CN115774075A - 一种基于RP-HPLC分析体外转录产物成分circRNA的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于RP‑HPLC分析体外转录产物成分circRNA的方法。本发明利用RP‑HPLC将circRNA、包含nicked RNA、pre‑mRNA的线性RNA分离开,以峰面积的百分比来计算circRNA的比例,即成环率。本发明对不同有机相梯度改变探索,筛选获得适合circRNA分离的RP‑HPLC分离梯度程序,从而能有效分离IVT产物中环状RNA的特征峰,进一步计算IVT产物中成环率,并通过电泳实验验证其准确性。本发明所述方法分离效果好,分离获得的circRNA、线性RNA可进一步大规模纯化用于工业。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物检测方法,具体涉及一种基于RP-HPLC分析circRNA体外转录产物成分的方法,特别是产物中circRNA比例。
背景技术
反相高效液相色谱(reversed-phase high performance liquid chromatogra,RP-HPLC)是由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系,它正好与由极性固定相和弱极性流动相所组成的液相色谱体系(正相色谱)相反。RP-HPLC的典型的固定相是十八烷基键合硅胶,典型的流动相是甲醇和乙腈。RP-HPLC是当今液相色谱的最主要的分离模式,几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物的分离。反相色谱法适于分离非极性、极性或离子型化合物,大部分的分析任务皆由反相色谱法完成。
mRNA疫苗是将含有编码抗原蛋白的mRNA导入人体,直接进行翻译,形成相应的抗原蛋白,从而诱导机体产生特异性免疫应答,达到预防免疫的作用。而环状RNA(circRNAs,circular RNAs)是一类单链、闭环的新型RNA。虽然最初大家认为circRNAs是异常剪接的罕见副产品,随着研究的深入,人们发现circRNAs是普遍表达的,并且在细胞中发挥着重要的功能。与线性mRNA相比,circRNAs具有更好的稳定性和更高的表达效率。为实现目标蛋白的表达并减少天然免疫刺激性,circRNA的纯化是必不可少的。体外转录(In vitrotranscription product,IVT)和环化反应体系包括双链RNA(dsRNA)、三磷酸化RNA、开环的circRNA、前体RNA等。体外转录产物(IVT)中除了circRNA以外,还包含nicked RNA、pre-mRNA等线性RNA,为了后续进一步利用纯的circRNA,本领域有需求将其从IVT体系中分离纯化出来。
本领域已知一些采用HPLC纯化RNA的方法,CN101563457A(公开日期2009年10月21日)公开了用于制备型纯化RNA的方法,该方法的特征在于使用多孔反相作为固定相利用HPLC来纯化RNA,该发明的一个重要因素是使用多孔反相。CN111812230A(公开日期2020年10月23日)公开了一种半定量测定DNA中RNA含量的SEC-HPLC检测方法,该方法通过将样品色谱图与含一定量RNA的质粒DNA标准品的色谱图作叠图分析,比较两者在RNA位置的出峰情况,从而判断样品的RNA百分含量。
虽然RP-HPLC是本领域分离RNA的常规方法,但是为了提高产率,大规模分析纯化circRNA,本领域亟需提供一种优化的分离程序、circRNA分离度更好的基于RP-HPLC分析circRNA体外转录产物成分的方法。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种分离效果好、基线平稳的基于RP-HPLC分析circRNA体外转录产物成分的方法。本发明进一步提供一种依据RP-HPLC结果,计算获得IVT产物中circRNA比例的高效液相色谱检测方法。本发明对不同有机相梯度改变探索,筛选获得适合circRNA分离的RP-HPLC分离梯度程序,从而能有效分离IVT产物中环状RNA的特征峰,特别适合16h IVT产物分离。
本发明的一方面,提供一种基于RP-HPLC分析circRNA体外转录产物(IVT)成分的方法,其特征在于,包含如下步骤:
(1)样品制备:制备用于RP-HPLC的体外转录产物;
(2)流动相配制:流动相A液为100 mM 醋酸三乙胺,pH 7.0;流动相B液为100%乙腈;
(3)色谱分离:分离梯度程序如下:起始:90% A液+10% B液;10min: 88.4% A液+11.6% B液;20min: 88% A液+12% B液;40min: 87.4% A液+12.6% B液;50min: 86.4% A液+13.6% B液;55min: 86.4% A液+13.6% B液;55.1min:90% A液+10% B液;65min:90% A液+10% B液;
(4)分别收集circRNA、线性RNA的目标色谱峰。
进一步地,还包含步骤(5)获得色谱图谱。
进一步地,还包含步骤(6)计算circRNA的比例。
进一步地,步骤(6)以峰面积的百分比来计算circRNA的比例。
进一步地,步骤(6)包含:将经过凝胶电泳表征过的液相色谱图上的circRNA色谱峰和线性RNA色谱峰作为样品的有效成分,其他峰为杂质峰;以circRNA、线性RNA两种峰的峰面积之和作为分母,以各自的峰面积作为分子,计算出各自的百分比,将circRNA色谱峰的面积百分比定义为circRNA比例,即成环率。
进一步地,步骤(3)色谱条件如下:色谱柱为反相色谱柱;流动相流速为:0.5~1ml/min;色谱的柱温为50℃;样品盘温度为2-8℃;检测器的检测波长为260nm;待测样品的进样体积为5-100微升。
进一步地,步骤(3)色谱条件如下:色谱柱为C18反相色谱柱;流动相流速为:0.5ml/min;色谱柱的柱温为50℃;样品盘温度为5℃;检测器的检测波长为260nm;待测样品的进样体积为10微升。
进一步地,步骤(2)中,流动相A配制方法为:4.42 ml冰醋酸,11.45 ml 三乙胺,350 ml RNase free 水,调节pH至7.0。按照上述冰醋酸、三乙胺、RNase free 水的体积比例,可以扩大体积配置。
进一步地,步骤(1)中体外转录产物为任意时间的体外转录产物,优选为2h-16h体外转录产物,最优选为16h体外转录产物。
进一步地,步骤(1)中体外转录产物为任意的mRNA体外转录产物,优选为eGFPmRNA体外转录产物。
进一步地,所述方法还包含将分离获得的circRNA、线性RNA进一步纯化的步骤。
本发明提供的基于RP-HPLC分析circRNA体外转录产物成分的方法具有以下多种优异的技术效果。
(1)将反相HPLC技术应用到环状RNA与线性RNA的分析中,能够很好地将二者分离开来,且所得色谱图基线平稳。
(2)本发明利用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)将环状RNA、包含nicked RNA、pre-mRNA的线性RNA分离开,以峰面积的百分比来计算环状RNA的比例,即成环率。
(3)本发明建立了基于RP-HPLC分析circRNA体外转录产物成分的方法学,本发明所述的高效液相色谱法分析方法在16h IVT产物含量8.25-27.5μg范围内,线性良好,精密度良好,重复性良好,符合《中国药典》相关规定。
(4)通过本发明的RP-HPLC方法,计算circRNA与线性RNA的分离度,在分离梯度程序3条件下,分离度为1.9。在分离梯度程序1条件下,分离度为1.0。在分离梯度程序2条件下,分离度为0.5。由此可见,在优化的分离梯度程序3下,目标产物circRNA与非目标产物线性RNA的分离度有明显提升。
(5)对于筛选获得的优化分离梯度程序3,RP-HPLC计算成环率为54.5%。采用电泳实验验证,其成环率计算结果与RP-HPLC计算结果相同,证明了本发明优化的分离梯度程序3条件下,RP-HPLC方法计算IVT产物中成环率的准确性。
附图说明
图1A-图1B,其中图1A为本发明空白对照溶液的RP-HPLC色谱图原图;图1B为本发明空白对照溶液的RP-HPLC色谱图放大图。
图2为本发明分离梯度程序1条件下,15μg 16h IVT产物的高效液相色谱图。
图3为本发明分离梯度程序1条件下,重复运行的3针16h IVT产物的高效液相色谱叠图。
图4为本发明不同含量的16h IVT产物的高效液相色谱图。
图5A-图5B,图5A为本发明不同含量的16h IVT产物的高效液相色谱法的主峰1(circRNA)方程式,图5B为本发明不同含量的16h IVT产物的高效液相色谱法的主峰2(线性RNA)线性方程式。
图6为本发明分离梯度程序2条件下,15μg的16h IVT产物的高效液相色谱图-全局图。
图7为本发明分离梯度程序3条件下,15μg的16h IVT产物的高效液相色谱图-全局图。
图8为本发明分离梯度程序3条件下,15μg的16h IVT产物的高效液相色谱图-局部放大图。
图9为本发明分离梯度程序3条件下,收集的峰1、峰2进行的SDS-PAGE检测电泳图。
图10为本发明分离梯度程序3条件下,luciferase mRNA样品的高效液相色谱图。
图11为本发明分离梯度程序3条件下,mCherry mRNA样品的高效液相色谱图。
具体实施方式
实施例1 RP-HPLC分析circRNA体外转录产物成分
通过RP-HPLC法检测16h IVT产物中circRNA的比例。
1.1 样品制备
空白对照溶液(稀释剂):纯化水;
样品:1.5μg/μl的eGFP mRNA体外16小时体外转录产物(IVT产物)。以下实施例中采用的样品均是eGFP mRNA IVT产物。eGFP mRNA IVT产物仅是作为示例,本发明的方法适用于任意的mRNA体外转录产物,不限于eGFP mRNA IVT产物。16小时体外转录产物仅是作为示例,本发明的方法适用于任意时间的体外转录产物,不限于16小时体外转录产物。
1.2 流动相配制
流动相A: 100 mM 醋酸三乙胺(pH 7.0);
配制方法为:4.42 ml冰醋酸+11.45 ml 三乙胺+ 350 ml RNase free 水 ,调节pH至7.0。
流动相B:100%乙腈
1.3 色谱条件
色谱柱为Sepax Bio-C18(4*250mm;粒径5μm,孔径300A)的反相色谱柱(C18柱);
流动相流速为:0.5ml/min;
色谱柱的柱温为50℃;
样品盘温度为5℃;
检测器的检测波长为260nm;
待测样品的进样体积为10微升。
1.4 分离梯度程序1如下:
起始:90% A液+10% B液
36min: 86.4% A液+13.6% B液
38min: 86.4% A液+13.6% B液
38.1min: 90% A液+10% B液
46min: 90% A液+10% B液
1.5 试验结果
(1)空白对照溶液的RP-HPLC色谱图结果如图1A-图1B所示。其中图1A为本发明空白对照溶液的RP-HPLC色谱图原图;图1B为本发明空白对照溶液的RP-HPLC色谱图放大图,其分离梯度为程序1,图1A为空白对照基线图(原图),以及图1B为空白对照基线图(放大图)。
(2)分离梯度程序1条件下,15μg 16h IVT产物的高效液相色谱图如图2所示,其中主峰1为circRNA,主峰2为线性RNA。
(3)分离梯度程序1条件下,重复运行的3针16h IVT产物的高效液相色谱叠图如图3所示,该结果表明:3次重复进样具有很好的重复性,说明该分离系统具有良好的稳定性。
实施例2 RP-HPLC分析circRNA体外转录产物成分的方法学研究
采用实施例1相同的实验条件,进行方法学研究。
2.1 不同含量的16h IVT产物RP-HPLC分析
依据分离梯度为程序1,不同含量的16h IVT产物的高效液相色谱图如图4所示,图4中:
16h IVT 2: IVT产物含量为8.25μg;
16h IVT 3: IVT产物含量为11.00μg;
16h IVT 4: IVT产物含量为13.75μg;
16h IVT 5: IVT产物含量为27.50μg;
2.2 线性数据:高效液相色谱法方法学线性数据如表1所示。
表1 RP-HPLC检测体外转录产物中circRNA方法学线性数据
本方法的适用的测试范围是将样品稀释不同的倍数,注射相同体积的样品进行测试的。线性公式是以16h IVT产物的总含量作为自变量X、以峰1(Peak1)或者峰2(Peak2)的面积作为因变量Y进行线性拟合的。相关系数是研究变量之间线性相关程度的量,一般用字母 R 表示,R2约接近1,说明二者的相关程度越高。
从表1数据可知,本发明所述的高效液相色谱法分析方法在16h IVT产物含量8.25-27.5μg范围内,线性良好。不同含量的16h IVT产物的高效液相色谱法的主峰1(circRNA)方程式如图5A,不同含量的16h IVT产物的高效液相色谱法的主峰2(线性RNA)线性方程式如图5B。
2.3 系统精密度数据
表2 高效液相色谱法方法学系统精密度数据
编号 | 组分1(主峰1)保留时间(min) | 组分2(主峰2)保留时间(min) |
1 | 30.07 | 31.76 |
2 | 30.10 | 31.92 |
3 | 30.00 | 31.89 |
平均值 | 30.06 | 31.85 |
相对标准偏差RSD% | 0.17 | 0.27 |
编号 | 组分1峰(主峰1)面积 | 组分2峰(主峰2)面积 |
1 | 1963941 | 2658260 |
2 | 2049447 | 2598793 |
3 | 1876388 | 2620279 |
平均值 | 1963259 | 2625777 |
相对标准偏差RSD% | 4.41 | 1.15 |
从表2数据可知,本发明的高效液相色谱法分析方法学精密度良好。
2.4 重复性数据
表3 高效液相色谱法方法学重复性数据
编号 | 主峰1含量(%) | 主峰2含量(%) |
1 | 39.54 | 53.53 |
2 | 41.13 | 52.15 |
3 | 38.46 | 53.71 |
平均值 | 39.71 | 53.13 |
相对标准偏差RSD% | 3.38 | 1.61 |
从表3数据可知,本发明的高效液相色谱法分析方法学重复性良好,符合《中国药典》四部9101分析方法验证指导原则相关表述。
实施例3不同的分离程序用于RP-HPLC分析circRNA体外转录产物成分
3.1 样品制备
空白对照溶液(稀释剂):纯化水;
样品:1.5μg/μl的eGFP mRNA体外16小时体外转录产物(IVT产物)。
3.2 流动相配制
流动相A: 100 mM 醋酸三乙胺(pH 7.0)
配制方法为:4.42 ml冰醋酸+11.45 ml 三乙胺+ 350 ml RNase free 水,调节pH至7.0。
流动相B:100%乙腈
3.3 色谱条件如下:
色谱柱为Sepax Bio-C18(4*250mm;粒径5μm,孔径300A)的反相色谱柱(C18柱);
流动相流速为:0.5ml/min;
色谱柱的柱温为50℃;
样品盘温度为5℃;
检测器的检测波长为260nm;
待测样品的进样体积为10微升。
3.4 通过不同分离梯度程序筛选优化,选择分离梯度程序2如下:
起始:90% A液+10% B液
5min:90% A液+10% B液
45min: 80% A液+20% B液
50min: 80% A液+20% B液
51min:90% A液+10% B液
61min:90% A液+10% B液
3.5 实验结果
在分离梯度程序2条件下,15μg的16h IVT产物的高效液相色谱图-全局图如图6。
实施例4优化的分离程序用于RP-HPLC分析circRNA体外转录产物成分
4.1 样品制备
空白对照溶液(稀释剂):纯化水;
样品:1.5μg/μl的eGFP mRNA体外16小时体外转录产物(IVT产物)。
4.2 流动相配制
流动相A: 100 mM 醋酸三乙胺(pH 7.0)
配制方法为:4.42 ml冰醋酸+11.45 ml 三乙胺+ 350 ml RNase free 水 ,调节pH至7.0。
流动相B:100%乙腈
4.3 色谱条件如下:
色谱柱为Sepax Bio-C18(4*250mm;粒径5μm,孔径300A)的反相色谱柱(C18柱);
流动相流速为:0.5ml/min;
色谱柱的柱温为50℃;
样品盘温度为5℃;
检测器的检测波长为260nm;
待测样品的进样体积为10微升。
4.4 通过不同分离梯度程序筛选优化,选择分离梯度程序3如下:
起始:90% A液+10% B液
10min: 88.4% A液+11.6% B液
20min: 88% A液+12% B液
40min: 87.4% A液+12.6% B液
50min: 86.4% A液+13.6% B液
55min: 86.4% A液+13.6% B液
55.1min:90% A液+10% B液
65min:90% A液+10% B液
4.5 实验结果
在分离梯度程序3条件下,15μg的16h IVT产物的高效液相色谱图-全局图如图7,15μg的16h IVT产物的高效液相色谱图-局部放大图如图8。
实施例5各分离梯度程序下分离度、circRNA成环率计算
对于circRNA与线性RNA的分离度,其计算公式:R=2(tR2-tR1)/(Y1+Y2),其中tR1代表1号峰的保留时间,tR2代表2号峰的保留时间,Y1代表1号峰峰宽,Y2代表2号峰峰宽。分离度R又称分辨率,为了判断分离物质对色谱柱在色谱柱中的分离情况,常用分离度作为柱的总分离效能指标,用R表示。R等于相邻色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比,表示相邻两峰的分离程度,R越大,表明相邻两组分分离越好。
计算circRNA与线性RNA的分离度,在分离梯度程序3条件下,分离度为1.9。在分离梯度程序1条件下,分离度为1.0。在分离梯度程序2条件下,分离度为0.5。由此可见,在优化的分离梯度程序3下,目标产物circRNA与非目标产物线性RNA的分离度有明显提升。
将经过凝胶电泳表征过的液相色谱图上的1号峰和2号峰作为样品的有效成分,其他峰为杂质峰。以两种峰的峰面积之和作为分母,以各自的峰面积作为分子,计算出各自的百分比,将主峰1号峰的面积百分比定义为circRNA比例。计算出circRNA(主峰1)在IVT产物中所占比例(即成环率)。在分离梯度程序1条件下,计算结果为41.5%。在分离梯度程序2条件下,计算结果为50.8%。在分离梯度程序3条件下,计算结果为54.5%。
对于获得的优化分离梯度程序3,采用电泳实验验证其成环率。将RP-HPLC收集的峰1、峰2进行SDS-PAGE检测,结果如图9所示,其中M为marker,泳道2为峰1(circRNA);泳道4为峰2(线性RNA)。利用电泳图分析软件对峰1、峰2的量进行测量,计算峰1(circRNA)与峰1(circRNA)加峰2(线性RNA)的比值,其成环率计算结果与上述RP-HPLC计算结果相同,证明了本发明优化的分离梯度程序3条件下,RP-HPLC方法计算IVT产物中成环率的准确性。
本发明可将RP-HPLC分离的circRNA主峰1、线性RNA主峰2,各自收集,用于后续进一步纯化。
实施例6优化的分离程序用于RP-HPLC分析其他circRNA体外转录产物成分
6.1 样品制备
空白对照溶液(稀释剂):纯化水;
样品1:1.5μg/μl的luciferase mRNA体外16小时体外转录产物(IVT产物)。
样品2:1.5μg/μl的mCherry mRNA体外16小时体外转录产物(IVT产物)。
6.2 流动相配制
流动相A: 100 mM 醋酸三乙胺(pH 7.0)
配制方法为:4.42 ml冰醋酸+11.45 ml 三乙胺+ 350 ml RNase free 水 ,调节pH至7.0。
流动相B:100%乙腈
6.3 色谱条件如下:
色谱柱为Sepax Bio-C18(4*250mm;粒径5μm,孔径300A)的反相色谱柱(C18柱);
流动相流速为:0.5ml/min;
色谱柱的柱温为50℃;
样品盘温度为5℃;
检测器的检测波长为260nm;
待测样品的进样体积为10微升。
6.4 通过不同分离梯度程序筛选优化,选择分离梯度程序3如下:
起始:90% A液+10% B液
10min: 88.4% A液+11.6% B液
20min: 88% A液+12% B液
40min: 87.4% A液+12.6% B液
50min: 86.4% A液+13.6% B液
55min: 86.4% A液+13.6% B液
55.1min:90% A液+10% B液
65min:90% A液+10% B液
6.5 实验结果
在分离梯度程序3条件下,样品1(luciferase mRNA)的高效液相色谱图如图10所示,样品2(mCherry mRNA)的高效液相色谱图如图11所示。实验结果表明,本发明优化的分离梯度程序3对于其他体外转录产物mRNA样品,例如luciferase mRNA、mCherry mRNA,同样具有良好的分离效果,具有一定普适性。
本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例,而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种基于 RP-HPLC 分析体外转录产物成分 circRNA 的方法,其特征在于,包含如下步骤:
(1)样品制备:制备用于RP-HPLC的体外转录产物;
(2)流动相配制:流动相A液为100 mM 醋酸三乙胺,pH 7.0;流动相B液为100%乙腈;
(3)色谱分离:分离梯度程序如下:起始:90% A液+10% B液;10min: 88.4% A液+11.6%B液;20min: 88% A液+12% B液;40min: 87.4% A液+12.6% B液;50min: 86.4% A液+13.6%B液;55min: 86.4% A液+13.6% B液;55.1min:90% A液+10% B液;65min:90% A液+10% B液;
(4)分别收集circRNA、线性RNA的目标色谱峰;
其中,步骤(3)色谱条件如下:色谱柱为反相色谱柱;流动相流速为:0.5~1ml/min;色谱柱的柱温为50℃;样品盘温度为2-8℃;检测器的检测波长为260nm;待测样品的进样体积为5-100微升。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,还包含步骤(5)获得色谱图谱。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,还包含步骤(6)计算circRNA在体外转录产物中的比例。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤(6)以峰面积的百分比来计算circRNA在体外转录产物中的比例。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤(6)包含:将经过凝胶电泳表征过的液相色谱图上的circRNA色谱峰和线性RNA色谱峰作为样品的有效成分,其他峰为杂质峰;以circRNA、线性RNA两种峰的峰面积之和作为分母,以各自的峰面积作为分子,计算出各自的百分比,将circRNA色谱峰的面积百分比定义为circRNA比例,即成环率。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)色谱条件如下:色谱柱为C18反相色谱柱;流动相流速为:0.5ml/min;色谱柱的柱温为50℃;样品盘温度为5℃;检测器的检测波长为260nm;待测样品的进样体积为10微升。
7.根据权利要求1或2任一项所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,流动相A配制方法为:4.42 ml冰醋酸,11.45 ml 三乙胺,350 ml RNase free 水,调节pH至7.0。
8.根据权利要求1或2任一项所述的方法,其特征在于,步骤(1)中体外转录产物为任意的mRNA体外转录产物。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,步骤(1)中体外转录产物为eGFP mRNA体外转录产物。
10.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,步骤(1)中体外转录产物为2h-16h体外转录产物。
11.根据权利要求10所述的方法,其特征在于,步骤(1)中体外转录产物为16h体外转录产物。
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CN111819280A (zh) * | 2018-03-30 | 2020-10-23 | 东丽株式会社 | 发夹型单链rna分子的制备方法 |
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DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES GRADES ET AL.: "Engineering of modified linear and circular messenger RNA and study of the influence on protein expression tuning" * |
KAZUHIRO FURUKAWA ET AL.: "Identification of Ligand Analogues that Control c-di-GMP Riboswitches" * |
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