CN111819280A - 发夹型单链rna分子的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供发夹型单链RNA分子的制备方法，其是抑制靶基因表达的发夹型单链RNA分子的制备方法，该制备方法包括以下工序：(i)退火工序，将第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子退火；以及(ii)连接工序，通过Rnl2家族的连接酶连接上述第1单链寡RNA分子的3’末端和上述第2单链寡RNA分子的5’末端，其中，通过第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的连接而生成的序列包含针对上述靶基因的基因表达抑制序列。

Description

发夹型单链RNA分子的制备方法
技术领域
本发明涉及发夹型单链RNA分子的制备方法。
背景技术
作为抑制基因表达的技术，例如已知有RNA干扰(RNAi) (非专利文献1)。在基于RNA干扰的基因表达抑制中，大多利用使用被称为siRNA (小干扰RNA，smallinterferingRNA)的短的双链RNA分子的方法。另外，还报道了：使用通过分子内退火部分地形成了双链的环状RNA分子的基因表达抑制技术(专利文献1)。
然而，由于siRNA在体内的稳定性低，容易解离成单链RNA，所以难以稳定地抑制基因表达。专利文献2报道了：利用使用环状胺衍生物形成的1个或2个接头将siRNA的有义链和反义链连接成单链而得的发夹型单链长链RNA分子可使siRNA稳定化。然而，该单链长链RNA分子无法通过使用TBDMS亚酰胺(amidite)等通用型亚酰胺的亚磷酰胺法有效地合成，因此，在其合成中需要使用特别的RNA亚酰胺(例如，专利文献2和3)。
专利文献4公开了：使用作为第三核酸链的辅助核酸和T4 RNA连接酶2来连接第一核酸链和第二核酸链的方法，但显示出辅助核酸越长则反应越慢，在该方法中带来良好的连接效率的辅助核酸受到限定。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利申请公开第2004/058886号；
专利文献2：国际公开WO2013/027843；
专利文献3：国际公开WO2016/159374；
专利文献4：国际公开WO2011/052013；
非专利文献
非专利文献1：Fire等人, Nature, (1998) Feb 19; 391 (6669): 806-811。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于：提供抑制标记基因表达的发夹型单链RNA分子的有效的制备方法。
用于解决课题的手段
为了解决上述课题，本发明人反复进行了深入研究，结果发现了：通过将包含针对靶基因的表达抑制序列的发夹型单链RNA分子分割成具有非核苷酸性接头或核苷酸性接头等接头的2个单链寡RNA分子进行合成，再将它们退火、连接，无需特别的RNA亚酰胺或辅助核酸，即可有效地制备该发夹型单链RNA分子；另外，通过调节连接条件，可进一步增加相对于酶使用量的发夹型单链RNA分子的生产效率，从而完成了本发明。
即，本发明包含以下内容。
[1] 发夹型单链RNA分子的制备方法，其是抑制靶基因表达的发夹型单链RNA分子的制备方法，该制备方法包括以下工序：
退火工序，将第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子退火；以及
连接工序，通过Rnl2家族的连接酶连接上述第1单链寡RNA分子的3’末端和上述第2单链寡RNA分子的5’末端，
其中，上述第1单链寡RNA分子包含经由第1接头进行连接的第1 RNA部分和第2 RNA部分，第1 RNA部分和第2 RNA部分中的一方可与另一方互补性地结合，
上述第2单链寡RNA分子包含经由第2接头进行连接的第3 RNA部分和第4 RNA部分，第3RNA部分和第4 RNA部分中的一方可与另一方互补性地结合，
上述第1单链寡RNA分子和上述第2单链寡RNA分子可在5’末端或3’末端的互补序列间形成分子间双链，
在退火工序中，当上述第1单链寡RNA分子和上述第2单链寡RNA分子形成双链时，上述第1单链寡RNA分子的3’末端的核糖核苷酸残基与上述第2单链寡RNA分子的5’末端的核糖核苷酸残基生成切口，并且在上述第1单链寡RNA分子的5’末端的核糖核苷酸残基与上述第2单链寡RNA分子的3’末端的核糖核苷酸残基之间存在1个以上的核糖核苷酸残基的缺口，
通过上述第1单链寡RNA分子与上述第2单链寡RNA分子的连接而生成的序列包含针对上述靶基因的基因表达抑制序列。
[2] 上述[1]所述的制备方法，其中，上述第1单链寡RNA分子由下述式(I)表示，上述第2单链寡RNA分子由下述式(II)表示：
5’-Xs-Lx1-Xa-3’ ・・・式(I)
5’-Ya1-Ya2-Ya3-Lx2-Ys-3’ ・・・式(II)
式(I)和式(II)中，Xs、Xa、Ya1、Ya2、Ya3和Ys表示1个或其以上的核糖核苷酸残基，
Lx1和Lx2分别表示第1接头和第2接头，
Ya3与Ys互补，
通过连接工序产生的Xa-Ya1与Xs互补，
通过连接工序产生的Xa-Ya1-Ya2-Ya3包含针对上述靶基因的基因表达抑制序列。
[3] 上述[1]或[2]所述的制备方法，其中，上述第1单链寡RNA分子在3’末端具有尿嘧啶(U)或腺嘌呤(A)，上述第2单链寡RNA分子在5’末端具有尿嘧啶(U)或腺嘌呤(A)。
[4] 上述[1]～[3]中任一项所述的制备方法，其中，第1接头和第2接头分别独立为：(i) 非核苷酸性接头，其包含吡咯烷骨架(backbone，主链)和哌啶骨架的至少一者；或者(ii) 核苷酸性接头。
[5] 上述[1]～[4]中任一项所述的制备方法，其中，Rnl2家族的连接酶为T4 RNA连接酶2。
[6] 上述[1]～[5]中任一项所述的制备方法，其中，上述连接在pH7.4～8.6的反应液中进行。
[7] 上述[1]～[6]中任一项所述的制备方法，其中，上述连接在含有2～10mM的二价金属离子的反应液中进行。
[8] 上述[1]～[7]中任一项所述的制备方法，其中，第1接头和第2接头分别独立为下述式(VI)所表示的非核苷酸性接头：
[化学式1]
Figure 343519DEST_PATH_IMAGE001
。
[9] 上述[1]～[8]中任一项所述的制备方法，其中，上述靶基因为TGF-β1基因、GAPDH基因、LAMA1基因或LMNA基因。
[10] 上述[1]～[9]中任一项所述的制备方法，其中，上述发夹型单链RNA分子由SEQ ID NO: 1所表示的核苷酸序列(塩基配列)构成，且第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，第50位和第51位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接。
[11] 上述[1]～[10]中任一项所述的制备方法，其中，上述第1单链寡RNA分子和上述第2单链寡RNA分子为以下(1)～(6)中的任意一种组合：
(1) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ IDNO: 7所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 6所表示的核苷酸序列构成，其中第10位和第11位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接；
(2) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ IDNO: 19所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 18所表示的核苷酸序列构成，其中第16位和第17位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接；
(3) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ IDNO: 27所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 26所表示的核苷酸序列构成，其中第20位和第21位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接；
(4) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ IDNO: 29所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 28所表示的核苷酸序列构成，其中第21位和第22位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接；
(5) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ IDNO: 31所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 30所表示的核苷酸序列构成，其中第22位和第23位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接；
(6) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ IDNO: 33所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 32所表示的核苷酸序列构成，其中第23位和第24位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接。
[12] 单链寡RNA分子，其为以下(a)～(l)中的任意一种分子：
(a) 由SEQ ID NO: 7所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(b) 由SEQ ID NO: 6所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第10位和第11位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(c) 由SEQ ID NO: 19所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(d) 由SEQ ID NO: 18所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第16位和第17位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(e) 由SEQ ID NO: 27所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(f) 由SEQ ID NO: 26所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第20位和第21位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(g) 由SEQ ID NO: 29所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(h) 由SEQ ID NO: 28所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第21位和第22位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(i) 由SEQ ID NO: 31所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(j) 由SEQ ID NO: 30所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第22位和第23位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(k) 由SEQ ID NO: 33所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(l) 由SEQ ID NO: 32所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第23位和第24位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接。
[13] 用于抑制TGF-β1基因表达的发夹型单链RNA分子的制备用试剂盒，该试剂盒包含以下(1)～(6)中的任意一种单链寡RNA分子的组合：
(1) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ IDNO: 7所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 6所表示的核苷酸序列构成，其中第10位和第11位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接；
(2) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ IDNO: 19所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 18所表示的核苷酸序列构成，其中第16位和第17位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接；
(3) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ IDNO: 27所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 26所表示的核苷酸序列构成，其中第20位和第21位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接；
(4) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ IDNO: 29所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 28所表示的核苷酸序列构成，其中第21位和第22位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接；
(5) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ IDNO: 31所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 30所表示的核苷酸序列构成，其中第22位和第23位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接；
(6) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ IDNO: 33所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 32所表示的核苷酸序列构成，其中第23位和第24位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请号2018-070423号的公开内容。
发明效果
根据本发明，可有效地制备抑制靶基因表达的发夹型单链RNA分子。
附图说明
[图1] 图1是本发明的一个实施方式的连接方法的概略图。
[图2] 图2是ssTbRNA分子(SEQ ID NO: 1)的示意图。P表示脯氨酸衍生物。SEQ IDNO: 1的第29位(U)～第47位(C)相当于活性序列(针对TGF-β1基因的基因表达抑制序列；反义序列)。
[图3] 图3显示表1所示的004～019的单链寡RNA分子(链1和链2)组(对)在使用了T4 RNA连接酶2的退火和连接反应后的连接效率。
[图4] 图4显示011、016和018的单链寡RNA分子(链1和链2)的结构。各对的右侧为链1、左侧为链2。
[图5] 图5显示在不同的寡RNA浓度和不同的反应温度下连接016的寡核酸时的连接效率的经时性变化。
[图6] 图6显示使用011、016和018的寡RNA (100μM)，在不同的反应温度下进行连接时的连接效率的经时性变化。A显示25℃下的连接结果，B显示37℃下的连接结果。
[图7] 图7显示在不同的ATP浓度下连接011的寡RNA时的变性PAGE分析的结果。
[图8] 图8显示在不同的ATP浓度下连接011的寡RNA时的连接效率。
[图9] 图9显示在不同的寡RNA浓度、不同的pH条件下连接016的寡RNA时的连接效率的经时性变化。
[图10] 图10显示在不同的pH条件下连接016的寡RNA时的连接效率。
[图11] 图11显示在不同的寡RNA浓度、不同的MgCl2浓度下连接016的寡RNA时的连接效率。A显示在10μM或100μM的寡RNA的存在下的连接结果，B显示在10μM或200μM的寡RNA的存在下的连接结果。
[图12] 图12显示在不同的MgCl2浓度、不同的pH条件下连接016的寡RNA时的连接效率。A显示pH7.5下的连接结果，B显示pH8.0下的连接结果。
[图13] 图13显示使用不同的酶量、且添加PEG进行连接时的连接效率。
[图14] 图14显示使用了不同的寡RNA浓度的连接反应的时间过程。
[图15] 图15显示将初期寡RNA浓度设为100μM、且边依次追加寡RNA边进行的连接反应中的目标产物ssTbRNA分子的生成量。ssTbRNA分子的生成量(nmol)=(单链寡RNA分子的添加量)×(FLP(Full Length Product、全长产物)(%))/100。图的横轴的h表示连接开始后的时间。连接开始时的寡RNA浓度为100μM (10nmol)、酶浓度为4单位/nmol寡RNA，在最终添加后成为寡RNA浓度为300μM (40nmol)、酶浓度为1单位/nmol寡RNA。
[图16] 图16显示将初期寡RNA浓度设为200μM、且边依次追加寡RNA边进行的连接反应中的目标产物ssTbRNA分子的生成量。ssTbRNA分子的生成量(nmol)=(单链寡RNA分子的添加量)×(FLP(%))/100。图的横轴的h表示连接开始后的时间。连接开始时的寡RNA浓度为200μM (20nmol)、酶浓度为4单位/nmol寡RNA，在最终添加后成为寡RNA浓度为480μM(80nmol)、酶浓度为0.5单位/nmol寡RNA。
[图17] 图17显示包含针对GAPDH基因、LAMA1基因或LMNA基因的基因表达抑制序列的发夹型单链RNA分子及其分割位置。(1)～(7)显示分割位置。针对各基因的基因表达抑制序列(活性序列/反义序列)显示在框中。
[图18] 图18显示使用了单链寡RNA分子对(链1和链2)的退火和连接反应后的连接效率，所述单链寡RNA分子对是包含针对GAPDH基因、LAMA1基因或LMNA基因的基因表达抑制序列的发夹型单链RNA分子的分割片段。
[图19] 图19显示表1所示的链1和链2的组(对)在使用了T4 RNA连接酶的退火和连接反应后的连接效率。
具体实施方式
以下，详细地说明本发明。
本发明涉及抑制靶基因表达的发夹型单链RNA分子的制备方法。利用本发明的方法制备的发夹型单链RNA分子具有如下的单链结构：包含基因表达抑制序列的双链RNA的有义链的3’末端和反义链的5’末端经由包含非核苷酸性接头或核苷酸性接头等接头的序列连接，且在其反义链的3’末端进一步经由包含非核苷酸性接头或核苷酸性接头等接头的序列连接有1个以上的核糖核苷酸残基。利用本发明的方法制备的发夹型单链RNA分子的5’末端和3’末端没有结合。在本说明书中，“发夹型”是指，单链RNA分子通过分子内退火(自身退火)形成1个以上的双链结构。利用本发明的方法制备的发夹型单链RNA分子中，典型的是，其包含5’末端的5’侧区域和包含3’末端的3’侧区域分别分开进行分子内退火而形成2个双链结构。在本说明书中，“RNA”、“RNA分子”、“核酸分子”和“核酸”可仅由核苷酸构成，也可由核苷酸和非核苷酸物质(例如，脯氨酸衍生物等环状胺衍生物)构成。
在本发明中，通过将抑制靶基因表达的发夹型单链RNA分子在2个接头(例如，非核苷酸性接头、核苷酸性接头、或它们组合而得的接头)所夹持的序列中以分割成2个的片段的方式合成，再将它们退火、连接，即可制得。连接是指，将2个核酸(在本发明中，典型的是RNA)通过使其末端的5’磷酸基和3’羟基结合(磷酸二酯键)而进行连接。在本发明的方法中，通过连接链较短的单链RNA分子的对来制备链较长的发夹型单链RNA分子，由此可实现该发夹型单链RNA分子的高产量的制备。
更具体而言，本发明涉及发夹型单链RNA分子的制备方法，其是抑制靶基因表达的发夹型单链RNA分子的制备方法，该制备方法包括以下工序：
退火工序，将第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子退火；以及
连接工序，通过Rnl2家族的连接酶连接上述第1单链寡RNA分子的3’末端和上述第2单链寡RNA分子的5’末端，
其中，通过第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的连接而生成的序列包含针对上述靶基因的基因表达抑制序列。
在本发明的方法中，第1单链寡RNA分子包含经由第1接头进行连接的第1 RNA部分和第2 RNA部分，第1 RNA部分和第2 RNA部分中的一方可与另一方互补性地结合。通过其互补性的结合，第1接头形成环，第1 RNA部分和第2 RNA部分与该环相邻且可形成茎。在第1单链寡RNA分子中，第1 RNA部分配置在5’末端侧，第2 RNA部分配置在3’末端侧。另外，第2单链寡RNA分子包含经由第2接头进行连接的第3 RNA部分和第4 RNA部分，第3 RNA部分和第4RNA部分中的一方可与另一方互补性地结合。通过其互补性的结合，第2接头形成环，第3RNA部分和第4 RNA部分与该环相邻且可形成茎。在第2单链寡RNA分子中，第3 RNA部分配置在5’末端侧，第4 RNA部分配置在3’末端侧。第1～第4 RNA部分分别包含1个或2个以上的核糖核苷酸残基。如此，第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子包含自身互补序列，可分别通过分子内退火(自身退火)而形成发夹结构。第1 RNA部分和第2 RNA部分优选其中一方具有较另一方长的核苷酸长度(塩基長)。另外，第3 RNA部分和第4 RNA部分优选其中一方具有较另一方长的核苷酸长度。在第1 RNA部分具有较第2 RNA部分长的核苷酸长度的情况下，第3 RNA部分优选具有较第4 RNA部分长的核苷酸长度。在第2 RNA部分具有较第1 RNA部分长的核苷酸长度的情况下，第4 RNA部分优选具有较第1 RNA部分长的核苷酸长度。在第1RNA部分和第2 RNA部分中，具有较长的核苷酸长度的一方的RNA部分优选与第1接头相邻且包含与具有较短的核苷酸长度的一方的RNA部分互补的核糖核苷酸残基或其序列。在第3RNA部分和第4 RNA部分中，具有较长的核苷酸长度的一方的RNA部分优选与第2接头相邻且包含与具有较短的核苷酸长度的一方的RNA部分互补的核糖核苷酸残基或其序列。
在本发明中，单链寡RNA分子中所含的2个RNA部分(第1和第2 RNA部分、或第3和第4 RNA部分)中的一方可与另一方“互补性地结合”是指，2个RNA部分中的任意一方(通常是指具有较短的核苷酸长度的RNA部分)的全长可与另一方的RNA部分(通常是指具有较长的核苷酸长度的一方的RNA部分)形成稳定的碱基配对而结合，这种情况下，前者的RNA部分的全长与后者的RNA部分内的对应的核糖核苷酸残基或其序列互补。单链寡RNA分子中所含的2个RNA部分的一方更优选与另一方的RNA部分中的对应的核糖核苷酸残基或其序列完全互补(即，一方的RNA部分的全部的核糖核苷酸残基与另一方的RNA部分中的对应的核糖核苷酸残基没有错配)。或者，单链寡RNA分子中所含的2个RNA部分的一方只要可与另一方的RNA部分形成稳定的碱基配对即可，可以包含1个以上、例如1个或2个核糖核苷酸残基的错配，这种情形也是“可互补性地结合”。然而，在本发明的方法中优选在所连接的分子末端的核糖核苷酸残基中不存在这种错配。
在一个实施方式中，第1 RNA部分和第4 RNA部分中的一方较另一方短，优选为1～7个核苷酸长度，例如为1～6个核苷酸长度、1～4个核苷酸长度、1～3个核苷酸长度、1个核苷酸长度或2个核苷酸长度。这种情况下，第1 RNA部分和第4 RNA部分中长的一方(另一方)可以是19～28个核苷酸长度，例如可以是19～27个核苷酸长度、19～25个核苷酸长度、19～23个核苷酸长度、20～28个核苷酸长度、21～27个核苷酸长度、20～25个核苷酸长度、22～27个核苷酸长度、23～26个核苷酸长度、24～28个核苷酸长度、26～28个核苷酸长度。
在第1 RNA部分较第4 RNA部分长的情况下，第2 RNA部分并不受以下的限定，可以是1～20个核苷酸长度，例如可以是2～20个核苷酸长度、2～15个核苷酸长度、3～10个核苷酸长度、3～6个核苷酸长度、5～12个核苷酸长度或9～12个核苷酸长度。在第1 RNA部分较第4 RNA部分短的情况下，第2 RNA部分并不受以下的限定，可以是8～38个核苷酸长度，例如可以是8～36个核苷酸长度、12～36个核苷酸长度、14～34个核苷酸长度、14～33个核苷酸长度、14～36个核苷酸长度或20～34个核苷酸长度。
第1 RNA部分的核苷酸序列与接头相邻且可包含CC (胞嘧啶-胞嘧啶)，这种情况下，第2 RNA部分的核苷酸序列优选以与其序列互补的方式、与接头相邻且包含GG (鸟嘌呤-鸟嘌呤)。在一个实施方式中，第1 RNA部分的核苷酸序列与接头相邻且可包含ACC (腺嘌呤-胞嘧啶-胞嘧啶)、GCC (鸟嘌呤-胞嘧啶-胞嘧啶)或UCC (尿嘧啶-胞嘧啶-胞嘧啶)，这种情况下，第2 RNA部分的核苷酸序列优选以与其序列互补的方式、与接头相邻且分别包含GGU (鸟嘌呤-鸟嘌呤-尿嘧啶)、GGC (鸟嘌呤-鸟嘌呤-胞嘧啶)或GGA (鸟嘌呤-鸟嘌呤-腺嘌呤)。第3 RNA部分的核苷酸序列与接头相邻且可包含C (胞嘧啶)，这种情况下，第4 RNA部分的核苷酸序列优选以与其残基互补的方式、与接头相邻且包含G (鸟嘌呤)。
第1或第2单链寡RNA分子的核苷酸长度、即2个RNA部分的总计核苷酸长度(不包括接头部分)并不受以下的限定，但优选为13～48个核苷酸长度。在第1 RNA部分较第4 RNA部分长的情况下，第1单链寡RNA分子的核苷酸长度、即第1 RNA部分和第2 RNA部分的总计核苷酸长度(不包括接头部分)优选为21～48个核苷酸长度，例如为21～45个核苷酸长度、25～45个核苷酸长度、26～35个核苷酸长度、26～30个核苷酸长度、26～28个核苷酸长度或33～36个核苷酸长度。在第1 RNA部分较第4 RNA部分短的情况下，第1单链寡RNA分子的核苷酸长度、即第1 RNA部分和第2 RNA部分的总计核苷酸长度(不包括接头部分)优选为13～45个核苷酸长度，例如为13～43个核苷酸长度、15～41个核苷酸长度、15～30个核苷酸长度、17～25个核苷酸长度或20～25个核苷酸长度。
在本发明的方法中，第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子在5’末端或3’末端的序列中彼此互补。第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子可在5’末端或3’末端的互补序列间(优选完全互补序列间)形成分子间双链。更具体而言，在一个实施方式中，形成了发夹结构的第1单链寡RNA分子的5’末端的序列(第1 RNA部分的5’末端的、发夹结构的茎/环中不包含的序列)和形成了发夹结构的第2单链寡RNA分子的5’末端的序列(第3 RNA部分的5’末端的、发夹结构的茎/环中不包含的序列)彼此互补，可形成分子间双链。在另一个实施方式中，形成了发夹结构的第1单链寡RNA分子的3’末端的序列(第2 RNA部分的3’末端的、发夹结构的茎/环中不包含的序列)和形成了发夹结构的第2单链寡RNA分子的3’末端的序列(第4 RNA部分的3’末端的、发夹结构的茎/环中不包含的序列)彼此互补，可形成分子间双链。在本发明的方法的退火工序中，第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子在5’末端或3’末端的互补序列间形成分子间双链，从而生成双链寡RNA。
在一个实施方式中，在第1和第2单链寡RNA分子间互补序列的长度(不包含后述的缺口部分)并不受以下的限定，通常为6个核苷酸长度以上，例如为7个核苷酸以上、10个核苷酸长度以上、12个核苷酸长度以上、14个核苷酸长度以上或18个核苷酸以上，例如可以是6～27个核苷酸长度、7～25个核苷酸长度、10～25个核苷酸长度、12～23个核苷酸长度、12～22个核苷酸长度、12～15个核苷酸长度或18～23个核苷酸长度。
在本发明的方法的退火工序中，当第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子形成双链时，第1单链寡RNA分子的3’末端的核糖核苷酸残基和上述第2单链寡RNA分子的5’末端的核糖核苷酸残基生成切口。更具体而言，在退火工序中，第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子除了在第1和第2单链寡RNA分子间通过互补序列的分子间退火形成双链(分子间双链)以外，还在第1 RNA部分和第2 RNA部分、以及第3 RNA部分和第4 RNA部分中分别通过分子内退火形成双链(分子内双链、即发夹结构)，在第2 RNA部分和第3 RNA部分之间生成切口。在本发明中，“切口”是指，在核酸双链的一方的核苷酸链中2个核苷酸残基间的磷酸二酯键被切断使得3’羟基和5’磷酸基游离的状态。切口可通过连接反应来连接。
在本发明的方法的退火工序中，当第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子形成双链时，在第1单链寡RNA分子的5’末端的核糖核苷酸残基与第2单链寡RNA分子的3’末端的核糖核苷酸残基之间存在1个以上的核糖核苷酸残基的缺口。该缺口无法通过连接反应来连接，因此第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子在连接反应后形成单链RNA分子。1个以上的核糖核苷酸残基的缺口可以是1～4个残基(1、2、3或4个残基)的缺口。在该缺口部分不会形成碱基配对。
第1单链寡RNA分子的5’末端的核糖核苷酸残基与第2单链寡RNA分子的3’末端的核糖核苷酸残基之间的缺口，在第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子退火而得的双链中，可位于更接近第1接头的位置、或者可位于更接近第2接头的位置。
通过第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的连接而生成的序列包含针对靶基因的基因表达抑制序列。第1 RNA部分或第4 RNA部分可包含针对靶基因的基因表达抑制序列(有义序列或反义序列；例如有义序列)。通过连接使第2 RNA部分和第3 RNA部分连接而得的序列可包含针对靶基因的基因表达抑制序列(反义序列或有义序列；例如反义序列)。在一个实施方式中，第2 RNA部分或第3 RNA部分可包含针对靶基因的基因表达抑制序列(反义序列或有义序列；例如反义序列)。
在本发明的方法中，接头、例如第1接头和第2接头可以是非核苷酸性接头、核苷酸性接头、或它们的组合。
在一个实施方式中，第1单链寡RNA分子在3’末端具有尿嘧啶(U)或腺嘌呤(A)，并且，第2单链寡RNA分子在5’末端具有尿嘧啶(U)或腺嘌呤(A)。这里，单链寡RNA分子在3’末端或5’末端具有尿嘧啶(U)或腺嘌呤(A)是指，单链寡RNA分子的3’末端或5’末端的核糖核苷酸残基包含尿嘧啶(U)或腺嘌呤(A)作为碱基。具体而言，第1单链寡RNA分子的3’末端的核糖核苷酸残基的碱基与第2单链寡RNA分子的5’末端的核糖核苷酸残基的碱基的优选组合可以是U-A、U-U、A-U或A-A。
本发明的方法的一个实施方式的概略图见图1。图1中，Lx1和Lx2为接头(例如，非核苷酸性接头、核苷酸性接头、或它们的组合)。在本发明的方法中，通过连接链较短的单链RNA分子的对来制备链较长的发夹型单链RNA分子，由此可实现高产量。
在一个实施方式中，本发明所涉及的抑制靶基因表达的发夹型单链RNA分子的制备方法包括以下工序：
退火工序，将下述式(I)所表示的第1单链寡RNA分子(图1中，链1)：
5’-Xs-Lx1-Xa-3’ ・・・式(I)
和下述式(II)所表示的第2单链寡RNA分子(图1中，链2)：
5’-Ya1-Ya2-Ya3-Lx2-Ys-3’ ・・・式(II)
退火；以及连接工序，连接第1单链寡RNA分子的3’末端和第2单链寡RNA分子的5’末端。该连接可通过Rnl2家族的连接酶来进行。
在另一个实施方式中，本发明所涉及的抑制靶基因表达的发夹型单链RNA分子的制备方法包括以下工序：
退火工序，将下述式(A)所表示的第1单链寡RNA分子：
5’-XXs-Lx1-XXa3-XXa2-XXa1-3’ ・・・式(A)
和下述式(B)所表示的第2单链寡RNA分子：
5’-YYa-Lx2-YYs-3’ ・・・式(B)
退火；以及连接工序，连接第1单链寡RNA分子的3’末端和第2单链寡RNA分子的5’末端。该连接可通过Rnl2家族的连接酶来进行。
在本发明中，“寡RNA”和“寡RNA分子”是指，具有49个核苷酸长度以下(非核苷酸性接头和核苷酸性接头等接头部分的残基数不计算在内)的核苷酸序列的RNA分子。本发明中，术语“寡RNA”和“寡RNA分子”通常互换使用。本发明所涉及的单链寡RNA分子有时还称为单链寡RNA、寡核酸、单链核酸分子、寡RNA或寡RNA分子。
式(I)和式(II)中，Xs、Xa、Ya1、Ya2、Ya3和Ys表示1个或其以上的核糖核苷酸残基。式(I)和式(II)中，Lx1和Lx2分别独立地表示接头、例如非核苷酸性接头、核苷酸性接头、或它们的组合。
式(I)表示区域Xs和Xa经由Lx1连接而得的结构。式(II)表示区域Ya1、Ya2和Ya3依次连接而得的核糖核苷酸序列(Ya1-Ya2-Ya3)与区域Ys经由Lx2连接而得的结构。
式(A)和式(B)中，XXs、XXa3、XXa2、XXa1、YYa和YYs表示1个或其以上的核糖核苷酸残基。式(A)和式(B)中，Lx1和Lx2分别独立地表示接头、例如非核苷酸性接头、核苷酸性接头、或它们的组合。
式(A)表示区域XXa3、XXa2和XXa1依次连接而得的核糖核苷酸序列(XXa3-XXa2-XXa1)与区域XXs经由Lx1连接而得的结构。式(B)表示区域YYa和YYs经由Lx2连接而得的结构。
Xs、Xa、Ya1、Ya2、Ya3、Ys、XXs、XXa3、XXa2、XXa1、YYa和YYs由核糖核苷酸残基构成。核糖核苷酸残基可以是具有选自腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤或胞嘧啶的任一种核酸碱基的残基。核糖核苷酸残基还可以是修饰核糖核苷酸残基，例如可具有被修饰的核酸碱基(修饰碱基)。作为修饰，可列举：荧光色素(染料)标记、甲基化、卤化、假尿苷化、氨基化、脱氨基、硫醇化、二羟基化等，但并不限于这些。Xs、Xa、Ya1、Ya2、Ya3和Ys可分别独立为仅由非修饰核糖核苷酸残基构成的残基，也可以是除非修饰核糖核苷酸残基以外还包含修饰核糖核苷酸残基的残基，还可以是仅由修饰核糖核苷酸残基构成的残基。Xs可在5’末端包含修饰核糖核苷酸残基。Ys可在3’末端包含修饰核糖核苷酸残基。同样，XXs、XXa3、XXa2、XXa1、YYa和YYs可分别独立为仅由非修饰核糖核苷酸残基构成的残基，也可以是除非修饰核糖核苷酸残基以外还包含修饰核糖核苷酸残基的残基，还可以是仅由修饰核糖核苷酸残基构成的残基。XXs可在5’末端包含修饰核糖核苷酸残基。YYs可在3’末端包含修饰核糖核苷酸残基。
在本发明中，通过连接工序产生的Xa-Ya1 (通过连接使Xa和Ya1连接而得的核苷酸序列)与Xs互补。在一个实施方式中，Xs可以是19～28个核苷酸长度，例如可以是19～27个核苷酸长度、19～25个核苷酸长度、19～23个核苷酸长度、20～28个核苷酸长度、21个核苷酸～27个核苷酸、21个核苷酸～25个核苷酸、22～27个核苷酸长度、23～26个核苷酸长度、24～28个核苷酸长度或26～28个核苷酸长度。
在本发明中，通过连接工序产生的XXa1-YYa (通过连接使XXa1和YYa连接而得的核苷酸序列)与YYs互补。在一个实施方式中，YYs可以是19～28个核苷酸长度，例如可以是19～27个核苷酸长度、19～25个核苷酸长度、19～23个核苷酸长度、20～28个核苷酸长度、21个核苷酸～27个核苷酸、21个核苷酸～25个核苷酸、22～27个核苷酸长度、23～26个核苷酸长度、24～28个核苷酸长度或26～28个核苷酸长度。
在本发明中，Xa与Xs内的对应的残基或序列互补。在一个实施方式中，式(I)中Xs的核苷酸序列与接头相邻且可包含C (胞嘧啶)。这种情况下，Xa的核苷酸序列以与Xs互补的方式、与接头相邻且包含G (鸟嘌呤)。在一个实施方式中，式(I)中Xs的核苷酸序列与接头相邻且可包含CC (胞嘧啶-胞嘧啶)。这种情况下，Xa的核苷酸序列以与Xs互补的方式、与接头相邻且包含GG (鸟嘌呤-鸟嘌呤)。在一个实施方式中，式(I)中Xs的核苷酸序列与接头相邻且可包含ACC (腺嘌呤-胞嘧啶-胞嘧啶)。这种情况下，Xa的核苷酸序列以与Xs互补的方式、与接头相邻且包含GGU (鸟嘌呤-鸟嘌呤-尿嘧啶)。在一个实施方式中，Xa可在3’末端包含碱基尿嘧啶(U)或腺嘌呤(A)。Xa可以是1～20个核苷酸长度，例如可以是2～20个核苷酸长度、2～15个核苷酸长度、3～10个核苷酸长度、3～6个核苷酸长度、5～12个核苷酸长度或9～12个核苷酸长度。
在本发明中，XXa3与XXs互补。在一个实施方式中，式(A)中XXs的核苷酸序列与接头相邻且可包含C (胞嘧啶)。这种情况下，XXa3的核苷酸序列以与XXs互补的方式、与接头相邻且包含G (鸟嘌呤)。在一个实施方式中，式(A)中XXs的核苷酸序列与接头相邻且可包含CC (胞嘧啶-胞嘧啶)。这种情况下，XXa3的核苷酸序列以与XXs互补的方式、与接头相邻且包含GG (鸟嘌呤-鸟嘌呤)。在一个实施方式中，式(A)中XXs的核苷酸序列与接头相邻且可包含ACC (腺嘌呤-胞嘧啶-胞嘧啶；以5’→3’的方向)。这种情况下，XXa3的核苷酸序列以与XXs互补的方式、与接头相邻且包含GGU (鸟嘌呤-鸟嘌呤-尿嘧啶；以5’→3’的方向)。在一个实施方式中，XXa1的核苷酸序列可在3’末端包含碱基尿嘧啶(U)或腺嘌呤(A)。XXa3和XXs优选为1～7个核苷酸长度，例如为1～4个核苷酸长度、1个核苷酸长度或2个核苷酸长度。在一个实施方式中，在YYs为26～28个核苷酸长度的情况下，XXa3和XXs可以是1个核苷酸长度。
在本发明中，Ya3与Ys互补。在一个实施方式中，Ya3的核苷酸序列与接头相邻且可包含C (胞嘧啶)。这种情况下，Ys的核苷酸序列以与Ya3互补的方式、与接头相邻且包含G(鸟嘌呤)。Ya3和Ys优选为1～7个核苷酸长度，例如为1～4个核苷酸长度、1个核苷酸长度或2个核苷酸长度。在一个实施方式中，在Xs为26～28个核苷酸长度的情况下，Ya3和Ys可以是1个核苷酸长度。
在本发明中，YYa与YYs内的对应的残基或序列互补。在一个实施方式中，YYa的核苷酸序列与接头相邻且可包含C (胞嘧啶)。这种情况下，YYs的核苷酸序列以与YYa互补的方式、与接头相邻且包含G (鸟嘌呤)。YYa可以是2～20个核苷酸长度，例如可以是2～15个核苷酸长度、3～10个核苷酸长度、3～6个核苷酸长度、5～12个核苷酸长度或9～12个核苷酸长度。
在本发明中，“互补”是指，2个核酸或核苷酸在其间可形成稳定的碱基配对。互补的2个核酸具有相同的核苷酸长度。互补的2个核酸典型的是由彼此的互补序列(互补链)构成、即完全互补。或者，互补的2个核酸可分别含有：修饰碱基、和在退火时在对应的位置可与该修饰碱基形成碱基对的核酸碱基。
当连接后的本发明所涉及的发夹型单链RNA分子发生分子内退火(自身退火)时，Ya2不与Xs或Ys形成碱基配对。Ya2优选为1～4个核苷酸长度，例如为1个、2个或3个核苷酸长度。同样，当连接后的本发明所涉及的发夹型单链RNA分子发生分子内退火(自身退火)时，XXa2不与XXs或YYs形成碱基配对。XXa2优选为1～4个核苷酸长度，例如为1个、2个或3个核苷酸长度。
在第1单链寡RNA分子(链1)中，式(I)中的Xs和Xa的总计核苷酸长度(不包括非核苷酸性接头、核苷酸性接头、或它们的组合等接头部分)优选为21～48个核苷酸长度，例如为21～45个核苷酸长度、25～45个核苷酸长度、26～35个核苷酸长度、26～30个核苷酸长度、26～28个核苷酸长度或33～36个核苷酸长度。
在第2单链寡RNA分子(链2)中，式(II)中的Ya1优选为6～27个核苷酸长度，例如为7～25个核苷酸长度、10～25个核苷酸长度、12～23个核苷酸长度、12～22个核苷酸长度、12～15个核苷酸长度或18～23个核苷酸长度。
在第2单链寡RNA分子(链2)中，式(II)中的Ya1、Ya2、Ya3和Ys的总计核苷酸长度(不包括非核苷酸性接头、核苷酸性接头、或它们的组合等接头部分)优选为13～45个核苷酸长度，例如为13～43个核苷酸长度、15～41个核苷酸长度、15～30个核苷酸长度、17～25个核苷酸长度或20～25个核苷酸长度。
在第1单链寡RNA分子(链1)中，式(A)中的XXs、XXa3、XXa2和XXa1的总计核苷酸长度(不包括非核苷酸性接头、核苷酸性接头、或它们的组合等接头部分)优选为13～45个核苷酸长度，例如为13～43个核苷酸长度、15～41个核苷酸长度、15～30个核苷酸长度、17～25个核苷酸长度或20～25个核苷酸长度。
XXa1优选为6～27个核苷酸长度，例如为7～25个核苷酸长度、10～25个核苷酸长度、12～23个核苷酸长度、12～22个核苷酸长度、12～15个核苷酸长度或18～23个核苷酸长度。
在第2单链寡RNA分子(链2)中，式(B)中的YYa和YYs的总计核苷酸长度(不包括非核苷酸性接头、核苷酸性接头、或它们的组合等接头部分)优选为21～48个核苷酸长度，例如为21～45个核苷酸长度、25～45个核苷酸长度、26～35个核苷酸长度、26～30个核苷酸长度、26～28个核苷酸长度或33～36个核苷酸长度。
在本发明中，对接头、例如第1接头和第2接头没有特别限定，例如可分别独立为非核苷酸性接头、核苷酸性接头、或它们的组合。核苷酸性接头由1个以上的核苷酸残基(核糖核苷酸残基或脱氧核糖核苷酸残基、优选核糖核苷酸残基)构成。非核苷酸性接头不含核苷酸残基。对本发明中使用的接头的构成单位没有特别限定，可以是核苷酸残基和/或非核苷酸残基。作为非核苷酸性接头与核苷酸性接头的组合的接头包含核苷酸残基和非核苷酸残基两者。本发明的接头例如可由以下(1)～(7)中的任意一种残基构成：
(1) 非修饰核苷酸残基；
(2) 修饰核苷酸残基；
(3) 非修饰核苷酸残基与修饰核苷酸残基的组合；
(4) 非核苷酸残基；
(5) 非核苷酸残基与非修饰核苷酸残基的组合；
(6) 非核苷酸残基与修饰核苷酸残基的组合；
(7) 非核苷酸残基、非修饰核苷酸残基和修饰核苷酸残基的组合。
在一个实施方式中，第1接头和第2接头均可为由核苷酸残基构成的接头(核苷酸性接头)，或者均可为由非核苷酸残基构成的接头(非核苷酸性接头)。或者，可以是第1接头和第2接头中的一方由核苷酸残基构成、而另一方由非核苷酸残基构成。第1接头和第2接头(上述式中，Lx1和Lx2的接头)可为相同结构也可为不同结构。
在本发明中使用的接头、例如第1接头和第2接头(上述式中，Lx1和Lx2)包含非核苷酸残基的情况下，对非核苷酸残基的个数没有特别限定，例如可以是1～8个、1～6个、1～4个、1个、2个或3个。“非核苷酸残基”是指，非核苷酸性接头的构成单位。非核苷酸残基并不限于以下的残基，例如可以是具有吡咯烷骨架或哌啶骨架的环状胺衍生物等。非核苷酸残基例如可以是以后述的式(III)所表示的结构为单元(1个)的残基。
在本发明的一个实施方式中，接头、例如第1接头和第2接头(上述式中，Lx1和Lx2)可以是包含1个以上的吡咯烷骨架和哌啶骨架中的至少一方的非核苷酸性接头。第1接头和第2接头(上述式中，Lx1和Lx2)可为相同结构也可为不同结构。第1接头和第2接头(上述式中，Lx1和Lx2)可分别独立地具有包含吡咯烷骨架的非核苷酸结构，也可具有包含哌啶骨架的非核苷酸结构，还可具有上述包含吡咯烷骨架的非核苷酸结构和上述包含哌啶骨架的非核苷酸结构的两者。利用本发明的方法制备的发夹型单链RNA分子通过这样的接头使有义链和反义链连接，从而核酸酶耐性优异。
在本发明的发夹型单链RNA分子中，吡咯烷骨架例如可以是构成吡咯烷的5元环的1个以上的碳原子被取代而得的吡咯烷衍生物的骨架，在被取代的情况下，例如优选为2位的碳原子(C-2)以外的碳原子。上述碳原子例如可被氮原子、氧原子或硫原子取代。吡咯烷骨架例如可在吡咯烷的5元环内包含例如碳-碳双键或碳-氮双键。在上述吡咯烷骨架中，构成吡咯烷的5元环的碳原子和氮原子例如可结合氢原子，也可结合如后所述的取代基。接头Lx1例如可经由上述吡咯烷骨架的任何基团连接式(I)中的Xs和Xa、以及式(A)中的XXs和XXa3。接头Lx2例如可经由上述吡咯烷骨架的任何基团连接式(II)中的Ya3和Ys、以及式(B)中的YYa和YYs。它们可经由上述5元环的任意一个碳原子和氮原子、优选上述5元环的2位的碳原子(C-2)和氮原子进行连接。作为上述吡咯烷骨架，例如可列举脯氨酸骨架、脯氨醇骨架等。
上述哌啶骨架例如可以是构成哌啶的6元环的1个以上的碳被取代而得的哌啶衍生物的骨架，在被取代的情况下，例如优选为C-2的碳原子以外的碳原子。上述碳原子例如可被氮原子、氧原子或硫原子取代。上述哌啶骨架例如可在哌啶的6元环内包含例如碳-碳双键或碳-氮双键。在上述哌啶骨架中，构成哌啶的6元环的碳原子和氮原子例如可结合氢原子，也可结合如后所述的取代基。接头Lx1例如可经由上述哌啶骨架的任何基团连接式(I)中的Xs和Xa、以及式(A)中的XXs和XXa3。接头Lx2例如可经由上述哌啶骨架的任何基团连接式(II)中的Ya3和Ys、以及式(B)中的YYa和YYs。它们可经由上述6元环的任意一个碳原子和氮原子、优选上述6元环的2位的碳原子(C-2)和氮原子进行连接。
上述接头例如可以仅包含由上述的非核苷酸结构构成的非核苷酸残基。
上述接头区例如可由下述式(III)表示、或者可包含1个或2个以上的下述式(III)所表示的非核苷酸残基：
[化学式2]
Figure 816089DEST_PATH_IMAGE002
上述式(III)中，
X1和X2分别独立为H2、O、S或NH；
Y1和Y2分别独立为单键、CH2、NH、O或S；
R3为与环A上的C-3、C-4、C-5或C-6结合的氢原子或取代基；
L1为由n个原子构成的亚烷基链，这里，亚烷基碳原子上的氢原子可被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代也可不被取代；或者
L1为上述亚烷基链的一个以上的碳原子被氧原子取代而得的聚醚链，
这里，在Y1为NH、O或S的情况下，与Y1结合的L1的原子为碳，与OR1结合的L1的原子为碳，氧原子彼此不相邻；
L2为由m个原子构成的亚烷基链，这里，亚烷基碳原子上的氢原子可被OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代也可不被取代；或者
L2为上述亚烷基链的一个以上的碳原子被氧原子取代而得的聚醚链，
这里，在Y2为NH、O或S的情况下，与Y2结合的L2的原子为碳，与OR2结合的L2的原子为碳，氧原子彼此不相邻；
Ra、Rb、Rc和Rd分别独立为取代基或保护基；
l为1或2；
m为0～30的范围的整数；
n为0～30的范围的整数；
环A中，环A上的C-2以外的1个碳原子可被氮原子、氧原子、硫原子取代，
在环A内可包含碳-碳双键或碳-氮双键，
这里，R1和R2可存在也可不存在，在存在的情况下，R1和R2分别独立为：由不存在R1和R2的式(III)表示的非核苷酸残基。
式(I)中的Xs和Xa、式(A)中的XXs和XXa3可经由式(III)中的-OR1-或-OR2-与接头Lx1连接。在一个实施方式中，Xs可经由-OR1-与接头Lx1连接、而Xa可经由-OR2-与接头Lx1连接。在另一个实施方式中，Xs可经由-OR2-与接头Lx1连接、而Xa可经由-OR1-与接头Lx1连接。在又一个实施方式中，XXs可经由-OR1-与接头Lx1连接、而XXa3可经由-OR2-与接头Lx1连接。在又一个实施方式中，XXs可经由-OR2-与接头Lx1连接、而XXa3可经由-OR1-与接头Lx1连接。
式(II)中的Ya3和Ys、式(B)中的YYa和YYs可经由式(III)中的-OR1-或-OR2-与接头Lx2连接。在一个实施方式中，Ya3可经由-OR1-与接头Lx2连接、而Ys可经由-OR2-与接头Lx2连接。在另一个实施方式中，Ya3可经由-OR2-与接头Lx2连接、而Ys可经由-OR1-与接头Lx2连接。在又一个实施方式中，YYa可经由-OR1-与接头Lx2连接、而YYs可经由-OR2-与接头Lx2连接。在又一个实施方式中，YYa可经由-OR2-与接头Lx2连接、而YYs可经由-OR1-与接头Lx2连接。
在一个优选实施方式中，Xs可经由-OR2-与接头Lx1连接、而Xa可经由-OR1-与接头Lx1连接，而且Ya3可经由-OR2-与接头Lx2连接、而Ys可经由-OR1-与接头Lx2连接。在另一个优选实施方式中，XXs可经由-OR2-与接头Lx1连接、而XXa3可经由-OR1-与接头Lx1连接，而且YYa可经由-OR2-与接头Lx2连接、而YYs可经由-OR1-与接头Lx2连接。
上述式(III)中，X1和X2例如分别独立为H2、O、S或NH。在上述式(III)中，X1为H2是指，X1和X1所结合的碳原子一起形成CH2 (亚甲基)。关于X2亦同。
上述式(III)中，Y1和Y2分别独立为单键、CH2、NH、O或S。
上述式(III)中，在环A中，l为1或2。在l=1的情况下，环A为5元环，例如为上述吡咯烷骨架。上述吡咯烷骨架例如可列举脯氨酸骨架、脯氨醇骨架等，可例示它们的二价结构。在l=2的情况下，环A为6元环，例如为上述哌啶骨架。环A中，环A上的C-2以外的1个碳原子可被氮原子、氧原子或硫原子取代。另外，环A可在环A内包含碳-碳双键或碳-氮双键。环A例如可为L型和D型的任一种。
上述式(III)中，R3为与环A上的C-3、C-4、C-5或C-6结合的氢原子或取代基。在R3为上述取代基的情况下，取代基R3可为1个也可为多个，还可以不存在，在为多个的情况下可相同也可不同。
取代基R3例如为卤素、OH、OR4、NH2、NHR4、NR4R5、SH、SR4或氧代基(=O)等。
R4和R5例如分别独立为取代基或保护基，可相同也可不同。上述取代基例如可列举：卤素、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、芳基、杂芳基、芳基烷基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基(cyclyl)烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、杂环基烯基、杂环基烷基、杂芳基烷基、甲硅烷基、甲硅烷氧基烷基等。以下亦同。取代基R3可以是列举的这些取代基。
上述保护基例如为使反应性高的官能团转换为惰性的官能团，可列举已知的保护基等。上述保护基例如可引用文献(J. F. W. McOmie, “Protecting Groups in OrganicChemistry”Plenum Press, London and New York, 1973)的记载。对上述保护基没有特别限定，例如可列举：叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、双(2-乙酰氧基乙基氧基)甲基(ACE)、三异丙基甲硅烷氧基甲基(TOM)、1-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE)、2-氰基乙氧基甲基(CEM)和甲苯基磺酰基乙氧基甲基(TEM)、二甲氧基三苯甲基(DMTr)等。在R3为OR4的情况下，对上述保护基没有特别限定，例如可列举：TBDMS基、ACE基、TOM基、CEE基、CEM基和TEM基等。除此之外，还可列举含甲硅烷基的基团。以下亦同。
上述式(III)中，L1为由n个原子构成的亚烷基链。上述亚烷基碳原子上的氢原子例如可被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，也可不被取代。或者，L1可以是上述亚烷基链的1个以上的碳原子被氧原子取代而得的聚醚链。上述聚醚链例如为聚乙二醇。需要说明的是，在Y1为NH、O或S的情况下，与Y1结合的L1的原子为碳，与OR1结合的L1的原子为碳，氧原子彼此不相邻。即，例如在Y1为O的情况下，其氧原子与L1的氧原子不相邻，OR1的氧原子与L1的氧原子不相邻。
上述式(III)中，L2为由m个原子构成的亚烷基链。上述亚烷基碳原子上的氢原子例如可被OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代，也可不被取代。或者，L2可以是上述亚烷基链的1个以上的碳原子被氧原子取代而得的聚醚链。需要说明的是，在Y2为NH、O或S的情况下，与Y2结合的L2的原子为碳，与OR2结合的L2的原子为碳，氧原子彼此不相邻。即，例如在Y2为O的情况下，其氧原子与L2的氧原子不相邻，OR2的氧原子与L2的氧原子不相邻。
对L1的n和L2的m没有特别限定，各自下限例如为0，上限也没有特别限定。n和m例如可根据接头Lx1和Lx2的所期望的长度而适当设定。从制备成本和收率等方面考虑，n和m例如分别优选0～30，更优选为0～20，进一步优选为0～15。n和m可以相同(n=m)也可不同。n+m例如为0～30，优选为0～20，更优选为0～15。
Ra、Rb、Rc和Rd例如分别独立为取代基或保护基。上述取代基和上述保护基例如与上述相同。
上述式(III)中，氢原子例如可分别独立地被Cl、Br、F和I等卤素取代。
在优选的实施方式中，上述接头为下述式(IV-1)～(IV-9)的任一个所表示的接头，或者可以是包含1个或2个以上的下述式(IV-1)～(IV-9)所表示的非核苷酸残基的接头。在下述式中，q为0～10的整数。在下述式中，n和m与上述式(III)相同。作为具体例子，可列举：式(IV-1)中n=8、式(IV-2)中n=3、式(IV-3)中n=4或8、式(IV-4)中n=7或8、式(IV-5)中n=3和m=4、式(IV-6)中n=8和m=4、式(IV-7)中n=8和m=4、式(IV-8)中n=5和m=4、式(IV-9)中q=1和m=4。
[化学式3]
Figure 850910DEST_PATH_IMAGE003
在一个实施方式中，上述接头为下述式(V)或(VI)所表示的接头，或者可以是包含1个或2个以上的下述式(V)或(VI)所表示的非核苷酸残基的接头。
[化学式4]
Figure 776140DEST_PATH_IMAGE004
[化学式5]
Figure 448DEST_PATH_IMAGE005
在一个实施方式中，第1 RNA部分(Xs、XXs)可在式(VI)中的2位碳原子侧与接头Lx1连接、而第2 RNA部分(Xa、XXa3)可在式(VI)中的1位氮原子侧与接头Lx1连接，第3 RNA部分(Ya3、YYa)可在2位碳原子侧与接头Lx2连接、而第4 RNA部分(Ys、YYs)可在式(VI)中的1位氮原子侧与接头Lx2连接。
式(VI)所表示的接头可以是下述式(VI-1)或(VI-2)所表示的光学活性体。
[化学式6]
Figure 327524DEST_PATH_IMAGE006
[化学式7]
Figure 549558DEST_PATH_IMAGE007
在第1和第2单链寡RNA分子中，Xa与Xs的3’侧区互补，Ya3与Ys互补。因此，在第1单链寡RNA分子中，Xa朝向Xs折叠，Xa与Xs通过自身退火形成双链。同样，在第2单链寡RNA分子中，Ys朝向Ya3折叠，Ys与Ya3通过自身退火形成双链。
在第1和第2单链寡RNA分子中，YYa与YYs的5’侧区互补，XXa3与XXs互补。因此，在第1单链寡RNA分子中，XXa3朝向XXs折叠，XXa3与XXs通过自身退火形成双链。同样，在第2单链寡RNA分子中，YYa朝向YYs折叠，YYa与YYs通过自身退火形成双链。
上述这样的接头容易形成β-转角结构。因此，认为式(I)的第1单链寡RNA分子由于接头Lx1而采取在β-转角侧折叠的结构，由此，当Xa和Xs进行自身退火时采取Xa的3’末端容易接近式(II)的第2单链寡RNA分子的5’末端(Ya1的5’末端)的结构。关于式(A)和(B)的第1和第2单链寡RNA分子亦同。
在另一个实施方式中，接头、例如第1接头和第2接头(上述式中，Lx1和Lx2)可以是由1个以上的核苷酸残基构成的核苷酸性接头。在接头为核苷酸性接头的情况下，对其长度没有特别限定，但优选为不会妨碍接头前后的序列、例如第1 RNA部分和第2 RNA部分、或者第3 RNA部分和第4 RNA部分的双链形成的长度。作为核苷酸性接头的第1接头和第2接头(上述式中，Lx1和Lx2)的长度(核苷酸数)和核苷酸序列可以相同也可不同。其核苷酸性接头的长度例如可以是1个核苷酸以上、2个核苷酸以上或3个核苷酸以上，并且，例如可以是100个核苷酸以下、80个核苷酸以下或50个核苷酸以下。这样的核苷酸性接头的长度例如可以是1～50个核苷酸、1～30个核苷酸、3～20个核苷酸、3～10个核苷酸或3～7个核苷酸，例如可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。核苷酸性接头优选为自身不互补、且在序列内部不会发生自身退火的结构。
在本发明中使用的接头、例如第1接头和第2接头(上述式中，Lx1和Lx2)包含非修饰核苷酸残基和修饰核苷酸残基(例如，修饰核糖核苷酸残基)的情况下，对修饰核苷酸残基的个数没有特别限定，例如可以是1～5个、1～4个、1～3个、例如1个或2个。
作为本发明中使用的核苷酸性接头的例子，可列举由5’-C-A-C-A-C-C-3’、5’-C-C-A-C-A-C-C-3’或5’-U-U-C-G-3’的RNA序列构成的接头。在一个实施方式中，第1接头和第2接头(上述式中，Lx1和Lx2)分别独立地选自5’-C-A-C-A-C-C-3’、5’-C-C-A-C-A-C-C-3’和5’-U-U-C-G-3’。在一个实施方式中，第1接头由5’-C-A-C-A-C-C-3’的RNA序列构成，而第2接头由5’-U-U-C-G-3’的RNA序列构成。
第1和第2单链寡RNA分子可利用本领域技术人员所已知的RNA合成法进行制作。作为本领域技术人员所已知的RNA合成法，例如可列举亚磷酰胺法或H-膦酸酯法等。在亚磷酰胺法中，将与载体的疏水性基团结合的核糖核苷通过其与RNA亚酰胺(核糖核苷亚磷酰胺)的缩合反应而延伸，经过氧化和脱保护，再重复进行与RNA亚酰胺的缩合反应，从而可进行RNA合成。若以式(I)和(II)的第1和第2单链寡RNA分子为例进行说明，则本发明所涉及的第1和第2单链寡RNA分子可如下制作：利用RNA合成法、例如亚磷酰胺法进行从3’末端侧到接头之前的序列(Xa、Ys)的合成，之后结合具有吡咯烷骨架或哌啶骨架的环状胺衍生物这样的非核苷酸残基而形成接头，在其末端进一步依次进行从接头到5’末端的序列(Xs；或Ya3、Ya2和Ya1)的合成，从而即可制得。或者，本发明所涉及的第1和第2单链寡RNA分子可如下制作：利用RNA合成法、例如亚磷酰胺法进行从3’末端侧到核苷酸性接头之前的序列(Xa、Ys)的合成，接着合成核苷酸性接头的序列，再依次进行从核苷酸性接头之后到5’末端的序列(Xs；或Ya3、Ya2和Ya1)的合成，从而即可制得。在使用非核苷酸性接头与核苷酸性接头的组合的情况下和使用式(A)和(B)的第1和第2单链寡RNA分子的情况下，也可按照上述方法进行制作。在本发明中，可使用任意的RNA亚酰胺，例如还可使用在2位的羟基上具有叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三异丙基甲硅烷氧基甲基(TOM)、双(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)、1-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE)、2-氰基乙氧基甲基(CEM)、甲苯基磺酰基乙氧基甲基(TEM)、二甲氧基三苯甲基(DMTr)等各种保护基的通用型RNA亚酰胺。另外，在本发明中，在RNA合成中，可使用聚苯乙烯系载体、丙烯酰胺系载体或玻璃载体等任意的固相载体。载体可以是珠、平板、碎片、管等任意形态。作为载体的例子，可列举聚苯乙烯珠、例如NittoPhase(R) HL rG (ibu)或rU (KINOVATE)，但并不限于这些。
在上述接头中，用于形成非核苷酸性接头的环状胺衍生物为RNA合成用的单体，例如具有下述式(VII)的结构。该环状胺衍生物基本上与上述的各接头结构对应，关于接头结构的说明也可引用到该环状胺衍生物中。形成接头的环状胺衍生物例如可用作自动核酸合成用的亚酰胺，例如可适用于普通的核酸自动合成装置。
[化学式8]
Figure 962085DEST_PATH_IMAGE008
上述式(VII)中，
X1和X2分别独立为H2、O、S或NH；
Y1和Y2分别独立为单键、CH2、NH、O或S；
R1和R2分别独立为H、保护基或磷酸保护基；
R3为与环A上的C-3、C-4、C-5或C-6结合的氢原子或取代基；
L1为由n个原子构成的亚烷基链，这里，亚烷基碳原子上的氢原子可被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，也可不被取代；或者
L1为上述亚烷基链的一个以上的碳原子被氧原子取代而得的聚醚链；
这里，在Y1为NH、O或S的情况下，与Y1结合的L1的原子为碳，与OR1结合的L1的原子为碳，氧原子彼此不相邻；
L2为由m个原子构成的亚烷基链，这里，亚烷基碳原子上的氢原子可被OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代，也可不被取代；或者
L2为上述亚烷基链的一个以上的碳原子被氧原子取代而得的聚醚链；
这里，在Y2为NH、O或S的情况下，与Y2结合的L2的原子为碳，与OR2结合的L2的原子为碳，氧原子彼此不相邻；
Ra、Rb、Rc和Rd分别独立为取代基或保护基；
l为1或2；
m为0～30的范围的整数；
n为0～30的范围的整数；
环A中，环A上的C-2以外的1个碳原子可被氮原子、氧原子或硫原子取代；
在环A内可包含碳-碳双键或碳-氮双键。
在上述式(VII)中，关于与上述式(III)相同的位置，可引用上述式(III)的说明。具体而言，在上述式(VII)中，例如X1、X2、Y1、Y2、R3、L1、L2、l、m、n和环A可全部引用上述式(III)的说明。
在上述式(VII)中，如上所述，R1和R2分别独立为H、保护基或磷酸保护基。
上述保护基例如与上述式(III)中的说明同样，作为具体例子，例如可选自组I。上述组I例如可列举：二甲氧基三苯甲基(DMTr)、TBDMS基、ACE基、TOM基、CEE基、CEM基、TEM基和下述式所示的含甲硅烷基的基团，其中，优选为DMTr基和上述含甲硅烷基的基团的任一种。
[化学式9]
Figure 724505DEST_PATH_IMAGE009
上述磷酸保护基例如可由下式表示。
Figure 906087DEST_PATH_IMAGE010
在上述式中，R6为氢原子或任意的取代基。R6例如优选烃基，上述烃基可被吸电子基团取代，也可不被取代。R6例如可列举：卤素、卤代烷基、杂芳基、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、甲硅烷基、甲硅烷氧基烷基、杂环基烯基、杂环基烷基、杂芳基烷基和烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基等烃等，而且，可被吸电子基团取代也可不被取代。具体而言，R6例如可列举：β-氰基乙基、硝基苯基乙基、甲基等。
R7和R8分别为氢原子或任意的取代基，可以相同也可不同。R7和R8例如优选烃基，上述烃基可进一步被任意的取代基取代，也可不被取代。上述烃基例如与上述的上述R6中的列举同样，优选为甲基、乙基、异丙基。这种情况下，具体而言，-NR7R8例如可列举二异丙基氨基、二乙基氨基、乙基甲基氨基等。或者，取代基R7和R8成为一体，可与它们所结合的氮原子一起(即，-NR7R8成为一体)形成含氮环(例如，哌啶基、吗啉代基等)。
作为上述磷酸保护基的具体例子，例如可选自下述组II。组II例如可列举：-P(OCH2CH2CN)(N(i-Pr)2)、-P(OCH3)(N(i-Pr)2)等。在上述式中，i-Pr表示异丙基。
在上述式(VII)中，例如，R1和R2中的任意一方为H或保护基，而另一方为H或磷酸保护基。优选例如在R1为上述保护基的情况下，R2优选H或上述磷酸保护基，具体而言，在R1选自上述组I的情况下，R2优选选自H或上述组II。另外，优选例如在R1为上述磷酸保护基的情况下，R2优选H或上述保护基，具体而言，在R1选自上述组II的情况下，R2优选选自H或上述组I。
上述环状胺衍生物可以是下述式(VII-1)～(VII-9)的任一者所表示的物质。在下述式中，n和m与上述式(VII)相同。在下述式中，q为0～10的整数。作为具体例子，可列举：式(VII-1)中n=8、式(VII-2)中n=3、式(VII-3)中n=4或8、式(VII-4)中n=7或8、式(VII-5)中n=3和m=4、式(VII-6)中n=8和m=4、式(VII-7)中n=8和m=4、式(VII-8)中n=5和m=4、式(VII-9)中q=1和m=4。
[化学式10]
Figure 548290DEST_PATH_IMAGE011
在一个实施方式中，上述环状胺衍生物可以是由下述式(VIII)所表示的脯氨醇衍生物或下述式(IX)所表示的脯氨酸衍生物表示的物质。
[化学式11]
Figure 448113DEST_PATH_IMAGE012
上述环状胺衍生物例如可包含标记物质、例如稳定同位素。
上述环状胺衍生物例如可按照国际公开WO2013/027843或国际公开WO2016/159374中记载的、核酸分子合成用单体的制备方法来合成。
在本发明的方法中，通过将上述的第1单链寡RNA分子(例如，图1中的链1)和第2单链寡RNA分子(例如，图1中的链2)退火、连接，可制备本发明所涉及的抑制靶基因表达的发夹型单链RNA分子。
在利用本发明的方法制备的发夹型单链RNA分子中，通过连接工序产生的Xa-Ya1-Ya2-Ya3包含针对靶基因的基因表达抑制序列。基因表达抑制序列可包含在Xa、Xa-Ya1、Xa-Ya1-Ya2或Xa-Ya1-Ya2-Ya3中。同样，通过连接工序产生的XXa3-XXa2-XXa1-YYa包含针对靶基因的基因表达抑制序列。基因表达抑制序列可包含在YYa、XXa1-YYa、XXa2-XXa1-YYa或XXa3-XXa2-XXa1-YYa中。基因表达抑制序列优选为由靶基因转录的mRNA的整体或一部分的有义序列或反义序列。需要说明的是，由于通过连接工序产生的Xa-Ya1与Xs互补，所以Xs也可包含针对靶基因的基因表达抑制序列。同样，由于XXa1-YYa与YYs互补，所以YYs也可包含针对靶基因的基因表达抑制序列。
上述发夹型单链RNA分子可包含1个基因表达抑制序列，也可包含2个以上。上述发夹型单链RNA分子例如可具有2个以上的针对相同靶基因的相同的基因表达抑制序列，也可具有2个以上的针对相同靶基因的不同的基因表达抑制序列，还可具有2个以上的针对不同靶基因的不同的基因表达抑制序列。具有2个以上的针对不同靶基因的基因表达抑制序列的发夹型单链RNA分子可用于抑制2种以上的不同靶基因的表达。在本发明中，“基因”是指，转录成mRNA的基因组区，可以是蛋白编码区，也可以是RNA编码区。
本发明所涉及的发夹型单链RNA分子具有经由基因表达抑制序列而抑制靶基因表达的能力。基于本发明所涉及的发夹型单链RNA分子的靶基因的表达抑制，优选为基于RNA干扰的表达抑制，但并不限于此。RNA干扰通常是指下述现象：长的双链RNA (dsRNA)在细胞内被Dicer切割成3’末端突出的19～21个碱基对左右的短的双链RNA (siRNA：smallinterfering RNA (小干扰RNA) )，其中之一的单链RNA与靶mRNA结合而降解靶mRNA，从而抑制靶mRNA的翻译，由此抑制源自靶mRNA的靶基因的表达。关于与靶mRNA结合的siRNA中所含的单链RNA的序列，例如根据靶基因的种类已经报道了各种类型。本发明例如可使用siRNA中所含的单链RNA的序列(优选反义序列)作为基因表达抑制序列。利用本发明的方法制备的发夹型单链RNA分子在体内被切割而生成siRNA，从而可抑制靶基因的表达。本发明所涉及的发夹型单链RNA分子可用于治疗或预防与靶基因的表达或表达增加有关的疾病或病症。
基因表达抑制序列优选为19～30个核苷酸长度，更优选为19～27个核苷酸长度，例如可以是19、20、21、22或23个核苷酸长度。基因表达抑制序列优选由与靶基因的mRNA的至少一部分序列完全相同或完全互补的RNA序列构成。基因表达抑制序列可针对靶基因的核苷酸序列通过常规方法进行设计。
靶基因可以是任意的基因，例如可以是任意的疾病相关基因。靶基因优选为源自与通过发夹型单链RNA分子在生物体、细胞、组织或器官等中带来基因表达抑制的对象相同的生物种的基因，例如可以是源自动物、植物、真菌等的基因，所述动物包括：人、黑猩猩、大猩猩等灵长类，马、牛、猪、绵羊、山羊、骆驼、驴等家畜，狗、猫、兔等宠物，小鼠、大鼠、豚鼠等啮齿类等在内的哺乳动物；鱼类、昆虫等。作为靶基因，没有特别限定，例如可列举：TGF-β1基因、GAPDH基因、LAMA1基因、LMNA基因。人TGF-β1 (转化生长因子-β1)基因的mRNA序列例如可根据GenBank (NCBI)登录号(accession number) NM_000660来获取(NCBI Gene ID：7040)。人GAPDH (甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因的mRNA序列例如可根据GenBank (NCBI)登录号NM_002046来获取(NCBI Gene ID：2597)。人LAMA1基因的mRNA序列例如可根据GenBank登录号NM_005559来获取(NCBI Gene ID：284217)。人LMNA基因的mRNA序列例如可根据GenBank登录号NM_170707来获取(NCBI Gene ID：4000)。在靶基因为TGF-β1基因的情况下，利用本发明的方法制备的发夹型单链RNA分子在体内抑制TGF-β1基因的表达。这样的发夹型单链RNA分子可通过TGF-β1基因的基因表达抑制，而用于治疗或预防与TGF-β1基因的表达或表达增加有关的疾病或病症、例如肺纤维化或急性肺病。同样，抑制GAPDH基因、LAMA1基因、LMNA基因等其他靶基因表达的本发明所涉及的发夹型单链RNA分子也可通过该靶基因的表达抑制，而用于治疗或预防与该靶基因的表达或表达增加有关的疾病或病症。
利用本发明的方法制备的、抑制靶基因表达的发夹型单链RNA分子的1个例子为下述的RNA分子：由SEQ ID NO: 1所表示的核苷酸序列构成、并且第24位和第25位的核苷酸(核糖核苷酸残基)经由接头(Lx1)连接、而第50位和第51位的核苷酸(核糖核苷酸残基)经由接头(Lx2)连接的RNA分子(例如，图2)。由SEQ ID NO: 1所表示的核苷酸序列构成的这样的发夹型单链RNA分子以5’末端→3’末端的方向包含：由SEQ ID NO: 2所表示的核苷酸序列构成的RNA序列、上述的接头(非核苷酸性接头、核苷酸性接头、或它们的组合；图1的Lx1)、由SEQ ID NO: 3所表示的核苷酸序列构成的RNA序列、上述的接头(非核苷酸性接头、核苷酸性接头、或它们的组合；图1的Lx2)和碱基G (鸟嘌呤)。由SEQ ID NO: 1所表示的核苷酸序列构成的上述发夹型单链RNA分子包含针对作为靶基因的TGF-β1基因的基因表达抑制序列。SEQ ID NO: 1所表示的核苷酸序列的第29位～第47位的序列相当于基因表达抑制序列(活性序列；SEQ ID NO: 50)。本发明提供：包含该基因表达抑制序列的发夹型单链RNA分子的制备方法。
用于制备这样的RNA分子的第1单链寡RNA分子(链1)和第2单链寡RNA分子(链2)的例子，列举在后述的表1中。在表1所列举的第1单链寡RNA分子(链1)和第2单链寡RNA分子(链2)的序列中，包含P (脯氨酸衍生物)的接头可取代成上述的其他非核苷酸性接头或核苷酸性接头等任意的接头。在一个实施方式中，第1单链寡RNA分子优选在3’末端具有尿嘧啶(U)或腺嘌呤(A)，并且，第2单链寡RNA分子优选在5’末端具有尿嘧啶(U)或腺嘌呤(A)。
作为用于制备由SEQ ID NO: 1所表示的核苷酸序列构成的发夹型单链RNA分子的特别优选的第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的对，可列举以下的组合：
(1) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ IDNO: 7所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头(Lx1)进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 6所表示的核苷酸序列构成，其中第10位和第11位的核糖核苷酸残基经由第2接头(Lx2)进行连接；
(2) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ IDNO: 19所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头(Lx1)进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 18所表示的核苷酸序列构成，其中第16位和第17位的核糖核苷酸残基经由第2接头(Lx2)进行连接；
(3) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ IDNO: 27所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头(Lx1)进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 26所表示的核苷酸序列构成，其中第20位和第21位的核糖核苷酸残基经由第2接头(Lx2)进行连接；
(4) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ IDNO: 29所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头(Lx1)进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 28所表示的核苷酸序列构成，其中第21位和第22位的核糖核苷酸残基经由第2接头(Lx2)进行连接；
(5) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ IDNO: 31所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头(Lx1)进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 30所表示的核苷酸序列构成，其中第22位和第23位的核糖核苷酸残基经由第2接头(Lx2)进行连接；以及
(6) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ IDNO: 33所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头(Lx1)进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 32所表示的核苷酸序列构成，其中第23位和第24位的核糖核苷酸残基经由第2接头(Lx2)进行连接。这些第1单链寡RNA分子在3’末端(Xa的3’末端)包含U或A。这些第2单链寡RNA分子在5’末端(Ya1的5’末端)包含U或A。
这里，例如，关于(1)的第1单链寡RNA分子，“第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头(Lx1)进行连接”是指，在第1单链寡RNA分子中SEQ ID NO: 19所表示的核苷酸序列的第24位的核糖核苷酸残基(碱基：C)与第25位的核糖核苷酸残基(碱基：G)经由第1接头Lx1结合。需要说明的是，本发明中的关于单链寡RNA分子和发夹型单链RNA分子的“第X位和第Y位的核糖核苷酸残基经由Z连接”的表述也依据此来解释。
在(1)～(6)的第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子中，接头Lx1和Lx2优选为式(VI)、例如式(VI-1)或式(VI-2)所表示的接头。
在优选的实施方式中，(1)～(6)的第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子具有式(VI)所示的接头作为Lx1和Lx2，式(I)的Xa可在式(VI)中的1位氮原子侧与接头Lx1连接，而Xs可在2位碳原子侧与接头Lx1连接，Ys可在式(VI)中的1位氮原子侧与接头Lx2连接，而Ya3可在2位碳原子侧与接头Lx2连接。
为了按照本发明的方法制备发夹型单链RNA分子，本发明提供单链寡RNA分子，所述单链寡RNA分子可用作第1单链寡RNA分子或第2单链寡RNA分子。
在一个实施方式中，作为用于制备抑制作为靶基因的TGF-β1基因表达的发夹型单链RNA分子的单链寡RNA分子的例子，可列举下述(a)～(l)，但并不限于这些：
(a) 由SEQ ID NO: 7所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(b) 由SEQ ID NO: 6所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第10位和第11位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(c) 由SEQ ID NO: 19所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(d) 由SEQ ID NO: 18所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第16位和第17位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(e) 由SEQ ID NO: 27所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(f) 由SEQ ID NO: 26所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第20位和第21位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(g) 由SEQ ID NO: 29所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(h) 由SEQ ID NO: 28所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第21位和第22位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(i) 由SEQ ID NO: 31所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(j) 由SEQ ID NO: 30所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第22位和第23位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(k) 由SEQ ID NO: 33所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；以及
(l) 由SEQ ID NO: 32所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第23位和第24位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接。
在优选的实施方式中，可将单链寡RNA分子(a)和(b)、(c)和(d)、(e)和(f)、(g)和(h)、(i)和(j)、或(k)和(l)组合，用于本发明所涉及的发夹型单链RNA分子的制备方法。
作为另一个实施方式，利用本发明的方法制备的针对GAPDH基因、LAMA1基因或LMNA基因即靶基因的发夹型单链RNA分子的例子见图17。针对GAPDH基因的发夹型单链RNA分子的例子为：由SEQ ID NO: 51所表示的核苷酸序列构成、并且第22位和第23位的核苷酸(核糖核苷酸残基)经由第1接头(Lx1)连接、而第48位和第49位的核苷酸(核糖核苷酸残基)经由第2接头(Lx2)连接的RNA分子。针对LAMA1基因的发夹型单链RNA分子的例子为：由SEQID NO: 52所表示的核苷酸序列构成、并且第24位和第25位的核苷酸(核糖核苷酸残基)经由第1接头(Lx1)连接、而第50位和第51位的核苷酸(核糖核苷酸残基)经由第2接头(Lx2)连接的RNA分子。针对LAMA1基因的发夹型单链RNA分子的其他例子为：由SEQ ID NO: 53所表示的核苷酸序列构成、并且第24位和第31位的核苷酸(核糖核苷酸残基)经由核苷酸性的第1接头(Lx1)连接、而第56位和第61位的核苷酸(核糖核苷酸残基)经由核苷酸性的第2接头(Lx2)连接的RNA分子。针对LMNA基因的发夹型单链RNA分子的例子为：由SEQ ID NO: 54所表示的核苷酸序列构成、并且第24位和第25位的核苷酸(核糖核苷酸残基)经由第1接头(Lx1)连接、而第50位和第51位的核苷酸(核糖核苷酸残基)经由第2接头(Lx2)连接的RNA分子。针对作为靶基因的GAPDH基因、LAMA1基因或LMNA基因的基因表达抑制序列(反义序列；分别为SEQ ID NO: 55、56、57)的例子也见图17。本发明还提供：包含这些基因表达抑制序列中的任一序列的发夹型单链RNA分子的制备方法。
作为用于制备抑制作为靶基因的GAPDH基因表达的发夹型单链RNA分子的单链寡RNA分子的例子，可列举下述(m)和(n)，但并不限于这些：
(m) 由SEQ ID NO: 37所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第22位和第23位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；以及
(n) 由SEQ ID NO: 36所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第20位和第21位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接。
在优选的实施方式中，可将(m)和(n)的单链寡RNA分子组合，用于本发明所涉及的发夹型单链RNA分子的制备方法。
作为用于制备抑制作为靶基因的LAMA1基因表达的发夹型单链RNA分子的单链寡RNA分子的例子，可列举下述(o)～(v)，但并不限于此：
(o) 由SEQ ID NO: 39所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(p) 由SEQ ID NO: 38所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第16位和第17位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(q) 由SEQ ID NO: 41所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(r) 由SEQ ID NO: 40所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第22位和第23位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(s) 由SEQ ID NO: 43所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第24位和第31位的核糖核苷酸残基经由核苷酸性接头进行连接；
(t) 由SEQ ID NO: 42所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第21位和第26位的核糖核苷酸残基经由核苷酸性接头进行连接；
(u) 由SEQ ID NO: 45所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第24位和第31位的核糖核苷酸残基经由核苷酸性接头进行连接；以及
(v) 由SEQ ID NO: 44所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第22位和第27位的核糖核苷酸残基经由核苷酸性接头进行连接。
在优选的实施方式中，可将单链寡RNA分子(o)和(p)、(q)和(r)、(s)和(t)、或(u)和(v)组合，用于本发明所涉及的发夹型单链RNA分子的制备方法。
作为用于制备抑制作为靶基因的LMNA基因表达的发夹型单链RNA分子的单链寡RNA分子的例子，可列举下述(w)～(z)，但并不限于此：
(w) 由SEQ ID NO: 47所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(x) 由SEQ ID NO: 46所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第21位和第22位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(y) 由SEQ ID NO: 49所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；以及
(z) 由SEQ ID NO: 48所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第23位和第24位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接。
在优选的实施方式中，可将单链寡RNA分子(w)和(x)、或(y)和(z)组合，用于本发明所涉及的发夹型单链RNA分子的制备方法。
单链寡RNA分子(a)～(z)中的“接头”相当于上述第1接头或第2接头，并且可使用上述的接头。单链寡RNA分子(s)～(v)中的核苷酸性接头可取代成上述的接头(例如，其他的核苷酸性接头)。
本发明中，通过连接将上述的第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子进行连接，从而可制备发夹型单链RNA分子。上述的第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子在连接之前进行退火。退火反应可通过在水性介质中混合第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子而开始。在本发明的方法中，退火工序可通过在水性介质(通常为水或缓冲液)中混合第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子，再静置一定时间(例如，1～15分钟)来进行，也可不静置而用于连接反应。在退火工序中，可进行第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子的热变性(例如，在90℃以上的温度下加热)，也可不进行。在进行热变性的情况下，例如只要在热变性温度(例如，90℃以上)下加热包含第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子的反应液，然后使其在退火温度(典型的是，基于单链寡RNA分子的Ya1序列的Tm值±5℃的范围的温度、例如55～60℃)下反应一定时间以进行退火，之后使其降温(例如降至4℃)即可。在不进行热变性而进行退火的情况下，可通过在室温(15～35℃)下混合第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子，再静置一定时间(例如，1分钟～1小时、或5～15分钟)，从而实施退火工序。
在一个实施方式中，在本发明的退火工序中，第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子可在反应液中以等摩尔量进行混合。在本发明中，“以等摩尔量进行混合”是指，将第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子以1：1.1～1.1：1的摩尔比进行混合。
在退火工序后，将包含双链寡RNA的退火反应液供于连接，所述双链寡RNA是使第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子退火而得的。可在连接反应液中添加一部分退火反应液，也可使用退火反应液的全量调制连接反应液。连接可以是酶性连接。酶性连接可以是通过RNA连接酶、特别是Rnl2家族的连接酶进行的连接。
Rnl2家族的连接酶(Rnl2家族成员)是具有RNA切口密封活性(RNA nick-sealingactivity，缺口密封活性)、即通过连接其3’羟基(3’-OH)和5’磷酸基(5’-PO4)来填补(密封)RNA的切口(RNA双链或RNA-DNA双链中的切口)的连接酶活性的酶(例如，参照Nandakumar J.等人, Cell 127, 第71-84页 (2006))。作为Rnl2家族的连接酶，可列举：T4RNA连接酶2、锥虫属(Trypanosoma) (例如，布氏锥虫(Trypanosoma brucei))和利什曼原虫属(Leishmania) (例如，蜥蜴利什曼原虫(Leishmania tarenotolae))的RNA编辑连接酶(REL)、弧菌噬菌体(Vibrio phage ) KVP40Rnl2、痘病毒AmEPV连接酶、棒状病毒AcNPV连接酶和棒状病毒XcGV连接酶、以及它们的突变体或修饰体等，但并不限于这些。这些连接酶为本领域技术人员所熟知，可商购获取或者可按照论文等的教导获取。例如，T4 RNA连接酶2可从New England Biolabs商购获取。T4 RNA连接酶2蛋白由噬菌体T4的基因gp24.1编码。T4 RNA连接酶2的分离例如可按照Nandakumar J.和Shuman S., (2005) J. Biol. Chem.,280: 23484-23489; Nandakumar J.,等人, (2004) J. Biol. Chem., 279: 31337-31347; Nandakumar J.和Shuman S., (2004) Mol. Cell, 16: 211-221等的记载进行。在本发明中，“Rnl2家族的连接酶”并不限于已分离的天然连接酶，只要具有RNA切口密封活性即可，包含重组蛋白、突变体、缺失体(末端切割形态等)、肽(例如，His、HA、c-Myc、V5、DDDDK等标签)或者与其他蛋白的融合体、糖链附加(糖基化)或脂质附加蛋白等的修饰蛋白等。
连接反应液可使用通常用于连接的成分或包含其的缓冲液进行调制。连接反应液除了包含上述第1单链寡RNA分子和上述第2单链寡RNA分子以外，还可包含可用于RNA的连接反应的成分、例如Tris-HCl、二价金属离子、二硫苏糖醇(DTT)和腺苷三磷酸(ATP)等。作为二价金属离子，可列举Mg2+、Mn2+等，但并不限于这些。连接反应液通常以盐的形式包含二价金属离子，例如包含金属氯化物(MgCl2、MnCl2等)。
第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的连接可使用RNA连接酶、或具有连接RNA彼此的末端或dsRNA的切口的活性的其他酶、特别是Rnl2家族的连接酶来进行。作为RNA连接酶，可使用dsRNA连接酶。dsRNA连接酶是主要具有连接双链RNA (dsRNA)的切口的活性的酶。作为dsRNA连接酶，可列举T4 RNA连接酶2，但并不限于此。T4 RNA连接酶2催化3’→5’磷酸二酯键的形成。
向连接反应液中添加Rnl2家族的连接酶，将已退火的第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子的双链寡RNA分子与Rnl2家族的连接酶一起在可连接的条件下培育，从而可将构成双链寡RNA分子的第1单链寡RNA分子的3’末端和第2单链寡RNA分子的5’末端(反义链内)连接成单链。
第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的连接可在以等摩尔量包含第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子的连接反应液中进行。在本发明中，“以等摩尔量包含”是指，以1：1.1～1.1：1的摩尔比包含第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子。
在本发明的方法中，可在分别以10μM以上、40μM以上、100μM以上、150μM以上、200μM以上、300μM以上或500μM以上的浓度包含第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子的连接反应液中进行连接。在一个实施方式中，连接反应液可分别包含10,000μM以下的第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子，例如以1,000μM以下、500μM以下或300μM以下的浓度包含。在一个实施方式中，第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子可在连接反应液中例如以50～500μM、100～300μM或100～250μM的浓度使用。在一个实施方式中，以等摩尔量包含第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子的连接反应液，以这样的浓度包含第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子。在本发明的方法中，相对于反应液中的Rnl2家族连接酶的浓度(或量)，可以以更多的浓度(或量)使用第1和第2单链寡RNA分子，以增加发夹型单链RNA分子的制备效率。
在一个实施方式中，连接反应液可包含0.01U/μL以上的Rnl2家族的连接酶，例如可以以0.01U/μL以上、0.08U/μL以上、0.2U/μL以上或0.35U/μL以上的浓度包含。连接反应液例如可以以10U/μL以下、1U/μL以下或0.5U/μL以下的浓度包含Rnl2家族的连接酶。在一个实施方式中，以等摩尔量包含第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子的连接反应液，以这样的浓度包含Rnl2家族的连接酶。
在一个实施方式中，连接反应液可以是pH6.5以上，例如可以是pH7.0～9.0、pH7.4以上、pH7.4～8.6、pH7.5～8.5或pH7.5～8.0。以等摩尔量包含第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子的连接反应液，可具有这样的pH。
在一个实施方式中，连接反应液包含1mM以上、例如1～20mM、2～10mM、3～6mM或5mM的二价金属离子。在一个实施方式中，连接反应液包含1mM以上、例如1～20mM、2～10mM、3～6mM或5mM的Mg2+或Mn2+，例如可包含该浓度的MgCl2。在一个实施方式中，以等摩尔量包含第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子的连接反应液，以这样的浓度包含二价金属离子。
连接反应液可包含聚乙二醇(PEG)等其他的添加物。作为聚乙二醇，例如可使用PEG6000、PEG8000、PEG20000等的PEG6000～20000。连接反应液例如可以以3～30w/v%、5～20w/v%、5～15w/v%或10～30w/v%的量包含聚乙二醇。在一个实施方式中，以等摩尔量包含第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子的连接反应液，以这样的浓度包含聚乙二醇。在一个实施方式中，可在包含0.4U/μL以下、例如0.01～0.4U/μL、0.08～0.4U/μL、或0.1U/μL以上且小于0.3U/μL的RNA连接酶的连接反应液中添加、使用这样的聚乙二醇。
连接反应液通常包含ATP。在本发明中，连接反应液例如以5mM以下、2mM以下、1mM以下和/或0.1mM以上、或0.1～1.5mM的浓度包含ATP。
在一个实施方式中，连接反应液可包含Tris-HCl，例如可包含10～70mM的Tris-HCl，但并不限于该浓度。连接反应液可包含二硫苏糖醇(DTT)，例如可包含0.1～5mM的DTT，但并不限于该浓度。
在本发明中，连接的反应时间只要是适合本发明所涉及的第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子的双链寡RNA的连接反应的时间即可。连接反应例如可进行20分钟以上或30分钟以上、1小时以上、2小时以上、或3小时以上的反应时间。本发明中的连接的反应时间可以是4小时以上、6小时以上、8小时以上、10小时以上、12小时以上、24小时以上或48小时以上。在本发明中，在使用包含特别高的浓度(例如，100μM或200μM以上)的第1和第2单链寡RNA分子的连接反应液的情况下，连接反应可进行更长的时间。例如，在连接反应液显示为pH7.4以上、pH7.4～8.6、pH7.5～8.5或pH7.5～pH8.0的情况下，可采用更长时间(例如，4小时以上、12小时以上或24小时以上)的反应时间。特别是在使用高浓度的单链寡RNA分子的情况下，可采用这样的更长时间的反应时间。
在本发明的方法中，可边阶段性地添加第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子边进行连接工序。关于第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子的“阶段性地添加”是指，在连接工序中以一定时间间隔多次向反应液中添加第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子。例如，将第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子与RNA连接酶一起培育至适合连接反应的时间后，进行1次或反复进行1次以上的追加反应工序、即追加性地添加第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子后进一步进行连接反应，从而可边向反应系统中阶段性地添加该单链RNA分子边进行连接。追加反应工序可重复进行2次、3次、4次或其以上。这种情况下，用于连接第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子的最初的培育时间(初期反应时间)可依照上述的连接反应时间，例如可以是4小时以上、8小时以上、12小时以上或24小时以上。追加第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子之后的培育时间(追加反应时间)例如可以是4小时以上、8小时以上、12小时以上或24小时以上。在连接的追加反应工序中，每个循环的追加反应时间彼此可以相同也可不同。连接的初期反应时间和每个循环的追加反应时间可以相同也可不同。在阶段性地添加第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子的情况下，最初向连接反应液中添加的单链RNA分子的浓度可与上述同样，例如可以是40μM以上、100μM以上、150μM以上或200μM以上的浓度。在各追加反应工序中向连接反应液中添加的单链RNA分子的量可与最初的反应液中所含的单链RNA分子的量(摩尔数)相同也可不同，例如可以是4nmol以上、10nmol以上、15nmol以上或20nmol以上。
通过边阶段性地添加第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子边进行连接，可减小由高浓度的单链RNA分子引起的反应抑制(连接效率降低)，同时使反应液中的第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子的含量增加，由此可增加上述发夹型单链RNA分子的产量。
上述这样的反应条件可任意地组合使用。例如，可将选自下述条件的多个条件任意地组合：退火工序的温度、退火工序的时间、退火的第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的混合比、连接反应液中的第1和第2单链寡RNA分子的量(浓度)、酶(例如，Rnl2家族的连接酶)的种类和使用量、二价金属离子的种类和浓度、pH、ATP浓度、PEG等添加成分和浓度、反应液中的其他缓冲液成分、连接反应时间、连接反应中的第1和第2单链寡RNA分子的阶段性添加(追加添加)等。例如，可将上述的连接反应液中的第1和第2单链寡RNA分子的较高的浓度(例如，100μM～300μM)与其他的各条件组合。或者，可将酶(例如，Rnl2家族的连接酶)的使用量(例如，0.01U/μL～1U/μL)与其他的各条件组合。
在本发明的方法中，通过以上述方式调节连接反应条件，相对于第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子的使用量，可使用更少的量的RNA连接酶、特别是Rnl2家族的连接酶，使连接产物的产量相对或绝对地增加。在本发明的方法中，相对于连接中使用的每摩尔数(nmol)的第1单链寡RNA分子和/或第2单链寡RNA分子，可使用10单位(U)以下、5单位以下、4单位以下、2单位以下、1单位以下、0.7单位以下、0.5单位以下、或0.3单位以下、或0.1单位以下的量的RNA连接酶、特别是Rnl2家族的连接酶。在一个实施方式中，相对于第1单链寡RNA分子和/或第2单链寡RNA分子的量(nmol)，RNA连接酶、特别是Rnl2家族的连接酶的使用量可以是0.001单位(U)以上、0.01单位以上、0.1单位以上、0.2单位以上、或1单位以上。需要说明的是，“相对于每摩尔数(nmol)的第1单链寡RNA分子和/或第2单链寡RNA分子使用“X”单位以下的量的RNA连接酶”是指，与第1单链寡RNA分子的摩尔数或第2单链寡RNA分子的摩尔数(nmol)的任一者或其两者相比，RNA连接酶、特别是Rnl2家族的连接酶的活性量为“X”单位以下。在一个实施方式中，可以以第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子的少的一方的摩尔数(nmol)为基准确定RNA连接酶的使用量。第1单链寡RNA分子的摩尔数(nmol)只要以添加在连接反应系统中的第1单链寡RNA分子的总计量来计算即可，例如在阶段性地添加单链寡RNA分子的情况下，以连接的初期反应液中的第1单链寡RNA分子的摩尔数和在追加反应工序中向反应系统中添加的第1单链寡RNA分子的摩尔数的总计摩尔数来计算。
连接反应的温度可根据所使用的酶(Rnl2家族的连接酶)而变化，例如可以是10～50℃、15～45℃、20～40℃、20～30℃或23～28℃。在使用T4 RNA连接酶2的情况下，例如可以是10～50℃、15～45℃、20～40℃、20～30℃或23～28℃。
连接工序完毕后，在连接反应液中以高比例包含本发明所涉及的包含基因表达抑制序列的发夹型单链RNA分子。
连接反应液中的本发明所涉及的包含基因表达抑制序列的发夹型单链RNA分子可通过本领域技术人员所已知的方法进行纯化。作为纯化技术，可列举：反相色谱、反相高效液相色谱(RP-HPLC)、超高效液相色谱(UHPLC)、离子交换色谱等色谱法、凝胶过滤、柱纯化、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)等、或它们的任意的组合，但并不限于这些。
在国际公开WO2013/027843记载的方法中，因在非常短的链中延伸反应终止而生成短链核酸杂质或缺失体等核酸杂质，从而导致反应液中的目标产物的纯度降低。另一方面，在本发明的方法的优选实施方式中，在可减少本发明所涉及的发夹型单链RNA分子的制备后的连接反应液中的核酸杂质方面有利。在本发明的方法的优选实施方式中，可在减少核酸杂质的生成的同时使用通用型RNA亚酰胺制备稳定性高的基因表达抑制性单链RNA分子。
利用本发明的方法制备的发夹型单链RNA分子可通过常规方法给予到生体内或细胞内，从而用于抑制靶基因的表达。
而且，本发明还涉及：用于抑制靶基因表达的发夹型单链RNA分子的制备用试剂盒，该试剂盒包含本发明所涉及的单链寡RNA分子的组合(对)。这样的试剂盒可适合用于实施本发明所涉及的抑制靶基因表达的发夹型单链RNA分子的制备方法。
在一个实施方式中，作为试剂盒的例子，可列举用于抑制TGF-β1基因表达的发夹型单链RNA分子的制备用试剂盒，该试剂盒包含以下(i)～(vi)中的任意一种单链寡RNA分子的组合，但并不限于这些：
(i) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ IDNO: 7所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 6所表示的核苷酸序列构成，其中第10位和第11位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接；
(ii) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQID NO: 19所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 18所表示的核苷酸序列构成，其中第16位和第17位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接；
(iii) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQID NO: 27所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 26所表示的核苷酸序列构成，其中第20位和第21位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接；
(iv) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQID NO: 29所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 28所表示的核苷酸序列构成，其中第21位和第22位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接；
(v) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ IDNO: 31所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 30所表示的核苷酸序列构成，其中第22位和第23位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接；以及
(vi) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQID NO: 33所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 32所表示的核苷酸序列构成，其中第23位和第24位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接。
在另一个实施方式中，作为试剂盒的例子，可列举：用于抑制GAPDH基因表达的发夹型单链RNA分子的制备用试剂盒，该试剂盒包含以下(vii)的单链寡RNA分子的组合，但并不限于此：
(vii) 由SEQ ID NO: 37所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子(其中第22位和第23位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接)与由SEQ ID NO: 36所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子(其中第20位和第21位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接)的组合。
在另一个实施方式中，作为试剂盒的例子，可列举：用于抑制LAMA1基因表达的发夹型单链RNA分子的制备用试剂盒，该试剂盒包含以下(viii)～(xi)中的任意一种单链寡RNA分子的组合，但并不限于此：
(viii) 由SEQ ID NO: 39所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子(其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接)与由SEQ ID NO: 38所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子(其中第16位和第17位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接)的组合；
(ix) 由SEQ ID NO: 41所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子(其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接)与由SEQ ID NO: 40所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子(其中第22位和第23位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接)的组合；
(x) 由SEQ ID NO: 43所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子(其中第24位和第31位的核糖核苷酸残基经由核苷酸性接头进行连接)与由SEQ ID NO: 42所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子(其中第21位和第26位的核糖核苷酸残基经由核苷酸性接头进行连接)的组合；
(xi) 由SEQ ID NO: 45所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子(其中第24位和第31位的核糖核苷酸残基经由核苷酸性接头进行连接)与由SEQ ID NO: 44所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子(其中第22位和第27位的核糖核苷酸残基经由核苷酸性接头进行连接)的组合。
在又一个实施方式中，作为试剂盒的例子，可列举用于抑制LMNA基因表达的发夹型单链RNA分子的制备用试剂盒，该试剂盒包含以下(xii)～(xiii)中的任意一种单链寡RNA分子的组合，但并不限于此：
(xii) 由SEQ ID NO: 47所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子(其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接)与由SEQ ID NO: 46所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子(其中第21位和第22位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接)的组合；
(xiii) 由SEQ ID NO: 49所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子(其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接)与由SEQ ID NO: 48所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子(其中第23位和第24位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接)的组合。
实施例
以下，利用实施例来进一步具体地说明本发明。但本发明的技术范围并不限于这些实施例。
[参考例1] 脯氨酸二酰胺亚酰胺(proline diamido amidite)的合成
为了生成包含脯氨酸衍生物接头的本发明的发夹型单链RNA分子而使用的脯氨酸二酰胺亚酰胺，例如可按照国际公开WO2013/027843的记载来合成。以下给出具体的合成例，但合成方法并不受其限定。
(1) Fmoc-羟基酰胺-L-脯氨酸
以Fmoc-L-脯氨酸作为起始原料。Fmoc为9-芴甲氧羰基。将10.00g (29.64mmol) Fmoc-L-脯氨酸、3.18g (35.56mmol) 4-氨基-1-丁醇和10.90g (70.72mmol) 1-羟基苯并三唑混合，对其混合物在减压下脱气，填充氩气。室温下向所得的混合物中加入140mL无水乙腈，再添加7.34g (35.56mmol)二环己基碳二亚胺的70mL无水乙腈溶液，之后在氩环境下、室温下搅拌15小时。反应结束后，过滤分离所生成的沉淀，对于所回收的滤液在减压下馏去溶剂。向所得的残余物中加入200mL二氯甲烷，用200mL饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。然后，回收有机层，用硫酸镁进行干燥，之后过滤。对于所得的滤液在减压下馏去溶剂，向其残余物中加入200mL二乙醚，制成粉末。通过滤取所产生的粉末，得到为无色粉末状物质的Fmoc-羟基酰胺-L-脯氨酸。
(2) DMTr-酰胺-L-脯氨酸
将7.80g (19.09mmol) Fmoc-羟基酰胺-L-脯氨酸与5mL无水吡啶混合，在室温下共沸干燥两次。向所得的残留物中加入8.20g (24.20mmol) 4,4’-二甲氧基三苯氯甲烷(4,4’-二甲氧基三苯甲基氯)、23mg (0.19mmol) 4-二甲基氨基吡啶(DMAP)和39mL无水吡啶。将该混合物在室温下搅拌1小时，之后加入7.8mL甲醇，在室温下搅拌30分钟。用100mL二氯甲烷稀释该混合物，用150mL饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，之后分离有机层。将该有机层用硫酸钠干燥后过滤。对于所得的滤液在减压下馏去溶剂。向所得的未纯化的残余物中加入39mL无水二甲基甲酰胺和18.7mL (189mmol)哌啶，在室温下搅拌1小时。反应结束后，在减压下、室温下从其混合液中馏去溶剂。将所得残余物供于硅胶柱色谱(商品名Wakogel C-300、展开溶剂为CH2Cl2：CH3OH=9：1、含0.05%吡啶)，从而得到为淡黄色油状物质的DMTr-酰胺-L-脯氨酸。DMTr为二甲氧基三苯甲基。
(3) DMTr-羟基二酰胺-L-脯氨酸
将所得的6.01g (12.28mmol) DMTr-酰胺-L-脯氨酸、2.83g (14.74mmol) N-(3’-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺(EDC)、3.98g (29.47mmol) 1-羟基苯并三唑和4.47g(44.21mmol)三乙胺的120mL无水二氯甲烷溶液混合。进一步在氩环境下、室温下向该混合液中加入1.95g (14.47mmol) 6-羟基己酸，之后在氩环境下、室温下搅拌1小时。将所得的混合液用600mL二氯甲烷稀释，用800mL饱和盐水洗涤3次。回收有机层，用硫酸钠干燥后过滤。对于所得滤液在减压下馏去溶剂。由此，得到为淡黄色泡状物质的DMTr-羟基二酰胺-L-脯氨酸。
(4) DMTr-二酰胺-L-脯氨酸亚酰胺
将所得的8.55g (14.18mmol) DMTr-羟基二酰胺-L-脯氨酸与无水乙腈混合，在室温下共沸干燥3次。向所得残留物中加入2.91g (17.02mmol)二异丙基铵盐四氮唑(diiisopropyl ammonium tetrazolide)，在减压下脱气，填充氩气。向其混合物中加入10mL无水乙腈，再加入5.13g (17.02mmol) 2-氰基乙氧基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺(2-cyanoethoxy-N,N,N',N'-tetraisopropyl phosphordiamidite)的7mL无水乙腈溶液。在氩环境下、室温下搅拌该混合物2小时。将所得混合物用二氯甲烷稀释，用200mL饱和碳酸氢钠水溶液洗涤3次，之后用200mL饱和盐水洗涤。回收有机层，用硫酸钠干燥后过滤。对于所得滤液在减压下馏去溶剂。将所得残余物供于使用氨基硅胶作为填充剂的柱色谱(展开溶剂为己烷：乙酸乙酯=1：3、含0.05%吡啶)，从而得到为无色糖浆状物质的DMTr-二酰胺-L-脯氨酸亚酰胺。
[实施例1] 单链寡RNA分子的合成
在以下的实施例中，具有使用了脯氨酸衍生物的接头和人TGF-β1基因表达抑制序列的发夹型单链RNA分子(以下，也称为“ssTbRNA分子”。图2)是通过使用RNA连接酶(T4 RNA连接酶2)连接作为其2个分割片段的单链寡RNA分子(链1和链2)来制作的(连接法；图1)。
为了研究分割位置，如下操作，制作了使ssTbRNA分子中的分割位置一个碱基一个碱基地移位了的单链寡RNA分子对(链1和链2；表1)。
[表1]
Figure 14224DEST_PATH_IMAGE013
具体而言，根据亚磷酰胺法，使用核酸合成仪(商品名AKTA oligopilot-100；GEHealthcare Life Sciences或商品名nS-8和nS-8II；GeneDesign公司制备)，从3’侧朝向5’侧合成各单链寡RNA分子(链1和链2)。在基于亚磷酰胺法的RNA合成中，使用 5’-O-DMT-2’-O-TBDMSi-RNA亚磷酰胺(ThermoFisher Scientific)或5’-O-DMT-2’-O-TBDMS-RNA亚磷酰胺(Sigma-Aldrich)作为RNA亚酰胺。作为载体，使用了聚苯乙烯珠(NittoPhase(R) HL rG(ibu)或rU；KINOVATE)或多孔质玻璃(CPG)珠(Universal UnyLinker Support 1000Å；Chemgenes)。作为5’-磷酸化试剂，使用了3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)-2,2-(N-甲基酰胺)]丙基-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺(3-(4,4'-dimethoxytrityloxy)-2,2-(N-methylamido)]propyl-[(2-cyanoethyl)- (N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite) (Solid Chemical Phosphorylation Reagent；LINK)。
在合成从3’末端到接头之前的RNA序列(图1中，Xa、Ys)后，在其5’末端上连接用于形成接头的DMTr-二酰胺-L-脯氨酸亚酰胺，进一步在其5’侧合成从紧随接头之后到5’末端的RNA序列(图1中，Xs；或Ya3、Ya2和Ya1)，从而制作了链1和链2的单链寡RNA分子。这些单链寡RNA分子具有式(VI-1)所示的接头作为Lx1和Lx2，Xa在式(VI-1)中的1位氮原子侧与接头Lx1连接、而Xs在2位碳原子侧与接头Lx1连接，Ys在式(VI-1)中的1位氮原子侧与接头Lx2连接、而Ya3在2位碳原子侧与接头Lx2连接。
关于链2 (反义链侧)，以DMTr-OFF的状态结束合成，利用常规方法进行单链寡RNA分子的切出和碱基部及2’位的脱保护。关于链1 (有义链侧)，以DMTr-ON的状态结束合成。
[实施例2] 连接方法的研究(分割位置)
为了研究ssTbRNA分子的分割成2个分割片段的分割位置，使用RNA连接酶(T4 RNA连接酶2)连接成对的链1和链2 (表1)，确定其连接效率。
具体而言，首先将各对的链1和链2溶解于注射用水(DW)中，以等摩尔量混合。将该等摩尔混合液在93℃下加热1分钟以进行热变性，然后在55℃下静置15分钟以进行退火，再降温至4℃。降温后，通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)(20℃)和未变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE)来分析反应液，研究链1和链2的退火状态。
用于确认退火状态的RP-HPLC的条件如下。
・柱：ACQUITY UPLC Oligonucleotide BEH C18柱, 130A, 1.7μm, 2.1mm×100mm；
・流动相：A) 0.1M的三乙基乙酸铵(TEAA)、B)乙腈(MeCN)；
・分析条件：B 5-30%、10分钟、20℃、0.4ml/分钟。
所使用的Native PAGE (非变性PAGE)的条件如下。
非变性PAGE；19%丙烯酰胺、150V、90分钟的电泳。
如此操作，得到了链1和链2已退火的双链寡RNA。存在显示链1和链2几乎全部退火的对和以更低的比例退火的对。
调制在缓冲液(50mM的Tris-HCl、2mM的MgCl2、1mM的二硫苏糖醇(DTT)、400μM的腺苷三磷酸(ATP))中包含所得的双链寡RNA(链1、链2的各自的最终浓度为10μM)的反应液(pH7.5)，添加2μL (10U/μL)的T4 RNA连接酶2 (New England Biolabs；下同) (40U/nmol寡RNA)，使反应液量达到50μL。将该反应液在37℃下培育30分钟。
酶反应后，通过超高效液相色谱(UHPLC)和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(DenaturedPAGE)确认反应液中的连接效率。
连接后UHPLC的条件如下。
・柱：ACQUITY UPLC Oligonucleotide BEH C18柱, 130A, 1.7μm, 2.1mm×100mm；
・流动相：A) 100mM的六氟-2-丙醇(HFIP)-8mM的三乙胺(TEA)、B) 甲醇(MeOH)；
・分析条件：B 5-40%、10分钟、80℃、0.4ml/分钟。
Denatured PAGE (变性PAGE)的条件如下。
变性PAGE；19%的丙烯酰胺、7.5M的尿素、200V、在90分钟的电泳后、用溴化乙锭(EtBr)进行染色。
根据UHPLC分析结果，利用面积百分率法由下式计算连接效率( FLP(%) )。
FLP (全长产物) (%)
=(目标连接产物的峰面积)/(色谱图中的总峰面积)×100
结果见图3。根据分割位置，连接效率产生了较大的差异。在链1的3’末端为U的分割位置，显示出连接效率提高的倾向。另外，在采用链1的3’末端或链2的5’末端为A的分割位置的情况下，也显示出连接效率提高的倾向。另外，在采用链1的3’末端的碱基和链2的5’末端的碱基分别为U或A的分割位置的情况下，显示出特别优异的连接效率。
需要说明的是，对各连接产物进行LC-MS分析，确认了具有所预测的分子量。在LC-MS分析中使用以下的仪器。
・LC装置：UHPLC UltiMate3000 (ThermoFisher Scientific公司制备)；
・MS装置：Q-Exactive (ThermoFisher Scientific公司制备)。
根据该结果，选出适合于连接方法的成对的011、016和018。
在上述条件下，通过RP-HPLC对如上操作使成对的011、016和018的链1和链2退火、并通过连接而连接之后的反应液进行分析时，作为目标物的ssTbRNA分子和游离链1和链2以外的反应液中的核酸杂质的量为微量，在ssTbRNA分子的峰附近出现的缺失体(缺失了ssTbRNA分子的一部分序列的分子)的量也较少(表2)。另一方面，在通过亚磷酰胺法对ssTbRNA分子的全长进行固相合成的方法(专利文献2)中，在合成后的反应液中含有较多的ssTbRNA分子以外的短链核酸杂质(合成终止于短链阶段的RNA分子等)，在ssTbRNA分子的峰附近出现的缺失体也较多(表2)。在本发明的方法中，显示出能以高纯度制备目标的发夹型单链RNA分子。
表2中，链1、链2和ssTbRNA分子的值表示基于色谱图的各自的峰面积比。另外，在包括ssTbRNA分子的峰在内的RRT (相对保留时间(relative retention time)；这里是指以ssTbRNA分子的峰的保持时间为1的情况下的相对保留时间)=0.98～1.07的范围计算峰面积%的总计值，作为ssTbRNA分子的峰附近的核酸(主要包括ssTbRNA分子和其缺失体)的相对量。需要说明的是，链1和链2的峰保留时间充分地远离ssTbRNA分子的峰，不包含在RRT=0.98～1.07的范围内。
[表2]
Figure 50313DEST_PATH_IMAGE014
[实施例3] 连接方法的研究(退火温度)
使用成对的011、016和018的链1和链2的单链寡RNA分子，在两种条件下进行退火试验。
首先，在热变性条件下，将链1和链2溶解于注射用水中，分别以40μM混合等摩尔量。将混合液在93℃下加热1分钟以进行热变性，然后在55℃下静置15分钟以进行退火，再降温至4℃。降温后，通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)(20℃)和未变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE)来分析反应液，研究链1和链2的退火状态。
另一方面，在室温条件下，将链1和链2溶解于注射用水中，分别以200～400μM混合等摩尔量。将混合液在室温下静置10分钟。通过RP-HPLC(20℃)和未变性聚丙烯酰胺凝胶电泳来分析静置后的反应液，研究链1和链2的退火状态。
其结果，在热变性条件和室温条件的任一种条件下，通过RP-HPLC均未确认到链单独的峰，观察到了通过退火而产生的双链的峰。另外，即使在未变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，在热变性条件和室温条件的两种条件下，也均确认到了链1和链2的几乎全部的分子的退火。
由于在热变性条件和室温条件下得到了同等的结果，所以以后在室温条件下实施连接方法中的退火。
需要说明的是，在以下的实施例中，通过RP-HPLC和未变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE)确认链1和链2的单链寡RNA分子的退火状态，在通过RP-HPLC确认双链RNA的纯度(FLP)为95%以上之后，将其用于连接反应。
用于确认退火状态的RP-HPLC的条件如下。
・柱：ACQUITY UPLC Oligonucleotide BEH C18柱, 130Å, 1.7μm, 2.1mm×100mm；
・流动相：A) 0.1M的三乙基乙酸铵(TEAA)、B) 乙腈(MeCN)；
・分析条件：B 5-30%、10分钟、20℃、0.4ml/分钟。
使用的Native PAGE (非变性PAGE)的条件如下。
非变性PAGE；19%的丙烯酰胺、150V、90分钟的电泳。
[实施例4] 连接方法的研究(反应温度和反应时间)
分别使用3种的成对的011、016和018 (表1；以下，将各对还只称为011、016和018)，对连接反应的温度和时间进行了研究。需要说明的是，011、016和018的链1和链2的结构见图4。
与实施例2同样，将各对的链1和链2溶解于注射用水中，分别以等摩尔量混合。将该等摩尔混合液在室温下静置10分钟，通过退火调制了双链寡RNA。
将在添加有T4 RNA连接酶2 (New England Biolabs)的缓冲液(50mM的Tris-HCl、2mM的MgCl2、1mM的DTT、400μM的ATP、pH7.5 (25℃))中同时包含所得的双链寡RNA(链1和链2的等摩尔混合液；各链的最终浓度为10μM、40μM或100μM)和0.4U/μL的T4 RNA连接酶2的100μL反应液，在25℃或37℃下进行培育、连接。该连接反应中使用的酶(T4 RNA连接酶2)的量为40U/nmol寡RNA、10U/nmol寡RNA或4U/nmol寡RNA。在连接反应中，在经过0.5小时、2小时、4小时或24小时后，采集20～25μL的样品，在85℃下加热20分钟使酶失活。通过变性PAGE和UHPLC来分析热失活后的反应液，计算连接效率(FLP(%))。变性PAGE和UHPLC的条件、以及FLP(%)的计算方法与实施例2相同。
其结果，在采用10μM或40μM的寡RNA浓度的情况下，连接效率均非常高，没有因反应温度或反应时间而发生大幅变化。在采用100μM的寡RNA浓度的情况下，与10μM或40μM的情形相比连接效率下降，但随着反应时间的变长连接效率上升。另外，在100μM的寡RNA浓度下，与37℃相比在25℃下培育的情况下4小时以后的连接效率较高。
关于016的结果见图5。另外，100μM的寡RNA浓度下的连接反应的结果见图6 (A：25℃、B：37℃)。011、016中的连接效率特别高。
[实施例5] 连接方法的研究(ATP浓度)
使用按照与实施例4同样的方式调制的011的双链寡RNA (等摩尔混合液)，对连接反应液中的ATP浓度进行了研究。向添加有T4 RNA连接酶2 (New England Biolabs)的缓冲液(50mM的Tris-HCl、2mM的MgCl2、1mM的DTT、400μM的ATP、pH7.5(25℃))中添加ATP，使ATP浓度达到0.4mM (未添加)、1mM、2mM、5mM或10mM。将在如此调制的缓冲液中包含双链寡RNA(各链的最终浓度为10μM、20μM或40μM)和T4 RNA连接酶2的25μL反应液，在37℃下培育30分钟，进行连接。连接反应后，在85℃下加热20分钟使酶失活，通过变性PAGE和UHPLC来分析其反应液，计算连接效率(FLP(%))。变性PAGE和UHPLC的条件、以及FLP(%)的计算方法与实施例2相同。
变性PAGE的结果见图7，在40μM的寡RNA浓度下显示的FLP(%)见图8。若增加ATP浓度，则连接反应受到抑制。
[实施例6] 连接方法的研究(pH)
使用按照与实施例4同样的方式调制的016的双链寡RNA (等摩尔混合液)，对连接反应液的pH条件进行了研究。使用以下的3种缓冲液。
(1) 50mM的Tris-HCl (pH7.0)、2mM的MgCl2、1mM的二硫苏糖醇(DTT)、400μM的ATP；
(2) 50mM的Tris-HCl (pH7.5)、2mM的MgCl2、1mM的DTT、400μM的ATP；
(3) 50mM的Tris乙酸(pH6.5)、2mM的MgCl2、1mM的DTT、400μM的ATP。
将在上述的任一种缓冲液中包含016的双链寡RNA (各链的最终浓度为10μM、100μM或200μM)和T4 RNA连接酶2 (最终浓度为0.4U/μL)的30μL反应液，在25℃下培育30分钟、4小时或24小时，进行连接。连接反应后，在85℃下加热20分钟使酶失活，通过变性PAGE和UHPLC来分析其反应液，计算连接效率(FLP(%))。变性PAGE和UHPLC的条件、以及FLP(%)的计算方法与实施例2相同。
结果见图9。在pH7.5的反应液中，即使在含有高浓度的寡RNA的情况下，在使其进行24小时的反应时也显示出95%以上的连接效率。
[实施例7] 连接方法的研究(pH8.0以上)
使用按照与实施例4同样的方式调制的016的双链寡RNA (等摩尔混合液)，进一步对连接反应液的pH条件进行了研究。使用以下的4种缓冲液。
(1) 50mM的Tris-HCl (pH7.0)、2mM的MgCl2、1mM的DTT、400μM的ATP；
(2) 50mM的Tris-HCl (pH7.5)、2mM的MgCl2、1mM的DTT、400μM的ATP；
(3) 50mM的Tris-HCl (pH8.0)、2mM的MgCl2、1mM的DTT、400μM的ATP；
(4) 50mM的Tris-HCl (pH8.5)、2mM的MgCl2、1mM的DTT、400μM的ATP。
将在上述的任一种缓冲液中包含016的双链寡RNA (各链的最终浓度为10μM或200μM)和T4 RNA连接酶2 (最终浓度为0.4U/μL)的30μL反应液，在25℃下培育30分钟、4小时或24小时，进行连接。连接反应后，在85℃下加热20分钟使酶失活，通过变性PAGE和UHPLC来分析其反应液，计算连接效率(FLP(%))。变性PAGE和UHPLC的条件、以及FLP(%)的计算方法与实施例2相同。结果见图10。pH7.5以上的反应液显示出较高的连接效率。
[实施例8] 连接方法的研究(二价离子浓度)
使用按照与实施例4同样的方式调制的016的双链寡RNA (等摩尔混合液)，对连接反应液中的MgCl2浓度进行了研究。使用以下的5种缓冲液。
(1) 0.5mM的MgCl2、50mM的Tris-HCl (pH7.5)、1mM的DTT、400μM的ATP；
(2) 1mM的MgCl2、50mM的Tris-HCl (pH7.5)、1mM的DTT、400μM的ATP；
(3) 2mM的MgCl2、50mM的Tris-HCl (pH7.5)、1mM的DTT、400μM的ATP；
(4) 5mM的MgCl2、50mM的Tris-HCl (pH7.5)、1mM的DTT、400μM的ATP；
(5) 10mM的MgCl2、50mM的Tris-HCl (pH7.5)、1mM的DTT、400μM的ATP。
将在上述的任一种缓冲液中包含016的双链寡RNA (各链的最终浓度为10μM、100μM或200μM)和T4 RNA连接酶2 (最终浓度为0.4U/μL)的30μL反应液，在25℃下培育30分钟、4小时或24小时，进行连接。连接反应后，在85℃下加热20分钟使酶失活，通过变性PAGE和UHPLC来分析其反应液，计算连接效率(FLP(%))。变性PAGE和UHPLC的条件、以及FLP(%)的计算方法与实施例2相同。
结果见图11 (A：10μM或100μM的寡RNA、B：10μM或200μM的寡RNA)。在双链寡RNA浓度为100μM的情况下，在2mM以上的MgCl2浓度下通过4小时以上的反应显示出95%以上的连接效率。在寡RNA浓度为200μM的情况下，在2mM以上的MgCl2浓度下通过24小时以上的反应也显示出95%以上的连接效率，而且，在5mM的MgCl2浓度下，在4小时后观察到连接效率的特别急剧的上升。由该结果显示：在使用更高浓度的寡RNA的情况下，通过适度增加MgCl2浓度，可加速连接反应的进行。
[实施例9] 酶连接法的研究(二价离子浓度和pH)
使用按照与实施例4同样的方式调制的016的双链寡RNA (等摩尔混合液)，对连接反应液中的二价离子浓度进行了研究。使用以下的6种缓冲液。
(1) 50mM的Tris-HCl (pH7.5)、1mM的DTT、400μM的ATP、2mM或5mM或10mM的MgCl2；
(2) 50mM的Tris-HCl (pH8.0)、1mM的DTT、400μM的ATP、2mM或5mM或10mM的MgCl2。
将在上述的任一种缓冲液中包含016的双链寡RNA (各链的最终浓度为10μM或200μM)和T4 RNA连接酶2 (最终浓度为0.4U/μL)的30μL反应液，在25℃下培育30分钟、4小时或24小时，进行连接。连接反应后，在85℃下加热20分钟使酶失活，通过变性PAGE和UHPLC来分析其反应液，计算连接效率(FLP(%))。变性PAGE和UHPLC的条件、以及FLP(%)的计算方法与实施例2相同。
结果见图12 (A：pH7.5、B：pH8.0)。在pH7.5和pH8.0下，在4小时后的时间点、5mM的MgCl2的情况下均观察到连接效率的最急剧的上升。
[实施例10] 酶连接法的研究(添加PEG)
使用按照与实施例4同样的方式调制的018的双链寡RNA (等摩尔混合液)，研究在连接反应溶液中添加PEG对连接效率的影响。
将在缓冲液(5、10或15% (w/v)的PEG8000、50mM的Tris-HCl (pH8.0)、2mM的MgCl2、1mM的DTT、400μM的ATP)中包含双链寡RNA (各链的最终浓度为200μM)和0.4U/μL或0.2U/μL的T4 RNA连接酶2的30μL反应液，在25℃下培育30分钟、4小时或24小时，进行连接。该连接反应中使用的酶(T4 RNA连接酶2)的量为2U/nmol寡RNA或1U/nmol寡RNA，与实施例4中的酶量相比，分别为1/20和1/40。连接反应后，在85℃下加热20分钟使酶失活。通过变性PAGE和UHPLC来分析热失活后的反应液，计算连接效率(FLP(%))。变性PAGE和UHPLC的条件、以及FLP(%)的计算方法与实施例2相同。
结果见图13。通过添加PEG，显示出连接效率的增加。
[实施例11] 酶连接法中的反应时间过程的分析
使用按照与实施例4同样的方式调制的016的双链寡RNA (等摩尔混合液)，对连接反应的时间过程进行了研究。
将在缓冲液(50mM的Tris-HCl (pH8.0)、5mM的MgCl2、1mM的DTT、400μM的ATP)中包含双链寡RNA (各链的最终浓度为100μM或200μM)、0.4U/μL的T4 RNA连接酶2的80μL反应液，在25℃下培育，进行连接。连接反应中，从开始起1、2、3、4、6、9、12、15、18和24小时后采样，在85℃下加热20分钟使酶失活，之后进行UHPLC分析，计算FLP%。UHPLC的条件、以及FLP(%)的计算方法与实施例2相同。
结果见图14。在寡RNA浓度为100μM的情况下反应开始后6小时连接反应大致达到平台期，而在200μM的情况下反应开始后9小时连接反应大致达到平台期。
[实施例12] 酶连接法中的寡RNA的追加添加
使用按照与实施例4同样的方式调制的016的双链寡RNA (等摩尔混合液)，通过向连接反应相中依次添加链1和链2的单链寡RNA分子，来研究使ssTbRNA分子的产量增加的方法。
首先，使用以各链的最终浓度100μM包含双链寡RNA的连接反应液进行了研究。将在缓冲液(50mM的Tris-HCl (pH8.0)、5mM的MgCl2、1mM的DTT、400μM的ATP)中包含双链寡RNA (最终浓度为100μM；就100μL反应液中的总寡RNA量而言，链1和链2均为10nmol)和T4RNA连接酶2 (0.4U/μL；4U/nmol寡RNA)的100μL反应液，分别注入到4支管中，通过在25℃下培育而开始连接反应。
从连接反应开始起12小时后，向3支管中以各链达到10nmol的量(11.1μL)添加016的双链寡RNA (反应缓冲液(50mM的Tris-HCl、5mM的MgCl2、1mM的DTT、400μM的ATP(pH8.0))中，016的链1和链2的等摩尔混合液)，接着进行培育。追加寡RNA后的反应液中的寡RNA浓度为180μM (各链的浓度)、酶(T4 RNA连接酶2)的量为0.36U/μL (2U/nmol寡RNA)。
在追加寡RNA的12小时后，向追加了寡RNA的3支管中的2支中进一步以各链达到10nmol的量(11.1μL)添加016的双链寡RNA (与上述相同的等摩尔混合液)，接着进行培育。第2次追加寡RNA后的反应液中的寡RNA浓度为245μM (各链的浓度)、酶(T4 RNA连接酶2)的量为0.33U/μL (1.33U/nmol寡RNA)。
在其12小时后，向追加了2次寡RNA的2支管中的1支中以各链达到10nmol的量(11.1μL)添加016的双链寡RNA (与上述相同的等摩尔混合液)，再培育12小时。第3次追加寡RNA后的反应液中的寡RNA浓度为300μM (各链的浓度)、酶(T4 RNA连接酶2)的量为0.3U/μL (1U/nmol寡RNA)。
每隔12小时从这些管中采集反应液，在85℃下加热20分钟使酶失活。所得的反应后的样品如下。反应时间是指，从连接反应开始时起的时间。
管1) 100μM的寡RNA (各链总计为10nmol；未追加)、酶量为0.4U/μL、反应温度为25℃、反应时间为12、24、36或48小时；
管2) 180μM的寡RNA (各链总计为20nmol；追加1次)、酶量为0.36U/μL、反应温度为25℃、反应时间为24、36或48小时；
管3) 245μM的寡RNA (各链总计为30nmol；追加2次)、酶量为0.33U/μL、反应温度为25℃、反应时间为36或48小时；
管4) 300μM的寡RNA (各链总计为40nmol；追加3次)、酶量为0.3U/μL、反应温度为25℃、反应时间为48小时。
对各样品进行UHPLC分析，计算FLP%。UHPLC的条件、以及FLP(%)的计算方法与实施例2相同。结果见表3。
[表3]
Figure 614149DEST_PATH_IMAGE015
而且，对于各样品由FLP%和单链寡RNA分子的添加量计算目标产物(ssTbRNA分子)的生成量(nmol)。其结果见图15。
利用同样的方法，使用以各链的最终浓度为200μM包含双链寡RNA的连接反应液进行了研究。
将在缓冲液(50mM的Tris-HCl、5mM的MgCl2、1mM的DTT、400μM的ATP (pH8.0))中包含双链寡RNA (最终浓度为200μM；就100μL反应液中的总寡RNA量而言，链1和链2均为20nmol)和T4 RNA连接酶2 (0.4U/μL；4U/nmol寡RNA)的100μL反应液，分别注入到4支管中，通过在25℃下培育而开始连接反应。12小时后，向3支管中以各链达到20nmol的量(22.2μL)添加016的双链寡RNA (反应缓冲液(50mM的Tris-HCl、5mM的MgCl2、1mM的DTT、400μM的ATP(pH8.0))中，016的链1与链2的等摩尔混合液)，接着进行培育。之后，与以最终浓度为100μM使用寡RNA的情形同样地，每隔12小时追加寡RNA直至3次为止，继续进行连接反应。
每隔12小时从这些管中采集反应液，在85℃下加热20分钟使酶失活。所得的反应后的样品如下。反应时间是指，从连接反应开始时起的时间。
管1) 200μM的寡RNA (各链总计为20nmol；未追加)、酶量为0.4U/μL、反应温度为25℃、反应时间为12、24、36或48小时；
管2) 327μM的寡RNA (各链总计为40nmol；追加1次)、酶量为0.36U/μL、反应温度为25℃、反应时间为24、36或48小时；
管3) 415μM的寡RNA (各链总计为60nmol；追加2次)、酶量为0.33U/μL、反应温度为25℃、反应时间为36或48小时；
管4) 480μM的寡RNA (各链总计为80nmol；追加3次)、酶量为0.3U/μL、反应温度为25℃、反应时间为48小时。
对各样品进行UHPLC分析，计算FLP%。UHPLC的条件、以及FLP(%)的计算方法与实施例2相同。结果见表4。
[表4]
Figure 1268DEST_PATH_IMAGE016
而且，对于各样品由FLP%和单链寡RNA分子的添加量计算目标产物(ssTbRNA分子)的生成量(nmol)。其结果见图16。
由以上的结果显示：在本发明的方法中，通过在连接反应相中依次追加寡RNA，可使发夹型单链RNA分子(这里是指ssTbRNA分子)的生成量增加。
在普通的RNA连接酶使用量(相对于10μM的起始寡RNA量，酶量为0.4U/μL)下，在与上述同样的连接反应条件下得到了FLP超过90%的连接效率，但每100μL反应液的ssTbRNA分子的生成量小于1nmol。显示出：与这样的普通情形相比，在本发明的方法中，在显示了90%以上的FLP的有效反应条件下可将每寡RNA量的酶使用量削减至1/30～1/40。
[实施例13] 针对其他靶基因的发夹型单链RNA分子的制备
按照与实施例1和2同样的方式，利用连接作为2个分割片段的链1和链2的方法制作了包含针对用于代替人TGF-β1基因的人GAPDH基因、人LAMA1基因或人LMNA基因的基因表达抑制序列的发夹型单链RNA分子。作为接头，使用了与实施例1和2同样的脯氨酸衍生物或核苷酸性接头。
发夹型单链RNA分子及其分子中的分割位置见图17。在图17中用框显示发夹型单链RNA分子中所含的针对各基因的基因表达抑制序列(反义序列)。另外，作为各发夹型单链RNA分子的2个分割片段的链1和链2的对见表5。表5的链1和链2的对具有U-U、A-A、A-U或U-A作为进行连接的末端的碱基的组合。
[表5]
Figure 105490DEST_PATH_IMAGE017
包含脯氨酸衍生物的链1和链2的单链寡RNA分子的合成按照与实施例1同样的方法来进行。包含核苷酸性接头以代替脯氨酸衍生物的链1和链2的单链寡RNA分子的合成，通过采用了亚磷酰胺法的固相合成法来进行。
如实施例2所记载进行操作，将各对的链1和链2 (表5)退火，得到了双链寡RNA。调制在缓冲液(50mM的Tris-HCl、2mM的MgCl2、1mM的二硫苏糖醇(DTT)、400μM的腺苷三磷酸(ATP))中包含所得的双链寡RNA (链1、链2的各自的最终浓度为10μM)的反应液( pH7.5[25℃])，添加2μL (10U/μL)的T4 RNA连接酶2 (New England Biolabs) (40U/nmol寡RNA)，使反应液量达到50μL。将该反应液在37℃下培育30分钟。
酶反应后，通过超高效液相色谱(UHPLC)和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(DenaturedPAGE)确认反应液中的连接效率。连接后UHPLC的条件和连接效率(FLP(%))的计算方法与实施例2相同。
需要说明的是，对各连接产物进行LC-MS分析，确认了具有所预测的分子量。LC-MS分析中使用的LC装置和MS装置与实施例2中使用的装置相同。
结果见图18。表5的链1和链2的对均显示出高的连接效率。
[比较例]
与实施例2的实验同时进行，使用T4 RNA连接酶代替T4 RNA连接酶2，连接表1所示的链1和链2已退火的双链寡RNA，确定其连接效率。
如实施例2所记载进行操作，将各对的链1和链2 (表1)退火，得到了双链寡RNA。调制在缓冲液(50mM的Tris-HCl、10mM的MgCl2、5mM的二硫苏糖醇(DTT)、1mM的腺苷三磷酸(ATP))中包含所得的双链寡RNA (链1、链2的各自的最终浓度为10μM)的反应液(pH7.8)，添加0.5μL (10U/μL)的T4 RNA连接酶(Promega) (10U/nmol寡RNA)，使反应液量达到50μL。将该反应液在37℃下培育30分钟。
酶反应后，通过超高效液相色谱(UHPLC)和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(DenaturedPAGE)确认反应液中的连接效率。连接后UHPLC的条件和连接效率(FLP(%))的计算方法与实施例2相同。
结果见图19。使用了T4 RNA连接酶的情况下的连接效率显著地低于T4 RNA连接酶2 (图3)。
产业实用性
本发明可使用通用型亚酰胺，在减少酶使用量的同时，可有效地制备包含针对靶基因的表达抑制序列的发夹型单链RNA分子。
序列表自由文本
SEQ ID NO: 1～57：合成RNA
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均通过直接引用而纳入本说明书中。
<110> 东丽株式会社
<120> 发夹型单链RNA分子的制备方法
<130> PH-7783-PCT
<150> JP 2018-070423
<151> 2018-03-30
<160> 57
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (24)..(25)
<223> 第24位和第25位的核苷酸经由接头进行连接
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (50)..(51)
<223> 第50位和第51位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 1
agcagaguac acacagcaua uaccgguaua ugcugugugu acucugcuuc g 51
<210> 2
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 2
agcagaguac acacagcaua uacc 24
<210> 3
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 3
gguauaugcu guguguacuc ugcuuc 26
<210> 4
<211> 10
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (9)..(10)
<223> 第9位和第10位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 4
cucugcuucg 10
<210> 5
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (24)..(25)
<223> 第24位和第25位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 5
agcagaguac acacagcaua uaccgguaua ugcugugugu a 41
<210> 6
<211> 11
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (10)..(11)
<223> 第10位和第11位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 6
acucugcuuc g 11
<210> 7
<211> 40
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (24)..(25)
<223> 第24位和第25位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 7
agcagaguac acacagcaua uaccgguaua ugcugugugu 40
<210> 8
<211> 12
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (11)..(12)
<223> 第11位和第12位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 8
uacucugcuu cg 12
<210> 9
<211> 39
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (24)..(25)
<223> 第24位和第25位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 9
agcagaguac acacagcaua uaccgguaua ugcugugug 39
<210> 10
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (12)..(13)
<223> 第12位和第13位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 10
guacucugcu ucg 13
<210> 11
<211> 38
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (24)..(25)
<223> 第24位和第25位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 11
agcagaguac acacagcaua uaccgguaua ugcugugu 38
<210> 12
<211> 14
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (13)..(14)
<223> 第13位和第14位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 12
uguacucugc uucg 14
<210> 13
<211> 37
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (24)..(25)
<223> 第24位和第25位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 13
agcagaguac acacagcaua uaccgguaua ugcugug 37
<210> 14
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (14)..(15)
<223> 第14位和第15位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 14
guguacucug cuucg 15
<210> 15
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (24)..(25)
<223> 第24位和第25位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 15
agcagaguac acacagcaua uaccgguaua ugcugu 36
<210> 16
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (15)..(16)
<223> 第15位和第16位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 16
uguguacucu gcuucg 16
<210> 17
<211> 35
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (24)..(25)
<223> 第24位和第25位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 17
agcagaguac acacagcaua uaccgguaua ugcug 35
<210> 18
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (16)..(17)
<223> 第16位和第17位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 18
guguguacuc ugcuucg 17
<210> 19
<211> 34
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (24)..(25)
<223> 第24位和第25位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 19
agcagaguac acacagcaua uaccgguaua ugcu 34
<210> 20
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (17)..(18)
<223> 第17位和第18位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 20
uguguguacu cugcuucg 18
<210> 21
<211> 33
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (24)..(25)
<223> 第24位和第25位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 21
agcagaguac acacagcaua uaccgguaua ugc 33
<210> 22
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (18)..(19)
<223> 第18位和第19位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 22
cuguguguac ucugcuucg 19
<210> 23
<211> 32
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (24)..(25)
<223> 第24位和第25位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 23
agcagaguac acacagcaua uaccgguaua ug 32
<210> 24
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (19)..(20)
<223> 第19位和第20位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 24
gcugugugua cucugcuucg 20
<210> 25
<211> 31
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (24)..(25)
<223> 第24位和第25位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 25
agcagaguac acacagcaua uaccgguaua u 31
<210> 26
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (20)..(21)
<223> 第20位和第21位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 26
ugcugugugu acucugcuuc g 21
<210> 27
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (24)..(25)
<223> 第24位和第25位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 27
agcagaguac acacagcaua uaccgguaua 30
<210> 28
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (21)..(22)
<223> 第21位和第22位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 28
augcugugug uacucugcuu cg 22
<210> 29
<211> 29
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (24)..(25)
<223> 第24位和第25位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 29
agcagaguac acacagcaua uaccgguau 29
<210> 30
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (22)..(23)
<223> 第22位和第23位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 30
uaugcugugu guacucugcu ucg 23
<210> 31
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (24)..(25)
<223> 第24位和第25位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 31
agcagaguac acacagcaua uaccggua 28
<210> 32
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (23)..(24)
<223> 第23位和第24位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 32
auaugcugug uguacucugc uucg 24
<210> 33
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (24)..(25)
<223> 第24位和第25位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 33
agcagaguac acacagcaua uaccggu 27
<210> 34
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (24)..(25)
<223> 第24位和第25位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 34
uauaugcugu guguacucug cuucg 25
<210> 35
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (24)..(25)
<223> 第24位和第25位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 35
agcagaguac acacagcaua uaccgg 26
<210> 36
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (20)..(21)
<223> 第20位和第21位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 36
ugucauacuu cucaugguuc gaa 23
<210> 37
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (22)..(23)
<223> 第22位和第23位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 37
caugagaagu augacaacag ccggcugu 28
<210> 38
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (16)..(17)
<223> 第16位和第17位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 38
acgagacaaa cacuccg 17
<210> 39
<211> 34
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (24)..(25)
<223> 第24位和第25位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 39
aguguuuguc ucguuacaau auccggauau ugua 34
<210> 40
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (22)..(23)
<223> 第22位和第23位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 40
auuguaacga gacaaacacu ccg 23
<210> 41
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (24)..(25)
<223> 第24位和第25位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 41
aguguuuguc ucguuacaau auccggau 28
<210> 42
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 42
uuguaacgag acaaacacuc cuucgg 26
<210> 43
<211> 35
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 43
aguguuuguc ucguuacaau aucccacacc ggaua 35
<210> 44
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 44
auuguaacga gacaaacacu ccuucgg 27
<210> 45
<211> 34
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 45
aguguuuguc ucguuacaau aucccacacc ggau 34
<210> 46
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (21)..(22)
<223> 第21位和第22位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 46
ugcgcuuuuu ggugacgcuu cg 22
<210> 47
<211> 29
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (24)..(25)
<223> 第24位和第25位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 47
agcgucacca aaaagcgcaa uuccggaau 29
<210> 48
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (23)..(24)
<223> 第23位和第24位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 48
auugcgcuuu uuggugacgc uucg 24
<210> 49
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (24)..(25)
<223> 第24位和第25位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 49
agcgucacca aaaagcgcaa uuccgga 27
<210> 50
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 50
uaugcugugu guacucugc 19
<210> 51
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (22)..(23)
<223> 第22位和第23位的核苷酸经由接头进行连接
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (48)..(49)
<223> 第48位和第49位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 51
caugagaagu augacaacag ccggcuguug ucauacuucu caugguucga a 51
<210> 52
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (24)..(25)
<223> 第24位和第25位的核苷酸经由接头进行连接
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (50)..(51)
<223> 第50位和第51位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 52
aguguuuguc ucguuacaau auccggauau uguaacgaga caaacacucc g 51
<210> 53
<211> 61
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 53
aguguuuguc ucguuacaau aucccacacc ggauauugua acgagacaaa cacuccuucg 60
g 61
<210> 54
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (24)..(25)
<223> 第24位和第25位的核苷酸经由接头进行连接
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (50)..(51)
<223> 第50位和第51位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 54
agcgucacca aaaagcgcaa uuccggaauu gcgcuuuuug gugacgcuuc g 51
<210> 55
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 55
guugucauac uucucaugg 19
<210> 56
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 56
auuguaacga gacaaacac 19
<210> 57
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 57
uugcgcuuuu uggugacgc 19

Claims (13)

1.发夹型单链RNA分子的制备方法，其是抑制靶基因表达的发夹型单链RNA分子的制备方法，包括以下工序：
退火工序，将第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子退火；以及
连接工序，通过Rnl2家族的连接酶连接上述第1单链寡RNA分子的3’末端和上述第2单链寡RNA分子的5’末端，
其中，上述第1单链寡RNA分子包含经由第1接头进行连接的第1 RNA部分和第2 RNA部分，第1 RNA部分和第2 RNA部分中的一方可与另一方互补性地结合，
上述第2单链寡RNA分子包含经由第2接头进行连接的第3 RNA部分和第4 RNA部分，第3RNA部分和第4 RNA部分中的一方可与另一方互补性地结合，
上述第1单链寡RNA分子和上述第2单链寡RNA分子可在5’末端或3’末端的互补序列间形成分子间双链，
在退火工序中，当上述第1单链寡RNA分子和上述第2单链寡RNA分子形成双链时，上述第1单链寡RNA分子的3’末端的核糖核苷酸残基与上述第2单链寡RNA分子的5’末端的核糖核苷酸残基生成切口，并且在上述第1单链寡RNA分子的5’末端的核糖核苷酸残基与上述第2单链寡RNA分子的3’末端的核糖核苷酸残基之间存在1个以上的核糖核苷酸残基的缺口，
通过上述第1单链寡RNA分子与上述第2单链寡RNA分子的连接而生成的序列包含针对上述靶基因的基因表达抑制序列。
2.权利要求1所述的制备方法，其中，上述第1单链寡RNA分子由下述式(I)表示，上述第2单链寡RNA分子由下述式(II)表示：
5’-Xs-Lx1-Xa-3’ ・・・式(I)
5’-Ya1-Ya2-Ya3-Lx2-Ys-3’ ・・・式(II)
式(I)和式(II)中，Xs、Xa、Ya1、Ya2、Ya3和Ys表示1个或其以上的核糖核苷酸残基，
Lx1和Lx2分别表示第1接头和第2接头，
Ya3与Ys互补，
通过连接工序产生的Xa-Ya1与Xs互补，
通过连接工序产生的Xa-Ya1-Ya2-Ya3包含针对上述靶基因的基因表达抑制序列。
3.权利要求1或2所述的制备方法，其中，上述第1单链寡RNA分子在3’末端具有尿嘧啶(U)或腺嘌呤(A)，上述第2单链寡RNA分子在5’末端具有尿嘧啶(U)或腺嘌呤(A)。
4.权利要求1～3中任一项所述的制备方法，其中，第1接头和第2接头分别独立为：(i)非核苷酸性接头，其包含吡咯烷骨架和哌啶骨架的至少一者；或者(ii)核苷酸性接头。
5.权利要求1～4中任一项所述的制备方法，其中，Rnl2家族的连接酶为T4 RNA连接酶2。
6.权利要求1～5中任一项所述的制备方法，其中，上述连接在pH7.4～8.6的反应液中进行。
7.权利要求1～6中任一项所述的制备方法，其中，上述连接在含有2～10mM的二价金属离子的反应液中进行。
8.权利要求1～7中任一项所述的制备方法，其中，第1接头和第2接头分别独立为下述式(VI)所表示的非核苷酸性接头：
[化学式1]
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
9.权利要求1～8中任一项所述的制备方法，其中，上述靶基因为TGF-β1基因、GAPDH基因、LAMA1基因或LMNA基因。
10.权利要求1～9中任一项所述的制备方法，其中，上述发夹型单链RNA分子由SEQ IDNO: 1所表示的核苷酸序列构成，且第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，第50位和第51位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接。
11.权利要求1～10中任一项所述的制备方法，其中，上述第1单链寡RNA分子和上述第2单链寡RNA分子为以下(1)～(6)中的任意一种组合：
(1) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ IDNO: 7所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 6所表示的核苷酸序列构成，其中第10位和第11位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接；
(2) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ IDNO: 19所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 18所表示的核苷酸序列构成，其中第16位和第17位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接；
(3) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ IDNO: 27所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 26所表示的核苷酸序列构成，其中第20位和第21位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接；
(4) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ IDNO: 29所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 28所表示的核苷酸序列构成，其中第21位和第22位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接；
(5) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ IDNO: 31所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 30所表示的核苷酸序列构成，其中第22位和第23位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接；
(6) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ IDNO: 33所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 32所表示的核苷酸序列构成，其中第23位和第24位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接。
12.单链寡RNA分子，其为以下(a)～(l)中的任意一种分子：
(a) 由SEQ ID NO: 7所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(b) 由SEQ ID NO: 6所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第10位和第11位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(c) 由SEQ ID NO: 19所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(d) 由SEQ ID NO: 18所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第16位和第17位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(e) 由SEQ ID NO: 27所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(f) 由SEQ ID NO: 26所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第20位和第21位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(g) 由SEQ ID NO: 29所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(h) 由SEQ ID NO: 28所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第21位和第22位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(i) 由SEQ ID NO: 31所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(j) 由SEQ ID NO: 30所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第22位和第23位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(k) 由SEQ ID NO: 33所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；
(l) 由SEQ ID NO: 32所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第23位和第24位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接。
13.用于抑制TGF-β1基因表达的发夹型单链RNA分子的制备用试剂盒，该试剂盒包含以下(1)～(6)中的任意一种单链寡RNA分子的组合：
(1) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ IDNO: 7所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 6所表示的核苷酸序列构成，其中第10位和第11位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接；
(2) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ IDNO: 19所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 18所表示的核苷酸序列构成，其中第16位和第17位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接；
(3) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ IDNO: 27所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 26所表示的核苷酸序列构成，其中第20位和第21位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接；
(4) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ IDNO: 29所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 28所表示的核苷酸序列构成，其中第21位和第22位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接；
(5) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ IDNO: 31所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 30所表示的核苷酸序列构成，其中第22位和第23位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接；
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