KR20180066250A - TGF-β1 유전자의 발현을 억제하는 단일-가닥 핵산 분자를 안정적으로 함유하는 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 5'-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC-P-G-3'(서열번호 1) (서열에서, P는 명세서에서 (I)로 표시되는 프롤린 유도체 링커임)에 의해 나타낸 뉴클레오티드 서열 및 완충액으로 이루어지고, 다음의 특성을 가진 단일-가닥 핵산 분자를 함유하는 조성물을 제공한다:
(a) 상온에서 용액의 형태로 존재하는 것; 및
(b) 25°C, 상대 습도 60%에서, 4주 동안의 저장 후에 핵산 분자의 함량이 저장 시작시의 함량과 비교하여 80% 이상인 것.

Description

TGF-β1 유전자의 발현을 억제하는 단일-가닥 핵산 분자를 안정적으로 함유하는 조성물
본 발명은 TGF-β1 유전자의 발현을 억제하는 단일-가닥 핵산 분자를 함유하는, 핵산 분자의 개선된 안정성을 나타내는 신규한 조성물, 특히 약학적 조성물인, 조성물에 관한 것이다.
폐 섬유증은 폐포의 손상 및 붕괴에 의해 촉진되어 폐의 지질(stroma)에서 일어나는 섬유증인 질환이다. 많은 경우에, 원인은 알려져 있지 않다. 원인을 발견할 수 없는 경우에, 폐 섬유증은 특히 특발성 폐 섬유증(IPF)로 칭한다. 섬유증이 진행되면서, 폐는 단단해지고 산소 교환 용량이 감소한다. 현 시점에서, 확실한 치료 방법이 없고, 이 치료 방법은 대부분 대증 치료법이다.
TGF-β는 세포 증식 및 분화를 조절하는 사이토카인으로 알려져 있고, 또한 간 또는 폐 피브릴화(fibrillization)에 있어서 또한 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 따라서, 이것은 폐 섬유증의 치료 표적으로서 관심을 끈다.
핵산 약물은 저분자 의약품의 쉬운 제조가능성 및 항체 약물의 유효성과 안전성을 모두 가지기 때문에, 차세대의 신약 개발 기술로서 기대된다. 그러나, 체내에서 핵산 분자의 불안정성, 증가된 선천성 면역 반응으로 인한 부작용, 효율적인 약물 전달 시스템(DDS) 발전의 부재 등의 장벽 때문에, 의약품의 개발은 기대된 바와 같이 진행되지 않았다.
호흡기 질환의 경우, 폐에 대한 약물의 국소 투여가 가능하기 때문에, 폐 섬유증은 핵산 약물의 효과적인 표적 질환이다. 체내에서의 안정성 및 선천성 면역 반응 유도와 같은 핵산 분자의 문제를 해결하기 위해, siRNA 또는 miRNA의 이중-가닥 핵산의 말단이 다양한 링커에 연결되는 단일-가닥 핵산 분자가 개발되었다(예를 들어, 특허 문헌 1-5). Hamasaki 등은 TGF-β1 발현-억제성 서열(이하, "PK-0051"로 지칭함)을 보유하는 하기의 화학식을 가지는 단일-가닥 핵산 분자를 폐 섬유증 및 급성 폐 손상의 모델 마우스에 기관내 투여하여, 증상이 현저하게 개선되었음을 보고하였다(비-특허 문헌 1).
5'-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC-P-G-3' (서열번호 1)
(밑줄은 TGF-β1 발현 억제성 서열을 나타낸다. P는 하기 화학식 (I)로 표시된 프롤린 유도체 링커이다).
Figure pct00001
특허 문헌 1: WO 2012/017919 특허 문헌 2: WO 2013/103146 특허 문헌 3: WO 2012/005368 특허 문헌 4: WO 2012/077446 특허 문헌 5: WO 2013/133393
비-특허 문헌 1: PLoS One, 2012, 7(8):e42655.
일반적으로, 핵산은 용액에서의 분해에 취약하고 불안정하기 때문에, 상온에서 다루는 것은 매우 어렵다. 따라서, 동결-건조 저장 및 50% 에탄올을 트리스-EDTA(TE) 완충액에 첨가하는 단계와 -20°C에서 동결되지 않도록 동일하게 저장하는 단계를 포함하는 방법이 일반적으로 적용되었다. 이런 상황 하에서, 상온에서 활성 성분으로서 핵산의 안정적인 존재를 보장할 수 있고 취급 특성에 있어 훌륭할 수 있는 안정적인 핵산 제조의 개발은 바라던 것이다.
따라서, 본 발명은 단일-가닥 핵산 분자(PK-0051)를 함유하는, 상온에서의 해결책으로서 폐 섬유증 또는 급성 폐 손상에 대하여 치료효과를 가지는 것이 확인된, 조성물, 특히 약학적 조성물, 및 이의 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자는 상기 언급된 문제를 해결하기 위해 집중적인 연구를 수행하였고, 예상외로 PK-0051을 완충액에서 용해시키고 PK-0051 용액의 pH를 특정 범위 내로 떨어지도록 조절함으로써 PK-0051 분자는 오랜 기간 동안 안정적으로 저장될 수 있음을 발견하였고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 다음과 같다.
[1] 5'-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC-P-G-3'(서열번호 1) (서열에서, P는 하기의 화학식 (I)에 의해 나타낸 프롤린 유도체 링커임)에 의해 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 단일-가닥 핵산 분자
Figure pct00002
및 완충액을 포함하고, 하기의 특성을 가지는 조성물:
(a) 상온에서 용액의 형태로 존재하는 것; 및
(b) 25°C, 상대 습도 60%에서, 4주 동안의 저장 후에 핵산 분자의 함량이 저장 시작시의 함량과 비교하여 80% 이상인 것.
[2] [1]의 조성물에서, 40°C, 상대습도 75%에서 4주 동안의 저장 후에 핵산 분자의 함량이 저장 시작시의 함량과 비교하여 80% 이상인 것인, 조성물.
[3] [1] 또는 [2]의 조성물에서, 60°C에서 4주 동안의 저장 후에 핵산 분자의 함량이 저장 시작시의 함량과 비교하여 60% 이상인 것인, 조성물.
[4] [1]의 조성물에서, 총 빛 노출 120만 럭스ㆍ시간 노출된 핵산 분자의 함량이 저장 시작시의 함량과 비교하여 80% 이상인 것인, 조성물.
[5] [1] 내지 [4] 중 어느 하나의 조성물에서, 완충액은 4.0 이상 및 9.0 이하로 조성물의 pH를 조절하는 것인, 조성물.
[6] [1] 내지 [4] 중 어느 하나의 조성물에서, 완충액은 4.4 이상 및 7.4 이하로 조성물의 pH를 조절하는 것인, 조성물.
[7] [1] 내지 [4] 중 어느 하나의 조성물에서, 완충액은 4.6 이상 및 7.0 이하로 조성물의 pH를 조절하는 것인, 조성물.
[8] [1] 내지 [4] 중 어느 하나의 조성물에서, 완충액은 5.5 이상 및 6.5 이하로 조성물의 pH를 조절하는 것인, 조성물.
[9] [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 조성물에서, 완충액은 소듐 하이드로젠 포스페이트, 소듐 디하드로젠 포스페이트, 디소듐 하이드로젠 포스페이트, 소듐 클로라이드, 아르지닌 하이드로클로라이드, 소듐 시트레이트, 트리소듐 시트레이트 디하이드레이트, 모노소듐 L-글루타메이트, 소듐 아세테이트, 소듐 카보네이트, 소듐 하이드로젠 카보네이트, 소듐 락테이트, 모노포타슘 포스페이트, 소듐 하이드록사이드, 메글루민, 글리신, 시트르산 및 아세트산으로부터 선택되는 하나 이상의 완충제를 포함하는 것인, 조성물.
[10] [1] 내지 [9] 중 어느 하나의 조성물에서, 완충액은 시트르산 및/또는 인산을 포함하는 것인, 조성물.
[11] [1] 내지 [10] 중 어느 하나의 조성물에서, 등장제(isotonicity agent)를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
[12] [11]의 조성물에서, 등장제는 D-소르비톨, 소듐 클로라이드, 글리세롤, D-만니톨, 포타슘 클로라이드, 락티톨 및 수크로스로부터 하나 이상으로 선택되는 것인, 조성물.
[13] [1] 내지 [12] 중 어느 하나의 조성물에서, 조성물은 폐 섬유증 또는 급성 폐 손상의 예방 또는 치료를 위한 것인, 조성물.
[14] 조성물의 pH를 4.6 이상 및 7.0 이하로 조절하는 완충액에서 상기 언급된 핵산 분자를 용해시키는 단계 및 상온에서 용액을 저장하는 단계를 포함하는, [1] 내지 [13] 중 어느 하나의 조성물을 생산하는 방법.
[15] 조성물의 pH를 5.5 이상 및 6.5 이하로 조절하는 완충액에서 상기 언급된 핵산 분자를 용해시키는 단계 및 상온에서 용액을 저장하는 단계를 포함하는, [1] 내지 [13] 중 어느 하나의 조성물을 생산하는 방법.
[16] [14] 또는 [15]의 방법에서, 완충액은 시트르산 및/또는 인산을 포함하는 것인, 방법.
[17] [14] 내지 [16] 중 어느 하나의 방법에서, 조성물은 폐 섬유증 또는 급성 폐 손상의 예방 또는 치료를 위한 것인, 방법.
[18] 조성물의 pH를 4.6 이상 및 7.0 이하로 조절하는 완충액에서 핵산 분자를 용해시키는 단계 및 상온에서 용액을 저장하는 단계를 포함하는, 조성물에서 핵산 분자를 안정화하기 위한 방법.
[19] 조성물의 pH를 5.5 이상 및 6.5 이하로 조절하는 완충액에서 핵산 분자를 용해시키는 단계 및 상온에서 용액을 저장하는 단계를 포함하는, 조성물에서 핵산 분자를 안정화하기 위한 방법.
[20] [18] 또는 [19]의 방법에서, 완충액은 시트르산 및/또는 인산을 포함하는 것인, 방법.
[21] [18] 내지 [20] 중 어느 하나의 방법에서, 용액은 폐 섬유증 또는 급성 폐 손상의 예방 또는 치료를 위한 조성물인 것인, 방법.
본 발명에 따르면, 활성 성분으로서의 단일-가닥 핵산 분자의 개선된 안정성을 나타내고, 사용 중에 재용해를 필요로 하지 않는, 신규하고 쉽게 다룰 수 있는 약학적 조성물이 제공될 수 있다.
도 1은 각 pH에서 완충액을 사용하여 제조된 PK-0051 용액의 25°C에서 안정성 시험 결과를 나타낸다.
도 2는 각 pH에서 완충액을 사용하여 제조된 PK-0051 용액의 40°C에서 안정성 시험 결과를 나타낸다.
도 3은 각 pH에서 완충액을 사용하여 제조된 PK-0051 용액의 60°C에서 안정성 시험 결과를 나타낸다.
도 4는 0.05 M 시트레이트 완충액(pH 4.0-7.5)을 사용하여 제조된 PK-0051 용액의 60°C에서 안정성 시험 결과를 나타낸다.
도 5는 0.1 M 시트레이트 완충액(pH 4.0-7.8)을 사용하여 제조된 PK-0051 용액의 60°C에서 안정성 시험 결과를 나타낸다.
도 6은 0.05 M 포스페이트 완충액(pH 4.0-7.9)을 사용하여 제조된 PK-0051 용액의 60°C에서 안정성 시험 결과를 나타낸다.
도 7은 0.05 M 시트레이트 완충액 : 0.05 M 포스페이트 완충액 (8:2) (pH 4.0-7.8)을 사용하여 제조된 PK-0051 용액의 60°C에서 안정성 시험 결과를 나타낸다.
도 8은 0.05 M 시트레이트 완충액 : 0.05 M 포스페이트 완충액 (5:5) (pH 4.0-7.8)을 사용하여 제조된 PK-0051 용액의 60°C에서 안정성 시험 결과를 나타낸다.
도 9는 0.05 M 시트레이트 완충액 : 0.05 M 포스페이트 완충액 (2:8) (pH 4.0-7.8)을 사용하여 제조된 PK-0051 용액의 60°C에서 안정성 시험 결과를 나타낸다.
도 10은 각 농도에서 시트레이트 완충액을 사용하여 제조된 PK-0051 용액의 40°C에서 안정성 시험 결과를 나타낸다.
도 11은 각 농도에서 시트레이트 완충액을 사용하여 제조된 PK-0051 용액의 60°C에서 안정성 시험 결과를 나타낸다.
도 12는 1 mg/mL PK-0051 용액(pH 6.5)의 안정성 시험 결과를 나타낸다.
도 13은 10 mg/mL PK-0051 용액(pH 6.5)의 안정성 시험 결과를 나타낸다.
도 14는 1 mg/mL PK-0051 용액(pH 6.0)의 안정성 시험 결과를 나타낸다.
도 15는 PK-0051의 각 투여 그룹의 폐 조직에서 hTGF-β1의 상대적인 양을 나타낸다.
도 16은 PK-0051의 각 투여 그룹의 폐 조직에서 하이드록시 프롤린의 양을 나타낸다.
도 17은 10, 20, 40 및 80 mg/mL PK-0051(0.05 M 시트레이트 완충액(pH 6.0))의 60°C에서 안정성 시험 결과 를 나타낸다.
도 18은 1 mg/mL PK-0051(0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 5.5))의 광안정성 시험 결과를 나타낸다. 이온 교환 HPLC는 측정을 위해 사용되었다.
도 19는 1 mg/mL PK-0051(0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0))의 광안정성 시험 결과를 나타낸다. 이온 교환 HPLC는 측정을 위해 사용되었다.
도 20은 1 mg/mL PK-0051(0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.5))의 광안정성 시험 결과를 나타낸다. 이온 교환 HPLC는 측정을 위해 사용되었다.
도 21은 1 mg/mL PK-0051(0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 5.5))의 광안정성 시험 결과를 나타낸다. 역-상 HPLC는 측정을 위해 사용되었다.
도 22는 1 mg/mL PK-0051(0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0))의 광안정성 시험 결과를 나타낸다. 역-상 HPLC는 측정을 위해 사용되었다.
도 23은 1 mg/mL PK-0051(0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.5))의 광안정성 시험 결과를 나타낸다. 역-상 HPLC는 측정을 위해 사용되었다.
[구현예의 설명]
본 발명은 상온에서 용액의 형태로 TGF-β1 유전자의 발현을 억제하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 단일-가닥 핵산 분자 PK-0051을 안정적으로 저장할 수 있는 핵산 분자를 함유하는 조성물(이하, "본 발명의 조성물"로 지칭함)을 제공한다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, "상온"는 15 - 30°C의 온도 범위를 의미하고, "안정적으로 저장하는"은 (조성물의 제조상) 저장 시작의 80% 이상의 핵산 분자가 분해 없이 (1) 4주 이상, (2) 바람직하게는 24주 이상(약 6개월), (3) 더 바람직하게는 200주 이상(약 3.7년) 동안 저장되는 것을 의미한다. 이러한 저장 안정성은 하기의 안정성 시험 결과로부터 각각 확인될 수 있거나 예측될 수 있다.
(1) 25°C, 상대 습도 60%에서, 4주 동안의 저장 후에 조성물에서 핵산 분자의 함량은 저장 시작시의 함량과 비교하여 80% 이상이다.
(2) 40°C, 상대 습도 75%에서, 4주 동안의 저장 후에 조성물에서 핵산 분자의 함량은 저장 시작시의 함량과 비교하여 80% 이상이다.
(3) 60°C에서, 4주 동안의 저장 후에 조성물에서 핵산 분자의 함량은 저장 시작시의 함량과 비교하여 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상이다.
대신에, 105°C, 15분 동안 또는 121°C, 15분 동안의 저장 후에 조성물에서 핵산 분자의 함량은 저장 시작시의 함량과 비교하여 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상이다.
본 발명의 조성물은 고온 조건 하에 안정적으로 저장될 수 있다. 또한, 이것은 심지어 동결-해동 조건 하에 안정적으로 저장될 수 있다.
또한, "안정적으로 저장되는"은 바람직하게는 "빛에 대하여 안정적으로 저장되는"을 포함한다. "빛에 대하여 안정적으로 저장되는" 것은 저장 시작시의 핵산 분자의 80% 이상이 심지어 총 빛 노출 120만 럭스ㆍ시간 노출 후에도 분해 없이 저장되는 것을 의미한다. 이러한 저장 안정성은 D65 램프를 광원으로서 가지는 주광 형광등(조도 1580 럭스) 아래에서 4주 동안 저장 후에 조성물에서 핵산 분자의 함량이 저장 시작시의 함량과 비교하여 80% 이상인 사실으로부터 확인되거나 예측될 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 주사용수에서 시험 샘플로서 동량의 핵산 분자를 분해함으로써 수득된 용액(100%) 및 검정 커브 샘플로서 상기 용액 및 주사용수를 9:1, 8:2, 7:3 및 6:4 비율(각각 90%, 80%, 70% 및 60%)로 혼합함으로써 수득된 용액을 사용하고, 검정 커브 샘플의 10 μL 각각을 피크 영역을 측정하기 위해 HPLC에 적용시키고, 각각의 검정 커브 샘플의 측정된 값을 수평 축(X) 상의 이론적 함량(%) 및 수직 축(Y) 상의 피크 영역으로 최소 자승법(the least squares method)에 의해 회귀선(Y=ax+b)을 수득하는 도표(검정 커브)를 만들고, 동일한 조건 하에 HPLC에 의해 측정된 시험 샘플의 피크 영역을 이론적 함량(%)을 내기 위해 검정 커브에 적용시킴으로써 조성물에서 핵산 분자의 함량이 측정된다. 상기-언급된 HPLC의 측정 조건은 다음과 같다.
역-상 HPLC
측정 장치: Shimadzu Corporation에 의해 제조된 LC-10A SHIMAZU HPLC 시스템(RP-HPLC)
검출기: 자외선 흡수 분광광도계(측정 파장: 245 nm) (Shimadzu Corporation에 의해 제조됨)
컬럼: X-Bridge OST C18(2.5 μm, 4.6Х50 mm) (Shimadzu Corporation에 의해 제조됨)
컬럼 온도: 40°C
이동상 A: 50 mM TEAA (pH 7.0), 0.5% 아세토나이트릴
이동상 B: 100% 아세토나이트릴
이동상의 피드: 이동상 A 및 이동상 B의 혼합 비율은 다음과 같이 농도 구배를 조절하기 위해 변화되었다.
주사 후 시간 (분) 이동상 A (vol%) 이동상 B (vol%)
0→12 100→60 0→40
유속: 1.0 mL/분
이온 교환 HPLC
측정 장치: Shimadzu Corporation에 의해 제조된 LC-20A SHIMAZU HPLC 시스템(AEX-HPLC)
검출기: 자외선 흡수 분광광도계(측정 파장: 260 nm)
컬럼: DNAPac PA-100 (4Х250 mm)
컬럼 온도: 80°C
이동상 A: 25 mM 트리스-HCL(pH 8.0), 8 M 요소, 10% 아세토나이트릴
이동상 B: 이동상 A. 700 mM 소듐 퍼클로레이트 모노하이드레이트
이동상의 피드: 이동상 A 및 이동상 B의 혼합 비율은 다음과 같이 농도 구배를 조절하기 위해 변화되었다.
주사 후 시간 (분) 이동상 A (vol%) 이동상 B (vol%)
0→20 90→60 10→40
유속: 1.0 mL/분
1. 핵산 분자
본 발명의 조성물에서 활성 성분으로서 함유되는 핵산 분자는 다음의 뉴클레오티드 서열에 의해 나타낸다.
5'-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC-P-G-3' (서열번호 1)
(서열에서, P는 하기 화학식 (I)에 의해 나타낸 프롤린 유도체 링커임).
Figure pct00003
상기 언급된 뉴클레오티드 서열에서, 밑줄친 서열은 인간 TGF-β1 mRNA에 상보적인 뉴클레오티드 서열이고, RNA 간섭 작용을 보이기 위해 mRNA에 결합하는 TGF-β1 발현 억제성 서열이다.
본 발명의 조성물에서 함유되는 핵산 분자는 그 자체로 알려진 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, WO2013/133393, PLoS One, 2012, 7(8):e42655에 기재된 방법에 따라 생산될 수 있다.
본 발명의 조성물에서 핵산 분자의 함량은 특별히 제한되지 않는 반면에, 조성물이 약학적 조성물인 경우, 전체 약학적 조성물과 비교하여 일반적으로는 0.0001 - 60 wt%, 바람직하게는 0.001 - 15 wt%, 더욱 바람직하게는 0.01 - 1 wt%이다.
2. 완충액
본 발명의 조성물은 완충액을 함유한다. 본 발명에서, 완충액은 완충 작용을 가지는 용액(특히, 수용액)을 지칭하고, 완충제를 함유함으로써 구성된다. 본 발명에서 완충제는 수용액의 pH의 안정화제를 의미하고, 약물 제조의 분야에서 일반적으로 사용되는 것이 선택될 수 있다.
본 발명에서, 조성물에서 핵산 분자의 분해는 완충액을 사용함으로써 방지될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 완충액으로서, 조성물의 pH를 4.0 이상 및 9.0 이하로 조절하는 완충액을 들 수 있다. 조성물의 pH를 4.4 이상 및 7.4 이하로 조절하는 완충액은 바람직하고, 조성물의 pH를 4.6 이상 및 7.0 이하로 조절하는 완충액은 더 바람직하고, 조성물의 pH를 5.5 이상 및 6.5 이하로 조절하는 완충액은 더욱 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 완충제로서, 구체적으로, 아스코르브산, 마그네슘 L-아스파테이트, 소듐 설파이트, L-아르기닌, L-아르기닌 하이드로클로라이드, 벤조산, 소듐 벤조에이트, 엡실론-아미노카프론산, 암모늄 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 소듐 클로라이드, 글루코사민 클로라이드, 염산 트리에탄올아민, 묽은 염산, 시트르산, 무수 시트르산, 무수 소듐 시트레이트, 시트르산 수화물, 소듐 시트레이트 수화물, 소듐 디하이드로젠 시트레이트, 소듐 시트레이트, 디소듐 시트레이트, 트리소듐 시트레이트, 트리소듐 시트레이트 2수화물, 포타슘 시트레이트, 글리실그리신, 글루코노-σ-락톤, 글루콘산, 칼슘 글루코네이트 수화물, L-글루탐산, 모노소듐 L-글루타메이트, 크레아티닌, 클로로부탄올, 디소듐 하이드로젠 포스페이트, 소듐 디하이드로젠 포스페이트, 숙신산, 디소듐 숙시네이트 6수화물, 아세트산, 암모늄 아세테이트, 포타슘 아세테이트, 소듐 아세테이트 수화물, 디아이소프로판올아민, 디에탄올아민, 타르타르산, 소듐 L-타르트레이트, 포타슘 하이드록사이드, 소듐 하이드록사이드, 타우린, 소듐 카보네이트, 소듐 카보네이트 수화물, 소듐 하이드로젠 카보네이트, 트리아이소프로판올아민, 트리에탄올아민, 트로메탐올, 이산화탄소, 젖산, 칼슘 락테이트 수화물, 소듐 락테이트 용액, L-히스티딘, 4-(2-하이드록시에틸), 빙초산, 글루코스, 모노소듐 퓨마레이트, 소듐 프로피오네이트, 벤잘코늄 클로라이드, 방향족 탄화수소 혼합 용매, 암모늄 보레이트, 말레산, 무수 소듐 아세테이트, 무수 소듐 카보네이트, 디소듐 하이드로젠 포스페이트 무수물, 소듐 메타포스페이트, 메탄술폰산, 황산, 암모늄 설페이트 포타슘 수화물, 인산, 소듐 모노하이드로젠 포스페이트 7수화물, 트리소듐 포스페이트, 2염기 소듐 포스페이트 수화물, 디소듐 하이드로젠 포스페이트 수화물, 소듐 디하이드로젠 포스페이트 수화물, 포타슘 디하이드로젠 포스페이트, 소듐 디하이드로젠 포스페이트, 소듐 디하이드로젠 포스페이트 1수화물로부터 선택되는 하나 이상의 완충제를 들 수 있다. 이중, 시트르산 또는 이의 염 또는 이의 수화물, 또는 인산 또는 이의 염 또는 이의 수화물을 완충제로서 함유하는 완충액이 바람직하게는 사용된다.
따라서, 본 발명의 조성물을 위해 사용되는 완충액으로서, 시트르산/ 또는 인산을 함유하는 완충액를 바람직하게는 들 수 있다.
본 발명에서, 완충액은 바람직하게는 상기-언급된 완충제와 같이 예시된 산 및 이의 염, 또는 상기-언급된 완충제와 같은 예시된 산의 2 이상의 종류의 염을 함유한다. 더 바람직하게, 시트르산 및 이의 염(예를 들어, 시트르산 및 소듐 시트레이트, 시트르산 및 트리소듐 시트레이트 등)을 함유하는 완충액, 인산 및 이의 염(예를 들어, 인산 및 소듐 디하이드로젠 포스페이트 등)을 함유하는 완충액 및 포스페이트의 2종류(예를 들어, 디소듐 하이드로젠 포스페이트 및 소듐 디하이드로젠 포스페이트)을 함유하는 완충액을 들 수 있다. 특히 바람직한 것은 시트르산 및 이의 염을 함유하는 완충액 및/또는 포스페이트의 2종류를 함유하는 완충액이다.
본 발명의 조성물을 위해 사용되는 완충액의 양은 원하는 pH 범위로 조절할 수 있는 한 임의의 양이 될 수 있다. 예를 들어, 조성물에서 완충제의 함량이 하기 범위 내로 떨어지도록 하는 것은 적절히 결정될 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물에서 완충제의 함량은 전체 조성물과 비교하여, 일반적으로 0.0001 - 40 wt%, 바람직하게는 0.0005 - 20 wt%, 더욱 바람직하게는 0.001 - 10 wt%이다.
3. 다른 첨가제
본 발명의 조성물은 용매를 추가로 함유할 수 있다. 용매의 예시는 약학적으로 허용 가능한 유기 용매(예를 들어, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 글리세롤 등), 물, 주사용수, 생리 식염수, 글루코스 용액 등을 포함한다. 용매의 하나 이상의 종류가 조합되어 사용될 수 있다.
본 발명에서, 핵산 분자는 단시간에 용해될 수 있기 때문에, 핵산 분자는 바람직하게는 용매에서 미리 용해되고, 완충액과 혼합된다. 용매로서, 물은 바람직하다. 본 명세서에서, 다르게 특정되지 않는 한, "핵산 분자가 완충액에서 용해된다"는 고체로서의 핵산 분자가 완충액에서 직접적으로 용해되는 것뿐만 아니라, 상기 언급된 바와 같이, 핵산 분자가 물 등과 같은 용매에서 용해되는 것을 의미하고, 수득된 용액은 완충액과 혼합된다.
본 발명에서, 용매의 함량은 전체 조성물과 비교하여 전체 양으로서, 일반적으로 0.0001 wt% 이상 및 100 wt% 미만, 바람직하게는 0.001 wt% 이상 및 100 wt% 미만, 더욱 바람직하게는 0.005 wt% 이상 및 100 wt% 미만이다.
본 발명의 조성물은 선택적으로 등장제를 추가로 함유한다. 등장제의 예시는 글루코스, D-소르비톨, 소듐 클로라이드, 글리세롤, D-만니톨, 포타슘 클로라이드, 락티톨, 수크로스, 글루코스 등을 포함한다. 바람직한 등장제는 D-소르비톨, 소듐 클로라이드, 글리세롤, D-만니톨, 포타슘 클로라이드, 락티톨 및 수크로스이고, 더 바람직한 것은 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드 및 수크로스이다. 등장제의 하나 이상의 종류는 조합되어 사용될 수 있다.
등장제가 사용되는 경우, 본 발명의 조성물의 삼투압 비율(생리 식염수에 의해 제공된 삼투압 몰농도에 대한 본 발명의 조성물의 삼투압 몰농도의 비율)은 바람직하게는 0.6 - 1.4, 더 바람직하게는 0.8 - 1.2, 더욱 바람직하게는 1.0이다.
본 발명의 조성물이 약학적 조성물인 경우, 조성물은 예를 들어, 흡입 액체, 주입, 액체 등으로서 알려진 방법에 의해 제형화될 수 있고, 비경구 투여(예를 들어, 경비 투여, 정맥내 투여, 점적주입, 근육내 투여, 피하 투여 등)에 의해 투여될 수 있다. 또한, 적합한 제형(예를 들어, 캡슐 등)으로 경구 투여될 수 있다. 바람직한 투여 방법은 네뷸라이저(nebulizer) 사용에 의한 액적(droplet) 입자의 흡입이다.
본 발명의 약학적 조성물이 주사제인 경우, 완충액에서 핵산 분자를 용해시키고 수득된 용액을 지질 막의 구성 분자와 접촉시킴으로써 핵산 분자를 캡슐화하는 리포솜 제조로서 또한 생산될 수 있다. 리포솜 제조는 정맥내 주사, 근육내 주사 등과 같은 전신 투여를 위한 주사로서 바람직하게 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 상기-언급된 구성성분에 더하여 필요에 따라 허용 가능한 첨가제를 함유할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물이 주사제인 경우, 첨가제의 예시는 등장제(예를 들어, 글루코스, D-소르비톨, 소듐 클로라이드, 글리세롤, D-만니톨, 포타슘 클로라이드, 락티톨, 수크로스, 글루코스 등), 진정제(예를 들어, 벤질 알코올 등), 보존제(예를 들어, 메틸 벤조에이트, 파라옥시벤조에이트, 클로로부탄올, 벤틸 알코올 등) 등을 포함한다. 바람직한 첨가제는 메틸 벤조에이트, D-소르비톨, 소듐 클로라이드, 글리세롤, D-만니톨, 포타슘 클로라이드, 락티톨 및 수크로스이다. 더 바람직한 첨가제는 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드 및 수크로스이다.
본 발명의 약학적 조성물이 흡입제로서 제형화되는 경우에, 예를 들어, 물 등과 같은 용매에서 핵산 분자를 용해시킴으로써 수득되는 용액이 완충제로 첨가된 수용액과 혼합되고, 혼합액은 박테리아 제거를 위해 필터링되고, 수득된 약물 용액은 흡입제를 생산하기 위해 바이알, 앰플 등과 같은 밀봉된 용기 내로 채워진다. 예를 들어, 핵산 분자는 물과 완충제(예를 들어, 시트르산 및 이의 염, 인산 및 이의 염)를 함유한 수용액과 함께 혼합되고, 음파처리 등에 의해 용해되고, 박테리아 제거를 위해 필터링되고, 수득된 약물 용액은 흡입제를 생산하기 위해 바이알, 앰플 등과 같은 밀봉 용기 내로 채워진다. 사용되는 밀봉 용기는 일반적으로 무색이고 투명한 붕규산 유리 용기인 반면에, 글라스 내부 부분 상의 액체 접촉 부분은 석영(quartz)-유사 표면 특성을 가지는 용기가 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 활성 성분으로서 TGF-β1의 발현을 억제할 수 있는 핵산 분자를 함유하기 때문에, TGF-β1 발현의 비정상적인 촉진과 관련된 질환, 특히 폐 섬유증 및 급성 폐 손상의 치료 또는 예방을 위해 유용하다. 본 발명에서, "치료"는 질환의 개선 및 예후의 개선의 의미를 포함하고, "예방"은 발병의 방지 또는 발병의 지연의 의미를 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물의 복용량은 또한 투여의 개체의 약물 수용가능성, 투여 경로, 질환의 중증도 등에 따라 다양하다. 예를 들어, 성인에 흡입 액체로서 폐 섬유증에 대한 치료제로 투여되는 경우, 활성 성분으로서의 핵산 분자의 복용량은 약 0.001 내지 약 20 mg/kg 체중, 바람직하게는 약 0.005 내지 약 5 mg/kg 체중, 더 바람직하게는 약 0.01 내지 1 mg/kg 체중이고, 이는 1일 1회 내지 수회에 걸쳐 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 핵산 분자에 완충액을 첨가하는 단계를 포함하는 조성물에서 핵산 분자를 안정화하기 위한 방법, 또는 핵산 분자를 함유하는 안정적인 조성물의 생산 방법에 관한 것이다. 이 방법을 위해 사용되는 완충액으로서, 본 발명의 조성물의 상기 언급된 예시와 유사한 것들을 들 수 있고, 유사한 것이 바람직하다.
본 발명의 안정화/생산 방법에서 첨가되는 완충액의 양은 원하는 범위로 pH가 조절될 수 있는 한 임의의 양이 될 수 있다. 예를 들어, 완충제의 양은 하기 범위 내로 떨어지도록 적절히 결정될 수 있다. 즉, 본 발명의 안정화/생산 방법에서 첨가되는 완충제의 양은 방법에 의해 수득되는 전체 조성물과 비교하여, 일반적으로는 0.0001 - 40 wt%, 바람직하게는 0.0005 - 20 wt%, 더욱 바람직하게는 0.001 - 10 wt%이다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
제조예 1 (단일-가닥 핵산 분자의 합성)
TGF-β1의 발현 억제성 서열을 가지는 단일 가닥 핵산 분자 PK-0051은 포스포라미디트법를 기반으로 한 핵산 신시사이저 (상표 이름: ABI Expedite (등록 상표) 8909 Nucleic Acid Synthesis System, Applied Biosystems)에 의해 합성하였다. 상기 언급된 방법을 위하여, RNA 포스포라미디트 (2'-O-TBDMSi, 상표 이름, Samchully Pharm. Co., Ltd.)이 RNA 아미디트(이하, 동일함)로서 사용되었다. 상기 언급된 아미디트는 통상적인 방법에 의해 보호가 제거되었다. 합성된 RNA는 HPLC에 의해 정제하였다. 정제 후의 각 RNA는 동결-건조하였다.
링커 부분으로서, L-프롤린디아미드아미디트를 사용하였다. 밑줄친 부분은 인간 TGF-β1 유전자의 발현 억제성 서열을 나타낸다.
5'-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC-P-G-3' (서열번호 1)
(P는 하기의 화학식 (I)으로 표시되는 프롤린 유도체 링커임).
Figure pct00004
실시예 1 ( 저장 온도에 대한 pH의 영향의 평가)
핵산의 흡입을 위한 프로토타입의 PK-0051-함유 조성물의 열 안정성을 평가하였다.
1. 시험 조성물의 제조
시험 조성물 1은 다음과 같이 제조하였다.
0.04 M 염산 97.0 mL, 0.04 M 포타슘 클로라이드 50 mL 및 주사용수 53 mL를 혼합하여 0.04 M 염산-포타슘 클로라이드 완충액(pH 1.0)을 제조하였다. 완충액을 사용하여, 0.1 mg/mL PK-0051을 제조하였다.
시험 조성물 2는 다음과 같이 제조하였다.
0.04 M 인산 10 mL, 0.04 M 붕산 10 mL 및 0.04 M 아세트산 10 mL를 혼합하여 브리튼-로빈슨 완충액을 제조하였고, 혼합물은 2N NaOH로 pH 2.0으로 조절하였다. 완충액을 사용하여, 0.1 mg/mL PK-0051을 제조하였다.
시험 조성물 3 - 12는 pH가 2N NaOH로 각각의 pH로 조절되는 것을 제외하고는 시험 조성물 2와 유사한 방법에 의해 제조하였다.
시험 조성물 1: PK-0051 (0.04 M 염산-포타슘 클로라이드 완충액 (pH 1.5)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 2: PK-0051 (0.04 M 브리튼-로빈슨 완충액(Britton-Robinson buffer) (pH 2.0)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 3: PK-0051 (0.04 M 브리튼 로빈슨 완충액 (pH 3.0)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 4: PK-0051 (0.04 M 브리튼 로빈슨 완충액 (pH 4.0)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 5: PK-0051 (0.04 M 브리튼 로빈슨 완충액 (pH 5.0)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 6: PK-0051 (0.04 M 브리튼 로빈슨 완충액 (pH 6.0)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 7: PK-0051 (0.04 M 브리튼 로빈슨 완충액 (pH 7.0)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 8: PK-0051 (0.04 M 브리튼 로빈슨 완충액 (pH 8.0)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 9: PK-0051 (0.04 M 브리튼 로빈슨 완충액 (pH 9.0)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 10: PK-0051 (0.04 M 브리튼 로빈슨 완충액 (pH 10.0)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 11: PK-0051 (0.04 M 브리튼 로빈슨 완충액 (pH 11.0)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 12: PK-0051 (0.04 M 브리튼 로빈슨 완충액 (pH 12.0)), (0.1 mg/mL)
2. 평가 방법
시험 조성물 1 - 12는 이들을 각각 1 mL 함유하는 4개의 5 mL 글라스 바이알에 각각 두었고, 각각의 조성물로부터 하나의 바이알은 4°C, 25°C/60%RH, 40°C/75%RH 및 60°C에서 안정성 시험 챔버(ESPEC CORP. 에 의해 제조됨)에서 저장하였다. 시험 조성물은 각각 50 μL로 샘플링하였고 4주 동안 매주 HPLC에 의해 측정하였다. PK-0051의 함량을 계산하였고, 안정성을 저장 시작시의 함량과 비교한 함량 비율(%)의 감소를 기반으로 하여 평가하였다. 함량의 계산 방법 및 측정 방법은 하기에 나타낸다.
시험 조성물로서 주사용수에서 동량의 PK-0051을 용해시킴으로서 수득된 용액 (100%)을 사용하고, 검정 커브 샘플로서 상기 용액과 주사용수를 9:1, 8:2, 7:3 및 6:4 (각각 90%, 80%, 70% 및 60%) 비율로 혼합하여 수득된 용액을 사용하며, 피크 영역을 측정하기 위해 각각의 검정 커브 샘플 10 μL를 HPLC에 적용시키고, 각각의 검정 커브 샘플의 측정된 값을 가로 축(X) 상의 이론적 함량(%) 및 세로 축(Y) 상의 피크 영역으로 플로팅하고, 최소 자승법에 의해 회귀선(Y=aX+b)를 구하고, 동일한 조건 하에 HPLC에 의해 측정된 시험 조성물의 피크 영역을 검정 커브로 적용시켜 이론적 함량 (%)을 제시함으로써 시험 조성물에서 PK-0051의 함량을 측정하였다.
측정 방법
검정 커브 샘플 (60% - 100%) 및 시험 조성물은 하기의 측정 조건 하에 측정하였다.
검출기: 자외선 흡수 분광 광도계(측정 파장: 254 nm)
컬럼: X-Bridge OST C18 (2.5 μm, 4.6Х50 mm)
컬럼 온도: 40°C
이동상 A: 50 mM TEAA (pH 7.0), 0.5% 아세토나이트릴
이동상 B: 100% 아세토나이트릴
이동상의 피드: 이동상 A 및 이동상 B의 혼합 비율은 다음과 같이 농도 구배를 조절하기 위해 변화되었다(표 3).
주사 후 시간 (분) 이동상 A (vol%) 이동상 B (vol%)
0→12 100→60 0→40
유속: 1.0 mL/분
3. 결과
결과는 도 1 - 도 3에 나타낸다. 60°C, 4주 저장의 가장 엄격한 조건 하에 5 -7의 pH 범위 내에서 함량에 있어 분명한 감소는 측정되지 않았다.
일반적으로, 핵산은 온도에 의해 쉽게 영향을 받고, 상온 또는 그 이상에서 장시간 동안의 이의 저장은 불가능하다고 한다. 결과는 단일-가닥 핵산은 심지어 상온 또는 그 이상에서 용액의 pH를 조절함으로써 장기간 동안 저장될 수 있음을 보여주었다.
실시예 2 ( 시트레이트 완충액 및/또는 포스페이트 완충액을 사용하여 상이한 pH에서의 안정성 평가)
핵산의 흡입을 위한 프로토타입의 PK-0051-함유한 조성물의 다양한 완충액 및 각 pH에서의 안정성을 평가하였다.
1. 시험 조성물
시험 조성물 13 - 48은 다음과 같이 제조하였다.
소듐 시트레이트 0.1 M 수용액 및 시트르산 0.1 M 수용액을 혼합하여 각 pH가 pH 4.0 - 7.5로 조절되도록 하는 0.1 M 시트레이트 완충액을 제조하였다. 주사용수와 함께 제조된 2.35 mg/mL PK-0051 (2.13 mL), 주사용수(0.37 mL) 및 0.1 M 시트레이트 완충액(2.5 mL)을 각 pH에서 혼합하여, 1 mg/mL 시험 조성물 13 - 48 각각의 5 mL를 제조하였다.
시험 조성물 49 - 68은 다음과 같이 제조하였다.
소듐 시트레이트 0.1 M 수용액 및 시트르산 0.1 M 수용액을 혼합하여, 각 pH가 pH 4.0 - 7.8로 조절되도록 하는 0.1 M 시트레이트 완충액을 제조하였다. 주사용수와 함께 제조된 5.8 mg/mL PK-0051 (0.086 mL) 및 0.1 M 시트레이트 완충액 (4.914 mL)을 각 pH에서 혼합하여, 0.1 mg/mL 시험 조성물 49 - 68 각각의 5 mL를 제조하였다.
시험 조성물 69 - 108은 다음과 같이 제조하였다.
소듐 디하이드로젠 포스페이트 0.1 M 수용액 및 디소듐 하이드로젠 포스페이트 0.1 M 용액을 혼합하여, 각 pH가 pH 4.0 - 7.9로 조절되도록 하는 0.1 M 포스페이트 완충액을 제조하였다. 주사용수와 함께 제조된 1.2 mg/mL PK-0051 (0.495 mL), 주사용수 (2.505 mL) 및 0.1 M 포스페이트 완충액 (3.000 mL)을 각 pH에서 혼합하여, 0.1 mg/mL 시험 조성물 69 - 108 각각의 6 mL를 제조하였다.
시험 조성물 109 - 168은 다음과 같이 제조하였다.
소듐 시트레이트 0.1 M 수용액 및 시트르산 0.1 M 수용액을 혼합하여, 각 pH가 pH 4.0 - 7.8로 조절되도록 하는 0.1 M 시트레이트 완충액을 제조하였다. 유사하게, 소듐 디하이드로젠 포스페이트 0.1 M 수용액 및 디소듐 하이드로젠 포스페이트 0.1 M 용액을 혼합하여, 각 pH가 pH 4.0 - 7.8로 조절되도록 하는 0.1 M 시트레이트 완충액을 제조하였다. 각각 동일한 pH를 갖는 0.1 M 시트레이트 완충액 : 0.1 M 포스페이트 완충액을 8:2 (4 mL:1 mL), 5:5 (3 mL:3 mL) 및 2:8 (1 mL:4 mL)으로 혼합하여, 각각 pH 4.0 - 7.8을 가지는 0.1 M 시트레이트-포스페이트 완충액 (8:2), 0.1 M 시트레이트-포스페이트 완충액 (5:5) 및 0.1 M 시트레이트-포스페이트 완충액 (2:8)을 제조하였다.
주사용수와 함께 제조된 5.8 mg/mL PK-0051 (0.1 mL), 주사용수 (2.9 mL) 및 0.1 M 시트레이트-포스페이트 완충액 (8:2) (3.0 mL)을 각 pH에서 혼합하여, 0.1 mg/mL 시험 조성물 109 - 128 각각의 6 mL를 제조하였다. 시험 조성물 129 - 148은 0.1 M 시트레이트-포스페이트 완충액 (5:5) (3.0 mL)을 사용한 것을 제외하고는 대신에 각 pH에서 0.1 M 시트레이트-포스페이트 완충액 (8:2) (3.0 mL)을 사용하여 시험 조성물 109 - 128에서와 유사한 방법에 의해 제조하였다. 시험 조성물 149 - 168은 0.1 M 시트레이트-포스페이트 완충액 (2:8) (3.0 mL)을 사용한 것을 제외하고는 대신에 각 pH에서 0.1 M 시트레이트-포스페이트 완충액 (8:2) (3.0 mL)을 사용하여 시험 조성물 109 - 128에서와 유사한 방법에 의해 제조하였다.
1-1. 0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 4.0 - 7.5)
시험 조성물 13: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 4.0)), (1 mg/mL)
시험 조성물 14: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 4.1)), (1 mg/mL)
시험 조성물 15: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 4.2)), (1 mg/mL)
시험 조성물 16: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 4.3)), (1 mg/mL)
시험 조성물 17: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 4.4)), (1 mg/mL)
시험 조성물 18: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 4.5)), (1 mg/mL)
시험 조성물 19: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 4.6)), (1 mg/mL)
시험 조성물 20: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 4.7)), (1 mg/mL)
시험 조성물 21: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 4.8)), (1 mg/mL)
시험 조성물 22: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 4.9)), (1 mg/mL)
시험 조성물 23: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 5.0)), (1 mg/mL)
시험 조성물 24: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 5.1)), (1 mg/mL)
시험 조성물 25: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 5.2)), (1 mg/mL)
시험 조성물 26: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 5.3)), (1 mg/mL)
시험 조성물 27: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 5.4)), (1 mg/mL)
시험 조성물 28: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 5.5)), (1 mg/mL)
시험 조성물 29: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 5.6)), (1 mg/mL)
시험 조성물 30: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 5.7)), (1 mg/mL)
시험 조성물 31: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 5.8)), (1 mg/mL)
시험 조성물 32: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 5.9)), (1 mg/mL)
시험 조성물 33: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)), (1 mg/mL)
시험 조성물 34: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.1)), (1 mg/mL)
시험 조성물 35: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.2)), (1 mg/mL)
시험 조성물 36: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.3)), (1 mg/mL)
시험 조성물 37: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.4)), (1 mg/mL)
시험 조성물 38: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.5)), (1 mg/mL)
시험 조성물 39: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.6)), (1 mg/mL)
시험 조성물 40: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.7)), (1 mg/mL)
시험 조성물 41: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.8)), (1 mg/mL)
시험 조성물 42: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.9)), (1 mg/mL)
시험 조성물 43: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 7.0)), (1 mg/mL)
시험 조성물 44: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 7.1)), (1 mg/mL)
시험 조성물 45: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 7.2)), (1 mg/mL)
시험 조성물 46: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 7.3)), (1 mg/mL)
시험 조성물 47: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 7.4)), (1 mg/mL)
시험 조성물 48: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 7.5)), (1 mg/mL)
1-2. 0.1 M 시트레이트 완충액 (pH 4.0 - 7.8)
시험 조성물 49: PK-0051 (0.1 M 시트레이트 완충액 (pH 4.0)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 50: PK-0051 (0.1 M 시트레이트 완충액 (pH 4.2)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 51: PK-0051 (0.1 M 시트레이트 완충액 (pH 4.4)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 52: PK-0051 (0.1 M 시트레이트 완충액 (pH 4.6)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 53: PK-0051 (0.1 M 시트레이트 완충액 (pH 4.8)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 54: PK-0051 (0.1 M 시트레이트 완충액 (pH 5.0)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 55: PK-0051 (0.1 M 시트레이트 완충액 (pH 5.2)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 56: PK-0051 (0.1 M 시트레이트 완충액 (pH 5.4)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 57: PK-0051 (0.1 M 시트레이트 완충액 (pH 5.6)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 58: PK-0051 (0.1 M 시트레이트 완충액 (pH 5.8)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 59: PK-0051 (0.1 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 60: PK-0051 (0.1 M 시트레이트 완충액 (pH 6.2)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 61: PK-0051 (0.1 M 시트레이트 완충액 (pH 6.4)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 62: PK-0051 (0.1 M 시트레이트 완충액 (pH 6.6)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 63: PK-0051 (0.1 M 시트레이트 완충액 (pH 6.8)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 64: PK-0051 (0.1 M 시트레이트 완충액 (pH 7.0)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 65: PK-0051 (0.1 M 시트레이트 완충액 (pH 7.2)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 66: PK-0051 (0.1 M 시트레이트 완충액 (pH 7.4)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 67: PK-0051 (0.1 M 시트레이트 완충액 (pH 7.6)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 68: PK-0051 (0.1 M 시트레이트 완충액 (pH 7.8)), (0.1 mg/mL)
1-3. 0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 4.0 - 7.9)
시험 조성물 69: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 4.0)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 70: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 4.1)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 71: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 4.2)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 72: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 4.3)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 73: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 4.4)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 74: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 4.5)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 75: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 4.6)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 76: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 4.7)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 77: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 4.8)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 78: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 4.9)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 79: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 5.0)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 80: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 5.1)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 81: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 5.2)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 82: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 5.3)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 83: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 5.4)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 84: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 5.5)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 85: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 5.6)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 86: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 5.7)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 87: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 5.8)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 88: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 5.9)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 89: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 6.0)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 90: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 6.1)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 91: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 6.2)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 92: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 6.3)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 93: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 6.4)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 94: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 6.5)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 95: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 6.6)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 96: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 6.7)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 97: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 6.8)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 98: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 6.9)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 99: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 7.0)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 100: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 7.1)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 101: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 7.2)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 102: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 7.3)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 103: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 7.4)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 104: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 7.5)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 105: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 7.6)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 106: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 7.7)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 107: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 7.8)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 108: PK-0051 (0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 7.9)), (0.1 mg/mL)
1-4. 0.05 M 시트레이트 완충액: 0.05 M 포스페이트 완충액 (8:2) (pH 4.0 - 7.8)
시험 조성물 109: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (8:2)(pH 4.0)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 110: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (8:2)(pH 4.2)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 111: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (8:2)(pH 4.4)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 112: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (8:2)(pH 4.6)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 113: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (8:2)(pH 4.8)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 114: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (8:2)(pH 5.0)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 115: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (8:2)(pH 5.2)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 116: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (8:2)(pH 5.4)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 117: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (8:2)(pH 5.6)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 118: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (8:2)(pH 5.8)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 119: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (8:2)(pH 6.0)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 120: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (8:2)(pH 6.2)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 121: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (8:2)(pH 6.4)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 122: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (8:2)(pH 6.6)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 123: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (8:2)(pH 6.8)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 124: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (8:2)(pH 7.0)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 125: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (8:2)(pH 7.2)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 126: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (8:2)(pH 7.4)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 127: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (8:2)(pH 7.6)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 128: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (8:2)(pH 7.8)), (0.1 mg/mL)
1-5. 0.05 M 시트레이트 완충액: 0.05 M 포스페이트 완충액 (5:5) (pH 4.0 - 7.8)
시험 조성물 129: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (5:5)(pH 4.0)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 130: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (5:5)(pH 4.2)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 131: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (5:5)(pH 4.4)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 132: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (5:5)(pH 4.6)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 133: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (5:5)(pH 4.8)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 134: PK-005 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (5:5)(pH 5.0)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 135: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (5:5)(pH 5.2)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 136: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (5:5)(pH 5.4)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 137: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (5:5)(pH 5.6)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 138: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (5:5)(pH 5.8)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 139: PK-005 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (5:5)(pH 6.0)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 140: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (5:5)(pH 6.2)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 141: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (5:5)(pH 6.4)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 142: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (5:5)(pH 6.6)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 143: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (5:5)(pH 6.8)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 144: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (5:5)(pH 7.0)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 145: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (5:5)(pH 7.2)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 146: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (5:5)(pH 7.4)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 147: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (5:5)(pH 7.6)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 148: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (5:5)(pH 7.8)), (0.1 mg/mL)
1-6. 0.05 M 시트레이트 완충액: 0.05 M 포스페이트 완충액 (2:8) (pH 4.0 - 7.8)
시험 조성물 149: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (2:8)(pH 4.0)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 150: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (2:8)(pH 4.2)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 151: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (2:8)(pH 4.4)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 152: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (2:8)(pH 4.6)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 153: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (2:8)(pH 4.8)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 154: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (2:8)(pH 5.0)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 155: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (2:8)(pH 5.2)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 156: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (2:8)(pH 5.4)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 157: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (2:8)(pH 5.6)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 158: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (2:8)(pH 5.8)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 159: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (2:8)(pH 6.0)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 160: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (2:8)(pH 6.2)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 161: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (2:8)(pH 6.4)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 162: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (2:8)(pH 6.6)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 163: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (2:8)(pH 6.8)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 164: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (2:8)(pH 7.0)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 165: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (2:8)(pH 7.2)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 166: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (2:8)(pH 7.4)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 167: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (2:8)(pH 7.6)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 168: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액:0.05 M 포스페이트 완충액 (2:8)(pH 7.8)), (0.1 mg/mL)
2. 평가 방법
각각의 시험 조성물 13 - 168을 이들의 1 mL를 함유하는 5개의 5 mL 글라스 바이알에 두었고, 안정성 시험 챔버(ESPEC CORP. 에 의해 제조됨)에 60°C에서 저장하였다. 시험 조성물은 4주째에 HPLC에 의해 측정하였다. PK-0051의 함량을 계산하였고, 안정성은 저장 시작시의 함량과 비교하여 함량 비율 (%)의 감소에 기초하여 평가하였다. 측정 방법 및 함량의 계산 방법은 실시예 1과 유사하였다.
3. 결과
결과는 도 4 - 도 9에 나타낸다. 사용된 완충액과 관계없이, 함량은 60°C에서의 4주 저장 후에 약 pH 4.6 - 약 pH 7.4에서 80% 이상이었다.
실시예 3 ( 시트레이트 완충액에서의 안정성 및 이의 농도 평가)
핵산의 흡입을 위한 프로토타입의 PK-0051-함유 조성물의 열 안정성을 평가하였다.
1. 시험 조성물
시험 조성물 169는 다음과 같이 제조하였다.
소듐 시트레이트 0.1 M 수용액 및 시트르산 0.1 M 수용액을 혼합하여, pH 6.8에서 0.1 M 시트레이트 완충액을 제조하였다. 주사용수와 함께 제조된 20 mg/mL PK-0051 (0.1 mL), 주사용수 (9.9 mL) 및 pH 6.8에서의 0.1 M 시트레이트 완충액 (10 mL)을 혼합하여, 0.1 mg/mL 시험 조성물 169의 20 mL를 제조하였다.
시험 조성물 170은 다음과 같이 제조하였다.
소듐 시트레이트 0.1 M 수용액 및 시트르산 0.1 M 수용액을 혼합하여, pH 6.8에서 0.1 M 시트레이트 완충액을 제조하였다. 이것을 10-배 희석하여 pH 6.8에서의 0.01 M 시트레이트 완충액을 제공하였다. 주사용수와 함께 제조된 14.2 mg/mL PK-0051 (0.0704 mL), 주사용수 (4.9296 mL) 및 pH 6.8에서의 0.1 M 시트레이트 완충액 (5 mL)을 혼합하여, 0.1 mg/mL 시험 조성물 170 10 mL를 제조하였다.
시험 조성물 169: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.8)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 170: PK-0051 (0.005 M 시트레이트 완충액 (pH 6.8)), (0.1 mg/mL)
2. 평가 방법
각각의 시험 조성물 169 및 170은 이들의 1 mL를 함유하는 9개의 5 mL 글라스 바이알에 두었고, 각각의 조성물로부터의 4개의 바이알은 안정성 시험 챔버에서 40°C/75%RH 및 60°C에서 저장하였고, 각각의 조성물로부터의 하나의 바이알은 4°C에서 저장하였다. 시험 조성물은 4주 동안 매주 HPLC에 의해 측정하였다. PK-0051의 함량을 계산하였고, 안정성을 저장 시작시의 함량과 비교한 함량 비율 (%)에 있어 감소를 기초로 하여 평가하였다. 측정 방법 및 함량의 계산 방법은 실시예 1과 유사하였다.
3. 결과
결과는 도 10 및 도 11에 나타낸다. 결과는 심지어 60°C, 4 주에 0.005 M 및 0.05 M의 시트레이트 완충액 농도에서 분명한 함량 변화가 없음을 보여준다. 이로부터, 심지어 단일-가닥 핵산의 농도가 증가하는 때에 시트레이트 완충액의 농도를 조절함으로써 핵산의 안정성의 효과가 유지될 수 있음을 암시한다.
실시예 4 (PK-0051-함유 조성물 (pH 6.5)의 안정성 평가)
PK-0051-함유 조성물 (pH 6.5) 10 mg/mL 및 1 mg/mL를 제조하였고 안정성을 평가하였다.
1. 시험 조성물
PK-0051-함유 조성물 (pH 6.5) 10 mg/mL를 다음과 같이 제조하였다.
시트르산 수화물 (21.0 g)을 주사용수(1 L)에서 용해시켜, 0.1 M 시트르산 용액을 제공하였다. 유사하게, 트리소듐 시트레이트 2수화물 (29.4 g)을 주사용수(1 L)에서 용해시켜, 0.1 M 시트레이트 용액을 제공하였다. pH를 6.5로 조절하기 위해 0.1 M 시트르산 용액을 0.1 M 소듐 시트레이트 용액에 첨가하여, 0.1 M 시트레이트 완충액 (pH 6.5)을 제공하였다. 제조예 1에서 합성된 PK-0051 (10 g)을 주사용수5d00 mL)에서 용해시켰다. 0.1 M 시트레이트 완충액(pH 6.5) (500 mL)을 이것에 첨가하였고, 혼합물을 교반시켰다. 조성물을 0.22 μm 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 필터를 통해 통과시켜, 10 mg/mL PK-0051-함유 조성물(pH 6.5)을 제공하였다.
1 mg/mL PK-0051-함유 조성물(pH 6.5)은 PK-0051이 1.0 g으로 변화된 것을 제외하고는 상기-언급된 방법과 유사한 방법에 의해 제조하였다.
시험 조성물 171 및 172로서 10 mg/mL 및 1 mg/mL PK-0051-함유 조성물(pH 6.5)을 사용하여, 안정성을 평가하였다.
시험 조성물 171: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.5)), (1 mg/mL)
시험 조성물 172: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.5)), (10 mg/mL)
2. 평가 방법
각각의 시험 조성물 171 및 172은 각각이 이들의 1 mL를 함유하는 9개의 5 mL 글라스 바이알에 두었고, 각각의 조성물로부터의 4개의 바이알은 안정성 시험 챔버에 25°C/60%RH, 40°C/75%RH 및 60°C에서 저장하였고, 각각의 조성물로부터의 하나의 바이알은 4°C에서 저장하였다. 시험 조성물은 4주 동안 매주 HPLC에 의해 측정하였다. PK-0051의 함량을 계산하였고, 안정성을 저장 시작시의 함량과 비교한 함량 비율(%)에 있어 감소를 기초로 하여 평가하였다. 측정 방법은 실시예 1과 동일하다.
1 mg/mL에서 제조하기 위해 주사용수에서 PK-0051을 용해시킴으로써 수득된 용액(100%) 및 검정 커브 샘플로서 상기 용액과 주사용수를 9:1, 8:2, 7:3 및 6:4의 비율(각각 90%, 80%, 70% 및 60%)로 혼합하여 수득된 용액을 사용하고, 피크 영역을 측정하기 위해 검정 커브 샘플 각각의 10 μL를 HPLC에 적용시키고, 각각의 검정 커브 샘플의 측정된 값을 가로 축(X) 상의 이론적 함량(%) 및 세로 축(Y) 상의 피크 영역으로 플로팅하고, 최소 자승법에 의해 회귀선(Y=aX+b) (검정 곡선)를 구하고, 이론적 함량 (%)을 제시하기 위해 동일한 조건 하에 HPLC에 의해 측정된 시험 조성물의 피크 영역을 검정 커브로 적용시킴으로써 시험 조성물에서 PK-0051의 함량을 측정하였다. 시험 조성물 172에서 PK-0051의 함량을 1 μL가 HPLC를 위해 사용되었다는 것을 제외하고는 상기-언급된 방법과 유사한 방법에 의해 측정하였다.
3. 결과
결과는 도 12 및 도 13에 나타낸다. 결과는 심지어 60°C, 4 주에 분명한 함량 변화가 없음을 보여준다. 이로부터, 1 mg/mL 및 10 mg/mL PK-0051-함유 조성물(pH 6.5)은 높은 안정성을 가짐을 보여준다.
실시예 5 (PK-0051-함유 조성물(pH 6.0)의 안정성 평가)
1 mg/mL PK-0051-함유 조성물 (pH 6.0)을 제조하였고 안정성을 평가하였다.
1. 시험 조성물
시트르산 수화물(21.014 g)을 주사용수(1 L)에서 용해시켜. 0.1 M 시트르산 용액을 제공하였다. 유사하게, 트리소듐 시트레이트 2수화물(29.41 g)을 주사용수(1 L)에서 용해시켜, 0.1 M 소듐 시트레이트 용액을 제공하였다. pH를 6.0으로 조절하기 위해 0.1 M 시트르산 용액을 0.1 M 소듐 시트레이트 용액에 첨가하여, 0.1 M 시트레이트 완충액(pH 6.0)을 제공하였다. 제조예 1에서 합성된 PK-0051(347 mg)은 주사용수(5 mL)에서 용해시켰다. 주사용수(4.856 mL) 및 0.1 M 시트레이트 완충액(pH 6.0) (5 mL)을 이 용액(0.144 mL)에 첨가하였고 혼합물을 교반시켰다. 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 필터를 통과시켜, 1 mg/mL PK-0051-함유 조성물(pH 6.0)을 제공하였다.
시험 조성물 173으로서 1 mg/mL PK-0051-함유 조성물(pH 6.0)을 사용하여, 안정성을 평가하였다.
시험 조성물 173: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)), (1 mg/mL)
2. 평가 방법
시험 조성물 173을 이의 1 mL를 함유하는 5개의 5 mL 글라스 바이알에 두었고, 하나의 바이알은 4°C에서 저장하였고 4개의 바이알은 60°C에서 안정성 시험 챔버에 저장하였다. 시험 조성물은 4주 동안 매주 HPLC에 의해 측정하였다. PK-0051의 함량을 계산하였고, 저장 시작시의 함량과 비교한 함량 비율 (%)에 있어 감소를 기초로 하여 안정성을 평가하였다. 측정 방법 및 함량의 계산 방법은 실시예 1과 유사하였다.
3. 결과
결과는 도 14에 나타낸다. 결과는 심지어 60°C, 4 주에 분명한 함량 변화가 없음을 보여준다. 이로부터, 1 mg/mL PK-0051-함유 조성물(pH 6.0)은 높은 안정성을 가짐을 보여준다.
실시예 6 (폐 섬유증 자연발생적인 모델 마우스에서 폐 섬유증 억제 효과)
폐 섬유증 자연발생적인 모델 마우스(Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2012, 46(3), 397-406 and PLoS One, 2012, 7(8):e42655에 기재된 인간 TGF-β1 형질전환된 마우스, 이하, TG 마우스로 지칭함)를 사용하여, 본 발명의 조성물의 폐 섬유증 억제 효과를 확인하였다. 지표로서 폐 조직에서 하이드록시 프롤린 상당량을 사용하고 PLoS One, 2012에 기재된 방법에 따라 상기 언급된 효과를 확인하였다.
1. 시험 조성물
실시예 4에서 제조된 10 mg/mL PK-0051-함유 조성물(pH 6.5)을 0.05 M 시트레이트 완충액(pH 6.5)으로 희석하였고 시험 조성물로서 사용하였다. 희석은 시험 조성물을 투여하는 날의 TG 마우스의 체중을 기초로 하여 수행하였다.
2. 시험 조성물의 그룹화 및 투여
마이크로 CT 장치(R_mCT2, Rigaku Corporation에 의해 제조됨)를 사용하여, TG 마우스의 폐에서 섬유증을 평가하였고, 마우스들은 각각의 그룹들 중에서 폐 섬유증의 수준 및 그룹화 시점에서의 체중이 동일하도록 그룹화 되었다.
각각의 투여 그룹은 하기에 나타낸다. 각각의 투여 그룹에서 11 마리의 수컷 마우스를 사용하였다. 이소플루레인 마취 하에, 시험 조성물을 Micro Sprayer(MSA-250-M: PENNCENTURY에 의해 제조됨)을 사용하여 TG 마우스의 기관 내로 총 4회 투여 되었다.
ㆍ투여 그룹 1
0.05 M 시트레이트 완충액(pH 6.5)을 TG 마우스에 1회/1주 투여하였다.
ㆍ투여 그룹 2
시험 조성물을 5 mg/kg 체중의 TG 마우스에 1회/2주 투여하였다.
ㆍ투여 그룹 3
시험 조성물을 5 mg/kg 체중의 TG 마우스에 1회/1주 투여하였다.
3. 폐 조직의 샘플링
펜토바르비탈을 마취를 위해 TG 마우스에 복강내 투여하였고(1.22 mg/150 μL/마우스 - 1.62 mg/200 μL/마우스), 혈액 샘플을 수집하였고 균질현탁액 샘플을 위해 양쪽 폐를 분리하고 동결시켰다.
4. 폐 조직에서 hTGF-β1의 정량화
양쪽 폐는 비드 셀 디스럽터(Beads Cell Disrupter, MS-100, TOMY SEIKO CO., LTD.에 의해 제조됨)에 의해 균질현탁화되었고, 상층액 부분은 원심분리에 의해 회수하였다. 상층액에서 hTGF-β1의 농도는 인간 TGF-β1 ELISA 세트(BD에 의해 제조됨)를 사용하여 측정하였다.
5. 폐 조직에서 하이드록시 프롤린의 정량화
균질현탁화 후 양쪽 폐는 하룻밤 동안 110°C에서 인큐베이션에 의해 건조하였고 비드 셀 디스럽터를 사용하여 다시 분쇄하였다. 분쇄된 양쪽 폐에 6N HCl (1 mL)를 첨가하였고 혼합물은 하룻밤 동안 110°C에서 통풍실(draft chamber)에서 인큐베이션하였다. 이후, 혼합물을 하룻밤 동안 110°C에서 통풍실(draft chamber)에서 인큐베이션하였다. 이에 2 mL의 PBS를 첨가하였고 혼합물은 1시간 동안 60°C에서 인큐베이션하였고 하이드록시 프롤린 양을 측정하기 위한 샘플을 제공하기 위해 필터를 통과시켰다. 하이드록시 프롤린 양을 of PLoS One. 2012; 7(8):e42655의 방법에 의해 측정하였다.
6. 결과
결과는 도 15 및 도 16에 나타낸다. 도 15는 각 투여 그룹에서 TGF-β1 농도를 보여주는 그래프이고, 여기에서 수직 축은 폐 조직의 TGF-β1 농도를 보여주는 것이다. 도 16은 각 투여 그룹에서 하이드록시 프롤린 양을 보여주는 그래프이고, 여기에서 수직 축은 폐 조직에서 하이드록시 프롤린 양을 보여주는 것이다. TG 마우스/핵산 분자 용액(0.1 mg/kg) 투여 그룹 3에서, TGF-β1 농도 및 폐 조직에서 하이드록시 프롤린 양은 TG 마우스/0.05 M 시트레이트 완충액(pH 6.5) 투여 그룹 1과 비교하여 유의적으로 억제되었다.
이로부터, 본 발명에서 핵산 분자인 PK-0051은 생체 내에서 표적 TGF-β1의 발현을 억제하고 폐 섬유증을 억제함을 보여주었다.
실시예 7 (10, 20, 40 및 80 mg /mL PK-0051-함유 조성물(pH 6.0)의 안정성 평가)
10, 20, 40 및 80 mg/mL PK-0051-함유 조성물(pH 6.0)을 제조하였고, 안정성을 평가하였다.
1. 시험 조성물
시험 조성물 174는 다음과 같이 제조하였다. 시트르산 수화물(105.07 g)을 주사용수(1 L)에서 용해시켜, 0.5 M 시트르산 용액을 제공하였다. 유사하게, 트리소듐 시트레이트 2수화물 (147.05 g)을 주사용수(1 L)에서 용해시켜, 0.5 M 소듐 시트레이트 용액을 제공하였다. pH를 6.0로 조절하기 위해 0.5 M 시트르산 용액을 0.5 M 소듐 시트레이트 용액에 첨가하여, 0.5 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)을 제공하였다. PK-0051 (840 mg)을 주사용수(8 mL)에 용해시키고, 저장 용액으로서 사용하였다. 주사용수 4.02 mL 및 0.5 M 시트레이트 완충액(pH 6.0) 0.5 mL를 저장 용액의 0.48 mL에 첨가하고, 혼합물을 교반시켰고, 0.22 μm 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 필터를 통해 통과시켰다.
시험 조성물 175는 주사용수 3.55 mL 및 0.5 M 시트레이트 완충액(pH 6.0) 0.5 mL가 첨가되었고 저장 용액의 0.95 mL와 함께 혼합되었다는 것을 제외하고는, 시험 조성물 174의 제조를 위해 사용된 방법과 유사한 방법에 의해 제조하였다.
시험 조성물 176은 주사용수 2.6 mL 및 0.5 M 시트레이트 완충액(pH 6.0) 0.5 mL가 첨가되었고 저장 용액의 1.9 mL와 함께 혼합되었다는 것을 제외하고는, 시험 조성물 174의 제조를 위해 사용된 방법과 유사한 방법에 의해 제조하였다.
시험 조성물 177은 주사용수 0.69 mL 및 0.5 M 시트레이트 완충액(pH 6.0) 0.5 mL가 첨가되었고 저장 용액의 3.81 mL와 함께 혼합되었다는 것을 제외하고는, 시험 조성물 174의 제조를 위해 사용된 방법과 유사한 방법에 의해 제조하였다.
시험 조성물 174: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)), (10 mg/mL)
시험 조성물 175: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)), (20 mg/mL)
시험 조성물 176: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)), (40 mg/mL)
시험 조성물 177: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)), (80 mg/mL)
2. 평가 방법
각각의 시험 조성물 174 - 177을 이의 1 mL를 함유하는 4개의 5 mL 글라스 바이알에 두었고, 60°C에서 안정성 시험 챔버에 저장하였다. 시험 조성물은 4주 동안 매주 HPLC에 의해 측정하였다. 시험 조성물을 매주 꺼냈고 10-배 희석하였다. 시험 조성물 174 10 μL, 시험 조성물 175 5 μL, 시험 조성물 176 3 μL 및 시험조성물 177 2 μL를 HPLC에 의해 측정하였다. 측정은 4주까지 수행하였다. PK-0051의 함량을 계산하였고, 저장 시작시의 함량과 비교한 함량 비율 (%)에 있어 감소를 기초로 하여 안정성을 평가하였다. 측정 방법 및 함량의 계산 방법은 하기에 기재되어 있다.
4°C에서 따로 저장된 시험 조성물 174를 10-배 용해시킴으로써 수득된 용액(100%) 및 검정 커브 샘플로서 상기 용액과 주사용수를 9:1, 8:2, 7:3 및 6:4의 비율(각각 90%, 80%, 70% 및 60%)로 혼합하여 수득된 용액을 사용하고, 피크 영역을 측정하기 위해 검정 커브 샘플 각각의 10 μL를 HPLC에 적용시켰다. 각각의 검정 커브 샘플의 측정된 값을 가로 축(X) 상의 이론적 함량(%) 및 세로 축(Y) 상의 피크 영역으로 플로팅함으로써, 최소 자승법에 의해 회귀선(Y=aX+b) (검정 곡선)를 구하였다. 이론적 함량 (%)을 측정하기 위해 동일한 조건 하에 HPLC에 의해 측정된 시험 조성물 174의 피크 영역을 검정 커브로 적용시켰다. 시험 조성물 175의 함량은 시험 조성물 175를 사용하여 생산된 각각의 검정 커브 샘플(5 μL)을 HPLC를 위해 사용되었다는 점을 제외하고는 상기-언급된 방법과 유사한 방법에 의해 측정하였다. 시험 조성물 176의 함량은 시험 조성물 176을 사용하여 생산된 각각의 검정 커브 샘플(3 μL)을 HPLC를 위해 사용되었다는 점을 제외하고는 상기-언급된 방법과 유사한 방법에 의해 측정하였다. 시험 조성물 177의 함량은 시험 조성물 177를 사용하여 생산된 각각의 검정 커브 샘플(2 μL)을 HPLC를 위해 사용되었다는 점을 제외하고는 상기-언급된 방법과 유사한 방법에 의해 측정하였다.
측정 방법
검정 커브 샘플(60% - 100%) 및 각각의 시험 조성물을 하기 측정 조건 하에 측정하였다.
이온 교환 HPLC
측정 장치: Shimadzu Corporation에 의해 제조된, LC-20A SHIMAZU HPLC 시스템 (AEX-HPLC)
검출기: 자외선 흡수 분광광도계 (측정 파장: 260 nm)
컬럼: DNAPac PA-100 (4Х250 mm)
컬럼 온도: 80°C
이동상 A: 25 mM 트리스-HCL (pH 8.0), 8 M 요소, 10% 아세토나이트릴
이동상 B: 이동상 A, 700 mM 소듐 퍼콜레이트 1수화물
이동상의 피드: 이동상 A 및 이동상 B의 혼합 비율은 다음과 같이 농도 구배를 조절하기 위해 변화되었다(표 4).
주사 후 시간(분) 이동상 A (vol%) 이동상 B (vol%)
0→20 90→60 10→40
유속: 1.0 mL/분
3. 결과
결과는 표 5 및 도 17에 나타낸다. 4주 동안 60°C에서 저장 후, PK-0051의 함량은 PK-0051의 농도가 10 mg/mL인 경우 약 97%, 농도가 20 mg/mL인 경우 약 95%, 농도가 40 mg/mL인 경우 약 91%, 농도가 80 mg/mL인 경우 약 85%이었다. 이로부터, 농도가 증가함에 따라 저장 시작시와 비교하여 함량에 있어 감소는 증가됨을 보여주었다. 반면에, PK-0051의 농도가 10 mg/mL 또는 20 mg/mL이었을 때, 저장 시작시와 비교하여 함량에 있어 감소는 10% 미만이다. 또한, 심지어 가장 낮은 함량인 PK-0051의 농도가 80 mg/mL인 경우, 함량에 있어 감소는 약 15%이었다. 따라서, PK-0051은 60°C, 4주의 혹독한 저장 조건 하에서도 높은 안정성을 가짐을 보여주었다.
저장 기간(주) PK-0051의 함량 (%)
10 mg/mL 20 mg/mL 40 mg/mL 80 mg/mL
0 100.20 100.05 99.67 98.50
1 98.42 99.39 99.34 101.43
2 99.41 99.20 98.38 94.01
3 97.63 97.79 95.81 91.48
4 96.63 94.95 91.35 84.94
실시예 8 ( 1 mg /mL PK-0051-함유 조성물(pH 5.5, 6.0 및 6.5)의 안정성 평가(광 안정성))
각각이 PK-0051-함유 조성물로 채워진 투명한 글라스 바이알과 갈색의 글라스 바이알 및 이들이 종이 박스에 추가로 포장된 것을 사용하여, 빛에 대한 PK-0051의 안정성을 평가하였다.
1. 시험 조성물
시험 조성물 178은 다음과 같이 제조하였다. 시트르산 수화물(21.014 g)을 주사용수(1 L)에 용해시켜, 0.1 M 시트르산 용액을 제공하였다. 유사하게, 트리소듐 시트레이트 2수화물(29.41 g)을 주사용수(1 L)에 용해시켜, 0.1 M 소듐 시트레이트 용액을 제공하였다. 0.1 M 시트르산 용액을 pH를 5.5로 조절하는 0.1 M 소듐 시트레이트 용액에 첨가하여, 0.1 M 시트레이트 완충액(pH 5.5)을 제공하였다. PK-0051(210 mg)을 주사용수(10 mL)에 용해시키고 저장 용액으로서 사용하였다. 주사용수 9.5 mL 및 0.1 M 시트레이트 완충액(pH 5.5) 10.5 mL를 저장 용액 1 mL에 첨가하였고, 혼합물을 교반시키고 0.22 μm 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 필터를 통해 통과시켰다.
시험 조성물 179는 0.1 M 시트레이트 완충액(pH 6.0)을 제공하기 위해 0.1 M 시트르산 용액을 pH를 6.0으로 조절하는 0.1 M 소듐 시트레이트 용액에 첨가하였고, 주사용수 9.5 mL 및 0.1 M 시트레이트 완충액(pH 6.0) 10.5 mL을 첨가하였고, 저장 용액 1 mL와 함께 혼합하였다는 점을 제외하고는 시험 조성물 178의 제조를 위해 사용된 방법과 유사한 방법에 의해 제조하였다.
시험 조성물 180은 0.1 M 시트레이트 완충액(pH 6.5)을 제공하기 위해 0.1 M 시트르산 용액을 pH를 6.5로 조절하는 0.1 M 소듐 시트레이트 용액에 첨가하였고, 주사용수 9.5 mL 및 0.1 M 시트레이트 완충액(pH 6.5) 10.5 mL을 첨가하였고, 저장 용액 1 mL와 함께 혼합하였다는 점을 제외하고는 시험 조성물 178 의 제조를 위해 사용된 방법과 유사한 방법에 의해 제조하였다.
시험 조성물 178: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 5.5)), (1 mg/mL)
시험 조성물 179: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)), (1 mg/mL)
시험 조성물 180: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.5)), (1 mg/mL)
2. 평가 방법
각각의 시험 조성물 178 - 180을 10개의 5 mL 투명한 글라스 바이알 및 10개의 5 mL 갈색의 글라스 바이알(투명한 병 및 차광성 병(shading bottle))에 두었다. 또한, 유사하게 시험 조성물 178 - 180으로 채워진 투명한 병 및 차광성 병을 종이 박스 내로 포장하였다(투명한 병 2차 패키지 및 차광성 병 2차 패키지). 이것들은 광원으로서 D65 랩프를 사용하는 주광 형광등(조도 1580 럭스) 아래 25°C/60%RH에서, 총 빛 노출이 120만 럭스ㆍ시간에 도달할 때까지(저장 기간 32일, 총 빛 노출 1,213,743 럭스ㆍ시간), 안정성 시험 챔버에서 저장하였다. 총 빛 노출이 30만 럭스ㆍ시간, 60만 럭스ㆍ시간, 90만 럭스ㆍ시간 및 120만 럭스ㆍ시간에 도달할 때, 시험 조성물을 꺼내었고, 이들의 10 μL를 역-상 HPLC 및 이온 교환 HPLC에 의해 측정하였다. PK-0051의 함량을 계산하였고, 안정성을 저장 시작시의 함량과 비교한 함량 비율(%)에 있어 감소를 기초로 하여 평가하였다. 함량의 계산 방법 및 측정 방법은 하기에 나타낸다.
상기(투명한 병, 차광성 병, 투명한 병 2차 패키지 및 차광성 병 2차 패키지)와 유사하게 제조되고 어두운 장소, 4°C에서 저장된 시험 조성물 178(100%) 및 주사용수를 9:1, 8:2, 7:3 및 6:4 비율로 혼합하였고, 용액(90%, 80%, 70% 및 60%)은 검정 커브 샘플로서 사용하였다. 각 검정 커브 샘플(10 μL)은 역-상 HPLC 및 이온 교환 HPLC에 적용시켰고, 피크 영역을 측정하였다. 각각의 검정 커브 샘플의 측정된 값을 가로 축(X) 상의 이론적 함량(%) 및 세로 축(Y) 상의 피크 영역으로 플로팅함으로써, 최소 자승법에 의해 회귀선(Y=aX+b)을 구하였다. 이론적 함량(%)을 구하기 위해, 동일한 조건 하에 역-상 HPLC 및 이온 교환 HPLC에 의해 측정된 시험 조성물 178의 피크 영역을 검정 커브에 적용시켰다. 시험 조성물 179 및 180의 함량은 상기-언급된 방법과 유사한 방법에 의해 측정하였다.
측정 방법
검정 커브 샘플(60% - 100%) 및 각각의 시험 조성물들은 하기 측정 조건 하에 측정하였다. 이온 교환 HPLC에 의한 측정은 실시예 7과 유사한 측정 방법에 의해 수행하였다.
역-상 HPLC
측정 도구: Shimadzu Corporation에 의해 제조된, LC-10A SHIMAZU HPLC 시스템 (RP-HPLC)
검출기: 자외선 흡수 분광광도계 (측정 파장: 260 nm)
컬럼: X-Bridge OST C18 (2.5 μm, 4.6Х50 mm)
컬럼 온도: 40°C
이동상 A: 50 mM TEAA (pH 7.0), 0.5% 아세토나이트릴
이동상 B: 100% 아세토나이트릴
이동상의 피드: 이동상 A 및 이동상 B의 혼합 비율은 다음과 같이 농도 구배를 조절하기 위해 변화되었다(표 6).
주사 후 시간 (분) 이동상 A (vol%) 이동상 B (vol%)
0→12 100→60 0→40
유속: 1.0 mL/분
3. 결과
결과는 표 7 - 9 및 도 18 - 23에 나타낸다. 모든 시험 조성물은 역-상 HPLC 또는 이온 교환 HPLC에 의한 측정에 의한 함량에 있어 뚜렷한 변화를 나타내지 않고 빛에 안정적임을 명확하게 밝혔다. 이러한 결과로부터, 본 발명의 조성물은 심지어 생산부터 사용까지의 기간 동안 120만 럭스ㆍ시간의 양의 빛에 노출된 경우에도 빛에 의한 제조의 품질의 감소가 없으며, 비-노출된 생산물과 동일한 방식으로 다룰 수 있다고 간주된다. 또한, 가격이 저렴한 투명한 글라스 바이알이 갈색의 글라스 바이알 대신에 사용될 수 있다.
0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 5.5)에서 PK-0051의 광안정성 시험
샘플 이름 럭스ㆍ시간 PK-0051의 함량 (%)
이온 교환 HPLC 역-상 HPLC
투명한 병, 4°C에서 어두운 장소 0 101.55 99.13
투명한 병
0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 5.5)		 30 101.10 100.95
60 100.85 99.50
90 100.28 96.83
120 99.73 98.70
투명한 병 제2의 패키지
0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 5.5)		 30 102.32 99.92
60 102.30 100.77
90 101.86 99.13
120 102.76 99.68
차광성 병
0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 5.5)		 30 101.99 100.38
60 101.79 100.26
90 101.61 100.03
120 102.23 100.60
차광성 병 제2의 패키지
0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 5.5)		 30 101.79 100.35
60 101.87 100.52
90 102.43 99.70
120 102.20 99.12
0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)에서 PK-0051의 광안정성 시험
샘플 이름 럭스ㆍ시간 PK-0051의 함량 (%)
이온 교환 HPLC 역-상 HPLC
투명한 병, 4°C에서 어두운 장소 0 102.83 98.35
투명한 병
0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)		 30 102.24 98.83
60 101.65 97.75
90 100.57 98.09
120 102.62 97.93
투명한 병 제2의 패키지
0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)		 30 102.41 98.21
60 102.35 99.07
90 103.23 98.07
120 103.00 99.18
차광성 병
0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)		 30 102.46 98.44
60 102.17 98.60
90 102.94 97.98
120 104.15 99.33
차광성 병 제2의 패키지
0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)		 30 103.70 98.52
60 102.12 98.68
90 103.16 98.83
120 104.11 98.65
0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.5)에서 PK-0051의 광안정성 시험
샘플 이름 럭스ㆍ시간 PK-0051의 함량 (%)
이온 교환 HPLC 역-상 HPLC
투명한 병, 4°C에서 어두운 장소 0 102.41 98.20
투명한 병
0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.5)		 30 102.57 98.53
60 102.12 98.77
90 103.14 97.82
120 101.23 98.71
투명한 병 제2의 패키지
0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.5)		 30 102.15 98.26
60 101.71 98.92
90 102.85 98.00
120 102.54 98.20
차광성 병
0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.5)		 30 101.83 99.63
60 103.21 98.62
90 103.97 99.12
120 102.73 98.74
차광성 병 제2의 패키지
0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.5)		 30 103.23 98.33
60 103.04 98.36
90 102.43 98.85
120 101.85 98.37
실시예 9 ( 등장제에 의해 조절되는 삼투압 비율로 PK-0051-함유 조성물의 안정성 평가)
다양한 등장제(NaCl, KCl, 글리세롤, D-만니톨, 락티톨, D-소르비톨 및 수크로스)를 사용하여, PK-0051-함유 조성물의 삼투압의 비율을 1±0.1으로 조절하였고 안정성을 평가하였다.
1. 시험 조성물
시험 조성물 181은 다음과 같이 제조하였다. 시트르산 수화물(105.07 g)을 주사용수(1 L)에 용해시켜. 0.5 M 시트르산 용액을 제공하였다. 유사하게, 트리소듐 시트레이트 2수화물(147.05 g)을 주사용수(1 L)에 용해시켜, 0.5 M 소듐 시트레이트 용액을 제공하였다. 0.5 M 시트르산 용액을 pH를 6.0으로 조절하는 0.5 M 소듐 시트레이트 용액에 첨가하여, 0.5 M 시트레이트 완충액(pH 6.0)을 제공하였다. NaCl 0.1g을 주사용수 10 mL에 용해시켜, 10% 용액을 제공하였다. PK-0051(210 mg)를 주사용수(140 mL)에 용해시키고 저장 용액으로서 사용하였다. NaCl 10% 용액 0.68 mL, 주사용수 11.82 mL 및 0.5 M 시트레이트 완충액(pH 6.0) 1.5 mL을 저장 용액 1 mL에 첨가하였고, 혼합물을 교반시키고 0.22 μm 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 필터를 통해 통과시켰다.
시험 조성물 182는 KCl이 NaCl 대신에 사용되었고, KCl 10% 용액 0.85 mL, 주사용수 11.65 mL 및 0.5 M 시트레이트 완충액(pH 6.0) 1.5 mL를 첨가하였고 저장 용액 1 mL와 혼합시켰다는 점을 제외하고는 시험 조성물 181의 제조를 위해 사용된 방법과 유사한 방법에 의해 제조하였다.
시험 조성물 183은 글리세롤이 NaCl 대신에 사용되었고, 글리세롤 10% 용액 1.8 mL, 주사용수 10.7 mL 및 0.5 M 시트레이트 완충액(pH 6.0) 1.5 mL을 첨가하였고 저장 용액 1 mL와 혼합시켰다는 점을 제외하고는 시험 조성물 181의 제조를 위해 사용된 방법과 유사한 방법에 의해 제조하였다.
시험 조성물 184는 D-만니톨이 NaCl 대신에 사용되었고, D-만니톨 10% 용액 3.75 mL, 주사용수 8.75 mL 및 0.5 M 시트레이트 완충액(pH 6.0) 1.5 mL를 첨가하였고 저장 용액 1 mL와 혼합시켰다는 점을 제외하고는 시험 조성물 181의 제조를 위해 사용된 방법과 유사한 방법에 의해 제조하였다.
시험 조성물 185는 락티톨이 NaCl 대신에 사용되었고, 락티톨 10% 용액 7.05 mL, 주사용수 5.45 mL 및 0.5 M 시트레이트 완충액(pH 6.0) 1.5 mL를 첨가하였고 저장 용액 1 mL와 혼합시켰다는 점을 제외하고는 시험 조성물 181의 제조를 위해 사용된 방법과 유사한 방법에 의해 제조하였다.
시험 조성물 186은 D-소르비톨이 NaCl 대신에 사용되었고, D-소르비톨 10% 용액 3.75 mL, 주사용수 8.75 mL 및 0.5 M 시트레이트 완충액(pH 6.0) 1.5 mL를 첨가하였고 저장 용액 1 mL와 혼합시켰다는 점을 제외하고는 시험 조성물 181의 제조를 위해 사용된 방법과 유사한 방법에 의해 제조하였다.
시험 조성물 187는 수크로스가 NaCl 대신에 사용되었고, 수크로스 10% 용액 7 mL, 주사용수 5.5 mL 및 0.5 M 시트레이트 완충액(pH 6.0) 1.5 mL를 첨가하였고 저장 용액 1 mL와 혼합시켰다는 점을 제외하고는 시험 조성물 181의 제조를 위해 사용된 방법과 유사한 방법에 의해 제조하였다.
시험 조성물 188은 주사용수 12.5 mL 및 0.5 M 시트레이트 완충액(pH 6.0) 1.5 mL를 첨가하였고 저장 용액 1 mL와 혼합시켰다는 점을 제외하고는 시험 조성물 181의 제조를 위해 사용된 방법과 유사한 방법에 의해 제조하였다.
시험 조성물 189는 주사용수 12.65 mL 및 NaCl 10% 용액 1.35 mL를 첨가하였고 저장 용액 1 mL와 혼합시켰다는 점을 제외하고는 시험 조성물 181의 제조를 위해 사용된 방법과 유사한 방법에 의해 제조하였다.
시험 조성물 181: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)/NaCl (1의 삼투압 비율)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 182: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)/KCl (1의 삼투압 비율)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 183: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)/글리세롤 (1의 삼투압 비율)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 184: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)/D-만니톨 (1의 삼투압 비율)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 185: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)/락티톨 (1의 삼투압 비율)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 186: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)/D-소르비톨 (1의 삼투압 비율)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 187: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)/수크로스 (1의 삼투압 비율)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 188: PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)), (0.1 mg/mL)
시험 조성물 189: PK-0051 (NaCl (1의 삼투압 비율)), (0.1 mg/mL)
2. 평가 방법
각각의 시험 조성물 181 - 189는 이들의 1 mL를 함유하는 14개의 5 mL 글라스 바이알에 두었고, 25°C/60%RH, 40°C/75%RH 및 60°C에서 안정성 시험 챔버에 저장하였다. 1주 및 2주 후, 각각의 시험 조성물(30 μL)을 역-상 HPLC 및 이온 교환 HPLC에 의해 측정하였다.
시험 조성물 181 - 189은 4주 동안 60°C에서 저장에 상응하는 조건(5분 및 15분 동안 105°C 및 121°C) 하의 가속 시험을 받는다. 각각의 시험 조성물 181 - 189는 5분 동안 105°C, 15분 동안 105°C, 5분 동안 121°C, 15분 동안 121°C의 4개의 조건 하에 오토클레이브 처리를 받았고, 역-상 HPLC 및 이온 교환 HPLC에 의해 측정하였다.
HPLC에 의한 측정 후, PK-0051의 함량을 계산하였고, 안정성을 저장 시작시 함량과 비교한 함량 비율(%)에 있어 감소를 기초로 하여 평가하였다. ?량의 계산 방법 및 측정 방법은 하기에 나타낸다.
시험 조성물 188(100%) 및 주사용수를 9:1, 8:2, 7:3 및 6:4에서 혼합함으로써 수득된 각각의 용액(90%, 80%, 70% 및 60%)을 검정 커브 샘플로서 사용하였고, 피크 영역을 측정하기 위해 검정 커브 샘플의 각 30 μL를 HPLC에 적용시켰고, 각각의 검정 커브 샘플의 측정된 값을 수평 축(X) 상의 이론적 함량(%) 및 수직 축(Y) 상의 피크 영역으로 플로팅하였고, 최소 자승법(the least squares method)에 의해 회귀선(Y=ax+b) (검정 커브)을 구하였고, 동일한 조건 하에 HPLC에 의해 측정된 시험 조성물의 피크 영역을 검정 커브에 적용시켰다, 이로써 이론적 함량(%)을 구하였다.
측정 방법
검정 커브 샘플(60% - 100%) 및 시험 조성물을 하기 측정 조건 하에 측정하였다. 이온 교환 HPLC에 의한 측정은 실시예 7과 유사한 측정 방법에 의해 수행하였다. 역-상 HPLC에 의한 측정은 50 mM TEAA(pH 7.3)을 이동상 A로서 사용하였고 측정 파장이 254 nm이었다는 점을 제외하고는 실시예 8과 유사한 측정 방법에 의해 수행하였다.
3. 결과
결과는 표 10 -18에 나타낸다. 시험 조성물 181 - 188은 2주 동안 25°C, 40°C 또는 60°C에서 저장 후 PK-0051의 함량에 있어 뚜렷한 감소를 나타내지 않았다. 시험 조성물 181 - 188은 높은 안정성을 나타내며, 오토클레이브 처리(5분 및 15분 동안 105°C 및 121°C)에 의해 PK-0051의 함량에 있어 약 15% 내의 감소를 보였다. 반면에, 시험 조성물 189는 2주 동안 25°C, 40°C 또는 60°C에서 저장 후 PK-0051의 함량에 있어 뚜렷한 감소를 나타내지 않았다; 그러나, 오토클레이브 처리(5분 및 15분 동안 121°C)에 의한 PK-0051의 함량에 있어 감소는 두드러지게 발견되었다(5분 동안 121°C에 의해 약 24% 감소, 15분 동안 121°C에 의해 약 41% 감소). 0.05 M 시트레이트 완충액(pH 6.0)의 부재에서 NaCl의 영향에 의해 안정성이 감소함을 또한 명확히 하였다. 상기 결과는 등장제는 0.05 M 시트레이트 완충액(pH 6.0)에서 PK-0051의 안정성을 감소시키지 않음을 명확히 하였다.
0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)/NaCl (1의 삼투압 비율)에서 PK-0051의 열 안정성
샘플 이름 저장 온도 또는 오토클레이브 처리 온도 저장 기간 PK-0051의 함량 (%)
역-상 HPLC 이온 교환 HPLC
시험 조성물 181

PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)/NaCl (1의 삼투압 비율)), (0.1 mg/mL)		 25°C 시작시 101.70 103.70
1 주 102.08 101.15
2 주 102.73 101.45
40°C 시작시 101.70 103.70
1 주 102.37 101.19
2 주 101.32 101.02
60°C 시작시 101.70 103.70
1 주 102.36 100.99
2 주 101.39 98.83
오토클레이브
105°C		 시작시 101.70 103.70
5 분 99.43 101.67
15 분 98.06 97.32
오토클레이브
121°C		 시작시 101.70 103.70
5 분 95.16 96.58
15 분 90.00 86.90
0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)/KCl (1의 삼투압 비율)에서 PK-0051의 열 안정성
샘플 이름 저장 온도 또는 오토클레이브 처리 온도 저장 기간 PK-0051의 함량 (%)
역-상 HPLC 이온 교환 HPLC
시험 조성물 182

PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)/KCl (1의 삼투압 비율)), (0.1 mg/mL)		 25°C 시작시 101.05 102.22
1 주 101.41 98.79
2 주 102.24 100.44
40°C 시작시 101.05 102.22
1 주 101.70 100.47
2 주 102.07 99.52
60°C 시작시 101.05 102.22
1 주 101.46 100.02
2 주 100.94 98.44
오토클레이브
105°C		 시작시 101.05 102.22
5 분 99.65 99.94
15 분 97.27 96.70
오토클레이브
121°C		 시작시 101.05 102.22
5 분 95.44 95.16
15 분 88.63 85.79
0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)/글리세롤 (1의 삼투압 비율)에서 PK-0051의 열 안정성
샘플 이름 저장 온도 또는 오토클레이브 처리 온도 저장 기간 PK-0051의 함량 (%)
역-상 HPLC 이온 교환 HPLC
시험 조성물 183

PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)/글리세롤 (1의 삼투압 비율)), (0.1 mg/mL)		 25°C 시작시 101.27 102.24
1 주 101.73 101.23
2 주 102.55 97.82
40°C 시작시 101.27 102.24
1 주 101.52 101.35
2 주 102.98 102.18
60°C 시작시 101.27 102.24
1 주 102.09 99.25
2 주 100.87 99.72
오토클레이브
105°C		 시작시 101.27 102.24
5 분 100.22 100.87
15 분 98.78 97.78
오토클레이브
121°C		 시작시 101.27 102.24
5 분 95.17 95.77
15 분 91.04 86.41
0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)/D-만니톨 (1의 삼투압 비율)에서 PK-0051의 열 안정성
샘플 이름 저장 온도 또는 오토클레이브 처리 온도 저장 기간 PK-0051의 함량 (%)
역-상 HPLC 이온 교환 HPLC
시험 조성물 184

PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)/D-만니톨 (1의 삼투압 비율)), (0.1 mg/mL)		 25°C 시작시 101.86 102.32
1 주 102.42 101.18
2 주 102.59 98.52
40°C 시작시 101.86 102.32
1 주 102.40 101.57
2 주 102.85 100.76
60°C 시작시 101.86 102.32
1 주 102.00 101.13
2 주 101.20 100.12
오토클레이브
105°C		 시작시 101.86 102.32
5 분 100.35 100.79
15 분 98.86 97.25
오토클레이브
121°C		 시작시 101.86 102.32
5 분 95.58 95.85
15 분 90.14 86.95
0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)/락티톨 (1의 삼투압 비율)에서 PK-0051의 열 안정성
샘플 이름 저장 온도 또는오토클레이브 처리 온도 저장 기간 PK-0051의 함량 (%)
역-상 HPLC 이온 교환 HPLC
시험 조성물 185

PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)/락티톨 (1의 삼투압 비율)), (0.1 mg/mL)		 25°C 시작시 102.18 102.70
1 주 102.37 101.06
2 주 101.12 102.50
40°C 시작시 102.18 102.70
1 주 103.15 101.60
2 주 101.84 101.04
60°C 시작시 102.18 102.70
1 주 102.63 101.45
2 주 101.62 100.04
오토클레이브
105°C		 시작시 102.18 102.70
5 분 100.15 100.79
15 분 99.01 98.17
오토클레이브
121°C		 시작시 102.18 102.70
5 분 95.54 96.00
15 분 90.80 87.74
0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)/D-소르비톨 (1의 삼투압 비율)에서 PK-0051의 열 안정성
샘플 이름 저장 온도 또는 오토클레이브 처리 온도 저장 기간 PK-0051의 함량 (%)
역-상 HPLC 이온 교환 HPLC
시험 조성물 186

PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)/D-소르비톨 (1의 삼투압 비율)), (0.1 mg/mL)		 25°C 시작시 101.42 102.53
1 주 101.93 100.91
2 주 102.21 99.73
40°C 시작시 101.42 102.53
1 주 102.16 101.24
2 주 101.99 102.88
60°C 시작시 101.42 102.53
1 주 102.01 100.98
2 주 100.04 99.18
오토클레이브
105°C		 시작시 101.42 102.53
5 분 99.66 100.91
15 분 98.05 96.94
오토클레이브
121°C		 시작시 101.42 102.53
5 분 95.35 94.84
15 분 90.10 85.32
0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)/수크로스 (1의 삼투압 비율)에서 PK-0051의 열 안정성
샘플 이름 저장 온도 또는오토클레이브 처리 온도 저장 기간 PK-0051의 함량 (%)
역-상 HPLC 이온 교환 HPLC
시험 조성물 187

PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)/수크로스 (1의 삼투압 비율)), (0.1 mg/mL)		 25°C 시작시 102.10 103.37
1 주 102.49 101.67
2 주 101.15 102.00
40°C 시작시 102.10 103.37
1 주 102.60 99.59
2 주 102.90 101.39
60°C 시작시 102.10 103.37
1 주 102.56 103.63
2 주 101.52 101.59
오토클레이브
105°C		 시작시 102.10 103.37
5 분 100.44 101.87
15 분 99.24 96.84
오토클레이브
121°C		 시작시 102.10 103.37
5 분 95.52 95.98
15 분 90.15 87.35
0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)에서 PK-0051의 열 안정성
샘플 이름 저장 온도 또는 오토클레이브 처리 온도 저장 기간 PK-0051의 함량 (%)
역-상 HPLC 이온 교환 HPLC
시험 조성물 188

PK-0051 (0.05 M 시트레이트 완충액 (pH 6.0)), (0.1 mg/mL)		 25°C 시작시 101.72 100.97
1 주 102.32 101.09
2 주 102.98 103.16
40°C 시작시 101.72 103.27
1 주 102.37 101.54
2 주 102.67 101.55
60°C 시작시 101.72 103.27
1 주 102.45 103.33
2 주 102.07 101.72
오토클레이브
105°C		 시작시 101.72 103.27
5 분 100.51 100.92
15 분 99.04 97.67
오토클레이브
121°C		 시작시 101.72 103.27
5 분 95.83 98.21
15 분 89.65 87.45
NaCl (1의 삼투압 비율)에서 PK-0051의 열 안정성
샘플 이름 저장 온도 또는 오토클레이브 처리 온도 저장 기간 PK-0051의 함량 (%)
역-상 HPLC 이온 교환 HPLC
시험 조성물 189

PK-0051(NaCl (1의 삼투압 비율)), (0.1 mg/mL)		 25°C 시작시 101.19 102.38
1 주 101.13 100.86
2 주 101.98 101.07
40°C 시작시 101.19 102.38
1 주 101.71 101.30
2 주 101.89 100.17
60°C 시작시 101.19 102.38
1 주 99.57 100.41
2 주 95.09 91.67
오토클레이브
105°C		 시작시 101.19 102.38
5 분 95.59 96.12
15 분 93.82 94.94
오토클레이브
121°C		 시작시 101.19 102.38
5 분 78.25 75.92
15 분 62.71 58.85
[산업상 이용가능성]
본 발명에 따르면, TGF-β1의 발현을 억제할 수 있는 단일-가닥 핵산 분자 PK-0051은 장기간 동안 상온에서 용액 상태로 안정적으로 저장될 수 있다. 따라서, 본 발명은 사용시 재용해에 의한 제조를 필요로 하지 않고, 취급에 있어 우수한, 편리하게 저장되고 운반될 수 있는 핵산 약학적 조성물을 제공한다는 점에서 매우 유용하다.
본 출원은 일본에서 출원된 특허출원 제2015-215207호(출원일: 2015년 10월 30일)에 기초하며, 그 내용은 본 명세서에 모두 포함된다.
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Claims (19)

  1. 5'-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC-P-G-3'(서열번호 1) (서열에서, P는 하기의 화학식 (I)으로 표시되는 프롤린 유도체 링커임)에 의해 나타낸 뉴클레오티드 서열 및 완충액으로 이루어지고, 다음의 특징을 가진 단일-가닥 핵산 분자를 포함하는 조성물:
    Figure pct00005

    (a) 상온에서 용액의 형태로 존재하는 것; 및
    (b) 25°C, 상대 습도 60%에서, 4주 동안의 저장 후에 핵산 분자의 함량이 저장 시작시의 함량과 비교하여 80% 이상인 것.
  2. 제1항에 있어서, 40°C, 상대습도 75%에서 4주 동안의 저장 후에 핵산 분자의 함량이 저장 시작시의 함량과 비교하여 80% 이상인 것인, 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 60°C에서 4주 동안의 저장 후에 핵산 분자의 함량이 저장 시작시의 함량과 비교하여 60% 이상인 것인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 총 빛 노출 120만 럭스ㆍ시간 노출된 핵산 분자의 함량이 저장 시작시의 함량과 비교하여 80% 이상인 것인, 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 상기 완충액은 4.0 이상 및 9.0 이하로 조성물의 pH를 조절하는 것인, 조성물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 상기 완충액은 4.4 이상 및 7.4 이하로 조성물의 pH를 조절하는 것인, 조성물.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 상기 완충액은 4.6 이상 및 7.0 이하로 조성물의 pH를 조절하는 것인, 조성물.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 상기 완충액은 5.5 이상 및 6.5 이하로 조성물의 pH를 조절하는 것인, 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 있어서, 상기 완충액은 소듐 하이드로젠 포스페이트, 소듐 디하드로젠 포스페이트, 디소듐 하이드로젠 포스페이트, 소듐 클로라이드, 아르지닌 하이드로클로라이드, 소듐 시트레이트, 트리소듐 시트레이트 디하이드레이트, 모노소듐 L-글루타메이트, 소듐 아세테이트, 소듐 카보네이트, 소듐 하이드로젠 카보네이트, 소듐 락테이트, 모노포타슘 포스페이트, 소듐 하이드록사이드, 메글루민, 글리신, 시트르산 및 아세트산으로부터 선택되는 하나 이상의 완충제를 포함하는 것인, 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한항에 있어서, 상기 완충액은 시트르산 및/또는 인산을 포함하는 것인, 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한항에 있어서, 등장제(isotonicity agent)를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 등장제는 D-소르비톨, 소듐 클로라이드, 글리세롤, D-만니톨, 포타슘 클로라이드, 락티톨 및 수크로스로부터 하나 이상으로 선택되는 것인, 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한항에 있어서, 상기 조성물은 폐 섬유증 또는 급성 폐 손상의 예방 또는 치료를 위한 것인, 조성물.
  14. 조성물의 pH를 5.5 이상 및 6.5 이하로 조절하는 완충액에서 상기 언급된 핵산 분자를 용해시키는 단계 및 상온에서 용액을 저장하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제13항 중 어느 한항에 따른 조성물을 생산하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 완충액은 시트르산 및/또는 인산을 포함하는 것인, 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 조성물은 폐 섬유증 또는 급성 폐 손상의 예방 또는 치료를 위한 것인, 방법.
  17. 조성물의 pH를 5.5 이상 및 6.5 이하로 조절하는 완충액에서 핵산 분자를 용해시키는 단계 및 상온에서 용액을 저장하는 단계를 포함하는, 조성물에서 핵산 분자를 안정화하기 위한 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 완충액은 시트르산 및/또는 인산을 포함하는 것인, 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 용액은 폐 섬유증 또는 급성 폐 손상의 예방 또는 치료를 위한 조성물인 것인, 방법.
KR1020187015234A 2015-10-30 2016-10-28 TGF-β1 유전자의 발현을 억제하는 단일-가닥 핵산 분자를 안정적으로 함유하는 조성물 KR102099711B1 (ko)

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