ES2352306T3

ES2352306T3 - Procedimiento para purificar arn a escala preparativa por hplc.

Info

Publication number: ES2352306T3
Application number: ES07857017T
Authority: ES
Inventors: Florian Von Der Mulbe; Thorsten Mutzke; Thomas Ketterer; Ladislaus Reidel
Original assignee: Curevac AG
Current assignee: Curevac SE
Priority date: 2006-12-22
Filing date: 2007-12-20
Publication date: 2011-02-17
Anticipated expiration: 2027-12-20
Also published as: ATE481482T1; KR20090098968A; WO2008077592A1; CN101563457B; DE102006061015A1; EP2092064B1; JP5307724B2; KR101183173B1; AU2007338360B2; CN101563457A; CA2670727A1; DE602007009295D1; JP2010512767A; EP2092064A1; CA2670727C; US8383340B2; AU2007338360A1; DK2092064T3; PL2092064T3; US20100048883A1

Abstract

Procedimiento para purificar ARN a escala preparativa, caracterizado porque el ARN se purifica por medio de HPLC o métodos de cromatografía líquida a presión baja o normal utilizando una fase porosa inversa como fase estacionaria, caracterizada porque la fase porosa inversa es un poliestireno poroso no alquilado, incluido un poliestirenodivinilbenceno poroso no alquilado.

Description

La presente invención se refiere a un procedimiento para purificar ARN a escala preparativa por medio de HPLC y a la utilización de una fase porosa inversa como fase estacionaria en este método.

La HPLC (abreviatura de “Cromatografía Líquida de Alta Resolución (Alta Presión)”) es un método bien establecido para separar mezclas de sustancias ampliamente utilizado en bioquímica, química analítica y química clínica.

En el caso más sencillo, un aparato de HPLC consiste en una bomba con un reservorio de eluyente que contiene la fase móvil, un sistema de aplicación de muestras, una columna de separación que contiene la fase estacionaria y un detector. Además, se puede proporcionar también un colector de fracciones, con el que se pueden recoger por separado fracciones individuales después de la separación, fracciones que, por tanto, estarán disponibles para otras aplicaciones.

El análisis de ARN por HPLC de fase inversa de par iónico es conocido de A. Azarani y K.H. Hecker (Nucleic Acids Research, vol. 29, nº 2 e7). Aquí, la fase estacionaria consiste en una matriz de poliestireno-divinilbenceno alquilado no porosa. La elución prosigue con un sistema tampón de dos eluyentes. El tampón A se compone de una disolución acuosa de acetato de trietilamonio 0,1M (TEAA), pH 7,0, y el tampón B se compone de una disolución acuosa de TEAA 0,1M, pH 7,0, en acetonitrilo al 25%. La elución se lleva a cabo por medio de los tres sistemas de gradientes siguientes: un 38-40% de B durante 1 minuto, a un 60% de B durante 15 minutos, a un 66% de B durante 6 minutos, a un 70% de B durante 0,5 minutos, a un 100% de B durante 0,5 minutos, manteniendo al 100% B durante 1 minuto, hasta un 38% durante 1 minuto, manteniendo al 38% B durante 2 minutos. Alternativamente, se utiliza el siguiente programa de gradientes: un 38-60% durante 30 minutos, hasta un 100% de B durante 2 minutos, hasta un 38% de B durante 3 minutos. El siguiente se utiliza como tercer programa de gradientes: un 38-40% de B durante 1 minuto, hasta un 60% de B durante 3 minutos, hasta un 100% de B durante 1 minuto, manteniendo al 100% B durante 6 minutos, hasta un 38% de B durante 1 minuto, manteniendo al 38% B durante 1 minuto.

Por tanto, este método de HPLC implicaba la utilización de programas de gradientes relativamente complicados y caros. Además, sólo se pueden separar y analizar con este método cantidades analíticas de ARN de hasta 1.000 ng (1 μg ó 0,001 mg) como máximo.

El objeto de la presente invención consiste aquí en mejorar un método de este tipo con el propósito de que ya no presente los inconvenientes de la técnica anterior.

Ello se consigue de acuerdo con la invención por un medio de un procedimiento para purificar ARN a escala preparativa que se distingue en que el ARN se purifica por HPLC utilizando una fase porosa inversa como fase estacionaria. Así, en el método según la invención, un factor significativo es que se utiliza una fase porosa inversa.

En el contexto de la presente invención, el término “por HPLC” incluye diversos procedimientos HPLC, así como métodos de cromatografía líquida a presión baja o normal, que se pueden utilizar para llevar a cabo el método de la invención. Éstos pueden incluir HPLC de fase inversa (RP-HPLC), cromatografía, cromatografía de exclusión de tamaño, filtración en gel, cromatografía de afinidad, cromatografía de interacción hidrofóbica o cromatografía de par iónico, de entre las cuales es preferente la HPLC de fase inversa. Sin entrar en detalles, la HPLC de fase inversa se compone de una fase estacionaria no polar y de una fase móvil moderadamente polar. Una fase estacionaria habitual es, por ejemplo, una sílice tratada por ejemplo con RMe2SiCl, donde R es un grupo alquilo de cadena lineal tal como C18H37 o C8H17. Por tanto, el tiempo de retención es más largo para las moléculas que son más no polares por naturaleza, permitiendo que las moléculas polares se eluyan más rápidamente. El tiempo de retención aumenta mediante la adición de un disolvente polar a la fase móvil y disminuye mediante la adición de un disolvente más hidrofóbico.

Sin embargo, las distintas técnicas mencionadas anteriormente funcionan según el principio de las interacciones hidrofóbicas que resultan de fuerzas las repulsivas entre un disolvente relativamente polar, el analito relativamente no polar y la fase estacionaria no polar (principio de fase inversa). La fuerza motriz en la unión del analito (molécula de ARN) a la fase estacionaria es la disminución en la zona del segmento no polar de la molécula de analito expuesta al disolvente. Este efecto hidrofóbico está dominado por la disminución de energía libre a partir de la entropía asociada a la minimización de la interfase molécula ordenada-disolvente polar. El efecto hidrofóbico se reduce mediante la adición de un disolvente más apolar en la fase móvil. Esto cambia el coeficiente de partición, de tal forma que el analito pasa más tiempo bajando por la columna en la fase móvil, eluyendo finalmente en la columna.

Las características de la molécula específica de ARN como analito pueden desempeñar un papel importante en sus propiedades de retención. En general, un analito con grupos funcionales más apolares resulta en un tiempo de retención más largo, ya que incrementa la hidrofobicidad de la molécula. Moléculas muy grandes, sin embargo, pueden resultar en una interacción incompleta entre la gran superficie del analito y la cadena alquilo. El tiempo de retención aumenta con la zona superficial hidrofóbica, que es más o menos inversamente proporcional al tamaño del soluto. Los compuestos de cadena ramificada eluyen más rápidamente que sus isómeros correspondientes debido a que el área superficial global disminuye.

Aparte de la hidrofobicidad de la fase móvil, otros modificadores de la fase móvil -según la invención- pueden afectar a la retención del analito (molécula de ARN). Por ejemplo, se puede considerar que la adición de sales inorgánicas provoca un aumento lineal en la tensión superficial de las soluciones acuosas y, debido a que la entropía de la interfase analito-disolvente está controlada por la tensión superficial, la adición de sales tiende a incrementar el tiempo de retención. Otro componente importante que se puede utilizar de acuerdo con la invención es el pH, ya que puede cambiar la hidrofobicidad del analito. Por esta razón, se puede utilizar un agente tampón tal como fosfato de sodio u otros agentes tampones comunes para controlar el pH. Se puede añadir a la fase móvil un ácido orgánico tal como ácido fórmico o, más habitualmente, ácido trifluoroacético. Las modificaciones anteriores pueden ser útiles para múltiples propósitos: controlan el pH, neutralizan la carga sobre cualquier material residual expuesto en la fase estacionaria y actúan como agentes de apareamiento iónico para neutralizar la carga del analito. El efecto varía según el uso, pero generalmente se mejora la cromatografía.

Para los propósitos de la presente invención, se entiende que el término “purificación” significa que el ARN deseado en una muestra se separa y/o se aísla de las impurezas presentes en la misma. Así, después de la purificación por HPLC, el ARN está presente en una forma más pura que en la muestra que contenía el ARN originalmente introducido antes de la purificación por HPLC.

Los constituyentes no deseados de las muestras que contienen ARN y que, por tanto, deben ser separados pueden ser en particular fragmentos degradados o fragmentos que han surgido como resultado de la terminación prematura de la transcripción o también de transcripciones excesivamente largas si los plásmidos no están linearizados completamente. Además, se pueden separar impurezas tales como enzimas, por ejemplo las RNAsas y polimerasas, así como nucleótidos.

Utilizando el procedimiento de acuerdo con la invención, se purifica el ARN, teniendo éste una mayor pureza después de la purificación que el material de partida. A este respecto, es conveniente que el grado de pureza se encuentre lo más cercano posible al 100%. Así, se puede lograr un grado de pureza superior al 70%, en particular el 80%, en especial el 90% y preferentemente el 99% o superior.

El procedimiento según la invención resulta en la purificación preparativa de ARN. Esto difiere del método analítico por HPLC que se describe en la técnica mencionada anteriormente (Azarani & Hecker). En un método analítico por HPLC, se introduce y separa una cantidad claramente más pequeña que en un método de HPLC preparativa. En el método expuesto en la técnica anterior, se introducen cantidades de 8 ng a 1.000 ng. En cambio, se entiende que un método de HPLC preparativa se refiere a un método de HPLC en el que se purifican cantidades de ARN relativamente grandes. Dichas cantidades relativamente grandes son, por ejemplo, cantidades de 0,5 mg o más, en particular 1,0 mg a 1.000 mg o más, en especial aproximadamente 1,5 mg o más, siendo posible aumentar incluso hasta el rango de kg. Por tanto, se debe entender que los planteamientos anteriores significan que estas cantidades se refieren a un sólo ciclo de HPLC. Si se realizan varios ciclos de HPLC, la cantidad aumenta en proporción directa con el número de ciclos de HPLC.

El procedimiento según la invención, en particular las realizaciones preferentes descritas detalladamente a continuación, muestra una serie de ventajas: utilizando el método según la invención se pueden separar cantidades de ARN sustancialmente más grandes que lo que posibilita el método conocido de la técnica anterior. Mediante el procedimiento de la invención estas cantidades relativamente altas se obtienen con un alto grado de pureza. Es posible la separación de fragmentos degradados o de fragmentos excesivamente largos o de fragmentos que han surgido como consecuencia de la terminación prematura de la transcripción. Además, es posible una buena separación de otras impurezas presentes en las muestras de ARN, tales como enzimas, por ejemplo RNAsas y polimerasas, así como nucleótidos. Estas cantidades relativamente grandes de ARN se pueden recuperar en unos minutos, incluso de muestras con un muy alto nivel de contaminación por impurezas. La recuperación del ARN se desarrolla de forma fiable; es decir, se recupera un ARN de alta pureza con gran fiabilidad.

Con el procedimiento según la invención se puede lograr un alto nivel de resolución. El método según la invención además puede operar fácilmente de forma automática. Por tanto, es el más adecuado para la purificación rutinaria de ARN a escala preparativa. El ARN es estable bajo las condiciones del procedimiento según la invención, es decir que se evita la degradación durante la purificación por HPLC en fragmentos de ARN y, con ello, la aparición de nuevas impurezas, así como una reducción en la producción del ARN deseado durante la purificación por HPLC. Así, el procedimiento según la invención se puede desarrollar de una forma sencilla, rápida, barata, precisa y con resultados fiables. El aislamiento del ARN después de la separación por HPLC puede llevarse a cabo sencillamente con un colector de fracciones, esto es, se puede lograr la recuperación de ARN de forma muy sencilla, posibilitando que tenga lugar un probable procesamiento directo del ARN diferente. Finalmente, la detección se puede llevar a cabo de forma altamente sensible.

El “ARN” a purificar mediante el procedimiento de acuerdo con la invención es un ácido ribonucleico de cualquier tipo. En particular el ARN se selecciona preferentemente de entre ARNt, ARNr y ARNm o ARN celular total. Además, el ARN puede comprender asimismo aptámeros y ribozimas. El ARN a aislar puede ser de una sola hebra o de doble hebra. El ARN de una sola hebra puede formar opcionalmente estructuras secundarias mediante replegamiento, siendo típicamente el ARN que se debe separar de una sola hebra. El ARN puede estar o no etiquetado también (con una etiqueta fluorescente o una radio-etiqueta o un epítopo de anticuerpo). Un ejemplo de un ARN etiquetado es el ARN de β-actina etiquetado con digoxigenina.

El ARN a ser purificado puede ser ARN nativo o no nativo. Se utiliza preferentemente ARN nativo, que se prepara por ejemplo mediante un sistema de expresión in vitro o celular. Se aísla entonces el ARN y se purifica el aislado utilizando el procedimiento según la invención. Opcionalmente, se puede purificar también ARN químicamente sintetizado por el método según la invención. En cualquier caso, el ARN puede contener también nucleótidos no nativos, en los que pueden estar presentes modificaciones químicas en el esqueleto del ARN, por ejemplo fosforo-tioato, en la estructura de la base nucleotídica, por ejemplo hipoxantina, dihidrouracilo, pseudouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-aminouracilo, 5-alquil(C1-C6)uracilo, 5-alquenil(C2-C6)uracilo, 5alquinil(C2-C6)uracilo, 5-(hidroximetil)uracilo, 5-clorouracilo, 5-fluorouracilo, 5bromouracilo, 5-hidroxicitosina, 5-alquil(C1-C6)citosina, 5-alquenil(C2-C6)citosina, 5-alquinil(C2-C6)citosina, 5-clorocitosina, 5-fluorocitosina, 5bromocitosina, N<2>-dimetilguanina, 2,4-diaminopurina, 8-azapurina, una 7deazapurina sustituida, preferentemente purina 7-deaza-7-sustituida y/o 7deaza-8-sustituida, 5-hidroximetilcitosina, N4-alquilcitosina, por ejemplo N4etilcitosina, 5-hidroxidesoxicitidina, 5-hidroximetildesoxicitidina, N4alquildesoxicitidina, por ejemplo N4-etildesoxicitidina, 6-tiodesoxiguanosina y desoxirribonucleótidos de nitropirrol, C5-propinilpirimidinas y diaminopurina, por ejemplo 2,6-diaminopurina, inosina, 5-metilcitosina, 2-aminopurina, 2-amino-6cloropurina, o también en el residuo de azúcar. Otros ejemplos de nucleótidos modificados son 2-amino-6-cloropurina-ribósido-5’-trifosfato, 2-aminodenosina5’-trifosfato, 2-tiocitidina-5’-trifosfato, 2-tiouridina-5’-trifosfato, 4-tiouridina-5’trifosfato, 5-aminoalilcitidina-5’-trifosfato, 6-aminoaliluridina-5’-trifosfato, 5bromocitidina-5’-trifosfato, 5-bromouridina-5’-trifosfato, 5-yodocitidina-5’trifosfato, 5-yodouridina-5’-trifosfato, 5-metilcitidina-5’-trifosfato, 5-metiluridina-5’trifosfato, 6-azacitidina-5’-trifosfato, 6-azauridina-5’-trifosfato, 6-cloropurinaribósido-5’-trifosfato, 7-deazaadenosina-5’-trifosfato, 7-deazaguanosina-5’trifosfato, 8-azaadenosina-5’-trifosfato, 8-azidoadenosina-5’-trifosfato, benzimidazol-ribósido-5’-trifosfato, N1-metiladenosina-5’-trifosfato, N1metilguanosina-5’-trifosfato, N6-metiladenosina-5’-trifosfato, O6-metilguanosina5’-trifosfato, pseudouridina-5’-trifosfato, puromicina-5’-trifosfato, xantosina-5’trifosfato.

En una realización preferente del procedimiento según la invención, el ARN a separar tiene un tamaño de hasta aproximadamente 15.000 nucleótidos (como molécula de ARN de una sola hebra) o pares de bases (como molécula de ARN de doble hebra), en particular 100 a 10.000, preferentemente 500 a

10.000 nucleótidos o pares de bases, en especial de 800 a 5.000 nucleótidos o pares de bases y con más preferencia de 800 a 2.000 nucleótidos o pares de bases. Para este tamaño de ARN, se ha demostrado que era posible alcanzar muy buenos resultados con respecto a la purificación del ARN, ya que el método según la invención se adapta particularmente bien al ARN de este tamaño. Opcionalmente, sin embargo, se pueden separar de esta forma fragmentos de ARN más pequeños, por ejemplo con una longitud de 30-1.000, 50-1.000 ó 100

1.000 ó 20-200, 20-100, 20-50 ó 20-30 nucleótidos.

Si el ARN a separar es ARNm, éste codificará preferentemente para proteínas, en particular aquellas que tienen carácter antigénico y, por ejemplo, todas aquellas proteínas producidas de forma recombinante o de origen natural conocidas por el especialista en la materia y que se utilizan con propósitos terapéuticos, de diagnóstico o de investigación. En particular, los antígenos son entonces antígenos tumorales o antígenos de patógenos, por ejemplo organismos virales, bacterianos o protozoicos.

Sin limitarse a ello, dichas proteínas incluyen, entre otras, hormonas de crecimiento o factores de crecimiento, por ejemplo para favorecer el crecimiento en un organismo vivo (transgénico) tal como, por ejemplo, TGF e IGF (“factores de crecimiento semejantes a la insulina”), proteínas que influyen en el metabolismo y/o la hematopoyesis, tal como (alfa-1)-antitripsina, receptor de LDL, eritropoyetina (EPO), insulina, GATA-1, etc., o proteínas tales como factores VIII y XI del sistema de coagulación sanguíneo, etc. Dichas proteínas incluyen además enzimas, por ejemplo galactosidasa (lacZ), enzimas de restricción de ADN (por ejemplo EcoRI, HindIII, etc.), lisozimas, etc., o proteasas tales como papaína, bromelina, queratinasas, tripsina, quimotripsina, pepsina, renina (quimosina), suizima, nortasa, etc., e inhibidores de proteasas (por ejemplo para el tratamiento de infecciones por VIH), tales como inhibidores de proteasas seleccionados de entre el grupo consistente en AG1776, amprenavir (141W94 ó VX-478), atazanavir (BSM-232632), inhibidor de la proteasa catepsina S, D1927, D9120, fosamprenavir (GW-433908 o VX-175), GS 9005, GW640385 (VX-385), inhibidor de la proteasa HCV, indinavir (MK-639), L756423, Levoprin-ZG, lopinavir (ABT-378), lopinavir/ritonavir (LPV ABT-378/r), MK-944A, mozenavir (DMP450), nelfinavir (AG-1343), NNRTI, P-1946, PL-100, prinomastat, ritonavir (ABT-538), RO033-4649, TMC114, saquinavir (Ro-318959), NRTI, tipranavir (PNU-140690), TLK 19781, TMC-114, vertex 385, VX

950. Las proteínas codificadas a partir del ARN separado según la invención pueden comprender también proteínas que estimulan o inhiben la transmisión de señales celulares, por ejemplo citocinas, etc. Por tanto, dichas proteínas comprenden asimismo, por ejemplo, citocinas de clase I de la familia de las citocinas, que incluyen 4 residuos de cisteína conservados en su posición (CCCC) y un motivo conservado entre la secuencia Trp-Ser-X-Trp-Ser (WSXWS), donde X representa un aminoácido no conservado. Las citocinas de clase I de la familia de las citocinas comprenden la subfamilia GM-CSF, por ejemplo IL-3, IL-5, GM-CSF, la subfamilia de IL-6, por ejemplo IL-6, IL-11, IL-12,

: o la subfamilia de IL-2, por ejemplo IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, etc., o las citocinas IL-1, IL-1, IL-10, etc. Del mismo modo, dichas proteínas pueden comprender también citocinas de la clase II de la familia de las citocinas (familia de receptores de interferones), que incluyen asimismo 4 residuos de cisteína conservados en su posición (CCCC), pero no el motivo conservado entre la secuencia Trp-Ser-X-Trp-Ser (WSXWS). Las citocinas de clase II de la familia de las citocinas incluyen por ejemplo IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, etc. Las proteínas codificadas por el ARN separado pueden incluir además citocinas de la familia del factor de necrosis tumoral, incluyendo, por ejemplo, TNF-alfa, TNFbeta, ligando CD40, ligando Fas, etc., o citocinas de la familia de las quimiocinas, en particular interferones, interleucinas, factores estimulantes de colonias y factores de necrosis tumoral, e interactúan con la proteína G, por ejemplo IL-8, MIP-1, RANTES, CCR5, CXR4, etc. Dichas proteínas pueden ser seleccionadas también de entre los factores de apoptosis o las proteínas asociadas o unidas a apoptosis, incluyendo AIF, Apaf, por ejemplo Apaf-1, Apaf2, Apaf-3, o APO-2 (L), APO-3 (L), apopaína, Bad, Bak, Bax, Bcl-2, Bcl-xL, BclxS, bik, CAD, calpaína, caspasas como caspasa-1, caspasa-2, caspasa-3, caspasa-4, caspasa-5, caspasa-6, caspasa-7, caspasa-8, caspasa-9, caspasa10, caspasa-11, ced-3, ced-9, c-Jun, c-Myc, crm A, citocromo C, CdR1, DcR1, DD, DED, DISC, ADN-PKcs, DR3, DR4, DR5, FADD/MORT-1, FAK, Fas (ligando Fas CD95/fas (receptor)), FLICE/MACH, FLIP, fodrina, fos, G-actina, Gas-2, gelsolina, granzimas A/B, ICAD, ICE, JNK, lamina A/B, MAP, MCL-1, Mdm-2, MEKK-1, MORT-1, NEDD, NF-B, NuMa, p53, PAK-2, PARP, perforina, PITSLRE, PKC, pRb, presenilina, prICE, RAIDD, Ras, RIP, esfingomielinasa, timidina quinasa de Herpes simplex, TRADD, TRAF2, TRAIL, TRAIL-R1, TRAILR2, TRAIL-R3, transglutaminasa, etc. Las proteínas codificadas por el ARN separado según la invención pueden seleccionarse también de entre antígenos, por ejemplo de antígenos superficiales específicos tumorales (TSSA), por ejemplo integrina 5t4 alfa5 beta1, 707-AP, AFP, ART-4, B7H4, BAGE, Bcr-abl, MN/C IX-antígeno, CA125, CAMEL, CAP-1, CASP-8, beta-catenina/m, CD4, CD19, CD20, CD22, CD25, CDC27/m, CD30, CD33, CD52, CD56, CD80, CDK4/m, CEA, CT, Cyp-B, DAM, EGFR, ErbB3, ELF2M, EMMPRIN, EpCam, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/new, HLA-A*0201R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HAST-2, hTERT (o hTRT), iCE, IGF-1R, IL-2R, IL5, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/melan-A, MART-2/Ski, MC1R, miosina/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, PAP, proteinasa-3, p190 minor bcrabl, Pml/RAR, PRAME, PSA, PSM, PSMA, RAGE, RU1 ó RU2, SAGE, SART-1

: o SART-3, survivina, TEL/AML1, TGF, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, VEGF y WT1, o de secuencias, tales como NY-Eso-1 o NY-Eso-B. Las proteínas que pueden ser codificadas por el ARN separado según la invención también incluyen además proteínas o secuencias proteicas que muestran una identidad de secuencia de al menos un 80% o un 85%, preferentemente al menos un 90%, particularmente al menos un 95% y especialmente al menos un 99% con una de las proteínas descritas anteriormente.

El ARNm a separar puede mostrar las siguientes modificaciones relativas a un ARNm de tipo salvaje correspondiente, las cuales pueden estar presentes como alternativas o combinadas.

Por una parte, el contenido G/C de la región del ARNm modificado que codifica para un péptido o un polipéptido puede ser superior al contenido G/C de la región codificante del ARNm de tipo salvaje que codifica para el péptido o polipéptido, quedando sin cambios la secuencia de aminoácidos codificada con relación al tipo salvaje. Esta modificación se basa en el hecho de que el orden secuencial del dominio de ARNm que debe traducirse es esencial para una traducción eficaz del ARNm. A este respecto, la composición y la secuencia de los diversos nucleótidos tienen que desempeñar un papel importante. En particular, las secuencias con un contenido elevado en G(guanosina) / C(citosina) son más estables que las secuencias con un contenido elevado en A(adenosina) / U(uracilo). Por tanto, según la invención, aunque conserven la secuencia de aminoácidos traducida, los codones varían con respecto al ARNm de tipo salvaje de modo tal que tienen un contenido más elevado en nucleótidos de G/C. Debido a que varios codones codifican para un mismo aminoácido (degeneración del código genético), es posible determinar los codones que son los más favorables a la estabilidad (uso alternativo de los codones). Por otra parte, también es posible proporcionar un ARN de traducción optimizada con el método según la invención.

En el procedimiento según la invención se utiliza una fase inversa como fase estacionaria para la purificación por HPLC. Para la cromatografía con fases inversas, un compuesto no polar sirve de fase estacionaria y un disolvente polar, tal como mezclas de agua, que se emplea generalmente en forma de tampón, por ejemplo con acetonitrilo y/o metanol, sirve de fase móvil para la elución.

El material de empaque de la columna que se utiliza como fase estacionaria puede proporcionarse en forma de perlas o como “bloque” polimerizado, es decir un bloque que llena una parte sustancial de la columna de cromatografía. Sin tener en cuenta su naturaleza concreta, la fase polimérica estacionaria es de naturaleza porosa, lo que significa que las perlas o el bloque se caracterizan por poros.

En una realización preferente del método según la invención, el material poroso de la fase inversa se proporciona con un tamaño de partícula de 8,0 μm a 50 μm, en particular de 8,0 a 30 μm, especialmente de 8,0 a 25 μm. El material de la fase inversa puede estar presente en forma de pequeñas esferas. El método según la invención puede llevarse a cabo de forma particularmente favorable con una fase porosa inversa con este tamaño de partícula, opcionalmente en forma de perlas, con el que se obtienen resultados de separación particularmente buenos.

La fase inversa utilizada en el método según la invención es porosa y tiene tamaños de partícula específicos. Con las fases inversas estacionarias que no son porosas y que son, por tanto, completamente diferentes con respecto al tamaño de partícula del contenido de la presente invención, tal como se describen por ejemplo en A. Azarani y K.H. Hecker, por otra parte, se crean presiones excesivamente altas, de modo que la purificación preparativa del ARN sólo es posible con mucha dificultad, si es que lo es.

En una realización preferente del procedimiento de acuerdo con la invención, la fase inversa tiene un tamaño de poro de 1.000 Å a 5.000 Å, en particular un tamaño de poro de 1.000 Å a 4.000 Å, especialmente de 1.500 Å a

4.000 Å, de 2.000 Å a 4.000 Å o de 2.500 Å a 4.000 Å. Son particularmente preferentes tamaños de poro para las fases inversas de 1.000 Å a 2.000 Å, particularmente de 1.000 Å a 1.500 Å y especialmente de 1.000 Å a 1.200 Å o de 3.500 a 4.500 Å. Con una fase inversa que tiene este tamaño de poro se alcanzan resultados particularmente buenos con respecto a la purificación del ARN por el procedimeinto según la invención y, en particular, se evitan así las altas presiones creadas en el método según A. Azarani y K.H. Hecker, por lo que se posibilita la separación preparativa de forma particularmente favorable. Con tamaños de poro por debajo de 1.000 Å, la separación de las moléculas de ARN empeora.

Un tamaño de poro de 1.000 Å a 5.000 Å, en particular un tamaño de poro de 1.000 Å a 4.000 Å, especialmente de 1.500 Å a 4.000 Å, de 2.000 Å a

4.000 Å o de 2.500 Å a 4.000 Å puede resultar adecuado para separar un ARN de otros componentes de una mezcla, teniendo el ARN un tamaño tal como se ha mencionado más arriba de hasta aproximadamente 15.000 nucleótidos (como molécula de ARN de una sola hebra) o pares de bases (como molécula de ARN de doble hebra), en particular de 100 a 10.000, preferentemente de 500 a 10.000 nucleótidos o pares de bases, especialmente de 800 a 5.000 nucleótidos o pares de bases y aun con más preferencia de 800 a 2.000 nucleótidos o pares de bases. Sin embargo, el tamaño de poro de la fase inversa se puede seleccionar también dependiendo del tamaño del ARN que se debe separar, es decir que se puede seleccionar un tamaño de poro más grande si se deben separar moléculas más grandes de ARN y se pueden seleccionar tamaños de poro más pequeños si se seleccionan moléculas de ARN más pequeñas. Ello se debe al hecho de que la retención de las moléculas de ARN así como la separación no sólo dependen de la interacción de la fase (inversa) sino también de la posibilidad de que las moléculas entren en los poros de la matriz y proporcionen así otro efecto de retención. Sin limitarse a ello, por ejemplo se puede utilizar así un tamaño de poro para la fase inversa de aproximadamente 2.000 Å a aproximadamente 5.000 Å o de 3.500 a 4.500 Å., preferentemente de alrededor de 2.500 a alrededor de 4.000, especialmente alrededor de 3.500 a aproximadamente 4.500 Å, para separar moléculas más grandes de ARN, por ejemplo moléculas de ARN de 100 a 10.000, preferentemente de 500 a 10.000 nucleótidos o pares de bases, particularmente de 800 a 5.000 nucleótidos o pares de bases y especialmente de 800 a 2.000 nucleótidos o pares de bases. Alternativamente, sin limitarse a ello, se puede utilizar un tamaño de poro para la fase inversa de aproximadamente 1.000 Å a aproximadamente 2.500 Å, preferentemente de alrededor de 1.000 Å a alrededor de 2.000 Å y particularmente de alrededor de 1.000 Å a 1.200 Å para separar moléculas más pequeñas de ARN, por ejemplo moléculas de ARN de aproximadamente 30-1.000, 50-1.000 ó 100-1.000 ó 20-200, 20-100, 20-50 ó 20-30 nucleótidos se pueden separar también de esta forma.

En general, cualquier material conocido para su utilización como fase inversa, fase estacionaria, en particular cualquier material polimérico puede ser utilizado en el procedimiento de la invención, siempre que se pueda producir aquel material en forma porosa. La fase estacionaria puede estar compuesta de material orgánico y/o inorgánico. Ejemplos de polímeros a utilizar para la presente invención son poliestirenos (no alquilados), poliestirenodivinilbencenos (no alquilados), gel de sílice, gel de sílice modificada con residuos no polares, en particular gel de sílice modificada con residuos que contienen alquilo, preferentemente con residuos que contienen butilo, octilo y/u octadecilo, gel de sílice modificada con residuos fenílicos, polimetacrilatos, etc., u otros materiales adecuados por ejemplo para la cromatografía en gel u otros métodos cromatográficos como los mencionados anteriormente, tales como dextrano, incluyendo por ejemplo los materiales Sephadex® y Sephacryl®, agarosa, mezclas de dextrano/agarosa, poliacrilamida, etc.

En una realización particularmente preferente, el material para la fase inversa es un polímero de poliestireno poroso, un polímero de poliestirenodivinilbenceno (no alquilado) (poroso), gel de sílice poroso, gel de sílice poroso modificado con residuos no polares, en particular gel de sílice poroso modificado con residuos que contienen alquilo, preferentemente con residuos que contienen butilo, octilo y/u octadecilo, gel de sílice poroso modificado con residuos fenílicos, polimetacrilatos porosos, donde se puede utilizar en particular un polímero de poliestireno poroso o un poliestirenodivinilbenceno no alquilado (poroso). Son conocidas en sí mismas fases estacionarias de poliestirenodivinilbenceno. Estos poliestirenodivinilbencenos conocidos de por sí ya empleados para los métodos de HPLC, que se obtienen comercialmente, se pueden utilizar para el método de acuerdo con la invención.

Un poliestirenovinilbenceno no alquilado poroso particularmente preferente para el procedimiento según la invención, sin limitarse a él, puede tener en particular un tamaño de partícula de 8,0 ± 1,5 μm, en particular 8,0 ± 0,5 μm, y un tamaño de poro de 1.000-1.500 Å, en particular 1.000-1.200 Å ó 3.500-4.500 Å. Con este material para las fases inversas se pueden alcanzar las ventajas descritas anteriormente del método según la invención de forma particularmente favorable.

Esta fase estacionaria mencionada detalladamente más arriba se sitúa convencionalmente en una columna. Se utiliza convencionalmente acero V2A como material para la columna, pero también se pueden emplear para la columna otros materiales, siempre que sean adecuados para las condiciones imperantes durante la HPLC. La columna es convencionalmente recta. Es conveniente que la columna de HPLC tenga una longitud de 5 cm a 100 cm y un diámetro de 4 mm a 25 mm. Las columnas utilizadas para el método según la invención pueden tener en particular las siguientes dimensiones: 50 mm de largo y 7,5 mm de diámetro o 50 mm de largo y 4,6 mm de diámetro, o 50 mm de largo y 10 mm de diámetro o cualquier otra dimensión con respecto a la longitud y al diámetro que sea adecuada para la recuperación preparativa de ARN, siendo factibles incluso longitudes de varios metros así como diámetros más grandes en el caso de un aumento de escala. Las dimensiones se dirigen aquí a lo técnicamente posible con la cromatografía líquida.

En una realización preferente, el procedimiento según la invención se realiza como método del par iónico, en el que un ión con un residuo lipofílico y una carga positiva es añadido a la fase móvil como contraión para el ARN cargado negativamente. De esta forma, se obtiene un par iónico con carácter lipofílico, que es ralentizado por la fase estacionaria no polar del sistema de fase inversa. En la práctica, las condiciones precisas para el método del par iónico deben resolverse empíricamente en cada caso específico de separación. El tamaño del contraión, su concentración y el valor de pH de la solución contribuyen en gran medida al resultado de la separación. Esto significa que las condiciones establecidas empíricamente de un método de par iónico no se pueden aplicar directamente a un caso diferente de separación. Si, por ejemplo, se conoce de la técnica anterior un método de par iónico, no significa que las mismas condiciones se puedan aplicar también inevitablemente al caso de separación que sirve de base a la presente invención, incluso aunque finalmente las mismas condiciones o condiciones similares demuestran ser de hecho favorables. Se añaden favorablemente en el método según la invención sales de alquilamonio tales como acetato de trietilamonio y/o compuestos de tetraalquilamonio, tales como tetrabutilamonio. Preferentemente, se añade acetato de trietilamonio 0,1M y el valor de pH se ajusta a aproximadamente 7. Este tampón para el método del par iónico resuelve de una forma particularmente favorable el problema de la separación que sirve de fundamento a la presente invención, es decir la purificación de ARN a escala preparativa. Las siguientes soluciones se pueden considerar como otras soluciones tampón: ácido trifluoroacético, ácido acético, ácido fórmico, tampón acetato, tampón fosfato, bisulfato de tetrabutilamonio, bromuro de tetrabutilamonio y cloruro de tetrabutilamonio.

La selección de la fase móvil depende del tipo de separación deseado. Esto quiere decir que la fase móvil establecida para una separación específica, como se puede conocer por ejemplo a partir de la técnica anterior, no puede ser aplicada directamente a un caso diferente de separación con una perspectiva suficiente de éxito. Para cada caso de separación, las condiciones ideales de elución, en particular la fase móvil empleada, deben determinarse mediante pruebas empíricas.

En una realización preferente del método de HPLC según la invención, se utiliza una mezcla de un disolvente acuoso y un disolvente orgánico como fase móvil para eluir el ARN. Es conveniente utilizar un tampón como disolvente acuoso, en particular con un pH de 6,0-8,0, por ejemplo de aproximadamente 7, por ejemplo 7,0; el tampón es preferentemente acetato de trietilamonio, en particular preferentemente 0,02M a 0,5M, especialmente 0,08M a 0,12M y con más preferencia un tampón acetato de trietilamonio 0,1M que, tal como se ha descrito anteriormente, actúa también como contraión del ARN en el método del par iónico.

En una realización preferente, el disolvente orgánico que se utiliza en la fase móvil es acetonitrilo, metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol y acetona o una mezcla de los mismos, en particular preferentemente acetonitrilo. Con estos disolventes orgánicos, en particular acetonitrilo, la purificación del ARN se lleva a cabo de forma particularmente favorable con el método según la invención.

En una realización particularmente preferente del método según la invención, la fase móvil es una mezcla de acetato de trietilamonio 0,1M, pH 7, y acetonitrilo.

Para el procedimiento según la invención ha demostrado ser particularmente favorable que la fase móvil contenga de un 5,0% en volumen a un 25,0% en volumen de disolventes orgánicos, en relación con la fase móvil, y para que alcance el 100% en volumen con el disolvente acuoso. Típicamente, en el caso de separación por gradientes, la proporción de disolvente orgánico aumenta, en particular en al menos un 10%, preferentemente en al menos un 50% y especialmente en al menos un 100%, opcionalmente en al menos un 200%, con respecto al % en volumen inicial en la fase móvil. En una realización preferente del método según la invención, la proporción de disolvente orgánico en la fase móvil se eleva durante la separación por HPLC al 3 hasta el 9%, preferentemente del 4 al 7,5%, en particular el 5,0% en volumen, en cada caso con relación a la fase móvil. De forma especialmente preferente, la proporción de disolvente orgánico en la fase móvil aumenta durante la separación por HPLC del 3 al 9, en particular del 5,0% en volumen hasta el 20,0% en volumen, en cada caso con respecto a la fase móvil. De forma aun más preferente, el método se lleva a cabo de forma tal que la proporción de disolvente orgánico en la fase móvil aumente durante la separación por HPLC del 6,5 al 8,5, en particular del 7,5% en volumen al 17,5% en volumen, en cada caso con relación a la fase móvil.

Para el procedimiento según la invención ha demostrado ser especialmente favorable que la fase móvil contenga de un 7,5% en volumen a un 17,5% en volumen de un disolvente orgánico, con relación de la fase móvil, y para que alcance el 100% en volumen con el disolvente acuoso tamponado.

En el procedimiento según la invención la elución puede llevarse a cabo isocráticamente o por separación en gradientes. En la separación isocrática, la elución del ARN prosigue con un único eluyente o con una mezcla constante de varios eluyentes, donde los disolventes descritos detalladamente más arriba se pueden utilizar como eluyentes.

En una realización preferente del procedimiento según la invención, se realiza la separación en gradiente. A este respecto, la composición del eluyente varía según un programa de gradientes. El equipo necesario para la separación en gradiente es conocido por los especialistas en la técnica. La elución en gradiente puede llevarse a cabo aquí del lado de baja presión por medio de cámaras de mezcla o del lado de alta presión por medio de otras bombas.

Preferentemente, en el método según la invención, la proporción de disolvente orgánico, tal como se ha descrito anteriormente, aumenta con relación al disolvente acuoso durante la separación en gradiente. Los agentes descritos más arriba se pueden utilizar aquí como disolventes acuosos y se pueden emplear los agentes también descritos anteriormente como disolventes orgánicos.

Por ejemplo, la proporción de disolvente orgánico en la fase móvil puede aumentar durante la separación por HPLC del 5,0% en volumen al 20,0% en volumen, en cada caso con relación a la fase móvil. En particular, la proporción de disolvente orgánico en la fase móvil puede incrementarse durante la separación por HPLC del 7,5% en volumen al 17,5% en volumen, en especial del 9,5 al 14,5% en volumen, en cada caso con relación a la fase móvil.

El siguiente programa de gradientes ha demostrado ser particularmente favorable para la purificación de ARN mediante el procedimiento según la invención:

Eluyente A: acetato de trietilamonio 0,1M, pH 7

Eluyente B: acetato de trietilamonio 0,1M, pH 7, con acetonitrilo al 25% en volumen

Composición del eluyente: inicio: un 62% de A y un 38% de B (del 1er al 3er minuto); aumento al 58% de B (aumento del 1,67% en B por minuto), (3er-15º minuto) al 100% de B (15º al 20º minuto)

Se describe a continuación otro ejemplo de programa de gradientes, utilizándose los mismos eluyentes A y B:

nivel de inicio: un 62% de A y un 38% de B (del 1er al 3er minuto)

rango de separación I: gradiente del 38%-49,5% de B (aumento del 5,75% en B / min) (3er-5º minuto)

rango de separación II: gradiente del 49,5%-57% de B (aumento del 0,83% en B / min) (5º-14º min)

rango de aclarado: 100% de B (15º-20º min)

Para que la columna no se ensucie o se obstruya y que no se interrumpa la detección, es conveniente utilizar para la HPLC un disolvente purificado. Se obtienen comercialmente dichos disolventes purificados. Se pueden filtrar además con un microfiltro de 1 a 5 μm, que se monta generalmente en el sistema aguas arriba de la bomba. Es conveniente además que todos los disolventes estén desgasificados antes de su utilización, ya que de otro modo aparecen burbujas de gas en la mayoría de las bombas. Si aparecieran burbujas de aire en el disolvente, pueden interferir no sólo en la separación sino también en el control continuo del flujo de salida al detector. Los disolventes se pueden desgasificar por calentamiento, por fuerte agitación con un agitador magnético, por breve evacuación, por ultrasonicación o haciendo pasar una pequeña corriente de helio por el recipiente de almacenamiento de disolvente.

El caudal del eluyente se selecciona de modo tal que tenga lugar una buena separación del ARN de los otros constituyentes contenidos en la muestra que se debe investigar. El caudal de eluyente seleccionado para el método según la invención puede ascender desde 1 ml/min hasta varios litros por minuto (en el caso de un aumento de escala), en particular aproximadamente 1 a 1.000 ml/min, preferentemente 5 ml a 500 ml/min, especialmente más de 100 ml/min, dependiendo del tipo y del alcance del aumento de escala. Este caudal puede ser establecido y regulado por la bomba.

La detección se lleva a cabo favorablemente con un detector de UV a 254 nm, en el que se puede realizar una medida de referencia a 600 nm. Sin embargo, se puede utilizar como alternativa cualquier otro método de detección, con el que el ARN descrito anteriormente de forma más detallada pueda ser detectado de forma satisfactoria y fiable.

Para la purificación preparativa del ARN con el procedimiento según la invención, es recomendable recoger las cantidades de disolvente eluído que contienen ARN. A este respecto, es conveniente llevar a cabo esta revogida de modo tal que el disolvente eluído se recoja en fracciones separadas individualmente. Esto puede llevarse a cabo por ejemplo con un colector de fracciones. De esta forma, las fracciones que contienen ARN de alta pureza se pueden separar de otras fracciones que contienen un ARN que sigue conteniendo impurezas indeseables, aunque en cantidades muy pequeñas. Las fracciones individuales se pueden recoger por ejemplo durante 1 minuto.

El procedimiento según la invención se lleva a cabo convenientemente bajo condiciones completamente desnaturalizadas. Se puede llevar a cabo por ejemplo al tener lugar la aplicación de la muestra a una temperatura de 4-12ºC, continuando de otro modo el método de HPLC a una temperatura más alta, preferentemente a 70ºC o más, particularmente a 75ºC o más, especialmente hasta 82ºC y con más preferencia a aproximadamente 78ºC. Normalmente, el calentamiento es importante para desnaturalizar el ARN, con lo cual se logra finalmente una mejor separación. La resolución cae a temperaturas más bajas, es decir que se reduce la separación del ARN de las impurezas.

La aplicación de las muestras puede realizarse por medio de dos métodos, inyección con interrupción de flujo o la inyección en bucle. Para la inyección con interrupción de flujo se utiliza una microjeringa que puede soportar la alta presión aplicada a la HPLC. La muestra se inyecta a través de un tabique en una válvula de entrada, ya sea directamente en el empaque de la columna o en una pequeña caída de material inerte inmediatamente sobre el empaque. En este caso, el sistema puede encontrarse bajo presión elevada o la bomba puede estar apagada antes de la inyección, lo que se realiza entonces cuando la presión ha caído hasta un valor cercano al normal. En el caso de inyección en bucle, se utiliza un inyector en bucle para introducir la muestra. Consiste en un bucle tubular en el que se inserta la muestra. Por medio de una válvula rotativa adecuada, la fase estacionaria se retira de la bomba a través del bucle, cuya salida conduce directamente dentro de la columna. La muestra es arrastrada de esta forma por la fase estacionaria dentro de la columna, sin interrumpir el flujo de disolvente hacia la bomba.

La presente invención proporciona además la utilización de una fase porosa inversa en el método de HPLC descrito anteriormente según la invención.

En una realización preferente del procedimiento según la invención, la fase porosa inversa tiene un tamaño de partícula de 8,0 μm a 50 μm, en particular de 8,0 a 30 μm, especialmente de 8,0 a 25 μm. La fase inversa puede estar presente en forma de perlas. El método según la invención puede llevarse a cabo de forma particularmente favorable con una fase porosa inversa con este tamaño de partícula y/o en forma de perlas, con el que se obtienen resultados de separación particularmente buenos.

La fase inversa utilizada para su uso según la invención es porosa, ya que con fases estacionarias inversas que no son porosas, y que son por tanto totalmente diferentes con relación al tamaño de partícula del asunto de la presente invención, tal como se describen por ejemplo en A. Azarani y K.H. Hecker, se crean presiones excesivamente altas, de modo que la purificación preparativa del ARN por HPLC es posible con mucha dificultad, si es que lo es.

En una realización preferente de la utilización según la invención, la fase inversa tiene un tamaño de poro de 1.000 Å a 5.000 Å. en particular un tamaño de poro de 1.000 Å a 4.000 Å, o los valores preferentes establecidos anteriormente. Los tamaños de poro particularmente preferentes para las fases inversas son de 1.000-1.200 Å y de 3.500-4.500 Å. Con una fase inversa que tiene estos tamaños de poro se alcanzan resultados particularmente buenos con relación a la purificación del ARN por el método según la invención; por tanto, se evitan en particular las presiones elevadas creadas en el método según A. Azarani y K.H. Hecker, por lo que se posibilita la separación preparativa de una forma particularmente favorable. Con tamaños de poro por debajo de 1.000 Å, la separación del ARN empeora, razón por la cual dichos tamaños de partícula son menos preferentes. Sin embargo, se puede seleccionar el tamaño de poro dependiendo del tamaño de ARN que se debe separar, tal como se ha mencionado anteriormente.

En una realización particularmente preferente de la utilización según la invención, el material para la fase inversa es poliestirenodivinilbenceno, donde se puede utilizar en particular poliestirenodivinilbenceno no alquilado. Son conocidas de por sí fases estacionarias con poliestirenodivinilbenceno. Los poliestirenodivinilbencenos ya conocidos y utilizados para métodos de HPLC, que se pueden obtener comercialmente se pueden emplear para el procedimiento según la invención.

Un poliestirenodivinilbenceno no alquilado poroso particularmente preferente para la utilización según la invención tiene en particular un tamaño de partícula de 8,0 ± 1,5 μm, en particular 8,0 ± 0,5 μm, y un tamaño de poro de

1.000 ó 4.000 Å. Con este material para la fase inversa, las ventajas descritas a continuación pueden ser alcanzadas de una forma particularmente favorable.

Para la utilización según la invención, esta fase estacionaria descrita de forma detallada más arriba se sitúa en una columna. Se utiliza convencionalmente acero V2A como material para la columna, pero también se pueden emplear para la columna otros materiales, siempre que sean adecuados para las condiciones imperantes durante la recuperación por HPLC. La columna es convencionalmente recta. Es conveniente que la columna de HPLC tenga una longitud de 5 cm a 100 cm y un diámetro de 4 mm a 25 mm. Las columnas utilizadas en el procedimiento según la invención pueden tener en particular las siguientes dimensiones: 50 mm de largo y 7,5 mm de diámetro o 50 mm de largo y 4,6 mm de diámetro, o 50 mm de largo y 10 mm de diámetro o cualquier otra dimensión con respecto a la longitud y al diámetro que sea adecuada para la purificación preparativa de ARN por medio de HPLC, siendo factibles incluso longitudes de varios metros así como diámetros más grandes en el caso de un aumento de escala. Las dimensiones se dirigen aquí a lo técnicamente posible para la cromatografía líquida.

Las demás condiciones para la utilización según la invención ya han sido descritas más arriba con relación al método según la invención, de modo que se hace referencia a las mismas para evitar repeticiones inútiles.

La utilización según la invención, en particular las realizaciones preferentes descritas detalladamente a continuación, muestra una serie de ventajas: en el contexto de la utilización según la invención, se pueden separar cantidades de ARN sustancialmente más grandes que las posibles con los métodos conocidos de la técnica anterior. La utilización según la invención permite obtener estas mayores cantidades con un alto grado de pureza. Es posible la separación de fragmentos degradados o de fragmentos relativamente largos o de fragmentos que han surgido como consecuencia de una terminación prematura de la transcripción. Además, es posible una buena separación de otras impurezas presentes en muestras de ARN, tales como enzimas, por ejemplo RNAsas o polimerasas y nucleótidos. Estas cantidades relativamente importantes de ARN se pueden recuperar en unos minutos, incluso a partir de muestras que tienen un muy alto nivel de contaminación por impurezas. La recuperación de ARN se desarrolla fiablemente, es decir que se recupera un ARN de gran pureza con alta fiabilidad. La utilización según la invención permite alcanzar una alta resolución. La utilización según la invención puede realizarse fácilmente de forma automática. Por tanto, es la más adecuada para la purificación rutinaria de ARN a escala preparativa. El ARN es estable bajo las condiciones del método de separación por HPLC, es decir que se evita la degradación en fragmentos de ARN y, con ello, la aparición de nuevas impurezas o una reducción en la producción de ARN puro durante la purificación por HPLC. Así, la utilización según la invención se puede realizar de una forma sencilla, rápida y barata, con precisión y con resultados fiables. El aislamiento de ARN después de la separación por HPLC puede desarrollarse simplemente con un colector de fracciones, es decir que la recuperación de ARN se puede conseguir de forma muy sencilla, siendo posible del mismo modo otro procesamiento directo del ARN. La detección puede llevarse a cabo de forma altente sensible.

A continuación se explica la invención de forma más detallada con referencia a las Figuras y a un ejemplo de realización, sin limitarse al mismo.

Figuras

Figura 1:: Cromatograma (analítica); de separación de 10 μg de luciferasa-ARNm

Figura 2:: Cromatograma (preparativa); de separación de 1,5 μg de luciferasa-ARNm

Figura 3:: Cromatograma de la Figura 2 recogidas; dest acando en g ris las fracciones

Figura 4:: Muestra la verificación de la purecogidas en un gel de agarosa; rez a de las frac ciones de ARNm

Figura 5:: Cromatograma de separación de de 2 kb y de 4 kb con una fase de poro de 1.000 Å; 20est acionaria 0 μg de que un fr tiene un tamaño agmento de ARN

Figura 6: Cromatograma de separación de 100 μg de un fragmento de ARN de 2 kb y de 4 kb con una fase estacionaria que tiene un tamaño de poro de 4.000 Å;

Figura 7: Cromatograma de separación de 250 μg de un fragmento de ARN de 2 kb y de 4 kb con una matriz estacionaria que tiene un tamaño de poro de 4.000 Å;

Figura 8: Diagrama de barras que demuestra la mejora en la expresión de la luciferasa procedente del ARN purificado con el método según la invención;

Figura 9: Muestra la secuencia de la luciferasa de tipo salvaje, específicamente la secuencia de ARNm, que se utilizó para los ejemplos de realización;

Figura 10: Cromatograma de separación de 3 mg de una preparación de ARN de Flic(GC) (FC-9050) con una matriz estacionaria que tiene un tamaño de poro de 4.000 Å;

Figura 11: Cromatograma de separación de 1,5 mg de una preparación de ARN de FOLH1(GC) (FO-9334) con una matriz estacionaria que tiene un tamaño de poro de 4.000 Å;

Figura 12: Cromatograma de separación de 1,5 mg de una preparación de ARN de KLK3(GC) (KL-8849) con una matriz estacionaria que tiene un tamaño de poro de 4.000 Å;

Figura 13: Cromatograma de separación de 1,5 mg de una preparación de ARN de PSCA(GC) (PS-8845) con una matriz estacionaria que tiene un tamaño de poro de 4.000 Å;

Figura 14: Cromatograma de separación de 1,5 mg de una preparación de ARN de STEAP(GC) (ST-8848) con una matriz estacionaria que tiene un tamaño de poro de 4.000 Å;

Figura 15: Cromatograma de separación de una mezcla de ARN de 2 kb (200 μg) y un ARN de 4 kb (200 μg) con una matriz estacionaria no porosa;

Figura 16: Muestra un análisis en gel de agarosa que corresponde al cromatograma según la Figura 15, que muestra una separación de

una mezcla de ARN de 2 kb (200 μg) y un ARN de 4 kb (200 μg)

con una matriz estacionaria no porosa.

Ejemplo 1: Purificación de 1,5 mg de ARNm de luciferasa por el procedimiento de HPLC según la invención

Se utilizó para la separación ARNm de luciferasa con un tamaño de 1.825 pares de bases. Se utilizó como fase estacionaria una matriz porosa de poliestireno/divinilbenceno (poliestirenodivinilbenceno) no alquilado (producto comercial convencional de Polymer Laboratories). Tenía un tamaño de partícula de 8 μm y un tamaño de poro de 4.000 Å. La columna empleada era de 5,0 cm de largo y tenía un diámetro de 7,5 mm. La temperatura del muestreador era de 12ºC, la temperatura para la separación por HPLC, en particular de la columna de separación, era de 78ºC, es decir que las operaciones se llevaron a cabo en condiciones totalmente desnaturalizantes.

La separación se desarrolló por medio de un programa de gradientes:

Eluyente A: acetato de trietilamonio 0,1M, pH 7

Composición del eluyente:

inicio: un 62% de A y un 38% de B (del 1er al 3er minuto)

aumento al 58% de B (aumento del 1,67% en B por minuto), (3er

15º minuto) al 100% de B (15º al 20º minuto)

La detección se llevó a cabo con un detector de UV a 254 nm con una medición de referencia a 600 nm. El caudal era de 3 ml/min.

Con el fin de mostrar las impurezas en el ARNm de luciferasa, se realizó en primer lugar una separación analítica, en la que se aplicaron a la columna solamente 10 μg de ARNm de luciferasa. El resultado de esta separación analítica por HPLC se muestra en la Figura 1 (se muestra el gradiente en el cromatograma con líneas quebradas). Como se puede observar claramente, además del ARNm de luciferasa deseado (tiempo de retención de 12,760 minutos), sigue habiendo impurezas (tiempos de retención de 12,398 minutos y 13,227 minutos), que flanquean el pico de ARNm de luciferasa.

El propósito para purificar el ARNm de luciferasa a escala preparativa es de eliminar estas impurezas no deseadas.

Las Figuras 2 y 3 muestran los cromatogramas correspondientes para la separación de ARNm de luciferasa a escala preparativa (1,5 mg), en los que se muestra el programa de gradientes con líneas quebradas en la Figura 2. Se destacan en gris en las Figuras 2 y 3 las fracciones recogidas 1 a 10; se recogieron las fracciones durante un período de 1 minuto.

En cada caso, 1 μg de ARNm de luciferasa procedente de las fracciones 2 a 10 recogidas se aplicó en un gel de agarosa y se visualizó con la asistencia de bromuro de etidio con el fin de determinar la pureza de la fracción de ARNm.

El resultado de la separación en gel de agarosa se muestra en la Figura 4 (M indica un estándar de tamaño). Las fracciones 5 a 8 contienen el ARNm de luciferasa deseado sin impurezas no deseadas. Como consecuencia, la separación del ARN tuvo éxito, conduciendo a una fracción altamente pura de ARN a escala preparativa.

Este ejemplo de realización muestra que con el procedimiento según la invención es posible purificar ARNm a escala preparativa por medio de HPLC.

Ejemplo 2: Separación de 200 μg de un fragmento de ARN de 2 kb y de 4 kb con una fase estacionaria que tiene un tamaño de poro de

1.000 Å

Se utilizaron para la separación 200 μg de un fragmento de ARN de 2 kb y de 4 kb. Se utilizó como fase estacionaria una matriz porosa de poliestireno/divinilbenceno no alquilado (producto comercial convencional de Polymer Laboratories). Tenía un tamaño de partícula de 8 μm y un tamaño de poro de 1.000 Å. La columna empleada era de 2,5 cm de largo y tenía un diámetro de 4,6 mm. La temperatura del muestreador era de 12ºC, la temperatura para la separación por HPLC, en particular de la columna de separación, era de 78ºC, es decir que las operaciones se llevaron a cabo en condiciones totalmente desnaturalizantes.

La separación se desarrolló por medio de un programa de gradientes:

Eluyente A: acetato de trietilamonio 0,1M

Eluyente B: acetato de trietilamonio 0,1M/acetonitrilo al 25% Composición del eluyente:

nivel de inicio: un 62% de A y un 38% de B (del 1er al 3er minuto)

rango de separación I: gradiente del 38%-49,5% de B (aumento del 5,75% en B / min), (3er-5º minuto)

5 rango de separación II: gradiente del 49,5%-57% de B (aumento del 0,83% en B / min) (5º-14º min.)

rango de aclarado: 100% de B (15º-20º min)

10 La Figura 5 muestra los cromatogramas correspondientes para esta separación a escala preparativa (200 μg), en los que se muestra el programa de gradientes con líneas quebradas en la Figura 5. Se destacan en gris en la Figura 5 las fracciones recogidas; se recogieron las fracciones durante un período de 1 minuto. Como resultado, la separación del ARN tuvo éxito, conduciendo a una

15 fracción muy pura de ARN a escala preparativa.

Ejemplo 3: Separación de 100 μg de un fragmento de ARN de 2 kb y de 4 kb con una fase estacionaria que tiene un tamaño de poro de

4.000 Å

Se utilizaron para la separación 100 μg de un fragmento de ARN de 2 kb

20 y de 4 kb. Se utilizó como fase estacionaria una matriz porosa de poliestireno/divinilbenceno no alquilado (producto comercial convencional de Polymer Laboratories). Tenía un tamaño de partícula de 8 μm y un tamaño de poro de 4.000 Å. La columna empleada era de 2,5 cm de largo y tenía un diámetro de 4,6 mm. La temperatura del muestreador era de 12ºC, la

25 temperatura para la separación por HPLC, en particular de la columna de separación, era de 78ºC, es decir que las operaciones se llevaron a cabo en condiciones totalmente desnaturalizantes.

La separación se desarrolló por medio de un programa de gradientes:

Eluyente A: acetato de trietilamonio 0,1M

30 Eluyente B: acetato de trietilamonio 0,1M/acetonitrilo al 25%

Composición del eluyente: nivel de inicio: un 62% de A y un 38% de B (del 1er al 3er minuto)

rango de aclarado: 100% de B (15º-20º min)

La Figura 6 muestra los cromatogramas correspondientes para esta separación a escala preparativa (100 μg), en los que se muestra el programa de gradientes con líneas quebradas en la Figura 6. Se destacan en gris en la Figura 6 las fracciones recogidas. Como resultado, la separación del ARN tuvo éxito, conduciendo a una fracción muy pura de ARN a escala preparativa.

Ejemplo 4: Separación de 250 μg de un fragmento de ARN de 2 kb y de 4 kb con una fase estacionaria que tiene un tamaño de poro de

4.000 Å

Se utilizaron para la separación 250 μg de un fragmento de ARN de 2 kb y de 4 kb. Se utilizó como fase estacionaria una matriz porosa de poliestireno/divinilbenceno no alquilado (producto comercial convencional de Polymer Laboratories). Tenía un tamaño de partícula de 8 μm y un tamaño de poro de 4.000 Å. La columna empleada era de 2,5 cm de largo y tenía un diámetro de 4,6 mm. La temperatura del muestreador era de 12ºC, la temperatura para la separación por HPLC, en particular de la columna de separación, era de 78ºC, es decir que las operaciones se llevaron a cabo en condiciones totalmente desnaturalizantes.

La separación se desarrolló por medio de un programa de gradientes:

Eluyente A: acetato de trietilamonio 0,1M

Eluyente B: acetato de trietilamonio 0,1M/acetonitrilo al 25%

Composición del eluyente:

nivel de inicio: un 62% de A y un 38% de B (del 1er al 3er minuto)

rango de separación I: gradiente del 38%-49,5% de B (aumento del

5,75% en B / min) (3er-5º minuto)

rango de aclarado: 100% de B (15º-20º min)

La Figura 7 muestra los cromatogramas correspondientes para esta separación a escala preparativa (250 μg), en los que se muestra el programa de gradientes con líneas quebradas en la Figura 7. Se destacan en gris en la Figura 7 las fracciones recogidas. Como resultado, la separación del ARN tuvo éxito, conduciendo a una fracción muy pura de ARN a escala preparativa.

La mejora de la expresión de la luciferasa que resulta de la purificación con el método según la invención se muestra en la Figura 8.

Ejemplo 5: Separación de 3 mg de un ARN de 1,7 kb (preparación

FliC(GC), FC9050) con una fase estacionaria que tiene un

tamaño de poro de 4.000 Å

Se utilizaron para la separación 3 mg de un ARN de 1,7 kb (preparación de FliC(GC), FC9050). Se utilizó como fase estacionaria una matriz porosa de poliestireno/divinilbenceno no alquilado (producto comercial convencional de Polymer Laboratories). Tenía un tamaño de partícula de 8 μm y un tamaño de poro de 4.000 Å. La columna empleada era de 2,5 cm de largo y tenía un diámetro de 4,6 mm. La temperatura del muestreador era de 12ºC, la temperatura para la separación por HPLC, en particular de la columna de separación, era de 78ºC, es decir que las operaciones se llevaron a cabo en condiciones totalmente desnaturalizantes.

La separación se desarrolló por medio de un programa de gradientes:

Eluyente A: acetato de trietilamonio 0,1M

Eluyente B: acetato de trietilamonio 0,1M/acetonitrilo al 25%

Composición del eluyente:

nivel de inicio: un 62% de A y un 38% de B (del 1er al 3er minuto)

rango de separación I: gradiente del 38%-49,5% de B (aumento del

5,75% en B / min) (3er-5º minuto)

rango de aclarado: 100% de B (15º-20º min)

La Figura 10 muestra los cromatogramas correspondientes para esta separación a escala preparativa (3 mg), en los que se muestra el programa de gradientes con líneas quebradas en la Figura 10. Se destacan en gris en la Figura 10 las fracciones recogidas. Como se puede observar, la separación del ARN tuvo éxito, conduciendo a una fracción muy pura de ARN a escala preparativa.

Ejemplo 6: Separación de 1,5 mg de una preparación de ARN de FOLH1(GC) (FO-9334), 1,5 mg de una preparación de ARN de KLK3(GC) (KL-8849), 1,5 mg de una preparación de ARN de PSCA(GC) (PS-8845) ó 1,5 mg de una preparación de ARN de STEAP(GC) (ST-8848) con una fase estacionaria que tiene un tamaño de poro de 4.000 Å

Se utilizaron para la separación 1,5 mg de una preparación de ARN de FOLH1(GC) (FO-9334), 1,5 mg de una preparación de ARN de KLK3(GC) (KL8849), 1,5 mg de una preparación de ARN de PSCA(GC) (PS-8845) ó 1,5 mg de una preparación de ARN de STEAP(GC) (ST-8848). Se utilizó como fase estacionaria una matriz porosa de poliestireno/divinilbenceno no alquilado (producto comercial convencional de Polymer Laboratories). Tenía un tamaño de partícula de 8 μm y un tamaño de poro de 4.000 Å. La columna empleada era de 2,5 cm de largo y tenía un diámetro de 4,6 mm. La temperatura del muestreador era de 12ºC, la temperatura para la separación por HPLC, en particular de la columna de separación, era de 78ºC, es decir que las operaciones se llevaron a cabo en condiciones totalmente desnaturalizantes.

La separación se desarrolló por medio de un programa de gradientes:

Eluyente A: acetato de trietilamonio 0,1M

nivel de inicio: un 62% de A y un 38% de B (del 1er al 3er minuto)

5 rango de separación II: gradiente del 49,5%-57% de B (aumento del 0,83% en B / min) (5º-14º min)

rango de aclarado: 100% de B (15º-20º min)

10 Las Figuras 11, 12, 13 y 14 muestran los cromatogramas correspondientes para esta separación de 1,5 mg de una preparación de ARN de FOLH1(GC) (FO-9334), 1,5 mg de una preparación de ARN de KLK3(GC) (KL-8849), 1,5 mg de una preparación de ARN de PSCA(GC) (PS-8845) ó 1,5 mg de una preparación de ARN de STEAP(GC) (ST-8848), respectivamente, a

15 escala preparativa (1,5 mg), en los que se muestra el programa de gradientes con líneas quebradas en estas Figuras. Se destacan en gris en las Figuras 11, 12, 13 y 14 las fracciones recogidas. Como se puede observar, la separación de los ARN en cada caso es posible, conduciendo a una fracción muy pura de ARN en cada caso a escala preparativa.

20 Ejemplo 7: Separación de una mezcla de 200 μg de un ARN de 2 kb y 200 μg de un ARN de 4 kb en una matriz no porosa estacionaria de poliestirenodivinilbenceno (Ejemplo Comparativo)

Se utilizó para la separación una mezcla de 200 μg de un ARN de 2 kb y 200 μg de un ARN de 4 kb. Las columnas empleadas se empacaron con 25 una matriz de poliestirenodivinilbenceno no alquilado poroso de 1.000 Å o una matriz no porosa estacionaria de poliestirenodivinilbenceno. La columna utilizada para el poliestirenodivinilbenceno no alquilado poroso de 1.000 Å era de 2,5 cm de largo y tenía un diámetro de 4,6 mm. La columna utilizada para el poliestirenodivinilbenceno no alquilado no poroso era de 2,5 cm de largo y tenía

30 un diámetro de 4,0 mm. La temperatura del muestreador era de 12ºC, la temperatura para la separación por HPLC, en particular de la columna de separación, era de 78ºC, es decir que las operaciones se llevaron a cabo en condiciones totalmente desnaturalizantes.

La separación se desarrolló por medio de un programa de gradientes:

Eluyente A: acetato de trietilamonio 0,1M

Eluyente B: acetato de trietilamonio 0,1M/acetonitrilo al 25%

Composición del eluyente:

5 nivel de inicio: un 62% de A y un 38% de B (del 1er al 3er minuto)

10 rango de aclarado: 100% de B (15º-20º min)

La Figura 15 muestra el cromatograma correspondiente para esta separación (cada una de 200 μg), en el que se muestra el programa de

15 gradientes con líneas quebradas en la Figura 15. Se destacan en gris en la Figura 15 las fracciones recogidas. Como se puede observar, la separación de ambos ARN no es posible por medio de un poliestirenodivinilbenceno no alquilado poroso común como matriz. La Figura 16 muestra el gel de agarosa que corresponde al cromatograma según la Figura 15.

Protocolo de secuencias

<110>CureVac GmbH

<120>Método para purificar ARN a escala preparativa por medio de HPLC <130>CU01P049WO

5

<140>

<141>

<150>DE 102006061015.6 10 <151>22.12.2006

<160>1

<170>PatentIn versión 3.3

15 <210>1 <211>1825

<212>ARN

<213>Artificial

20 <220> <223>Luciferasa de tipo salvaje, CAP-Ppluc(wt)-muag-A70 de Figura 9

<400>1

imagen1

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Procedimiento para purificar ARN a escala preparativa, caracterizado porque el ARN se purifica por medio de HPLC o métodos de cromatografía líquida a presión baja o normal utilizando una fase porosa inversa como fase estacionaria, caracterizada porque la fase porosa inversa es un poliestireno poroso no alquilado, incluido un poliestirenodivinilbenceno poroso no alquilado.
2.

Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se selecciona el ARN de entre ARNt, ARNr, ARNm o ARN celular total, en particular también variantes de ARN, tal como por ejemplo aptámeros o ribozimas.
3.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el ARN tiene un tamaño de hasta aproximadamente
15.000 nucleótidos o pares de bases, incluido un tamaño de hasta 100 a
10.000 nucleótidos o pares de bases.
4.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la fase porosa inversa tiene un tamaño de partícula de 8 μm a 50 μm, en particular de 8 a 30 μm, y especialmente de 8 a 25 μm y/o un tamaño de poro de 1.000 Å a 5.000 Å o un tamaño de poro de

1.000 Å a 4.000 Å.
5.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la fase porosa inversa está compuesta de perlas o aparece como un bloque polimerizado.
6.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la columna de HPLC tiene una longitud de más de 5 cm, en particular hasta 100 cm y un diámetro de más de 4 mm, en particular hasta 25 mm, preferentemente hasta 1 m, especialmente hasta 100 cm.
7.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la purificación por HPLC se realiza según un método de par iónico, añadiéndose un ión con carga positiva a la fase móvil como contraión para el ARN cargado negativamente, o por cromatografía de exclusión de tamaños, filtración en gel, cromatografía de

afinidad, cromatografía de interacción hidrofóbica o cromatografía de par iónico.
8.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se utiliza una mezcla de un disolvente acuoso y un disolvente orgánico para la purificación por HPLC con el propósito de la elución.
9.

Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque el disolvente acuoso es un tampón, donde el tampón se selecciona preferentemente de entre acetato de trietilamonio, ácido trifluoroacético, ácido acético, ácido fórmico, tampón acetato, tampón fosfato, bisulfato de tetrabutilamonio, bromuro de tetrabutilamonio y cloruro de tetrabutilamonio.
10.

Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque el tampón de acetato de trietilamonio es un tampón de acetato de trietilamonio 0,1M.
11.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado porque el disolvente orgánico es acetonitrilo, metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol y acetona o una mezcla de los mismos.
12.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, caracterizado porque la fase móvil es una mezcla de acetato de trietilamonio 0,1M y acetonitrilo.
13.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, caracterizado porque la fase móvil contiene del 5,0% en volumen al 25,0% en volumen de disolvente orgánico, en relación con la fase móvil, y para que alcance el 100% en volumen con el disolvente acuoso, o caracterizado porque la fase móvil contiene del 7,5% en volumen al 17,5% en volumen, en particular del 9,5 al 14,4% en volumen, de disolvente orgánico, con relación a la fase móvil, y para que alcance el 100% en volumen con el disolvente acuoso.
14.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la separación se desarrolla de forma isocrática.
15.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque se desarrolla una separación en gradientes.
16.

Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque, en el

caso

de una separación en gradiente, la proporción de disolvente

orgánico aumenta en particular en al menos un 10%, preferentemente en

al menos un 50% y especialmente en al menos un 100%, opcionalmente

5

en al menos un 200%, con respecto al % en volumen inicial en la fase

móvil.
17.

Procedimiento según la reivindicación 16, caracterizado porque la

proporción de disolvente orgánico en la fase móvil se eleva durante la

separación por HPLC a desde el 3 hasta el 9%, preferentemente del 4 al

10

7,5%, en particular del 5,0% en volumen, o aumenta del 3 al 9, en

particular del 5,0% en volumen al 20,0% en volumen, en cada caso con

respecto a la fase móvil, o aumenta del 6,5 al 8,5, en particular del 7,5%

en volumen al 17,5% en volumen, en cada caso con relación a la fase

móvil.

15

18. Utilización de una fase porosa inversa en un método de HPLC según una

cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizada porque la fase

porosa inversa

es un poliestireno poroso no alquilado, incluyendo un

poliestirenodivinilbenceno poroso no alquilado.