는 혈액 샘플에서의 방사능을 주기적으로 카운팅함으로써 생체내에서 측정될 수 있다. 장을 통한 IgG 전달의 용량-의존적 억제를 시험하기 위해, 특정 비율의 방사선표지된 IgG 및 표지되지 않은 IgG의 혼합물이 마우스에 제공되고, 혈장의 방사능이 주기적으로 측정될 수 있다(Kim et al., Eur. R Immunol., 24: 2429-2434,1994).
항원 결합 단백질의 반감기는 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Kim et al. (Eur. J. of Immuno. 24: 542,1994)]에 기재된 방법에 따른 약동학 연구에 의해 측정될 수 있다. 이러한 방법에 따르면, 방사선표지된 항원 결합 단백질은 마우스로 정맥내 주사되고, 이의 혈장 농도는 시간의 함수로서, 예를 들어, 주사 3분 내지 72시간 후에 주기적으로 측정된다. 이에 따라 수득된 청소 곡선은 이상성(biphasic)이어야 한다. 변형된 IgG 또는 이의 단편의 생체내 반감기의 결정을 위해, β-상의 청소율이 계산되고, 변형되지 않은 IgG의 청소율과 비교된다.
본 발명의 항원 결합 단백질은 항원에 면역특이적으로 결합하는 능력에 대해 검정될 수 있다. 상기 검정은 용액 중(예를 들어, Houghten, BiolTechniques, 13: 412-421,1992), 비드 상(Lam, Nature, 354: 82-84,1991), 칩 상(Fodor, Nature, 364: 555-556,1993), 박테리아 상(미국 특허 번호 5,223,409호), 포자 상(미국 특허 번호 5,571,698호; 5,403,484호; 및 5,223,409호), 플라스미드 상(Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 1865-1869,1992) 또는 파지 상(Scott and Smith, Science, 249: 386-390,1990; Devlin, Science, 249: 404-406,1990; Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6378-6382, 1990; 및 Felici, J : Mol. Biol., 222: 301-310, 1991)(이들 참고문헌 각각은 전체내용이 참조로서 본원에 포함됨)에서 수행될 수 있다. 항원 또는 이의 단편에 면역특이적으로 결합하는 것으로 확인된 항체는 항원에 대한 이들의 특이적 친화성에 대해 이후 검정될 수 있다.
본 발명의 항원 결합 단백질은 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 항원에 대한 면역특이적 결합 및 다른 항원과의 교차-반응성에 대해 검정될 수 있다. 면역특이적 결합 및 교차-반응성을 분석하기 위해 이용될 수 있는 면역검정은 몇가지 예를 들어, 웨스턴 블롯, 방사선면역측정법, ELISA(효소결합면역흡착측정법), "샌드위치" 면역검정, 면역침전 검정, 침전소 반응, 젤 확산 침전소 반응, 면역확산 검정, 응집 검정, 보체-고정 검정, 면역방사측정법, 형광 면역검정, 단백질 A 면역검정과 같은 기술을 이용한 경쟁 및 비-경쟁 검정 시스템을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 검정은 일상적인 것으로, 당 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York] 참조). 예시적 면역검정은 하기에 간략히 기재되어 있다(그러나 이로 제한하고자 하는 것은 아니다).
바람직한 구체예에서, 항원에 대한 항체의 결합 속도 및 분리 속도를 결정하기 위해 BIAcore 동역학 분석이 이용된다. BIAcore 동역학 분석은 칩으로부터의 항원과 칩의 표면 상의 고정된 항체의 결합 및 해리를 분석하는 것을 포함한다.
항원 결합 단백질: 본원에서 사용되는 용어 "항원 결합 단백질"은 TNF-알파에 결합할 수 있는 항체, 항체 단편 및 다른 단백질 작제물에 대한 언급을 포함한다.
항체: 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 본원에서 사용되며, 면역글로불린-유사 도메인을 갖는 분자에 대한 언급을 포함하고, 모노클로날, 재조합, 폴리클로날, 키메라, 인간화, 이특이적 및 헤테로컨쥬게이트 항체를 포함한다.
인간 IgG1 중쇄 불변 도메인은 대립유전자 변이체를 포함하는 자연에서 발견되는 IgG1 중쇄 불변 도메인에 대한 인간 아미노산 서열을 나타낸다.
"반감기(t1/2)"는 항원 결합 폴리펩티드의 농도가 이의 본래의 값의 절반에 도달하는데 필요한 시간을 나타낸다. 단백질의 혈청 반감기는 문헌[Kim et al. (Eur. J. of Immuno. 24: 542, 1994)]에 기재된 방법에 따른 약동학 연구에 의해 측정될 수 있다. 이러한 방법에 따르면, 방사선표지된 단백질은 마우스로 정맥내 주사되고, 이의 혈장 농도는 시간의 함수로서, 예를 들어, 주사 약 3분 내지 약 72시간 후에 주기적으로 측정된다. 분자의 약동학 분석 및 반감기의 결정을 위한 다른 방법은 당업자에게 익숙할 것이다. 세부사항은 문헌[Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Peters et al, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996)]에서 발견될 수 있다. t 알파 및 t 베타 반감기 및 곡선하 영역(AUC)과 같은 약동학 파라미터를 기재하는 문헌["Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. ex edition (1982)] 및 문헌["Clinical Pharmacokinetics: Concepts and Applications", Rowland and Tozer, Third Edition (1995)]이 또한 참조된다.
"청소(CL)"는 단위 시간 당 단백질의 비가역적으로 청소된 혈장 부피를 나타낸다. 청소는 용량/AUC로 계산된다(AUC는 곡선하 영역 또는 혈장 약물 농도 시간 곡선하 영역이다). 청소는 또한 약물의 혈장 농도에 의해 나누어진 약물 제거 속도(제거 속도 = CL* 농도)에 의해 계산될 수 있다.
"평균 체류 시간(MRT)"은 항원 결합 폴리펩티드가 비가역적으로 제거되기 전에 신체에 존재하는 평균 시간이다. MRT= AUMC/AUC로 계산된다.
"항정 상태 농도"(Css)는 약물 제거 속도가 지속된 약물 투여의 결과로서 약물 투여 속도와 동등해지는 경우에 도달된 농도이다. CSS는 피크와 최저 수준 사이에서 변동하고, 마이크로그램/㎖로 측정된다. "평균 항정-상태 최저 농도"는 제공된 시간에서 환자 집단에 걸친 최저 수준의 평균을 나타낸다.
"동등한 평균 항정-상태 최저 농도"는 언급된 값과 동일하거나 언급된 값의 약 10% 내지 30% 이내인 평균 항정-상태 최저 농도를 나타낸다. 본 발명의 항원 결합 폴리펩티드에 대한 동등한 평균 항정-상태 최저 농도는 평균 항정-상태 최저 농도가 SEQ ID No. 2의 경쇄 서열 및 SEQ ID No. 12의 중쇄 서열을 포함하는 IgG로 달성된 평균 항정-상태 최저 농도에 0.8 내지 1.25배인 것으로 간주될 수 있다.
반감기 및 AUC는 시간에 대한 약물(예를 들어, 본 발명의 항원 결합 폴리펩티드)의 혈청 농도의 곡선으로부터 결정될 수 있다. 반감기는 구획 또는 비-구획 분석을 통해 결정될 수 있다. WINNONLIN™ 분석 패키지(Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, USA로부터 이용가능함)가, 예를 들어, 곡선을 모델링하기 위해 이용될 수 있다. 한 구체예에서, "반감기"는 말기 반감기를 나타낸다.
특이적으로 결합하다: 항원 결합 단백질과 관련하여 본 명세서 전체에 걸쳐 사용되는 용어 "특이적으로 결합하다"는 항원 결합 단백질이 다른 관련되지 않은 단백질에 결합하지 않거나 극소로 결합하면서 TNF-알파에 결합하는 것을 의미한다. 그러나, 상기 용어는 항원 결합 단백질이 또한 밀접하게 관련된 분자와 교차-반응성일 수 있다는 사실을 배제하지 않는다. 본원에 기재된 항원 결합 단백질은 이들이 밀접하게 관련된 분자에 결합하는 것보다 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 50배, 적어도 100배, 또는 적어도 1000배 더 큰 친화성으로 TNF-알파에 결합할 수 있다.
CDR:
　"CDR"은 항원 결합 단백질의 상보성 결정 영역 아미노산 서열로 정의된다. 이들은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 과가변 영역이다. 면역글로불린의 가변 부분 내에 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR(또는 CDR 영역)이 존재한다. 따라서, 본원에서 사용되는 "CDR"은 3개 모두의 중쇄 CDR, 3개 모두의 경쇄 CDR, 모든 중쇄 및 경쇄 CDR, 또는 적어도 2개의 CDR을 나타낸다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 가변 도메인 서열 및 전장 항체 서열 내의 아미노산 잔기는 케이뱃 넘버링 규약에 따라 넘버링된다. 유사하게, 실시예에서 사용되는 용어 "CDR", "CDRL1", "CDRL2", "CDRL3", "CDRH1", "CDRH2", "CDRH3"는 케이뱃 넘버링 규약에 따른다. 추가 정보를 위해, 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)]을 참조하라.
변이체의 동일성 %: 용어 "동일한" 또는 "서열 동일성"은 최적으로 정렬되고 적절한 삽입 또는 결실과 비교되는 경우에 2개의 핵산 또는 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성의 정도를 나타낸다. 본원에 기재된 변이체는 아미노산 수준에서 자연 CDR 또는 가변 도메인 서열과 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 가질 수 있다.
본원에 기재된 특정 구체예는 예시의 목적으로 제시되며, 본 발명을 제한하는 것이 아님이 이해될 것이다. 본 발명의 주요 특징은 본 발명의 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 구체예에서 이용될 수 있다. 당업자는 본원에 기재된 특정 절차에 대한 다수의 동등물을 인지하거나, 일상적인 것을 넘어서지 않는 연구를 이용하여 확인할 수 있을 것이다. 상기 동등물은 본 발명의 범위 내인 것으로 간주되고, 청구항에 의해 포함된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 분야의 당업자의 수준을 나타낸다. 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별적 간행물 또는 특허 출원이 참조로서 포함되는 것으로 특별히 및 개별적으로 나타낸 것과 동일한 정도로 참조로서 본원에 포함된다. 청구항 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우 단수 용어의 사용은 "하나"를 의미할 수 있으나, 이는 또한 "하나 초과", "적어도 하나", 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와 일치할 수 있다. 청구항에서의 용어 "또는"의 사용은, 본 발명의 개시가 단지 대안 및 "및/또는"을 나타내는 정의를 뒷받침함에도 불구하고, 대안만 나타내는 것으로 명백히 지정되거나 대안이 상호 배타적이지 않는 한 "및/또는"을 의미하기 위해 사용된다. 본 출원 전체에 걸쳐, 용어 "약"은 어떠한 값이 이러한 값을 결정하기 위해 이용되는 장치 및 방법에 대한 고유한 오차 변동, 또는 연구 대상체 사이에 존재하는 변동을 포함하는 것을 나타내기 위해 사용된다.
본 명세서 및 청구항(들)에서 사용되는 바와 같은, 용어 "포함하는"(및 "-들을 포함하다" 및 "-을 포함하다"와 같은 포함하는의 임의의 형태), "갖는"(및 "-들을 갖다" 및 "-을 갖다"와 같은 갖는의 임의의 형태), "포함하여"(및 "-을 포함하여" 및 "-들을 포함하여"와 같은 포함하여의 임의의 형태) 또는 "함유하는"(및 "-을 함유하는" 및 "-들을 함유하는"과 같은 함유하는의 임의의 형태)는 총괄적이거나 열린 형태이며, 추가의 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 한 양태에서, 상기 열린 형태 용어는 또한 이들의 범위 내에 제한되거나 폐쇄된 정의, 예를 들어, "본질적으로 구성되는" 또는 "구성되는"을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "또는 이의 조합"은 상기 용어 전의 나열된 항목의 모든 순열 및 조합을 나타낸다. 예를 들어, "A, B, C, 또는 이의 조합"은 A, B, C, AB, AC, BC, 또는 ABC, 및 순서가 특정 상황에서 중요한 경우, 또한 BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC, 또는 CAB 중 적어도 하나를 포함하는 것으로 의도된다. 상기 예에 계속하여, 하나 이상의 항목 또는 용어의 반복, 예를 들어, BB, AAA, AB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB 등을 함유하는 조합이 특별히 포함된다. 당업자는 문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한 통상적으로 임의의 조합의 항목 또는 용어의 수에 대해 제한이 없는 것을 이해할 것이다.
본원에 개시되고 청구된 조성물 및/또는 방법 모두는 본 발명의 개시에 비추어 과도한 실험 없이 이루어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 구체예에 의해 기재되었으나, 본 발명의 개념, 사상 및 범위로부터 벗어나지 않고 조성물 및/또는 방법 및 본원에 기재된 방법의 단계 또는 단계의 순서에 변화가 적용될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 상기 모든 유사한 치환 및 변형은 첨부된 청구항에 의해 정의되는 바와 같은 본 발명의 사상, 범위 및 개념 내에 속하는 것으로 간주된다.
본원에 언급된 모든 문헌은 허용될 수 있는 최대 범위로 참조로서 포함된다.
개시내용의 임의의 구성요소는 본 출원의 상황으로부터 달리 명백하지 않은 한 개시내용의 임의의 다른 구성요소와 조합되는 것으로 명백히 간주된다.
본 발명은 본 발명을 제한하는 것이 아닌 하기 실시예를 참조로 하여 추가로 기재된다.
실시예
실시예 1: 항체 발현 벡터의 클로닝
항-TNFα 항체의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 인코딩하는 DNA 발현 작제물을 새로이 사전에 제조하였고, 포유동물 발현 벡터로의 클로닝을 위한 제한 부위를 포함시켰다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열 둘 모두는 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된 서열이었다(방법에 대해, WO2009024567호 및 Kotsopoulou et al, J Biotechnol (2010) 146: 186-193 참조). 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 기재하는 정보는 미국 특허 US6090382호에서 발견될 수 있다. 본 연구에서 사용되는 작제물을 생성시키기 위해, 가변 중쇄 도메인(VH) 서열을 PCR을 이용하여 증폭시켰다. PCR 프라이머는 인간 γ1 불변 영역을 함유하는 pTT 포유동물 발현 벡터로의 클로닝을 위한 신호 서열을 함유하는 VH 도메인을 구성시키기 위해 HindIII 및 SpeI 제한 부위를 함유하였다. 유사하게, 인간 카파 불변 영역을 함유하는 pTT 포유동물 발현 벡터로의 클로닝을 촉진시키기 위해 VL 도메인 서열을 HindIII 및 BsiWI 제한 부위를 함유하는 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 중쇄 발현 플라스미드에는 코드 SJC322가 제공되었고, 경쇄 발현 플라스미드에는 플라스미드 코드 SJC321이 제공되었다.
CDR 영역 내에 변형을 갖는 항-TNFα 항체의 대안적 가변 중쇄 및 경쇄 영역을 인코딩하는 DNA 발현 작제물(Rajpal et al. PNAS (2005) 102(24): pg 8466-8471에 기재된 바와 같음)이 중첩 올리고뉴클레오티드의 형성 및 상기 기재된 것과 유사한 분자생물학 기술에 의해 새로이 제조되었다. 변이체 cb1-3, cb2-6 및 cb2-44의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 생성된 플라스미드가 표 1에 기재되어 있다.
실시예 2: Fc 영역의 조작
Quikchange 프로토콜(Promega)을 이용하여 파스콜리주맙(항-IL-4 항체)의 중쇄를 인코딩하는 플라스미드의 인간 γ1 불변 영역으로 변형(M252Y/S254T/T256E 및 T250Q/M428L)을 도입시키기 위해 정방향 및 역방향 프라이밍 프라이머를 사용하였다.
상기 실시예 1에 기재된 바와 같이, 항-TNFα 항체의 VH 도메인을 인코딩하는 PCR 단편을 주형으로서 이전에 작제된 코돈 최적화된 벡터를 이용하여 생성시켰다. 생성된 단편을 HindIII 및 SpeI을 이용하여 이전 단락에 기재된 변형된 인간 γ1 불변 영역을 함유하는 pTT 발현 벡터로 클로닝하였다. M252Y/S254T/T256E 변형을 갖는 항-TNFα 항체의 중쇄를 인코딩하는 플라스미드를 SJC324로 지정하였다. T250Q/M428L 변형을 갖는 중쇄를 인코딩하는 플라스미드를 SJC323으로 지정하였다.
Quikchange 프로토콜(Promega)을 이용하여 항-TNFα 중쇄 발현 플라스미드 SJC322의 인간 γ1 불변 영역으로 변형을 도입시키기 위해 정방향 및 역방향 프라이밍 프라이머를 사용하였다. 플라스미드 SJC326은 인간 γ1 불변 영역 내에 M428L/N434S 변형을 함유하는 항-TNFα 중쇄를 인코딩한다. 플라스미드 SJC328은 인간 γ1 불변 영역 내에 V308F 변형을 함유하는 항-TNFα 중쇄를 인코딩한다.
실시예 3: pTT5 에피솜 벡터를 이용한 HEK2936E 세포에서의 항체의 발현
상기 기재된 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 발현 플라스미드를 HEK 293 6E 세포로 일시적으로 공동-트랜스펙션시켰다. 발현된 항체를 1 ㎖ HiTrap-단백질 A 컬럼(GE Healthcare)을 이용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 상층액으로부터 정제하였다. 하기 표 1은 생성된 항체의 목록을 제시한다.
일부 항체를 또한 다양한 세트의 발현 벡터를 이용하여 CHO 세포에서 발현시켰다. 분자 생물학, 발현 및 정제의 설명을 위해 실시예 13, 14 및 15를 참조하라.
표 1: 발현된 항체의 목록
Figure pct00001
실시예 4: 직접 결합 ELISA에서의 종양 괴사 인자 알파로의 항체의 결합
재조합 종양 괴사 인자 알파(TNFα)로의 단백질 A를 이용하여 정제된 발현된 항체의 결합을 시험하기 위해 결합 ELISA를 수행하였다. ELISA 플레이트를 0.1 ㎍/㎖로 재조합 인간 TNFα를 이용하여 코팅하고, 블로킹 용액(4% BSA)을 이용하여 블로킹하였다. 정제된 항체의 다양한 희석액을 첨가하고(0.05% Tween 20을 함유하는 pH 8.0의 Tris-완충된 염수 중 4% BSA에 희석됨), 플레이트를 탈이온수에서의 세척 전 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 블로킹 용액에서의 퍼옥시다제 표지된 항 인간 카파 경쇄 항체(Sigma A7164)의 첨가에 의해 결합을 검출하였다. 플레이트를 탈이온수에서의 세척 전에 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 OPD 기질(Sigma P9187)의 첨가에 의해 발달시키고, 2M HCl의 첨가에 의해 색 발달을 중지시켰다. 흡광도를 플레이트 판독기를 이용하여 490nm에서 측정하고, 평균 흡광도를 농도에 대해 플로팅하였다. 결과는 도 1에 제시되며, 이는 모든 항체가 유사한 프로파일을 갖는 것을 입증한다.
실시예 5: L929 시험관내 중화 검정에서의 항체의 분석
본 검정을 TNF-α를 중화시키고, 세포 사멸을 억제하는 항체의 중화 능력을 시험하기 위해 이용하였다. 간단히, L929 세포를 100㎕ RPMI 1640(w/o 페놀 레드) 중 10,000/웰로 96-웰 편평-바닥 플레이트에 시딩하고, 37℃, 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 1시간 동안 1.25 ㎍/㎖ 악티노마이신 D로 감작시켰다. 중화 연구를 위해, 0.001-60㎍/㎖(0.0067-400 nm)의 항-TNF-α mAb를 실온에서 1시간 동안 1:1의 비율로 약 2ng/㎖(약 0.05nM)의 TNF-α와 함께 예비-인큐베이션하였다. 대조군 그룹에 대해, 항체 대신 RPMI를 사용하였다. 악티노마이신 D와의 1시간의 예비-인큐베이션 후, 20㎕의 항체-항원 복합체를 웰 당 첨가하였다. 10㎕의 배지 단독을 음성 대조군으로서 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 18시간 인큐베이션하였다. 상기 처리 기간 후, 제조업체의 설명서(Promega, Madison USA)에 따라 세포 생활력을 세포 적정-Glo 발광 검정 키트에 의해 결정하였다. L929 검정에 대해, 공지되지 않은 것의 세포 생활력 백분율을 미처리 그룹의 백분율(100%로 취함)로 표현하였고, IC50 값을 Graphpad prism에 의해 결정하였다. 항체의 IC50 값에서의 차이를 일원 분산 분석(Newman-Keuls 사후 검정)에 의해 평가였고, 0.05 미만의 P-값을 유의한 것으로 간주하였다. 데이터는 이중으로 측정된 n=4 실험의 평균 ± SEM으로 표현된다. 각각의 항체에 대한 IC50 값을 결정하였고, 이는 하기 표 2에 나열된다. 결과는 시험된 모든 항체의 효능이 동등한 것을 나타낸다.
표 2: L929 중화 검정에서의 다양한 항- TNFα 항체에 대한 IC 50 값
Figure pct00002
표 3은 실험으로부터 유래된 IC50 값을 제시한다. 결과는 개선된 항-TNFα 항체(BPC1499, BPC1500, BPC1501)가 상기 검정에서 BPC1492 및 아달리무맙에 비해 증가된 효능을 나타내는 것을 나타낸다.
표 3: L929 중화 검정에서의 개선된 항-TNFα 항체에 대한 IC 50 값
Figure pct00003
실시예 6: 시험관내 IL-6 방출에 대한 항체의 효과
항체의 중화 능력을 전체 혈액 세포로부터 TNF-α 매개 IL-6 방출을 억제하는데 있어서 이들의 효과를 측정함으로써 결정하였다. 간단히, 130㎕의 전체 혈액을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 1시간 동안 가습화된 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 중화 연구를 위해, 0.001-30 ㎍/㎖(0.0067-200 nm)의 TNF-α mAb를 4℃에서 1시간 동안 1:1의 비율로 10ng/㎖(약 0.4 nM)의 TNF-알파와 함께 예비-인큐베이션하였다. 대조군 그룹에 대해, 항체 대신 RPMI를 사용하였다. 상기 예비-처리 후, 웰 당 20㎕의 항원-항체 복합체 또는 RPMI(음성 대조군)를 첨가하고, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 100㎕의 PBS(w/o MgCl2 또는 CaCl2)를 각각의 웰에 첨가하고, 500 rpm에서 10분 동안 플레이트 진탕기에 배치하였다. 이후, 플레이트를 5분 동안 2000 rpm에서 회전시켰다. 120㎕의 상층액을 조심스럽게 분리시키고, 새로운 96-웰 둥근 바닥 플레이트로 옮기고, IL-6 방출을 MSD 기반 검정 키트(Meso Scale Diagnostics, Maryland USA)를 이용하여 결정하였다. 전체 혈액 검정을 위해, 각각의 샘플에 대한 MSD 신호를 MSD SECTOR® Imager 2400을 이용하여 판독하였고, 세포로부터의 IL-6 방출을 PRISM 4.00 소프트웨어(GraphPad. San Diego, USA)의 표준 데이터 분석 패키지를 이용하여 정량하였다. 각각의 항체에 의한 IL-6 억제의 백분율을 TNF-α 단독 처리된 군의 백분율로 표현하였다. 이후, 각각의 항체에 대해 용량 반응 곡선을 수득하였고, IC50 값을 결정하였다. IC50 값의 로그를 이용하여, 항체의 효능에서의 차이를 일원 분산 분석(Newman-Keuls 사후 검정)에 의해 결정하였고, 각각의 공여자(n=3)에 대해 0.05 미만의 P-값을 유의한 것으로 간주하였다. 데이터는 이중으로 측정된 3개의 공여자의 평균 ± SEM으로 표현된다.
하기 표 4는 이들 데이터로부터 유래된 IC50 값을 제시한다. 이들 결과는 시험된 항체 사이에 효능에 있어서 유의한 차이가 없는 것을 암시한다.
표 4: TNFα -유도된 IL-6 방출 검정에서의 다양한 항- TNF 항체에 대한 IC 50 값
Figure pct00004
IC50 값은 표 5에 제시된다. 결과는 개선된 항-TNFα 항체(BPC1499, BPC1500, BPC1501)가 상기 검정에서 증가된 효능을 나타내는 것을 나타낸다.
표 5: TNFα -유도된 IL-6 방출 검정에서의 다양한 개선된 항- TNF 항체에 대한 IC 50 값
Figure pct00005
실시예 7: 가속화된 스트레스인자 연구
연구 전에, 시험되는 항체를 OD280nm에서 분광광도계에서 정량하였고, PBS(pH7.4) 중에 1.1㎎/㎖로 희석시켰다. 분취액을 분리시키고, 10% v/v의 500 mM 소듐 아세테이트를 첨가하여 pH5.5에서 1㎎/㎖의 최종 농도를 발생시키고, 샘플을 침전에 대해 검사하였다. PBS 중의 나머지 샘플은 pH7.4에서 1㎎/㎖의 최종 농도로 첨가된 10% PBS v/v를 가졌고, 기준선 응집 수준(크기 배제 크로마토그래피에 의해 모니터됨)을 제공하기 위해 상기 샘플의 분취액을 분리시켰다. 이후, 샘플을 인큐베이터에서 2주 동안 37℃에서 인큐베이션하였고, 이후 샘플을 OD280nm에서 분광광도계에서 다시 정량하였고, 응집에 대해 평가(크기 배제 크로마토그래피에 의함)하였다. 샘플을 직접 결합 ELISA에서 인간 TNFα 결합에 대해 시험하였다. 결과는 도 2에 제시되어 있고, 이는 시험된 모든 항체의 결합 활성이 가속화 스트레스인자 연구 후에 동등한 것을 입증한다.
실시예 8: 25% 인간 혈청에서의 안정성 연구
연구 전에, 시험되는 항체를 OD280nm에서 분광광도계에서 정량하였고, PBS(pH7.4) 중에 1.25㎎/㎖로 희석시켰다. 분취액을 분리시키고, 25% v/v의 인간 혈청을 첨가하여 1㎎/㎖의 최종 농도를 발생시켰다. PBS 중의 나머지 샘플은 1㎎/㎖의 최종 농도로 첨가된 25% PBS v/v를 가졌고, 기준선 수준을 제공하기 위해 상기 샘플의 분취액을 분리시켰다. 이후, 샘플을 인큐베이터에서 2주 동안 37℃에서 인큐베이션하였고, 이후 샘플을 직접 결합 ELISA에서 인간 TNFα 결합에 대해 시험하였다. 결과는 도 3에 제시되어 있고, 이는 시험된 모든 항체의 결합 활성이 2주 동안 25% 인간 혈청에서의 인큐베이션 후에 동등한 것을 입증한다.
실시예 9: 동결-해동 후의 인간 TNFα로의 결합의 분석
항체 샘플을 50 mM 아세테이트 및 150 mM NaCl을 함유하는 완충액(pH6.0) 중에 1㎎/㎖로 희석시키고, 드라이아이스에서 급속 동결시킨 후, 밤새 4℃에서 해동시켰다. 인간 TNFα로의 항체의 결합을 급속 동결되지 않았던 항체와 비교하여 시험하였다. 동결-해동 후의 결합 활성을 평가하기 위해, ELISA 플레이트를 1 ㎍/㎖로 재조합 인간 TNFα를 이용하여 코팅하고, 블로킹 용액(Tris 완충 염수 중 4% BSA)을 이용하여 블로킹하였다. 다양한 농축액을 코팅된 플레이트에 첨가하였고, 탈이온수에서의 세척 전에 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 블로킹 용액에서의 퍼옥시다제 표지된 항 인간 카파 경쇄 항체(Sigma A7164)의 첨가에 의해 결합을 검출하였다. 플레이트를 탈이온수에서의 세척 전에 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 OPD 기질(Sigma P9187)의 첨가에 의해 발달시키고, 색 발달을 2M HCL의 첨가에 의해 중지시켰다. 흡광도를 플레이트 판독기를 이용하여 490nm에서 측정하고, 평균 흡광도를 농도에 대해 플로팅하였다. 결과는 도 4에 제시되어 있고, 이는 시험된 모든 항체의 결합 활성이 동결-해동 후에 동등한 것을 입증한다.
실시예 10: FcγRIIIa로의 항- TNFα 항체의 결합의 분석
ELISA 플레이트를 1 ㎍/㎖로 재조합 인간 FcγRIIIa(V158 및 F158 변이체)를 이용하여 코팅하고, 블로킹 용액(Tris 완충 염수 중 4% BSA)을 이용하여 블로킹하였다. 다양한 농축액을 코팅된 플레이트에 첨가하였고, 탈이온수에서의 세척 전에 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 블로킹 용액에서의 퍼옥시다제 표지된 항 인간 카파 경쇄 항체(Sigma A7164)의 첨가에 의해 결합을 검출하였다. 플레이트를 탈이온수에서의 세척 전에 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 OPD 기질(Sigma P9187)의 첨가에 의해 발달시키고, 색 발달을 2M HCl의 첨가에 의해 중지시켰다. 흡광도를 플레이트 판독기를 이용하여 490nm에서 측정하고, 평균 흡광도를 농도에 대해 플로팅하였다. 결과는 도 5a 및 5b에 제시되어 있고, 이는 BPC1494가 BPC1492 및 BPC1496에 비해 FcγRIIIa(V158 및 F158 변이체)에 결합하는 감소된 능력을 갖는 것을 입증한다.
실시예 11: ProteOn 분석: FcRn 결합
시험하기 위한 항체를 일차 아민 커플링에 의해 GLC 바이오센서 칩(BioRad 176-5011) 상에 유사한 수준으로 고정시켰다. 2048nM, 512nM, 128nM, 32nM, 및 8nM의 재조합 인간 및 시노몰구스 FcRn을 분석물로 사용하였고, 결합 곡선을 이중 참조하기 위해 완충액 단독(즉, 0nM)의 주입을 이용하였다. FcRn 주입 후의 항체 표면의 재생은 pH9.0의 HBS-N을 이용하였고, 검정은 25℃에서 ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System에서 수행하였고, 적절한 완충액 중에 희석된 FcRn을 갖는 HBS-N pH7.4 및 HBS-N pH6.0에서 수행하였다. 친화성을 pH6.0에서의 결합에 대해 "총괄적 R-max(Global R-max)" 및 pH 7.4에서의 친화성 계산을 위해 pH6.0에서의 결합으로부터의 R-max를 이용한 ProteOn 분석 소프트웨어에 고유한 평형 모델을 이용하여 계산하였다. 결합 곡선이 pH 7.4에서 포화에 도달하지 않았기 때문에, 수득된 값은 진정한 친화성이 아닐 수 있으나, 이들은 작제물을 등급화시키는데 이용될 수 있다. 결과는 표 6에 제시되며, 이는 BPC1494 및 BPC1496이 BPC1492와 비교하는 경우에 pH6.0에서 인간 및 시노몰구스 FcRn에 대한 개선된 친화성을 갖는 것을 입증한다.
표 6 인간 및 시노몰구스 FcRn에 결합하는 항-TNF 알파 작제물의 친화성
Figure pct00006
실시예 12: 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스에서의 PK 연구.
단일 용량 약동학 연구에서, BPC1494 및 BPC1492를 FcRn 인간화 마우스의 2개의 상이한 계통 및 FcRn이 결핍된 하나의 계통에 1 ㎎/㎏으로 정맥내(IV) 투여하였다(Petkova et al. Int . Immunol (2010) 18(12): 1759-1769). 혈장 샘플을 확인된 Gyrolab 형광 면역검정을 이용하에 적절하게 BPC1494 또는 BPC1492에 대해 분석하였다.
상기 방법은 포획 항원으로서 비오티닐화된 인간 TNF 알파 및 검출 항체로서 Alexa 표지된 항-인간 IgG(Fc 특이적) 항체를 사용하였다. 검정 완충액으로 1:10으로 희석된 마우스 혈장의 분취액을 이용하여, 최저 정량 한계(LLQ)는 100 ng/㎖였고, 최고 정량 한계(HLQ)는 100,000 ng/㎖였다. 최저 표준 아래의 혈장 농도를 정량가능하지 않은 것으로 간주하였다. 3개의 상이한 농도로 제조되고, 연구 샘플과 함께 저장된 QC 샘플을 단독으로 제조된 교정 표준에 대해 샘플의 각각의 배치로 분석하였다. 분석이 허용되기 위해서는, 각각의 농도에서 적어도 하나의 QC가 공칭 농도로부터 20% 초과로 벗어나지 않아야 한다. 이러한 연구로부터의 QC 결과가 상기 허용 기준을 충족시킨다.
PK 분석을 WinNonlin, version 6.1을 이용하여 비-구획 약동학 분석에 의해 수행하였다. 모든 계산은 공칭 혈액 샘플링 시간을 이용하였다. BPC1494 및 BPC1492에 대한 전신 노출을 선형 로그 사다리꼴 계산 방법을 이용하여 투여 시작으로부터 마지막 정량가능한 시점(AUC0 -t)까지의 혈장 농도 시간 곡선하 영역(AUC)을 계산함으로써 결정하였다. 추가 PK 파라미터는 샘플 표지화에서의 불일치로 인해 데이터로부터 유도될 수 없었다.
표 7 - 트랜스제닉 마우스로의 1 ㎎/㎏의 목표 용량의 단일 정맥내 투여(볼루스) 후의 BPC1494 및 BPC1492에 대한 약동학 파라미터의 요약
Figure pct00007
유사한 Cmax 농도가 모든 그룹에 대해 수득되었다. 인간 FcRn 넉-인(knock-in) 마우스 계통 둘 모두에서, BPC1494는 BPC1492보다 높은 노출(AUC0 -t)을 가졌으나, 이러한 차이는 현저한 것은 아니었다(1.3 배). 인간 및 마우스 FcRn 둘 모두의 부재하에서, BPC1492은 BPC1494보다 높은 노출을 가졌다.
실시예 13: pEF 벡터로의 항체 발현 벡터의 클로닝
일부 경우에, 중쇄 및 경쇄에 대한 발현 카세트를 인코딩하는 DNA를 HindIII 및 EcoRI을 이용하여 실시예 3에 기재된 벡터로부터 절제하였고, 표준 분자생물학 기술을 이용하여 발현이 hEF1a 프로모터로부터 발생하는 pEF 벡터로 클로닝하였다(벡터의 설명에 대해, Kotsopoulou et al J. Biotechnol (2010) 146: 186-193 참조).
표 8
Figure pct00008
실시예 14: pEF 발현 벡터를 이용한 CHO 세포에서의 항체의 발현
중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 발현 플라스미드를 CHO DG44 세포로 공동-트랜스펙션시키고, 항체를 생성시키는 규모로 발현시켰다.　BPC1492의 생성을 위해, 플라스미드 SJC329 및 SJC330을 이용하였다.　 BPC1494의 발현을 위해, 플라스미드 SJC329 및 SJC331을 이용하였다.　 BPC1496을 위해, 플라스미드 SJC329 및 SJC332를 이용하였다.
간단히, 30㎍의 DNA(15㎍ 중쇄 및 15㎍ 경쇄)를 Not1 제한 효소를 이용하여 밤새 선형화시켰다.　 이후, 생성된 제한된 DNA를 에탄올 침전시키고, TE 완충액에 재용해시켰다.　 배양물로부터, 6X106개의 CHO DG44 세포를 수득하였고, 10㎖의 PBS 중에서 세척하였다.　 이후, 세포 펠렛을 300㎕의 Amaxa 용액 V에 재현탁시켰다.　 이후, 100㎕의 상기 언급된 세포 현탁액을 3 ㎍의 선형화된 DNA를 또한 함유한 3개의 Amaxa 큐벳 각각에 첨가하였다.　 큐벳을 Amaxa nucleofector II 장치에 삽입하고, 미리 설정된 프로그램 U-023으로 전기천공시켰다. 전기천공된 세포의 3개의 큐벳의 내용물(300㎕)을 10㎖의 가온된 MR14 배지(뉴클레오시드 및 BSA를 포함함)에 첨가하고, 48시간 동안 T75 플라스크에서 인큐베이션하였다.　 상기 기간 후, 배지를 뉴클레오시드-비함유-MR14(BSA만 함유하는 MR14)로 교환하였다.　 3-4일마다, 적응용 배지를 제거하고, 새로운 선택 배지로 대체하였다.　 세포가 회복한 후, 배지를 2X MR14로 대체하고, IgG 발현을 혼탁측정법에 의해 확인하였다.　 2L 진탕-플라스크에 0.6X106/㎖로 1L의 IgG-발현 세포를 시딩하고, 7일 동안 성장시켰다.　 세포를 원심분리에 의해 상층액으로부터 분리시키고, 상층액을 단백질 정제에 사용하였다.
1리터의 세포 배양 상층액을 AKTA Xpress 시스템에서 2-단계 자동화 과정을 이용하여 정제하였다. 항체를 5㎖ MabSelectSure 컬럼에서 포획한 후, 용리 전에 세척하였다. 이후, 용리된 항체를 440㎖ Superdex 200 젤 여과 컬럼에 로딩하였고, 96-웰 블록에서 2㎖ 분획을 수거하였다. 정제된 항체의 분획을 풀링시키고, 0.2㎛ 여과시킨 후, Amicon 회전 농축기를 이용하여 약 5㎎/㎖로 농축시켰다. 최종 물질을 다시 0.2㎛ 여과시킨 후, 전달을 위해 멸균 튜브에 분배하였다. 최종 물질을 응집을 결정하기 위한 분석 SEC, 내독소 검정, 정확한 질량 결정을 위한 LC-MS(당화를 결정하기 위해 PNGaseF 및 미처리 물질을 포함함), SDS PAGE 전기영동, 서열 확인을 위한 PMF 및 농도 결정을 위한 A280에 적용시켰다.
실시예 15: pEF 발현 벡터를 이용한 CHO 세포에서의 항체의 발현을 위한 대안적 방법
DHFR-무표지 CHO DG44 세포를 컬럼비아 대학의 체이신 박사(Dr. Chasin)로부터 입수하였다. 이들 세포를 이후 화학적으로 규정된 배지로 적합화시켰다. 이들 적합화된 숙주 세포를 DG44-c로 명명하였고, 글루타맥스(Glutamax) 및 HT-보충물이 보충된 전매의 화학적으로 규정된 배지에서 배양하였다.
폴리클로날 풀의 생성: 프로토콜에 대한 더욱 세부사항에 대해서는 WO2009024567호 및 문헌[Kotsopoulou et al, J. Biotechnol (2010) 164(4): 186-193]을 참조하라. 간단히, DG44-c 세포를 전기천공(Amaxa nucleofector 시스템 이용)에 의해 중쇄 및 경쇄 및 DHFR 및 neoR을 각각 인코딩하는 플라스미드로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 48시간 후, G418의 첨가(400 ㎍/㎖의 최종 농도) 및 HT의 제거에 의해 선택을 개시시켰다. 생활력 및 세포 수가 충분히 증가한 경우(이 경우, 트랜스펙션 2개월 후), 메토트렉세이트(MTX)를 5nM의 최종 농도로 첨가하였다. 세포를 확장시키고, 생성 곡선을 MTX의 첨가 후 9-16일에 개시시켰다. 이들 생성 곡선을 위해, 세포를 화학적으로 규정된 배지에서 0.6-0.8x106 세포/㎖로 시딩하고, 6, 9 또는 10, 12 또는 13 및/또는 16일에 공급하였다. 생활력이 약 50%로 떨어진 경우 상층액을 수거하고, 세포를 30분 동안 4000g에서의 원심분리 후 사르토브란(sartobran) 캡슐을 통한 여과에 의해 제거하였다.
항체를 2 단계 크로마토그래피 절차를 이용하여 실온에서 정제하였다: 50㎖ MabSelect SuRe 컬럼(GE Healthcare) 및 이후 1.5L Superdex 200 pg SEC(GE Healthcare)를 이용한 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 이용하여 최초 포획을 수행하였다. 적응용 배지를 9cm/h의 유량으로 사전-평형화된 MabSelect SuRe 컬럼에 로딩하였다. 평형 완충액(50mm Tris pH 8.0, 2M NaCl)을 이용한 기준선 세척 후, 전도도가 안정적이 될때까지 컬럼을 저염 완충액(50 mM NaCl Tris pH 8.0, 150 mM NaCl)을 이용하여 세척하였다. 이후, 컬럼을 용리 완충액(25 mM 시트레이트 pH 2.5)으로 용리시켰다. 피크 단백질 용리에 해당하는 분획을 1/10 부피의 1.0M Tris pH 8.0으로 즉시 중화시키고, 이를 이후에 풀링시키고, 0.2㎛ 바틀탑(bottletop) 필터를 통해 여과시켰다. 회수된 샘플을 SEC 완충액(50 mM Na 아세테이트, 150 mM NaCl)으로 사전 평형화된 SEC 컬럼으로 21cm/h로 로딩하였다. 주요(단량체) 단백질 피크를 함유하는 분획을 풀링하고, 여과 멸균시켰다.
상기 방법에 의해 제조된 항체를 하기 실시예에 요약되는 분석 동등성 연구에 사용하였다.
실시예 16: 스트레스 조건의 샘플 및 대조군 샘플에 대한 분석 동등성
단백질의 응집 수준을 결정하기 위해 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 최적화된 방법은 100 mM 소듐 포스페이트, 400 mM NaCl, pH 6.8에서 평형화된 TOSOH TSK G3000SWXL 컬럼으로의 샘플의 주입을 포함하였다. 흡광도를 280nm 및 214nm 둘 모두에서 측정하였다. 역상 HPLC는 소수성을 기초로 하여 단백질 및 이의 아이소형을 분리시킨다. 단백질을 PLRP-S 1000°A 8 ㎛ 컬럼에 주입하고, 50% 포름산, 및 95% 아세토니트릴에 의해 생성된 구배를 이용하여 용리시켰다.　 흡광도를 280nm에서 측정하였다.　분자의 순도는 전체 피크 영역에 비한 주요 피크 영역의 백분율로 보고된다. mAb의 다양한 아이소형을 모세관 등전 포커싱(cIEF)을 이용한 이들의 pI 값을 기초로 하여 분리시켰다. IEF 분리를 10cm, UV280 투명 카트리지 모세관에서 수행하였다. 최적화된 방법은 압력 주입에 의해 모세관으로 로딩된 5% pH 3-10 양성전해질, 10 mM NaOH, 관심 단백질 및 내부 pI 마커(7.05 및 9.5)를 함유하는 용액을 포함하였다.
항체(아달리무맙, BPC1494, BPC1496)의 특정 활성을 MSD를 이용하여 결정하였다. 간단히, 96-웰 플레이트를 PBS 중 1 ㎍/㎖로 희석된 웰 당 50 ㎕의 TNFα로 코팅하였다. 플레이트를 2시간 동안 진탕 없이 주위 온도에서 벤치 탑(bench top)에서 인큐베이션하였다. 코팅 용액을 제거하고, 플레이트를 웰 당 50 ㎕의 0.05% 폴리소르베이트 20을 갖는 PBS 중 1% BSA로 블로킹시켰다. 플레이트를 400 rpm에서의 진탕과 함께 24℃에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, 세척 완충액으로 4회 세척하였다. 항체를 0.05% 폴리소르베이트 20을 갖는 PBS 중 0.1% BSA에 희석시키고, 30㎕의 각각의 샘플을 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 400rpm에서의 진탕과 함께 24℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 플레이트를 세척 완충액으로 4회 세척하였다. 항-인간 IgG 설포태그(sulfotag)를 검정 완충액에 1/5000으로 희석시켰다. 30㎕를 플레이트의 각각의 웰에 첨가한 후, 400rpm에서의 진탕과 함께 24℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 플레이트를 세척 완충액으로 4회 세척하였다. 4x MSD 판독 완충액 농축액을 탈이온수를 이용하여 1x로 희석시켰다. 이후, 플레이트의 웰 당 100 ㎕를 첨가하였다. 이후, 플레이트를 MSD Sector Imager 기계를 이용하여 판독하였다. 검정으로부터 수득된 신호로부터, 분자의 특정 활성을 계산하였다.
탈아미드화 분석
탈아미드화는 아스파라긴 및 글루타민 잔기에 대해 발생할 수 있는 일반적인 번역후 변형이나, 특히 글리신 잔기에 인접한 경우에 아스파라긴 잔기에서 가장 흔하게 관찰된다. 이들 잔기가 어떻게 민감한지 시험하고, 효능에 대한 탈아미드화의 효과를 결정하기 위해, 아달리무맙, BPC1494 및 BPC1496을 스트레스 연구에 노출시켰다. 탈아미드화를 야기시키는 것으로 이전에 밝혀진 조건인 48시간 동안 pH 9.0의 1% 암모늄 바이카르보네이트에서의 인큐베이션에 의해 스트레스를 수행하였다. 스트레스가 적용된 샘플을 대조군(PBS 중)과 함께 인큐베이션시키고, 상기 대조군 뿐만 아니라 스트레스가 적용되지 않은 참조와 비교하고, c-IEF, SEC 및 결합 ELISA를 이용하여 분석하였다. 강제화된 탈아미드화를 또한 EDTA의 존재 및 부재하에서 모든 샘플에 대해 수행하였다. 강제화된 탈아미드화 조건이 탈아미드화에 더하여 분획화를 야기시키는 것이 이전에 밝혀졌다. EDTA는 분획화를 방지하고/하거나 최소화시킨다.
산화 분석
다양한 잔기의 산화가 단백질의 가공 및 저장 전체에 걸쳐 발생할 수 있으나, 가장 일반적으로 산화되는 잔기는 본 스크린의 초점이었던 메티오닌이다. 이들 잔기의 산화 민감성을 30분 동안 5 mM 및 50 mM H2O2에서의 인큐베이션에 의한 스트레스 조건에 대한 노출을 통해 시험하였고, RP-HPLC, SEC 및 ELISA를 이용하여 평가하였다.
결과의 개요
BPC1494 및 BPC1496 둘 모두는 스트레스 적용된 샘플 및 대조군 샘플 둘 모두에 대해 분석 동등성에 의해 제시된 바와 같이 아달리무맙에 비해 매우 유리하게 거동한다. 시험된 모든 항체에 대해, 이용된 모든 분석 기술에 의해 제시된 바와 같이 강제화된 산화 조건하에서 유의한 분해가 관찰되지 않았다. c-IEF에 의해 측정된 바와 같은 유의한 탈아미드화가 시험된 모든 항체에 대해 예상된 바와 같이 pH 9.0에서 관찰되었다. 또한, 본 발명자는 EDTA가 없는 샘플에서 pH 9.0에서 SEC에 의해 제시된 바와 같이 시험된 모든 항체에 대해 유의한 분획화를 관찰하였으며, 이 또한 예상된 바와 같다. 아달리무맙과 비교하는 경우 BPC1494의 pI 값에서 감소(약 0.2)가 있었다. 이는 BPC1494의 중쇄 서열 내의 추가 글루탐산 잔기의 존재에 기인되며, 따라서 BPC1494를 더욱 산성으로 만든다. 강제화된 탈아미드화 및 산화는 결합에 대해 최소의 영향을 미치며, 이는 BPC1494, BPC1496 및 아달리무맙에 대해 관찰되었다.
실시예 17: ELISA에 의한 개선된 항체의 결합 분석
항체 BPC1499, 1500 및 1501을 실시예 4에 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 결합 활성에 대해 평가하였다. 2개의 상이한 항원 코팅 농도(0.1 및 1.0㎍/㎖)를 이용하여, 항체는 BPC1492와 비교하는 경우 이들의 결합 프로파일에서 어떠한 차이도 나타내지 않았다. 시험된 조건하에서, ELISA가 다양하게 보고된 결합 활성을 갖는 항체 사이를 구별하지 않는 것으로 보인다. 동일 항체를 더욱 민감한 검정으로 간주되는 실시예 18, 5 및 6에 기재된 방법을 이용하여 평가하였다. 이들 검정에서, 항체 BPC1499, 1500 및 1501은 BPC1492와 비교하는 경우 개선된 결합 친화성 및 개선된 효능을 나타낸다.
실시예 18: 포획 표면을 이용한 TNF 알파 결합의 Biacore 분석
단백질 A 및 항-인간 IgG(GE Healthcare BR-1008-39)를 CM3 바이오센서 칩 상의 별개의 플로우 셀에 커플링시켰다. 이들 표면을 결합 분석을 위해 항체를 포획하는데 이용하였다. 64nM, 21.33nM, 7.11nM, 2.37nM, 0.79nM의 재조합 인간 및 시노몰구스 TNF 알파, 및 결합 곡선을 이중 참조하기 위해 사용된 완충액 단독(즉, 0nM)의 주입을 분석물로서 사용하였다. 포획 표면의 재생을 100 mM 인산 및 3M MgCl2를 이용하여 수행하였다. 영동 완충액으로서 HBS-EP를 이용하여 37℃에서 Biacore T100 기계에서 영동을 수행하였다. 작제물 BPC1494 및 BPC1496은 단백질 A 및 항-인간 IgG 표면에 대해 감소된 결합을 나타내었고, 이는 이들 표면을 상기 분자에 대한 동역학을 발생시키기에 부적합하게 만든다.
표 9 포획된 항-TNF 알파 항체로 결합하는 인간 및 시노몰구스 TNF 알파의 동역학 분석
Figure pct00009
실시예 19: ProteOn 역 검정 결합 분석
비오티닐화된 TNF 알파를 20 ㎍/㎖의 최종 전체 단백질 농도로 1:49의 비율(즉, 0.4 ㎍의 비오티닐화된 TNF 알파 및 19.6 ㎍의 비오티닐화된 BSA)로 비오티닐화된 BSA와 혼합하였다. 이러한 혼합물을 NLC 바이오센서 칩(단일 플로우셀)(Biorad 176-5021) 상에 포획시켰다. 칩 표면을 안정적인 신호가 달성될 때까지 10 mM 글리신 pH3.0으로 컨디셔닝하였다. 256 nM, 64 nM, 16 nM, 4 nM 및 1 nM 및 0 nM의 시험되는 항체를 분석물로 사용하였다. 비오티닐화된 BSA 단독으로 코팅된 플로우셀에 대해 결합 곡선을 참조하였다. 재생을 10 mM 글리신 pH3.0을 이용하여 달성하였다. 데이터를 ProteOn 분석 소프트웨어에 고유한 1:1 모델에 적합화시켰다.
표 10 뉴트라비딘(Neutravidin) 포획 TNF 알파로 결합하는 항-TNF 알파 항체의 겉보기 동역학
Figure pct00010
이러한 데이터는 수행된 2개의 실험 중 하나의 세트(두번째 세트는 제시되지 않음)이다. 데이터의 KD 등급화가 둘 모두의 데이터 세트를 대표한다.
실시예 20: 인간 TNFα에 결합하는 대안적 항체의 작제
CDR 영역 내에 변형을 갖는 추가 가변 중쇄 영역을 인코딩하는 DNA 발현 작제물(Rajpal et al. PNAS (2005) 102(24): pg 8466-8471에 기재된 바와 같음)을 중첩 올리고뉴클레오티드의 형성 및 실시예 1에 기재된 것과 유사한 분자생물학 기술에 의해 새로이 제조하였다. 이들 변이체 항체의 가변 중쇄 도메인을 인코딩하는 DNA 서열의 예는 SED IQ NO: 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93 및 95에 제공된다. CDR 영역 내에 변형을 갖는 추가 가변 경쇄 도메인 영역을 인코딩하는 DNA 발현 작제물(Rajpal et al. PNAS (2005) 102(24): pg 8466-8471에 기재된 바와 같음)을 중첩 올리고뉴클레오티드의 형성 및 실시예 1에 기재된 것과 유사한 분자생물학 기술에 의해 새로이 제조하였다. 이들 변이체 항체의 가변 경쇄 도메인을 인코딩하는 DNA 서열의 예는 SED IQ NO: 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135 및 137에 제공된다. 작제된 후, 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 발현 플라스미드를 HEK 293 6E 세포로 일시적으로 공동-트랜스펙션시켰다. 발현된 항체를 상층액으로부터 정제하고, 실시예 6에 기재된 것과 유사한 방법을 이용하여 활성을 평가하였다.
실시예 21: BPC2604(파스콜리주맙-YTE)에 대한 발현 벡터의 작제
파스콜리주맙의 중쇄를 인코딩하는 pTT-기반 DNA 발현 작제물을 Quikchange 프로토콜(Promega)을 이용하여 M252Y/S254T/T256E(EU 지침 넘버링)의 변화를 포함하도록 조작하였다.
실시예 22: Pasco 및 Pasco - YTE 벡터의 발현/정제
BPC2604의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 발현 플라스미드를 HEK 293 6E 세포로 일시적으로 공동-트랜스펙션시켰다. 발현된 항체를 AKTA Xpress 상의 5㎖ MabSelectSure 컬럼 및 Superdex 200 컬럼을 이용한 친화성 크로마토그래피 및 SEC에 의해 수행되는 2단계 정제를 이용하여 벌크 상층액으로부터 정제하였다.
실시예 23: FcRn 결합에 대한 Pasco 대 Pasco YTE의 BIAcore 분석
항체를 일차 아민 커플링에 의해 GLM 칩(아세테이트 pH4.5 중 20 ㎍/㎖) 상에 고정시켰다. 2048, 512, 128, 32 및 8nM의 인간, 시노몰구스, 래트 및 마우스 FcRn 수용체를 사용하였다. 이중 참조를 위해 0nM을 이용하였다. 검정을 HBS-EP pH7.4 및 HBS-EP pH6.0(각각의 pH에 대해 적절한 영동 완충액 중에 희석된 FcRn 수용체)에서 수행하였다. 표면을 200 mM Tris pH9.0을 이용하여 FcRn 결합에 대해 재생시켰다. 데이터를 임의의 작제물에 대해 수득된 가장 높은 R-max로 설정된 R-max를 이용하여 평형 모델에 적합화시켰다. 결과는 하기 표 11에 제시되며, 이는 YTE-변형된 파스콜리주맙(BPC2604)이 파스콜리주맙에 비해 pH6.0에서 FcRn으로의 개선된 결합을 나타내는 것을 입증한다.
표 11: 인간 및 시노몰구스 FcRn에 대한 항-IL-4 항체 작제물의 친화성 (n.a.b.는 분석가능한 결합이 아님)
Figure pct00011
실시예 24: Pasco 대 Pasco - YTE를 이용한 PK 연구
도 6 은 1 ㎎/㎏의 목표 용량의 단일 정맥내(1시간 주입) 투여 후의 암컷 시노몰구스 원숭이에서의 파스콜리주맙-YTE (BPC2604) 및 수컷 시노몰구스 원숭이에서의 파스콜리주맙의 평균 용량 표준화 혈장 농도를 나타낸다. BPC2604 및 파스콜리주맙에 대한 데이터를 독립된 연구에서 생성시켰다. 파스콜리주맙 및 BPC2604에 대한 혈장 항체 농도를 포획 시약으로서 IL-4 및 검출 시약으로서 항-인간 IgG(Fc 특이적)-HRP 컨쥬게이트를 이용한 화학발광 ELISA에 의해 평가하였다. 검정에 대해 확인된 범위는 50-5000ng/㎖였다. 결과는 도 6에 제시된다. 둘 모두의 화합물은 유사한 Cmax를 갖지만, BPC2604는 3배 낮은 혈장 청소를 가져, AUC에서 3배 증가 및 반감기(T½)에서 2배 증가를 발생시킨다.
실시예 25: 수컷 시노몰구스 원숭이에서의 피하 투여 후의 BPC1494의 혈장 농도
반복 용량 약동학 연구에서, BPC1494를 30 또는 100 ㎎/㎏으로 4주 동안 매주 또는 격주로 수컷 시노몰구스 원숭이에 피하 투여하였다. 그룹 2(n=3)에 대해, 동물에 1일에 2회의 30㎎/㎏ 용량을 투여(약 1시간 간격)한 후, 8, 15 및 22일에 단일한 30 ㎎/㎏ 용량을 투여하였다. 그룹 3(n=3)에 대해, 동물에 1일에 2회의 30㎎/㎏ 용량을 투여(약 1시간 간격)한 후, 15일에 단일한 30 ㎎/㎏ 용량을 투여하였다. 그룹 4(n=3)에 대해, 동물에 1일에 2회의 100㎎/㎏ 용량을 투여(약 1시간 간격)한 후, 15일에 단일한 100 ㎎/㎏ 용량을 투여하였다. 혈장 샘플을 연구의 투여 및 회복 단계 전체에 걸쳐 때때로 채취하였다.
혈장 샘플을 샘플 희석을 기초로 한 적격의 분석 방법 후 면역검정 분석을 이용하여 BPC1494에 대해 분석하였다. 혈장 샘플을 BPC1494 또는 BPC1492에 대해 분석하였다. 상기 방법은 포획 항원으로서 10 ㎍/㎖의 비오티닐화된 재조합 인간 TNF-알파 및 검출 항체로서 AlexaFluor 647-표지된 항-인간 IgG(Fc 특이적) 항체의 1:100 희석액(G18-145)을 이용하였다. BPC1494에 대한 최저 정량 한계(LLQ)는 50 ㎕ 분취액의 100배 희석된 원숭이 혈장을 이용하여 1 ㎍/㎖였고, 최고 정량 한계(HLQ)는 100 ㎍/㎖였다.　데이터를 획득하고 정량하기 위해 상기 연구에서 사용된 컴퓨터 시스템은 Gyrolab Workstation Version 5.2.0, Gyrolab Companion version 1.0 및 SMS2000 version 2.3을 포함하였다. PK 분석을 WinNonlin Enterprise Pheonix version 6.1을 이용하여 비-구획 약동학 분석에 의해 수행하였다.
약동학 데이터가 30 ㎎/㎏/주 용량 그룹(2)에 대해 4주에서 투여된 마지막 투여로부터 투여 840시간 후의 시점(t)까지 및 30 & 100 ㎎/㎏/격주 용량 그룹(3 및 4)에 대해 3주에 투여된 마지막 투여로부터 투여 1008시간 후의 시점(t)까지 결정된 파라미터로 표 12에 제공된다.
표 12: 4주 조사 연구에 걸친 30 ㎎/㎏/주 또는 30 및 100 ㎎/㎏/격주의 BPC1494의 피하 투여 후의 수컷 시노몰구스 원숭이에서의 BPC1494에 대한 개별 및 평균 약동학 파라미터
Figure pct00012
실시예 26: 단백질 L 포획된 항- TNFα mAb로의 FcRn의 SPR 결합 분석
본 연구를 표지 비함유 동역학/친화성 측정에 대해 설계된 표면 플라즈몬 기반 기계인 ProteOnTM XPR36(BioRadTM) 바이오센서 기계를 이용하여 수행하였다. 단백질 L을 일차 아민 커플링에 의해 GLM 칩(BioRad, Cat No: 176-5012) 상에 고정시켰다. 이후, 이러한 표면을 인간화 항체를 포획하는데 사용하였고, 이후 2048nM, 512nM, 128nM, 32nM, 및 8nM의 인간 및 시노몰구스 FcRn(둘 모두 사내 재료), 및 결합 곡선을 이중 참조하기 위해 사용된 완충액 단독(즉, 0nM)의 주입을 분석물로서 이용하였다. 단백질 L 표면의 재생을 글리신-HCl pH1.5를 사용하여 수행하였다. 검정을 25℃에서 수행하였고, 적절한 완충액에 희석된 인간 또는 시노몰구스 FcRn을 갖는 HBS-EP pH7.4 및 HBS-EP pH6.0에서 수행하였다. 친화성을 pH6.0에서의 결합에 대해 "총괄적 R-max" 및 pH 7.4에서의 친화성 계산에 대해 pH6.0에서의 결합으로부터의 R-max를 이용한 ProteOn 분석 소프트웨어에 고유한 평형 모델을 이용하여 계산하였다. 결합 곡선이 pH 7.4에서 포화에 도달하지 않았기 때문에, 수득된 값은 진정한 친화성이 아닐 수 있으나, 시험된 항체의 결합을 등급화시키는데 이용하였다.
인간 FcRn에 대한 BPC1492, BPC1494 및 BPC1496의 다양한 배치의 결합 친화성을 단백질 L에 의한 항체 포획을 이용하여 비교하였다. 표 17은 상기 포맷을 이용한 일련의 실험으로부터의 결과를 제시한다. 데이터는 BPC1494 및 BPC1496이 pH6.0 및 pH7.4 둘 모두에서 BPC1492에 비해 재조합 인간 FcRn에 대해 개선된 친화성을 갖는 것을 입증한다. BPC1492에 비한 FcRn에 대한 BPC1494의 결합 친화성에서의 개선 배수는 포획 상에서의 단백질 L 활성에서의 변화로 인해 실험마다 상이하다. 그러나, 표 13에 제시된 실험에서, pH6.0에서의 결합 친화성의 개선 배수는 3.5배 내지 16.3배의 범위이다. 중성 pH에서의 FcRn에 대한 인간 IgG의 약한 결합 활성으로 인해 pH7.4에서의 결합 친화성에서의 개선 배수를 결정할 수 없었다.
시노몰구스 FcRn에 대한 BPC1492, BPC1494 및 BPC1496의 다양한 배치의 결합 친화성을 또한 단백질 L로 포획된 항체를 이용하여 비교하였다. 표 14는 상기 포맷을 이용한 실험으로부터의 결과를 제시한다. 데이터는 BPC1494가 pH6.0 및 pH7.4 둘 모두에서 BPC1492에 비해 재조합 시노몰구스 FcRn에 대해 개선된 친화성을 갖는 것을 입증한다. BPC1492(범위 394-398nM)에 비한 시노몰구스 FcRn에 대한 BPC1494(범위 41.8-46.8nM)의 결합 친화성에서의 개선 배수는 pH6에서 약 9배이다. FcRn에 대한 BPC1492의 약한 결합 활성으로 인해 pH7.4에서 결합 친화성에서의 개선 배수를 결정할 수 없었다.
표 13 단백질 L 포획 방법을 이용한 재조합 인간 FcRn 결합 친화성
Figure pct00013
표 14 단백질 L 포획 방법을 이용한 재조합 시노몰구스 FcRn 결합 친화성
Figure pct00014
실시예 27
BPC1494의 상업적 제조에 사용되는 최종 생성 세포주의 개발, 실행, 및 선택 동안, 세포주 플랫폼간 변화(cell line platform-to-platform variation)가 관찰되었다. 생성물 품질은 생성물을 발현시키기 위해 사용된 세포주 플랫폼에 따라 다양하였다. 예를 들어, 재료를 생성시키기 위해 사용된 최초 플랫폼에서, 주요 아이소형의 수준 %(cIEF에 의해 분석됨)는 60%인 한편, 최종 생성 세포주를 선택하기 위해 사용된 두번째 플랫폼에서, 클론에 따라 주요 피크 아이소형 %는 49% 내지 36%로 다양하였다. 또한, 두번째 플랫폼에서 생성된 클론은 연장된 세포 배양 기간에 걸쳐 더욱 일정한 프로파일을 발생시켰다. 두번째 플랫폼의 이러한 시간 의존적 일관성(도 7 참조)은 일정한 방식으로 목표 규격을 충족시킬 수 있는 제조 과정에 필요한 배치간 생성 프로파일 확실성 및 재현성을 수득하는데 중요한 특징이다. 결과로서, 상기 생성물을 개발하는데 사용된 세포주 플랫폼 사이에서 관찰된 변화는 본 발명자가 임상 제조 캠페인을 위한 일정하고 확실한 생성 프로파일을 발생시킬 수 있는 더욱 바람직한 클론을 확인하는 것을 가능케 하였다.
실시예 28
BPC1494에 대한 제형화 도전은 (i) 첫째로, 상업적 제시에서 목표 30-45% 주요 아이소형 생성물 프로파일을 뒷받침하고 유지할 수 있는 제형을 확인하고, (ii) 둘째로, 상기 부류의 항-TNF 항체의 피하 전달에 대해 동조적인 환자 체험을 발생시킨 pH를 갖는 상기 제형을 확인하는 최소한 이차원적인 일이다. 특히, 상기 두번째 포인트는 비-임상의 가정 환경에서 완전한 환자 순응을 보장하는데 중요하다.
상기 제형을 발견하려는 시도에서, 본 발명자에게 또한 추가로 흥미로운 것은 BPC1494가 통상적인 Ch2 융해 프로파일보다 낮은 것을 나타낸다는 관찰이었다. 일반 제형에서의 다른 mAb와 비교하는 경우, BPC1494는 열역학적으로 불안정한 것으로 보인다.
표 15
Figure pct00015
BPC1494에 대해, YTE 삼중 돌연변이는 CH2 도메인을 낮은 T시작 및 Tm1으로 불안정화시키는 것으로 보이며, 이는 낮은 안정성과 관련될 수 있다. 도 8A를 참조하라. 응집은 CH2 도메인에서의 유의한 구조 변화와 연관된 것으로 보인다.
결과로서, CH2 도메인의 Tm을 증가시키고, 이에 의해 더욱 안정한 생성물 프로파일 및 연장된 저장 기간을 본 발명자에게 제공하는 제형을 확인하기 위해 세번째 차원을 또한 제형 시도에 추가하였다.
이들 이유로, 본 발명자는 유의한 수의 방법 및 생각을 연구하였고, 이는 궁극적이고 놀랍게도 3개 모두의 요구를 확실히 전달할 수 있는 제형 처방, 즉, 본 발명의 목표 및 요망되는 %의 주요 생성물 피크 프로파일을 안정적으로 유지시킬 수 있는 제형, 비-임상 환경에서 환자 자가-투여를 위한 동조적인 pH의 제형, 및 관찰되는 통상적인 Ch2 언폴딩 특성보다 낮은 특성을 증가시키고 안정화시킬 수 있는 제형을 발견하였다.
BPC1494에 대해 다수의 분해 경로, 예를 들어, 하기 중 일부 또는 전부의 잠재적 조합이 제공되는 것으로 보인다.
- 응집
- 분획화: Cu 분해 부위 (LT) = 7; 가수분해 부위 (NP, NY) = 2; 산-촉매화 분해 경향이 있는 부위 (DG, DP, DY) = 8 [하나의 Asp-Pro 부위]
- 탈아미드화: 가능할 수 있는 탈아미드화 부위 (NG, NN, NS, NT, 또는 NP) = 10; 가능한 탈아미드화 부위(SNG, LNG, LNN, ENN) = 3; 아스파르틸 이성화 부위 (GD)의 전체 수 = 1
- 산화: CH2 불안정화는 증가된 산화 경향의 전조이다 {4 Met 잔기 주목}
실시예 29 - pH- 완충제 연구: 재료 및 방법
연구를 50 ㎎/㎖의 mAb 농도에서 수행하였다. DOE 설계는 3×5 완전 요인이었다. 샘플을 바이얼 당 1 ㎖로 충전된 유리 바이얼에서 40℃에서 1개월 동안 스트레스를 가하였다. 시험은 DSC (최초, i), SEC, 및 cIEF (스트레스)를 포함하였다. 시험된 요인은 표 16에 제공되고, 모든 시험된 샘플은 표 17에 제공된다.
표 16
Figure pct00016
표 17
Figure pct00017
도 9A 및 9B에 제시된 바와 같이, Tm1 및 Tm2는 pH와 함께 증가한다. 이러한 DSC 실험은 pH ≤ 6에서 증가된 열역학적/입체형태적 안정성을 예측한다.
실시예 30 - 역전된 열적 및 물리적/화학적 안정성 경향:
입체형태적 안정성은 pH가 감소함에 따라 감소하는 반면, 응집에 대한 내성은 개선된다. pH 5.25 - 6.25가 안정적이고 확실한 pH 범위로 확인될 수 있다. 히스티딘 pH 6.0이 안정적이고 확실한 것으로 보이며(입체형태적 안정성과 올리고머화 경향 사이의 절충); 이러한 His 완충 시스템이 Tm이 부형제 추가에 의해 이후에 개선될 수 있다는 이해와 함께 제안된다.
도 10 (A) 물리적 안정성 [cIEF]: 열 안정성과 비-선형 상관관계. 최적의 물리적 안정성은 히스티딘 pH 5.0 - 6.5에서 관찰된다.
도 10 (B) 화학적 안정성 [SEC]: pH 5.5 - 6.5의 히스티딘 완충제와 동등하고 확실한 것으로 보인다. 증가된 물리적 안정성 & 제형 확실성이 히스티딘 pH 6.0에서 관찰된다.
도 10 (C) 열역학적/입체형태적 안정성 [DSC]: 안정성은 예측되는 바와 같이 pH 의존적이다. 완충제와 상관 없이 pH가 증가함에 따라 증가한다. 완충제 유형에 대한 유의한 의존성이 더 낮은 pH 범위에서 관찰되었다.
종합: 히스티딘 pH 6.0은 안정적이고 확실한 것으로 보인다.
실시예 31
부형제 스크리닝 연구를 위한 HTF (고 처리량 제형) 방법: 재료 및 방법. 연구를 50 ㎎/㎖의 mAb 농도에서 수행하였다. DOE 계획은 중심 합성 계획(CCD)이었다. 샘플을 96-웰 폴리프로필렌 플레이트에서 40℃에서 1개월 동안 스트레스를 가하였다. 시험은 pH, 및 280nm, 360nm, 50nm에서의 흡광도 측정, SEC 및 cIEF를 포함하였다. 시험된 요인은 표 18에 제시된다.
표 18
Figure pct00018
요망성을 최대화시키기 위한 통계적 해결안은 다음과 같은 조성을 나타내었다: 트레할로스, 아르기닌, 및 메티오닌을 포함하는 His-기반 완충제. BPC1494 생성물 제형에 대한 HTF 통계적 해결안은 다음과 같은 4개의 반응(동일 중요성)을 기초로 하였다: %SEC-단량체, %SEC-HMW, %SEC-LMW, %cIEF-메인. 이들 3개의 부형제는 증가된 안정성 및 안정성 범위의 확장 둘 모두를 제공한다. [-NaCl]에 대한 HTF 통계 해결안은 확실성 범위의 협소화와 함께 NaCl과의 안정성 전망에서의 변화를 나타낸다. 도 11을 참조하라:
- 도 11A: 0 및 300 mM의 트레할로스;
- 도 11B: 100 mM의 아르기닌;
- 도 11C: 0 및 50 mM의 NaCl.
데이터는 메티오닌에 대해서는 제시되지 않았다.
실시예 32 - 진탕 연구를 통한 PS80 수준의 최적화
30 mM His pH 6.0 + 150 mM 트레할로스, 50 mM Arg, 10 mM Met, 0.05 mM EDTA 중에 제형화되고, 다양한 농도의 계면활성제(0, 0.01%, 0.02%, 0.04% PS80)를 함유하는 50 ㎎/㎖의 BPC1494. 250 rpm 및 25℃에서 72시간 동안 유리 고-실리콘 PFS (0.8 ㎖ 충전) 및 유리 바이얼(1 ㎖ 충전) 둘 모두를 진탕시켰다. 진탕된 샘플을 다양한 분석 방법을 통해 시험하였다. GA, pH, A280, SEC, 및 cIEF에 의해 생성물 품질에서 유의한 진탕-유도 변화가 검출되지 않았다. 그러나, MFI를 통한 육안으로 보이지 않는(sub-visible) 입자 시험은 PS80-함유 제형을 뒷받침하였다. 표 19를 참조하라.
표 19
Figure pct00019
실시예 33 - 사전-충전된 주사기(PFS)에서의 제형 안정성 연구
50 ㎎/㎖ 제형에서의 BPC1494의 안정성을 평가하기 위해 연구를 수행하였다. 사용된 제형은 표 20에 요약되어 있다:
표 20은 본 연구에서 평가된 제형 조성을 요약한다.
Figure pct00020
상기 처음 4개의 제형을 고 실리콘 사전-충전 주사기(PFS)에 저장하였다.　실리콘이 없는 PFS를 이용한 대조군을 대조군 제형 E로 포함시켰다.
샘플을 -20℃, 2-8℃, 25℃ 및 40℃에서 저장하였다.　PFS는 각각의 온도 조건에서 트레이 내에 수평 위치로 저장된다.
본 연구의 결과(표 21 참조)는 모든 시험된 제형에서의 생성물의 장기간 안정성을 입증한다.　또한, 목표 제형을 아르기닌 및 메티오닌이 샘플 완충액으로부터 제거된 샘플과 비교한 경우 아르기닌 및 메티오닌이 증가된 온도에서 응집으로부터의 보호를 제공하는 것이 관찰되었다(표 21의 SEC 결과 참조). 또한, 캘리퍼(Caliper) 방법을 이용하여 데이터를 발생시켰고, 결과는 SEC 데이터와 일치한다.　질량분광법 데이터(표 22 참조)는 또한 메티오닌이 없는 제형에 비해 유리 메티오닌이 첨가된 제형에서 산화에서의 2배 감소를 나타낸다.　데이터는 또한 실리콘이 BPC1494의 안정성에 영향을 미치지 않은 것을 나타낸다.
표 21: 시험된 제형의 BPC1494 안정성 연구 결과
Figure pct00021
Figure pct00022
표 22: BPC1494 안정성 연구에 대한 질량분광법 결과
Figure pct00023
실시예 34 - PFS에서의 제형 확실성 연구
본 연구의 일차 목적은 BPC1494 등장성 제형의 확실성을 평가하는 것이었다(실시예 33에 상술됨).
연구 계획은 부분 요인 실험 계획(DOE)을 기초로 하였다. 상기 연구는 상기 제형 조성물의 확실성을 뒷받침하기 위해 선택된 범위 내의 mAb의 안정성을 평가하고 모니터하였다.
표 23에는 mAb 농도, pH, 및 목표 제형에 비한 부형제 농도에 대해 시험된 범위가 요약되어 있다.
표 23 - 제형의 확실성을 평가하기 위해 시험된 요인의 범위
Figure pct00024
표 24에서 하기 제시된 바와 같이, 9개의 제형 및 3개의 대조군이 포함되었다.
사용된 대조군은 완충제 대조군(제형 1), 목표 제형(제형 2) 및 아세테이트 완충제(제형 12)였다. 마이크로 플로우 이미징(Micro Flow Imaging)(MFI)를 이용한 미립자 시험을 위한 대조군으로서 제공하기 위해 완충제 대조군(여기서 광 노출시에 관찰된 임의의 변색은 부형제 분해를 나타냄)이 포함되며, 단지 상대 비교 목적을 위해 최종적으로 아세테이트 완충제 대조군이 포함된다.
표 24: 샘플 요약
Figure pct00025
모든 샘플을 -20℃, 2-8℃, 25℃, 25℃+ 800 lux/hr(LIGHT) 및 40℃에서 저장하였다. 연구를 BD로부터 수득된 정보를 기초로 하여 주사기 주위에서 설정된 +/- 0.3 단위 명세와 함께 주사기 당 0.4 ㎎인 일반 실리콘 수준을 함유하는 1 ㎖ BD Hypak 사전-충전 주사기(PFS)에서 수행하였다. 생성물 안정성을 PFS 중 0.8 ㎖ 충전에서 평가하였다. 샘플을 모든 성분(바늘, 마개, 및 주사기 벽)이 제형에 의해 접촉되도록 하여 안정성을 위해 수평으로 저장하였다.
연구로부터의 결과는 시험된 범위 내에서의 PBC1494 mAb의 장기간 안정성을 입증한다. 결과는 50 ㎎/㎖의 목표 농도의 +/-10% 범위, 및 목표 pH의 +/- 0.2 pH 단위 내에서의 mAb의 안정성을 입증하였다. 상기 제형의 장기간 안정성은 또한 아르기닌 및 트레할로스 농도의 +/-20%, 및 메티오닌, EDTA 및 PS80 농도의 +/-50% 이내인 경우에 입증되었다.
실시예 36 - 100㎎/㎖ 동결-해동 및 장기간 안정성 연구
본 연구의 목적은 5 ㎖ Flexboy(EVA) 백에서 히스티딘 완충제(이전 표의 제형 2)에서 제형화되는 경우 100 ㎎/㎖ BPC1494 항체의 확실성 및 안정성을 평가하는 것이었다. 2개의 요인이 본 연구에 포함되었다: mAb 농도(100 ㎎/㎖ 목표로부터 +/-20%) 및 pH 범위 (pH 6.0 목표로부터 +/-0.2 단위). 연구는 또한 100 ㎎/㎖ mAb를 ≤-60℃(여기서, -70℃)로부터 2-8℃로의 5 주기의 동결-해동 스트레스에 적용시켰다.
표 25 샘플 요약
Figure pct00026
5 ㎖ EVA 백을 충전하고, 1, 3, 및 6개월 동안 -70℃, -40℃, -20℃, 2-8℃, 25℃ 및 25℃ + 800 lux/hr에서의 안정성에 대해 적용시켰다. 백을 -70℃로부터 2-8℃로의 5회의 동결 해동 주기에 적용시켰다.
연구로부터의 결과는 시험된 범위 내에서의 mAb 생성물의 장기간 안정성을 입증한다. 결과는 100 ㎎/㎖의 목표 농도의 +/-10% 범위, 및 목표 pH의 +/- 0.2 pH 단위 내에서의 mAb의 안정성을 입증하였다.
표 A
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
서열 목록
SEQ ID NO: 1 항-TNF 항체 경쇄의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00031
SEQ ID NO: 2 항-TNF 항체 경쇄의 단백질 서열
Figure pct00032
SEQ ID NO: 3 항-TNF 항체 가변 도메인(VL)의 단백질 서열
Figure pct00033
SEQ ID NO: 4 항-TNF 항체 중쇄 + M252Y/S254T/T256E 변형의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00034
SEQ ID NO: 5 항-TNF 항체 중쇄 + M252Y/S254T/T256E 변형의 단백질 서열
Figure pct00035
SEQ ID NO: 6 항-TNF 항체 중쇄 가변 도메인(VH)의 단백질 서열
Figure pct00036
SEQ ID NO: 7 IgG1 불변 도메인 + M252Y/S254T/T256E 변형의 단백질 서열
Figure pct00037
SEQ ID NO: 8 항-TNF 항체 중쇄 + M428L/N434S 변형의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00038
SEQ ID NO: 9 항-TNF 항체 중쇄 + M428L/N434S 변형의 단백질 서열
Figure pct00039
SEQ ID NO: 10 IgG1 불변 도메인 + M428L/N434S 변형의 단백질 서열
Figure pct00040
SEQ ID NO: 11 항-TNF 항체 중쇄(야생형 IgG1)의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00041
SEQ ID NO: 12 항-TNF 항체 중쇄(야생형 IgG1)의 단백질 서열
Figure pct00042
SEQ ID NO: 13 IgG1 불변 도메인(야생형)의 단백질 서열
Figure pct00043
SEQ ID NO: 14 항-TNF 항체 중쇄 + T250Q/M428L 변형의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00044
SEQ ID NO: 15 항-TNF 항체 중쇄 + T250Q/M428L 변형의 단백질 서열
Figure pct00045
SEQ ID NO: 16 IgG1 불변 도메인 + T250Q/M428L 변형의 단백질 서열
Figure pct00046
SEQ ID NO: 17 항-TNF 항체 중쇄 + V308F 변형의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00047
SEQ ID NO: 18 항-TNF 항체 중쇄 + V308F 변형의 단백질 서열
Figure pct00048
SEQ ID NO: 19 IgG1 불변 도메인 + V308F 변형의 단백질 서열
Figure pct00049
SEQ ID NO: 20 항-TNF 항체 중쇄 + V259I 변형의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00050
SEQ ID NO: 21 항-TNF 항체 중쇄 + V259I 변형의 단백질 서열
Figure pct00051
SEQ ID NO: 22 IgG1 불변 도메인 + V259I 변형의 단백질 서열
Figure pct00052
SEQ ID NO: 23 항-TNF 항체 중쇄 + P257L 및 N434Y 변이체의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00053
SEQ ID NO: 24 항-TNF 항체 중쇄 + P257L 및 N434Y 변형의 단백질 서열
Figure pct00054
SEQ ID NO: 25 IgG1 불변 도메인 + P257L 및 N434Y 변형의 단백질 서열
Figure pct00055
SEQ ID NO: 26 신호 펩티드 서열
Figure pct00056
SEQ ID NO: 27 항-TNF 항체 CDRH1
Figure pct00057
SEQ ID NO: 28 항-TNF 항체 CDRH2
Figure pct00058
SEQ ID NO: 29 항-TNF 항체 CDRH3
Figure pct00059
SEQ ID NO: 30 항-TNF 항체 CDRL1
Figure pct00060
SEQ ID NO: 31 항-TNF 항체 CDRL2
Figure pct00061
SEQ ID NO: 32 항-TNF 항체 CDRL3
Figure pct00062
SEQ ID NO: 33 항-TNF 항체 CDRH1 변이체
Figure pct00063
SEQ ID NO: 34 항-TNF 항체 CDRH1 변이체
Figure pct00064
SEQ ID NO: 35 항-TNF 항체 CDRH1 변이체
Figure pct00065
SEQ ID NO: 36 항-TNF 항체 CDRH1 변이체
Figure pct00066
SEQ ID NO: 37 항-TNF 항체 CDRH1 변이체
Figure pct00067
SEQ ID NO: 38 항-TNF 항체 CDRH1 변이체
Figure pct00068
SEQ ID NO:39 심지아(세르톨리주맙) LC (VL+Ck)
Figure pct00069
SEQ ID NO: 40 항-TNF 항체 CDRH3 변이체
Figure pct00070
SEQ ID NO: 41 항-TNF 항체 CDRH3 변이체
Figure pct00071
SEQ ID NO: 42 항-TNF 항체 CDRH3 변이체
Figure pct00072
SEQ ID NO: 43 항-TNF 항체 CDRH3 변이체
Figure pct00073
SEQ ID NO: 44 항-TNF 항체 CDRH3 변이체
Figure pct00074
SEQ ID NO: 45 항-TNF 항체 CDRH3 변이체
Figure pct00075
SEQ ID NO: 46 항-TNF 항체 CDRH3 변이체
Figure pct00076
SEQ ID NO: 47 항-TNF 항체 CDRH3 변이체
Figure pct00077
SEQ ID NO: 48 항-TNF 항체 CDRH3 변이체
Figure pct00078
SEQ ID NO: 49 항-TNF 항체 CDRH3 변이체
Figure pct00079
SEQ ID NO: 50 항-TNF 항체 CDRL1 변이체
Figure pct00080
SEQ ID NO: 51 항-TNF 항체 CDRL1 변이체
Figure pct00081
SEQ ID NO: 52 항-TNF 항체 CDRL1 변이체
Figure pct00082
SEQ ID NO: 53 항-TNF 항체 CDRL1 변이체
Figure pct00083
SEQ ID NO: 54 항-TNF 항체 CDRL1 변이체
Figure pct00084
SEQ ID NO: 55 항-TNF 항체 CDRL1 변이체
Figure pct00085
SEQ ID NO: 56 항-TNF 항체 CDRL1 변이체
Figure pct00086
SEQ ID NO: 57 항-TNF 항체 CDRL1 변이체
Figure pct00087
SEQ ID NO: 58 항-TNF 항체 CDRL1 변이체
Figure pct00088
SEQ ID NO: 59 항-TNF 항체 CDRL1 변이체
Figure pct00089
SEQ ID NO: 60 항-TNF 항체 CDRL1 변이체
Figure pct00090
SEQ ID NO: 61 항-TNF 항체 CDRL1 변이체
Figure pct00091
SEQ ID NO: 62 항-TNF 항체 CDRL2 변이체
Figure pct00092
SEQ ID NO: 63 항-TNF 항체 CDRL2 변이체
Figure pct00093
SEQ ID NO: 64 항-TNF 항체 CDRL2 변이체
Figure pct00094
SEQ ID NO: 65 항-TNF 항체 CDRL2 변이체
Figure pct00095
SEQ ID NO: 66 항-TNF 항체 CDRL2 변이체
Figure pct00096
SEQ ID NO: 67 항-TNF 항체 CDRL2 변이체
Figure pct00097
SEQ ID NO: 68 항-TNF 항체 CDRL2 변이체
Figure pct00098
SEQ ID NO: 69 항-TNF 항체 CDRL2 변이체
Figure pct00099
SEQ ID NO: 70 항-TNF 항체 CDRL2 변이체
Figure pct00100
SEQ ID NO: 71 항-TNF 항체 CDRL2 변이체
Figure pct00101
SEQ ID NO: 72 항-TNF 항체 CDRL2 변이체
Figure pct00102
SEQ ID NO: 73 항-TNF 항체 CDRL3 변이체
Figure pct00103
SEQ ID NO: 74 항-TNF 항체 CDRL3 변이체
Figure pct00104
SEQ ID NO: 75 항-TNF 항체 CDRL3 변이체
Figure pct00105
SEQ ID NO: 76 항-TNF 항체 CDRL3 변이체
Figure pct00106
SEQ ID NO: 77 항-TNF 항체 가변 중쇄 도메인 변이체 cb1-3-VH(aka cb2-6-VH)의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00107
SEQ ID NO: 78 항-TNF 항체 가변 중쇄 도메인 변이체 cb1-3-VH(aka cb2-6-VH)의 단백질 서열
Figure pct00108
SEQ ID NO: 79 항-TNF 항체 가변 중쇄 도메인 변이체 cb2-44-VH의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00109
SEQ ID NO: 80 항-TNF 항체 가변 중쇄 도메인 변이체 cb2-44-VH의 단백질 서열
Figure pct00110
SEQ ID NO: 81 항-TNF 항체 가변 중쇄 도메인 변이체 cb1-39-VH의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00111
SEQ ID NO: 82 항-TNF 항체 가변 중쇄 도메인 변이체 cb1-39-VH의 단백질 서열
Figure pct00112
SEQ ID NO: 83 항-TNF 항체 가변 중쇄 도메인 변이체 cb1-31-VH의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00113
SEQ ID NO: 84 항-TNF 항체 가변 중쇄 도메인 변이체 cb1-31-VH의 단백질 서열
Figure pct00114
SEQ ID NO: 85 항-TNF 항체 가변 중쇄 도메인 변이체 cb2-11-VH의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00115
SEQ ID NO: 86 항-TNF 항체 가변 중쇄 도메인 변이체 cb2-11-VH의 단백질 서열
Figure pct00116
SEQ ID NO: 87 항-TNF 항체 가변 중쇄 도메인 변이체 cb2-40-VH의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00117
SEQ ID NO: 88 항-TNF 항체 가변 중쇄 도메인 변이체 cb2-40-VH의 단백질 서열
Figure pct00118
SEQ ID NO: 89 항-TNF 항체 가변 중쇄 도메인 변이체 cb2-35-VH의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00119
SEQ ID NO: 90 항-TNF 항체 가변 중쇄 도메인 변이체 cb2-35-VH의 단백질 서열
Figure pct00120
SEQ ID NO: 91 항-TNF 항체 가변 중쇄 도메인 변이체 cb2-28-VH의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00121
SEQ ID NO: 92 항-TNF 항체 가변 중쇄 도메인 변이체 cb2-28-VH의 단백질 서열
Figure pct00122
SEQ ID NO: 93 항-TNF 항체 가변 중쇄 도메인 변이체 cb2-38-VH의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00123
SEQ ID NO: 94 항-TNF 항체 가변 중쇄 도메인 변이체 cb2-38-VH의 단백질 서열
Figure pct00124
SEQ ID NO: 95 항-TNF 항체 가변 중쇄 도메인 변이체 cb2-20-VH의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00125
SEQ ID NO: 96 항-TNF 항체 가변 중쇄 도메인 변이체 cb2-20-VH의 단백질 서열
Figure pct00126
SEQ ID NO: 97 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb1-8-VL의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00127
SEQ ID NO: 98 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb1-8-VL의 단백질 서열
Figure pct00128
SEQ ID NO: 99 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb1-43-VL의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00129
SEQ ID NO: 100 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb1-43-VL의 단백질 서열
Figure pct00130
SEQ ID NO: 101 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb1-45-VL의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00131
SEQ ID NO: 102 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb1-45-VL의 단백질 서열
Figure pct00132
SEQ ID NO: 103 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb1-4-VL의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00133
SEQ ID NO: 104 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb1-4-VL의 단백질 서열
Figure pct00134
SEQ ID NO: 105 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb1-41-VL의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00135
SEQ ID NO: 106 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb1-41-VL의 단백질 서열
Figure pct00136
SEQ ID NO: 107 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb1-37-VL의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00137
SEQ ID NO: 108 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb1-37-VL의 단백질 서열
Figure pct00138
SEQ ID NO: 109 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb1-39-VL의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00139
SEQ ID NO: 110 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb1-39-VL의 단백질 서열
Figure pct00140
SEQ ID NO: 111 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb1-33-VL의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00141
SEQ ID NO: 112 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb1-33-VL의 단백질 서열
Figure pct00142
SEQ ID NO: 113 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb1-35-VL의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00143
SEQ ID NO: 114 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb1-35-VL의 단백질 서열
Figure pct00144
SEQ ID NO: 115 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb1-31-VL의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00145
SEQ ID NO: 116 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb1-31-VL의 단백질 서열
Figure pct00146
SEQ ID NO: 117 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb1-29-VL의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00147
SEQ ID NO: 118 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb1-29-VL의 단백질 서열
Figure pct00148
SEQ ID NO: 119 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb1-22-VL의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00149
SEQ ID NO: 120 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb1-22-VL의 단백질 서열
Figure pct00150
SEQ ID NO: 121 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb1-23-VL의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00151
SEQ ID NO: 122 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb1-23-VL의 단백질 서열
Figure pct00152
SEQ ID NO: 123 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb1-12-VL의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00153
SEQ ID NO: 124 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb1-12-VL의 단백질 서열
SEQ ID NO: 125 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb1-10-VL의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00155
SEQ ID NO: 126 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb1-10-VL의 단백질 서열
Figure pct00156
SEQ ID NO: 127 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb2-1-VL의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00157
SEQ ID NO: 128 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb2-1-VL의 단백질 서열
Figure pct00158
SEQ ID NO: 129 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb2-11-VL의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00159
SEQ ID NO: 130 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb2-11-VL의 단백질 서열
Figure pct00160
SEQ ID NO: 131 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb2-40-VL의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00161
SEQ ID NO: 132 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb2-40-VL의 단백질 서열
Figure pct00162
SEQ ID NO: 133 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb2-35-VL의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00163
SEQ ID NO: 134 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb2-35-VL의 단백질 서열
Figure pct00164
SEQ ID NO: 135 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb2-28-VL의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00165
SEQ ID NO: 136 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb2-28-VL의 단백질 서열
Figure pct00166
SEQ ID NO: 137 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb2-20-VL의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00167
SEQ ID NO: 138 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb2-20-VL의 단백질 서열
Figure pct00168
SEQ ID NO: 139 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb1-3-VL의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00169
SEQ ID NO: 140 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb1-3-VL의 단백질 서열
Figure pct00170
SEQ ID NO: 141 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb2-6-VL의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00171
SEQ ID NO: 142 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb2-6-VL의 단백질 서열
Figure pct00172
SEQ ID NO: 143 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb2-44-VL의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00173
SEQ ID NO: 144 항-TNF 항체 가변 경쇄 도메인 변이체 cb2-44-VL의 단백질 서열
Figure pct00174
SEQ ID NO: 145 항-TNF 항체 중쇄 변이체 cb1-3-VH + M252Y/S254T/T256E 변형의 단백질 서열
Figure pct00175
SEQ ID NO: 146 항-TNF 항체 중쇄 변이체 cb2-44-VH + M252Y/S254T/T256E 변형의 단백질 서열
Figure pct00176
SEQ ID NO: 147 항-TNF 항체 경쇄 변이체 cb1-3-VL의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00177
SEQ ID NO: 148 항-TNF 항체 경쇄 변이체 cb1-3-VL의 단백질 서열
Figure pct00178
SEQ ID NO: 149 항-TNF 항체 경쇄 변이체 cb2-6-VL의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00179
SEQ ID NO: 150 항-TNF 항체 경쇄 변이체 cb2-6-VL의 단백질 서열
Figure pct00180
SEQ ID NO:151 항-TNF 항체 경쇄 변이체 cb2-44-VL의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00181
SEQ ID NO: 152 항-TNF 항체 경쇄 변이체 cb2-44-VL의 단백질 서열
Figure pct00182
SEQ ID NO: 153 항-TNF 항체 중쇄 변이체 cb1-3-VH의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00183
SEQ ID NO: 154 항-TNF 항체 중쇄 변이체 cb1-3-VH의 단백질 서열
Figure pct00184
SEQ ID NO: 155 항-TNF 항체 중쇄 변이체 cb2-44-VH의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00185
SEQ ID NO: 156 항-TNF 항체 중쇄 변이체 cb2-44-VH의 단백질 서열
Figure pct00186
SEQ ID NO: 157 M252Y/S254T/T256E 변형을 함유하는 파스콜리주맙 중쇄의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00187
SEQ ID NO: 158 M252Y/S254T/T256E 변형을 함유하는 파스콜리주맙 중쇄의 단백질 서열
Figure pct00188
SEQ ID NO: 159 파스콜리주맙 경쇄의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00189
SEQ ID NO:160 파스콜리주맙 경쇄의 단백질 서열
Figure pct00190
SEQ ID NO: 161 파스콜리주맙 중쇄의 단백질 서열
Figure pct00191
SEQ ID NO: 162 항-TNF 항체 중쇄 + M428L/N434S 변형의 대안적 단백질 서열
Figure pct00192
SEQ ID NO: 163 IgG1 불변 도메인 + M428L/N434S 변형의 대안적 단백질 서열
Figure pct00193
SEQ ID NO: 164 항-TNF 항체 중쇄 + H433K/N434F 변형의 단백질 서열
Figure pct00194
SEQ ID NO: 165 IgG1 불변 도메인 + H433K/N434F 변형의 단백질 서열
Figure pct00195
SEQ ID NO: 166 항-TNF 항체 중쇄 + H433K/N434F 변형의 대안적 단백질 서열
Figure pct00196
SEQ ID NO: 167 IgG1 불변 도메인 + H433K/N434F 변형의 대안적 단백질 서열
Figure pct00197
SEQ ID NO: 168 항-TNF 항체 중쇄 + M428L/N434S 변형의 대안적 단백질 서열
Figure pct00198
SEQ ID NO: 169 IgG1/2 불변 도메인 + M428L/N434S 변형의 대안적 단백질 서열
Figure pct00199
SEQ ID NO: 170 골리무맙_VH
Figure pct00200
SEQ ID NO: 171 골리무맙_VL
Figure pct00201
SEQ ID NO: 172 골리무맙_HC
Figure pct00202
SEQ ID NO: 173 골리무맙_LC
Figure pct00203
SEQ ID NO: 174 레미케이드_VH
Figure pct00204
SEQ ID NO: 175 레미케이드_VL
Figure pct00205
SEQ ID NO: 176 레미케이드_HC
Figure pct00206
SEQ ID NO: 177 레미케이드_LC
Figure pct00207
SEQ ID NO: 178 심지아(세르톨리주맙) VH
Figure pct00208
SEQ ID NO: 179 심지아(세르톨리주맙) VL
Figure pct00209
SEQ ID NO: 180 심지아(세르톨리주맙) HC (VH+CH1)
Figure pct00210
SEQUENCE LISTING <110> ELLIS, johnathan TOMLINSON, Ian SHAH, Tejash MOLLOY, Micheal YASIN, Ahmed CROTTS, George MORAR-MITRICA Sorina <120> Antigen-binding proteins with increased FcRn binding <130> PB65370 <150> US61/756135 <151> 2013-01-24 <160> 180 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanised sequence <400> 1 gatatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcct ctgtgggcga tagagtgacc 60 atcacctgcc gggccagcca gggcatcaga aactacctgg cctggtatca gcagaagcct 120 ggcaaggccc ctaagctgct gatctacgcc gccagcaccc tgcagagcgg cgtgcccagc 180 agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240 gaggacgtgg ccacctacta ctgccagcgg tacaacagag ccccttacac cttcggccag 300 ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gccgccccca gcgtgttcat cttccccccc 360 agcgatgagc agctcaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gtctgctgaa caacttctac 420 ccccgggagg ccaaagtgca gtggaaagtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag 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accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggattg gctgaacggc 960 aaggagtaca agtgtaaggt gtccaacaag gccctgcctg cccctatcga gaaaaccatc 1020 agcaaggcca agggccagcc cagagagccc caggtgtaca ccctgccccc tagcagagat 1080 gagctgacca agaaccaggt gtccctgacc tgcctggtga agggcttcta ccccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct 1200 gtgctggaca gcgatggcag cttcttcctg tacagcaagc tgaccgtgga caagagcaga 1260 tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caatcactac 1320 acccagaaga gcctgagcct gtcccctggc aag 1353 <210> 5 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanised sequence <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met 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caggtgtaca ccctgccccc tagcagagat 1080 gagctgacca agaaccaggt gtccctgacc tgcctggtga agggcttcta ccccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct 1200 gtgctggaca gcgatggcag cttcttcctg tacagcaagc tgaccgtgga caagagcaga 1260 tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caatcactac 1320 acccagaaga gcctgagcct gtcccctggc aag 1353 <210> 12 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanised sequence <400> 12 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr 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<220> <223> Humanised sequence <400> 173 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 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Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Met Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Thr Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Trp Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Val Lys Arg Thr 100 105 <210> 176 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanised sequence <400> 176 Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn His 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ala 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Thr Asp Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile 245 250 255 Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 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Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Trp Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Val Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 178 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanised sequence <400> 178 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr 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Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Ala Ala 225

Claims (47)

  1. TNF-알파 항원 결합 단백질 및 히스티딘 완충제를 포함하는 액체 제형.
  2. 제 1항에 있어서, 제형이 염을 포함하지 않는 제형.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 완충제가 계면 활성제, 킬레이트제, 폴리올, 항산화제 및 아미노산 중 하나 이상, 이들의 조합물, 또는 이들 모두를 추가로 포함하는 제형.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, TNF-알파 항원 결합 단백질이 20 내지 300 ㎎/㎖의 농도로 존재하는 제형.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 제형이 하기를 포함하고, pH 5.0 내지 7.0으로 조정된 제형:
    (a) 5 내지 100 mM의 히스티딘; 및/또는
    (b) 0 내지 150 mM의 염화나트륨; 및/또는
    (c) 0 내지 100 mM의 아르기닌 비함유 염기; 및/또는
    (d) 0 내지 0.2 mM의 EDTA; 및/또는
    (e) 0 내지 0.1%의 폴리소르베이트 80, 및/또는
    (f) 0 내지 300 mM의 트레할로스; 및/또는
    (g) 0 내지 30 mM의 메티오닌.
  6. 제 5항에 있어서,
    (a) 히스티딘이 약 30 mM의 농도로 존재하고/하거나;
    (b) 트레할로스가 150 mM 내지 225 mM의 농도로 존재하고/하거나;
    (c) 아르기닌 비함유 염기가 50 mM 내지 75 mM의 농도로 존재하고/하거나;
    (d) EDTA가 약 0.05 mM의 농도로 존재하고/하거나;
    (e) 폴리소르베이트 80이 약 0.02%의 농도로 존재하고/하거나;
    (f) 메티오닌이 약 10 mM의 농도로 존재하는, 제형.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 제형이 약 pH 6.0으로 조정된 pH의 제형인 제형.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, TNF-알파 항원 결합 단백질이 50 ㎎/㎖의 농도로 존재하는 제형.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 제형이 약 1주 후에 실온(약 25℃)에서 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 단량체 함량을 갖는 제형.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 제형이 하기를 함유하고, pH가 약 pH 6.0으로 조정된 제형:
    (a) 30 mM 농도의 히스티딘;
    (b) 150 mM 농도의 트레할로스;
    (c) 50 mM 농도의 아르기닌;
    (d) 10 mM 농도의 메티오닌;
    (e) 0.05 mM 농도의 EDTA;
    (f) 0.02% 농도의 PS80.
  11. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 제형이 하기를 함유하고, pH가 약 pH 6.0으로 조정된 제형:
    (a) 30 mM 농도의 히스티딘;
    (b) 225 mM 농도의 트레할로스;
    (c) 75 mM 농도의 아르기닌;
    (d) 10 mM 농도의 메티오닌;
    (e) 0.05 mM 농도의 EDTA;
    (f) 0.02% 농도의 PS80.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, TNF-알파 항원 결합 단백질이 하기를 포함하는 제형:
    (i) CDRH1(SEQ ID NO: 27), CDRH2(SEQ ID NO: 28), CDRH3(SEQ ID No: 29), CDRL1(SEQ ID NO: 30), CDRL2(SEQ ID NO: 31), 및 CDRL3(SEQ ID NO: 32); 또는 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 또는 CDRL3에 비해 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 함유하는 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 또는 CDRL3의 CDR 변이체; 및
    (ii) 인간 IgG1 불변 도메인에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 인간 IgG1 불변 도메인의 신생아 Fc 수용체(FcRn) 결합 부분.
  13. 제 12항에 있어서, TNF-알파 항원 결합 단백질이 하기를 포함하는 제형:
    (j) CDRH1(SEQ ID NO: 27), CDRH2(SEQ ID NO: 28), CDRH3(SEQ ID No: 29), CDRL1(SEQ ID NO: 30), CDRL2(SEQ ID NO: 31), 및 CDRL3(SEQ ID NO: 32); 및
    (ii) 인간 IgG1 불변 도메인에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 인간 IgG1 불변 도메인의 신생아 Fc 수용체(FcRn) 결합 부분.
  14. 제 12항 또는 제 13항에 있어서, 항원 결합 단백질이 SEQ ID No. 2의 경쇄 서열 및 SEQ ID No. 12의 중쇄 서열을 포함하는 IgG에 비해 pH 6에서 증가된 FcRn 결합 친화성 및/또는 증가된 반감기를 갖는 제형.
  15. 제 12항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, TNF-알파 항원 결합 단백질이 2주마다 1회 투여되는 SEQ ID No. 2의 경쇄 서열 및 SEQ ID No. 12의 중쇄 서열을 포함하는 IgG의 동일 용량에 의해 달성되는 것과 동등한 평균 항정-상태 최저 농도(mean steady-state trough concentration)를 달성하기 위해 4주마다 1회 이하로 투여될 수 있는 제형.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, TNF-알파 항원 결합 단백질이 25℃에서 ProteOn XPR36 단백질 상호작용 어레이 시스템에 의해 평가시 pH 6에서 변형이 없는 동일한 CDR을 갖는 항-TNF 항원 결합 단백질보다 4배 더 큰 FcRn에 대한 친화성을 갖고, 상기 어레이 시스템이 칩 상에 고정된 항원 결합 단백질을 갖는, 제형.
  17. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, TNF-알파 항원 결합 단백질이 SEQ ID No. 2의 경쇄 서열 및 SEQ ID No. 12의 중쇄 서열을 포함하는 IgG의 변이체이고, 항원 결합 단백질 변이체가 IgG에 비해 항원 결합 단백질 변이체의 반감기를 증가시키기 위해 IgG 불변 도메인의 신생아 Fc 수용체(FcRn) 결합 부분 내에 하나 이상의 치환을 포함하고, 변이체가 4 내지 8주 간격으로 40 ㎎의 단일 용량으로 환자에 투여되는 경우, 환자 집단에서의 평균 항정-상태 최저 항체 농도가 투여 간격 사이에 5 ㎍/㎖ 아래, 바람직하게는 6 ㎍/㎖ 아래로 떨어지지 않는, 제형.
  18. 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, TNF-알파 항원 결합 단백질의 인간 IgG1 불변 도메인이 아미노산 치환이 도입되기 전에 SEQ ID No. 13의 서열을 갖는 제형.
  19. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단백질이 2주마다 1회 투여되는 SEQ ID No. 2의 경쇄 서열 및 SEQ ID No. 12의 중쇄 서열을 포함하는 IgG의 동일 용량에 의해 달성되는 것과 동등한 평균 항정-상태 최저 농도를 달성하기 위해 4주마다 1회 이하로 환자에게 투여될 수 있는, 질병을 치료하기 위한 약제로 사용하기 위한, 제형.
  20. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 제형이 4 내지 8주 간격으로 약 35 내지 약 45 ㎎의 단일 용량으로 환자에 투여되는, 질병의 치료를 위한, 제형.
  21. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 제형이 4주마다 1회 이하로 단일한 40 ㎎ 용량으로 환자에게 피하 투여되는 제형.
  22. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에서 4주마다 1회 이하의 제형의 투여가 약 4 ㎍/㎖ 내지 약 7 ㎍/㎖의 환자 집단에서의 평균 항정-상태 최저 농도를 달성하는 제형.
  23. 제 22항에 있어서, 평균 항정-상태 최저 농도가 약 5 ㎍/㎖ 내지 약 6 ㎍/㎖인 제형.
  24. 제 21항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 제형이 8주마다 1회 이하로 단일한 40 ㎎ 용량으로 환자에게 피하 투여되는 제형.
  25. 제 1항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, TNF-알파 항원 결합 단백질의 반감기가 자연 IgG에 비해 2배, 3배, 4배 또는 5배 증가되는 제형.
  26. 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, TNF-알파 항원 결합 단백질의 청소가 약 2.㎖/hr 내지 약 4㎖/hr인 제형.
  27. 제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, TNF-알파 항원 결합 단백질이 케이뱃의 EU 지침에 따라 넘버링된 위치 250, 252, 254, 256, 257, 259, 308, 428 또는 434 중 하나 이상에서 인간 IgG1 불변 도메인에 비해 아미노산 치환을 포함하는 제형.
  28. 제 12항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, TNF-알파 항원 결합 단백질의 하나 이상의 아미노산 치환이 케이뱃의 EU 지침에 따라 넘버링된 아미노산 잔기 252, 254 및 256에 존재하고, 잔기 252에서의 치환이 tyr, phe, trp 또는 thr에 의한 치환이고, 잔기 254에서의 치환이 thr에 의한 치환이고, 잔기 256에서의 치환이 ser, arg, glu, asp 또는 thr에 의한 치환인 제형.
  29. 제 28항에 있어서, 잔기 252에서의 치환이 tyr에 의한 met의 치환이고, 잔기 254에서의 치환이 thr에 의한 ser의 치환이고, 잔기 256에서의 치환이 glu에 의한 thr의 치환인 제형.
  30. 제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, TNF-알파 항원 결합 단백질이 SEQ ID No: 7에 제시된 불변 도메인을 포함하는 제형.
  31. 제 12항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환이 케이뱃의 EU 지침에 따라 넘버링된 아미노산 잔기 250 및 428에 존재하고, 잔기 250에서의 치환이 glu 또는 gln에 의한 치환이고, 잔기 428에서의 치환이 leu 또는 phe에 의한 치환인 제형.
  32. 제 31항에 있어서, 잔기 250에서의 치환이 glu에 의한 thr의 치환이고, 잔기 428에서의 치환이 leu에 의한 met의 치환인 제형.
  33. 제 32항에 있어서, TNF-알파 결합 단백질이 SEQ ID No: 16에 제시된 불변 도메인을 포함하는 제형.
  34. 제 12항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, TNF-알파 결합 단백질의 하나 이상의 아미노산 치환이 케이뱃의 EU 지침에 따라 넘버링된 아미노산 잔기 428 및 434에 존재하고, 잔기 428에서의 aa 치환이 leu에 의한 met의 치환이고, 잔기 434에서의 aa 치환이 ser에 의한 asn의 치환인 제형.
  35. 제 34항에 있어서, TNF-알파 결합 단백질이 SEQ ID No: 10에 제시된 불변 도메인을 포함하는 제형.
  36. 제 1항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단백질이 항체인 제형.
  37. 제 1항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, TNF-알파 결합 단백질이 메토트렉세이트와 함께 투여되고, 바람직하게는 항원 결합 단백질이 류마티스 관절염의 치료를 위해 투여되는 제형.
  38. 제 1항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, TNF-알파 결합 단백질이 SEQ ID NO: 6 및/또는 SEQ ID NO: 3의 가변 도메인, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 함유하거나 SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 3의 길이에 걸쳐 적어도 90%의 동일성을 공유하는 SEQ ID NO: 6 및/또는 SEQ ID NO: 3의 가변 도메인의 변이체를 포함하는 제형.
  39. 제 1항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 있어서, TNF-알파 결합 단백질이 SEQ ID No 5, 9 또는 15에 제시된 중쇄 서열과 함께 임의로 SEQ ID No: 2에 제시된 경쇄 서열을 포함하는 제형.
  40. 제 1항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, TNF-알파 결합 단백질이 SEQ ID NO: 78 또는 80에 제시된 가변 중쇄 도메인 서열을 포함하는 제형.
  41. 제 1항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, TNF-알파 결합 단백질이 SEQ ID NO: 145 또는 SEQ ID NO: 146에 제시된 중쇄 서열을 포함하는 제형.
  42. 제 1항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 따른 제형을 투여하는 것을 포함하는, 질병을 가진 환자를 치료하는 방법.
  43. 제 1항 내지 제 42항 중 어느 한 항에 따른 제형을 4 내지 8주 간격으로 약 35 내지 약 45 ㎎의 단일 용량으로 환자에게 피하 투여하는 것을 포함하는, 질병을 가진 환자를 치료하는 방법.
  44. 제 42항 또는 제 43항에 있어서, 질병이 류마티스 관절염, 다관절 소아 특발성 관절염, 건선성 관절염, 강직척추염, 크론병 또는 건선인 방법.
  45. 류마티스 관절염, 다관절 소아 특발성 관절염, 건선성 관절염, 강직척추염, 크론병 또는 건선의 치료를 위한 약제의 제조에서 사용하기 위한 제 1항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 따른 제형의 용도.
  46. 제 1항 내지 제 41항 중 어느 한 항의 제형을 포함하고, TNF-알파 결합 단백질 및 메토트렉세이트의 동시 전달을 위한 메토트렉세이트를 임의로 포함하는 키트.
  47. SEQ ID No: 5에 따른 중쇄 및 SEQ ID No: 2에 따른 경쇄를 포함하는 TNF-알파 항원 결합 단백질을 포함하는 액체 제형으로서, 하기를 함유하고, pH가 약 pH 6.0으로 조정된, 액체 제형:
    (a) 30 mM 농도의 히스티딘;
    (b) 150 mM 농도의 트레할로스;
    (c) 50 mM 농도의 아르기닌;
    (d) 10 mM 농도의 메티오닌;
    (e) 0.05 mM 농도의 EDTA;
    (f) 0.02% 농도의 PS80.
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