CN101563457A

CN101563457A - 利用hplc在制备级上纯化rna的方法

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Publication number: CN101563457A
Application number: CNA2007800471332A
Authority: CN
Inventors: 托马斯·克特雷尔; 弗洛里安·冯德米尔贝; 拉迪斯劳斯·赖德尔; 托尔斯藤·穆茨克
Original assignee: Curevac AG
Current assignee: Kuriwag Manufacturing Co ltd
Priority date: 2006-12-22
Filing date: 2007-12-20
Publication date: 2009-10-21
Anticipated expiration: 2027-12-20
Also published as: ATE481482T1; KR20090098968A; WO2008077592A1; CN101563457B; DE102006061015A1; EP2092064B1; JP5307724B2; KR101183173B1; AU2007338360B2; CA2670727A1; DE602007009295D1; JP2010512767A; EP2092064A1; CA2670727C; ES2352306T3; US8383340B2; AU2007338360A1; DK2092064T3; PL2092064T3; US20100048883A1

Abstract

本申请描述了用于制备型纯化RNA的方法，该方法的特征在于使用多孔反相作为固定相利用HPLC来纯化RNA。本申请还描述了多孔反相在该HPLC法中的应用。

Description

利用HPLC在制备级上纯化RNA的方法

技术领域

本发明涉及利用HPLC在制备级(制备规模)上纯化RNA的方法以及多孔反相在该方法中作为固定相的应用。

背景技术

HPLC(“高效(高压)液相色谱”的缩写)是一种已建立的用于分离物质的混合物的方法，该方法广泛用于生物化学、分析化学以及临床化学中。

在最简单的情况下，HPLC装置包括带有洗脱液储器(装有流动相)的泵、加样系统、装有固定相的分离柱、以及检测器。此外，还可以提供流分收集器，利用该流分收集器可以在分离以后分别收集单独流分，且单独流分因此可用于进一步的应用中。

从A.Azarani和K.H.Hecker(Nucleic Acids Research，vol.29，no.2e7)中已知利用离子对反相HPLC进行的RNA分析。其中的固定相由非多孔烷基化聚苯乙烯二乙烯基苯基质构成。用两种洗脱液的缓冲体系进行洗脱。缓冲液A由0.1M乙酸三乙铵(TEAA)的水溶液组成(pH7.0)，而缓冲液B由0.1M TEAA的水溶液(pH7.0)以及25％乙腈组成。利用以下三种梯度体系进行洗脱：38-40％B经1分钟，至60％B经15分钟，至66％B经6分钟，至70％B经0.5分钟，至100％B经0.5分钟，在100％B下保持1分钟，至38％经1分钟，在38％B下保持2分钟。可替换地，使用以下梯度程序：38-60％经30分钟，至100％B经2分钟，至38％B经3分钟。以下用作第三梯度程序：38-40％B经1分钟，至60％B经3分钟，至100％B经1分钟，在100％B下保持6分钟，至38％B经1分钟，在38％B下保持1分钟。

因此，这种HPLC方法涉及使用相对复杂且昂贵的梯度程序。此外，这种方法仅能分离和分析最多达1000ng(1μg或0.001mg)的分析量的RNA。

发明内容

本发明的目的是改进这种方法，达到使其不再具有现有技术缺点的效果。

根据本发明，通过用于在制备级(制备规模)上纯化RNA的方法实现上述目的，该方法的显著区别在于使用多孔反相作为固定相利用HPLC来纯化RNA。因此，在根据本发明的方法中，一个重要因素是使用多孔反相。

在本发明的上下文中，术语“利用HPLC”应包括可以用来实施本发明方法的各种HPLC方法以及低压或常压液相色谱法。这些HPLC方法可以包括反相HPLC(RP-HPLC)、色谱法、尺寸排阻色谱法、凝胶过滤、亲和色谱法、疏水作用色谱法或离子对色谱法，其中反相HPLC是优选的。简言之，反相HPLC包括非极性的固定相和中等极性的流动相。例如，一种常用的固定相是用诸如RMe₂SiCl处理过的二氧化硅，其中R是诸如C₁₈H₃₇或C₈H₁₇的直链烷基。因此，对于本身非极性更强的分子，保留时间会更长，从而使得极性分子更容易洗脱。通过向流动相中加入极性溶剂可延长保留时间，而加入疏水性更强的溶剂则可缩短保留时间。

然而，上述各种技术是基于疏水作用的原理而操作的，疏水作用是由相对极性的溶剂、相对非极性的分析物、以及非极性的固定相之间的排斥力而引起的(反相原理)。分析物(RNA分子)结合于固定相的驱动力是分析物分子暴露于溶剂的非极性部分面积的减少。这种疏水效应受控于自由能的降低(来自与有序分子-极性溶剂界面的极小化有关的熵)。通过向流动相中加入非极性更强的溶剂可以降低疏水效应。这会使分配系数发生变化以致分析物经一定时间在流动相中沿柱下移，最终从柱洗脱。

作为分析物的特定RNA分子的特性在其保留特性方面可以起到重要作用。通常，具有非极性更强的官能团的分析物导致更长的保留时间，因为它使分子的疏水性提高。然而，非常大的分子会导致较大分析物表面和烷基链之间的不完全相互作用。保留时间随疏水表面积的增加而增加，其中疏水表面积与溶质大小大致成反比。因为总表面积减小，支链化合物比它们的相应异构体更快速地被洗脱。

除流动相疏水性之外，根据本发明，其他流动相改性剂也会影响分析物(RNA分子)的保留。例如，认为加入无机盐会引起水溶液表面张力的线性增加，并且由于分析物-溶剂界面的熵受控于表面张力，所以盐的加入倾向于使保留时间增加。根据本发明可以使用的另一个重要因素是pH，因为这能够改变分析物的疏水性。为此，可以使用缓冲剂，如磷酸钠或其他常用缓冲剂来控制pH。可以向流动相中加入有机酸，例如甲酸或最常用的三氟乙酸。上述改性可以出于多种目的：它们控制pH，中和在固定相上的任何残余暴露材料上的电荷以及作为离子配对剂(ion pairing agent)来中和分析物上的电荷。这种效应依赖于应用而不同但通常会改进色谱法。

针对本发明的目的，术语“纯化”应理解为意指将样品中所期望的RNA分离出来和/或与其中存在的杂质分开。因此，与HPLC纯化以前最初引入的含RNA的样品相比，HPLC纯化以后，RNA以更纯的形式存在。含RNA的样品中的不期望的成分(因此其需要被分离)具体而言可以是降解的片段或由于提前终止转录而产生的片段、或过长的转录本(如果质粒未被完全线性化)。此外，可以将杂质，如酶(例如核糖核酸酶和聚合酶)以及核苷酸，分离出来。

利用根据本发明的方法，使RNA得到纯化，纯化后的RNA比原料具有更高的纯度。在这方面人们希望纯度尽可能地接近100％。以这种方式可以达到大于70％、特别地80％、非常特别地90％以及最有利地99％或更大的纯度。

根据本发明的方法导致制备型RNA纯化。这不同于在上述现有技术中(Azarani & Hecker)描述的分析型HPLC法。与制备型HPLC法相比，分析型HPLC法引入和分离明显更少的量。在现有技术描述的方法中，引入的量为8ng至1000ng。相比之下，制备型HPLC法应理解为是指其中相对大量的RNA被纯化的HPLC方法。这种相对大量例如是0.5mg或更多，特别地1.0mg至1000mg或更多，非常特别地大约1.5mg或更多，甚至增加到kg范围也是可能的。因此以上陈述应理解为是指这些量涉及单次HPLC运行。如果实施多次HPLC运行，则该量与HPLC运行的次数成正比地增加。

根据本发明的方法，尤其是下文详细描述的优选实施方式，具有一系列优点：利用根据本发明的方法，与现有技术已知方法的可能情况相比，可以分离明显更大量的RNA。利用根据本发明的方法，可以以高纯度获得这些相对大量的RNA。可以分离降解片段或过长片段或由于提前终止转录所产生的片段。此外，可以较好地分离RNA样品中存在的其他杂质，如酶(例如核糖核酸酶和聚合酶)以及核苷酸。可以在数分钟内回收这些相对大量的RNA，甚至是从具有非常高度的杂质污染的样品中进行回收。RNA回收可以可靠地进行，即，以较高的可靠性回收高纯度的RNA。

在根据本发明的方法中，可以实现高水平的分离度(resolution)。另外，根据本发明的方法可以容易地自动操作。因此它最适合用于制备级的RNA的常规纯化。在根据本发明的方法的条件下RNA是稳定的，即，避免在HPLC纯化过程中降解成RNA片段并由此产生新的杂质、以及所期望的RNA的产率降低。因此可以以简单、快速、廉价的方式来精确地实施根据本发明的方法，并产生可靠的结果。在HPLC分离以后，可以简单地用流分收集器进行RNA的分离，即，可以非常简单地实现RNA的回收，同样也可以直接对RNA实施进一步处理。最后可以非常灵敏地进行检测。

可用根据本发明的方法纯化的“RNA”是任何类型的核糖核酸。RNA特别优选选自tRNA、rRNA、mRNA或全细胞RNA。此外，RNA还可以包括适体和核酶。要分离的RNA可以是单链或双链的。单链RNA可以可选地通过重折叠而形成二级结构，要分离的RNA通常是单链的。RNA可以是未标记的或(用荧光标记或放射性标记或抗体表位)标记的。标记RNA的一个实例是地高辛标记的β-肌动蛋白RNA。

要纯化的RNA可以是天然的或非天然的RNA。优选使用天然RNA，其利用例如细胞或体外表达系统而制备。然后分离RNA并利用根据本发明的方法进行分离纯化。可选地，也可以利用根据本发明的方法纯化化学合成的RNA。不论如何，RNA还可以包含非天然核苷酸，其中化学修饰可存在于RNA的骨架中，例如硫代磷酸酯(phosphorthioate)；可存在于核苷酸碱基结构中，例如次黄嘌呤、二氢尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、5-(C1-C6)-烷基尿嘧啶、5-(C2-C6)-烯基尿嘧啶、5-(C2-C6)-炔基尿嘧啶、5-(羟甲基)尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-(C1-C6)-烷基胞嘧啶、5-(C2-C6)-烯基胞嘧啶、5-(C2-C6)-炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、N<2>-二甲基鸟嘌呤、2，4-二氨基嘌呤、8-氮杂嘌呤、取代的7-去氮嘌呤(优选7-去氮-7-取代的嘌呤和/或7-去氮-8-取代的嘌呤)、5-羟甲基胞嘧啶、N4-烷基胞嘧啶(例如N4-乙基胞嘧啶)、5-羟基脱氧胞苷、5-羟甲基脱氧胞苷、N4-烷基脱氧胞苷(例如N4-乙基脱氧胞苷)、6-硫代脱氧鸟苷、以及硝基吡咯的脱氧核糖核苷酸、C5-丙炔基嘧啶，以及二氨基嘌呤(例如2，6-二氨基嘌呤)、肌苷、5-甲基胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤；或者也存在于糖残基中。修饰核苷酸的其他实例是2-氨基-6-氯嘌呤-核苷-5′-三磷酸、2-氨基腺苷-5′-三磷酸、2-硫代胞苷-5′-三磷酸、2-硫代尿苷-5′-三磷酸、4-硫代尿苷-5′-三磷酸、5-氨基烯丙基胞苷-5′-三磷酸、5-氨基烯丙基尿苷-5′-三磷酸、5-溴胞苷-5′-三磷酸、5-溴尿苷-5′-三磷酸、5-碘胞苷-5′-三磷酸、5-碘尿苷-5′-三磷酸、5-甲基胞苷-5′-三磷酸、5-甲基尿苷-5′-三磷酸、6-氮杂胞苷-5′-三磷酸、6-氮杂尿苷-5′-三磷酸、6-氯嘌呤-核苷-5′-三磷酸、7-去氮腺苷-5′-三磷酸、7-去氮鸟苷-5′-三磷酸、8-氮杂腺苷-5′-三磷酸，8-叠氮腺苷-5′-三磷酸、苯并咪唑-核苷-5′-三磷酸、N1-甲基腺苷-5′-三磷酸、N1-甲基鸟苷-5′-三磷酸、N6-甲基腺苷-5′-三磷酸、O6-甲基鸟苷-5′-三磷酸、假尿苷-5′-三磷酸、嘌呤霉素-5′-三磷酸、黄苷-5′-三磷酸。

在根据本发明的方法的一种优选实施方式中，要分离的RNA的大小为多达约15000个核苷酸(作为单链RNA分子)或碱基对(作为双链RNA分子)，特别地100至10000个，更优选500至10000个核苷酸或碱基对，甚至更优选800至5000个核苷酸或碱基对并且甚至更优选800至2000个核苷酸或碱基对。对于这样大小的RNA，已证明对于RNA的纯化可以获得非常好的结果，因为根据本发明的方法特别好地适合于这样大小的RNA。然而，可选地，也可以以此方式分离更小的RNA片段，例如长度为30-1000、50-1000或100-1000或20-200、20-100、20-50或20-30个核苷酸。

如果要分离的RNA是mRNA，将优选编码蛋白，特别是那些具有抗原特性的蛋白，以及例如所有重组产生的或天然存在的蛋白，其是本领域技术人员根据现有技术已知的并且用于治疗、诊断或研究目的。特别地，抗原是肿瘤抗原或病原体的抗原，病原体例如是病毒、细菌或原生生物。

并不限于此，这样的蛋白质尤其包括生长激素或生长因子，例如用于在(转基因)活生物体内促进生长，例如TGF和IGF(“胰岛素样生长因子”)；影响代谢作用和/或造血作用的蛋白，例如(α-1)-抗胰蛋白酶、LDL受体、促红细胞生成素(EPO)、胰岛素、GATA-1等；或如凝血系统的因子VIII和XI的蛋白质，等等。这样的蛋白质进一步包括酶，如半乳糖苷酶(lacZ)、DNA限制性内切酶类(例如EcoRI、HindIII等)、溶菌酶类等，或蛋白酶类，如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、角蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、凝乳酵素(凝乳酶)、suizyme、nortase等，以及蛋白酶抑制剂(例如用于治疗HIV感染)，如选自由AG1776、氨普那韦(141W94或VX-478)、阿扎那韦(BMS-232632)、组织蛋白酶S蛋白酶抑制剂、D1927、D9120、福沙那韦(GW-433908或VX-175)、GS 9005、GW640385(VX-385)、HCV蛋白酶抑制剂、茚地那韦(MK-639)、L-756423、Levoprin-ZG、洛匹那韦(ABT-378)、洛匹那韦/利托那韦(LPVABT-378/r)、MK-944A、莫折那韦(DMP450)、奈非那韦(AG-1343)、NNRT1、P-1946、PL-100、普啉司他、利托那韦(ABT-538)、RO033-4649、TMC114、沙奎那韦(Ro-31-8959)、NRT1、替拉那韦(PNU-140690)、TLK 19781、TMC-114、vertex 385、VX-950组成的组中的蛋白酶抑制剂。由根据本发明分离的RNA编码的蛋白同样可以包括刺激或抑制细胞信号传输的蛋白，例如细胞因子等。因此这样的蛋白质还包括例如I型细胞因子家族的细胞因子，其包含4个位置保守的半胱氨酸残基(CCCC)和一个保守序列基元(或基序)Trp-Ser-X-Trp-Ser(WSXWS)，其中X表示非保守氨基酸。I型细胞因子家族的细胞因子包括GM-CSF亚家族，例如IL-3、IL-5、GM-CSF；IL-6亚家族，例如IL-6、IL-11、IL-12；或IL-2亚家族，例如IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15等，或细胞因子IL-1、IL-1、IL-10等。同样，这样的蛋白质还可以包括II型细胞因子家族(干扰素受体家族)的细胞因子，其同样包含4个位置保守的半胱氨酸残基(CCCC)，但没有保守序列基元Trp-Ser-X-Trp-Ser(WSXWS)。II型细胞因子家族的细胞因子包括例如IFN-α、IFN-β、IFN-γ等。由分离的RNA编码的蛋白还可以另外包括肿瘤坏死家族的细胞因子，包括例如TNF-α、TNF-β、CD40配体、Fas配体等，或趋化因子家族的细胞因子，尤其是干扰素、白细胞介素、集落刺激因子和肿瘤坏死因子，并且与G蛋白相互作用，例如IL-8、MIP-1、RANTES、CCR5、CXR4等。这样的蛋白质还可以选自凋亡因子或凋亡相关蛋白或凋亡关联蛋白，其包括AIF、Apaf(例如Apaf-1，Apaf-2，Apaf-3)、或APO-2(L)、APO-3(L)、凋亡素(apopain)、Bad、Bak、Bax、Bcl-2、Bcl-x_L、Bcl-x_S、bik、CAD、钙蛋白酶、半胱天冬蛋白酶类(caspases)例如半胱天冬蛋白酶-1、半胱天冬蛋白酶-2、半胱天冬蛋白酶-3、半胱天冬蛋白酶-4、半胱天冬蛋白酶-5、半胱天冬蛋白酶-6、半胱天冬蛋白酶-7、半胱天冬蛋白酶-8、半胱天冬蛋白酶-9、半胱天冬蛋白酶-10、半胱天冬蛋白酶-11、ced-3、ced-9、c-Jun、c-Myc、crmA、细胞色素C、CdR1、DcR1、DD、DED、DISC、DNA-PK_CS、DR3、DR4、DR5、FADD/MORT-1、FAK、Fas(Fas配体CD95/fas(受体))、FLICE/MACH、FLIP、胞衬蛋白、fos、G-肌动蛋白、Gas-2、凝溶胶蛋白、颗粒酶A/B、ICAD、ICE、JNK、核纤层蛋白A/B、MAP、MCL-1、Mdm-2、MEKK-1、MORT-1、NEDD、NF-B、NuMa、p53、PAK-2、PARP、穿孔蛋白、PITSLRE、PKC、pRb、早老素、prICE、RAIDD、Ras、RIP、鞘磷脂酶、来自单纯疱疹的胸苷激酶、TRADD、TRAF2、TRAIL、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、转谷氨酰胺酶等。由根据本发明分离的RNA编码的蛋白质还可以选自抗原，例如选自肿瘤特异性表面抗原(TSSA)，例如5T4α5β1整联蛋白、707-AP、AFP、ART-4、B7H4、BAGE、Bcr-abl、MN/C IX-抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、CASP-8、β-联环蛋白/m、CD4、CD19、CD20、CD22、CD25、CDC27/m、CD30、CD33、CD52、CD56、CD80、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、EGFR、ErbB3、ELF2M、EMMPRIN、EpCam、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gp100、HAGE、HER-2/new、HLA-A*0201-R170I、HPV-E7、HSP70-2M、HAST-2、hTERT(或hTRT)、iCE、IGF-1R、IL-2R、IL-5、KIAA0205、LAGE、LDLR/FUT、MAGE、MART-1/黑色素-A(melan-A)、MART-2/Ski、MC1R、肌球蛋白/m、MUC1、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、PAP、蛋白酶-3、p190次要bcr-abl、Pml/RAR、PRAME、PSA、PSM、PSMA、RAGE、RU1或RU2、SAGE、SART-1或SART-3、存活素、TEL/AML1、TGF、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、VEGF以及WT1，或选自序列，如NY-Eso-1或NY-Eso-B。可以由根据本发明分离的RNA编码的蛋白另外还包括与上述蛋白中的一种具有至少80％或85％，优选至少90％，更优选至少95％以及最优选至少99％的序列同一性的蛋白或蛋白序列。

要分离的mRNA可以相对于相应的野生型mRNA具有以下修饰，相应的野生型mRNA可以作为替换或以合并方式而存在。一方面，编码肽或多肽的修饰mRNA区的G/C含量可以大于编码肽或多肽的野生型mRNA的编码区的G/C含量，编码的氨基酸序列相对于野生型没有改变。这种修饰基于以下事实：要翻译的mRNA域的序列顺序对于有效的mRNA翻译是重要的。在这方面，各种核苷酸的组成和顺序具有重要作用。尤其是，具有高G(鸟苷)/C(胞嘧啶)含量的序列比具有高A(腺苷)/U(尿嘧啶)含量的序列更加稳定。因此，根据本发明，虽然维持翻译的氨基酸序列不变，但密码子相对于野生型mRNA以使它们具有更高G/C核苷酸含量的方式变化。因为若干种密码子编码一种和相同的氨基酸(遗传密码的简并)，所以可以确定最有利于稳定性的密码子(可选的密码子应用)。另一方面，借助于根据本发明的方法，还可以提供翻译优化的RNA。

在根据本发明的方法中，反相用作HPLC纯化的固定相。对于反相色谱法，非极性化合物用作固定相而极性溶剂，如水(其通常以缓冲液的形式使用)与例如乙腈和/或甲醇的混合物，用作洗脱的流动相。

可以以珠粒(bead)形式或作为聚合的“块体”(即填充大部分色谱柱的块体)来提供填装在柱上的材料，其用作固定相。不论其确切的特性如何，聚合固定相的特性是多孔的，其意味着珠粒或块体的特征是具有孔。

在根据本发明的方法的一种优选实施方式中，所提供的多孔反相材料的颗粒大小为8.0μm至50μm，特别地8.0至30，更优选8.0至25μm。该反相材料可以以小球的形式存在。借助于具有这种颗粒大小的多孔反相(可选地为珠粒形式)，可以特别有利地实施根据本发明的方法，其中可以获得特别好的分离结果。

在根据本发明的方法中使用的反相是多孔的并且具有特定的颗粒大小。另一方面，在使用例如由A.Azarani和K.H.Hecker所描述的固定反相(其不是多孔的，因而就颗粒大小而言完全不同于本发明的主题)的情况下会产生过高压力，以使得就算可以进行RNA的制备型纯化，也存在着很大困难。

在根据本发明的方法的一种优选实施方式中，反相的孔径为1000

至5000

特别地孔径为1000

至4000

更优选1500至4000

2000

至4000

或2500

至4000

反相的特别优选的孔径是1000

至2000

更优选1000

至1500

以及最优选1000至1200

或3500-4500

借助于具有这些孔径的反相，利用根据本发明的方法可以获得特别好的RNA纯化的结果，尤其是因而可以避免在按照A.Azarani和K.H.Hecker的方法中所产生的升高的压力，从而可以以特别有利的方式进行制备型分离。在孔径小于1000

时，RNA分子的分离会变得较差。

1000

至5000

的孔径，特别是1000

至4000

的孔径，更优选1500

至4000

2000

至4000

或2500

至4000

的孔径可以适合于从混合物的其他组分中分离出RNA，其中RNA的大小如上所述具有多达约15000个核苷酸(作为单链RNA分子)或碱基对(作为双链RNA分子)，特别地100至10000，更优选500至10000个核苷酸或碱基对，甚至更优选800至5000个核苷酸或碱基对以及甚至更优选800至2000个核苷酸或碱基对。然而，也可以根据要分离的RNA的大小来选择反相的孔径，即，如果要分离较大的RNA分子则可以选择较大的孔径，而如果选择较小的RNA分子则可以选择较小的孔径。这是由于这样的效应，即，RNA分子的保留和分离不仅取决于(反)相的相互作用而且还取决于分子进入基质的孔中并因此提供进一步保留效应的可能性。不限于此，例如，反相的孔径为约2000至约5000

更优选为约2500至约4000，最优选为约3500至约4500因此可以用来分离较大的RNA分子，例如，100至10000个，更优选500至10000个核苷酸或碱基对，甚至更优选800至5000个核苷酸或碱基对以及甚至更优选800至2000个核苷酸或碱基对的RNA分子。可替换地，不限于此，反相的孔径为约1000

至约2500

更优选为约1000

至约2000以及最优选为约1000

至1200

可以用来分离较小的RNA分子，例如，还可以以这种方式来分离约30-1000、50-1000或100-1000或20-200、20-100、20-50或20-30个核苷酸的RNA分子。

通常，已知用作反相固定相的任何材料，尤其是任何高分子材料，如果可以以多孔形式提供，则该材料可以用于本发明的方法。固定相可以由有机和/或无机材料构成。用于本发明的聚合物的实例是(非烷基化)聚苯乙烯、(非烷基化)聚苯乙烯二乙烯基苯、硅胶、用非极性残基改性的硅胶(特别是用含烷基的残基改性的硅胶、更优选用含丁基、辛基和/或十八烷基的残基改性的硅胶、用苯基残基改性的硅胶)、聚甲基丙烯酸酯等，或其他适用于例如凝胶色谱法或如上所述的其他色谱法的材料，如葡聚糖，包括例如

和

材料、琼脂糖、葡聚糖/琼脂糖混合物、聚丙烯酰胺等。

在一种特别优选的实施方式中，用于反相的材料是多孔聚苯乙烯聚合物、(非烷基化)(多孔)聚苯乙烯二乙烯基苯聚合物、多孔硅胶、用非极性残基改性的多孔硅胶(特别是用含烷基的残基改性的多孔硅胶、更优选用含丁基、辛基和/或十八烷基的残基改性的多孔硅胶、用苯基残基改性的多孔硅胶)、多孔聚甲基丙烯酸酯，其中尤其可以使用多孔聚苯乙烯聚合物或非烷基化的(多孔)聚苯乙烯二乙烯基苯。使用聚苯乙烯二乙烯基苯的固定相本身是已知的。本身已知的已用于HPLC法的聚苯乙烯二乙烯基苯是可商购的，其可以用于根据本发明的方法。

特别优选用于根据本发明方法的非烷基化多孔聚苯乙烯二乙烯基苯，尤其可以具有8.0±1.5μm、特别是8.0±0.5μm的颗粒大小，1000-1500

特别是1000-1200

或3500-4500

的孔径，但不限于此。将这种材料用于反相，可以以特别有利的方式来实现根据本发明的方法的上述优点。

以上详细描述的固定相通常位于柱中。V2A钢通常用作柱的材料，但其他材料也可以用于柱，条件是它们适合于HPLC过程中主要的条件。通常，柱是直的。有利的是，HPLC柱的长度为5cm至100cm且直径为4mm至25mm。用于根据本发明方法的柱可以特别具有以下尺寸：长度为50mm以及直径为7.5mm或长度为50mm以及直径为4.6mm，或长度为50mm以及直径为10mm或长度和直径适合于RNA的制备型回收的任何其他尺寸，在扩大规模(或升级，upscaling)的情况下，甚至数米的长度以及更大的直径也是可行的。这里，尺寸应适合于液相色谱的技术上的可能性。

在一种优选实施方式中，以离子对方法来实施根据本发明的方法，其中将带有亲脂残基和正电荷的离子加入到流动相中作为带负电荷的RNA的反荷离子(或抗衡离子，counterion)。这样，就获得了具有亲脂特性的离子对，其通过反相体系的非极性固定相而减速。在实践中，离子对方法的具体条件必须针对每个具体的分离问题根据经验而确定。反荷离子的大小、其浓度以及溶液的pH值在很大程度上影响分离结果。这意味着，凭经验确定的离子对方法的条件不能直接应用于不同的分离问题。例如，如果现有技术已知一种离子对方法，这并不意味着相同的条件可以必然地也适用于本发明的分离问题，即使最终事实上证明相同或类似的条件是有利的。在根据本发明的方法中，有利地加入烷基铵盐，如乙酸三乙铵，和/或四烷基铵化合物，如四丁基铵。优选地，加入0.1M乙酸三乙铵并将pH值调节至约7。用于离子对方法的这种缓冲液以特别有利的方式解决了本发明的分离问题，即，制备级上RNA的纯化。可以考虑以下的其他缓冲溶液：三氟乙酸、乙酸、甲酸、乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、硫酸氢四丁铵、溴化四丁铵以及氯化四丁铵。

流动相的选择取决于所期望的分离类型。这意味着为特定分离而确定的流动相(如可以例如从现有技术已知的)直接应用于不同的分离问题不具有足够的成功前景。对于每个分离问题，理想的洗脱条件，尤其是所使用的流动相，必须通过经验性试验来确定。

在根据本发明的HPLC法的一种优选实施方式中，使用含水溶剂和有机溶剂的混合物作为洗脱RNA的流动相。有利的是，缓冲液作为含水溶剂而使用，特别具有6.0-8.0的pH，例如约7，例如7.0；优选地该缓冲液是乙酸三乙铵，特别优选0.02M至0.5M，特别是0.08M至0.12M，特别是约0.1M乙酸三乙铵缓冲液，如上所述，其在离子对方法中还作为RNA的反荷离子。

在一种优选的实施方式中，在流动相中使用的有机溶剂是乙腈、甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇以及丙酮或它们的混合物，特别优选乙腈。借助于这些有机溶剂，尤其是乙腈，应用根据本发明的方法可以以特别有利的方式来进行RNA的纯化。

在根据本发明的方法的一种特别优选的实施方式中，流动相是0.1M乙酸三乙铵(pH7)和乙腈的混合物。

已证明对于根据本发明的方法而言特别有利的是，流动相包含5.0vol.％至25.0vol.％有机溶剂(相对于流动相)，并应用含水溶剂使其达到100vol.％。通常，在梯度分离的情况下，有机溶剂的比例增加，相对于在流动相中的最初体积百分比(vol.％)，特别是增加至少10％，更优选增加至少50％以及最优选增加至少100％，可选地增加至少200％。在一种优选实施方式中，在根据本发明的方法中，在流动相中有机溶剂的比例在HPLC分离过程中总计占3至9vol.％，优选4至7.5vol.％，特别是5.0vol.％(在每种情况下均相对于流动相)。更优选地，流动相中有机溶剂的比例在HPLC分离过程中从3至9、特别是5.0vol.％增加至高达20.0vol.％(在每种情况下均相对于流动相)。更优选地，以在流动相中有机溶剂的比例在HPLC分离过程中从6.5至8.5，特别是7.5vol.％增加至高达17.5vol.％(在每种情况下均相对于流动相)的方式实施该方法。

已证明，流动相包含7.5vol.％至17.5vol.％的有机溶剂(相对于流动相)，以及应用水缓冲溶剂使其达到100vol.％，对于根据本发明的方法是更加特别有利的。

在根据本发明的方法的情况下，可以等度地或借助于梯度分离来进行洗脱。在等度分离(isocratic separation)中，用单一洗脱液或多种洗脱液的恒定混合物(constant mixture)来进行RNA的洗脱，其中可以使用以上详细描述的溶剂作为洗脱液。

在根据本发明的方法的一种优选实施方式中，进行梯度分离。在这方面，借助于梯度程序来改变洗脱液的组成。梯度分离所必要的设备是本领域技术人员已知的。这里，可以在混合室的低压侧或较远的泵(further pumps)的高压侧进行梯度洗脱。

优选地，在根据本发明的方法中，如上所述，在梯度分离过程中有机溶剂的比例相对于含水溶剂而增加。上述试剂在这里可以用作含水溶剂，并且上述试剂同样可以用作有机溶剂。

例如，在HPLC分离过程中流动相中有机溶剂的比例可以从5.0vol.％增加至20.0vol.％(在每种情况下均相对于流动相)。尤其是，在HPLC分离过程中流动相中有机溶剂的比例可以从7.5vol.％增加至17.5vol.％，尤其是从9.5增加至14.5vol.％(在每种情况下均相对于流动相)。

已证明以下梯度程序对于使用根据本发明的方法的RNA的纯化特别有利：

洗脱液A：0.1M乙酸三乙铵，pH7

洗脱液B：0.1M乙酸三乙铵，pH7，含25vol.％乙腈

洗脱液组成：

开始：62％A和38％B(第1至第3分钟)

增加至58％B(B每分钟增加1.67％)，(第3至第15分钟)

100％B(第15至第20分钟)

以下描述梯度程序的另一实例，其中使用相同的洗脱液A和B：

洗脱液组成：

·起始水平：62％A和38％B(第1至第3分钟)

·分离范围I：梯度38％-49.5％B(B增加5.75％/分钟)(第3至第5分钟)

·分离范围II：梯度49.5％-57％B(B增加0.83％/分钟)(第5至第14分钟)

·冲洗范围：100％B(第15至第20分钟)

为了使柱不被污损或堵塞并且检测不被中断，将纯化的溶剂用于HPLC是有利的。这样的纯化的溶剂是可商购的。还可以另外用1至5μm的微过滤器对其进行过滤，该微过滤器通常安装在泵上游的系统中。使用前对所有溶剂进行脱气也是有利的，否则大多数泵中会存在气泡。如果溶剂中存在气泡，这不仅会干扰分离而且还会干扰对检测器中流出物的连续监测。可以通过加热、用磁力搅拌器进行强力搅拌、短时抽真空(或瞬时抽真空，brief evacuation)、超声处理或通过使小股的氦穿过溶剂储存容器来对溶剂进行脱气。

选择洗脱液的流速使得能够将RNA与包含在待研究样品中的其他成分良好地分离开来。选择用于根据本发明方法的洗脱液的流速可以是1ml/min至几升/分钟(在扩大规模的情况下)，尤其是约1至1000ml/min，更优选5ml至500ml/min，甚至更优选大于100ml/min，这取决于扩大规模的类型和范围。可以通过泵来设置和调节这种流速。

有利地用UV检测器在254nm进行检测，其中可以在600nm进行参考测量(reference measurement)。然而，可以可替换地使用任何其他检测方法，借此可以以令人满意和可靠的方式检测上文详细描述的RNA。

为了用根据本发明的方法进行RNA的制备型纯化，建议收集含RNA的经洗脱的溶剂量。在这方面，有利的是，以这样一种方式进行这种收集使得洗脱的溶剂被收集在单独分开的流分中。这可以例如用流分收集器进行。这样，可将高纯度的含RNA的流分与其他含RNA的流分(仍然含有不希望的杂质，尽管量非常少)分离开来。单独流分可以例如经1分钟而被收集。

在完全变性条件下可以有利地实施根据本发明的方法。这可以例如在，于4-12℃温度下进行加样的情况下进行，HPLC方法此外在更高的温度下进行，优选在70℃或更高，特别优选在75℃或更高，尤其是高达82℃，以及特别优选在约78℃。为了使RNA变性，加热通常是重要的，由此可最终实现更好的分离。在更低温度下分离度会下降，即，RNA与杂质的分离减少。

可以用两种方法来加样：停流进样或定量环进样(loopinjectoin)。对于停流进样，使用能够承受在HPLC中所施加的高压的微量注射器。通过进口阀中的隔垫(septum)将样品直接注射到柱填料上或注射到直接位于填料上的小滴惰性物质上。在这种情况下，该系统可以处于高压下，或可以在注入前关闭泵，然后当压力已经下降至接近正常值时进行注入。在定量环进样的情况下，用定量环进样器(loop injector)来注入样品。其包括管状环，样品被引入其中。然后借助于适合的旋转阀，通过该环将固定相输送至泵外，环的出口直接通入柱中。样品以这种方式被固定相携带进入柱中，而没有中断溶剂流入泵中。

本发明进一步提供了多孔反相在上述根据本发明的HPLC法中的应用。

在根据本发明的方法的一种优选实施方式中，多孔反相的颗粒大小为8.0μm至50μm，特别是8.0至30，更优选8.0至25μm。反相可以以珠粒形式存在。用具有上述颗粒大小和/或珠粒形式的多孔反相可以特别有利地实施根据本发明的方法，其中可以获得特别良好的分离结果。

用于根据本发明的应用的反相是多孔的，因为在使用例如由A.Azarani和K.H.Hecker所描述的固定反相(其不是多孔的，因而就颗粒大小而言完全不同于本发明的主题)的情况下，会产生过高压力，以使得就算可以利用HPLC进行RNA的制备型纯化，也存在着很大困难。

在根据本发明的应用的一种优选实施方式中，反相的孔径为1000至5000

特别地孔径为1000

至4000

或上述优选值。反相的特别优选的孔径是1000-1200

以及3500-4500

借助于具有这些孔径的反相，利用根据本发明的方法可以获得RNA纯化特别良好的结果，尤其是由此避免了在按照A.Azarani和K.H.Hecker的方法中所产生的升高的压力，从而可以以特别有利的方式进行制备型分离。当孔径小于1000

时，RNA的分离会变得较差，因此这样的颗粒大小是不太优选的。然而，如上所述，可以根据要分离的RNA大小来选择孔径。

在根据本发明的应用的一种特别优选的实施方式中，用于反相的材料是聚苯乙烯二乙烯基苯，其中尤其可以使用非烷基化聚苯乙烯二乙烯基苯。使用聚苯乙烯二乙烯基苯的固定相本身是已知的。已用于HPLC法的本身已知的聚苯乙烯二乙烯基苯是可商购的，其可以用于根据本发明的方法。

特别优选用于根据本发明的应用的非烷基化多孔聚苯乙烯二乙烯基苯尤其可具有8.0±1.5μm、特别是8.0±0.5μm的颗粒大小，以及1000-或4000

的孔径。将这种材料用于反相，可以以特别有利的方式来实现下述优点。

对于根据本发明的应用，以上详细描述的固定相位于柱中。V2A钢通常用作柱的材料，但其他材料也可以用于柱，条件是它们适合于HPLC回收过程中主要的条件。通常柱是直的。有利的是，HPLC柱的长度为5cm至100cm且直径为4mm至25mm。用于根据本发明方法的柱可以尤其具有以下尺寸：长度为50mm以及直径为7.5mm或长度为50mm以及直径为4.6mm，或长度为50mm以及直径为10mm或长度和直径适合于利用HPLC进行RNA的制备型回收的任何其他尺寸，在规模扩大(或升级，upscale)的情况下，甚至数米的长度以及更大的直径也是可行的。这里，尺寸应适合于液相色谱的技术上的可能性。

上文已连同根据本发明的方法对用于根据本发明应用的其他条件进行了描述，因此可参照上文以避免不必要的重复。

根据本发明的应用，尤其是下文中详细描述的优选实施方式，具有一系列优点：在根据本发明的应用的情况下，与现有技术的已知方法的可能情况相比，可以分离明显更大量的RNA。根据本发明的应用使得可以以高纯度获得这些更大量。可以分离降解片段或相对较长片段或由于提前终止转录所产生的片段。此外，可以较好地分离在RNA样品中存在的其他杂质，如酶(例如核糖核酸酶或聚合酶)以及核苷酸。可以在数分钟内回收这些相对大量的RNA，甚至是从具有非常高度的杂质污染的样品中进行回收。可以可靠地进行RNA回收，即，以较高的可靠性回收高纯度RNA。根据本发明的应用使得可以实现高分离度。根据本发明的应用可以容易地自动操作。因此它最适合用于制备级的RNA的常规纯化。在HPLC分离方法的条件下RNA是稳定的，即，可避免在HPLC纯化过程中降解成RNA片段并由此产生新的杂质，或纯RNA的产率降低。因此可以以简单、快速、廉价的方式来精确地实施根据本发明的应用，并产生可靠的结果。在HPLC分离以后，可以简单地用流分收集器来分离RNA，即，可以非常简单地实现RNA的回收，同样也可以直接对RNA进行进一步处理。检测可以非常灵敏地进行。

以下参照附图和示例性实施方式更加详细地说明本发明，但不限于此。

附图说明

图1示出了分离10μg荧光素酶-mRNA(分析型)的色谱图；

图2示出了分离1.5μg荧光素酶-mRNA(制备型)的色谱图；

图3示出了图2的色谱图，其中以灰色突出显示收集的流分；

图4示出了在琼脂糖凝胶上对收集的mRNA流分纯度的验证；

图5示出了用孔径为1000

的固定相分离200μg的2kb和4kb RNA片段的色谱图；

图6示出了用孔径为4000

的固定相分离100μg的2kb和4kb RNA片段的色谱图；

图7示出了用孔径为4000的固定基质分离250μg的2kb和4kb RNA片段的色谱图；

图8是条形图，其说明了经根据本发明的方法纯化的RNA的荧光素酶表达得到改善；

图9示出了用于示例性实施方式的野生型荧光素酶的序列，具体而言是mRNA序列；

图10示出了用孔径为4000的固定基质分离3mg的Flic(GC)RNA制剂(FC-9050)的色谱图；

图11示出了用孔径为4000

的固定基质分离1.5mg的FOLH1(GC)RNA制剂(FO-9334)的色谱图；

图12示出了用孔径为4000

的固定基质分离1.5mg的KLK3(GC)RNA制剂(KL-8849)的色谱图；

图13示出了用孔径为4000的固定基质分离1.5mg的PSCA(GC)RNA制剂(PS-8845)的色谱图；

图14示出了用孔径为4000

的固定基质分离1.5mg的STEAP(GC)RNA制剂(ST-8848)的色谱图；

图15示出了用非多孔固定基质分离2kb RNA(200μg)和4kbRNA(200μg)的混合物的色谱图；

图16示出了对应于图15的色谱图的琼脂糖凝胶分析，其示出了用非多孔固定基质对2kb RNA(200μg)和4kb RNA(200μg)的混合物的分离。

具体实施方式

实施例1：利用根据本发明的HPLC法来纯化1.5mg荧光素酶mRNA

大小为1825个碱基对的荧光素酶mRNA用于分离。多孔的非烷基化聚苯乙烯/二乙烯基苯(聚苯乙烯二乙烯基苯)基质(来自Polymer Laboratories的常规商品)用作固定相。其颗粒大小为8μm且孔径为4000

所使用的柱的长度为5.0cm且直径为7.5mm。进样器温度为12℃，HPLC分离温度、具体而言是分离柱的温度为78℃，即在完全变性条件下进行操作。

通过以下梯度程序进行分离：

洗脱液A：0.1M乙酸三乙铵，pH7

洗脱液B：0.1M乙酸三乙铵，pH7，含25vol.％乙腈

洗脱液组成：

开始：62％A和38％B(第1至第3分钟)

增加至58％B(B每分钟分钟增加1.67％)，(第3至第15分钟)

100％B(第15至第20分钟)

用UV检测器在254nm进行检测，在600nm进行参考测量(reference measurement)。流速为3ml/min。

为了显示在荧光素酶mRNA中的杂质，首先进行分析型分离，其中仅将10μg荧光素酶mRNA施加于柱。这种分析型HPLC分离的结果示于图1中(在色谱图中用虚线示出梯度)。可以清楚地看到，除所期望的荧光素酶的mRNA(保留时间为12.760分钟)之外，仍然存在杂质(保留时间为12.398分钟和13.227分钟)，其位于荧光素酶mRNA峰的两侧。

制备级纯化荧光素酶mRNA的目的是除去这些不希望的杂质。

图2和图3示出了用于制备级(1.5mg)分离荧光素酶mRNA的相应的色谱图，其中在图2中以虚线示出梯度程序。在图2和图3中以灰色突出显示收集的流分1至10；这些流分经1分钟而被收集。

在每种情况下，将来自收集流分2至10的1μg荧光素酶mRNA施加于琼脂糖凝胶上并利用溴化乙锭加以显色，以确定mRNA流分的纯度。

琼脂糖凝胶分离的结果示于图4中(M表示大小标准)。流分5至8包含所期望的荧光素酶mRNA而不含不希望的杂质。结果，RNA的分离是成功的，得到制备级的高纯度的RNA流分。

该示例性实施方式表明，利用根据本发明的方法可以通过HPLC在制备级纯化mRNA。

实施例2：用孔径为1000

的固定相分离200μg的2kb和4kbRNA片段

200μg的2kb和4kb RNA片段用于分离。多孔的非烷基化聚苯乙烯/二乙烯基苯基质(来自Polymer Laboratories的常规商品)用作固定相。其颗粒大小为8μm且孔径为1000

所使用的柱长为2.5cm且直径为4.6mm。进样器温度是12℃，HPLC分离温度、具体而言是分离柱的温度为78℃，即，在完全变性条件下进行操作。

利用以下梯度程序进行分离：

洗脱液A：0.1M乙酸三乙铵

洗脱液B：0.1M乙酸三乙铵/25％乙腈

洗脱液组成：

·起始水平：62％A和38％B(第1至第3分钟)

·冲洗范围：100％B(第15至第20分钟)

用UV检测器在254nm进行检测，在600nm进行参考测量。流速是3ml/min。

图5示出了在制备级(200μg)进行这种分离的相应的色谱图，其中在图5中以虚线示出梯度程序。在图5中以灰色突出显示收集的流分；经1分钟时间收集流分。结果，RNA的分离是成功的，得到制备级的高纯度的RNA流分。

实施例3：用孔径为4000

的固定相分离100μg的2kb和4kbRNA片段

100μg的2kb和4kb RNA片段用于分离。多孔的非烷基化聚苯乙烯/二乙烯基苯基质(来自Polymer Laboratories的常规商品)用作固定相。其颗粒大小为8μm且孔径为4000

所使用的柱长度为2.5cm且直径为4.6mm。进样器温度是12℃，HPLC分离温度、具体而言是分离柱的温度为78℃，即，在完全变性条件下进行操作。

利用以下梯度程序进行分离

洗脱液A：0.1M乙酸三乙铵

洗脱液B：0.1M乙酸三乙铵/25％乙腈

洗脱液组成：

·起始水平：62％A和38％B(第1至第3分钟)

·冲洗范围：100％B(第15至第20分钟)

图6示出了在制备级(100μg)进行这种分离的相应色谱图，其中在图6中用虚线示出了梯度程序。在图6中以灰色突出显示收集的流分。结果，RNA的分离是成功的，得到制备级的高纯度的RNA流分。

实施例4：用孔径为4000

的固定相分离250μg的2kb和4kbRNA片段

250μg的2kb和4kb RNA片段用于分离。多孔的非烷基化聚苯乙烯/二乙烯基苯基质(来自Polymer Laboratories的常规商品)用作固定相。其颗粒大小为8μm且孔径为4000

利用以下梯度程序进行分离

洗脱液A：0.1M乙酸三乙铵

洗脱液B：0.1M乙酸三乙铵/25％乙腈

洗脱液组成：

·起始水平：62％A和38％B(第1至第3分钟)

·冲洗范围：100％B(第15至第20分钟)

图7示出了在制备级(250μg)进行这种分离的相应色谱图，其中在图7中用虚线示出了梯度程序。在图7中用灰色突出显示收集的流分。结果，RNA的分离是成功的，得到制备级的高纯度的RNA流分。

图8示出了用根据本发明的方法进行纯化而导致的荧光素酶表达的改善。

实施例5：用孔径为4000的固定相分离3mg的1.7kbRNA(FliC(GC)-制剂，FC9050)

3mg的1.7kb RNA(FliC(GC)-制剂，FC9050)用于分离。多孔的非烷基化聚苯乙烯/二乙烯基苯基质(来自Polymer Laboratories的常规商品)用作固定相。其颗粒大小为8μm且孔径为4000

所使用的柱长度为2.5cm且直径为4.6mm。进样器温度为12℃，HPLC分离温度、具体而言是分离柱的温度为78℃，即，在完全变性条件下进行操作。

通过以下梯度程序进行分离

洗脱液A：0.1M乙酸三乙铵

洗脱液B：0.1M乙酸三乙铵/25％乙腈

洗脱液组成：

·起始水平：62％A和38％B(第1至第3分钟)

·冲洗范围：100％B(第15至第20分钟)

用UV检测器在254nm进行检测，在600nm处进行参考测量。流速是3ml/min。

图10示出了在制备级(3mg)进行这种分离的相应色谱图，其中在图10中用虚线示出了梯度程序。在图10中用灰色突出显示收集的流分。可以看到，RNA的分离是成功的，得到制备级的高纯度的RNA流分。

实施例6：用孔径为4000的固定相分离1.5mg的FOLH1(GC)RNA制剂(FO-9334)、1.5mg的KLK3(GC)RNA制剂(KL-8849)、1.5mg的PSCA(GC)RNA制剂(PS-8845)或1.5mg的STEAP(GC)RNA制剂(ST-8848)

1.5mg的FOLH1(GC)RNA制剂(FO-9334)、1.5mg的KLK3(GC)RNA制剂(KL-8849)、1.5mg的PSCA(GC)RNA制剂(PS-8845)或1.5mg的STEAP(GC)RNA制剂(ST-8848)用于分离。多孔的非烷基化聚苯乙烯/二乙烯基苯基质(来自Polymer Laboratories的常规商品)用作固定相。其颗粒大小为8μm且孔径为4000

利用以下梯度程序进行分离

洗脱液A：0.1M乙酸三乙铵

洗脱液B：0.1M乙酸三乙铵/25％乙腈

洗脱液组成：

·起始水平：62％A和38％B(第1至第3分钟)

·冲洗范围：100％B(第15至第20分钟)

图11、图12、图13和图14分别示出了在制备级(1.5mg)上分离1.5mg的FOLH1(GC)RNA制剂(FO-9334)、1.5mg的KLK3(GC)RNA制剂(KL-8849)、1.5mg的PSCA(GC)RNA制剂(PS-8845)或1.5mg的STEAP(GC)RNA制剂(ST-8848)的相应色谱图，其中在这些图中用虚线示出了梯度程序。在图11、图12、图13以及图14中用灰色突出显示收集的流分。可以看到，在每种情况下RNA的分离都是可能的，使得在每种情况下得到制备级的高纯度的RNA流分。

实施例7：在非多孔固定聚苯乙烯二乙烯基苯基质上分离200μg的2kb RNA和200μg的4kb RNA的混合物(比较例)

200μg的2kb RNA和200μg的4kb RNA的混合物用于分离。所使用的柱装填有1000

的非烷基化多孔聚苯乙烯二乙烯基苯或非多孔固定聚苯乙烯二乙烯基苯基质。用于1000的非烷基化多孔聚苯乙烯二乙烯基苯的柱长度为2.5cm且直径为4.6mm。用于非烷基化非多孔聚苯乙烯二乙烯基苯的柱长度为2.5cm且直径为4.0mm。进样器温度为12℃，HPLC分离温度、具体而言是分离柱的温度为78℃，即，在完全变性条件下进行操作。

利用以下梯度程序进行分离

洗脱液A：0.1M乙酸三乙铵

洗脱液B：0.1M乙酸三乙铵/25％乙腈

洗脱液组成：

·起始水平：62％A和38％B(第1至第3分钟)

·冲洗范围：100％B(第15至第20分钟)

图15示出了在制备级(分别为200μg)进行这种分离的相应色谱图，其中在图15中用虚线示出了梯度程序。在图15中用灰色突出显示收集的流分。可以看到，利用常用的非烷基化多孔聚苯乙烯二乙烯基苯作为基质，两种RNA均不能分离。图16示出了对应于图15的色谱图的琼脂糖凝胶。

序列表

<110>库瑞瓦格有限责任公司

<120>利用HPLC在制备级上纯化RNA的方法

<130>P26325GVSP

<140>PCT/EP/2007/011294

<141>2007-12-20

<150>DE 10 2006 061 015.6

<151>2006-12-22

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1825

<212>RNA

<213>人工

<220>

<223>野生型荧光素酶，图9的CAP-Ppluc(wt)-muag-A70

<400>1

gggagaaagc uuggcauucc gguacuguug guaaagccac cauggaagac gccaaaaaca 60

uaaagaaagg cccggcgcca uucuauccgc uggaagaugg aaccgcugga gagcaacugc 120

auaaggcuau gaagagauac gcccugguuc cuggaacaau ugcuuuuaca gaugcacaua 180

ucgaggugga caucacuuac gcugaguacu ucgaaauguc cguucgguug gcagaagcua 240

ugaaacgaua ugggcugaau acaaaucaca gaaucgucgu augcagugaa aacucucuuc 300

aauucuuuau gccgguguug ggcgcguuau uuaucggagu ugcaguugcg cccgcgaacg 360

acauuuauaa ugaacgugaa uugcucaaca guaugggcau uucgcagccu accguggugu 420

ucguuuccaa aaagggguug caaaaaauuu ugaacgugca aaaaaagcuc ccaaucaucc 480

aaaaaauuau uaucauggau ucuaaaacgg auuaccaggg auuucagucg auguacacgu 540

ucgucacauc ucaucuaccu cccgguuuua augaauacga uuuugugcca gaguccuucg 600

auagggacaa gacaauugca cugaucauga acuccucugg aucuacuggu cugccuaaag 660

gugucgcucu gccucauaga acugccugcg ugagauucuc gcaugccaga gauccuauuu 720

uuggcaauca aaucauuccg gauacugcga uuuuaagugu uguuccauuc caucacgguu 780

uuggaauguu uacuacacuc ggauauuuga uauguggauu ucgagucguc uuaauguaua 840

gauuugaaga agagcuguuu cugaggagcc uucaggauua caagauucaa agugcgcugc 900

uggugccaac ccuauucucc uucuucgcca aaagcacucu gauugacaaa uacgauuuau 960

cuaauuuaca cgaaauugcu ucugguggcg cuccccucuc uaaggaaguc ggggaagcgg 1020

uugccaagag guuccaucug ccagguauca ggcaaggaua ugggcucacu gagacuacau 1080

cagcuauucu gauuacaccc gagggggaug auaaaccggg cgcggucggu aaaguuguuc 1140

cauuuuuuga agcgaagguu guggaucugg auaccgggaa aacgcugggc guuaaucaaa 1200

gaggcgaacu gugugugaga gguccuauga uuauguccgg uuauguaaac aauccggaag 1260

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caaccgcgaa aaaguugcgc ggaggaguug uguuugugga cgaaguaccg aaaggucuua 1620

ccggaaaacu cgacgcaaga aaaaucagag agauccucau aaaggccaag aagggcggaa 1680

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uccuccccuc cuugcaccga gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800

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Claims

1.一种用于在制备级上纯化RNA的方法，其特征在于，利用多孔反相作为固定相通过HPLC或低压或常压液相色谱法来纯化所述RNA。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述RNA选自tRNA、rRNA、mRNA或全细胞RNA、特别地以及RNA变体，例如适体或核酶。

3.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，所述RNA的大小为多达约15000个核苷酸或碱基对。

4.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，所述RNA的大小为多达100至10000个核苷酸或碱基对。

5.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，所述多孔反相的颗粒大小为8μm至50μm，特别是8μm至30μm并且更优选8μm至25μm。

6.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，所述反相的孔径为

至

7.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，所述反相的孔径为

至

8.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，所述多孔反相是多孔聚苯乙烯、多孔非烷基化聚苯乙烯、聚苯乙烯二乙烯基苯、多孔非烷基化聚苯乙烯二乙烯基苯、多孔硅胶、用非极性残基改性的多孔硅胶、用含烷基的残基改性的多孔硅胶、用苯基残基改性的多孔硅胶、或多孔聚甲基丙烯酸酯，其中所述含烷基的残基选自含丁基、辛基和/或十八烷基的残基。

9.根据前述权利要求之一所述的方法，特征在于，所述多孔反相由珠粒形成或作为聚合的块体而存在。

10.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，所述HPLC柱的长度为大于5cm、特别是长达100cm，且直径为大于4mm、特别是达25mm，优选长达1m、更优选长达100cm。

11.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，HPLC纯化以离子对方法进行，其中将带有正电荷的离子加入流动相中作为带负电荷的所述RNA的反荷离子，或通过尺寸排阻色谱法、凝胶过滤、亲和色谱法、疏水作用色谱法或离子对色谱法来进行HPLC纯化。

12.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，针对洗脱目的，使用含水溶剂和有机溶剂的混合物来进行HPLC纯化。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述含水溶剂是缓冲剂。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述缓冲剂是乙酸三乙铵、三氟乙酸、乙酸、甲酸、乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、硫酸氢四丁铵、溴化四丁铵以及氯化四丁铵。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述乙酸三乙铵缓冲液是0.1M的乙酸三乙铵缓冲液。

16.根据权利要求12至15之一所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂是乙腈、甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇以及丙酮或它们的混合物。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂是乙腈。

18.根据权利要求12至17之一所述的方法，其特征在于，所述流动相是0.1M乙酸三乙铵和乙腈的混合物。

19.根据权利要求12至18之一所述的方法，其特征在于，所述流动相包含相对于所述流动相为5.0vol.％至25.0vol.％的有机溶剂，并与所述含水溶剂构成100vol.％。

20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述流动相包含相对于所述流动相为7.5vol.％至17.5vol.％、特别是9.5vol.％至14.4vol.％的有机溶剂，并与所述含水溶剂构成100vol.％。

21.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，所述分离等度地进行。

22.根据权利要求1至20之一所述的方法，其特征在于，进行梯度分离。

23.根据权利要求22所述的方法，其中，在梯度分离的情况下，相对于在所述流动相中的最初vol.％，有机溶剂的比例增加，特别是增加至少10％、更优选增加至少50％并且最优选增加至少100％、可选地增加至少200％。

24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，在HPLC分离过程中，所述流动相中的所述有机溶剂的比例为3vol.％至9vol.％、优选4vol.％至7.5vol.％、特别是5.0vol.％。

25.根据权利要求23或权利要求24所述的方法，其特征在于，在HPLC分离过程中，所述流动相中的所述有机溶剂的比例从3vol.％至9vol.％、特别是5.0vol.％，增加至高达20.0vol.％，在每种情况下均相对于所述流动相。

26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，在HPLC分离过程中，所述流动相中的所述有机溶剂的比例从6.5vol.％至8.5vol.％、特别是7.5vol.％，增加至高达17.5vol.％，在每种情况下均相对于所述流动相。

27.多孔反相在根据权利要求1至26之一所述的HPLC法中的应用。

28.根据权利要求27所述的应用，其中，所述多孔反相如权利要求5至8之一所限定。