KR20200136363A - 헤어핀형 1개쇄 rna 분자의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 표적 유전자의 발현을 억제하는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 제조 방법으로서, (i)제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 어닐링하는 어닐링 공정과, (ii)상기 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 3' 말단과 상기 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 5' 말단을 Rnl2 패밀리의 리가제에 의해 라이게이션하는 라이게이션 공정을 포함하고, 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 라이게이션에 의해 생성되는 서열은 상기 표적 유전자에 대한 유전자 발현 억제 서열을 포함하는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 제조 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 제조 방법에 관한 것이다.
유전자 발현을 억제하는 기술로서, 예를 들면, RNA 간섭(RNAi)이 알려져 있다(비특허문헌 1). RNA 간섭에 의한 유전자 발현 억제에는 siRNA(small interfering RNA)라고 불리는 짧은 2개쇄의 RNA 분자를 사용하는 방법이 많이 이용되고 있다. 또한 분자내 어닐에 의해, 부분적으로 2중쇄를 형성한 환상 RNA 분자를 사용한 유전자 발현 억제 기술도 보고되고 있다(특허문헌 1).
그러나, siRNA는 in vivo에서의 안정성이 낮고, 1개쇄 RNA로 해리되기 쉽기 때문에, 유전자 발현을 안정적으로 억제하는 것이 곤란하다. 특허문헌 2는 siRNA의 센스쇄와 안티센스쇄를 환상 아민 유도체를 이용하여 형성되는 1개 또는 2개의 링커를 이용하여 1개쇄에 연결한 헤어핀형 1개쇄 장쇄 RNA 분자가 siRNA를 안정화할 수 있는 것을 보고하고 있다. 그러나 이 1개쇄 장쇄 RNA 분자는 TBDMS 아미다이트 등의 범용형 아미다이트를 사용한 포스포로아미다이트법으로는 효율적으로 합성할 수 없으므로, 그 합성에는 특별한 RNA 아미다이트(예를 들면 특허문헌 2 및 3)를 사용할 필요가 있다.
특허문헌 4는 제 3 핵산쇄로서의 보조 핵산과 T4 RNA 리가제 2를 이용하여, 제 1 핵산쇄와 제 2 핵산쇄를 라이게이션하는 방법을 개시하고 있지만, 보조 핵산이 길수록 반응이 느린 것을 나타내고 있고, 그 방법에 있어서 양호한 라이게이션 효율을 초래하는 보조 핵산은 한정되어 있다.
Fire et al., Nature, (1998) Feb 19;391(6669):806-811
본 발명은 표기 유전자의 발현을 억제하는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 효율적인 제조 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토를 거듭한 결과, 표적 유전자에 대한 발현 억제 서열을 포함하는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자를 비뉴클레오티드성 링커나 뉴클레오티드성 링커 등의 링커를 갖는 2개의 1개쇄 올리고 RNA 분자로 분할해서 합성하고, 이들을 어닐링하고, 라이게이션함으로써, 특별한 RNA 아미다이트나 보조 핵산을 필요로 하지 않고, 당해 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자를 효율적으로 제조할 수 있는 것, 또한 라이게이션 조건을 조절함으로써, 효소 사용량에 대한 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 생산 효율을 더욱 증가시킬 수 있는 것을 찾아내어 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하를 포함한다.
[1]표적 유전자의 발현을 억제하는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 제조 방법으로서,
제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 어닐링하는 어닐링 공정과,
상기 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 3' 말단과 상기 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 5' 말단을 Rnl2 패밀리의 리가제에 의해 라이게이션하는 라이게이션 공정을 포함하고,
상기 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자는 제 1 링커를 통해 연결된 제 1 RNA 부분과 제 2 RNA 부분을 포함하고, 제 1 RNA 부분과 제 2 RNA 부분의 한쪽은 다른쪽에 대해서 상보적으로 결합 가능하며,
상기 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자는 제 2 링커를 통해 연결된 제 3 RNA 부분과 제 4 RNA 부분을 포함하고, 제 3 RNA 부분과 제 4 RNA 부분의 한쪽은 다른쪽에 대해서 상보적으로 결합 가능하며,
상기 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 상기 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자는 5' 말단 또는 3' 말단의 상보적인 서열간에서 분자간 2중쇄를 형성 가능하며,
어닐링 공정에 있어서 상기 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 상기 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자가 2중쇄를 형성할 때, 상기 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 3' 말단의 리보뉴클레오티드 잔기와 상기 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 5' 말단의 리보뉴클레오티드 잔기는 닉을 생성하고, 또 상기 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 5' 말단의 리보뉴클레오티드 잔기와 상기 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 3' 말단의 리보뉴클레오티드 잔기 사이에는 1개 이상의 리보뉴클레오티드 잔기의 갭이 존재하고,
상기 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 상기 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 라이게이션에 의해 생성되는 서열은 상기 표적 유전자에 대한 유전자 발현 억제 서열을 포함하는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 제조 방법.
[2]상기 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자는 하기 식(I)로 나타내어지고, 상기 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자는 하기 식(II)로 나타내어지고,
5'-Xs-Lx1-Xa-3'···식(I)
5'-Ya1-Ya2-Ya3-Lx2-Ys-3'···식(II)
식(I) 및 식(II) 중, Xs, Xa, Ya1, Ya2, Ya3 및 Ys는 1개 또는 그 이상의 리보뉴클레오티드 잔기를 나타내고,
Lx1 및 Lx2는 각각 제 1 링커 및 제 2 링커를 나타내고,
Ya3은 Ys와 상보적이며,
라이게이션 공정에서 생기는 Xa-Ya1은 Xs와 상보적이며,
라이게이션 공정에서 생기는 Xa-Ya1-Ya2-Ya3은 상기 표적 유전자에 대한 유전자 발현 억제 서열을 포함하는 상기 [1]에 기재된 제조 방법.
[3]상기 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자가 3' 말단에 우라실(U) 또는 아데닌(A)을 갖고, 상기 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자가 5' 말단에 우라실(U) 또는 아데닌(A)을 갖는 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 제조 방법.
[4]제 1 링커 및 제 2 링커는 각각 독립적으로 (i)피롤리딘 골격 및 피페리딘 골격 중 적어도 한쪽을 포함하는 비뉴클레오티드성 링커, 또는 (ii)뉴클레오티드성 링커인 상기 [1]∼[3] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[5]Rnl2 패밀리의 리가제가 T4 RNA 리가제 2인 상기 [1]∼[4] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[6]pH 7.4∼8.6의 반응액 중에서 상기 라이게이션이 행해지는 상기 [1]∼[5] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[7]2∼10mM의 2가 금속이온을 포함하는 반응액 중에서 상기 라이게이션이 행해지는 상기 [1]∼[6] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[8]제 1 링커 및 제 2 링커는 각각 독립적으로 하기 식(VI)으로 나타내어지는 비뉴클레오티드성 링커인 상기 [1]∼[7] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[9]상기 표적 유전자는 TGF-β1 유전자, GAPDH 유전자, LAMA1 유전자 또는 LMNA 유전자인 상기 [1]∼[8] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[10]상기 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자는 서열 번호 1로 나타내어지는 염기서열로 이루어지고, 24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되고, 50번째와 51번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 상기 [1]∼[9] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[11]상기 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 상기 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자는 이하의 (1)∼(6) 중 어느 하나인 상기 [1]∼[10] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
(1)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 7로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 10번째와 11번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 6으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합
(2)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 19로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 16번째와 17번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 18로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합
(3)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 27로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 20번째와 21번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 26으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합
(4)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 29로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 21번째와 22번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 28로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합
(5)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 31로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 22번째와 23번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 30으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합
(6)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 33으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 23번째와 24번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 32로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합
[12]이하의 (a)∼(l) 중 어느 하나인 1개쇄 올리고 RNA 분자.
(a)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 7로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자
(b)10번째와 11번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 6으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자
(c)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 19로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자
(d)16번째와 17번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 18로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자
(e)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 27로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자
(f)20번째와 21번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 26으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자
(g)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 29로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자
(h)21번째와 22번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 28로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자
(i)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 31로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자
(j)22번째와 23번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 30으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자
(k)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 33으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자
(l)23번째와 24번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 32로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자
[13]이하의 (1)∼(6) 중 어느 하나의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합을 포함하는 TGF-β1 유전자의 발현을 억제하기 위한 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 제조용 키트.
(1)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 7로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 10번째와 11번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 6으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합
(2)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 19로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 16번째와 17번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 18로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합
(3)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 27로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 20번째와 21번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 26으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합
(4)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 29로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 21번째와 22번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 28로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합
(5)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 31로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 22번째와 23번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 30으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합
(6)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 33으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 23번째와 24번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 32로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합
본 명세서는 본원의 우선권의 기초가 되는 일본국 특허 출원번호 2018-070423호의 개시 내용을 포함한다.
본 발명에 의하면, 표적 유전자의 발현을 억제하는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자를 효율적으로 제조할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시형태의 라이게이션법의 개략도이다.
도 2는 ssTbRNA 분자 (서열 번호 1)의 모식도이다. P는 프롤린 유도체를 나타낸다. 서열 번호 1의 29번째(U)∼47번째(C)는 활성 서열(TGF-β1 유전자에 대한 유전자 발현 억제 서열;안티센스 서열)에 상당하다.
도 3은 표 1에 나타내는 004∼019의 1개쇄 올리고 RNA 분자 (스트랜드 1 및 2)의 셋트(페어)의 T4 RNA 리가제 2를 사용한 어닐링 및 라이게이션 반응후의 라이게이션 효율을 나타낸다.
도 4는 011, 016, 및 018의 1개쇄 올리고 RNA 분자 (스트랜드 1 및 2)의 구조를 나타낸다. 각각의 페어의 우측이 스트랜드 1, 좌측이 스트랜드 2이다.
도 5는 016의 올리고 핵산을 다른 올리고 RNA 농도 및 다른 반응온도에서 라이게이션했을 때의 라이게이션 효율의 경시적 변화를 나타낸다.
도 6은 011, 016, 및 018의 올리고 RNA(100μM)를 사용하고, 다른 반응온도에서 라이게이션했을 때의 라이게이션 효율의 경시적 변화를 나타낸다. A는 25℃, B는 37℃에서의 라이게이션의 결과를 나타낸다.
도 7은 011의 올리고 RNA를 다른 ATP 농도 하에서 라이게이션했을 때의 변성 PAGE 해석의 결과를 나타낸다.
도 8은 011의 올리고 RNA를 다른 ATP 농도 하에서 라이게이션했을 때의 라이게이션 효율을 나타낸다.
도 9는 016의 올리고 RNA를 다른 올리고 RNA 농도, 다른 pH 조건 하에서 라이게이션했을 때의 라이게이션 효율의 경시적 변화를 나타낸다.
도 10은 016의 올리고 RNA를 다른 pH 조건 하에서 라이게이션했을 때의 라이게이션 효율을 나타낸다.
도 11은 016의 올리고 RNA를 다른 올리고 RNA 농도, 다른 MgCl2 농도 하에서 라이게이션했을 때의 라이게이션 효율을 나타낸다. A는 10μM 또는 100μM 올리고 RNA, B는 10μM 또는 200μM 올리고 RNA의 존재 하에서의 라이게이션의 결과를 나타낸다.
도 12는 016의 올리고 RNA를 다른 MgCl2 농도, 다른 pH 조건 하에서 라이게이션했을 때의 라이게이션 효율을 나타낸다. A는 pH 7.5, B는 pH 8.0에서의 라이게이션의 결과를 나타낸다.
도 13은 다른 효소량을 사용하고, PEG를 첨가해서 라이게이션했을 때의 라이게이션 효율을 나타낸다.
도 14는 다른 올리고 RNA 농도를 사용한 라이게이션 반응의 타임 코스를 나타낸다.
도 15는 초기 올리고 RNA 농도를 100μM로 하고, 올리고 RNA를 순차 추가하면서 행한 라이게이션 반응에 있어서의 목적 산물 ssTbRNA 분자의 생성량을 나타낸다. ssTbRNA 분자의 생성량(nmol)=(1개쇄 올리고 RNA 분자의 첨가량)×(FLP(Full Length Product, 완전길이의 생성물)(%))/100. 그래프의 가로축의 h는 라이게이션 개시후의 시간을 나타낸다. 라이게이션 개시시의 올리고 RNA 농도 100μM(10nmol), 효소 농도 4유닛/nmol 올리고 RNA는 최종 첨가후에는 올리고 RNA 농도 300μM(40nmol), 효소 농도 1유닛/nmol 올리고 RNA로 되었다.
도 16은 초기 올리고 RNA 농도를 200μM로 하고, 올리고 RNA를 순차 추가하면서 행한 라이게이션 반응에 있어서의, 목적 산물 ssTbRNA 분자의 생성량을 나타낸다. ssTbRNA 분자의 생성량(nmol)=(1개쇄 올리고 RNA 분자의 첨가량)×(FLP(%))/100. 그래프의 가로축의 h는 라이게이션 개시후의 시간을 나타낸다. 라이게이션 개시시의 올리고 RNA 농도 200μM(20nmol), 효소 농도 4유닛/nmol 올리고 RNA는 최종 첨가후에는 올리고 RNA 농도 480μM(80nmol), 효소 농도 0.5유닛/nmol 올리고 RNA로 되었다.
도 17은 GAPDH 유전자, LAMA1 유전자, 또는 LMNA 유전자에 대한 유전자 발현 억제 서열을 포함하는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자와, 그 분할위치를 나타낸다. (1)∼(7)은 분할 위치를 나타낸다. 각 유전자에 대한 유전자 발현 억제 서열(활성 서열/안티센스 서열)을 프레임으로 나타냈다.
도 18은 GAPDH 유전자, LAMA1 유전자, 또는 LMNA 유전자에 대한 유전자 발현 억제 서열을 포함하는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 분할 프래그먼트인 1개쇄 올리고 RNA 분자의 페어(스트랜드 1 및 2)를 사용한 어닐링 및 라이게이션 반응후의 라이게이션 효율을 나타낸다.
도 19는 표 1에 나타내는 스트랜드 1 및 스트랜드 2의 셋트(페어)의 T4 RNA 리가제를 사용한 어닐링 및 라이게이션 반응후의 라이게이션 효율을 나타낸다.
도 2는 ssTbRNA 분자 (서열 번호 1)의 모식도이다. P는 프롤린 유도체를 나타낸다. 서열 번호 1의 29번째(U)∼47번째(C)는 활성 서열(TGF-β1 유전자에 대한 유전자 발현 억제 서열;안티센스 서열)에 상당하다.
도 3은 표 1에 나타내는 004∼019의 1개쇄 올리고 RNA 분자 (스트랜드 1 및 2)의 셋트(페어)의 T4 RNA 리가제 2를 사용한 어닐링 및 라이게이션 반응후의 라이게이션 효율을 나타낸다.
도 4는 011, 016, 및 018의 1개쇄 올리고 RNA 분자 (스트랜드 1 및 2)의 구조를 나타낸다. 각각의 페어의 우측이 스트랜드 1, 좌측이 스트랜드 2이다.
도 5는 016의 올리고 핵산을 다른 올리고 RNA 농도 및 다른 반응온도에서 라이게이션했을 때의 라이게이션 효율의 경시적 변화를 나타낸다.
도 6은 011, 016, 및 018의 올리고 RNA(100μM)를 사용하고, 다른 반응온도에서 라이게이션했을 때의 라이게이션 효율의 경시적 변화를 나타낸다. A는 25℃, B는 37℃에서의 라이게이션의 결과를 나타낸다.
도 7은 011의 올리고 RNA를 다른 ATP 농도 하에서 라이게이션했을 때의 변성 PAGE 해석의 결과를 나타낸다.
도 8은 011의 올리고 RNA를 다른 ATP 농도 하에서 라이게이션했을 때의 라이게이션 효율을 나타낸다.
도 9는 016의 올리고 RNA를 다른 올리고 RNA 농도, 다른 pH 조건 하에서 라이게이션했을 때의 라이게이션 효율의 경시적 변화를 나타낸다.
도 10은 016의 올리고 RNA를 다른 pH 조건 하에서 라이게이션했을 때의 라이게이션 효율을 나타낸다.
도 11은 016의 올리고 RNA를 다른 올리고 RNA 농도, 다른 MgCl2 농도 하에서 라이게이션했을 때의 라이게이션 효율을 나타낸다. A는 10μM 또는 100μM 올리고 RNA, B는 10μM 또는 200μM 올리고 RNA의 존재 하에서의 라이게이션의 결과를 나타낸다.
도 12는 016의 올리고 RNA를 다른 MgCl2 농도, 다른 pH 조건 하에서 라이게이션했을 때의 라이게이션 효율을 나타낸다. A는 pH 7.5, B는 pH 8.0에서의 라이게이션의 결과를 나타낸다.
도 13은 다른 효소량을 사용하고, PEG를 첨가해서 라이게이션했을 때의 라이게이션 효율을 나타낸다.
도 14는 다른 올리고 RNA 농도를 사용한 라이게이션 반응의 타임 코스를 나타낸다.
도 15는 초기 올리고 RNA 농도를 100μM로 하고, 올리고 RNA를 순차 추가하면서 행한 라이게이션 반응에 있어서의 목적 산물 ssTbRNA 분자의 생성량을 나타낸다. ssTbRNA 분자의 생성량(nmol)=(1개쇄 올리고 RNA 분자의 첨가량)×(FLP(Full Length Product, 완전길이의 생성물)(%))/100. 그래프의 가로축의 h는 라이게이션 개시후의 시간을 나타낸다. 라이게이션 개시시의 올리고 RNA 농도 100μM(10nmol), 효소 농도 4유닛/nmol 올리고 RNA는 최종 첨가후에는 올리고 RNA 농도 300μM(40nmol), 효소 농도 1유닛/nmol 올리고 RNA로 되었다.
도 16은 초기 올리고 RNA 농도를 200μM로 하고, 올리고 RNA를 순차 추가하면서 행한 라이게이션 반응에 있어서의, 목적 산물 ssTbRNA 분자의 생성량을 나타낸다. ssTbRNA 분자의 생성량(nmol)=(1개쇄 올리고 RNA 분자의 첨가량)×(FLP(%))/100. 그래프의 가로축의 h는 라이게이션 개시후의 시간을 나타낸다. 라이게이션 개시시의 올리고 RNA 농도 200μM(20nmol), 효소 농도 4유닛/nmol 올리고 RNA는 최종 첨가후에는 올리고 RNA 농도 480μM(80nmol), 효소 농도 0.5유닛/nmol 올리고 RNA로 되었다.
도 17은 GAPDH 유전자, LAMA1 유전자, 또는 LMNA 유전자에 대한 유전자 발현 억제 서열을 포함하는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자와, 그 분할위치를 나타낸다. (1)∼(7)은 분할 위치를 나타낸다. 각 유전자에 대한 유전자 발현 억제 서열(활성 서열/안티센스 서열)을 프레임으로 나타냈다.
도 18은 GAPDH 유전자, LAMA1 유전자, 또는 LMNA 유전자에 대한 유전자 발현 억제 서열을 포함하는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 분할 프래그먼트인 1개쇄 올리고 RNA 분자의 페어(스트랜드 1 및 2)를 사용한 어닐링 및 라이게이션 반응후의 라이게이션 효율을 나타낸다.
도 19는 표 1에 나타내는 스트랜드 1 및 스트랜드 2의 셋트(페어)의 T4 RNA 리가제를 사용한 어닐링 및 라이게이션 반응후의 라이게이션 효율을 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 표적 유전자의 발현을 억제하는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의해 제조되는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자는 유전자 발현 억제 서열을 포함하는 2개쇄 RNA의 센스쇄의 3' 말단 및 안티센스쇄의 5' 말단이 비뉴클레오티드성 링커 또는 뉴클레오티드성 링커 등의 링커를 포함하는 서열을 통해 연결되고, 그 안티센스쇄의 3' 말단에 비뉴클레오티드성 링커 또는 뉴클레오티드성 링커 등의 링커를 포함하는 서열을 통해 1개 이상의 리보뉴클레오티드 잔기가 더 연결된 1개쇄 구조를 갖는다. 본 발명의 방법에 의해 제조되는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 5' 말단과 3' 말단은 결합되어 있지 않다. 본 명세서에 있어서 「헤어핀형」이란 1개쇄 RNA 분자가 분자내 어닐링(자기 어닐링)에 의해 1개 이상의 2중쇄 구조를 형성하는 것을 의미한다. 본 발명의 방법에 의해 제조되는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자는 전형적으로는 그 5' 말단을 포함하는 5'측 영역과 3' 말단을 포함하는 3'측 영역이 각각 별개로 분자내 어닐링함으로써, 2개의 2중쇄 구조를 형성한다. 본 명세서에 있어서 「RNA」, 「RNA 분자」, 「핵산 분자」 및 「핵산」은 뉴클레오티드만으로 구성되어 있어도 좋지만, 뉴클레오티드와 비뉴클레오티드 물질(예를 들면 프롤린 유도체 등의 환상 아민 유도체)로 구성되어 있어도 좋다.
본 발명에서는 표적 유전자의 발현을 억제하는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자를 2개의 링커(예를 들면 비뉴클레오티드성 링커, 뉴클레오티드성 링커, 또는 이들을 조합한 링커)에 끼워진 서열 중에서 2개로 분할한 프래그먼트로서 합성하고, 이들을 어닐링하고, 라이게이션함으로써, 제조할 수 있다. 라이게이션이란 2개의 핵산(본 발명에 있어서는 전형적으로는 RNA)을 그 말단의 5' 인산기와 3' 수산기를 결합(포스포디에스테르 결합)시킴으로써 연결하는 것을 의미한다. 본 발명의 방법에서는 비교적 장쇄의 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자를 보다 단쇄의 1개쇄 RNA 분자의 페어의 라이게이션에 의해 제조하고, 그것에 의해 상기 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 고수량의 제조를 실현할 수 있다.
보다 구체적으로는 본 발명은 표적 유전자의 발현을 억제하는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 제조 방법으로서,
제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 어닐링하는 어닐링 공정과,
상기 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 3' 말단과 상기 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 5' 말단을 Rnl2 패밀리의 리가제에 의해 라이게이션하는 라이게이션 공정을 포함하고,
제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 라이게이션에 의해 생성되는 서열은 상기 표적 유전자에 대한 유전자 발현 억제 서열을 포함하는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법에 있어서, 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자는 제 1 링커를 통해 연결된 제 1 RNA 부분과 제 2 RNA 부분을 포함하고, 제 1 RNA 부분과 제 2 RNA 부분의 한쪽은 다른쪽에 대해서 상보적으로 결합 가능하다. 그 상보적인 결합에 의해, 제 1 링커는 루프를 형성하고, 제 1 RNA 부분과 제 2 RNA 부분은 상기 루프에 인접해서 스템을 형성할 수 있다. 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자에 있어서, 제 1 RNA 부분은 5' 말단측에, 제 2 RNA 부분은 3' 말단측에 배치된다. 또한 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자는 제 2 링커를 통해 연결된 제 3 RNA 부분과 제 4 RNA 부분을 포함하고, 제 3 RNA 부분과 제 4 RNA 부분의 한쪽은 다른쪽에 대해서 상보적으로 결합 가능하다. 그 상보적인 결합에 의해, 제 2 링커는 루프를 형성하고, 제 3 RNA 부분과 제 4 RNA 부분은 상기 루프에 인접해서 스템을 형성할 수 있다. 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자에 있어서, 제 3 RNA 부분은 5' 말단측에, 제 4 RNA 부분은 3' 말단측에 배치된다. 제 1∼제 4 RNA 부분은 각각 1개 또는 2개 이상의 리보뉴클레오티드 잔기를 포함한다. 이렇게 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자 및 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자는 자기 상보 서열을 포함하고, 각각, 분자내 어닐링(자기 어닐링)에 의해, 헤어핀 구조를 형성할 수 있다. 제 1 RNA 부분과 제 2 RNA 부분은 한쪽이 다른쪽보다 긴 염기길이를 갖는 것이 바람직하다. 또 제 3 RNA 부분과 제 4 RNA 부분은 한쪽이 다른쪽보다 긴 염기길이를 갖는 것이 바람직하다. 제 1 RNA 부분이 제 2 RNA 부분보다 긴 염기길이를 갖는 경우, 제 3 RNA 부분은 제 4 RNA 부분보다 긴 염기길이를 갖는 것이 바람직하다. 제 2 RNA 부분이 제 1 RNA 부분보다 긴 염기길이를 갖는 경우, 제 4 RNA 부분은 제 1 RNA 부분보다 긴 염기길이를 갖는 것이 바람직하다. 제 1 RNA 부분과 제 2 RNA 부분 중, 보다 긴 염기길이를 갖는 쪽의 RNA 부분은 보다 짧은 염기길이를 갖는 쪽의 RNA 부분에 상보적인 리보뉴클레오티드 잔기 또는 그 서열을 제 1 링커에 인접해서 포함하는 것이 바람직하다. 제 3 RNA 부분과 제 4 RNA 부분 중, 보다 긴 염기길이를 갖는 쪽의 RNA 부분은 보다 짧은 염기길이를 갖는 쪽의 RNA 부분에 상보적인 리보뉴클레오티드 잔기 또는 그 서열을 제 2 링커에 인접해서 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 1개쇄 올리고 RNA 분자에 포함되는 2개의 RNA 부분(제 1 및 제 2 RNA 부분, 또는 제 3 및 제 4 RNA 부분)의 한쪽이 다른쪽에 대해서 「상보적으로 결합 가능하다」란 2개의 RNA 부분 중 어느 한쪽(통상은 보다 짧은 염기길이를 갖는 쪽의 RNA 부분)의 전체 길이가 다른쪽의 RNA 부분(통상은 보다 긴 염기길이를 갖는 쪽의 RNA 부분)에 대해서, 안정된 염기대합을 형성해서 결합할 수 있는 것을 의미하고, 이 경우, 전자의 RNA 부분의 전체 길이는 후자의 RNA 부분내의 대응하는 리보뉴클레오티드 잔기 또는 그 서열에 대해서 상보적이다. 1개쇄 올리고 RNA 분자에 포함되는 2개의 RNA 부분의 한쪽은 다른쪽의 RNA 부분 중의 대응하는 리보뉴클레오티드 잔기 또는 그 서열에 대해서 완전히 상보적(즉, 한쪽의 RNA 부분의 모든 리보뉴클레오티드 잔기가 다른쪽의 RNA 부분 중의 대응하는 리보뉴클레오티드 잔기에 대해서 미스매치를 갖지 않는다)인 것이 보다 바람직하다. 또는 1개쇄 올리고 RNA 분자에 포함되는 2개의 RNA 부분의 한쪽은 다른쪽의 RNA 부분에 대해서, 안정된 염기대합을 형성할 수 있는 한, 1개 이상, 예를 들면 1개 또는 2개의 리보뉴클레오티드 잔기의 미스매치를 포함해도 좋고, 그 경우도 「상보적으로 결합 가능」이다. 단 그 미스매치는 본 발명의 방법에 있어서 라이게이션되는 분자말단의 리보뉴클레오티드 잔기에는 존재하지 않는 것이 바람직하다.
일실시형태에서는 제 1 RNA 부분 및 제 4 RNA 부분의 한쪽은 다른쪽보다 짧고, 바람직하게는 1∼7 염기길이이며, 예를 들면 1∼6 염기길이, 1∼4 염기길이, 1∼3 염기길이, 1 염기길이 또는 2 염기길이이다. 그 경우, 제 1 RNA 부분 및 제 4 RNA 부분 중 긴 쪽(다른쪽)은 19∼28 염기길이이어도 좋고, 예를 들면 19∼27 염기길이, 19∼25 염기길이, 19∼23 염기길이, 20∼28 염기길이, 21∼27 염기길이, 20∼25 염기길이, 22∼27 염기길이, 23∼26 염기길이, 24∼28 염기길이, 26∼28 염기길이이어도 좋다.
제 1 RNA 부분이 제 4 RNA 부분보다 긴 경우, 제 2 RNA 부분은 이하에 한정되는 것은 아니지만, 1∼20 염기길이이어도 좋고, 예를 들면 2∼20 염기길이, 2∼15 염기길이, 3∼10 염기길이, 3∼6 염기길이, 5∼12 염기길이 또는 9∼12 염기길이이어도 좋다. 제 1 RNA 부분이 제 4 RNA 부분보다 짧은 경우, 제 2 RNA 부분은 이하에 한정되는 것은 아니지만, 8∼38 염기길이이어도 좋고, 예를 들면 8∼36 염기길이, 12∼36 염기길이, 14∼34 염기길이, 14∼33 염기길이, 14∼36 염기길이 또는 20∼34 염기길이이어도 좋다.
제 1 RNA 부분의 염기서열은 링커와 인접해서 CC(사이토신-사이토신)를 포함해도 좋고, 이 경우, 제 2 RNA 부분의 염기서열은 그 서열과 상보적으로 되도록 링커와 인접해서 GG(구아닌-구아닌)를 포함하는 것이 바람직하다. 일실시형태에서는 제 1 RNA 부분의 염기서열은 링커와 인접해서 ACC(아데닌-사이토신-사이토신), GCC(구아닌-사이토신-사이토신), 또는 UCC(우라실-사이토신-사이토신)를 포함해도 좋고, 이 경우, 제 2 RNA 부분의 염기서열은 그 서열과 상보적으로 되도록 링커와 인접해서 각각 GGU(구아닌-구아닌-우라실), GGC(구아닌-구아닌-사이토신), 또는 GGA(구아닌-구아닌-아데닌)를 포함하는 것이 바람직하다. 제 3 RNA 부분의 염기서열은 링커와 인접해서 C(사이토신)를 포함해도 좋고, 이 경우, 제 4 RNA 부분의 염기서열은 그 잔기와 상보적으로 되도록 링커와 인접해서 G(구아닌)를 포함하는 것이 바람직하다.
제 1 또는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 염기길이 즉 2개의 RNA 부분의 합계 염기길이(링커 부분은 포함하지 않는다)는 이하에 한정되지 않지만, 바람직하게는 13∼48 염기길이이다. 제 1 RNA 부분이 제 4 RNA 부분보다 긴 경우, 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 염기길이 즉 제 1 RNA 부분 및 제 2 RNA 부분의 합계 염기길이(링커 부분은 포함하지 않는다)는 바람직하게는 21∼48 염기길이이며, 예를 들면 21∼45 염기길이, 25∼45 염기길이, 26∼35 염기길이, 26∼30 염기길이, 26∼28 염기길이 또는 33∼36 염기길이이다. 제 1 RNA 부분이 제 4 RNA 부분보다 짧은 경우, 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 염기길이 즉 제 1 RNA 부분 및 제 2 RNA 부분의 합계 염기길이(링커 부분은 포함하지 않는다)는 바람직하게는 13∼45 염기길이이며, 예를 들면 13∼43 염기길이, 15∼41 염기길이, 15∼30 염기길이, 17∼25 염기길이 또는 20∼25 염기길이이다.
본 발명의 방법에 있어서, 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자는 5' 말단 또는 3' 말단의 서열에 있어서 서로 상보적이다. 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자는 5' 말단 또는 3' 말단의 상보적인 서열간(바람직하게는 완전히 상보적인 서열간)에서 분자간 2중쇄를 형성 가능하다. 보다 구체적으로는 일실시형태에서는 헤어핀 구조를 형성한 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 5' 말단의 서열(제 1 RNA 부분의 5' 말단의 헤어핀 구조의 스템·루프에 포함되지 않는 서열)과, 헤어핀 구조를 형성한 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 5' 말단의 서열(제 3 RNA 부분의 5' 말단의 헤어핀 구조의 스템·루프에 포함되지 않는 서열)이 서로 상보적이며, 분자간 2중쇄를 형성 가능하다. 다른 실시형태에서는 헤어핀 구조를 형성한 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 3' 말단의 서열(제 2 RNA 부분의 3' 말단의 헤어핀 구조의 스템·루프에 포함되지 않는 서열)과, 헤어핀 구조를 형성한 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 3' 말단의 서열(제 4 RNA 부분의 3' 말단의 헤어핀 구조의 스템·루프에 포함되지 않는 서열)이 서로 상보적이며, 분자간 2중쇄를 형성 가능하다. 본 발명의 방법의 어닐링 공정세서는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자가 5' 말단 또는 3' 말단의 상보적인 서열간에서 분자간 2중쇄를 형성함으로써, 2개쇄 올리고 RNA가 생성된다.
일실시형태에서는 제 1 및 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자간에서 상보적인 서열의 길이(후술의 갭 부분을 포함하지 않는다)는 이하에 한정되지 않지만, 통상은 6 염기길이 이상, 예를 들면 7 염기 이상, 10 염기길이 이상, 12 염기길이 이상, 14 염기길이 이상, 또는 18 염기 이상이며, 예를 들면 6∼27 염기길이 7∼25 염기길이, 10∼25 염기길이, 12∼23 염기길이, 12∼22 염기길이, 12∼15 염기길이 또는 18∼23 염기길이이어도 좋다.
본 발명의 방법의 어닐링 공정에 있어서, 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자가 2중쇄를 형성할 때, 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 3' 말단의 리보뉴클레오티드 잔기와 상기 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 5' 말단의 리보뉴클레오티드 잔기는 닉을 생성한다. 보다 구체적으로는 어닐링 공정에 있어서 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자는 제 1 및 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자간에서 상보적인 서열의 분자간 어닐링에 의해 2중쇄(분자간 2중쇄)를 형성하는 것에 추가해서, 제 1 RNA 부분과 제 2 RNA 부분, 및 제 3 RNA 부분과 제 4 RNA 부분에 있어서, 각각, 분자내 어닐링에 의한 2중쇄(분자내 2중쇄, 즉 헤어핀 구조)를 형성하고, 제 2 RNA 부분과 제 3 RNA 부분 사이에는 닉이 생긴다. 본 발명에 있어서 「닉」이란 핵산 2중쇄의 한쪽의 뉴클레오티드쇄에 있어서 2개의 뉴클레오티드 잔기간의 포스포디에스테르 결합이 끊어져서 3' 수산기와 5' 인산기가 유리되어 있는 상태를 가리킨다. 닉은 라이게이션 반응에 의해 연결 가능하다.
본 발명의 방법의 어닐링 공정에 있어서, 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자가 2중쇄를 형성할 때, 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 5' 말단의 리보뉴클레오티드 잔기와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 3' 말단의 리보뉴클레오티드 잔기 사이에는 1개 이상의 리보뉴클레오티드 잔기의 갭이 존재한다. 이 갭은 라이게이션 반응에 의해 연결되지 않으므로, 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자는 라이게이션 반응후, 1개쇄 RNA 분자를 형성한다. 1개 이상의 리보뉴클레오티드 잔기의 갭은 1∼4잔기(1, 2, 3, 또는 4잔기)의 갭이어도 좋다. 이 갭 부분에서는 염기대합은 형성되지 않는다.
제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 5' 말단의 리보뉴클레오티드 잔기와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 3' 말단의 리보뉴클레오티드 잔기 사이의 갭은 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자가 어닐링한 2중쇄 중, 제 1 링커에 의해 가까운 위치에 있어도 좋고, 또는 제 2 링커에 의해 가까운 위치에 있어도 좋다.
제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 라이게이션에 의해 생성되는 서열은 표적 유전자에 대한 유전자 발현 억제 서열을 포함한다. 제 1 RNA 부분 또는 제 4 RNA 부분은 표적 유전자에 대한 유전자 발현 억제 서열(센스 서열 또는 안티센스 서열; 예를 들면 센스 서열)을 포함할 수 있다. 라이게이션에 의해 제 2 RNA 부분과 제 3 RNA 부분이 연결된 서열은 표적 유전자에 대한 유전자 발현 억제 서열(안티센스 서열 또는 센스 서열; 예를 들면 안티센스 서열)을 포함할 수 있다. 일실시형태에서는 제 2 RNA 부분 또는 제 3 RNA 부분이 표적 유전자에 대한 유전자 발현 억제 서열(안티센스 서열 또는 센스 서열; 예를 들면 안티센스 서열)을 포함해도 좋다.
본 발명의 방법에 있어서, 링커, 예를 들면 제 1 링커 및 제 2 링커는 비뉴클레오티드성 링커, 뉴클레오티드성 링커, 또는 이들의 조합이어도 좋다.
일실시형태에서는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자는 3' 말단에 우라실(U) 또는 아데닌(A)을 갖고, 또한, 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자는 5' 말단에 우라실(U) 또는 아데닌(A)을 갖는다. 여기에서 1개쇄 올리고 RNA 분자가 3' 말단 또는 5' 말단에 우라실(U) 또는 아데닌(A)을 갖는다란 1개쇄 올리고 RNA 분자의 3' 말단 또는 5' 말단의 리보뉴클레오티드 잔기가 염기로서 우라실(U) 또는 아데닌(A)을 포함하는 것을 의미한다. 구체적으로는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 3' 말단의 리보뉴클레오티드 잔기의 염기와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 5' 말단의 리보뉴클레오티드 잔기의 염기의 바람직한 조합은 U-A, U-U, A-U, 또는 A-A일 수 있다.
본 발명의 방법의 일실시형태의 개략도를 도 1에 나타낸다. 도 1 중, Lx1 및 Lx2는 링커(예를 들면 비뉴클레오티드성 링커, 뉴클레오티드성 링커, 또는 이들의 조합)이다. 본 발명의 방법에서는 비교적 장쇄의 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자를 보다 단쇄의 1개쇄 RNA 분자의 페어를 라이게이션함으로써 제조하고, 그것에 의해 고수량을 실현할 수 있다.
일실시형태에 있어서, 본 발명에 따른 표적 유전자의 발현을 억제하는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 제조 방법은,
하기 식(I)로 나타내어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자 (도 1 중, 스트랜드 1):
5'-Xs-Lx1-Xa-3'···식(I)
과, 하기 식(II)로 나타내어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자 (도 1 중, 스트랜드 2):
5'-Ya1-Ya2-Ya3-Lx2-Ys-3'···식(II)
를 어닐링하는 어닐링 공정과, 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 3' 말단과 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 5' 말단을 라이게이션하는 라이게이션 공정을 포함한다. 이 라이게이션은 Rnl2 패밀리의 리가제에 의해 행할 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명에 따른, 표적 유전자의 발현을 억제하는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 제조 방법은,
하기 식(A)로 나타내어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자:
5'-XXs-Lx1-XXa3-XXa2-XXa1-3'···식(A)
와, 하기 식(B)로 나타내어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자:
5'-YYa-Lx2-YYs-3'···식(B)
를 어닐링하는 어닐링 공정과, 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 3' 말단과 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 5' 말단을 라이게이션하는 라이게이션 공정을 포함한다. 이 라이게이션은 Rnl2 패밀리의 리가제에 의해 행할 수 있다.
본 발명에 있어서 「올리고 RNA」 및 「올리고 RNA 분자」란 49 염기길이 이하(비뉴클레오티드성 링커 및 뉴클레오티드성 링커 등의 링커 부분의 잔기수는 불산입)의 염기서열을 갖는 RNA 분자를 가리킨다. 본 발명에 있어서 용어 「올리고 RNA」와 「올리고 RNA 분자」는 통상 호환적으로 사용된다. 본 발명에 따른 1개쇄 올리고 RNA 분자는 1개쇄 올리고 RNA, 올리고 핵산, 1개쇄 핵산 분자, 올리고 RNA, 또는 올리고 RNA 분자라고 칭해지는 일도 있다.
식(I) 및 식(II) 중, Xs, Xa, Ya1, Ya2, Ya3, 및 Ys는 1개 또는 그 이상의 리보뉴클레오티드 잔기를 나타낸다. 식(I) 및 식(II) 중, Lx1 및 Lx2는 각각 독립적으로 링커, 예를 들면 비뉴클레오티드성 링커, 뉴클레오티드성 링커, 또는 이들의 조합을 나타낸다.
식(I)은 영역 Xs와 Xa가 Lx1을 통해 연결된 구조를 나타내고 있다. 식(II)는 영역 Ya1, Ya2, 및 Ya3이 이 순서로 연결된 리보뉴클레오티드 서열(Ya1-Ya2-Ya3)과 영역 Ys가 Lx2를 통해 연결된 구조를 나타내고 있다.
식(A) 및 식(B) 중, XXs, XXa3, XXa2, XXa1, YYa, 및 YYs는 1개 또는 그 이상의 리보뉴클레오티드 잔기를 나타낸다. 식(A) 및 식(B) 중, Lx1 및 Lx2는 각각 독립적으로 링커, 예를 들면 비뉴클레오티드성 링커, 뉴클레오티드성 링커, 또는 이들의 조합을 나타낸다.
식(A)는 영역 XXa3, XXa2, 및 XXa1이 이 순서로 연결된 리보뉴클레오티드 서열(XXa3-XXa2-XXa1)과 영역 XXs가 Lx1을 통해 연결된 구조를 나타내고 있다. 식(B)는 영역 YYa와 YYs가 Lx2를 통해 연결된 구조를 나타내고 있다.
Xs, Xa, Ya1, Ya2, Ya3, Ys, XXs, XXa3, XXa2, XXa1, YYa, 및 YYs는 리보뉴클레오티드 잔기로 이루어진다. 리보뉴클레오티드 잔기는 아데닌, 우라실, 구아닌, 또는 사이토신으로부터 선택되는 어느 하나의 핵산 염기를 갖는 것이어도 좋다. 리보뉴클레오티드 잔기는 또한 수식 리보뉴클레오티드 잔기이어도 좋고, 예를 들면 수식된 핵산 염기(수식 염기)를 갖고 있어도 좋다. 수식으로서는 형광 색소 표지, 메틸화, 할로겐화, 슈도유리딘화, 아미노화, 탈아미노화, 티오화, 디히드로화 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. Xs, Xa, Ya1, Ya2, Ya3, 및 Ys는 각각 독립적으로, 비수식 리보뉴클레오티드 잔기만으로 이루어지는 것이어도 좋고, 비수식 리보뉴클레오티드 잔기에 추가하여 수식 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하는 것이어도 좋고, 수식 리보뉴클레오티드 잔기만으로 이루어지는 것이어도 좋다. Xs가 5' 말단에 수식 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하고 있어도 좋다. Ys가 3' 말단에 수식 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하고 있어도 좋다. 마찬가지로, XXs, XXa3, XXa2, XXa1, YYa, 및 YYs는 각각 독립적으로, 비수식 리보뉴클레오티드 잔기만으로 이루어지는 것이어도 좋고, 비수식 리보뉴클레오티드 잔기에 추가하여 수식 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하는 것이어도 좋고, 수식 리보뉴클레오티드 잔기만으로 이루어지는 것이어도 좋다. XXs가 5' 말단에 수식 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하고 있어도 좋다. YYs가 3' 말단에 수식 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하고 있어도 좋다.
본 발명에 있어서, 라이게이션 공정에서 생기는 Xa-Ya1(라이게이션에 의해 Xa와 Ya1이 연결된 뉴클레오티드 서열)은 Xs와 상보적이다. 일실시형태에서는 Xs는 19∼28 염기길이이어도 좋고, 예를 들면 19∼27 염기길이, 19∼25 염기길이, 19∼23 염기길이, 20∼28 염기길이, 21 염기∼27 염기, 21 염기∼25 염기, 22∼27 염기길이, 23∼26 염기길이, 24∼28 염기길이 또는 26∼28 염기길이이어도 좋다.
본 발명에 있어서, 라이게이션 공정에서 생기는 XXa1-YYa(라이게이션에 의해 XXa1과 YYa가 연결된 뉴클레오티드 서열)는 YYs와 상보적이다. 일실시형태에서는 YYs는 19∼28 염기길이이어도 좋고, 예를 들면 19∼27 염기길이, 19∼25 염기길이, 19∼23 염기길이, 20∼28 염기길이, 21 염기∼27 염기, 21 염기∼25 염기, 22∼27 염기길이, 23∼26 염기길이, 24∼28 염기길이 또는 26∼28 염기길이이어도 좋다.
본 발명에 있어서, Xa는 Xs 내의 대응하는 잔기 또는 서열과 상보적이다. 일실시형태에서는 식(I) 중, Xs의 염기서열이 링커와 인접해서 C(사이토신)를 포함해도 좋다. 이 경우, Xa의 염기서열은 Xs와 상보적으로 되도록 링커와 인접해서 G(구아닌)를 포함한다. 일실시형태에서는 식(I) 중, Xs의 염기서열이 링커와 인접해서 CC(사이토신-사이토신)를 포함해도 좋다. 이 경우, Xa의 염기서열은 Xs와 상보적으로 되도록 링커와 인접해서 GG(구아닌-구아닌)를 포함한다. 일실시형태에서는 식(I) 중, Xs의 염기서열은 링커와 인접해서 ACC(아데닌-사이토신-사이토신)를 포함해도 좋다. 이 경우, Xa의 염기서열은 Xs와 상보적으로 되도록 링커와 인접해서 GGU(구아닌-구아닌-우라실)를 포함한다. 일실시형태에서는 Xa는 3' 말단에 염기 우라실(U) 또는 아데닌(A)을 포함해도 좋다. Xa는 1∼20 염기길이이어도 좋고, 예를 들면 2∼20 염기길이, 2∼15 염기길이, 3∼10 염기길이, 3∼6 염기길이, 5∼12 염기길이 또는 9∼12 염기길이이어도 좋다.
본 발명에 있어서, XXa3은 XXs와 상보적이다. 일실시형태에서는 식(A) 중, XXs의 염기서열이 링커와 인접해서 C(사이토신)를 포함해도 좋다. 이 경우, XXa3의 염기서열은 XXs와 상보적으로 되도록 링커와 인접해서 G(구아닌)를 포함한다. 일실시형태에서는 식(A) 중, XXs의 염기서열이 링커와 인접해서 CC(사이토신-사이토신)를 포함해도 좋다. 이 경우, XXa3의 염기서열은 XXs와 상보적으로 되도록 링커와 인접해서 GG(구아닌-구아닌)를 포함한다. 일실시형태에서는 식(A) 중, XXs의 염기서열은 링커와 인접해서 ACC(아데닌-사이토신-사이토신;5'로부터 3'의 방향으로)를 포함해도 좋다. 이 경우, XXa3의 염기서열은 XXs와 상보적으로 되도록 링커와 인접해서 GGU(구아닌-구아닌-우라실;5'로부터 3'의 방향으로)를 포함한다. 일실시형태에서는 XXa1의 염기서열은 3' 말단에 염기 우라실(U) 또는 아데닌(A)을 포함해도 좋다. XXa3 및 XXs는 바람직하게는 1∼7 염기길이이며, 예를 들면 1∼4 염기길이, 1 염기길이 또는 2 염기길이이다. 일실시형태에서는 YYs가 26∼28 염기길이의 경우, XXa3 및 XXs는 1 염기길이이어도 좋다.
본 발명에 있어서, Ya3은 Ys와 상보적이다. 일실시형태에서는 Ya3의 염기서열은 링커와 인접해서 C(사이토신)를 포함해도 좋다. 이 경우, Ys의 염기서열은 Ya3과 상보적으로 되도록 링커와 인접해서 G(구아닌)를 포함한다. Ya3 및 Ys는 바람직하게는 1∼7 염기길이이며, 예를 들면 1∼4 염기길이, 1 염기길이 또는 2 염기길이이다. 일실시형태에서는 Xs가 26∼28 염기길이의 경우, Ya3 및 Ys는 1 염기길이이어도 좋다.
본 발명에 있어서, YYa는 YYs 내의 대응하는 잔기 또는 서열과 상보적이다. 일실시형태에서는 YYa의 염기서열은 링커와 인접해서 C(사이토신)를 포함해도 좋다. 이 경우, YYs의 염기서열은 YYa와 상보적으로 되도록 링커와 인접해서 G(구아닌)를 포함한다. YYa는 2∼20 염기길이이어도 좋고, 예를 들면 2∼15 염기길이, 3∼10 염기길이, 3∼6 염기길이, 5∼12 염기길이 또는 9∼12 염기길이이어도 좋다.
본 발명에 있어서, 「상보적」이란 2개의 핵산 또는 뉴클레오티드가 그 사이에서 안정된 염기대합을 형성할 수 있는 것을 의미한다. 상보적인 2개의 핵산은 같은 염기길이를 갖는다. 상보적인 2개의 핵산은 전형적으로는 서로의 상보 서열(상보쇄)로 이루어지고, 즉, 완전히 상보적이다. 또는 상보적인 2개의 핵산은 수식 염기와, 그것과 염기대를 형성할 수 있는 핵산 염기를 어닐링시에 대응하는 위치에 각각 함유해도 좋다.
Ya2는 라이게이션후의 본 발명에 따른 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자가 분자내 어닐링(자기 어닐링)을 발생할 때에, Xs 및 Ys 어느 것과도 염기대합을 형성하지 않는다. Ya2는 바람직하게는 1∼4 염기길이이며, 예를 들면 1, 2, 또는 3 염기길이이다. 마찬가지로, XXa2는 라이게이션후의 본 발명에 따른 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자가 분자내 어닐링(자기 어닐링)을 발생할 때에, XXs 및 YYs 어느 것과도 염기대합을 형성하지 않는다. XXa2는 바람직하게는 1∼4 염기길이이며, 예를 들면 1, 2, 또는 3 염기길이이다.
제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자 (스트랜드 1)에 있어서, 식(I) 중의 Xs와 Xa의 합계 염기길이(비뉴클레오티드성 링커, 뉴클레오티드성 링커, 또는 이들의 조합 등의 링커 부분은 포함하지 않는다)는 바람직하게는 21∼48 염기길이이며, 예를 들면 21∼45 염기길이, 25∼45 염기길이, 26∼35 염기길이, 26∼30 염기길이, 26∼28 염기길이 또는 33∼36 염기길이이다.
제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자 (스트랜드 2)에 있어서, 식(II) 중의 Ya1은 바람직하게는 6∼27 염기길이이며, 예를 들면 7∼25 염기길이, 10∼25 염기길이, 12∼23 염기길이, 12∼22 염기길이, 12∼15 염기길이 또는 18∼23 염기길이이다.
제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자 (스트랜드 2)에 있어서, 식(II) 중의 Ya1, Ya2, Ya3, 및 Ys의 합계 염기길이(비뉴클레오티드성 링커, 뉴클레오티드성 링커, 또는 이들의 조합 등의 링커 부분은 포함하지 않는다)는 바람직하게는 13∼45 염기길이이며, 예를 들면 13∼43 염기길이, 15∼41 염기길이, 15∼30 염기길이, 17∼25 염기길이 또는 20∼25 염기길이이다.
제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자 (스트랜드 1)에 있어서, 식(A) 중의 XXs, XXa3, XXa2, 및 XXa1의 합계 염기길이(비뉴클레오티드성 링커, 뉴클레오티드성 링커, 또는 이들의 조합 등의 링커 부분은 포함하지 않는다)는 바람직하게는 13∼45 염기길이이며, 예를 들면 13∼43 염기길이, 15∼41 염기길이, 15∼30 염기길이, 17∼25 염기길이 또는 20∼25 염기길이이다.
XXa1은 바람직하게는 6∼27 염기길이이며, 예를 들면 7∼25 염기길이, 10∼25 염기길이, 12∼23 염기길이, 12∼22 염기길이, 12∼15 염기길이 또는 18∼23 염기길이이다.
제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자 (스트랜드 2)에 있어서, 식(B) 중의 YYa와 YYs의 합계 염기길이(비뉴클레오티드성 링커, 뉴클레오티드성 링커, 또는 이들의 조합 등의 링커 부분은 포함하지 않는다)는 바람직하게는 21∼48 염기길이이며, 예를 들면 21∼45 염기길이, 25∼45 염기길이, 26∼35 염기길이, 26∼30 염기길이, 26∼28 염기길이 또는 33∼36 염기길이이다.
본 발명에 있어서, 링커, 예를 들면 제 1 링커 및 제 2 링커는 특별히 한정되지 않지만, 각각 독립적으로, 예를 들면 비뉴클레오티드성 링커, 뉴클레오티드성 링커, 또는 이들의 조합이어도 좋다. 뉴클레오티드성 링커는 1개 이상의 뉴클레오티드 잔기(리보뉴클레오티드 잔기 또는 디옥시리보뉴클레오티드 잔기, 바람직하게는 리보뉴클레오티드 잔기)로 이루어진다. 비뉴클레오티드성 링커는 뉴클레오티드 잔기를 포함하지 않는다. 본 발명에 있어서 사용하는 링커의 구성단위는 특별히 한정되지 않고, 뉴클레오티드 잔기 및/또는 비뉴클레오티드 잔기이어도 좋다. 비뉴클레오티드성 링커와 뉴클레오티드성 링커의 조합인 링커는 뉴클레오티드 잔기와 비뉴클레오티드 잔기 양쪽을 포함한다. 본 발명의 링커는 예를 들면, 이하의 (1)∼(7) 중 어느 하나의 잔기로 구성될 수 있다.
(1)비수식 뉴클레오티드 잔기
(2)수식 뉴클레오티드 잔기
(3)비수식 뉴클레오티드 잔기와 수식 뉴클레오티드 잔기의 조합
(4)비뉴클레오티드 잔기
(5)비뉴클레오티드 잔기와 비수식 뉴클레오티드 잔기의 조합
(6)비뉴클레오티드 잔기와 수식 뉴클레오티드 잔기의 조합
(7)비뉴클레오티드 잔기, 비수식 뉴클레오티드 잔기 및 수식 뉴클레오티드 잔기의 조합
일실시형태에서는 제 1 링커 및 제 2 링커의 양쪽이 뉴클레오티드 잔기로 이루어지는 것(뉴클레오티드성 링커)이어도 좋고, 또는 비뉴클레오티드 잔기로 이루어지는 것(비뉴클레오티드성 링커)이어도 좋다. 또는 제 1 링커 및 제 2 링커의 한쪽이 뉴클레오티드 잔기로 이루어지고, 다른쪽이 비뉴클레오티드 잔기로 이루어지는 것이어도 좋다. 제 1 링커 및 제 2 링커(상기 식 중, Lx1 및 Lx2의 링커)는 같은 구조이어도 좋고, 다른 구조이어도 좋다.
본 발명에 있어서 사용하는 링커, 예를 들면 제 1 링커 및 제 2 링커(상기 식 중, Lx1 및 Lx2)가 비뉴클레오티드 잔기를 포함할 경우, 비뉴클레오티드 잔기의 개수는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 1∼8개, 1∼6개, 1∼4개, 1, 2 또는 3개이어도 좋다. 「비뉴클레오티드 잔기」는 비뉴클레오티드성 링커의 구성단위를 가리킨다. 비뉴클레오티드 잔기는 이하에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 피롤리딘 골격 또는 피페리딘 골격을 갖는 환상 아민 유도체 등이어도 좋다. 비뉴클레오티드 잔기는 예를 들면 후술의 식(III)으로 나타내어지는 구조를 단위(1개)로 하는 것이어도 좋다.
본 발명의 일실시형태에 있어서, 링커, 예를 들면 제 1 링커 및 제 2 링커(상기 식 중, Lx1 및 Lx2)는 피롤리딘 골격 및 피페리딘 골격 중 적어도 한쪽을 1개 이상 포함하는 비뉴클레오티드성 링커이어도 좋다. 제 1 링커 및 제 2 링커(상기 식 중, Lx1 및 Lx2)는 같은 구조이어도 좋고, 다른 구조이어도 좋다. 제 1 링커 및 제 2 링커(상기 식 중, Lx1 및 Lx2)는 각각 독립적으로 피롤리딘 골격을 포함하는 비뉴클레오티드 구조를 가져도 좋고, 피페리딘 골격을 포함하는 비뉴클레오티드 구조를 가져도 좋고, 상기 피롤리딘 골격을 포함하는 비뉴클레오티드 구조와, 상기 피페리딘 골격을 포함하는 비뉴클레오티드 구조의 양쪽을 가져도 좋다. 본 발명의 방법에 의해 제조되는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자는 이러한 링커로 센스쇄와 안티센스쇄가 연결되어 있음으로써, 뉴클레아제 내성이 우수하다.
본 발명의 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자에 있어서, 피롤리딘 골격은 예를 들면 피롤리딘의 5원환을 구성하는 탄소원자가 1개 이상 치환된 피롤리딘 유도체의 골격이어도 좋고, 치환될 경우, 예를 들면 2위치의 탄소원자(C-2) 이외의 탄소원자인 것이 바람직하다. 상기 탄소원자는 예를 들면 질소원자, 산소원자 또는 황원자로 치환되어도 좋다. 피롤리딘 골격은 예를 들면 피롤리딘의 5원환내에, 예를 들면 탄소-탄소 이중결합 또는 탄소-질소 이중결합을 포함해도 좋다. 상기 피롤리딘 골격에 있어서, 피롤리딘의 5원환을 구성하는 탄소원자 및 질소원자는 예를 들면 수소원자가 결합해도 좋고, 후술하는 것치환기가 결합해도 좋다. 링커 Lx1은 예를 들면 상기 피롤리딘 골격 중 어느 하나의 기를 통해, 식(I)에 있어서의 Xs와 Xa, 및 식(A)에 있어서의 XXs와 XXa3을 연결해도 좋다. 링커 Lx2는 예를 들면 상기 피롤리딘 골격 중 어느 하나의 기를 통해, 식(II)에 있어서의 Ya3과 Ys, 및 식(B)에 있어서의 YYa와 YYs를 연결해도 좋다. 이들은 상기 5원환 중 어느 하나의 탄소원자와 질소원자, 바람직하게는 상기 5원환의 2위치의 탄소원자(C-2)와 질소원자를 통해 연결될 수 있다. 상기 피롤리딘 골격으로서는 예를 들면 프롤린 골격, 프롤리놀 골격 등을 들 수 있다.
상기 피페리딘 골격은 예를 들면 피페리딘의 6원환을 구성하는 탄소가 1개 이상 치환된 피페리딘 유도체의 골격이어도 좋고, 치환될 경우, 예를 들면 C-2의 탄소원자 이외의 탄소원자인 것이 바람직하다. 상기 탄소원자는 예를 들면 질소원자, 산소원자 또는 황원자로 치환되어도 좋다. 상기 피페리딘 골격은 예를 들면 피페리딘의 6원환내에, 예를 들면 탄소-탄소 이중결합 또는 탄소-질소 이중결합을 포함해도 좋다. 상기 피페리딘 골격에 있어서, 피페리딘의 6원환을 구성하는 탄소원자 및 질소원자는 예를 들면 수소원자가 결합해도 좋고, 후술하는 치환기가 결합해도 좋다. 링커 Lx1은 예를 들면 상기 피페리딘 골격 중 어느 하나의 기를 통해, 식(I)에 있어서의 Xs와 Xa, 및 식(A)에 있어서의 XXs와 XXa3을 연결해도 좋다. 링커 Lx2는 예를 들면 상기 피페리딘 골격 중 어느 하나의 기를 통해, 식(II)에 있어서의 Ya3과 Ys, 및 식(B)에 있어서의 YYa와 YYs를 연결해도 좋다. 이들은 상기 6원환 중 어느 하나의 탄소원자와 질소원자, 바람직하게는 상기 6원환의 2위치의 탄소원자(C-2)와 질소원자를 통해 연결될 수 있다.
상기 링커는 예를 들면 상기 비뉴클레오티드 구조로 이루어지는 비뉴클레오티드 잔기만을 포함하는 것일 수 있다.
상기 링커 영역은 예를 들면 하기 식(III)으로 나타내어지거나, 또는 하기 식(III)으로 나타내어지는 비뉴클레오티드 잔기를 1개 또는 2개 이상 포함하는 것이어도 좋다.
상기 식(III) 중,
x1 및 x2는 각각 독립적으로 H2, O, S 또는 NH이며;
Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 단결합, CH2, NH, O 또는 S이며;
R3은 환 A 상의 C-3, C-4, C-5 또는 C-6에 결합하는 수소원자 또는 치환기이며,
L1은 n개의 원자로 이루어지는 알킬렌쇄이며, 여기에서, 알킬렌 탄소원자 상의 수소원자는 OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH, 또는 SRa로 치환되어도 치환되어 있지 않아도 좋고, 또는
L1은 상기 알킬렌쇄의 하나 이상의 탄소원자가 산소원자로 치환된 폴리에테르쇄이며,
여기에서, Y1이 NH, O 또는 S의 경우, Y1에 결합하는 L1의 원자는 탄소이며, OR1에 결합하는 L1의 원자는 탄소이며, 산소원자끼리는 인접하지 않고;
L2는 m개의 원자로 이루어지는 알킬렌쇄이며, 여기에서, 알킬렌 탄소원자 상의 수소원자는 OH, ORc, NH2, NHRc, NRcRd , SH 또는 SRc로 치환되어도 치환되어 있지 않아도 좋고, 또는
L2는 상기 알킬렌쇄의 하나 이상의 탄소원자가 산소원자로 치환된 폴리에테르쇄이며,
여기에서, Y2가 NH, O 또는 S의 경우, Y2에 결합하는 L2의 원자는 탄소이며, OR2에 결합하는 L2의 원자는 탄소이며, 산소원자끼리는 인접하지 않고;
Ra, Rb, Rc 및 Rd는 각각 독립적으로 치환기 또는 보호기이며;
l은 1 또는 2가며;
m은 0∼30의 범위의 정수이며;
n은 0∼30의 범위의 정수이며;
환 A는 환 A 상의 C-2 이외의 1개의 탄소원자가 질소원자, 산소원자, 황원자로 치환되어도 좋고,
환 A 내에 탄소-탄소 이중결합 또는 탄소-질소 이중결합을 포함해도 좋고,
여기에서, R1 및 R2는 존재해도 존재하지 않아도 좋고, 존재할 경우, R1 및 R2는 각각 독립적으로 R1 및 R2가 존재하지 않는 식(III)으로 나타내어지는 비뉴클레오티드 잔기이다.
식(I)에 있어서의 Xs와 Xa, 식(A)에 있어서의 XXs와 XXa3은 식(III) 중의 -OR1- 또는 -OR2-를 통해, 링커 Lx1과 연결할 수 있다. 일실시형태에서는 Xs가 -OR1-을 통해, Xa가 -OR2-를 통해 링커 Lx1과 연결해도 좋다. 다른 실시형태에서는 Xs가 -OR2-를 통해, Xa가 -OR1-을 통해 링커 Lx1과 연결해도 좋다. 다른 실시형태에서는 XXs가 -OR1-을 통해, XXa3이 -OR2-를 통해 링커 Lx1과 연결해도 좋다. 다른 실시형태에서는 XXs가 -OR2-를 통해, XXa3이 -OR1-을 통해 링커 Lx1과 연결해도 좋다.
식(II)에 있어서의 Ya3과 Ys, 식(B)에 있어서의 YYa와 YYs는 식(III) 중의 -OR1- 또는 -OR2-를 통해 링커 Lx2와 연결할 수 있다. 일실시형태에서는 Ya3이 -OR1-을 통해, Ys가 -OR2-를 통해 링커 Lx2와 연결해도 좋다. 다른 실시형태에서는 Ya3이 -OR2-를 통해, Ys가 -OR1-을 통해 링커 Lx2와 연결해도 좋다. 다른 실시형태에서는 YYa가 -OR1-을 통해, YYs가 -OR2-를 통해 링커 Lx2와 연결해도 좋다. 다른 실시형태에서는 YYa가 -OR2-를 통해, YYs가 -OR1-을 통해 링커 Lx2와 연결해도 좋다.
바람직한 일실시형태에서는 Xs가 -OR2-를 통해, Xa가 -OR1-을 통해 링커 Lx1과 연결하고, 또한 Ya3이 -OR2-를 통해, Ys가 -OR1-을 통해 링커 Lx2와 연결해도 좋다. 바람직한 다른 실시형태에서는 XXs가 -OR2-를 통해, XXa3이 -OR1-을 통해 링커 Lx1과 연결하고, 또한 YYa가 -OR2-를 통해, YYs가 -OR1-을 통해 링커 Lx2와 연결해도 좋다.
상기 식(III) 중, x1 및 x2는 예를 들면 각각 독립적으로 H2, O, S 또는 NH이다. 상기 식(III) 중에 있어서, X1이 H2이다란 X1이 X1의 결합하는 탄소원자와 함께, CH2(메틸렌기)를 형성하는 것을 의미한다. X2에 대해서도 마찬가지이다.
상기 식(III) 중, Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 단결합, CH2, NH, O 또는 S이다.
상기 식(III) 중, 환 A에 있어서, l은 1 또는 2이다. l=1의 경우, 환 A는 5원환이며, 예를 들면 상기 피롤리딘 골격이다. 상기 피롤리딘 골격은 예를 들면 프롤린 골격, 프롤리놀 골격 등을 들 수 있고, 이들의 2가의 구조를 예시할 수 있다. l=2의 경우, 환 A는 6원환이며, 예를 들면 상기 피페리딘 골격이다. 환 A는 환 A 상의 C-2 이외의 1개의 탄소원자가 질소원자, 산소원자 또는 황원자로 치환되어도 좋다. 또한 환 A는 환 A 내에 탄소-탄소 이중결합 또는 탄소-질소 이중결합을 포함해도 좋다. 환 A는 예를 들면 L형 및 D형 어느 것이라도 좋다.
상기 식(III) 중, R3은 환 A 상의 C-3, C-4, C-5 또는 C-6에 결합하는 수소원자 또는 치환기이다. R3이 상기 치환기의 경우, 치환기 R3은 1이어도 복수이어도, 존재하지 않아도 좋고, 복수의 경우, 동일해도 달라도 좋다.
치환기 R3은 예를 들면 할로겐, OH, OR4, NH2, NHR4, NR4R5, SH, SR4 또는 옥소기(=O) 등이다.
R4 및 R5는 예를 들면 각각 독립적으로 치환기 또는 보호기이며, 동일해도 달라도 좋다. 상기 치환기는 예를 들면 할로겐, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알킬알킬, 시크릴알킬, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 아미노알킬, 헤테로시크릴알케닐, 헤테로시크릴알킬, 헤테로아릴알킬, 실릴, 실릴옥시알킬 등을 들 수 있다. 이하, 동일하다. 치환기 R3은 이들의 열거하는 치환기이어도 좋다.
상기 보호기는 예를 들면 반응성이 높은 관능기를 불활성으로 변환하는 관능기이며, 공지의 보호기 등을 들 수 있다. 상기 보호기는 예를 들면 문헌(J. F. W. McOmie, 「Protecting Groups in Organic Chemistry」 Plenum Press, London and New York, 1973)의 기재를 원용할 수 있다. 상기 보호기는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 tert-부틸디메틸실릴기(TBDMS), 비스(2-아세톡시에틸옥시)메틸기(ACE), 트리이소프로필실릴옥시메틸기(TOM), 1-(2-시아노에톡시)에틸기(CEE), 2-시아노에톡시메틸기(CEM) 및 톨릴술포닐에톡시메틸기(TEM), 디메톡시트리틸기(DMTr) 등을 들 수 있다. R3이 OR4의 경우, 상기 보호기는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면TBDMS기, ACE기, TOM기, CEE기, CEM기 및 TEM기 등을 들 수 있다. 이 외에도, 실릴 함유기도 들 수 있다. 이하, 동일하다.
상기 식(III) 중, L1은 n개의 원자로 이루어지는 알킬렌쇄이다. 상기 알킬렌 탄소원자 상의 수소원자는 예를 들면 OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH, 또는 SRa로 치환되어도 좋고, 치환되어 있지 않아도 좋다. 또는 L1은 상기 알킬렌쇄의 1개 이상의 탄소원자가 산소원자로 치환된 폴리에테르쇄이어도 좋다. 상기 폴리에테르쇄는 예를 들면 폴리에틸렌글리콜이다. 또, Y1이 NH, O 또는 S인 경우, Y1에 결합하는 L1의 원자는 탄소이며, OR1에 결합하는 L1의 원자는 탄소이며, 산소원자끼리는 인접하지 않는다. 즉, 예를 들면 Y1이 O인 경우, 그 산소원자와 L1의 산소원자는 인접하지 않고, OR1의 산소원자와 L1의 산소원자는 인접하지 않는다.
상기 식(III) 중, L2는 m개의 원자로 이루어지는 알킬렌쇄이다. 상기 알킬렌 탄소원자 상의 수소원자는 예를 들면 OH, ORc, NH2, NHRc, NRcRd, SH 또는 SRc로 치환되어도 좋고, 치환되어 있지 않아도 좋다. 또는 L2는 상기 알킬렌쇄의 1개 이상의 탄소원자가 산소원자로 치환된 폴리에테르쇄이어도 좋다. 또, Y2가 NH, O 또는 S의 경우, Y2에 결합하는 L2의 원자는 탄소이며, OR2에 결합하는 L2의 원자는 탄소이며, 산소원자끼리는 인접하지 않는다. 즉, 예를 들면 Y2가 O의 경우, 그 산소원자와 L2의 산소원자는 인접하지 않고, OR2의 산소원자와 L2의 산소원자는 인접하지 않는다.
L1의 n 및 L2의 m은 특별히 제한되지 않고, 각각, 하한은 예를 들면 0이며, 상한도 특별히 제한되지 않는다. n 및 m은 예를 들면 링커 Lx1 및 Lx2의 소망의 길이에 따라 적당하게 설정할 수 있다. n 및 m은 예를 들면 제조 비용 및 수율 등의 점으로부터 각각 0∼30이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0∼20이며, 더욱 바람직하게는 0∼15이다. n과 m은 동일해도 좋고(n=m), 달라도 좋다. n+m은 예를 들면 0∼30이며, 바람직하게는 0∼20이며, 보다 바람직하게는 0∼15이다.
Ra, Rb, Rc 및 Rd는 예를 들면 각각 독립적으로 치환기 또는 보호기이다. 상기 치환기 및 상기 보호기는 예를 들면 상술과 동일하다.
상기 식(III)에 있어서, 수소원자는 예를 들면 각각 독립적으로 Cl, Br, F 및 I 등의 할로겐으로 치환되어도 좋다.
바람직한 실시형태에서는 상기 링커는 하기 식(IV-1)∼(IV-9) 중 어느 하나로 나타내어지는 것이거나, 또는 하기 식(IV-1)∼(IV-9)로 나타내어지는 비뉴클레오티드 잔기를 1개 또는 2개 이상 포함하는 것이어도 좋다. 하기 식에 있어서, q는 0∼10의 정수이다. 하기 식에 있어서, n 및 m은 상기 식(III)과 동일하다. 구체예로서는 식(IV-1)에 있어서 n=8, 식(IV-2)에 있어서 n=3, 식(IV-3)에 있어서 n=4 또는 8, 식(IV-4)에 있어서 n=7 또는 8, 식(IV-5)에 있어서 n=3 및 m=4, 식(IV-6)에 있어서 n=8 및 m=4, 식(IV-7)에 있어서 n=8 및 m=4, 식(IV-8)에 있어서 n=5 및 m=4, 식(IV-9)에 있어서 q=1 및 m=4를 들 수 있다.
일실시형태에서는 상기 링커는 하기 식(V) 또는 (VI)으로 나타내어지는 것이거나, 또는 하기 식(V) 또는 (VI)으로 나타내어지는 비뉴클레오티드 잔기를 1개 또는 2개 이상 포함하는 것이어도 좋다.
일실시형태에서는 제 1 RNA 부분(Xs, XXs)은 식(VI) 중의 2위치 탄소원자측에서, 제 2 RNA 부분(Xa, XXa3)은 식(VI) 중의 1위치 질소원자측에서 링커 Lx1과 연결하고, 제 3 RNA 부분(Ya3, YYa)은 2위치 탄소원자측에서, 제 4 RNA 부분(Ys, YYs)은 식(VI) 중의 1위치 질소원자측에서 링커 Lx2와 연결하고 있어도 좋다.
식(VI)으로 나타내어지는 링커는 하기 식(VI-1) 또는 (VI-2)로 나타내어지는 광학 활성체이어도 좋다.
제 1 및 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자에 있어서, Xa는 Xs의 3'측 영역과 상보적이며, Ya3은 Ys와 상보적이다. 이 때문에, 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자에 있어서, Xa는 Xs를 향해서 리턴하고, Xa는 Xs와 자기 어닐링에 의해, 2중쇄를 형성한다. 마찬가지로 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자에 있어서, Ys는 Ya3을 향해서 리턴하고, Ys는 Ya3과 자기 어닐링에 의해, 2중쇄를 형성한다.
제 1 및 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자에 있어서, YYa는 YYs의 5'측 영역과 상보적이며, XXa3은 XXs와 상보적이다. 이 때문에, 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자에 있어서, XXa3은 XXs를 향해서 리턴하고, XXa3은 XXs와 자기 어닐링에 의해, 2중쇄를 형성한다. 마찬가지로 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자에 있어서, YYa는 YYs를 향해서 리턴하고, YYa는 YYs와 자기 어닐링에 의해, 2중쇄를 형성한다.
상기와 같은 링커는 β턴 구조를 형성하기 쉽다. 그 때문에 식(I)의 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자는 링커 Lx1에 의해 β턴측에서 리턴 구조를 취하고, 그것에 의해 Xa가 Xs와 자기 어닐링할 때에 Xa의 3' 말단이 식(II)의 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 5' 말단(Ya1의 5' 말단)에 접근하기 쉬운 구조를 취한다고 생각된다. 식(A) 및 (B)의 제 1 및 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자에 대해서도 동일하다.
다른 실시형태에 있어서, 링커, 예를 들면 제 1 링커 및 제 2 링커(상기 식 중, Lx1 및 Lx2)는 1개 이상의 뉴클레오티드 잔기로 이루어지는 뉴클레오티드성 링커이어도 좋다. 링커가 뉴클레오티드성 링커인 경우, 그 길이는 특별히 한정되지 않지만, 링커의 전후의 서열, 예를 들면 제 1 RNA 부분과 제 2 RNA 부분, 또는 제 3 RNA 부분과 제 4 RNA 부분에 의한 2중쇄 형성을 방해하지 않는 길이인 것이 바람직하다. 뉴클레오티드성 링커인 제 1 링커 및 제 2 링커(상기 식 중, Lx1 및 Lx2)의 길이(염기수) 및 염기서열은 같아도 달라도 좋다. 그 뉴클레오티드성 링커의 길이는 예를 들면 1 염기 이상, 2 염기 이상, 또는 3염기 이상이어도 좋고, 또한, 예를 들면 100염기 이하, 80염기 이하, 또는 50염기 이하이어도 좋다. 그러한 뉴클레오티드성 링커의 길이는 예를 들면 1∼50염기, 1∼30염기, 3∼20염기, 3∼10염기, 또는 3∼7염기이어도 좋고, 예를 들면 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10염기이어도 좋다. 뉴클레오티드성 링커는 자기 상보적이 아닌 서열 내부에 있어서 자기 어닐링을 발생하지 않는 구조인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서 사용하는 링커, 예를 들면 제 1 링커 및 제 2 링커(상기 식 중, Lx1 및 Lx2)가 비수식 뉴클레오티드 잔기와 수식 뉴클레오티드 잔기(예를 들면 수식 리보뉴클레오티드 잔기)를 포함할 경우, 수식 뉴클레오티드 잔기의 개수는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 1∼5개, 1∼4개, 1∼3개, 예를 들면 1개 또는 2개이어도 좋다.
본 발명에 있어서 사용하는 뉴클레오티드성 링커의 예로서, 5'-C-A-C-A-C-C-3', 5'-C-C-A-C-A-C-C-3', 또는 5'-U-U-C-G-3'의 RNA 서열로 이루어지는 링커를 들 수 있다. 일실시형태에서는 제 1 링커 및 제 2 링커(상기 식 중, Lx1 및 Lx2)는 각각 독립적으로 5'-C-A-C-A-C-C-3', 5'-C-C-A-C-A-C-C-3', 및 5'-U-U-C-G-3'로부터 선택된다. 일실시형태에서는 제 1 링커는 5'-C-A-C-A-C-C-3'의 RNA 서열로 이루어지고, 제 2 링커는 5'-U-U-C-G-3'의 RNA 서열로 이루어진다.
제 1 및 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자는 당업자에게 공지의 RNA 합성법을 이용하여 제작할 수 있다. 당업자에게 공지의 RNA 합성법으로서는 예를 들면 포스포로아미다이트법이나 H-포스포네이트법 등을 들 수 있다. 포스포로아미다이트법에서는 담체의 소수성 기에 결합한 리보뉴클레오시드를 RNA 아미다이트(리보뉴클레오시드포스포로아미다이트)와의 축합반응에 의해 신장하고, 산화와 탈보호를 거쳐 RNA 아미다이트와의 축합반응을 반복하여 행함으로써, RNA 합성을 행할 수 있다. 식(I) 및 (II)의 제 1 및 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 예로 들어서 설명하면 본 발명에 따른 제 1 및 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자는 RNA 합성법, 예를 들면 포스포로아미다이트법에 의해, 3' 말단측으로부터 링커의 전방까지의 서열(Xa, Ys)의 합성을 행한 후, 피롤리딘 골격 또는 피페리딘 골격을 갖는 환상 아민 유도체와 같은 비뉴클레오티드 잔기를 결합해서 링커를 형성하고, 그 말단에 또한 링커로부터 5' 말단까지의 서열(Xs; 또는 Ya3, Ya2, 및 Ya1)의 합성을 순차 행함으로써, 제작할 수 있다. 또는 본 발명에 따른 제 1 및 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자는 RNA 합성법, 예를 들면 포스포로아미다이트법에 의해, 3' 말단측으로부터 뉴클레오티드성 링커의 전방까지의 서열(Xa, Ys)의 합성을 행하고, 계속해서 뉴클레오티드성 링커의 서열을 합성하고, 또한 뉴클레오티드성 링커의 뒤부터 5' 말단까지의 서열(Xs; 또는 Ya3, Ya2, 및 Ya1)의 합성을 순차 행함으로써, 제작할 수 있다. 비뉴클레오티드성 링커와 뉴클레오티드성 링커의 조합을 사용할 경우, 및 식(A) 및 (B)의 제 1 및 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 사용할 경우도 상기 방법에 준해서 제작할 수 있다. 본 발명에서는 임의의 RNA 아미다이트를 사용할 수 있고, 예를 들면 2위치의 수산기에 t-부틸디메틸실릴(TBDMS), 트리이소프로필실릴옥시메틸(TOM), 비스(2-아세톡시에톡시)메틸(ACE)1-(2-시아노에톡시)에틸기(CEE), 2-시아노에톡시메틸기(CEM), 톨릴술포닐에톡시메틸기(TEM), 디메톡시트리틸기(DMTr) 등의 여러가지 보호기를 갖는 범용형 RNA 아미다이트도 사용할 수 있다. 또 본 발명에서는 RNA 합성에 있어서, 폴리스티렌계 담체, 아크릴아미드계 담체, 또는 유리 담체 등의 임의의 고상 담체를 사용할 수 있다. 담체는 비즈, 플레이트, 칩, 튜브 등의 임의의 형태이어도 좋다. 담체의 예로서, 폴리스티렌비즈, 예를 들면 NittoPhase(R） HL rG(ibu), 또는 rU(KINOVATE)를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
상기 링커 중, 비뉴클레오티드성 링커를 형성하기 위한 환상 아민 유도체는 RNA 합성용 모노머로서, 예를 들면 하기 식(VII)의 구조를 갖는다. 이 환상 아민 유도체는 기본적으로 상기 각 링커 구조와 대응하고 있고, 링커 구조에 대한 설명은 이 환상 아민 유도체에도 원용된다. 링커를 형성하는 환상 아민 유도체는 예를 들면 자동 핵산 합성용 아미다이트로서 사용할 수 있고, 예를 들면 일반적인 핵산 자동 합성 장치에 적용 가능하다.
상기 식(VII) 중,
X1 및 X2는 각각 독립적으로 H2, O, S 또는 NH이며;
Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 단결합, CH2, NH, O 또는 S이며;
R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, 보호기 또는 인산 보호기이며;
R3은 환 A 상의 C-3, C-4, C-5 또는 C-6에 결합하는 수소원자 또는 치환기이며;
L1은 n개의 원자로 이루어지는 알킬렌쇄이며, 여기에서, 알킬렌 탄소원자 상의 수소원자는 OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH, 또는 SRa로 치환되어도 치환되어 있지 않아도 좋고, 또는,
L1은 상기 알킬렌쇄의 하나 이상의 탄소원자가 산소원자로 치환된 폴리에테르쇄이며,
여기에서, Y1이 NH, O 또는 S의 경우, Y1에 결합하는 L1의 원자는 탄소이며, OR1에 결합하는 L1의 원자는 탄소이며, 산소원자끼리는 인접하지 않고;
L2는 m개의 원자로 이루어지는 알킬렌쇄이며, 여기에서, 알킬렌 탄소원자 상의 수소원자는 OH, ORc, NH2, NHRc, NRcRd, SH 또는 SRc로 치환되어도 치환되어 있지 않아도 좋고, 또는,
L2는 상기 알킬렌쇄의 하나 이상의 탄소원자가 산소원자로 치환된 폴리에테르쇄이며,
여기에서, Y2가 NH, O 또는 S의 경우, Y2에 결합하는 L2의 원자는 탄소이며, OR2에 결합하는 L2의 원자는 탄소이며, 산소원자끼리는 인접하지 않고;
Ra, Rb, Rc 및 Rd는 각각 독립적으로 치환기 또는 보호기이며;
l은 1 또는 2이며;
m은 0∼30의 범위의 정수이며;
n은 0∼30의 범위의 정수이며;
환 A는 환 A 상의 C-2 이외의 1개의 탄소원자가 질소원자, 산소원자 또는 황원자로 치환되어도 좋고,
환 A 내에 탄소-탄소 이중결합 또는 탄소-질소 이중결합을 포함해도 좋다.
상기 식(VII)에 있어서, 상기 식(III)과 동일 개소에 대해서는 상기 식(III)의 설명을 원용할 수 있다. 구체적으로, 상기 식(VII)에 있어서, 예를 들면 X1, X2, Y1, Y2, R3, L1, L2, l, m, n 및 환 A는 상기 식(III)의 설명을 모두 원용할 수 있다.
상기 식(VII)에 있어서, R1 및 R2는 상술한 바와 같이 각각 독립적으로 H, 보호기 또는 인산 보호기이다.
상기 보호기는 예를 들면 상기 식(III)에 있어서의 설명과 동일하며, 구체예로서, 예를 들면 군 I로부터 선택할 수 있다. 상기 군 I는 예를 들면 디메톡시트리틸(DMTr)기, TBDMS기, ACE기, TOM기, CEE기, CEM기, TEM기, 및, 하기 식에 나타내는 실릴 함유기를 들 수 있고, 그 중에서도, DMTr기 및 상기 실릴 함유기 중 어느 하나인 것이 바람직하다.
상기 인산 보호기는 예를 들면 하기 식으로 나타낼 수 있다.
-P(OR6)(NR7R8)
상기 식에 있어서, R6은 수소원자 또는 임의의 치환기이다. R6은 예를 들면 탄화수소기가 바람직하고, 상기 탄화수소기는 전자흡인기로 치환되어 있어도 좋고, 치환되어 있지 않아도 좋다. R6은 예를 들면 할로겐, 할로알킬, 헤테로아릴, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 아미노알킬, 실릴, 실릴옥시알킬, 헤테로시크릴알케닐, 헤테로시크릴알킬, 헤테로아릴알킬, 및, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아릴알킬, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알킬알킬, 시크릴알킬 등의 탄화수소 등을 들 수 있고, 또한, 전자흡인기로 치환되어 있어도 좋고, 치환되어 있지 않아도 좋다. R6은 구체적으로는 예를 들면 β-시아노에틸기, 니트로페닐에틸기, 메틸기 등을 들 수 있다.
R7 및 R8은 각각, 수소원자 또는 임의의 치환기이며, 동일해도 달라도 좋다. R7 및 R8은 예를 들면 탄화수소기가 바람직하고, 상기 탄화수소기는 또한 임의의 치환기로 치환되어 있어도 좋고, 치환되어 있지 않아도 좋다. 상기 탄화수소기는 예를 들면 상술한 상기 R6에서의 열거와 동일하며, 바람직하게는 메틸기, 에틸기, 이소프로필기이다. 이 경우, -NR7R8은 구체적으로는 예를 들면 디이소프로필아미노기, 디에틸아미노기, 에틸메틸아미노기 등을 들 수 있다. 또는 치환기 R7 및 R8이 일체로 되어 이들이 결합하는 질소원자와 함께(즉, -NR7R8이 일체로 되어서), 질소 함유 환(예를 들면 피페리딜기, 모르폴리노기 등)을 형성해도 좋다.
상기 인산 보호기의 구체예로서는 예를 들면 하기 군 II로부터 선택할 수 있다. 군 II는 예를 들면, -P(OCH2CH2CN)(N(i-Pr)2), -P(OCH3)(N(i-Pr)2) 등을 들 수 있다. 상기 식에 있어서, i-Pr은 이소프로필을 나타낸다.
상기 식(VII)에 있어서, 예를 들면 R1 및 R2는 어느 한쪽이 H 또는 보호기이며, 다른쪽이 H 또는 인산 보호기이다. 바람직하게는 예를 들면 R1이 상기 보호기의 경우, R2는 H 또는 상기 인산 보호기가 바람직하고, 구체적으로는 R1이 상기 군 I로부터 선택될 경우, R2는 H 또는 상기 군 II로부터 선택되는 것이 바람직하다. 또한 바람직하게는 예를 들면, R1이 상기 인산 보호기의 경우, R2는 H 또는 상기 보호기가 바람직하고, 구체적으로는 R1이 상기 군 II로부터 선택될 경우, R2는 H 또는 상기 군 I로부터 선택되는 것이 바람직하다.
상기 환상 아민 유도체는 하기 식(VII-1)∼(VII-9) 중 어느 하나로 나타내어지는 것이어도 좋다. 하기 식에 있어서, n 및 m은 상기 식(VII)과 동일하다. 하기 식에 있어서, q는 0∼10의 정수이다. 구체예로서는 식(VII-1)에 있어서 n=8, 식(VII-2)에 있어서 n=3, 식(VII-3)에 있어서 n=4 또는 8, 식(VII-4)에 있어서 n=7 또는 8, 식(VII-5)에 있어서 n=3 및 m=4, 식(VII-6)에 있어서 n=8 및 m=4, 식(VII-7)에 있어서 n=8 및 m=4, 식(VII-8)에 있어서 n=5 및 m=4, 식(VII-9)에 있어서 q=1 및 m=4를 들 수 있다.
일실시형태에서는 상기 환상 아민 유도체는 하기 식(VIII)로 나타내어지는 프롤리놀 유도체 또는 하기 식(IX)로 나타내어지는 프롤린 유도체로 나타내어지는 것이어도 좋다.
상기 환상 아민 유도체는 예를 들면 표지물질, 예를 들면 안정동위체를 포함해도 좋다.
상기 환상 아민 유도체는 예를 들면 국제공개 WO2013/027843 또는 국제공개WO2016/159374에 기재된 핵산 분자 합성용 모노머의 제조 방법에 따라서 합성할 수 있다.
본 발명의 방법에서는 상기 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자 (예를 들면 도 1 중, 스트랜드 1)와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자 (예를 들면 도 1 중, 스트랜드 2)를 어닐링하고, 라이게이션함으로써, 본 발명에 따른 표적 유전자의 발현을 억제하는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자를 제조할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 제조되는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자에 있어서, 라이게이션 공정에서 발생하는 Xa-Ya1-Ya2-Ya3은 표적 유전자에 대한 유전자 발현 억제 서열을 포함한다. 유전자 발현 억제 서열은 Xa, Xa-Ya1, Xa-Ya1-Ya2, 또는 Xa-Ya1-Ya2-Ya3에 포함되어 있어도 좋다. 마찬가지로, 라이게이션 공정에서 생기는 XXa3-XXa2-XXa1-YYa는 표적 유전자에 대한 유전자 발현 억제 서열을 포함한다. 유전자 발현 억제 서열은 YYa, XXa1-YYa, XXa2-XXa1-YYa, 또는 XXa3-XXa2-XXa1-YYa에 포함되어 있어도 좋다. 유전자 발현 억제 서열은 바람직하게는 표적 유전자로부터 전사되는 mRNA의 전체 또는 일부의 센스 서열 또는 안티센스 서열이다. 또, 라이게이션 공정에서 생기는 Xa-Ya1은 Xs와 상보적인 점에서 Xs도 표적 유전자에 대한 유전자 발현 억제 서열을 포함하고 있어도 좋다. 마찬가지로, XXa1-YYa는 YYs와 상보적인 점에서 YYs도 표적 유전자에 대한 유전자 발현 억제 서열을 포함하고 있어도 좋다.
상기 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자는 유전자 발현 억제 서열을 1개 포함해도 좋고, 2개 이상 포함해도 좋다. 상기 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자는 예를 들면 같은 표적 유전자에 대한 같은 유전자 발현 억제 서열을 2개 이상 가져도 좋고, 같은 표적에 대한 다른 유전자 발현 억제 서열을 2개 이상 가져도 좋고, 다른 표적 유전자에 대한 다른 유전자 발현 억제 서열을 2개 이상 가져도 좋다. 다른 표적 유전자에 대한 유전자 발현 억제 서열을 2개 이상 갖는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자는 2종류 이상의 다른 표적 유전자의 발현 억제에 유용하다. 본 발명에 있어서 「유전자」란 mRNA에 전사되는 게놈 영역을 가리키고, 단백질 코드 영역이어도 좋지만, RNA 코드 영역이어도 좋다.
본 발명에 따른 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자는 유전자 발현 억제 서열을 통해 표적 유전자의 발현을 억제하는 능력을 갖는다. 본 발명에 따른 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자에 의한 표적 유전자의 발현 억제는 RNA 간섭에 의한 것이 바람직하지만, 그것에 한정되지 않는다. RNA 간섭은 일반적으로, 긴 2개쇄 RNA(dsRNA)가 세포내에 있어서, Dicer에 의해, 3' 말단이 돌출한 19∼21 염기대 정도의 짧은 2개쇄 RNA(siRNA:small interfering RNA)로 절단되고, 그 한쪽의 1개쇄 RNA가 표적 mRNA에 결합해서 표적 mRNA를 분해함으로써, 표적 mRNA의 번역을 억제하고, 그것에 의해 표적 mRNA가 유래하는 표적 유전자의 발현을 억제하는 현상이다. 표적 mRNA에 결합하는 siRNA에 포함되는 1개쇄 RNA의 서열은 예를 들면 표적 유전자의 종류에 따라 여러가지 종류가 보고되고 있다. 본 발명은 예를 들면, siRNA에 포함되는 1개쇄 RNA의 서열(바람직하게는 안티센스 서열)을 유전자 발현 억제 서열로서 사용할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 제조되는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자는 in vivo에서 절단되어서 siRNA를 생성함으로써 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 본 발명에 따른 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자는 표적 유전자의 발현 또는 발현증가와 관련되는 질환 또는 장해의 치료 또는 예방을 위해서 사용할 수 있다.
유전자 발현 억제 서열은 바람직하게는 19∼30 염기길이이며, 보다 바람직하게는 19∼27 염기길이이며, 예를 들면 19, 20, 21, 22, 또는 23 염기길이이어도 좋다. 유전자 발현 억제 서열은 표적 유전자의 mRNA 중 적어도 일부의 서열과 완전히 동일 또는 완전히 상보적인 RNA 서열로 이루어지는 것이 바람직하다. 유전자 발현 억제 서열은 표적 유전자의 염기서열에 대해서 상법에 의해 설계할 수 있다.
표적 유전자는 임의의 유전자이어도 좋고, 예를 들면 임의의 질환관련 유전자이어도 좋다. 표적 유전자는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자에 의해 생체, 세포, 조직 또는 기관 등에 있어서 유전자 발현 억제를 초래하는 대상과 같은 생물종에 유래하는 것이 바람직하고, 예를 들면 인간, 침팬지, 고릴라 등의 영장류, 말, 소, 돼지, 양, 염소, 낙타, 당나귀 등의 가축, 개, 고양이, 토끼 등의 애완동물, 마우스, 래트, 몰모트 등의 설치류 등을 포함하는 포유 동물, 어류, 곤충 등의 동물, 식물, 진균 등에 유래하는 것이어도 좋다. 표적 유전자로서는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 TGF-β1 유전자, GAPDH 유전자, LAMA1 유전자, LMNA 유전자를 들 수 있다. 인간 TGF-β1(트랜스포밍 증식인자-β1) 유전자의 mRNA 서열은 예를 들면 GenBank(NCBI) 액세션 번호 NM_000660에 의거하여 입수할 수 있다(NCBI Gene ID:7040). 인간 GAPDH(글리세르알데히드-3-인산 디히드로게나제) 유전자의 mRNA 서열은 예를 들면 GenBank(NCBI) 액세션 번호 NM_002046에 의거하여 입수할 수 있다(NCBI Gene ID:2597). 인간 LAMA1 유전자의 mRNA 서열은 예를 들면 GenBank 액세션 번호 NM_005559에 의거하여 입수할 수 있다(NCBI Gene ID:284217). 인간 LMNA 유전자의 mRNA 서열은 예를 들면 GenBank 액세션 번호 NM_170707에 의거하여 입수할 수 있다(NCBI Gene ID:4000). 표적 유전자가 TGF-β1 유전자일 경우, 본 발명의 방법에 의해 제조되는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자는 in vivo에서 TGF-β1 유전자의 발현을 억제한다. 그러한 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자는 TGF-β1 유전자의 유전자 발현 억제를 통해서, TGF-β1 유전자의 발현 또는 발현증가와 관련되는 질환 또는 장해, 예를 들면 폐선유증이나 급성 폐질환의 치료 또는 예방을 위해서 사용할 수 있다. 마찬가지로, GAPDH 유전자, LAMA1 유전자, LMNA 유전자 등의 다른 표적 유전자의 발현을 억제하는 본 발명에 따른 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자도 상기 표적 유전자의 발현 억제를 통해서, 상기 표적 유전자의 발현 또는 발현 증가와 관련되는 질환 또는 장해의 치료 또는 예방을 위해서 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 제조되는 표적 유전자의 발현을 억제하는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 하나의 예는 서열 번호 1로 나타내어지는 염기서열로 이루어지고, 또한 24번째와 25번째의 뉴클레오티드(리보뉴클레오티드 잔기)가 링커(Lx1)를 통해 연결되고, 50번째와 51번째의 뉴클레오티드(리보뉴클레오티드 잔기)가 링커(Lx2)를 통해 연결되어 있는 RNA 분자이다(예를 들면 도 2). 서열 번호 1로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 그러한 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자는 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 서열 번호 2로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 RNA 서열과, 상기 링커(비뉴클레오티드성 링커, 뉴클레오티드성 링커, 또는 이들의 조합;도 1의 Lx1)와, 서열 번호 3으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 RNA 서열과, 상기 링커(비뉴클레오티드성 링커, 뉴클레오티드성 링커, 또는 이들의 조합;도 1의 Lx2)와, 염기 G(구아닌)를 포함한다. 서열 번호 1로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 상기 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자는 표적 유전자인 TGF-β1 유전자에 대한 유전자 발현 억제 서열을 포함한다. 서열 번호 1로 나타내어지는 염기서열의 29번째∼47번째의 서열이 유전자 발현 억제 서열(활성 서열;서열 번호 50)에 상당하다. 본 발명은 이 유전자 발현 억제 서열을 포함하는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 제조 방법을 제공한다.
그러한 RNA 분자를 제조하기 위한, 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자 (스트랜드 1)와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자 (스트랜드 2)의 예는 후술의 표 1에 열거되어 있다. 표 1에 열거되어 있는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자 (스트랜드 1)와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자 (스트랜드 2)의 서열에 있어서, P(프롤린 유도체)를 포함하는 링커는 상기 다른 비뉴클레오티드성 링커 또는 뉴클레오티드성 링커 등의 임의의 링커로 치환된 것이어도 좋다. 일실시형태에서는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자는 3' 말단에 우라실(U) 또는 아데닌(A)을 갖는 것이 바람직하고, 또한 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자는 5' 말단에 우라실(U) 또는 아데닌(A)을 갖는 것이 바람직하다.
서열 번호 1로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자를 제조하기 위한 특히 바람직한 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 페어로서는 이하:
(1)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커(Lx1)를 통해 연결되어 있는 서열 번호 7로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 10번째와 11번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커(Lx2)를 통해 연결되어 있는 서열 번호 6으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합,
(2)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커(Lx1)를 통해 연결되어 있는 서열 번호 19로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 16번째와 17번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커(Lx2)를 통해 연결되어 있는 서열 번호 18로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합,
(3)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커(Lx1)를 통해 연결되어 있는 서열 번호 27로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 20번째와 21번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커(Lx2)를 통해 연결되어 있는 서열 번호 26으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합
(4)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커(Lx1)를 통해 연결되어 있는 서열 번호 29로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 21번째와 22번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커(Lx2)를 통해 연결되어 있는 서열 번호 28로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합
(5)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커(Lx1)를 통해 연결되어 있는 서열 번호 31로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 22번째와 23번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커(Lx2)를 통해 연결되어 있는 서열 번호 30으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합, 및
(6)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커(Lx1)를 통해 연결되어 있는 서열 번호 33으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 23번째와 24번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커(Lx2)를 통해 연결되어 있는 서열 번호 32로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합,
을 들 수 있다. 이들의 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자는 3' 말단(Xa의 3' 말단)에 U 또는 A를 포함한다. 이들의 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자는 5' 말단(Ya1의 5' 말단)에 U 또는 A를 포함한다.
여기에서, 예를 들면 (1)의 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자에 대해서, 「24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커(Lx1)를 통해 연결되어 있다」란 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자에 있어서 서열 번호 19로 나타내어지는 염기서열의 24번째의 리보뉴클레오티드 잔기(염기:C)와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기(염기:G)가 제 1 링커 Lx1을 통해 결합하고 있는 것을 의미한다. 또, 본 발명에 있어서의 1개쇄 올리고 RNA 분자 및 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자에 관한 「X번째와 Y번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 Z를 통해 연결되어 있다」라는 표현도 이것에 준해서 해석된다.
(1)∼(6)의 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자에 있어서, 링커 Lx1 및 Lx2는 바람직하게는 식(VI), 예를 들면 식(VI-1) 또는 식(VI-2)로 나타내어지는 것이다.
바람직한 실시형태에서는 (1)∼(6)의 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자는 Lx1 및 Lx2로서 식(VI)으로 나타내어지는 링커를 갖고 있고, 식(I)의 Xa는 식(VI) 중의 1위치 질소원자측에서, Xs는 2위치 탄소원자측에서 링커 Lx1과 연결하고, Ys는 식(VI) 중의 1위치 질소원자측에서, Ya3은 2위치 탄소원자측에서 링커 Lx2와 연결하고 있어도 좋다.
본 발명은 본 발명의 방법에 따라서 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 제조를 위해서 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자 또는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자로서 사용할 수 있는 1개쇄 올리고 RNA 분자를 제공한다.
일실시형태에서는 표적 유전자인 TGF-β1 유전자의 발현을 억제하는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 제조에 사용하는 1개쇄 올리고 RNA 분자의 예로서, 하기 (a)∼(l)을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다:
(a)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 7로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자,
(b)10번째와 11번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 6으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자,
(c)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 19로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자,
(d)16번째와 17번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 18로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자,
(e)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 27로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자,
(f)20번째와 21번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 26으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자,
(g)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 29로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자,
(h)21번째와 22번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 28로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자,
(i)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 31로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자,
(j)22번째와 23번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 30으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자,
(k)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 33으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자, 및
(l)23번째와 24번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 32로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자.
바람직한 실시형태에서는 1개쇄 올리고 RNA 분자 (a) 및 (b); (c) 및 (d); (e) 및 (f); (g) 및 (h); (i) 및 (j); 또는 (k) 및 (l)을 조합해서 본 발명에 따른 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 제조 방법에 사용할 수 있다.
다른 실시형태로서, 본 발명의 방법에 의해 제조되는 GAPDH 유전자, LAMA1 유전자, 또는 LMNA 유전자인 표적 유전자에 대한 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 예가 도 17에 나타내어져 있다. GAPDH 유전자에 대한 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 예는 서열 번호 51로 나타내어지는 염기서열로 이루어지고, 또한 22번째와 23번째의 뉴클레오티드(리보뉴클레오티드 잔기)가 제 1 링커(Lx1)를 통해 연결되고, 48번째와 49번째의 뉴클레오티드(리보뉴클레오티드 잔기)가 제 2 링커(Lx2)를 통해 연결되어 있는 RNA 분자이다. LAMA1 유전자에 대한 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 예는 서열 번호 52로 나타내어지는 염기서열로 이루어지고, 또한 24번째와 25번째의 뉴클레오티드(리보뉴클레오티드 잔기)가 제 1 링커(Lx1)를 통해 연결되고, 50번째와 51번째의 뉴클레오티드(리보뉴클레오티드 잔기)가 제 2 링커(Lx2)를 통해 연결되어 있는 RNA 분자이다. LAMA1 유전자에 대한 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 다른 예는 서열 번호 53으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지고, 또한 24번째와 31번째의 뉴클레오티드(리보뉴클레오티드 잔기)가 뉴클레오티드성 제 1 링커(Lx1)를 통해 연결되고, 56번째와 61번째의 뉴클레오티드(리보뉴클레오티드 잔기)가 뉴클레오티드성 제 2 링커(Lx2)를 통해 연결되어 있는 RNA 분자이다. LMNA 유전자에 대한 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 예는 서열 번호 54로 나타내어지는 염기서열로 이루어지고, 또한 24번째와 25번째의 뉴클레오티드(리보뉴클레오티드 잔기)가 제 1 링커(Lx1)를 통해 연결되고, 50번째와 51번째의 뉴클레오티드(리보뉴클레오티드 잔기)가 제 2 링커(Lx2)를 통해 연결되어 있는 RNA 분자이다. 표적 유전자로서의 GAPDH 유전자, LAMA1 유전자, 또는 LMNA 유전자에 대한 유전자 발현 억제 서열(안티센스 서열; 각각, 서열 번호 55, 56, 57)의 예도 도 17에 나타내어져 있다. 본 발명은 이들의 유전자 발현 억제 서열 중 어느 하나를 포함하는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 제조 방법도 제공한다.
표적 유전자인 GAPDH 유전자의 발현을 억제하는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 제조에 사용하는 1개쇄 올리고 RNA 분자의 예로서, 하기 (m) 및 (n)을 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다:
(m)22번째와 23번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 37로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자, 및
(n)20번째와 21번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 36으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자
바람직한 실시형태에서는 (m) 및 (n)의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 조합해서 본 발명에 따른 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 제조 방법에 사용할 수 있다.
표적 유전자인 LAMA1 유전자의 발현을 억제하는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 제조에 사용하는 1개쇄 올리고 RNA 분자의 예로서, 하기 (o)∼(v)를 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다:
(o)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 39로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자,
(p)16번째와 17번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 38로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자,
(q)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 41로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자,
(r)22번째와 23번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 40으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자,
(s)24번째와 31번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 뉴클레오티드성 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 43으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자,
(t)21번째와 26번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 뉴클레오티드성 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 42로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자,
(u)24번째와 31번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 뉴클레오티드성 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 45로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자, 및
(v)22번째와 27번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 뉴클레오티드성 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 44로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자.
바람직한 실시형태에서는 1개쇄 올리고 RNA 분자 (o) 및 (p); (q) 및 (r); (s) 및 (t); 또는 (u) 및 (v)를 조합해서 본 발명에 따른 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 제조 방법에 사용할 수 있다.
표적 유전자인 LMNA 유전자의 발현을 억제하는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 제조에 사용하는 1개쇄 올리고 RNA 분자의 예로서, 하기 (w)∼(z)를 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다:
(w)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 47로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자,
(x)21번째와 22번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 46으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자,
(y)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 49로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자, 및
(z)23번째와 24번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 48로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자.
바람직한 실시형태에서는 1개쇄 올리고 RNA 분자 (w) 및 (x); 또는 (y) 및 (z)를 조합해서 본 발명에 따른 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 제조 방법에 사용할 수 있다.
1개쇄 올리고 RNA 분자 (a)∼(z)에 있어서의 「링커」는 상기 제 1 링커 또는 제 2 링커에 상당하고, 또 상기 링커를 사용할 수 있다. 1개쇄 올리고 RNA 분자 (s)∼(v) 중의 뉴클레오티드성 링커는 상기 링커(예를 들면 다른 뉴클레오티드성 링커)로 치환되어도 좋다.
본 발명에서는 상기 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자 및 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 라이게이션으로 연결함으로써, 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자를 제조할 수 있다. 상기 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자는 라이게이션 전에 어닐링된다. 어닐링 반응은 수성 매체 중에서 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 혼합함으로써, 야기할 수 있다. 본 발명의 방법에 있어서, 어닐링 공정은 수성 매체(통상은 물 또는 버퍼) 중에서 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 혼합하고, 일정 시간(예를 들면 1∼15분간)에 걸쳐 정치함으로써 행해도 좋고, 정치하지 않고 라이게이션 반응에 사용해도 좋다. 어닐링 공정에서는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 열변성(예를 들면 90℃ 이상의 온도에서의 가열)을 행해도 좋지만, 행하지 않아도 좋다. 열변성을 행할 경우, 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 포함하는 반응액을 예를 들면 열변성 온도(예를 들면 90℃ 이상)에서 가열하고, 이어서 어닐링 온도(전형적으로는 1개쇄 올리고 RNA 분자의 Ya1 서열에 의거하는 Tm값±5℃의 범위의 온도, 예를 들면 55∼60℃)에서 일정 시간 반응시켜서 어닐링시킨 후, 강온(예를 들면 4℃까지)시키면 좋다. 열변성을 행하지 않고 어닐링할 경우, 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 실온(15∼35℃)에서 혼합하고, 일정 시간(예를 들면 1분간∼1시간, 또는 5∼15분간)에 걸쳐 정치함으로써 어닐링 공정을 실시해도 좋다.
일실시형태에서는 본 발명의 어닐링 공정에 있어서, 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자는 반응액 중 등몰량으로 혼합해도 좋다. 본 발명에 있어서 「등몰량으로 혼합한다」란 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 1:1.1∼1.1:1의 몰비로 혼합하는 것을 의미한다.
어닐링 공정후, 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자가 어닐링한 2개쇄 올리고 RNA를 포함하는 어닐링 반응액을 라이게이션에 제공한다. 어닐링 반응액의 일부를 라이게이션 반응액에 첨가해도 좋고, 어닐링 반응액 전량을 이용하여 라이게이션 반응액을 조제해도 좋다. 라이게이션은 효소적인 라이게이션이어도 좋다. 효소적인 라이게이션은 RNA 리가제, 특히, Rnl2 패밀리의 리가제에 의한 라이게이션이어도 좋다.
Rnl2 패밀리의 리가제(Rnl2 패밀리 멤버)는 RNA 닉실링 활성, 즉, RNA의 닉(RNA 2중쇄 또는 RNA-DNA 2중쇄 중의 닉)을 그 3' 수산기(3'-OH) 및 5' 인산기(5'-PO4)를 연결함으로써 메우는(실링하는) 리가제 활성을 갖는 효소이다(예를 들면 Nandakumar J. et al., Cell 127, p.71-84(2006)를 참조). Rnl2 패밀리의 리가제로서는 T4 RNA 리가제 2, 트리파노소마속(예를 들면 Trypanosoma brucei) 및 리슈마니아속(예를 들면 Leishmania tarenotolae)의 RNA 편집 리가제(REL), 비브리오파지 KVP40Rnl2, 폭스윌스 AmEPV 리가제, 바큘로바이러스 AcNPV 리가제, 및 바큘로바이러스 XcGV 리가제, 및 이들의 변이체 또는 수식체 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 이들 리가제는 당업자에게는 잘 알려져 있어, 시판되어 있거나 또는 논문 등의 교시에 따라서 입수할 수 있다. 예를 들면 T4 RNA 리가제 2는 New England Biolabs로부터 시판되고 있다. T4 RNA 리가제 2 단백질은 박테리오파제 T4의 유전자 gp 24.1에 의해 코드되어 있다. T4 RNA 리가제 2의 단리는 예를 들면Nandakumar J. and Shuman S., (2005) J. Biol. Chem., 280:23484-23489; Nandakumar J., et al., (2004) J. Biol. Chem., 279:31337-31347; Nandakumar J. and Shuman S., (2004) Mol. Cell, 16:211-221 등의 기재에 따라서 행할 수 있다. 본 발명에 있어서, 「Rnl2 패밀리의 리가제」는 단리된 천연 리가제에 한정되지 않고, RNA 닉실링 활성을 갖는 한, 재조합 단백질, 돌연변이체, 결손체(말단 절단 형태 등), 펩티드(예를 들면 His, HA, c-Myc, V5, DDDDK 등의 태그) 또는 다른 단백질과의 융합체, 당쇄 부가(그리코실화) 또는 지방질 부가 단백질 등의 수식 단백질 등을 포함한다.
라이게이션 반응액은 라이게이션에 통상 사용하는 성분 또는 그것을 포함하는 버퍼를 이용하여 조제할 수 있다. 라이게이션 반응액은 상기 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자 및 상기 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자에 추가해서, RNA의 라이게이션 반응에 사용할 수 있는 성분, 예를 들면 Tris(트리스)-HCl, 2가 금속이온, 디티오트레이톨(DTT), 및 아데노신 3인산(ATP) 등을 포함해도 좋다. 2가 금속이온으로서는 Mg2+, Mn2+ 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 라이게이션 반응액은 2가 금속이온을, 통상, 염의 형태로 포함하고, 예를 들면 금속염화물(MgCl2, MnCl2 등)을 포함한다.
제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 라이게이션은 RNA 리가제, 또는 RNA끼리의 말단 또는 dsRNA의 닉을 연결하는 활성을 갖는 다른 효소, 특히 Rnl2 패밀리의 리가제를 이용하여 행할 수 있다. RNA 리가제로서는 dsRNA 리가제를 사용할 수 있다. dsRNA 리가제는 2개쇄 RNA(dsRNA)의 닉을 연결하는 활성을 주로 해서 갖는 효소이다. dsRNA 리가제로서는 T4 RNA 리가제 2를 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. T4 RNA 리가제 2는 3'→5' 포스포디에스테르 결합의 형성을 촉매한다.
라이게이션 반응액에 Rnl2 패밀리의 리가제를 첨가하고, 어닐링한 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 2개쇄 올리고 RNA 분자를 Rnl2 패밀리의 리가제와 함께, 라이게이션이 가능한 조건 하에서 인큐베이트함으로써, 2개쇄 올리고 RNA 분자를 구성하는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 3' 말단과 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 5' 말단(안티센스쇄내)을 1개쇄에 라이게이션할 수 있다.
제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 라이게이션은 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 등몰량으로 포함하는 라이게이션 반응액 중에서 행해도 좋다. 본 발명에 있어서 「등몰량으로 포함한다」란 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 1:1.1∼1.1:1의 몰비로 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 방법에서는 라이게이션을 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 각각, 10μM 이상, 40μM 이상, 100μM 이상, 150μM 이상, 200μM 이상, 300μM 이상, 또는 500μM 이상의 농도로 포함하는 라이게이션 반응액 중에서 행해도 좋다. 일실시형태에서는 라이게이션 반응액은 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 각각, 10,000μM 이하로 포함해도 좋고, 예를 들면 1,000μM 이하, 500μM 이하, 또는 300μM 이하의 농도로 포함해도 좋다. 일실시형태에서는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자는 라이게이션 반응액 중에서, 예를 들면 50∼500μM, 100∼300μM, 또는 100∼250μM의 농도로 사용해도 좋다. 일실시형태에서는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 등몰량으로 포함하는 라이게이션 반응액이 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 이러한 농도로 포함한다. 본 발명의 방법에서는 반응액 중의 Rnl2 패밀리의 리가제의 농도(또는 양)에 대해서 제 1 및 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 보다 많은 농도(또는 양)로 사용하고, 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 제조 효율을 증가시킬 수 있다.
일실시형태에서는 라이게이션 반응액은 Rnl2 패밀리의 리가제를 0.01U/μL 이상 포함해도 좋고, 예를 들면 0.01U/μL 이상, 0.08U/μL 이상, 0.2U/μL 이상, 또는 0.35U/μL 이상의 농도로 포함해도 좋다. 라이게이션 반응액은 Rnl2 패밀리의 리가제를 예를 들면 10U/μL 이하, 1U/μL 이하, 또는 0.5U/μL 이하의 농도로 포함해도 좋다. 일실시형태에서는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 등몰량으로 포함하는 라이게이션 반응액이 Rnl2 패밀리의 리가제를 이러한 농도로 포함한다.
일실시형태에서는 라이게이션 반응액은 pH 6.5 이상이어도 좋고, 예를 들면 pH 7.0∼9.0, pH 7.4 이상, pH 7.4∼8.6, pH 7.5∼8.5, 또는 pH 7.5∼8.0이어도 좋다. 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 등몰량으로 포함하는 라이게이션 반응액이 이러한 pH를 갖고 있어도 좋다.
일실시형태에서는 라이게이션 반응액은 1mM 이상, 예를 들면 1∼20mM, 2∼10mM, 3∼6mM, 또는 5mM의 2가 금속이온을 포함한다. 일실시형태에서는 라이게이션 반응액은 1mM 이상, 예를 들면 1∼20mM, 2∼10mM, 3∼6mM, 또는 5mM의 Mg2+ 또는 Mn2+를 포함하고, 예를 들면 상기 농도의 MgCl2를 포함해도 좋다. 일실시형태에서는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 등몰량으로 포함하는 라이게이션 반응액이 2가 금속이온을 이러한 농도로 포함한다.
라이게이션 반응액은 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 다른 첨가 물질을 포함해도 좋다. 폴리에틸렌글리콜로서는 예를 들면 PEG6000, PEG8000, PEG20000 등의 PEG6000∼20000을 사용할 수 있다. 라이게이션 반응액은 폴리에틸렌글리콜을, 예를 들면 3∼30w/v%, 5∼20w/v%, 5∼15w/v% 또는 10∼30w/v%의 양으로 포함해도 좋다. 일실시형태에서는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 등몰량으로 포함하는 라이게이션 반응액이 폴리에틸렌글리콜을 이러한 농도로 포함한다. 일실시형태에서는 그러한 폴리에틸렌글리콜의 첨가를 0.4U/μL 이하, 예를 들면 0.01∼0.4U/μL, 0.08∼0.4U/μL, 또는 0.1U/μL 이상 0.3U/μL 미만의 RNA 리가제를 포함하는 라이게이션 반응액에 있어서 사용해도 좋다.
라이게이션 반응액은 통상은 ATP를 포함한다. 본 발명에 있어서, 라이게이션 반응액은 ATP를, 예를 들면 5mM 이하, 2mM 이하, 1mM 이하, 및/또는 0.1mM 이상, 또는 0.1∼1.5mM의 농도로 포함한다.
일실시형태에서는 라이게이션 반응액은 Tris-HCl을 포함해도 좋고, 예를 들면 10∼70mM Tris-HCl을 포함해도 좋지만, 이 농도에 한정되지 않는다. 라이게이션 반응액은 디티오트레이톨(DTT)을 포함해도 좋고, 예를 들면 0.1∼5mM DTT를 포함해도 좋지만, 이 농도에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, 라이게이션의 반응시간은 본 발명에 따른 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자 및 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 2개쇄 올리고 RNA의 라이게이션 반응에 적합한 시간이면 좋다. 라이게이션 반응은 예를 들면 20분 이상 또는 30분 이상, 1시간 이상, 2시간 이상, 또는 3시간 이상의 반응시간에 걸쳐 행해도 좋다. 본 발명에 있어서의 라이게이션의 반응시간은 4시간 이상, 6시간 이상, 8시간 이상, 10시간 이상, 12시간 이상, 24시간 이상, 또는 48시간 이상이어도 좋다. 본 발명에 있어서, 특히 고농도(예를 들면 100μM 또는 200μM 이상)의 제 1 및 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 포함하는 라이게이션 반응액을 사용할 경우, 보다 장시간에 걸쳐 라이게이션 반응을 행해도 좋다. 예를 들면 라이게이션 반응액이 pH 7.4 이상, pH 7.4∼8.6, pH 7.5∼8.5, 또는 pH 7.5∼pH 8.0을 나타낼 경우에, 보다 장시간(예를 들면 4시간 이상, 12시간 이상, 또는 24시간 이상)의 반응시간을 사용해도 좋다. 특히 고농도의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 사용할 경우에, 그러한 보다 장시간의 반응시간을 사용해도 좋다.
본 발명의 방법에서는 라이게이션 공정을 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 단계적으로 첨가하면서 행해도 좋다. 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자 및 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자에 대해서 「단계적으로 첨가한다」란 라이게이션 공정에 있어서, 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자 및 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 복수회에 걸쳐, 시간적 간격을 두고 반응액에 첨가하는 것을 의미한다. 예를 들면 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자 및 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 라이게이션 반응에 적합한 시간에 걸쳐 RNA 리가제와 함께 인큐베이트한 후, 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자 및 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 추가적으로 첨가해서 더 라이게이션 반응을 행하는 추가 반응 공정을 1회 행하거나 또는 그 이상 반복해서 행함으로써, 상기 1개쇄 RNA 분자를 반응계에 단계적으로 첨가하면서 라이게이션을 행할 수 있다. 추가 반응 공정은 2회, 3회, 4회, 또는 그 이상 반복해서 행해도 좋다. 이 경우, 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자 및 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 라이게이션을 위한 최초의 인큐베이션 시간(초기 반응시간)은 상기 라이게이션 반응시간에 따르면 좋고, 예를 들면 4시간 이상, 8시간 이상, 12시간 이상, 또는 24시간 이상이어도 좋다. 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자 및 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 추가후의 인큐베이션 시간(추가 반응시간)은 예를 들면 4시간 이상, 8시간 이상, 12시간 이상, 또는 24시간 이상이어도 좋다. 라이게이션의 추가 반응 공정에 있어서, 사이클마다의 추가 반응시간은 서로 동일해도 달라도 좋다. 라이게이션의 초기 반응시간과 사이클마다의 추가 반응시간은 동일해도 달라도 좋다. 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자 및 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 단계적으로 첨가할 경우, 라이게이션 반응액에 최초로 첨가하는 1개쇄 RNA 분자의 농도는 상기와 같아도 좋고, 예를 들면 40μM 이상, 100μM 이상, 150μM 이상, 또는 200μM 이상의 농도이어도 좋다. 각각의 추가 반응 공정에 있어서 라이게이션 반응액에 첨가하는 1개쇄 RNA 분자의 양은 최초의 반응액 중에 포함되는 1개쇄 RNA 분자의 양(몰수)과 같아도 달라도 좋고, 예를 들면 4nmol 이상, 10nmol 이상, 15nmol 이상, 또는 20nmol 이상이어도 좋다.
제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자 및 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 단계적으로 첨가하면서 라이게이션을 행함으로써, 고농도의 1개쇄 RNA 분자에 의한 반응 저해(라이게이션 효율 저하)를 경감하면서, 반응액 중의 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자 및 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 함량을 증가시키고, 그것에 의해 상기 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 수량을 증대시킬 수 있다.
이상과 같은 반응 조건은 임의로 조합해서 사용할 수 있다. 예를 들면 어닐링 공정의 온도, 어닐링 공정의 시간, 어닐링시키는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 혼합비, 라이게이션 반응액 중의 제 1 및 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 양(농도), 효소(예를 들면, Rnl2 패밀리의 리가제)의 종류 및 사용량, 2가 금속이온의 종류 및 농도, pH, ATP 농도, PEG 등의 첨가 성분 및 농도, 반응액 중의 다른 버퍼 성분, 라이게이션 반응시간, 라이게이션 반응 중의 제 1 및 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 단계적 첨가(추가 첨가) 등의 상기 조건으로부터 선택되는 복수의 조건을 임의로 조합할 수 있다. 예를 들면 상기 라이게이션 반응액 중의 제 1 및 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 비교적 높은 농도(예를 들면 100μM∼300μM)를 다른 각각의 조건과 조합해도 좋다. 또는 효소(예를 들면, Rnl2 패밀리의 리가제)의 사용량(예를 들면 0.01U/μL∼1U/μL)을 다른 각각의 조건과 조합해도 좋다.
본 발명의 방법에서는 상기한 바와 같이 라이게이션 반응 조건을 조절함으로써, 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자 및 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 사용량에 대해서 보다 적은 양의 RNA 리가제, 특히 Rnl2 패밀리의 리가제를 사용해서 라이게이션 산물의 수량을 상대적으로 또는 절대적으로 증가시킬 수 있다. 본 발명의 방법에서는 라이게이션에 사용하는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자 및/또는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 몰수(nmol)당 10유닛(U) 이하, 5유닛 이하, 4유닛 이하, 2유닛 이하, 1 유닛 이하, 0.7유닛 이하, 0.5유닛 이하, 또는 0.3유닛 이하, 또는 0.1 유닛 이하의 양의 RNA 리가제, 특히 Rnl2 패밀리의 리가제를 사용해도 좋다. 일실시형태에서는 RNA 리가제, 특히 Rnl2 패밀리의 리가제의 사용량은 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자 및/또는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 양(nmol)당 0.001유닛(U) 이상, 0.01유닛 이상, 0.1유닛 이상, 0.2유닛 이상, 또는 1유닛 이상이어도 좋다. 또, 「제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자 및/또는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 몰수(nmol)당 ”X”유닛 이하의 양의 RNA 리가제」란 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 몰수 또는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 몰수(nmol) 중 어느 한쪽, 또는 그 양쪽과 비교해서 RNA 리가제, 특히 Rnl2 패밀리의 리가제의 활성량이 ”X”유닛 이하인 것을 의미한다. 일실시형태에서는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자 중 적은 쪽의 몰수(nmol)를 기준으로 해서 RNA 리가제의 사용량을 정해도 좋다. 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 몰수(nmol)는 라이게이션 반응계에 첨가한 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 합계량으로서 산출하면 좋고, 예를 들면 1개쇄 올리고 RNA 분자를 단계적으로 첨가할 경우에는 라이게이션의 초기 반응액 중의 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 몰수와, 추가 반응공정에서 반응계에 첨가한 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 몰수의 합계 몰수로서 산출한다.
라이게이션 반응의 온도는 사용하는 효소(Rnl2 패밀리의 리가제)에 의해 변동할 수 있지만, 예를 들면 10∼50℃, 15∼45℃, 20∼40℃, 20∼30℃, 또는 23∼28℃이어도 좋다. 예를 들면 T4 RNA 리가제 2를 사용할 경우, 10∼50℃, 15∼45℃, 20∼40℃, 20∼30℃, 또는 23∼28℃이어도 좋다.
라이게이션 공정의 완료후, 라이게이션 반응액 중에는 본 발명에 따른 유전자 발현 억제 서열을 포함하는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자가 높은 비율로 포함된다.
라이게이션 반응액 중의 본 발명에 따른 유전자 발현 억제 서열을 포함하는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자는 당업자에 공지의 방법에 의해, 정제할 수 있다. 정제 기술로서는 역상 크로마토그래피, 역상 고속 액체 크로마토그래피(RP-HPLC), 초고속 액체 크로마토그래피(UHPLC), 이온 교환 크로마토그래피 등의 크로마토그래피법, 겔 여과, 컬럼 정제, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 등, 또는 이들의 임의의 조합을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
국제공개 WO2013/027843 기재의 방법에서는 극히 단쇄 중에 신장 반응이 정지한 것에 의한 단쇄 핵산 불순물이나 결손체 등의 핵산 불순물의 생성에 의해, 반응액 중의 목적 산물의 순도의 저하가 일어난다. 한편, 본 발명의 방법의 바람직한 실시형태에서는 본 발명에 따른 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 제조후의 라이게이션 반응액 중의 핵산 불순물을 저감할 수 있는 점에서 유리하다. 본 발명의 방법의 바람직한 실시형태에서는 핵산 불순물의 생성을 저감하면서, 범용형 RNA 아미다이트를 사용해서 안정성이 높은 유전자 발현 억제성 1개쇄 RNA 분자를 제조할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자는 상법에 의해, 생체내 또는 세포내에 투여함으로써, 표적 유전자의 발현을 억제하기 위해서 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합(페어)을 포함하는 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 제조용 키트에도 관한 것이다. 그러한 키트는 본 발명에 따른 표적 유전자의 발현을 억제하는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 제조 방법을 실시하기 위해서, 적합하게 사용할 수 있다.
일실시형태에서는 키트의 예로서, 이하의 (i)∼(vi) 중 어느 하나의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합을 포함하는 TGF-β1 유전자의 발현을 억제하기 위한 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 제조용 키트를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다:
(i)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 7로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 10번째와 11번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 6으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합,
(ii)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 19로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 16번째와 17번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 18로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합,
(iii)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 27로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 20번째와 21번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 26으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합,
(iv)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 29로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 21번째와 22번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 28로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합,
(v)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 31로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 22번째와 23번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 30으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합, 및
(vi)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 33으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 23번째와 24번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 32로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합.
다른 실시형태에서는 키트의 예로서, 이하의 (vii)의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합을 포함하는 GAPDH 유전자의 발현을 억제하기 위한 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 제조용 키트를 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다:
(vii)22번째와 23번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 37로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 20번째와 21번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 36으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합.
[0160]
다른 실시형태에서는 키트의 예로서, 이하의 (viii)∼(xi) 중 어느 하나의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합을 포함하는 LAMA1 유전자의 발현을 억제하기 위한 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 제조용 키트를 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다:
(viii)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 39로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 16번째와 17번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 38로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합,
(ix)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 41로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 22번째와 23번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 40으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합,
(x)서열 번호 43으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자 (24번째와 31번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 뉴클레오티드성 링커를 통해 연결되어 있다)와, 서열 번호 42로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자 (21번째와 26번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 뉴클레오티드성 링커를 통해 연결되어 있다)의 조합,
(xi)서열 번호 45로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자 (24번째와 31번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 뉴클레오티드성 링커를 통해 연결되어 있다)와, 서열 번호 44로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자 (22번째와 27번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 뉴클레오티드성 링커를 통해 연결되어 있다)의 조합.
다른 실시형태에서는 키트의 예로서, 이하의 (xii)∼(xiii) 중 어느 하나의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합을 포함하는 LMNA 유전자의 발현을 억제하기 위한 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 제조용 키트를 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다:
(xii)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 47로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 21번째와 22번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 46으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합,
(xiii)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 49로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 23번째와 24번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 48로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합.
실시예
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명의 기술적 범위는 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[참고예 1]프롤린디아미드아미다이트의 합성
프롤린 유도체 링커를 포함하는 본 발명의 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자를 생성하기 위해서 사용하는 프롤린디아미드아미다이트는 예를 들면 국제공개 WO2013/027843의 기재에 따라서 합성할 수 있다. 구체적인 합성예를 이하에 나타내지만, 합성 방법은 그것에 의해 한정되지 않는다.
(1)Fmoc-히드록시아미드-L-프롤린
Fmoc-L-프롤린을 개시 원료로 한다. Fmoc는 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐 기이다. Fmoc-L-프롤린(10.00g, 29.64mmol), 4-아미노-1-부탄올(3.18g, 35.56mmol) 및 1-히드록시벤조트리아졸(10.90g, 70.72mmol)을 혼합하고, 그 혼합물에 대해서, 감압 하에서 탈기하고, 아르곤 가스를 충전한다. 얻어진 혼합물에 무수 아세토니트릴(140mL)을 실온에서 첨가하고, 또한, 디시클로헥실카르보디이미드(7.34g, 35.56mmol)의 무수 아세토니트릴 용액(70mL)을 첨가한 후, 아르곤 분위기 하, 실온에서 15시간 교반한다. 반응 종료후, 생성한 침전을 여과분별하고, 회수한 액에 대해서, 감압 하에서 용매를 증류 제거한다. 얻어진 잔사에 디클로로메탄(200mL)을 첨가하고, 포화 중조수(200mL)로 세정한다. 그리고, 유기층을 회수하고, 황산 마그네슘으로 건조한 후, 여과한다. 얻어진 여과액에 대해서, 감압 하에서 용매를 증류 제거하고, 그 잔사에 디에틸에테르(200mL)를 첨가하고, 분말화한다. 발생한 분말을 여과채취함으로써, 무색 분말상 물질로서 Fmoc-히드록시아미드-L-프롤린이 얻어진다.
(2)DMTr-아미드-L-프롤린
Fmoc-히드록시아미드-L-프롤린(7.80g, 19.09mmol)을 무수 피리딘(5mL)과 혼합하고, 실온에서 2회 공비 건조한다. 얻어진 잔사에 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(8.20g, 24.20mmol), 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)(23mg, 0.19mmol) 및 무수 피리딘(39mL)을 첨가한다. 이 혼합물을 실온에서 1시간 교반한 후, 메탄올(7.8mL)을 첨가하고, 실온에서 30분 교반한다. 이 혼합물을, 디클로로메탄(100mL)으로 희석하고, 포화 중조수(150mL)로 세정후, 유기층을 분리한다. 이 유기층을 황산 나트륨으로 건조한 후, 여과한다. 얻어진 여과액에 대해서, 감압 하에서 용매를 증류 제거한다. 얻어진 미정제의 잔사에 무수 디메틸포름아미드(39mL) 및 피페리딘(18.7mL, 189mmol)을 첨가하고, 실온에서 1시간 교반한다. 반응 종료후, 그 혼합액으로부터 감압 하, 실온에서 용매를 증류 제거한다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(상품명 Wakogel C-300, 전개 용매 CH2Cl2:CH3OH=9:1, 0.05% 피리딘 함유)에 제공함으로써, 담황색 유상 물질로서 DMTr-아미드-L-프롤린이 얻어진다. DMTr은 디메톡시트리틸기이다.
(3)DMTr-히드록시디아미드-L-프롤린
얻어진 DMTr-아미드-L-프롤린(6.01g, 12.28mmol), N-(3'-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드(EDC)(2.83g, 14.74mmol), 1-히드록시벤조트리아졸(3.98g, 29.47mmol) 및 트리에틸아민(4.47g, 44.21mmol)의 무수 디클로로메탄 용액(120mL)을 혼합한다. 이 혼합액에, 또한, 아르곤 분위기 하, 실온에서, 6-히드록시헥산산(1.95g, 14.47mmol)을 첨가하고, 그 후에 아르곤 분위기 하, 실온에서, 1시간 교반한다. 얻어진 혼합액을 디클로로메탄(600mL)으로 희석하고, 포화 식염수(800mL)로 3회 세정한다. 유기층을 회수하고, 황산 나트륨으로 건조한 후, 여과한다. 얻어진 여과액에 대해서, 감압 하에서 용매를 증류 제거한다. 이것에 의해 담황색 거품상 물질로서 DMTr-히드록시디아미드-L-프롤린이 얻어진다.
(4)DMTr-디아미드-L-프롤린아미다이트
얻어진 DMTr-히드록시디아미드-L-프롤린(8.55g, 14.18mmol)을 무수 아세토니트릴과 혼합하고, 실온에서 3회 공비 건조한다. 얻어진 잔류물에 디이소프로필암모늄테트라졸리드(2.91g, 17.02mmol)를 첨가하고, 감압 하에서 탈기하고, 아르곤 가스를 충전한다. 그 혼합물에 대해서, 무수 아세토니트릴(10mL)을 첨가하고, 또한, 2-시아노에톡시-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트(5.13g, 17.02mmol)의 무수 아세토니트릴 용액(7mL)을 첨가한다. 이 혼합물을, 아르곤 분위기 하, 실온에서 2시간 교반한다. 얻어진 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고, 포화 중조수(200mL)로 3회 세정한 후, 포화 식염수(200mL)로 세정한다. 유기층을 회수하고, 황산 나트륨으로 건조한 후, 여과한다. 얻어진 여과액에 대해서, 감압 하에 용매를 증류 제거한다. 얻어진 잔사를 충전제로서 아미노실리카겔을 사용한 컬럼크로마토그래피(전개 용매 헥산:아세트산 에틸=1:3, 0.05% 피리딘 함유)에 제공함으로써, 무색 시럽상 물질로서 DMTr-디아미드-L-프롤린아미다이트가 얻어진다.
[실시예 1] 1개쇄 올리고 RNA 분자의 합성
이하의 실시예에서는 프롤린 유도체를 사용한 링커와 인간 TGF-β1 유전자 발현 억제 서열을 갖는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자 (이하, 「ssTbRNA 분자」라고도 칭한다.;도 2)를 그 2개의 분할 프래그먼트인 1개쇄 올리고 RNA 분자 (스트랜드 1 및 스트랜드 2)를 RNA 리가제(T4 RNA 리가제 2)를 사용해서 라이게이션함으로써, 제작한다(라이게이션법;도 1).
분할 위치의 검토를 위해서 ssTbRNA 분자 중의 분할 위치를 1 염기씩 시프트시킨 페어의 1개쇄 올리고 RNA 분자 (스트랜드 1 및 스트랜드 2;표 1)를 하기와 같이 해서 제작했다.
구체적으로는 각각의 1개쇄 올리고 RNA 분자 (스트랜드 1 및 스트랜드 2)를 포스포로아미다이트법에 의거해서 핵산 합성기(상품명 AKTA oligopilot-100;GE Healthcare Life Sciences 또는 상품명 nS-8 및 nS-8II;진 디자인사제)를 사용하여 3'측으로부터 5'측을 향해서 합성했다. 포스포로아미다이트법에 의거하는 RNA 합성에는 RNA 아미다이트로서 5'-O-DMT-2'-O-TBDMSi-RNA 포스포로아미다이트(ThermoFisher Scientific) 또는 5'-O-DMT-2'-O-TBDMS-RNA 포스포로아미다이트(시그마알도리치)를 사용했다. 담체로서는 폴리스티렌 비즈(NittoPhase(R） HL rG(ibu), 또는 rU;KINOVATE) 또는 다공질 유리(CPG) 비즈(Universal UnyLinker Support 1000Å;Chemgenes)를 사용했다. 5'-인산화 시약으로서는 3-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)-2,2-(N-메틸아미드)]프로필-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미다이트(Solid Chemical Phosph orylation Reagent;LINK)를 사용했다.
3' 말단으로부터 링커 직전까지의 RNA 서열(도 1 중, Xa, Ys)이 합성된 후, 그 5' 말단에 링커 형성용 DMTr-디아미드-L-프롤린아미다이트를 연결하고, 또한 그 5'측에 링커 직후로부터 5' 말단까지의 RNA 서열(도 1 중, Xs; 또는 Ya3, Ya2, 및 Ya1)을 합성함으로써, 스트랜드 1 및 스트랜드 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 제작했다. 이들의 1개쇄 올리고 RNA 분자는 Lx1 및 Lx2로서 식(VI-1)로 나타내어지는 링커를 갖고 있고, Xa는 식(VI-1) 중의 1위치 질소원자측에서, Xs는 2위치 탄소원자측에서 링커 Lx1과 연결하고, Ys는 식(VI-1) 중의 1위치 질소원자측에서, Ya3은 2위치 탄소원자측에서 링커 Lx2와 연결되어 있다.
스트랜드 2(안티센스측)에 대해서는 DMTr-OFF의 상태에서 합성을 종료하고, 상법에 의해 1개쇄 올리고 RNA 분자의 절출과 염기부 및 2'위치의 탈보호를 행했다. 스트랜드 1(센스측)에 대해서는 DMTr-ON의 상태로 합성을 종료했다.
[실시예 2] 라이게이션법의 검토(분할 위치)
ssTbRNA 분자의 2개의 분할 프래그먼트로의 분할 위치를 검토하기 위해서, 페어의 스트랜드 1 및 스트랜드 2(표 1)를 RNA 리가제(T4 RNA 리가제 2)를 사용해서 라이게이션하고, 그 라이게이션 효율을 결정했다.
구체적으로는 우선, 각 페어의 스트랜드 1 및 스트랜드 2를 주사 용수(DW)에 용해하고, 등몰량을 혼합했다. 이 등몰 혼합액을 93℃에서 1분간 가열해서 열변성하고, 이어서 어닐링을 위해서 55℃에서 15분 정치하고, 4℃까지 강온시켰다. 강온 후, 반응액을 역상 고속 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)(20℃)와 미변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Native PAGE)으로 분석하고, 스트랜드 1 및 스트랜드 2의 어닐링 상태를 조사했다.
어닐링 상태의 확인을 위해서 사용한 RP-HPLC의 조건은 이하와 같다.
·컬럼:ACQUITY UPLC Oligonucleotide BEH C18 Column, 130A, 1.7μM, 2.1mm×100mm
·이동상:A) 0.1M 아세트산 트리에틸암모늄(TEAA), B)아세토니트릴(MeCN)
·분석 조건:B5-30%, 10분, 20℃, 0.4ml/min
사용한 Native PAGE(미변성 PAGE)의 조건은 이하와 같다.
미변성 PAGE;19% 아크릴아미드, 150V, 90분간의 영동
이렇게 해서 스트랜드 1 및 스트랜드 2가 어닐링한 2개쇄 올리고 RNA를 얻었다. 스트랜드 1 및 스트랜드 2의 거의 전체가 어닐링하는 것이 나타내어진 페어와, 보다 낮은 비율로 어닐링한 페어가 존재했다.
얻어진 2개쇄 올리고 RNA(스트랜드 1, 스트랜드 2의 각각의 최종 농도 10μM)를 버퍼(50mM Tris-HCl, 2mM MgCl2, 1mM 디티오트레이톨(DTT), 400μM 아데노신3인산(ATP)) 중에 포함하는 반응액(pH 7.5)을 조제하고, 2μL의 10U/μL T4 RNA 리가제 2(New England Biolabs;이하 동일)(40U/nmol 올리고 RNA)를 첨가해서 반응액량 50μL로 했다. 이 반응액을 37℃에서 30분 인큐베이트했다.
효소 반응후, 반응액 중의 라이게이션 효율을 초고속 액체 크로마토그래피(UHPLC) 및 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Denatured PAGE)에 의해 확인했다.
라이게이션후 UHPLC의 조건은 이하와 같다.
·컬럼:ACQUITY UPLC Oligonucleotide BEH C18 Column, 130A, 1.7μM, 2.1mm×100mm
·이동상:A)100mM 헥사플루오로-2-프로판올(HFIP)-8mM 트리에틸아민(TEA), B)메탄올(MeOH)
·분석 조건:B5-40%, 10분, 80℃, 0.4ml/min
Denatured PAGE(변성 PAGE)의 조건은 이하와 같다.
변성 PAGE;19% 아크릴아미드, 7.5M 요소, 200V, 90분간의 영동후, 에튬브로마이드(EtBr)로 염색
라이게이션 효율(FLP(%))은 UHPLC 해석 결과에 의거해서 면적 백분률법에 의해, 이하의 식으로 산출했다.
FLP(Full Length Product)(%)
=(목적의 라이게이션 생성물의 피크 면적)/(크로마토그램 중의 총 피크 면적)×100
결과를 도 3에 나타낸다. 분할 위치에 따라 라이게이션 효율에 큰 차가 생겼다. 스트랜드 1의 3' 말단이 U가 되는 분할 위치에서는 라이게이션 효율이 높아지는 경향이 나타내어졌다. 또 스트랜드 1의 3' 말단 또는 스트랜드 2의 5' 말단이 A가 되는 분할 위치를 채용한 경우에도 라이게이션 효율이 높아지는 경향이 나타내어졌다. 또 스트랜드 1의 3' 말단의 염기와 스트랜드 2의 5' 말단의 염기가 각각 U 또는 A가 되는 분할 위치를 채용한 경우, 특히 우수한 라이게이션 효율이 나타내어졌다.
또, 각각의 라이게이션 생성물에 대해서, LC-MS 분석을 행하여 예측되는 분자량을 갖는 것을 확인했다. LC-MS 분석에는 이하의 기기를 사용했다.
·LC 장치:UHPLC UltiMate3000(ThermoFisher Scientific사제)
·MS 장치:Q-Exactive(ThermoFisher Scientific사제)
이 결과에 의거하여 라이게이션법에 적합한 페어 011, 016, 및 018을 선발했다.
상기한 바와 같이 해서 페어 011, 016, 및 018의 스트랜드 1 및 스트랜드 2를 어닐링시키고, 라이게이션에 의해 연결한 후의 반응액을 상기 조건에서 RP-HPLC에 의해 해석한 결과, 목적물인 ssTbRNA 분자와 유리 스트랜드 1 및 스트랜드 2 이외의 반응액 중의 핵산 불순물의 양은 얼마 안되며, ssTbRNA 분자의 피크 부근에 나타나는 결손체(ssTbRNA 분자의 서열의 일부가 빠진 것)의 양도 적었다(표 2). 한편, ssTbRNA 분자의 전체 길이를 포스포로아미다이트법에 의해 고상 합성하는 방법(특허문헌 2)에서는 합성후의 반응액에 ssTbRNA 분자 이외의 단쇄 핵산 불순물(합성이 단쇄 중에 정지한 RNA 분자 등)이 비교적 많이 포함되어 있고, ssTbRNA 분자의 피크 부근에 나타나는 결손체도 많았다(표 2). 본 발명의 방법에서는 목적의 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자를 고순도로 제조할 수 있는 것이 나타내어졌다.
표 2 중, 스트랜드 1, 스트랜드 2, 및 ssTbRNA 분자의 값은 크로마토그램에 의거하는 각각의 피크 면적비율을 나타낸다. 또한 ssTbRNA 분자의 피크 부근의 핵산(주로 ssTbRNA 분자와 그 결손체를 포함한다)의 상대량으로서, ssTbRNA 분자의 피크를 포함하는 RRT(relative retention time; 여기에서는 ssTbRNA 분자의 피크의 유지시간을 1로 한 경우의 상대 유지시간)=0.98∼1.07의 범위에 대해서 피크 면적%의 합계값을 산출했다. 또 스트랜드 1과 스트랜드 2의 피크 유지시간은 ssTbRNA 분자의 피크와는 충분히 떨어져 있고, RRT=0.98∼1.07의 범위에는 포함되지 않는다.
[실시예 3] 라이게이션법의 검토(어닐링 온도)
페어 011, 016, 및 018의 스트랜드 1 및 스트랜드 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 사용하고, 2개의 조건에서 어닐링 테스트를 행했다.
우선, 열변성 조건에서는 스트랜드 1 및 스트랜드 2를 주사 용수에 용해하고, 각각 40μM로 등몰량을 혼합했다. 혼합액을 93℃에서 1분간 가열해서 열변성하고, 이어서 어닐링을 위해서 55℃에서 15분 정치하고, 4℃까지 강온시켰다. 강온후, 반응액을 역상 고속 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)(20℃)와 미변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Native PAGE)으로 분석하고, 스트랜드 1 및 스트랜드 2의 어닐링 상태를 조사했다.
한편, 실온조건에서는 스트랜드 1 및 스트랜드 2를 주사 용수에 용해하고, 각각 200∼400μM로 등몰량을 혼합했다. 혼합액을 실온에서 10분간 정치했다. 정치 후의 반응액을 RP-HPLC(20℃)와 미변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석하고, 스트랜드 1 및 스트랜드 2의 어닐링 상태를 조사했다.
그 결과, 열변성 조건과 실온 조건 중 어디에 있어서나, RP-HPLC에서는 스트랜드 단독의 피크는 확인되지 않고, 어닐링에 의해 생긴 2개쇄의 피크가 관찰되었다. 또 미변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서도 열변성 조건과 실온 조건의 양쪽에서, 스트랜드 1 및 스트랜드 2의 거의 모든 분자의 어닐링이 확인되었다.
열변성 조건과 실온 조건에서 동등한 결과가 얻어진 점에서, 이후, 라이게이션법에 있어서의 어닐링은 실온 조건에서 실시했다.
또, 이하의 실시예에서는 스트랜드 1 및 스트랜드 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 어닐링 상태를 RP-HPLC와 미변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Native PAGE)으로 확인하고, RP-HPLC에 의해 2개쇄 RNA의 순도(FLP)가 95% 이상인 것을 확인한 후에 라이게이션 반응에 사용했다.
어닐링 상태의 확인을 위해서 사용한 RP-HPLC의 조건은 이하와 같다.
·컬럼:ACQUITY UPLC Oligonucleotide BEH C18 Column, 130Å, 1.7㎛, 2.1mm×100mm
·이동상:A) 0.1M 아세트산 트리에틸암모늄(TEAA), B)아세토니트릴(MeCN)
·분석 조건:B5-30%, 10분, 20℃, 0.4ml/min
사용한 Native PAGE(미변성 PAGE)의 조건은 이하와 같다.
미변성 PAGE;19% 아크릴아미드, 150V, 90분간의 영동
[실시예 4] 라이게이션법의 검토(반응온도 및 반응시간)
3종류의 페어 011, 016, 및 018(표 1;이하, 각 페어를 단지 011, 016, 및 018이라고도 칭한다)을 각각 사용해서 라이게이션 반응의 온도와 시간에 대해서 검토를 행했다. 또 011, 016, 및 018의 스트랜드 1 및 스트랜드 2의 구조를 도 4에 나타낸다.
실시예 2와 마찬가지로, 각 페어의 스트랜드 1 및 스트랜드 2를 주사 용수에 용해하고, 각각 등몰량으로 혼합했다. 이 등몰 혼합액을 실온에서 10분간 정치하고, 어닐링에 의해 2개쇄 올리고 RNA를 조제했다.
얻어진 2개쇄 올리고 RNA(스트랜드 1과 스트랜드 2의 등몰 혼합액;각 스트랜드의 최종 농도 10μM, 40μM, 또는 100μM)를 T4 RNA 리가제 2(New England Biolabs)의 첨부 버퍼(50mM Tris-HCl, 2mM MgCl2, 1mM DTT, 400μM ATP, pH 7.5(25℃ 중, 0.4U/μL의 T4 RNA 리가제 2와 함께 포함하는 반응액 100μL를 25℃ 또는 37℃에서 인큐베이트하고, 라이게이션했다. 이 라이게이션 반응에 사용한 효소(T4 RNA 리가제 2)의 양은 40U/nmol 올리고 RNA, 10U/nmol 올리고 RNA, 또는 4U/nmol 올리고 RNA이다. 라이게이션 반응 중, 0.5시간, 2시간, 4시간, 또는 24시간 경과후에 20∼25μL의 샘플을 채취하고, 85℃에서 20분 가열해서 효소를 실활시켰다. 열 실활후의 반응액을 변성 PAGE, 및 UHPLC에 의해 해석하고, 라이게이션 효율(FLP(%))을 산출했다. 변성 PAGE 및 UHPLC의 조건, 및 FLP(%)의 산출 방법은 실시예 2와 같다.
그 결과, 10μM 또는 40μM의 올리고 RNA 농도를 사용한 경우, 라이게이션 효율은 반응온도나 반응시간에서 크게 바뀔 일은 없고, 모두 매우 높았다. 100μM의 올리고 RNA 농도를 사용한 경우, 10μM 또는 40μM의 경우와 비교해서 라이게이션 효율은 저하했지만, 반응시간이 길어짐에 따라서 라이게이션 효율은 상승했다. 또 100μM의 올리고 RNA 농도에서는 37℃보다 25℃에서 인큐베이트한 경우의 쪽이 4시간 이후의 라이게이션 효율은 높았다.
016에 대한 결과를 도 5에 나타낸다. 또한 100μM의 올리고 RNA 농도에서의 라이게이션 반응의 결과를 도 6에 나타낸다(A:25℃, B:37℃). 011, 016에 있어서의 라이게이션 효율이 특히 높았다.
[실시예 5] 라이게이션법의 검토(ATP 농도)
실시예 4와 동일하게 조제한 011의 2개쇄 올리고 RNA(등몰 혼합액)를 이용하여, 라이게이션 반응액 중의 ATP 농도의 검토를 행했다. T4 RNA 리가제 2(New England Biolabs)의 첨부 버퍼(50mM Tris-HCl, 2mM MgCl2, 1mM DTT, 400μM ATP, pH 7.5(25℃))에, ATP를 첨가해서 ATP 농도 0.4mM(첨가 없음), 1mM, 2mM, 5mM, 또는 10mM로 했다. 이렇게 조제한 버퍼 중, 2개쇄 올리고 RNA(각 스트랜드의 최종 농도 10μM, 20μM, 또는 40μM)와 T4 RNA 리가제 2를 포함하는 반응액 25μL를 37℃에서 30분 인큐베이트하고, 라이게이션했다. 라이게이션 반응후, 85℃에서 20분 가열해서 효소를 실활시키고, 그 반응액을 변성 PAGE, 및 UHPLC에 의해 해석하고, 라이게이션 효율(FLP(%))을 산출했다. 변성 PAGE 및 UHPLC의 조건, 및 FLP(%)의 산출 방법은 실시예 2와 같다.
변성 PAGE의 결과를 도 7에, 올리고 RNA 농도 40μM로 나타내어진 FLP(%)를 도 8에 나타낸다. ATP 농도를 증가시키면, 라이게이션 반응은 저해되었다.
[실시예 6] 라이게이션법의 검토(pH)
실시예 4와 동일하게 조제한 016의 2개쇄 올리고 RNA(등몰 혼합액)를 이용하여, 라이게이션 반응액의 pH 조건의 검토를 행했다. 이하의 3종류의 버퍼를 사용했다.
(1) 50mM Tris-HCl(pH 7.0), 2mM MgCl2, 1mM 디티오트레이톨(DTT), 400μM ATP
(2) 50mM Tris-HCl(pH 7.5), 2mM MgCl2, 1mM DTT, 400μM ATP
(3) 50mM Tris아세트산(pH 6.5), 2mM MgCl2, 1mM DTT, 400μM ATP
016의 2개쇄 올리고 RNA(각 스트랜드의 최종 농도 10μM, 100μM, 또는 200μM), 및 T4 RNA 리가제 2(최종 농도 0.4U/μL)를 상기 중 어느 하나의 버퍼 중에 포함하는 반응액 30μL를 25℃에서 30분, 4시간, 또는 24시간에 걸쳐 인큐베이트하고, 라이게이션했다. 라이게이션 반응후, 85℃에서 20분 가열해서 효소를 실활시키고, 그 반응액을 변성 PAGE, 및 UHPLC에 의해 해석하고, 라이게이션 효율(FLP(%))을 산출했다. 변성 PAGE 및 UHPLC의 조건, 및 FLP(%)의 산출 방법은 실시예 2와 같다.
결과를 도 9에 나타낸다. pH 7.5의 반응액에서는 고농도의 올리고 RNA를 포함하는 경우라도 24시간 반응시켰을 때에 95% 이상의 라이게이션 효율을 나타냈다.
[실시예 7] 라이게이션법의 검토(pH 8.0 이상)
실시예 4와 동일하게 조제한 016의 2개쇄 올리고 RNA(등몰 혼합액)를 이용하여, 라이게이션 반응액의 pH 조건을 더 검토했다. 이하의 4종류의 버퍼를 사용했다.
(1) 50mM Tris-HCl(pH 7.0), 2mM MgCl2, 1mM DTT, 400μM ATP
(2) 50mM Tris-HCl(pH 7.5), 2mM MgCl2, 1mM DTT, 400μM ATP
(3) 50mM Tris-HCl(pH 8.0), 2mM MgCl2, 1mM DTT, 400μM ATP,
(4) 50mM Tris-HCl(pH 8.5), 2mM MgCl2, 1mM DTT, 400μM ATP
016의 2개쇄 올리고 RNA(각 스트랜드의 최종 농도 10μM 또는 200μM), 및 T4 RNA 리가제 2(최종 농도 0.4U/μL)를 상기 중 어느 하나의 버퍼 중에 포함하는 반응액 30μL를 25℃에서 30분, 4시간, 또는 24시간에 걸쳐 인큐베이트하고, 라이게이션했다. 라이게이션 반응후, 85℃에서 20분 가열해서 효소를 실활시키고, 그 반응액을 변성 PAGE, 및 UHPLC에 의해 해석하고, 라이게이션 효율(FLP(%))을 산출했다. 변성 PAGE 및 UHPLC의 조건, 및 FLP(%)의 산출 방법은 실시예 2와 같다. 결과를 도 10에 나타낸다. pH 7.5 이상의 반응액은 높은 라이게이션 효율을 나타냈다.
[실시예 8] 라이게이션법의 검토(2가 이온 농도)
실시예 4와 동일하게 조제한 016의 2개쇄 올리고 RNA(등몰 혼합액)를 이용하여, 라이게이션 반응액 중의 MgCl2 농도의 검토를 행했다. 이하의 5종류의 버퍼를 사용했다.
(1) 0.5mM MgCl2, 50mM Tris-HCl(pH 7.5), 1mM DTT, 400μM ATP
(2) 1mM MgCl2, 50mM Tris-HCl(pH 7.5), 1mM DTT, 400μM ATP
(3) 2mM MgCl2, 50mM Tris-HCl(pH 7.5), 1mM DTT, 400μM ATP
(4) 5mM MgCl2, 50mM Tris-HCl(pH 7.5), 1mM DTT, 400μM ATP
(5) 10mM MgCl2, 50mM Tris-HCl(pH 7.5), 1mM DTT, 400μM ATP
016의 2개쇄 올리고 RNA(각 스트랜드의 최종 농도 10μM, 100μM, 또는 200μM), 및 T4 RNA 리가제 2(최종 농도 0.4U/μL)를 상기 중 어느 하나의 버퍼 중에 포함하는 반응액 30μL를 25℃에서 30분, 4시간, 또는 24시간에 걸쳐 인큐베이트하고, 라이게이션했다. 라이게이션 반응후, 85℃에서 20분 가열해서 효소를 실활시키고, 그 반응액을 변성 PAGE, 및 UHPLC에 의해 해석하고, 라이게이션 효율(FLP(%))을 산출했다. 변성 PAGE 및 UHPLC의 조건, 및 FLP(%)의 산출 방법은 실시예 2와 같다.
결과를 도 11에 나타낸다(A:10μM 또는 100μM 올리고 RNA, B:10μM 또는 200μM 올리고 RNA). 2개쇄 올리고 RNA 농도가 100μM인 경우에는 2mM 이상의 MgCl2 농도로 4시간 이상의 반응에 의해 95% 이상의 라이게이션 효율이 나타내어졌다. 올리고 RNA 농도가 200μM인 경우도 2mM 이상의 MgCl2 농도로 24시간 이상의 반응에 의해 95% 이상의 라이게이션 효율이 나타내어지고, 또한, 5mM의 MgCl2 농도에서는 4시간후에 라이게이션 효율의 특히 급격한 상승이 확인되었다. 이 결과로부터, 보다 고농도의 올리고 RNA를 사용할 경우에는 MgCl2 농도를 적당하게 증가시킴으로써, 라이게이션 반응의 진행을 빠르게 할 수 있는 것이 나타내어졌다.
[실시예 9] 효소 라이게이션법의 검토(2가 이온 농도 및 pH)
실시예 4와 동일하게 조제한 016의 2개쇄 올리고 RNA(등몰 혼합액)를 이용하여, 라이게이션 반응액 중의 2가 이온 농도의 검토를 행했다. 이하의 6종류의 버퍼를 사용했다.
(1) 50mM Tris-HCl(pH 7.5), 1mM DTT, 400μM ATP, 2mM, 5mM, 또는 10mM MgCl2
(2) 50mM Tris-HCl(pH 8.0), 1mM DTT, 400μM ATP, 2mM, 5mM, 또는 10mM MgCl2
016의 2개쇄 올리고 RNA(각 스트랜드의 최종 농도 10μM 또는 200μM), 및 T4 RNA 리가제 2(최종 농도 0.4U/μL)를 상기 중 어느 하나의 버퍼 중에 포함하는 반응액 30μL를 25℃에서 30분, 4시간, 또는 24시간에 걸쳐 인큐베이트하고, 라이게이션했다. 라이게이션 반응후, 85℃에서 20분 가열해서 효소를 실활시키고, 그 반응액을 변성 PAGE, 및 UHPLC에 의해 해석하고, 라이게이션 효율(FLP(%))을 산출했다. 변성 PAGE 및 UHPLC의 조건, 및 FLP(%)의 산출 방법은 실시예 2와 같다.
결과를 도 12에 나타낸다(A:pH 7.5, B:pH 8.0). pH 7.5와 pH 8.0 어느 것에 있어서나 4시간후의 시점에서, 5mM MgCl2의 경우에 라이게이션 효율의 가장 급격한 상승이 확인되었다.
[실시예 10] 효소 라이게이션법의 검토(PEG 첨가)
실시예 4와 동일하게 조제한 018의 2개쇄 올리고 RNA(등몰 혼합액)를 이용하여, 라이게이션 반응 용액에의 PEG의 첨가에 의한 라이게이션 효율에의 영향을 조사했다.
버퍼(5, 10, 또는 15%(w/v)의 PEG 8000, 50mM Tris-HCl(pH 8.0), 2mM MgCl2, 1mM DTT, 400μM ATP) 중에, 2개쇄 올리고 RNA(각 스트랜드의 최종 농도 200μM)와, 0.4U/μL, 또는 0.2U/μL의 T4 RNA 리가제 2를 포함하는 반응액 30μL를, 25℃에서 30분, 4시간, 또는 24시간에 걸쳐 인큐베이트하고, 라이게이션했다. 이 라이게이션 반응에 사용한 효소(T4 RNA 리가제 2)의 양은 2U/nmol 올리고 RNA, 또는 1U/nmol 올리고 RNA이며, 실시예 4에서의 효소량과 비교하면, 각각 1/20, 및 1/40이다. 라이게이션 반응후, 85℃에서 20분 가열해서 효소를 실활시켰다. 열 실활후의 반응액을 변성 PAGE, 및 UHPLC에 의해 해석하고, 라이게이션 효율(FLP(%))을 산출했다. 변성 PAGE 및 UHPLC의 조건, 및 FLP(%)의 산출 방법은 실시예 2와 같다.
결과를 도 13에 나타낸다. PEG의 첨가에 의해 라이게이션 효율이 증가한 것이 나타내어졌다.
[실시예 11] 효소 라이게이션법에 있어서의 반응 타임 코스의 해석
실시예 4와 동일하게 조제한 016의 2개쇄 올리고 RNA(등몰 혼합액)를 이용하여, 라이게이션 반응의 타임 코스의 검토를 행했다.
2개쇄 올리고 RNA(각 스트랜드의 최종 농도 100μM 또는 200μM), 0.4U/μL의 T4 RNA 리가제 2를 버퍼(50mM Tris-HCl(pH 8.0), 5mM MgCl2, 1mM DTT, 400μM ATP) 중에 포함하는 반응액 80μL를 25℃에서 인큐베이트하고, 라이게이션했다. 라이게이션 반응 중, 개시부터 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12, 15, 18, 및 24시간후에 샘플링하고, 85℃에서 20분 가열해서 효소를 실활시킨 후, UHPLC 해석을 행하고, FLP%를 산출했다. UHPLC의 조건, 및 FLP(%)의 산출 방법은 실시예 2와 같다.
결과를 도 14에 나타낸다. 올리고 RNA 농도가 100μM인 경우에는 반응 개시후 6시간, 200μM의 경우에는 반응 개시후 9시간에서 라이게이션 반응이 거의 안정기에 도달했다.
[실시예 12] 효소 라이게이션법에 있어서의 올리고 RNA의 추가 첨가
실시예 4와 동일하게 조제한 016의 2개쇄 올리고 RNA(등몰 혼합액)를 이용하여, 라이게이션 반응 상에 스트랜드 1 및 스트랜드 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 순차 첨가함으로써 ssTbRNA 분자의 수량을 증가시키는 방법을 검토했다.
우선, 2개쇄 올리고 RNA를 각 스트랜드의 최종 농도 100μM로 포함하는 라이게이션 반응액을 이용하여 검토를 행했다. 2개쇄 올리고 RNA(최종 농도 100μM;100μL의 반응액 중의 토털 올리고 RNA량은 스트랜드 1 및 스트랜드 2의 각각에 대해서 10nmol), 및 T4 RNA 리가제 2(0.4U/μL;4U/nmol 올리고 RNA)를 버퍼(50mM Tris-HCl(pH 8.0), 5mM MgCl2, 1mM DTT, 400μM ATP) 중에 포함하는 반응액 100μL를 4개의 튜브에 분주하고, 25℃에서 인큐베이트함으로써 라이게이션 반응을 개시했다.
라이게이션 반응 개시부터 12시간후, 3개의 튜브에 016의 2개쇄 올리고 RNA(반응 버퍼(50mM Tris-HCl, 5mM MgCl2, 1mM DTT, 400μM ATP(pH 8.0)) 중, 016의 스트랜드 1과 스트랜드 2의 등몰 혼합액)를 각 스트랜드 10nmol이 되는 양(11.1μL)으로 첨가하고, 계속해서 인큐베이트했다. 올리고 RNA 추가후의 반응액 중의 올리고 RNA 농도는 180μM(각 스트랜드의 농도), 효소(T4 RNA 리가제 2)의 양은 0.36U/μL(2U/nmol 올리고 RNA)이다.
올리고 RNA 추가의 12시간후, 올리고 RNA를 추가한 3개 중 2개의 튜브에 016의 2개쇄 올리고 RNA(상기와 같은 등몰 혼합액)를 각 스트랜드 10nmol이 되는 양(11.1μL)으로 더 첨가하고, 계속해서 인큐베이트했다. 2회째의 올리고 RNA 추가후의 반응액 중의 올리고 RNA 농도는 245μM(각 스트랜드의 농도), 효소(T4 RNA 리가제 2)의 양은 0.33U/μL(1.33U/nmol 올리고 RNA)이다.
그 12시간후, 올리고 RNA를 2회 추가한 2개 중 1개의 튜브에, 016의 2개쇄 올리고 RNA(상기와 같은 등몰 혼합액)를 각 스트랜드 10nmol이 되는 양(11.1μL)으로 첨가하고, 또한 12시간 인큐베이트했다. 3회째의 올리고 RNA 추가후의 반응액 중의 올리고 RNA 농도는 300μM(각 스트랜드의 농도), 효소(T4 RNA 리가제 2)의 양은 0.3U/μL(1U/nmol 올리고 RNA)이다.
이들의 튜브로부터 12시간마다 반응액을 샘플링하고, 85℃에서 20분 가열해서 효소를 실활시켰다. 얻어진 반응후의 샘플은 이하와 같다. 반응시간은 라이게이션 반응 개시시로부터의 시간을 가리킨다.
튜브 1) 100μM 올리고 RNA(각 스트랜드에 대해서 토털 10nmol;추가 없음), 효소량 0.4U/μL, 반응온도 25℃, 반응시간 12,24, 36, 또는 48시간
튜브 2) 180μM 올리고 RNA(각 스트랜드에 대해서 토털 20nmol;1회 추가), 효소량 0.36U/μL, 반응온도 25℃, 반응시간 24, 36, 또는 48시간
튜브 3) 245μM 올리고 RNA(각 스트랜드에 대해서 토털 30nmol;2회 추가), 효소량 0.33U/μL, 반응온도 25℃, 반응시간 36, 또는 48시간
튜브4) 300μM 올리고 RNA(각 스트랜드에 대해서 토털 40nmol;3회 추가), 효소량 0.3U/μL, 반응온도 25℃, 반응시간 48시간
각 샘플에 대해서 UHPLC 해석을 행하고, FLP%를 산출했다. UHPLC의 조건, 및 FLP(%)의 산출 방법은 실시예 2와 같다. 결과를 표 3에 나타낸다.
또한, 각 샘플에 대해서, FLP%와 1개쇄 올리고 RNA 분자의 첨가량으로부터 목적 산물(ssTbRNA 분자)의 생성량(nmol)을 산출했다. 그 결과를 도 15에 나타낸다.
동일한 방법으로 2개쇄 올리고 RNA를 각 스트랜드의 최종 농도 200μM로 포함하는 라이게이션 반응액을 이용하여 검토를 행했다.
2개쇄 올리고 RNA(최종 농도 200μM;100μL의 반응액 중의 토털의 올리고 RNA량은 스트랜드 1 및 스트랜드 2의 각각에 대해서 20nmol), 및 T4 RNA 리가제 2(0.4U/μL;4U/nmol 올리고 RNA)를 버퍼(50mM Tris-HCl, 5mM MgCl2, 1mM DTT, 400μM ATP(pH 8.0)) 중에 포함하는 반응액 100μL를, 4개의 튜브에 분주하고, 25℃에서 인큐베이트함으로써 라이게이션 반응을 개시했다. 12시간후, 3개의 튜브에 016의 2개쇄 올리고 RNA(반응 버퍼(50mM Tris-HCl, 5mM MgCl2, 1mM DTT, 400μM ATP(pH 8.0)) 중, 016의 스트랜드 1과 스트랜드 2의 등몰 혼합액)를 각 스트랜드 20nmol이 되는 양(22.2μL)으로 첨가하고, 계속해서 인큐베이트했다. 그 후에 올리고 RNA를 최종 농도 100μM로 사용한 경우와 마찬가지로, 12시간마다 3회째까지 올리고 RNA를 추가하고, 라이게이션 반응을 계속했다.
이들 튜브로부터 12시간마다 반응액을 샘플링하고, 85℃에서 20분 가열해서 효소를 실활시켰다. 얻어진 반응후의 샘플은 이하와 같다. 반응시간은 라이게이션 반응 개시시부터의 시간을 가리킨다.
튜브 1) 200μM 올리고 RNA(각 스트랜드에 대해서 토털 20nmol;추가 없음), 효소량 0.4U/μL, 반응온도 25℃, 반응시간 12,24, 36, 또는 48시간
튜브 2) 327μM 올리고 RNA(각 스트랜드에 대해서 토털 40nmol;1회 추가), 효소량 0.36U/μL, 반응온도 25℃, 반응시간 24, 36, 또는 48시간
튜브 3) 415μM 올리고 RNA(각 스트랜드에 대해서 토털 60nmol;2회 추가), 효소량 0.33U/μL, 반응온도 25℃, 반응시간 36, 또는 48시간
튜브 4) 480μM 올리고 RNA(각 스트랜드에 대해서 토털 80nmol;3회 추가), 효소량 0.3U/μL, 반응온도 25℃, 반응시간 48시간
각 샘플에 대해서 UHPLC 해석을 행하고, FLP%를 산출했다. UHPLC의 조건, 및 FLP(%)의 산출 방법은 실시예 2와 같다. 결과를 표 4에 나타낸다.
또한, 각 샘플에 대해서, FLP%와 1개쇄 올리고 RNA 분자의 첨가량으로부터 목적 산물(ssTbRNA 분자)의 생성량(nmol)을 산출했다. 그 결과를 도 16에 나타낸다.
이상의 결과로부터, 본 발명의 방법에서는 라이게이션 반응상에 올리고 RNA를 순차 추가함으로써, 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자 (여기에서는 ssTbRNA 분자)의 생성량을 증가시킬 수 있는 것이 나타내어졌다.
일반적인 RNA 리가제 사용량(출발 올리고 RNA량 10μM에 대해서, 효소량 0.4U/μL)에서는 상기와 동일한 라이게이션 반응 조건에서 FLP 90% 초과의 라이게이션 효율이 얻어지지만, 100μL 반응액당 ssTbRNA 분자의 생성량은 1nmol 미만이다. 그러한 일반적인 경우와 비교해서 본 발명의 방법에서는 90% 이상의 FLP를 나타낸 효율적인 반응 조건 하에서, 올리고 RNA량당 효소 사용량을 1/30∼1/40로 삭감할 수 있는 것이 나타내어졌다.
[실시예 13] 다른 표적 유전자에 대한 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 제조
인간 TGF-β1 유전자 대신에 인간 GAPDH 유전자, 인간 LAMA1 유전자, 또는 인간 LMNA 유전자에 대한 유전자 발현 억제 서열을 포함하는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자를 실시예 1 및 2와 마찬가지로 2개의 분할 프래그먼트인 스트랜드 1 및 스트랜드 2를 라이게이션하는 방법에 의해 제작했다. 링커로서는 실시예 1 및 2와 동일한 프롤린 유도체, 또는 뉴클레오티드성 링커를 사용했다.
헤어핀형 1개쇄 RNA 분자, 및 그 분자 중의 분할 위치를 도 17에 나타낸다. 도 17 중, 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자에 포함되는 각 유전자에 대한 유전자 발현 억제 서열(안티센스 서열)을 프레임으로 나타냈다. 또한 각각의 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 2개의 분할 프래그먼트인 스트랜드 1 및 스트랜드 2의 페어를 표 5에 나타낸다. 표 5의 스트랜드 1 및 스트랜드 2의 페어는 라이게이션하는 말단의 염기의 조합으로서, U-U, A-A, A-U, 또는 U-A를 갖는 것이다.
프롤린 유도체를 포함하는 스트랜드 1 및 스트랜드 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 합성은 실시예 1과 동일한 방법에 의해 행했다. 프롤린 유도체 대신에 뉴클레오티드성 링커를 포함하는 스트랜드 1 및 스트랜드 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 합성은 포스포로아미다이트법을 사용한 고상 합성법에 의해 행했다.
실시예 2에 기재한 바와 같이 해서 각 페어의 스트랜드 1 및 스트랜드 2(표 5)를 어닐링하고, 2개쇄 올리고 RNA를 얻었다. 얻어진 2개쇄 올리고 RNA(스트랜드 1, 스트랜드 2의 각각의 최종 농도 10μM)를 버퍼(50mM Tris-HCl, 2mM MgCl2, 1mM 디티오트레이톨(DTT), 400μM 아데노신3인산(ATP)) 중에 포함하는 반응액(pH 7.5 [25℃])을 조제하고, 2μL의 10U/μL T4 RNA 리가제 2(New England Biolabs)(40U/nmol 올리고 RNA)를 첨가해서 반응액량 50μL로 했다. 이 반응액을 37℃에서 30분 인큐베이트했다.
효소 반응후, 반응액 중의 라이게이션 효율을 초고속 액체 크로마토그래피(UHPLC) 및 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Denatured PAGE)에 의해 확인했다. 라이게이션후 UHPLC의 조건, 및 라이게이션 효율(FLP(%))의 산출 방법은 실시예 2와 같다.
또, 각각의 라이게이션 생성물에 대해서 LC-MS 분석을 행하고, 예측되는 분자량을 갖는 것을 확인했다. LC-MS 분석에 사용한 LC 장치 및 MS 장치는 실시예 2에서 사용한 것과 동일하다.
결과를 도 18에 나타낸다. 표 5의 스트랜드 1 및 2의 페어는 모두 높은 라이게이션 효율을 나타냈다.
[비교예]
실시예 2의 실험과 병행해서 T4 RNA 리가제 2 대신에 T4 RNA 리가제를 이용하여, 표 1에 나타낸 스트랜드 1 및 스트랜드 2가 어닐링한 2개쇄 올리고 RNA를 라이게이션하고, 그 라이게이션 효율을 결정했다.
실시예 2에 기재한 바와 같이 해서, 각각의 페어의 스트랜드 1 및 스트랜드 2(표 1)를 어닐링하고, 2개쇄 올리고 RNA를 얻었다. 얻어진 2개쇄 올리고 RNA(스트랜드 1, 스트랜드 2의 각각의 최종 농도 10μM)를 버퍼(50mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 5mM 디티오트레이톨(DTT), 1mM 아데노신3인산(ATP)) 중에 포함하는 반응액(pH 7.8)을 조제하고, 0.5μL의 10U/μL T4 RNA 리가제(Promega)(10U/nmol 올리고 RNA)를 첨가해서 반응액량 50μL로 했다. 이 반응액을 37℃에서 30분 인큐베이트했다.
효소 반응후, 반응액 중의 라이게이션 효율을 초고속 액체 크로마토그래피(UHPLC) 및 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Denatured PAGE)에 의해 확인했다. 라이게이션후 UHPLC의 조건, 및 라이게이션 효율(FLP(%))의 산출 방법은 실시예 2와 같다.
결과를 도 19에 나타낸다. T4 RNA 리가제를 사용한 경우의 라이게이션 효율은 T4 RNA 리가제 2(도 3)와 비교해서 현저하게 낮았다.
(산업상의 이용 가능성)
본 발명은 범용형 아미다이트를 사용하여 효소 사용량을 저감하면서, 표적 유전자에 대한 발현 억제 서열을 포함하는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 효율적인 제조를 가능하게 할 수 있다.
(서열표 프리 텍스트)
서열 번호 1∼57:합성 RNA
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 그대로 인용에 의해 본 명세서에 도입되는 것으로 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Toray Industries, Inc.
<120> Method for producing hairpin single-stranded RNA molecules
<130> PH-7783-PCT
<150> JP 2018-070423
<151> 2018-03-30
<160> 57
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 51
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(25)
<223> nucleotides 24 and 25 are connected via a linker
<220>
<221> modified_base
<222> (50)..(51)
<223> nucleotides 50 and 51 are connected via a linker
<400> 1
agcagaguac acacagcaua uaccgguaua ugcugugugu acucugcuuc g 51
<210> 2
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<400> 2
agcagaguac acacagcaua uacc 24
<210> 3
<211> 26
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<400> 3
gguauaugcu guguguacuc ugcuuc 26
<210> 4
<211> 10
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (9)..(10)
<223> nucleotides 9 and 10 are connected via a linker
<400> 4
cucugcuucg 10
<210> 5
<211> 41
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(25)
<223> nucleotides 24 and 25 are connected via a linker
<400> 5
agcagaguac acacagcaua uaccgguaua ugcugugugu a 41
<210> 6
<211> 11
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (10)..(11)
<223> nucleotides 10 and 11 are connected via a linker
<400> 6
acucugcuuc g 11
<210> 7
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(25)
<223> nucleotides 24 and 25 are connected via a linker
<400> 7
agcagaguac acacagcaua uaccgguaua ugcugugugu 40
<210> 8
<211> 12
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (11)..(12)
<223> nucleotides 11 and 12 are connected via a linker
<400> 8
uacucugcuu cg 12
<210> 9
<211> 39
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(25)
<223> nucleotides 24 and 25 are connected via a linker
<400> 9
agcagaguac acacagcaua uaccgguaua ugcugugug 39
<210> 10
<211> 13
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (12)..(13)
<223> nucleotides 12 and 13 are connected via a linker
<400> 10
guacucugcu ucg 13
<210> 11
<211> 38
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(25)
<223> nucleotides 24 and 25 are connected via a linker
<400> 11
agcagaguac acacagcaua uaccgguaua ugcugugu 38
<210> 12
<211> 14
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (13)..(14)
<223> nucleotides 13 and 14 are connected via a linker
<400> 12
uguacucugc uucg 14
<210> 13
<211> 37
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(25)
<223> nucleotides 24 and 25 are connected via a linker
<400> 13
agcagaguac acacagcaua uaccgguaua ugcugug 37
<210> 14
<211> 15
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (14)..(15)
<223> nucleotides 14 and 15 are connected via a linker
<400> 14
guguacucug cuucg 15
<210> 15
<211> 36
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(25)
<223> nucleotides 24 and 25 are connected via a linker
<400> 15
agcagaguac acacagcaua uaccgguaua ugcugu 36
<210> 16
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (15)..(16)
<223> nucleotides 15 and 16 are connected via a linker
<400> 16
uguguacucu gcuucg 16
<210> 17
<211> 35
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(25)
<223> nucleotides 24 and 25 are connected via a linker
<400> 17
agcagaguac acacagcaua uaccgguaua ugcug 35
<210> 18
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (16)..(17)
<223> nucleotides 16 and 17 are connected via a linker
<400> 18
guguguacuc ugcuucg 17
<210> 19
<211> 34
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(25)
<223> nucleotides 24 and 25 are connected via a linker
<400> 19
agcagaguac acacagcaua uaccgguaua ugcu 34
<210> 20
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (17)..(18)
<223> nucleotides 17 and 18 are connected via a linker
<400> 20
uguguguacu cugcuucg 18
<210> 21
<211> 33
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(25)
<223> nucleotides 24 and 25 are connected via a linker
<400> 21
agcagaguac acacagcaua uaccgguaua ugc 33
<210> 22
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> nucleotides 18 and 19 are connected via a linker
<400> 22
cuguguguac ucugcuucg 19
<210> 23
<211> 32
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(25)
<223> nucleotides 24 and 25 are connected via a linker
<400> 23
agcagaguac acacagcaua uaccgguaua ug 32
<210> 24
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (19)..(20)
<223> nucleotides 19 and 20 are connected via a linker
<400> 24
gcugugugua cucugcuucg 20
<210> 25
<211> 31
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(25)
<223> nucleotides 24 and 25 are connected via a linker
<400> 25
agcagaguac acacagcaua uaccgguaua u 31
<210> 26
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(21)
<223> nucleotides 20 and 21 are connected via a linker
<400> 26
ugcugugugu acucugcuuc g 21
<210> 27
<211> 30
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(25)
<223> nucleotides 24 and 25 are connected via a linker
<400> 27
agcagaguac acacagcaua uaccgguaua 30
<210> 28
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (21)..(22)
<223> nucleotides 21 and 22 are connected via a linker
<400> 28
augcugugug uacucugcuu cg 22
<210> 29
<211> 29
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(25)
<223> nucleotides 24 and 25 are connected via a linker
<400> 29
agcagaguac acacagcaua uaccgguau 29
<210> 30
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (22)..(23)
<223> nucleotides 22 and 23 are connected via a linker
<400> 30
uaugcugugu guacucugcu ucg 23
<210> 31
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(25)
<223> nucleotides 24 and 25 are connected via a linker
<400> 31
agcagaguac acacagcaua uaccggua 28
<210> 32
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (23)..(24)
<223> nucleotides 23 and 24 are connected via a linker
<400> 32
auaugcugug uguacucugc uucg 24
<210> 33
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(25)
<223> nucleotides 24 and 25 are connected via a linker
<400> 33
agcagaguac acacagcaua uaccggu 27
<210> 34
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(25)
<223> nucleotides 24 and 25 are connected via a linker
<400> 34
uauaugcugu guguacucug cuucg 25
<210> 35
<211> 26
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(25)
<223> nucleotides 24 and 25 are connected via a linker
<400> 35
agcagaguac acacagcaua uaccgg 26
<210> 36
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(21)
<223> nucleotides 20 and 21 are connected via a linker
<400> 36
ugucauacuu cucaugguuc gaa 23
<210> 37
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (22)..(23)
<223> nucleotides 22 and 23 are connected via a linker
<400> 37
caugagaagu augacaacag ccggcugu 28
<210> 38
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (16)..(17)
<223> nucleotides 16 and 17 are connected via a linker
<400> 38
acgagacaaa cacuccg 17
<210> 39
<211> 34
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(25)
<223> nucleotides 24 and 25 are connected via a linker
<400> 39
aguguuuguc ucguuacaau auccggauau ugua 34
<210> 40
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (22)..(23)
<223> nucleotides 22 and 23 are connected via a linker
<400> 40
auuguaacga gacaaacacu ccg 23
<210> 41
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(25)
<223> nucleotides 24 and 25 are connected via a linker
<400> 41
aguguuuguc ucguuacaau auccggau 28
<210> 42
<211> 26
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<400> 42
uuguaacgag acaaacacuc cuucgg 26
<210> 43
<211> 35
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<400> 43
aguguuuguc ucguuacaau aucccacacc ggaua 35
<210> 44
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<400> 44
auuguaacga gacaaacacu ccuucgg 27
<210> 45
<211> 34
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<400> 45
aguguuuguc ucguuacaau aucccacacc ggau 34
<210> 46
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (21)..(22)
<223> nucleotides 21 and 22 are connected via a linker
<400> 46
ugcgcuuuuu ggugacgcuu cg 22
<210> 47
<211> 29
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(25)
<223> nucleotides 24 and 25 are connected via a linker
<400> 47
agcgucacca aaaagcgcaa uuccggaau 29
<210> 48
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (23)..(24)
<223> nucleotides 23 and 24 are connected via a linker
<400> 48
auugcgcuuu uuggugacgc uucg 24
<210> 49
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(25)
<223> nucleotides 24 and 25 are connected via a linker
<400> 49
agcgucacca aaaagcgcaa uuccgga 27
<210> 50
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<400> 50
uaugcugugu guacucugc 19
<210> 51
<211> 51
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (22)..(23)
<223> nucleotides 22 and 23 are connected via a linker
<220>
<221> modified_base
<222> (48)..(49)
<223> nucleotides 48 and 49 are connected via a linker
<400> 51
caugagaagu augacaacag ccggcuguug ucauacuucu caugguucga a 51
<210> 52
<211> 51
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(25)
<223> nucleotides 24 and 25 are connected via a linker
<220>
<221> modified_base
<222> (50)..(51)
<223> nucleotides 50 and 51 are connected via a linker
<400> 52
aguguuuguc ucguuacaau auccggauau uguaacgaga caaacacucc g 51
<210> 53
<211> 61
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<400> 53
aguguuuguc ucguuacaau aucccacacc ggauauugua acgagacaaa cacuccuucg 60
g 61
<210> 54
<211> 51
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(25)
<223> nucleotides 24 and 25 are connected via a linker
<220>
<221> modified_base
<222> (50)..(51)
<223> nucleotides 50 and 51 are connected via a linker
<400> 54
agcgucacca aaaagcgcaa uuccggaauu gcgcuuuuug gugacgcuuc g 51
<210> 55
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<400> 55
guugucauac uucucaugg 19
<210> 56
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<400> 56
auuguaacga gacaaacac 19
<210> 57
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<400> 57
uugcgcuuuu uggugacgc 19
Claims (13)
- 표적 유전자의 발현을 억제하는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 제조 방법으로서,
제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자를 어닐링하는 어닐링 공정과,
상기 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 3' 말단과 상기 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 5' 말단을 Rnl2 패밀리의 리가제에 의해 라이게이션하는 라이게이션 공정을 포함하고,
상기 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자는 제 1 링커를 통해 연결된 제 1 RNA 부분과 제 2 RNA 부분을 포함하고, 제 1 RNA 부분과 제 2 RNA 부분의 한쪽은 다른쪽에 대해서 상보적으로 결합 가능하며,
상기 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자는 제 2 링커를 통해 연결된 제 3 RNA 부분과 제 4 RNA 부분을 포함하고, 제 3 RNA 부분과 제 4 RNA 부분의 한쪽은 다른쪽에 대해서 상보적으로 결합 가능하며,
상기 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 상기 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자는 5' 말단 또는 3' 말단의 상보적인 서열간에서 분자간 2중쇄를 형성 가능하며,
어닐링 공정에 있어서 상기 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 상기 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자가 2중쇄를 형성할 때, 상기 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 3' 말단의 리보뉴클레오티드 잔기와 상기 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 5' 말단의 리보뉴클레오티드 잔기는 닉을 생성하고, 또 상기 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 5' 말단의 리보뉴클레오티드 잔기와 상기 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 3' 말단의 리보뉴클레오티드 잔기 사이에는 1개 이상의 리보뉴클레오티드 잔기의 갭이 존재하고,
상기 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 상기 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 라이게이션에 의해 생성되는 서열은 상기 표적 유전자에 대한 유전자 발현 억제 서열을 포함하는 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 제조 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자는 하기 식(I)로 나타내어지고, 상기 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자는 하기 식(II)로 나타내어지고,
5'-Xs-Lx1-Xa-3'···식(I)
5'-Ya1-Ya2-Ya3-Lx2-Ys-3'···식(II)
식(I) 및 식(II) 중, Xs, Xa, Ya1, Ya2, Ya3 및 Ys는 1개 또는 그 이상의 리보뉴클레오티드 잔기를 나타내고,
Lx1 및 Lx2는 각각 제 1 링커 및 제 2 링커를 나타내고,
Ya3은 Ys와 상보적이며,
라이게이션 공정에서 생기는 Xa-Ya1은 Xs와 상보적이며,
라이게이션 공정에서 생기는 Xa-Ya1-Ya2-Ya3은 상기 표적 유전자에 대한 유전자 발현 억제 서열을 포함하는 제조 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자가 3' 말단에 우라실(U) 또는 아데닌(A)을 갖고, 상기 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자가 5' 말단에 우라실(U) 또는 아데닌(A)을 갖는 제조 방법. - 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
제 1 링커 및 제 2 링커는 각각 독립적으로 (i)피롤리딘 골격 및 피페리딘 골격 중 적어도 한쪽을 포함하는 비뉴클레오티드성 링커, 또는 (ii)뉴클레오티드성 링커인 제조 방법. - 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
Rnl2 패밀리의 리가제가 T4 RNA 리가제 2인 제조 방법. - 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
pH 7.4∼8.6의 반응액 중에서 상기 라이게이션이 행해지는 제조 방법. - 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
2∼10mM의 2가 금속이온을 포함하는 반응액 중에서 상기 라이게이션이 행해지는 제조 방법. - 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
제 1 링커 및 제 2 링커는 각각 독립적으로 하기 식(VI)으로 나타내어지는 비뉴클레오티드성 링커인 제조 방법.
- 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 표적 유전자는 TGF-β1 유전자, GAPDH 유전자, LAMA1 유전자 또는 LMNA 유전자인 제조 방법. - 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자는 서열 번호 1로 나타내어지는 염기서열로 이루어지고, 24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되고, 50번째와 51번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 제조 방법. - 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와 상기 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자는 이하의 (1)∼(6) 중 어느 하나인 제조 방법.
(1)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 7로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 10번째와 11번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 6으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합
(2)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 19로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 16번째와 17번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 18로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합
(3)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 27로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 20번째와 21번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 26으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합
(4)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 29로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 21번째와 22번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 28로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합
(5)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 31로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 22번째와 23번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 30으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합
(6)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 33으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 23번째와 24번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 32로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합 - 이하의 (a)∼(l) 중 어느 하나인 1개쇄 올리고 RNA 분자.
(a)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 7로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자
(b)10번째와 11번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 6으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자
(c)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 19로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자
(d)16번째와 17번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 18로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자
(e)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 27로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자
(f)20번째와 21번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 26으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자
(g)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 29로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자
(h)21번째와 22번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 28로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자
(i)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 31로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자
(j)22번째와 23번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 30으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자
(k)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 33으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자
(l)23번째와 24번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 32로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 1개쇄 올리고 RNA 분자 - 이하의 (1)∼(6) 중 어느 하나의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합을 포함하는 TGF-β1 유전자의 발현을 억제하기 위한 헤어핀형 1개쇄 RNA 분자의 제조용 키트.
(1)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 7로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 10번째와 11번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 6으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합
(2)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 19로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 16번째와 17번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 18로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합
(3)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 27로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 20번째와 21번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 26으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합
(4)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 29로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 21번째와 22번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 28로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합
(5)24번째와 25번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 1 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 31로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1의 1개쇄 올리고 RNA 분자와, 22번째와 23번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 제 2 링커를 통해 연결되어 있는 서열 번호 30으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2의 1개쇄 올리고 RNA 분자의 조합
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040058886A1 (en) | 2002-08-08 | 2004-03-25 | Dharmacon, Inc. | Short interfering RNAs having a hairpin structure containing a non-nucleotide loop |
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
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| Fire et al., Nature, (1998) Feb 19;391(6669):806-811 |
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